JP2006519025A - Compositions and methods for immobilizing a substance on a solid support - Google Patents

Compositions and methods for immobilizing a substance on a solid support Download PDF

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Abstract

本発明は、生体分子などの物質を簡便に固相支持体に固定する方法を開発すること。固相支持体への固定後に、特定の溶液に溶解したときに固定された生体分子などの物質が徐放され、あるいは細胞などの生体への親和性が実質的に保持または改善されるような効果を達成する固定方法を開発することを課題とする。
本発明は、物質を固相支持体に固定するための組成物であって、ａ）正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体；およびｂ）塩、を含む、組成物を提供することによって上記課題を解決する。本発明はまた、このような組成物が固定された固相支持体（デバイス）、および物質の固定方法にも関する。The present invention develops a method for simply immobilizing a substance such as a biomolecule on a solid support. After immobilization to a solid support, a substance such as a biomolecule immobilized when dissolved in a specific solution is released slowly, or the affinity to a living body such as a cell is substantially maintained or improved. The task is to develop a fixing method that achieves the effect.
The present invention provides a composition for immobilizing a substance on a solid support comprising a) a complex of a positively charged substance and a negatively charged substance; and b) a salt. The above-mentioned problems are solved by providing. The present invention also relates to a solid support (device) to which such a composition is immobilized, and a method for immobilizing a substance.

Description

本発明は、生体分子などの物質の固定技術に関する。より詳細には、本発明は、固相支持体に生体分子などの物質を固定するための新規組成物およびそのための方法に関する。   The present invention relates to a technique for immobilizing a substance such as a biomolecule. More specifically, the present invention relates to a novel composition for immobilizing a substance such as a biomolecule on a solid support and a method therefor.

マイクロタイタープレートなどの固相支持体に生体分子などの物質を固定して種々の分析を行う試みが広く行われている。   Attempts to perform various analyzes by immobilizing a substance such as a biomolecule on a solid support such as a microtiter plate are widely performed.

従来の固相支持体に生体分子を固定するやり方としては、例えば、共有結合を介する方法、疎水性相互作用、吸着、シラン化などの固相の表面処理などの方法がある。   Examples of a conventional method for immobilizing a biomolecule on a solid support include a method via a covalent bond, a method such as a surface treatment of a solid phase such as hydrophobic interaction, adsorption, and silanization.

例えば、Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．は、陽イオン性界面活性剤を媒体としたオリゴマーのポリスチレンウエルへの結合を利用する方法を開示した（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４１６７〜４１７５、１９９４）。   For example, Nikiforov et al. Disclosed a method that utilizes binding of oligomers to a polystyrene well using a cationic surfactant as a medium (Nikiforov et al., Nucleic Acids Res. 22: 4167-4175, 1994).

Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．は、未知量のクローニングＤＮＡを０．１Ｍ ＭｇＣｌ２の存在下でマイクロタイターウエルに結合させる技術を開示した（Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １８３：３７９〜３８２（１９８５））。Ｄａｈｌｅｎ，Ｐ． ｅｔ ａｌ．は、マイクロタイターウエル中でのサンドイッチハイブリダイゼーションにおいて、クローニング捕捉ＤＮＡをウエルに吸着させることを記載している（Ｄａｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ １：１５９〜１６８（１９８７））。ＮａＣｌを媒体としたオリゴマーのポリスチレンウエルへの結合がＮｉｋｉｆｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．３：２８５〜２９１，１９９４）により検討されている。 Nagata et al. Disclosed a technique for binding unknown amounts of cloning DNA to microtiter wells in the presence of 0.1 M MgCl 2 (Nagata et al., FEBS Letters 183: 379-382 (1985)). Dahlen, P.M. et al. Describe adsorbing cloning capture DNA to wells in sandwich hybridization in microtiter wells (Dahlen et al., Mol. Cell. Probes 1: 159-168 (1987)). The binding of oligomers in NaCl media to polystyrene wells is described in Nikiforov et al. (PCR Methods App. 3: 285-291, 1994).

しかし、これらの方法は、固定工程において、一定の工数を必要とするか、特殊な処理を必要とすることから、より簡便な生体分子などの物質の固定方法への需要は大いにある。   However, since these methods require a certain number of man-hours or special treatments in the fixing step, there is a great demand for more simple methods for fixing substances such as biomolecules.

また、固定後に徐放することが望ましい場合も多い。そのような場合として、例えば、マイクロタイタープレートなどのプレート上でいったん生体分子を固定した後、アッセイにおいてアッセイ溶液にそのプレートを浸した後にその固定された生体分子が徐々に放出することが必要な場合などが挙げられる。あるいは、細胞などの生体に対して固定後に親和性を保持することが求められる場合もあるが、従来の方法では達成されていないか、あるいは固定後の生体への親和性が大いに低減することが多く、満足な固定方法が開発されていないのが現状である。   In addition, it is often desirable to release slowly after fixation. In such a case, for example, after immobilizing a biomolecule once on a plate such as a microtiter plate, it is necessary to gradually release the immobilized biomolecule after the plate is immersed in an assay solution in an assay. Cases. Alternatively, in some cases, it is required to maintain affinity for a living body such as a cell after fixation, but this is not achieved by conventional methods, or the affinity for a living body after fixation may be greatly reduced. At present, a satisfactory fixing method has not been developed.

本発明では、生体分子などの物質を簡便に固相支持体に固定する方法を開発することを課題の一つとした。本発明はまた、（ｉ）固相支持体への固定後に、特定の溶液に溶解したときに固定された生体分子などの物質が徐放され、あるいは（ｉｉ）細胞などの生体への親和性が実質的に保持または改善されるような効果を達成する固定方法を開発することも課題の一つとした。   An object of the present invention is to develop a method for easily fixing a substance such as a biomolecule to a solid support. The present invention also provides that (i) a substance such as a biomolecule immobilized when dissolved in a specific solution is fixedly released after being immobilized on a solid support, or (ii) an affinity for a living body such as a cell. One of the issues was to develop a fixing method that achieves an effect such that the material is substantially maintained or improved.


本発明は、上記課題を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドなどの生体分子のような物質を、それとは反対の電荷を有する物質と複合体を形成させ、その複合体に塩（有機塩、無機塩（例えば、培地に含まれるリン酸カルシウムなどの無機塩））を添加したものが、予想外に、簡便に固相支持体に固定されることを本発明者らが見いだしたことによって解決した。
The present invention solves the above problem by forming a complex with a substance such as a biomolecule such as DNA, RNA, or polypeptide, and a substance having a charge opposite to that of the substance. It was solved by the present inventors that the addition of (for example, an inorganic salt such as calcium phosphate contained in a medium) was unexpectedly fixed to a solid support unexpectedly.

本発明者らはまた、上記構成を有する固定された生体分子などの物質が、固定された後、アッセイ溶液などの溶液に固相支持体（例えば、プレート）を浸すと徐放されることを予想外に見いだした。本発明者らはまた、上記構成を有する物質は、生体（例えば、組織、細胞）に対する親和性が保持または改善されることを見いだした。   The present inventors also indicate that a substance such as an immobilized biomolecule having the above-described configuration is released slowly when it is immersed in a solid support (eg, a plate) in a solution such as an assay solution. I found it unexpectedly. The present inventors have also found that the substance having the above-described configuration retains or improves the affinity for a living body (for example, tissue, cell).

このように、本発明は、以下を提供する。
１． 物質を固相支持体に固定するための組成物であって、
ａ）正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体；および
ｂ）塩、
を含む、組成物。
２． 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の少なくとも一方は、細胞親和性を有する、項目１に記載の組成物。
３． 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の両方が、細胞親和性を有する、項目１に記載の組成物。
４． 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の少なくとも一方は、生体分子を含む、項目１に記載の組成物。
５． 前記生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、脂質、糖、有機低分子、およびこれらの複合体からなる群より選択される、項目４に記載の組成物。
６． 前記負に荷電した物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ポリペプチド、化学化合物、及びその複合体からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
７． 前記正に荷電した物質は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミノ酸及びその複合体からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
８． 前記塩は、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンからなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
９． 前記生体分子は、細胞に導入されて生物学的活性を有する、項目４に記載の組成物。
１０． 前記複合体および塩は薬学的に受容可能である、項目１に記載の組成物。
１１． 目的の物質が固定されたデバイスであって、
ａ）正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体；
ｂ）塩；および
ｃ）該複合体および該塩が固定された固相支持体、
を含み、該目的の物質は、該正に荷電した物質および／ または該負に荷電した物質である、デバイス。
１２． 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の少なくとも一方は、細胞親和性を有する、項目１１に記載のデバイス。
１３． 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の両方が、細胞親和性を有する、項目１１に記載のデバイス。
１４． 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の少なくとも一方は、生体分子を含む、項目１１に記載のデバイス。
１５． 前記生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、脂質、糖、有機低分子、およびこれらの複合体からなる群より選択される、項目１４に記載のデバイス。
１６． 前記負に荷電した物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ポリペプチド、化学化合物、及びその複合体からなる群より選択される、項目１１に記載のデバイス。
１７． 前記正に荷電した物質は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミノ酸及びその複合体からなる群より選択される、項目１１に記載のデバイス。
１８． 前記塩は、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンからなる群より選択される、項目１１に記載のデバイス。
１９． 前記固相支持体は、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属、天然ポリマーおよび合成ポリマーからなる群より選択される材料を含む、項目１１に記載のデバイス。
２０． 前記固相支持体は、コーティングによって処理される、項目１１に記載のデバイス。
２１． 前記コーティングは、ポリ−Ｌ−リジン、シラン、ＡＰＳ、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂および金属からなる群より選択される物質を含むコーティング剤によって行われる、項目２０に記載のデバイス。
２２． 前記固相支持体はチップである、項目１１に記載のデバイス。
２３． 前記固相支持体はチップであり、前記複合体は該チップ上にアレイ状に配列される、項目１１に記載のデバイス。
２４． 前記生体分子は、細胞に導入されて生物学的活性を有する、項目１４に記載のデバイス。
２５． 前記複合体、前記塩および前記固体支持体に含まれる材料は薬学的に受容可能である、項目１１に記載のデバイス。
２６． 物質を固相支持体に固定する方法であって、
ａ）固相支持体を提供する工程；
ｂ）正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体を提供する工程；
ｃ）塩と該複合体との混合物を提供する工程；および
ｄ）該塩と該複合体との該混合物を固相支持体に付着させる工程、
を包含する、方法。
２７． 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の少なくとも一方は、細胞親和性を有する、項目２６に記載の方法。
２８． 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の両方が、細胞親和性を有する、項目２６に記載の方法。
２９． 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の少なくとも一方は、生体分子を含む、項目２６に記載の方法。
３０． 前記生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、脂質、糖、有機低分子、およびこれらの複合体からなる群より選択される、項目２９に記載の方法。
３１． 前記負に荷電した物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ポリペプチド、化学化合物、及びその複合体からなる群より選択される、項目２５に記載の方法。
３２． 前記正に荷電した物質は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミノ酸及びその複合体からなる群より選択される、項目２６に記載の方法。
３３． 前記塩は、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンからなる群より選択される、項目２６に記載の方法。
３４． 前記固相支持体は、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属、天然ポリマーおよび合成ポリマーからなる群より選択される材料を含む、項目２６に記載の方法。
３５． 前記固相支持体は、コーティングによって処理される、項目２６に記載の方法。
３６． 前記コーティングは、ポリ−Ｌ−リジン、シラン、ＡＰＳ、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂および金属からなる群より選択される物質を含むコーティング剤によって行われる、項目３５に記載の方法。
３７． 前記固相支持体はチップである、項目２６に記載の方法。
３８． 前記固相支持体はチップであり、前記複合体は該チップ上にアレイ状に配列される、項目２６に記載の方法。
３９． 前記生体分子は、細胞に導入されて生物学的活性を有する、項目２９に記載の方法。
４０． 前記複合体および塩は薬学的に受容可能である、項目２６に記載の方法。
４１． 前記工程ｂ）は、生体分子を破壊しない条件下で行われる、項目２９に記載の方法。
４２． 前記工程ｃ）は、生体分子を破壊しない条件下で行われる、項目２９に記載の方法。
４３． 前記混合物を前記固相支持体に付着した後、その混合物中の溶媒を低減または除去する工程をさらに包含する、項目２６に記載の方法。 Thus, the present invention provides the following.
1. A composition for immobilizing a substance on a solid support,
a) a complex of a positively charged substance and a negatively charged substance; and b) a salt,
A composition comprising:
2. The composition according to item 1, wherein at least one of the positively charged substance and the negatively charged substance has a cell affinity.
3. The composition according to item 1, wherein both the positively charged substance and the negatively charged substance have cytophilicity.
4). The composition according to item 1, wherein at least one of the positively charged substance and the negatively charged substance includes a biomolecule.
5. Item 5. The composition according to Item 4, wherein the biomolecule is selected from the group consisting of DNA, RNA, polypeptide, lipid, sugar, small organic molecule, and a complex thereof.
6). Item 2. The composition according to Item 1, wherein the negatively charged substance is selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, polypeptide, chemical compound, and complex thereof.
7). Item 2. The composition according to Item 1, wherein the positively charged substance is selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a cationic polyamino acid and a complex thereof.
8). Item 1 wherein the salt is selected from the group consisting of calcium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium bicarbonate, sodium pyruvate, HEPES, calcium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfide, iron nitrate, amino acids and vitamins. A composition according to 1.
9. Item 5. The composition according to Item 4, wherein the biomolecule is introduced into a cell and has biological activity.
10. 2. The composition of item 1, wherein the complex and salt are pharmaceutically acceptable.
11. A device to which a target substance is fixed,
a) a complex of a positively charged substance and a negatively charged substance;
b) a salt; and c) a solid support on which the complex and the salt are immobilized,
The device of interest is the positively charged material and / or the negatively charged material.
12 Item 12. The device according to Item 11, wherein at least one of the positively charged substance and the negatively charged substance has cell affinity.
13. Item 12. The device according to Item 11, wherein both the positively charged substance and the negatively charged substance have cytophilicity.
14 Item 12. The device of item 11, wherein at least one of the positively charged substance and the negatively charged substance comprises a biomolecule.
15. 15. The device according to item 14, wherein the biomolecule is selected from the group consisting of DNA, RNA, polypeptide, lipid, sugar, small organic molecule, and a complex thereof.
16. Item 12. The device according to Item 11, wherein the negatively charged substance is selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, polypeptide, chemical compound, and complex thereof.
17. Item 12. The device according to Item 11, wherein the positively charged substance is selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a cationic polyamino acid and a complex thereof.
18. Item 11 wherein the salt is selected from the group consisting of calcium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium bicarbonate, sodium pyruvate, HEPES, calcium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfide, iron nitrate, amino acids and vitamins. Device described in.
19. Item 12. The device of item 11, wherein the solid support comprises a material selected from the group consisting of glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal, natural polymer and synthetic polymer.
20. Item 12. The device of item 11, wherein the solid support is treated by coating.
21. Item 21. The device according to Item 20, wherein the coating is performed by a coating agent comprising a material selected from the group consisting of poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin, and metal.
22. Item 12. The device according to Item 11, wherein the solid support is a chip.
23. Item 12. The device according to Item 11, wherein the solid support is a chip, and the complex is arranged in an array on the chip.
24. Item 15. The device according to Item 14, wherein the biomolecule is introduced into a cell and has biological activity.
25. Item 12. The device according to Item 11, wherein the materials contained in the complex, the salt and the solid support are pharmaceutically acceptable.
26. A method of immobilizing a substance on a solid support,
a) providing a solid support;
b) providing a complex of a positively charged substance and a negatively charged substance;
c) providing a mixture of the salt and the complex; and d) attaching the mixture of the salt and the complex to a solid support.
Including the method.
27. 27. A method according to item 26, wherein at least one of the positively charged substance and the negatively charged substance has a cell affinity.
28. 27. A method according to item 26, wherein both the positively charged substance and the negatively charged substance have cytophilicity.
29. 27. The method of item 26, wherein at least one of the positively charged substance and the negatively charged substance comprises a biomolecule.
30. 30. The method of item 29, wherein the biomolecule is selected from the group consisting of DNA, RNA, polypeptide, lipid, sugar, small organic molecule, and complexes thereof.
31. 26. The method of item 25, wherein the negatively charged substance is selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, polypeptide, chemical compound, and complex thereof.
32. 27. A method according to item 26, wherein the positively charged substance is selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a cationic polyamino acid and a complex thereof.
33. Item 26 wherein the salt is selected from the group consisting of calcium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium hydrogen carbonate, sodium pyruvate, HEPES, calcium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfide, iron nitrate, amino acids and vitamins. The method described in 1.
34. 27. A method according to item 26, wherein the solid support comprises a material selected from the group consisting of glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal, natural polymer and synthetic polymer.
35. 27. A method according to item 26, wherein the solid support is treated by coating.
36. 36. The method of item 35, wherein the coating is performed by a coating agent comprising a material selected from the group consisting of poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin, and metal.
37. 27. A method according to item 26, wherein the solid support is a chip.
38. 27. A method according to item 26, wherein the solid support is a chip, and the complexes are arranged in an array on the chip.
39. 30. The method of item 29, wherein the biomolecule is introduced into a cell and has biological activity.
40. 27. A method according to item 26, wherein the complex and salt are pharmaceutically acceptable.
41. 30. The method of item 29, wherein the step b) is performed under conditions that do not destroy the biomolecule.
42. 30. A method according to item 29, wherein step c) is performed under conditions that do not destroy biomolecules.
43. 27. A method according to item 26, further comprising the step of reducing or removing a solvent in the mixture after the mixture is attached to the solid support.

以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および付随する図面、ならびに当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。   Preferred embodiments of the present invention will be described below. However, those skilled in the art can appropriately implement the embodiments and the like from the description of the present invention and the accompanying drawings, and well-known and common techniques in the field, and the effects of the present invention can be achieved. It should be appreciated that and understand the effect easily.

（発明の実施の形態）
以下に本発明の好ましい形態を説明する。 (Embodiment of the Invention)
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described.

本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。   Throughout this specification, it should be understood that the singular forms also include the plural concept unless specifically stated otherwise. Therefore, singular articles (for example, “a”, “an”, “the” in the case of English, “ein”, “der”, “das”, “die”, etc. in the case of German and their case changes) Corresponding articles in other languages such as "un", "une", "le", "la" in Spanish, "un", "una", "el", "la", etc. It should be understood that the adjectives, etc. also include the plural concept thereof unless otherwise stated. In addition, it is to be understood that the terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified. Thus, unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。 (Definition of terms)
Listed below are definitions of terms particularly used in the present specification.

本明細書において使用される用語「物質」は、当該分野において用いられる最も広義な意味と同じ意味で用いられ、正または負に荷電することができるものを含む。   The term “substance” as used herein is used in the same meaning as the broadest meaning used in the art, and includes substances that can be positively or negatively charged.

本明細書において「正に荷電した物質」は、正荷電を有するすべての物質を包含する。そのような物質としては、例えば、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質などのカチオン性物質が含まれるがそれらに限定されない。そのような正に荷電した物質は、複合体を形成することができる物質であることが有利である。そのような複合体を形成することができる正に荷電した物質としては、例えば、カチオン性ポリマーのようにある程度の分子量を有する物質、あるいは、カチオン性脂質のように特定の溶媒（例えば、水、水溶液など）中においてある程度溶解せずに残存することができる物質などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような好ましい正に荷電した物質としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリＬリシン、合成ポリペプチドもしくはそれらの誘導体などが挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、正に荷電した物質としては、ヒストン、合成ポリペプチドなどのような生体分子が挙げられるがそれらに限定されない。そのような好ましい正に荷電した物質の種類は、複合体を形成するパートナーである負に荷電した物質の種類に応じて変動する。好ましい複合体形成パートナーを選択することは、当業者には容易であり、そのような選択は、当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。そのような好ましい複合体形成パートナーの選択においては、種々のパラメータを考慮することができる。そのようなパラメータとしては、例えば、電荷、分子量、疎水性、親水性、置換基の性質、ｐＨ、温度、塩濃度、圧力などの種々の物理的パラメータ、化学的パラメータなどが挙げられるがそれらに限定されない。   As used herein, “positively charged substance” includes all substances having a positive charge. Examples of such substances include, but are not limited to, cationic substances such as cationic polymers and cationic lipids. Such positively charged substances are advantageously substances capable of forming a complex. The positively charged substance that can form such a complex includes, for example, a substance having a certain molecular weight such as a cationic polymer, or a specific solvent such as water (e.g., water, Examples include, but are not limited to, substances that can remain in the aqueous solution without being dissolved to some extent. Examples of such preferable positively charged substance include, but are not limited to, polyethyleneimine, poly L-lysine, synthetic polypeptide, or derivatives thereof. Alternatively, positively charged substances include, but are not limited to, biomolecules such as histones, synthetic polypeptides, and the like. The type of such preferred positively charged material will vary depending on the type of negatively charged material that is the partner forming the complex. Selecting a preferred complexing partner is easy for those skilled in the art, and such selection can be made using techniques well known in the art. Various parameters can be taken into account in selecting such a preferred complexing partner. Examples of such parameters include various physical parameters such as charge, molecular weight, hydrophobicity, hydrophilicity, substituent properties, pH, temperature, salt concentration, pressure, and chemical parameters. It is not limited.

本明細書において「カチオン性ポリマー」は、カチオン性の官能基を有するポリマーをいい、例えば、ポリエチレンイミン、ポリＬリシン、合成ポリペプチドもしくはそれらの誘導体が挙げられるがそれらに限定されない。   As used herein, “cationic polymer” refers to a polymer having a cationic functional group, and examples thereof include, but are not limited to, polyethyleneimine, poly-L-lysine, synthetic polypeptide, or derivatives thereof.

本明細書において「カチオン性脂質」は、カチオン性の官能基を有する脂質をいい、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、及びその誘導体が挙げられるがそれらに限定されない。   As used herein, “cationic lipid” refers to a lipid having a cationic functional group, and examples thereof include, but are not limited to, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, and derivatives thereof.

ここで、カチオン性の官能基としては、例えば、一級アミン、二級アミン、三級アミンが挙げられるがそれらに限定されない。   Here, examples of the cationic functional group include, but are not limited to, primary amines, secondary amines, and tertiary amines.

本明細書において「負に荷電した物質」は、負荷電を有するすべての物質を包含する。そのような物質としては、例えば、生体分子ポリマー、アニオン性脂質などのアニオン性物質が含まれるがそれらに限定されない。そのような負に荷電した物質は、複合体を形成することができる物質であることが有利である。そのような複合体を形成することができる負に荷電した物質としては、例えば、ＤＮＡのようなアニオン性ポリマーのようにある程度の分子量を有する物質、あるいは、アニオン性脂質のように特定の溶媒（例えば、水、水溶液など）中においてある程度溶解せずに残存することができる物質などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような好ましい負に荷電した物質としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ポリペプチド、化学化合物、及びその複合体などが挙げられるがそれらに限定されない。ならびに、負に荷電した物質としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ポリペプチド、化学化合物、及びその複合体などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような好ましい負に荷電した物質の種類は、複合体を形成するパートナーである正に荷電した物質の種類に応じて変動する。好ましい複合体形成パートナーを選択することは、当業者には容易であり、そのような選択は、当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。そのような好ましい複合体形成パートナーの選択においては、種々のパラメータを考慮することができる。そのようなパラメータもまた、上述の正に荷電した物質において考慮すべきパラメータと同様、種々のものを包含する。   As used herein, “negatively charged material” includes all materials having negative charge. Examples of such substances include, but are not limited to, anionic substances such as biomolecular polymers and anionic lipids. Such a negatively charged substance is advantageously a substance capable of forming a complex. Examples of the negatively charged substance capable of forming such a complex include a substance having a certain molecular weight such as an anionic polymer such as DNA, or a specific solvent such as an anionic lipid ( Examples thereof include, but are not limited to, substances that can remain in the aqueous solution without being dissolved to some extent. Examples of such preferable negatively charged substance include, but are not limited to, DNA, RNA, PNA, polypeptide, chemical compound, and complex thereof. In addition, examples of the negatively charged substance include, but are not limited to, DNA, RNA, PNA, polypeptide, chemical compound, and complex thereof. The type of such preferred negatively charged material will vary depending on the type of positively charged material that is the partner forming the complex. Selecting a preferred complexing partner is easy for those skilled in the art, and such selection can be made using techniques well known in the art. Various parameters can be taken into account in selecting such a preferred complexing partner. Such parameters also include various as well as the parameters to be considered in the positively charged materials described above.

本明細書において「アニオン性ポリマー」は、アニオン性の官能基を有するポリマーをいい、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ポリペプチド、化学化合物、及びその複合体が挙げられるがそれらに限定されない。   As used herein, “anionic polymer” refers to a polymer having an anionic functional group, and examples thereof include, but are not limited to, DNA, RNA, PNA, polypeptide, chemical compound, and complex thereof.

本明細書において「アニオン性脂質」は、アニオン性の官能基を有する脂質をいい、例えば、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンが挙げられるがそれらに限定されない。   In the present specification, “anionic lipid” refers to a lipid having an anionic functional group, and examples thereof include, but are not limited to, phosphatidic acid and phosphatidylserine.

ここで、アニオン性の官能基としては、例えば、カルボキシル基、リン酸基が挙げられるがそれらに限定されない。   Here, examples of the anionic functional group include, but are not limited to, a carboxyl group and a phosphate group.

また、目的の物質に対して、正電荷または負電荷を有する置換基などの部分を付加することによって、その目的の物質の電荷を変換することも可能である。好ましい複合体パートナーが固定を目的とする物質と同じ電荷を有している場合に、いずれかの電荷を変換することによって複合体形成を促進することが可能である。   In addition, the charge of the target substance can be converted by adding a portion such as a substituent having a positive charge or a negative charge to the target substance. When preferred complex partners have the same charge as the substance intended for immobilization, complex formation can be facilitated by converting either charge.

本明細書において「複合体」とは、二つ以上の物質が互いに直接的または間接的に相互作用する結果、それらの物質の総体があたかも１つの物質のように挙動するものをいう。   As used herein, the term “complex” refers to a substance in which two or more substances interact directly or indirectly with each other so that the total of those substances behaves as if it were one substance.

本明細書において「相互作用」とは、２つの物体について言及するとき、その２つの物体が相互に力を及ぼしあうことをいう。そのような相互作用としては、例えば、共有結合、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、疎水性相互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、相互作用は、水素結合、疎水性相互作用などである。本明細書において「共有結合」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、電子対が２つの原子に共有されて形成する化学結合をいう。本明細書において「水素結合」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、電気的陰性度の高い原子に一つしかない水素原子の核外電子が引き寄せられて水素原子核が露出し、これが別の電気的陰性度の高い原子を引き寄せて生じる結合をいい、例えば、水素原子と電気的陰性度の高い（フッ素、酸素、窒素などの）原子との間にできる。   In this specification, “interaction” means that when two objects are referred to, the two objects exert a force on each other. Examples of such interactions include, but are not limited to, covalent bonds, hydrogen bonds, van der Waals forces, ionic interactions, nonionic interactions, hydrophobic interactions, electrostatic interactions, etc. Not. Preferably, the interaction is a hydrogen bond, a hydrophobic interaction or the like. In this specification, the term “covalent bond” is used in a normal sense in the art, and refers to a chemical bond formed by sharing an electron pair with two atoms. In the present specification, the term “hydrogen bond” is used in a normal sense in the field, and the hydrogen nucleus is exposed by attracting an extra-nuclear electron of a hydrogen atom that is only one of the highly electronegative atoms. A bond formed by attracting another highly electronegative atom, for example, formed between a hydrogen atom and an atom (fluorine, oxygen, nitrogen, etc.) having a high electronegativity.

本明細書において「複合体パートナー」とは、複合体を形成するあるメンバーについて言及するとき、そのメンバーと直接的または間接的に相互作用する別のメンバーをいう。   As used herein, “complex partner” when referring to a member that forms a complex refers to another member that interacts directly or indirectly with that member.

本明細書において複合体を形成する条件は、複合体パートナーの種類に応じて変動する。そのような条件は、当業者は容易に理解することができ、当該分野において周知の技法を用いて任意の複合体パートナー（例えば、正に荷電した物質および負に荷電した物質）から複合体を形成させることができる。   In this specification, the conditions for forming a complex vary depending on the type of complex partner. Such conditions can be readily understood by those skilled in the art, and can be performed from any complex partner (eg, positively charged and negatively charged substances) using techniques well known in the art. Can be formed.

本明細書において使用される用語「生体物質」または「生体分子」とは、本明細書において互換可能に用いられ、生体に関連する物質または分子をいう。生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されない。生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。したがって、コンビナトリアルケミストリで合成された分子も生体への効果を目的としている限り、生体物質の定義に入る。生体物質には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例えば、有機低分子など）、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。従って、ポリマー分子と複合体を形成し得る限り、生体物質には、細胞自体、組織の一部、他の物質も包含され得る。   As used herein, the term “biological substance” or “biomolecule” is used interchangeably herein and refers to a substance or molecule associated with a living body. A biomolecule includes, but is not limited to, a molecule extracted from a living body. Any molecule that can affect a living body falls within the definition of a biomolecule. Therefore, as long as a molecule synthesized by combinatorial chemistry is also intended to have an effect on a living body, it falls within the definition of a biological substance. Biological materials include proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNA such as cDNA, genomic DNA, RNA such as mRNA), polysaccharides, oligosaccharides , Lipids, small molecules (for example, small organic molecules), complex molecules thereof, and the like, but are not limited thereto. Thus, biological materials can include cells themselves, parts of tissues, and other materials as long as they can form complexes with polymer molecules.

本明細書において「ポリマー分子」とは、ポリマーが重合してできる高分子量の物質をさし、通常、分子量が約５０００以上のものをいう。   In the present specification, the “polymer molecule” means a high molecular weight substance obtained by polymerizing a polymer, and generally refers to a substance having a molecular weight of about 5000 or more.

本明細書において使用される用語「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において互換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸またはその改変体のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものも包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この用語の定義は、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変体が包含される。   The terms “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide” as used herein are used interchangeably herein and refer to polymers of amino acids of any length or variants thereof. . This polymer may be linear, branched, or cyclic. The amino acid may be natural or non-natural and may be a modified amino acid. The term can also encompass those assembled into a complex of multiple polypeptide chains. The term also encompasses natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component). This term definition includes, for example, polypeptides (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like compounds (eg, peptoids), and other variants known in the art, including one or more analogs of amino acids. Is included.

本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、本明細書において互換可能に使用され、任意の長さのヌクレオチドまたはその改変体のポリマーをいう。これらの用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。   As used herein, the terms “polynucleotide”, “oligonucleotide”, “nucleic acid” and “nucleic acid molecule” are used interchangeably herein and are polymers of nucleotides of any length or variants thereof. Say. These terms also include “derivative oligonucleotides” or “derivative polynucleotides”. “Derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide” refers to an oligonucleotide or polynucleotide in which the linkage between nucleotides is different from the usual, and is used interchangeably. Specific examples of such an oligonucleotide include, for example, 2′-O-methyl-ribonucleotide, a derivative oligonucleotide in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and a phosphodiester bond in an oligonucleotide. Is an N3′-P5 ′ phosphoramidate bond derivative oligonucleotide, a ribose and phosphodiester bond in the oligonucleotide converted to a peptide nucleic acid bond, uracil in the oligonucleotide is C− A derivative oligonucleotide substituted with 5-propynyluracil, a derivative oligonucleotide where uracil in the oligonucleotide is substituted with C-5 thiazole uracil, and cytosine in the oligonucleotide is C-5 propynylcytosine Substituted derivative oligonucleotides, derivative oligonucleotides in which the cytosine in the oligonucleotide is replaced with phenoxazine-modified cytosine, derivative oligonucleotides in which the ribose in the DNA is replaced with 2'-O-propylribose Examples thereof include derivative oligonucleotides in which ribose in the oligonucleotide is substituted with 2′-methoxyethoxyribose. Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence may also be conservatively modified (eg, degenerate codon substitutes) and complementary sequences, as well as those explicitly indicated. Is contemplated. Specifically, a degenerate codon substitute creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98). 1994)).

本明細書において「塩」は、当該分野において通常用いられる意味と同じ意味で用いられ、無機塩および有機塩の両方を含む。塩は、通常、酸と塩基との中和反応によって生成する。塩には中和反応で生成するＮａＣｌ、Ｋ２ＳＯ４などといったもののほかに、金属と酸との反応で生成するＰｂＳＯ４、ＺｎＣｌ２など種々の種類があり、これらは、直接中和反応によって生成したものでなくても、酸と塩基との中和反応から生成したとみなすことができる。塩としては、正塩（酸のＨや塩基のＯＨが塩に含まれていないもの、例えば、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ＣＨ３ＣＯＯＮａ、Ｎａ２ＣＯ３）、酸性塩（酸のＨが塩に残っているもの、例えば、ＮａＨＣＯ３、ＫＨＳＯ４、ＣａＨＰＯ４）、塩基性塩（塩基のＯＨが塩の中に残っているもの、例えば、ＭｇＣｌ（ＯＨ）、ＣｕＣｌ（ＯＨ））などに分類することができるがそれらの分類は、本発明においてはそれほど重要ではない。好ましい塩としては、培地を構成する塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸、ビタミン）、緩衝液を構成する塩（例えば、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム）などが好ましい。細胞に対する親和性を保持または改善する効果がより高いからである。これらの塩は、単独で用いてもよいし、複数用いてもよい。複数用いることが好ましい。細胞に対する親和性が高くなる傾向があるからである。従って、ＮａＣｌなどを単独で用いるよりも、培地中に含まれる塩（例えば、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム）を複数用いることが好ましく、より好ましくは、培地中に含まれる塩全部をそのまま使用することが有利であり得る。別の好ましい実施形態では、グルコースを加えてもよい。 In this specification, "salt" is used by the same meaning as is normally used in the said field | area, and includes both inorganic salt and organic salt. The salt is usually produced by a neutralization reaction between an acid and a base. In addition to NaCl, K 2 SO 4 and the like produced by the neutralization reaction, there are various types of salts such as PbSO 4 and ZnCl 2 produced by the reaction between the metal and the acid. Even if it is not produced, it can be regarded as produced from a neutralization reaction between an acid and a base. Examples of the salt include a normal salt (having no acid H or base OH, for example, NaCl, NH 4 Cl, CH 3 COONa, Na 2 CO 3 ), an acid salt (acid H is converted into a salt). Classification is made into those remaining, for example, NaHCO 3 , KHSO 4 , CaHPO 4 ), basic salts (those in which the base OH remains in the salt, for example, MgCl (OH), CuCl (OH)), etc. Although possible, their classification is not very important in the present invention. Preferred salts include salts constituting the medium (for example, calcium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium hydrogen carbonate, sodium pyruvate, HEPES, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfide, iron nitrate, amino acids, vitamins), buffer solution (For example, potassium chloride, magnesium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium chloride) and the like are preferable. This is because the effect of retaining or improving the affinity for cells is higher. These salts may be used alone or in combination. It is preferable to use a plurality. This is because the affinity for cells tends to increase. Therefore, it is preferable to use a plurality of salts (for example, potassium chloride, magnesium chloride, sodium hydrogenphosphate, sodium chloride) contained in the medium, and more preferably contained in the medium, rather than using NaCl alone. It may be advantageous to use the entire salt as is. In another preferred embodiment, glucose may be added.

本明細書において使用される「支持体」または「基板」は交換可能であり、本明細書において、生体分子のような物質を固定することができる要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）をいう。支持体の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子のような物質に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。   As used herein, “support” or “substrate” is interchangeable and refers herein to an element capable of immobilizing a substance such as a biomolecule. Support materials can be either covalently bonded or non-covalently bonded to a substance such as a biomolecule used in the present invention or derivatized to have such characteristics. Any solid material to be obtained is mentioned.

支持体として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）などが挙げられるがそれらに限定されない。支持体は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、酸化珪素、炭化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどの有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。支持体を構成する材料が固相である場合、本明細書において特に「固相支持体」という。固相支持体は、本明細書において、プレート、マイクロウェルプレート、チップ、スライドグラス、フィルム、ビーズ、金属（表面）などの形態をとり得る。   As such a material for use as a support, any material capable of forming a solid surface can be used, for example, glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal (including alloys) ), Natural and synthetic polymers such as, but not limited to, polystyrene, cellulose, chitosan, dextran, and nylon. The support may be formed from a plurality of layers of different materials. For example, an inorganic insulating material such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon oxide, silicon carbide, or silicon nitride can be used. Polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin, polycarbonate Organic materials such as polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicon resin, polyphenylene oxide, and polysulfone can be used. In the present invention, a membrane used for blotting, such as a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, or a PVDF membrane, can also be used. When the material constituting the support is a solid phase, it is particularly referred to herein as “solid support”. As used herein, a solid support may take the form of a plate, microwell plate, chip, slide glass, film, bead, metal (surface), and the like.

本明細書において「コーティング」とは、固相支持体について用いられるとき、その固相支持体の表面上にある物質の膜を形成させることおよびそのような膜をいう。コーティングは種々の目的で行われ、例えば、固相支持体の品質向上（例えば、寿命の向上、耐酸性などの耐環境性の向上）、固相支持体に結合されるべき物質の親和性の向上などを目的とすることが多い。そのようなコーティングのための物質としては、種々の物質が用いられ得、上述の固相支持体に使用される物質のほか、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質などの生体物質、ポリマー（例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＳ（例えば、γ−アミノプロピルシラン）、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂）、シラン、金属（例えば、金など）が使用され得るがそれらに限定されない。そのような物質の選択は当業者の技術範囲内にあり、当該分野において周知の技術を用いて場合ごとに選択することができる。一つの好ましい実施形態では、そのようなコーティングは、ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＳ、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂、エポキシシランまたはメルカプトシランのようなシラン、金のような金属を用いることが有利であり得る。このような物質は、細胞または細胞を含む物体（例えば、生体、臓器など）に適合する物質を用いることが好ましくあり得る。   The term “coating” as used herein refers to the formation of a film of a substance on the surface of a solid support and such a film. The coating is performed for various purposes, for example, improving the quality of the solid support (for example, improving the lifetime, improving the environmental resistance such as acid resistance), the affinity of the substance to be bound to the solid support. It is often aimed at improvement. Various materials can be used as the material for such coating. In addition to the materials used for the solid support described above, biological materials such as DNA, RNA, protein, and lipid, polymers (for example, poly -L-lysine, APS (eg, γ-aminopropylsilane), MAS, hydrophobic fluororesin), silane, metal (eg, gold, etc.) can be used, but are not limited thereto. The selection of such materials is within the skill of the artisan and can be selected on a case-by-case basis using techniques well known in the art. In one preferred embodiment, such coatings advantageously use poly-L-lysine, APS, MAS, hydrophobic fluororesins, silanes such as epoxy silane or mercapto silane, metals such as gold. obtain. As such a substance, it may be preferable to use a substance that is compatible with a cell or an object including the cell (for example, a living body, an organ, etc.).

本明細書において「固定」とは、固相支持体について用いられるとき、その対象となる物質（例えば、生体分子）がその支持体において少なくともある一定の時間の間保持される状態またはそのような状態にさせることをいう。従って、物質が固相支持体上で固定された後、条件が変化する（例えば、別の溶媒中に浸される）場合は、その固定状態が解除されてもよい。   As used herein, the term “fixed” refers to a state in which a target substance (for example, a biomolecule) is held on the support for at least a certain period of time, or the like. It means to make a state. Therefore, after the substance is fixed on the solid support, the fixed state may be released when the conditions change (for example, immersed in another solvent).

本明細書において用いられる「細胞親和性」とは、ある物質が細胞（例えば、細菌細胞、動物細胞、酵母、植物細胞など）または細胞を含む物体（例えば、組織、臓器、生体など）と相互作用が可能な状態に置かれたときに、その細胞または細胞を含む物体に対して有害な影響を与えない性質をいう。好ましくは、細胞親和性を有する物質は、細胞が優先的に相互作用する物質であり得るがそれに限定されない。本発明では、固定されるべき物質（例えば、正に荷電した物質および／または負に荷電した物質）は、細胞親和性を有することが好ましいがそれに限定されない。固定されるべき物質が細胞親和性を有する場合、その物質が本発明にしたがって固定されると、細胞親和性が保持または改善されることが予想外に見いだされた。通常、細胞親和性を有する物質が固相支持体に固定される場合は、必ずしも細胞親和性が保持されるとは限らなかったことに鑑みると、本発明の効果は計り知れない。   As used herein, “cytophilic” refers to a substance that interacts with a cell (eg, bacterial cell, animal cell, yeast, plant cell, etc.) or an object (eg, tissue, organ, organism, etc.) containing the cell. When placed in a state where action is possible, it means a property that does not have a detrimental effect on the cell or the object containing the cell. Preferably, the substance having cell affinity may be a substance with which cells interact preferentially, but is not limited thereto. In the present invention, the substance to be immobilized (for example, a positively charged substance and / or a negatively charged substance) preferably has cell affinity, but is not limited thereto. It has been unexpectedly found that if the substance to be immobilized has cytophilicity, cell affinity is retained or improved when the substance is immobilized according to the present invention. In general, when a substance having cell affinity is immobilized on a solid support, the effect of the present invention is immeasurable in view of the fact that cell affinity is not always maintained.

本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。   A “cell” as used herein is defined in the same way as the broadest meaning used in the art, and is a structural unit of a tissue of a multicellular organism, surrounded by a membrane structure that isolates the outside world, Refers to a living organism having self-regenerative ability and having genetic information and its expression mechanism. The cells used herein may be naturally occurring cells or artificially modified cells (eg, fusion cells, genetically modified cells). The source of cells can be, for example, a single cell culture, or such as cells from a normally grown transgenic animal embryo, blood, or body tissue, or a normally grown cell line Examples include but are not limited to cell mixtures.

本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／または形態を有するのであれば、組織と呼ばれ得る。   As used herein, “tissue” refers to a population of cells having substantially the same function and / or morphology in a multicellular organism. A “tissue” usually has the same origin, but even cell populations with different origins can be referred to as a tissue if they have the same function and / or morphology.

本明細書において「臓器」または「器官」とは、互換可能に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。１つの実施形態では、本発明が対象とする臓器は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。   In the present specification, the term “organ” or “organ” is used interchangeably, and a function of an organism individual is localized and operated in a specific part of the individual, and that part has morphological independence. Is a structure. In general, in a multicellular organism (eg, animal, plant), an organ is composed of several tissues having a specific spatial arrangement, and the tissue is composed of many cells. Such organs or organs include organs or organs associated with the vascular system. In one embodiment, organs targeted by the present invention include skin, blood vessels, cornea, kidney, heart, liver, umbilical cord, intestine, nerve, lung, placenta, pancreas, brain, peripheral limbs, retina and the like. It is not limited to them.

本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、「単離された細胞」とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。   As used herein, “isolated” means that the substances naturally associated with it in a normal environment are at least reduced, preferably substantially free. Thus, an “isolated cell” refers to a cell that is substantially free of other substances (eg, other cells, proteins, nucleic acids) that accompany it in its natural environment. When referring to a nucleic acid or polypeptide, “isolated” is, for example, substantially free of cellular material or culture medium when made by recombinant DNA technology, and precursor when chemically synthesized. Refers to a nucleic acid or polypeptide that is substantially free of somatic or other chemicals.

本発明で用いられる細胞または細胞を含む物体（例えば、臓器、組織）は、どの生物由来の細胞（たとえば、原核生物（例えば、大腸菌など）、真核生物の単細胞生物（酵母など）、任意の種類の多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、カニクイサル、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が用いられる。ヒト由来の細胞が用いられてもよい。   A cell or an object (for example, an organ or tissue) containing a cell used in the present invention may be any cell derived from a living organism (for example, a prokaryotic organism (for example, E. coli, etc.), a eukaryotic unicellular organism (for example, yeast), any Types of multicellular organisms (eg, animals (eg, vertebrates, invertebrates), plants (eg, monocotyledonous plants, dicotyledonous plants, etc.)) may be used. Preferably, cells derived from vertebrates (eg, eel eels, lampreys, cartilaginous fish, teleosts, amphibians, reptiles, birds, mammals, etc.) are used, more preferably mammals (eg, single pores, Marsupials, rodents, wings, wings, carnivores, carnivores, long noses, odd hoofs, even hoofs, rodents, scales, sea cattle, cetaceans, primates , Rodents, rabbit eyes, etc.). More preferably, cells derived from primates (eg, cynomolgus monkeys, chimpanzees, Japanese monkeys, humans) are used. Human-derived cells may be used.

本明細書において「徐放」とは、ある物質がその物質を溶解する溶媒に浸される場合に、一定時間は固相を保ちつつ徐々に溶解することをいう。従って、ある物質が徐放性を有する場合は、通常、溶媒に浸された後も約５分間は固定された状態が保たれ、好ましくは少なくとも約１０分間、より好ましくは少なくとも約１５分間は、さらに好ましくは少なくとも約３０分間固定された状態が保たれる。医薬として用いられる場合は、徐放性は、少なくとも約３０分間、好ましくは少なくとも約１時間、より好ましくは少なくとも約３時間、さらに好ましくは少なくとも約６〜１２時間固定された状態が保たれることが有利である。ＤＮＡのトランスフェクションなど、細胞に直接固定された物質を導入する目的で使用される場合は、通常、少なくとも約１５分間固定された状態が保たれる。   In this specification, “sustained release” means that when a substance is immersed in a solvent that dissolves the substance, the substance gradually dissolves while maintaining a solid phase for a certain period of time. Thus, if a substance has sustained release properties, it usually remains fixed for about 5 minutes after being immersed in a solvent, preferably at least about 10 minutes, more preferably at least about 15 minutes. More preferably, it remains fixed for at least about 30 minutes. When used as a medicament, the sustained release should remain fixed for at least about 30 minutes, preferably at least about 1 hour, more preferably at least about 3 hours, more preferably at least about 6-12 hours. Is advantageous. When used for the purpose of introducing a substance directly fixed to a cell, such as DNA transfection, it is usually kept fixed for at least about 15 minutes.

本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプタ−への結合を包含する。そのような生物学的活性は、測定対象となる活性に応じて当該分野において周知の技術によって測定することができる。   As used herein, “biological activity” refers to an activity that a certain factor (eg, polypeptide or protein) may have in vivo, and includes an activity that exhibits various functions. For example, when a factor is an enzyme, the biological activity includes the enzyme activity. In another example, when an agent is a ligand, the ligand includes binding to the corresponding receptor. Such biological activity can be measured by techniques well known in the art depending on the activity to be measured.

本明細書において「生体分子を破壊しない条件」とは、生体分子が発揮する少なくとも一つの生物学的活性（例えば、遺伝子発現活性、酵素活性など）が損なわれない条件をいう。そのような条件については、当業者はその生体分子に応じ、種々の考慮事項（例えば、温度、ｐＨ、圧力、化学的条件など）を考慮することによって、適宜設定することができる。また、生体分子を破壊しない条件が未知の場合でも、その生体物質について試験されるべき条件に曝し、その後目的とする生物学的活性が保持されているかを調べることによってあらかじめ決定することができる。従って、本発明を実施する際には、そのような条件は、目的とする生物学的活性が保たれている限り、どのような条件であってもよいことが当業者に理解される。   As used herein, “conditions that do not destroy biomolecules” refer to conditions that do not impair at least one biological activity (eg, gene expression activity, enzyme activity, etc.) exhibited by the biomolecule. Such conditions can be appropriately set by those skilled in the art by considering various considerations (eg, temperature, pH, pressure, chemical conditions, etc.) according to the biomolecule. Even if the conditions for not destroying the biomolecule are unknown, the conditions can be determined in advance by exposing the biological material to the conditions to be tested and then examining whether the target biological activity is retained. Accordingly, when practicing the present invention, those skilled in the art will understand that such conditions may be any conditions as long as the desired biological activity is maintained.

本明細書において溶媒（例えば、水、有機溶媒（例えば、ヘキサンなど））の「低減」または「除去」は、その溶媒を含む混合物または組成物を、ある条件に置くことにより、その混合物または組成物中の溶媒比率が減少またはなくなることによって達成される。   As used herein, “reducing” or “removing” a solvent (eg, water, organic solvent (eg, hexane, etc.)) is performed by placing the mixture or composition containing the solvent under certain conditions. This is achieved by reducing or eliminating the solvent ratio in the product.

本明細書において「薬学的に受容可能」とは、ある物質について言及するとき、その物質が医薬として投与され得る性質をいう。   As used herein, “pharmaceutically acceptable” refers to the property of a substance that can be administered as a medicament when referring to the substance.

本明細書において使用され得る「薬学的に受容可能な物質」としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および／または薬学的アジュバント挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、目的とする化合物（生物学的活性または医薬品の有効成分としての活性を有する化合物）、またはその改変体もしくは誘導体は、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で提供される。   “Pharmaceutically acceptable substances” that can be used herein include antioxidants, preservatives, colorants, flavors, and diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents, These include, but are not limited to, buffers, delivery vehicles, excipients and / or pharmaceutical adjuvants. Typically, the compound of interest (a compound having biological activity or activity as an active ingredient of a pharmaceutical), or a variant or derivative thereof, is one or more physiologically acceptable carriers, excipients Or provided in the form of a composition comprising a diluent.

本明細書で使用される薬学的に受容可能な物質は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸塩；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。   The pharmaceutically acceptable substances used herein are non-toxic to the recipient and are preferably inert at the dosages and concentrations used, for example acetate, citric acid Salt, or other organic acid salt; ascorbic acid, α-tocopherol; low molecular weight polypeptide; protein (eg, serum albumin, gelatin or immunoglobulin); hydrophilic polymer (eg, polyvinylpyrrolidone); amino acid (eg, glycine, Glutamine, asparagine, arginine or lysine); monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (including glucose, mannose or dextrin); chelating agents (eg EDTA); sugar alcohols (eg mannitol or sorbitol); salt-forming counterions (For example, Natri Arm); and / or non-ionic surface-active agents (e.g., Tween, Pluronic (pluronic) or polyethylene glycol (PEG)) but the like are not limited thereto.

（生体分子チップ・アレイ）
本明細書において「チップ」とは、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書では、積載される物質に応じて、「ＤＮＡチップ」、「プロテインチップ」などと称することがある。 (Biomolecular chip array)
In this specification, a “chip” refers to a micro integrated circuit that has various functions and is a part of a system. In this specification, it may be referred to as “DNA chip”, “protein chip” or the like depending on the substance to be loaded.

本明細書において用いられる用語「アレイ」とは、基板または膜上の固定物体の固定されたパターンまたはパターン化された基板そのものをいう。アレイの中で、小さな基板（例えば、１０×１０ ｍｍ上など）上にパターン化されているものは「マイクロアレイ」というが、本明細書では、「マイクロアレイ」と「アレイ」とは互換可能に使用される。従って、上述の基板より大きなものにパターン化されたものでも「マイクロアレイ」と呼ぶことがある。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望のポリヌクレオチドのセットで構成される。アレイは好ましくは異なるポリヌクレオチドを少なくとも１０２個、より好ましくは少なくとも１０３個、およびさらに好ましくは少なくとも１０４個、さらにより好ましくは少なくとも１０５個を含む。これらのポリヌクレオチドは、例えば、１２５×８０ ｍｍ、１０×１０ ｍｍのような規格化されたフォーマット上に配置される。 The term “array” as used herein refers to a fixed pattern of a fixed object on a substrate or film or the patterned substrate itself. An array that is patterned on a small substrate (eg, 10 × 10 mm) is referred to as a “microarray”. In this specification, “microarray” and “array” are used interchangeably. Is done. Accordingly, even a pattern formed on a substrate larger than the above substrate may be called a “microarray”. For example, an array is composed of a set of desired polynucleotides that are themselves immobilized on a solid surface or membrane. Array preferably comprises different at least 10 two polynucleotides at least 10 3 and more preferably, and more preferably at least 10 4, even more preferably at least 10 5 a. These polynucleotides are arranged on a standardized format such as, for example, 125 × 80 mm, 10 × 10 mm.

本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを伴う微粒子との関連づけに適切であり、そしてすべての各々のアドレスにおける存在物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。アドレスの形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、または不規則な形であり得る。   As used herein, the term “address” refers to a unique location on a substrate and may be distinguishable from other unique locations. The address is suitable for associating with the microparticle with that address, and can take any shape, with the presence at every address being distinguishable from the presence at the other address (eg, optical). The address shape can be, for example, circular, elliptical, square, rectangular, or irregular.

各々のアドレスのサイズは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のアドレスの数、分析物の量および／または利用可能な試薬、微粒子のサイズおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。大きさは、例えば、１−２ｎｍから数ｃｍの範囲であり得るが、そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。   The size of each address is, among other things, the size of the substrate, the number of addresses on a particular substrate, the amount of analyte and / or available reagents, the size of the microparticles and any method in which the array is used. Depends on the degree of resolution required. The size can range, for example, from 1-2 nm to several centimeters, but can be any size consistent with the application of the array.

アドレスの空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に適合するように設計される。アドレスは、密に充填され得、広汎に分散され得るか、または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。   The spatial arrangement and shape of the address is designed to suit the specific application for which the microarray is used. Addresses can be tightly packed, widely dispersed, or subgrouped into a desired pattern appropriate for a particular type of analyte.

マイクロアレイ（基板上にＤＮＡが配置されている場合、「ＤＮＡマイクロアレイ」とも呼ばれる）については、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。   Microarrays (also referred to as “DNA microarrays when DNA is arranged on a substrate”) are widely outlined in (edited by Shujunsha, separate volume on cell engineering “DNA microarrays and the latest PCR method”).

合成型ＤＮＡマイクロアレイにおける標識方法としては、例えば、二蛍光標識法が挙げられる。この方法では、２つの異なるｍＲＮＡサンプルをそれぞれ異なる蛍光で標識し、同一マイクロアレイ上で競合的ハイブリダイゼーションを行って、両方の蛍光を測定し、それを比較することで遺伝子発現の相違を検出する。蛍光色素としては、例えば、Ｃｙ５およびＣｙ３などが最も用いられているが、それらに限定されない。Ｃｙ３およびＣｙ５の利点は、蛍光波長の重なりが殆どないという点である。二蛍光標識法は、遺伝子発現の相違のみならず、変異または多型性を検出するためにも使用され得る。   Examples of the labeling method in the synthetic DNA microarray include a two-fluorescence labeling method. In this method, two different mRNA samples are labeled with different fluorescence, competitive hybridization is performed on the same microarray, both fluorescences are measured and compared to detect differences in gene expression. For example, Cy5 and Cy3 are most used as fluorescent dyes, but are not limited thereto. The advantage of Cy3 and Cy5 is that there is almost no overlap in fluorescence wavelength. Two fluorescent labeling methods can be used not only to detect differences in gene expression, but also to detect mutations or polymorphisms.

ＤＮＡマイクロアレイを用いたアッセイにおいては、ＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイズした蛍光シグナルを蛍光検出器等で検出する。このような検出器は、現在までに種々の検出器が利用可能である。例えば、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのグループは、オリジナルスキャナを開発しており、このスキャナは、蛍光顕微鏡と稼動ステージとを組み合わせたものである（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎを参照のこと）。従来型のゲル用蛍光イメージアナライザであるＦＭＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング）、Ｓｔｏｒｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）などでも、スポットがそれほど高密度でなければ、ＤＮＡマイクロアレイの読み取りを行い得る。その他に利用可能な検出器としては、Ｓｃａｎａｒｒａｙ ４０００、同５０００（ＧｅｎｅｒａｌＳｃａｎｎｉｎｇ；スキャン型（共焦点型））、ＧＭＳ４１８ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（宝酒造；スキャン型（共焦点型））、Ｇｅｎｅ Ｔｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ（日本レーザー電子；スキャン型（非共焦点型））、Ｇｅｎｅ Ｔａｃ ２０００（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ；（ＣＣＤカメラ型））などが挙げられる。   In an assay using a DNA microarray, a fluorescence signal hybridized on the DNA microarray is detected by a fluorescence detector or the like. As such a detector, various detectors can be used up to now. For example, the Stanford University group has developed an original scanner that combines a fluorescence microscope and a working stage (see http://cmgm.stanford.edu/pbrown). Even with conventional fluorescent image analyzers for gels such as FMBIO (Hitachi Software Engineering) and Storm (Molecular Dynamics), DNA microarrays can be read if the spots are not so dense. Other detectors that can be used include Scanarray 4000, 5000 (General Scanning; confocal), GMS418 Array Scanner (Takara Shuzo; scan (confocal)), Gene Tip Scanner (Japan Laser Electronics; Scan type (non-confocal type)), Gene Tac 2000 (Genomic Solutions; (CCD camera type)), and the like.

マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ Ｏら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１９−２３）。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提唱しているＧＡＴＣ（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と呼ばれる形式が挙げられる。   Since the data obtained from the microarray is enormous, data analysis software for managing the correspondence between clones and spots, data analysis, etc. is important. As such software, software attached to various detection systems can be used (Ermolaeva O et al. (1998) Nat. Genet. 20: 19-23). The database format includes, for example, a format called GATC (Genetic Analysis Technology Consortium) proposed by Affymetrix.

本発明において固相支持体に配置される生体分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドなど）は、生体由来物質（例えば、ｍＲＮＡ）を用いて分子生物学的手法で作製され得、あるいは、当業者に公知の方法によって化学的に合成され得る。例えば、自動固相ペプチド合成機を用いた合成方法は、以下により記載される：Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）．Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．；Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．（１９９２）．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９９３）．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａｇ；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．（１９９７）．Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（Ｉ ９９４）．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．（１９９７）．Ｓｏｌｉｄ-Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどにより市販されるＤＮＡ合成機の何れかを用いて、自動化学合成により調製され得る。自動オリゴヌクレオチドの合成のための組成物および方法は、例えば、米国特許第４，４１５，７３２号，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８３）；米国特許第４，５００，７０７号およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８５）；米国特許第４，６６８，７７７号，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）に開示されており、当業者は、これらの方法を利用して、本発明において使用される生体分子を調製することができる。   In the present invention, a biomolecule (for example, DNA, RNA, polypeptide, etc.) disposed on a solid support can be prepared by a molecular biological technique using a biological material (for example, mRNA), or It can be chemically synthesized by methods known to those skilled in the art. For example, a synthesis method using an automated solid phase peptide synthesizer is described by: Stewart, J. et al. M.M. et al. (1984). Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co. Grant, G .; A. (1992). Synthetic Peptides: A User's Guide, W.M. H. Freeman; Bodanszky, M .; (1993). Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag; Bodanzky, M .; et al. (1994). The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag; B. (1997). Phase Peptide Synthesis, Academic Press; Pennington, M .; W. et al. (I 994). Peptide Synthesis Protocols, Humana Press; B. (1997). Solid-Phase Peptide Synthesis, Academic Press. Oligonucleotides can be prepared by automated chemical synthesis using any of the DNA synthesizers commercially available, such as from Applied Biosystems. Compositions and methods for the synthesis of automated oligonucleotides are described, for example, in US Pat. No. 4,415,732, Caruthers et al. (1983); US Pat. No. 4,500,707 and Caruthers (1985); US Pat. No. 4,668,777, Caruthers et al. (1987) and those skilled in the art can utilize these methods to prepare biomolecules for use in the present invention.

（本発明の好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明するが、これらの好ましい実施形態の説明は、例示のために提供され、本発明の範囲を限定すべきでないことが理解されるべきである。 (Description of a preferred embodiment of the present invention)
While preferred embodiments of the invention are described below, it is to be understood that the description of these preferred embodiments is provided for purposes of illustration and should not limit the scope of the invention.

１つの局面において、本発明は、生体分子のような物質を固相支持体に固定するための組成物を提供する。この組成物は、固定されるべき物質と、その物質とは反対の電荷を有する物質との複合体、および塩（例えば、培地中に含まれる塩類）を含む。これらの複合体と塩との混合による予想外の効果で、固定されるべき物質が、固相支持体に簡便に固定されることが見いだされた。このような固定による効果は、例えば、（ｉ）固定後の物質の拡散が徐放であること、および（ｉｉ）固定後の物質が細胞親和性を保つか改善されていることなどが挙げられる。本発明の組成物は、ａ）正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体；およびｂ）塩、を含む。ここで、固定を目的とする物質は、正に荷電した物質および負に荷電した物質のいずれでも、あるいはその両方でもよい。   In one aspect, the present invention provides a composition for immobilizing a substance such as a biomolecule to a solid support. The composition includes a complex of a substance to be fixed and a substance having a charge opposite to that substance, and a salt (for example, salts contained in the medium). It has been found that the substance to be immobilized can be simply immobilized on a solid support by an unexpected effect of mixing these complexes and salts. The effects of such fixation include, for example, (i) that the diffusion of the substance after fixation is sustained release, and (ii) that the substance after fixation maintains or has improved cell affinity. . The composition of the present invention comprises a) a complex of a positively charged substance and a negatively charged substance; and b) a salt. Here, the substance intended for fixation may be either a positively charged substance or a negatively charged substance, or both.

１つの好ましい実施形態において、正に荷電した物質および負に荷電した物質の少なくとも一方は、細胞親和性を有する。ある物質の細胞親和性は、その物質と細胞とを混合したときに、その物質が存在しないときに比べて、その細胞の生存が維持されるか否かを評価することによって判断することができる。そのような細胞の生存の維持は、細胞の種々のパラメータを測定することによって具体的に判断することができる。好ましくは、細胞親和性を有する物質は、その細胞の生存を改善することが有利であり得る。   In one preferred embodiment, at least one of the positively charged substance and the negatively charged substance has cytophilicity. The cell affinity of a substance can be determined by assessing whether the cell remains viable when the substance is mixed with cells compared to when the substance is not present. . The maintenance of the survival of such cells can be specifically determined by measuring various parameters of the cells. Preferably, a substance having cytophilicity may be advantageous to improve the survival of the cell.

１つの好ましい実施形態において、正に荷電した物質および負に荷電した物質の両方が細胞親和性を有することが有利である。このような場合、両方の物質が複合体を形成したときにも細胞親和性を喪失しないことが好ましいがそれに限定されない。   In one preferred embodiment, it is advantageous that both positively charged and negatively charged substances have cytophilic properties. In such a case, it is preferable not to lose the cell affinity even when both substances form a complex, but it is not limited thereto.

１つの好ましい実施形態において、正に荷電した物質および負に荷電した物質の少なくとも一方は、生体分子であり得る。ここで、この生体分子が固定の目的の対象であってもよいし、そうでなくてもよい。   In one preferred embodiment, at least one of the positively charged substance and the negatively charged substance can be a biomolecule. Here, this biomolecule may or may not be the target for fixation.

本発明の好ましい実施形態において使用され得るそのような生体分子としては、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなど）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡなど）、ペプチド、脂質、糖、有機低分子（例えば、コンビナトリアルケミストリのライブラリーメンバー）、およびこれらの複合体（例えば、糖タンパク質、糖脂質、核酸ペプチド、リポタンパク質などが含まれるがそれらに限定されない）が挙げられるがそれらに限定されない。   Such biomolecules that can be used in preferred embodiments of the present invention include DNA (eg, genomic DNA, cDNA, etc.), RNA (eg, mRNA, etc.), peptides, lipids, sugars, small organic molecules (eg, combinatorial). Chemistry library members), and complexes thereof (for example, but not limited to, glycoproteins, glycolipids, nucleic acid peptides, lipoproteins, etc.).

１つの特定の実施形態では、本発明において固定されるべき生体分子は、ＤＮＡのような遺伝子コード分子であり得る。本発明において達成された固定方法を用いることによって、ＤＮＡがトランスフェクトのような遺伝子導入のための処置がされるときに、処置の完了に必要な時間（例えば、約１５分から約３０分程度）、継続して徐放が起こることによって、そのような分子の導入が効率よく行われるという効果が達成された。このような徐放効果は、従来の固定方法では達成されなかったか、十分ではなかったことから、このような効果は、本発明の特筆すべき効果として挙げることができる。また、本発明の組成物は、固定された後に、細胞に対する親和性が保持されるかあるいは改善され、特に、トランスフェクションのような遺伝子の導入において従来の固定方法よりも効率よくかつ細胞に対するダメージなしにそのような導入が行われることが見いだされた。   In one particular embodiment, the biomolecule to be immobilized in the present invention can be a gene encoding molecule such as DNA. By using the fixing method achieved in the present invention, when DNA is treated for gene transfer such as transfection, the time required to complete the treatment (for example, about 15 to about 30 minutes) As a result of continuous sustained release, the effect of efficiently introducing such molecules was achieved. Since such a sustained release effect has not been achieved or is not sufficient by the conventional fixing method, such an effect can be mentioned as a remarkable effect of the present invention. In addition, the composition of the present invention retains or improves the affinity for cells after being fixed, and in particular, it is more efficient than conventional fixing methods in introducing genes such as transfection, and damages to cells. It was found that such an introduction could be made without.

本発明の好ましい実施形態において、固定されるべき負に荷電した物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ペプチド及びその複合体のような生体分子でもよく、アニオン性ポリマー、アニオン性脂質のように生体分子でなくてもよい。   In a preferred embodiment of the present invention, the negatively charged substance to be immobilized may be a biomolecule such as DNA, RNA, PNA, peptide and complex thereof, or a biomolecule such as an anionic polymer or anionic lipid. It does not have to be.

本発明の好ましい実施形態において、固定されるべき正に荷電した物質は、生体分子でもよく、生体分子でなくてもよく、例えば、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質ポリＬリシンなど合成ポリペプチドもしくはそれらの誘導体などであり得る。本発明の好ましい実施形態において、正に荷電した物質としては、例えば、ポリイミンポリマー、ポリＬリシン、合成ポリペプチドもしくはそれらの誘導体などのトランスフェクション試薬などが挙げられるがそれらに限定されない。   In a preferred embodiment of the present invention, the positively charged substance to be immobilized may or may not be a biomolecule, such as a synthetic polypeptide such as a cationic polymer, a cationic lipid poly-L-lysine or the like. Or a derivative thereof. In a preferred embodiment of the present invention, positively charged substances include, but are not limited to, transfection reagents such as polyimine polymers, poly L-lysine, synthetic polypeptides or derivatives thereof.

固相上のトランスフェクションを目的とした特定の実施形態において、固定されるべき物質として負に荷電したＤＮＡが選択され、その複合体パートナーとしてはポリイミンポリマーのような正に荷電したＤＮＡが選択されることが好ましい。この場合、塩としては、細胞に親和性のある塩（例えば、培地に用いられる塩類、緩衝液中で用いられる塩類など）が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、トランスフェクションを目的とする場合は、培地または緩衝液中に含まれる塩類すべての組み合わせを用いることが有利であり得る。このような塩類の組み合わせは、通常細胞にとって好ましい組み合わせであるからである。そのような培地の例示としては、例えば、ダルベッコＭＥＭ、ＨＡＭ１２培地、αＭＥＭ培地、ＲＰＭ１６４０（例えば、ニチレイから市販）が挙げられるがそれらに限定されない。そのような培地に含まれる塩類としては、例えば、塩化カルシウム、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。そのような塩の濃度は、当業者が適宜選択して調整することができるが、好ましくは、細胞の浸透圧とほぼ等しいことが有利であり得る。   In a specific embodiment intended for transfection on a solid phase, a negatively charged DNA is selected as the substance to be immobilized and a positively charged DNA such as a polyimine polymer is selected as its complex partner It is preferred that In this case, examples of the salt include, but are not limited to, salts having affinity for cells (for example, salts used in a culture medium, salts used in a buffer solution, and the like). Preferably, for transfection purposes, it may be advantageous to use a combination of all the salts contained in the medium or buffer. This is because such a combination of salts is usually a preferable combination for cells. Examples of such a medium include, but are not limited to, Dulbecco MEM, HAM12 medium, αMEM medium, and RPM1640 (for example, commercially available from Nichirei). Examples of salts contained in such a medium include calcium chloride, potassium chloride, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium chloride, sodium chloride, monosodium phosphate, and disodium phosphate. It is not limited to. The concentration of such a salt can be appropriately selected and adjusted by those skilled in the art, but it may be advantageous that it is preferably approximately equal to the osmotic pressure of the cell.

好ましい実施形態では、固定される生体分子は、細胞に導入され、その細胞内で生物学的活性（例えば、薬効、酵素、シグナル伝達、遺伝子発現など）を発揮することが有利であり得る。遺伝子発現が目的とされる場合には、生体分子はその遺伝子をコードする配列を含むＤＮＡであり得る。シグナル伝達が目的とされる場合には、生体分子はシグナル伝達刺激因子（例えば、サイトカイン、特定のリガンドなど）などであり得る。薬効が目的とされる場合は、生体分子は薬効を有する化学物質であり得る。そのような薬効を有する化学物質としては、例えば、中枢神経系用薬；末梢神経用剤；感覚器官用薬；循環器官用薬；呼吸器官用薬；消化器官用薬；ホルモン剤；泌尿生殖器官および肛門用薬；外皮用薬；歯科口腔用剤；その他の個々の器官系用薬；ビタミン剤；滋養強壮薬；血液および体液用薬；人工透析用薬；その他の代謝性医薬品（例えば、臓疾患用剤、解毒剤、習慣性中毒用剤、痛風治療剤、酵素製剤、糖尿病用剤、他に分類されない代謝性薬など）；細胞賦活用剤；腫瘍用薬；放射性医薬品；アレルギー用薬；抗生物質製剤；化学療法剤；生物学的製剤；調剤用薬；診断用薬；体外診断用医薬品；分類されない治療を主目的としない薬剤；ならびに麻薬などが挙げられるがそれらに限定されない。   In a preferred embodiment, it may be advantageous that the immobilized biomolecule is introduced into a cell and exerts biological activity (eg, medicinal effects, enzymes, signal transduction, gene expression, etc.) within the cell. When gene expression is intended, the biomolecule can be DNA containing the sequence encoding the gene. When signal transduction is intended, the biomolecule can be a signal transduction stimulator (eg, cytokine, specific ligand, etc.) and the like. When a medicinal effect is intended, the biomolecule can be a chemical substance having a medicinal effect. Examples of such chemical substances having a medicinal effect include drugs for central nervous system; drugs for peripheral nerves; drugs for sensory organs; drugs for cardiovascular organs; drugs for respiratory organs; drugs for digestive organs; And anal drugs; skin drugs; dental and oral drugs; other individual organ system drugs; vitamins; nourishing tonics; drugs for blood and body fluids; drugs for artificial dialysis; other metabolic drugs (eg viscera) Disease agents, antidote agents, addictive addiction agents, gout treatment agents, enzyme preparations, antidiabetic agents, metabolic drugs not classified elsewhere); cell activating agents; tumor drugs; radiopharmaceuticals; allergy drugs; Antibiotics; chemotherapeutics; biologicals; pharmaceuticals; diagnostics; in vitro diagnostics; drugs that are not primarily targeted for unclassified treatments; and narcotics, but are not limited to these.

医薬としての使用を目的とする場合は、本発明の組成物において含まれる複合体および塩は、薬学的に受容可能であることが好ましい。   When intended for use as a medicament, the complexes and salts included in the compositions of the present invention are preferably pharmaceutically acceptable.

別の局面において、本発明はまた、目的の物質が固定されたデバイスを提供する。このデバイスでは、目的の物質（例えば、ＤＮＡのような生体分子）と、その物質とは反対の電荷を有する物質との複合体、および塩（例えば、培地中に含まれる塩類）が混合されその固相支持体に固定されている。これらの複合体と塩との混合による予想外の効果で、固定されるべき物質が、固相支持体に簡便に固定されることが見いだされた。このような固定による効果により、本発明のデバイスは、例えば、（ｉ）固体支持体上に固定された物質の徐放性を有し、および／または（ｉｉ）固定された物質が細胞親和性を保つかまたは改善されていることなどが達成される。従って、本発明のデバイスは、細胞などの生体またはその一部を用いたアッセイなどに用いられるマイクロタイタープレート、アレイ（チップ）などの形態として提供され、固定されるべき物質（活性成分、発現遺伝子をコードするＤＮＡなど）が徐放されることおよび／または細胞親和性が保持されることが所望されるアッセイなどにおいて有用である。あるいは、ある有効成分が徐放されることが好ましい場合において、医薬送達媒体として使用され得る。そのような場合は、複合体を構成する物質、塩および固相支持体は、生体適合性であり、好ましくは薬学的に受容可能であることが所望される。従って、本発明のデバイスは、ａ）正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体；ｂ）塩；およびｃ）その複合体とその塩とが（好ましくは混合されて）固定された固相支持体を含む。ここで、目的の物質は、上記正に荷電した物質であっても、負に荷電した物質であってもその両方であってもよい。あるいは、形成された複合体自体が目的の物質であってもよい。   In another aspect, the present invention also provides a device having a target substance immobilized thereon. In this device, a complex of a target substance (for example, a biomolecule such as DNA) and a substance having a charge opposite to that of the substance, and a salt (for example, a salt contained in a medium) are mixed and the device is mixed. Fixed to a solid support. It has been found that the substance to be immobilized can be simply immobilized on a solid support by an unexpected effect of mixing these complexes and salts. Due to the effect of such immobilization, the device of the present invention has, for example, (i) a sustained release property of the substance immobilized on the solid support, and / or (ii) the immobilized substance has cytophilicity. Keeping or improving things is achieved. Therefore, the device of the present invention is provided as a form of a microtiter plate, an array (chip) or the like used for an assay using a living body such as a cell or a part thereof, and the substance (active component, expressed gene) to be fixed. Is useful in assays where it is desired that sustained release of DNA and / or cell affinity is desired. Alternatively, it can be used as a pharmaceutical delivery vehicle in cases where it is preferred that an active ingredient be released slowly. In such cases, it is desirable that the materials, salts, and solid supports that make up the complex are biocompatible, and preferably pharmaceutically acceptable. Thus, the device of the present invention has a) a positively charged and negatively charged substance complex; b) a salt; and c) the complex and its salt are fixed (preferably mixed). A solid support. Here, the target substance may be the positively charged substance, the negatively charged substance, or both. Alternatively, the formed complex itself may be the target substance.

本発明のデバイスの好ましい実施形態において、正に荷電した物質および負に荷電した物質の少なくとも一方は、細胞親和性を有する。好ましくは、細胞親和性を有する物質は、その細胞の生存を改善し得るがそれに限定されない。より好ましくは、正に荷電した物質および負に荷電した物質の両方が細胞親和性を有することが有利である。このような場合、両方の物質が複合体を形成したときにも細胞親和性を喪失しないことがさらに好ましいがそれに限定されない。   In a preferred embodiment of the device of the present invention, at least one of a positively charged substance and a negatively charged substance has cytophilicity. Preferably, the substance having cell affinity can improve the survival of the cell, but is not limited thereto. More preferably, it is advantageous that both positively charged and negatively charged substances have cytophilic properties. In such a case, it is more preferable that both the substances do not lose their cell affinity when they form a complex, but the present invention is not limited thereto.

本発明のデバイスの好ましい実施形態において使用され得るそのような生体分子としては、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡ／ｃＤＮＡライブラリーのメンバーなど）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、またはＲＮＡｉなど）、ペプチド（例えば、プロテオミクスライブラリーのメンバー）、脂質、糖、有機低分子（例えば、コンビナトリアルケミストリのライブラリーメンバー）、およびこれらの複合体（例えば、糖タンパク質、糖脂質、核酸ペプチド組成物、リポタンパク質などが含まれるがそれらに限定されない）、薬剤などが挙げられるがそれらに限定されない。   Such biomolecules that can be used in preferred embodiments of the device of the present invention include DNA (eg, genomic DNA, cDNA, or members of a genomic DNA / cDNA library), RNA (eg, mRNA, RNAi, etc.) ), Peptides (eg, proteomics library members), lipids, sugars, small organic molecules (eg, combinatorial chemistry library members), and complexes thereof (eg, glycoproteins, glycolipids, nucleic acid peptide compositions, Including, but not limited to, lipoproteins and the like) and drugs.

本発明のデバイスの好ましい実施形態では、正に荷電した物質および／または負に荷電した物質および／または塩としては、本発明の組成物の好ましい実施形態において列挙される物質であってもよいが、それに限定されない。そのような物質および／または塩は、目的とする物質の種類または性質に応じて適宜変更することができる。あるいは、それらの物質および／または塩は、固相支持体の種類に応じて当業者が適切に選択することができる。そのような適切な物質／塩の選択は、おのおのがすでに選択した固相支持体の種類について適切な性質（例えば、細胞親和性）を有していることが公知であるようなものを選択することができるし、あるいは、デバイスの調製の前に予備的な試験を行うことによって確認してもよい。   In a preferred embodiment of the device of the present invention, the positively charged substance and / or the negatively charged substance and / or salt may be those listed in the preferred embodiments of the composition of the present invention. Not limited to that. Such a substance and / or salt can be appropriately changed according to the kind or property of the target substance. Alternatively, those substances and / or salts can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of the solid support. The selection of such an appropriate substance / salt is such that each is known to have appropriate properties (eg, cell affinity) for the type of solid support already selected. Or it may be confirmed by conducting preliminary tests prior to device preparation.

本発明のデバイスにおいて使用される固相支持体は、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属、天然ポリマーおよび合成ポリマーからなる群より選択される材料を含むがそれに限定されない。   The solid support used in the device of the present invention includes, but is not limited to, a material selected from the group consisting of glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal, natural polymer and synthetic polymer.

本発明のデバイスの１つの好ましい実施形態において、固相支持体は、コーティングによって処理されていてもよい。コーティングは、ポリ−Ｌ−リジン、シラン、ＡＰＳ、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂、金属など、通常固相支持体において使用することが企図される物質を利用して行うことができる。好ましい実施形態では、細胞培養において利用されるコーティング剤（例えば、ポリ−Ｌ−リジン、シラン、ＡＰＳ、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂、金属）などを使用することができる。   In one preferred embodiment of the device of the present invention, the solid support may be treated with a coating. The coating can be performed using a substance that is usually intended for use in a solid support, such as poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin, metal, and the like. In a preferred embodiment, a coating agent (for example, poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin, metal) used in cell culture can be used.

本発明のデバイスの１つの好ましい実施形態では、固相支持体はチップであってもよい。本発明のデバイスにおける固相支持体がチップである場合、好ましくは、複合体はチップ上にアレイ状に配列される。このような場合、本発明のデバイスは、「アレイ」とも称され得る。   In one preferred embodiment of the device of the present invention, the solid support may be a chip. When the solid support in the device of the present invention is a chip, the composites are preferably arranged in an array on the chip. In such cases, the device of the present invention may also be referred to as an “array”.

本発明のデバイスの１つの好ましい実施形態では、生体分子は、細胞に導入された後、生物学的活性を有するものであることが所望され得る。このような場合、生物学的活性としては、例えば、薬効、遺伝子発現、酵素活性、シグナル伝達活性などが挙げられるがそれらに限定されない。遺伝子発現が目的とされる場合には、生体分子はその遺伝子をコードする配列を含むＤＮＡであり得る。シグナル伝達が目的とされる場合には、生体分子はシグナル伝達刺激因子（例えば、サイトカイン、特定のリガンドなど）などであり得る。薬効が目的とされる場合は、生体分子は薬効を有する化学物質であり得る。薬効を有する化合物は、本明細書において別の場所において記載されるように種々の化合物の中から選択することができる。   In one preferred embodiment of the device of the present invention, it may be desirable for the biomolecule to be biologically active after being introduced into a cell. In such a case, examples of the biological activity include, but are not limited to, drug efficacy, gene expression, enzyme activity, signal transduction activity, and the like. When gene expression is intended, the biomolecule can be DNA containing the sequence encoding the gene. When signal transduction is intended, the biomolecule can be a signal transduction stimulator (eg, cytokine, specific ligand, etc.) and the like. When a medicinal effect is intended, the biomolecule can be a chemical substance having a medicinal effect. The medicinal compound can be selected from a variety of compounds as described elsewhere herein.

固相上のトランスフェクションを目的とした１つの特定の実施形態において、固定されるべき物質として負に荷電したＤＮＡが選択され、その複合体パートナーとしてはポリイミンポリマーのような正に荷電したＤＮＡが選択されることが好ましい。この場合、塩としては、細胞に親和性のある塩（例えば、培地に用いられる塩類、緩衝液中で用いられる塩類など）が挙げられるがそれらに限定されない。好ましい実施形態において使用される固相支持体の材料としては、例えば、スライドガラス（ポリ−Ｌ−リジン、シラン、ＡＰＳ、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂、好ましくはポリ−Ｌ−リジンなどによってコーティングされる）、ポリスチレン樹脂などが挙げられるがそれらに限定されない。ポリ−Ｌ−リジン、シラン、ＡＰＳ、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂などでコーティングされた固相支持体が好ましい。細胞との親和性、トランスフェクションの効率に好ましい効果を有することが知られているからである。   In one particular embodiment intended for transfection on a solid phase, a negatively charged DNA is selected as the substance to be immobilized and a positively charged DNA such as a polyimine polymer as its complex partner Is preferably selected. In this case, examples of the salt include, but are not limited to, salts having affinity for cells (for example, salts used in a culture medium, salts used in a buffer solution, and the like). As a material of the solid support used in the preferred embodiment, for example, a glass slide (poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin, preferably poly-L-lysine is coated). ), Polystyrene resin and the like, but are not limited thereto. A solid support coated with poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin or the like is preferred. This is because it is known to have favorable effects on affinity with cells and efficiency of transfection.

本発明のデバイスの１つの特定の実施形態では、固定されるべき生体分子は、ＤＮＡのような遺伝子コード分子であり得る。本発明のデバイスを用いることによって、ＤＮＡがトランスフェクトのような遺伝子導入のための処置がされるときに、処置の完了に必要な時間（例えば、約１５分から約３０分程度）、継続して徐放が起こることによって、そのような分子の導入が効率よく行われるという効果が達成された。このような徐放効果は、従来の固定方法では達成されなかったか、十分ではなかったことから、このような効果は、本発明の特筆すべき効果として挙げることができる。また、本発明のデバイスは、細胞に対する親和性が保持されるかあるいは改善され、特に、トランスフェクションのような遺伝子の導入において従来のデバイスよりも効率よくかつ細胞に対するダメージなしにそのような導入が行われることが見いだされた。   In one particular embodiment of the device of the present invention, the biomolecule to be immobilized can be a gene encoding molecule such as DNA. By using the device of the present invention, when DNA is treated for gene transfer such as transfection, the time required for completion of the treatment (for example, about 15 minutes to about 30 minutes) is continued. The effect of the efficient introduction of such molecules was achieved by the sustained release. Since such a sustained release effect has not been achieved or is not sufficient by the conventional fixing method, such an effect can be mentioned as a remarkable effect of the present invention. Also, the device of the present invention retains or improves the affinity for cells, and in particular, such introduction of genes such as transfection is more efficient than conventional devices and without damage to the cells. It was found to be done.

本発明のデバイスは、医薬デバイスとして使用される場合、複合体、固相支持体および塩は薬学的に受容可能であることが好ましい。   When the device of the present invention is used as a pharmaceutical device, the complex, solid support and salt are preferably pharmaceutically acceptable.

さらに別の局面において、本発明は、物質を固相支持体に固定する方法を提供する。このような物質の固定方法では、固定されるべき物質と、その物質とは反対の電荷を有する物質との複合体、および塩（例えば、培地中に含まれる塩類）が提供され、これらの複合体と塩との混合による予想外の効果で、固定されるべき物質が、固相支持体に簡便に、かつ、特殊な固定条件を選択することも必要とせずに固定されることが見いだされた。本発明の固定方法による効果により、（ｉ）固体支持体上に固定された物質の徐放性を有し、および／または（ｉｉ）固定された物質が細胞親和性を保つかまたは改善されていることなどが挙げられる。従って、本発明の固定方法は、ａ）固相支持体を提供する工程；ｂ）正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体を提供する工程；ｃ）塩と上記複合体との混合物を提供する工程；およびｄ）上記混合物を固相支持体に付着させる工程、を包含する。ここで、目的の物質は、上記正に荷電した物質であっても、負に荷電した物質であってもその両方であってもよい。あるいは、形成された複合体自体が目的の物質であってもよい。   In yet another aspect, the present invention provides a method for immobilizing a substance on a solid support. Such a method of immobilizing a substance provides a complex of the substance to be immobilized and a substance having a charge opposite to that of the substance, and a salt (for example, a salt contained in the medium). Due to the unexpected effect of mixing body and salt, it has been found that the substance to be immobilized can be immobilized on the solid support simply and without the need to select special fixation conditions. It was. Due to the effect of the immobilization method of the present invention, (i) the substance immobilized on the solid support has a sustained release property and / or (ii) the immobilized substance retains or improves the cell affinity. And so on. Therefore, the immobilization method of the present invention comprises: a) providing a solid support; b) providing a complex of a positively charged substance and a negatively charged substance; c) a salt and the above complex Providing a mixture of: and d) attaching the mixture to a solid support. Here, the target substance may be the positively charged substance, the negatively charged substance, or both. Alternatively, the formed complex itself may be the target substance.

ここで、上記固相支持体、上記複合体および上記塩の提供は、当業者の技術常識の範囲内にあり、当該分野において周知の技術を利用して当業者が容易に実施することができる。例えば、固相支持体は、市販のものを購入してもよいし（例えば、スライドガラス、マイクロタイタープレートなど）、塩、目的の物質の複合体パートナーもまた、市販のものを購入してもよい。あるいは、化学的または生化学的にそのような固相支持体、塩または目的の物質の複合体パートナーを合成または加工してもよい。塩と複合体との混合は、塩と複合体との相互作用が発揮されるような形態であればどのような方法を用いてもよい。本発明の固定方法は、アッセイ用のデバイスまたは医薬送達デバイスを作製する際に使用することができ、その有用性は広い範囲に及ぶ。   Here, the provision of the solid support, the complex, and the salt is within the scope of technical common knowledge of those skilled in the art, and can be easily performed by those skilled in the art using techniques well known in the art. . For example, a solid support may be purchased commercially (for example, a glass slide or a microtiter plate), and a complex partner of a salt or a target substance may also be purchased commercially. Good. Alternatively, such solid phase supports, salts or complex partners of the substance of interest may be synthesized or processed chemically or biochemically. For mixing the salt and the complex, any method may be used as long as the interaction between the salt and the complex is exhibited. The immobilization method of the present invention can be used in making an assay device or a pharmaceutical delivery device, and its usefulness is in a wide range.

本発明の固定方法において、塩と複合体との混合物を付着する工程は、どのような技術を用いてもよく、手動（ピペッティングなど）でも、自動（例えば、インクジェットプリンターなどのプリンター技術）でもよい。好ましくは、混合物はインクジェットプリンターのプリントピンを用いて付着させることができる。   In the fixing method of the present invention, any technique may be used for attaching the mixture of the salt and the complex, either manually (pipetting or the like) or automatically (for example, printer technology such as an ink jet printer). Good. Preferably, the mixture can be deposited using print pins of an ink jet printer.

本発明の方法の好ましい実施形態において、正に荷電した物質および負に荷電した物質の少なくとも一方は、細胞親和性を有する。好ましくは、細胞親和性を有する物質は、その細胞の生存を改善し得るが本発明はそれに限定されない。より好ましくは、正に荷電した物質および負に荷電した物質の両方が細胞親和性を有する。このような場合、両方の物質が複合体を形成したときにも細胞親和性を喪失しないことがさらに好ましいが、本発明はそれに限定されない。   In a preferred embodiment of the method of the present invention, at least one of a positively charged substance and a negatively charged substance has cytophilicity. Preferably, a substance having cell affinity can improve the survival of the cell, but the present invention is not limited thereto. More preferably, both positively charged and negatively charged substances have cytophilic properties. In such a case, it is more preferable not to lose the cell affinity even when both substances form a complex, but the present invention is not limited thereto.

本発明の方法の１つの好ましい実施形態において固定が企図される生体分子としては、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡ／ｃＤＮＡライブラリーのメンバーなど）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉなど）、ペプチド（例えば、プロテオミクスライブラリーのメンバー）、脂質、糖、有機低分子（例えば、コンビナトリアルケミストリのライブラリーメンバー）、およびこれらの複合体（例えば、糖タンパク質、糖脂質、核酸ペプチド、リポタンパク質などが含まれるがそれらに限定されない）、薬剤などが挙げられるがそれらに限定されない。   Biomolecules intended for immobilization in one preferred embodiment of the method of the present invention include DNA (eg, genomic DNA, cDNA, or a member of a genomic DNA / cDNA library), RNA (eg, mRNA or RNAi, etc.) ), Peptides (eg, proteomics library members), lipids, sugars, small organic molecules (eg, combinatorial chemistry library members), and complexes thereof (eg, glycoproteins, glycolipids, nucleic acid peptides, lipoproteins) Such as, but not limited to), and the like.

本発明の方法の１つの好ましい実施形態では、正に荷電した物質および／または負に荷電した物質および／または塩としては、本発明の組成物の好ましい実施形態において列挙される物質であってもよいが、それに限定されない。そのような物質および／または塩は、目的とする物質の種類または性質に応じて適宜変更することができる。あるいは、それらの物質および／または塩は、固相支持体の種類に応じて当業者が適切に選択することができる。そのような適切な物質／塩の選択は、おのおのがすでに選択した固相支持体の種類について適切な性質（例えば、細胞親和性）を有していることが公知であるようなものを選択することができるし、あるいは、本発明の方法を実施する前に予備的な試験を行うことによって確認してもよい。   In one preferred embodiment of the method of the invention, the positively charged substance and / or the negatively charged substance and / or salt may be substances listed in preferred embodiments of the composition of the invention. Good but not limited to it. Such a substance and / or salt can be appropriately changed according to the kind or property of the target substance. Alternatively, those substances and / or salts can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of the solid support. The selection of such an appropriate substance / salt is such that each is known to have appropriate properties (eg, cell affinity) for the type of solid support already selected. Or it may be confirmed by performing a preliminary test before carrying out the method of the invention.

本発明の方法において使用される固相支持体は、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属、天然ポリマーおよび合成ポリマーからなる群より選択される材料を含むがそれに限定されない。このような固相支持体は、本発明の方法において、新たに調製することもできるし、リサイクルすることもできる。好ましくは、コーティングすることが有利であり得る。コーティングは特に、リサイクリングを目的とする場合には有利であり得る。   The solid support used in the method of the present invention includes, but is not limited to, a material selected from the group consisting of glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal, natural polymer and synthetic polymer. Such a solid support can be newly prepared or recycled in the method of the present invention. Preferably, it may be advantageous to coat. The coating can be particularly advantageous when intended for recycling.

本発明の方法では、使用される固相支持体がコーティングによって処理されたものでもよいし、方法の実施の際に固相支持体をコーティングする工程を包含していてもよい。このようなコーティングに使用される物質としては、ポリ−Ｌ−リジン、シラン、ＡＰＳ、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂、金属などあるいはそれらの混合物を用いることができるが、それらに限定されず、通常固相支持体において使用することが企図される物質を利用して行うことができる。   In the method of the present invention, the solid support to be used may have been treated by coating, or may include a step of coating the solid support in carrying out the method. As a material used for such a coating, poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin, metal, or a mixture thereof can be used, but is not limited thereto, and is usually solid. This can be done utilizing materials intended for use in the phase support.

本発明の方法の好ましい実施形態では、固相支持体はチップであり得る。本発明の方法は、チップのような小型および集積されたデバイスのようなものを製造する際にも適用可能であり、その有用性は広範な範囲に及ぶ。この場合、チップ上に固定される物質は、アレイ状に配置されることが好ましい。このようにアレイ状に配置される場合、そのデバイスは「アレイ」とも呼ばれる。従って、本発明の方法は、生体分子アレイまたは生体分子チップを製造する際に応用することができる。そのような方法によって製造されたチップまたはアレイは、徐放および／または細胞親和性が要求されるチップまたはアレイの用途において使用される場合に特に有用である。本発明の方法はまた、高い集積度が必要とされるアレイにおいて、簡便な固定従って簡便にかつ細かいスポッティングが必要とされる場合において特に有用性が高い。   In a preferred embodiment of the method of the present invention, the solid support can be a chip. The method of the present invention can also be applied in the production of small and integrated devices such as chips, and its usefulness extends over a wide range. In this case, the substances fixed on the chip are preferably arranged in an array. When arranged in this manner, the device is also referred to as an “array”. Therefore, the method of the present invention can be applied when manufacturing a biomolecule array or a biomolecule chip. Chips or arrays produced by such methods are particularly useful when used in chip or array applications where sustained release and / or cell affinity is required. The method of the present invention is also particularly useful in arrays where a high degree of integration is required, where simple fixation and thus simple and fine spotting is required.

本発明の方法の１つの好ましい実施形態では、生体分子は、細胞に導入された後、生物学的活性を有するものであることが所望され得る。このような場合、生物学的活性としては、例えば、薬効、遺伝子発現、酵素活性、シグナル伝達活性などが挙げられるがそれらに限定されない。遺伝子発現が目的とされる場合には、生体分子はその遺伝子をコードする配列を含むＤＮＡであり得る。シグナル伝達が目的とされる場合には、生体分子はシグナル伝達刺激因子（例えば、サイトカイン、特定のリガンドなど）などであり得る。薬効が目的とされる場合は、生体分子は薬効を有する化学物質であり得る。薬効を有する化合物は、本明細書において別の場所において記載されるように種々の化合物の中から選択することができる。   In one preferred embodiment of the method of the present invention, it may be desirable that the biomolecule has biological activity after being introduced into the cell. In such a case, examples of the biological activity include, but are not limited to, drug efficacy, gene expression, enzyme activity, signal transduction activity, and the like. When gene expression is intended, the biomolecule can be DNA containing the sequence encoding the gene. When signal transduction is intended, the biomolecule can be a signal transduction stimulator (eg, cytokine, specific ligand, etc.) and the like. When a medicinal effect is intended, the biomolecule can be a chemical substance having a medicinal effect. The medicinal compound can be selected from a variety of compounds as described elsewhere herein.

このような種々の目的において本発明の方法が使用される場合は、本発明の固定が達成された後に引き続いて上述の工程（例えば、トランスフェクションなどの遺伝子導入、シグナル伝達測定、薬剤送達など）が行われてもよく、あるいは、固定した後一定期間保存された後に上述の工程が行われてもよい。保存される場合は、本発明の方法によって固定された後に、徐放が開始しないような処置（徐放に使用される溶媒とは異なる保存溶媒に浸すか、あるいは、乾燥させるなど）を行うことが好ましい。   When the method of the present invention is used for such various purposes, the above-described steps (for example, gene introduction such as transfection, signal transduction measurement, drug delivery, etc.) are performed after the fixation of the present invention is achieved. Alternatively, the above-described steps may be performed after being fixed and stored for a certain period of time. When preserved, perform a treatment (such as immersing in a preservation solvent different from the solvent used for sustained release or drying) after the fixation by the method of the present invention does not start. Is preferred.

固相上のトランスフェクションを目的とした特定の実施形態において、固定されるべき物質として負に荷電したＤＮＡが選択され、その複合体パートナーとしてはポリイミンポリマーのような正に荷電したＤＮＡが選択されることが好ましい。この場合、塩としては、細胞に親和性のある塩（例えば、培地に用いられる塩類、緩衝液中で用いられる塩類など）が挙げられるがそれらに限定されない。好ましい実施形態において使用される固相支持体の材料としては、例えば、スライドガラス（好ましくはポリ−Ｌ−リジン、シラン、ＡＰＳ、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂などによってコーティングされる）、ポリスチレン樹脂などが挙げられるがそれらに限定されない。ポリ−Ｌ−リジン、シラン、ＡＰＳ、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂などでコーティングされた固相支持体が好ましい。細胞との親和性、トランスフェクションの効率に好ましい効果を有することが知られているからである。このような場合、本発明の方法は、好ましくは、コーティング工程を包含し得る。   In a specific embodiment intended for transfection on a solid phase, a negatively charged DNA is selected as the substance to be immobilized and a positively charged DNA such as a polyimine polymer is selected as its complex partner It is preferred that In this case, examples of the salt include, but are not limited to, salts having affinity for cells (for example, salts used in a culture medium, salts used in a buffer solution, and the like). Examples of the material of the solid support used in the preferred embodiment include a glass slide (preferably coated with poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin, etc.), polystyrene resin, and the like. But not limited to. A solid support coated with poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin or the like is preferred. This is because it is known to have favorable effects on affinity with cells and efficiency of transfection. In such cases, the method of the present invention may preferably include a coating step.

本発明の方法の１つの特定の実施形態では、固定されるべき生体分子は、ＤＮＡのような遺伝子コード分子であり得る。本発明の方法で固定することによって、ＤＮＡがトランスフェクトのような遺伝子導入のための処置がされるときに、処置の完了に必要な時間（例えば、約１５分から約３０分程度）、継続して徐放が起こることによって、そのような分子の導入が効率よく行われるという効果が達成された。このような徐放効果は、従来の固定方法では達成されなかったか、十分ではなかったことから、このような効果は、本発明の特筆すべき効果として挙げることができる。また、本発明の固定方法により、細胞に対する親和性が保持されるかあるいは改善されることから、そのような効果が期待される状態（例えばトランスフェクションのような遺伝子の導入）において従来の方法に対して有利な効果を達成する。   In one particular embodiment of the method of the invention, the biomolecule to be immobilized can be a gene encoding molecule such as DNA. By fixing with the method of the present invention, when DNA is treated for gene transfer such as transfection, the treatment is continued for a time required for completion of the treatment (for example, about 15 to about 30 minutes). As a result of the sustained release, the effect of efficiently introducing such molecules was achieved. Since such a sustained release effect has not been achieved or is not sufficient by the conventional fixing method, such an effect can be mentioned as a remarkable effect of the present invention. In addition, since the affinity for cells is maintained or improved by the immobilization method of the present invention, the conventional method is used in a state where such an effect is expected (for example, gene introduction such as transfection). A beneficial effect is achieved.

本発明の方法では、医薬を処方する際に利用される場合は、使用される物質、塩および固相支持体などの少なくとも一つ、好ましくはそのすべてが薬学的に受容可能であることが好ましい。   In the method of the present invention, when used in formulating a medicament, it is preferable that at least one, preferably all of the substance, salt and solid support used are pharmaceutically acceptable. .

本発明の方法の１つの好ましい実施形態では、複合体を提供する工程は、生体分子を破壊しない条件下で行われる。このような生体分子を破壊しない条件は、当業者であれば、提供されるおのおのの複合体パートナーの種類、複合体形成の他の条件（例えば、ｐＨ、温度など）を考慮することによって適切に選択することができ、あるいは、予備的に適切な条件を試験することによって容易に選択することができる。そのような適切な条件の選択または試験は、当業者の技術常識の範囲内であり、当業者は過度な実験をすることなく決定することができる。   In one preferred embodiment of the method of the present invention, the step of providing the complex is performed under conditions that do not destroy the biomolecule. The conditions that do not destroy such biomolecules are appropriate for those skilled in the art by considering the type of each complex partner provided and other conditions for complex formation (eg, pH, temperature, etc.). It can be selected, or it can be easily selected by preliminarily testing appropriate conditions. The selection or testing of such appropriate conditions is within the common general knowledge of those skilled in the art and can be determined by one skilled in the art without undue experimentation.

本発明の１つの好ましい実施形態において、塩と複合体との混合物の提供は、生体分子を破壊しない条件下で行われ得る。このような生体分子を破壊しない条件は、当業者であれば、提供される複合体および塩の種類、複合体形成の他の条件（例えば、ｐＨ、温度など）を考慮することによって適切に選択することができ、あるいは、予備的に適切な条件を試験することによって容易に選択することができる。そのような適切な条件の選択または試験は、当業者の技術常識の範囲内であり、当業者は過度な実験をすることなく決定することができる。   In one preferred embodiment of the present invention, the provision of the salt and complex mixture can be performed under conditions that do not destroy the biomolecule. Conditions for not destroying such biomolecules are appropriately selected by those skilled in the art by considering the types of complexes and salts provided and other conditions for complex formation (eg, pH, temperature, etc.). Or can be easily selected by preliminarily testing appropriate conditions. The selection or testing of such appropriate conditions is within the common general knowledge of those skilled in the art and can be determined by one skilled in the art without undue experimentation.

本発明の１つの好ましい実施形態において、混合物を固相支持体に付着した後、その混合物中の溶媒を低減または除去する工程をさらに包含することが有利であり得る。そのような溶媒の低減または除去は、自然乾燥、凍結乾燥、乾燥剤を用いた乾燥などが挙げられるがそれらに限定されない。   In one preferred embodiment of the present invention, it may be advantageous to further include the step of reducing or removing the solvent in the mixture after the mixture is attached to the solid support. Such reduction or removal of the solvent includes, but is not limited to, natural drying, freeze drying, drying using a desiccant and the like.

本発明の組成物、デバイスおよび方法は、ヒト用途でも使用され得るが、その他の宿主（例えば、哺乳動物など）を対象として使用されてもよい。従って、本発明の組成物は、農薬として使用されてもよい。   The compositions, devices and methods of the present invention may be used in human applications, but may be used with other hosts (eg, mammals, etc.). Therefore, the composition of the present invention may be used as an agrochemical.

本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら （１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．およびその３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験化学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、当業者は適宜そのような周知文献を当たることにより本発明を実施することができる。     Molecular biological techniques, biochemical techniques, and microbiological techniques used in this specification are well known and commonly used in the art, and are described in, for example, Ausubel F. et al. A. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J et al. (1987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. And its 3rd Edition (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, separate experiment chemistry “Gene Transfer & Expression Analysis Experimental Method” Yodosha, 1997, etc. The present invention can be implemented by hitting such well-known documents.

以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。   The present invention will be described below based on examples, but the following examples are provided for illustrative purposes only. Accordingly, the scope of the present invention is not limited to the detailed description of the invention nor the following examples, but is limited only by the scope of the claims.

以下に本発明の例示を具体的な実施例を提示して示す。以下の実施例において用いられる試薬、支持体などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ、和光純薬などから市販されるものを用いた。   Examples of the present invention are shown below by showing specific examples. With the exception of exceptions, reagents and supports used in the following examples were those commercially available from Sigma, Wako Pure Chemicals, etc.

（実施例１：固定組成物の作製）
本実施例では、目的の物質としてＤＮＡを選択し、ＤＮＡを固相支持体に固定するための組成物を調製した。 (Example 1: Preparation of fixing composition)
In this example, DNA was selected as a target substance, and a composition for immobilizing DNA on a solid support was prepared.

ＤＮＡとしてトランスフェクションのためのプラスミドを調製した。プラスミドとして、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１およびｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１（ともにＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた。これらのプラスミドでは、遺伝子発現はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の制御下にある。プラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１ ｂｌｕｅ、Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ，ＴＸ，ＵＳＡ）中で増幅し増幅したプラスミドＤＮＡを複合体パートナーの一方として用いた。ＤＮＡは、ＤＮａｓｅもＲＮａｓｅも含まない蒸留水中に溶解した。   Plasmid for transfection was prepared as DNA. As plasmids, pEGFP-N1 and pDsRed2-N1 (both BD Biosciences, Clontech, CA, USA) were used. In these plasmids, gene expression is under the control of cytomegalovirus (CMV). Plasmid DNA was obtained from E. coli. Plasmid DNA amplified and amplified in E. coli (XL1 blue, Stratgene, TX, USA) was used as one of the complex partners. DNA was dissolved in distilled water containing neither DNase nor RNase.

複合体の他方のパートナーとして、トランスフェクション試薬を用いた。使用したトランスフェクション試薬は以下の通りである：Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ），ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ），ＴｆｘＴＭ−２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ），ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ），ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ），ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ），ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１-３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＥｘＧｅｎ ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）。   Transfection reagent was used as the other partner of the complex. The transfection reagents used were as follows: Effectene Transfection Reagent (cat. No. 301425, Qiagen, CA, USA), TransFastTM Transfection Reagent (E2431, Promega, WI, USA), TfxTM-20E39, RegentTM-20E39 , WI, USA), SuperFect Transfection Reagent (301305, Qiagen, CA, USA), PolyFect Transfection Reagent (301105, Qiagen, CA, USA), LipofectAMINE 2000 Reagent (11668-019, Citro ration, CA, USA), JetPEI (× 4) conc. (101-30, Polyplus-translation, France) and ExGen 500 (R0511, Fermentas Inc., MD, USA).

これらのＤＮＡプラスミドとトランスフェクション試薬とを、ＤＮａｓｅもＲＮａｓｅも含まない蒸留水、ＮａＣｌ溶液（０．９％）、ＰＢＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコＭＥＭ培地（グルコース（４．５ｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク、京都、日本）添加、１０％仔ウシ血清アルブミン（大日本製薬、大阪、日本）を補充）中に溶解した。   These DNA plasmids and transfection reagents were mixed with distilled water containing neither DNase nor RNase, NaCl solution (0.9%), PBS buffer (Sigma) and Dulbecco's MEM medium (glucose (4.5 g / L), L -Dissolved in glutamine and sodium pyruvate (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) supplemented with 10% calf serum albumin (Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan)).

固相支持体としては、本発明では、スライドガラス、ならびにポリ−Ｌ−リジン、シラン、ＡＰＳ、ＰＬＬまたはＭＡＳでコーティングされたスライドガラス、およびポリスチレン製のマイクロタイタープレートを用いた。   As the solid support, in the present invention, a slide glass, a slide glass coated with poly-L-lysine, silane, APS, PLL, or MAS, and a microtiter plate made of polystyrene were used.

溶解された複合体と塩との混合溶液を、おのおのの固相支持体上にスポッティングし、スポットを自然乾燥させることによって目的の生体分子を固定した。   The mixed solution of the dissolved complex and salt was spotted on each solid phase support, and the target biomolecule was immobilized by naturally drying the spot.

次に、固定された生体分子をＰＢＳに浸すことによって、固定の状況を確認した。確認は、ＰＢＳへの浸潤直後（０分）、５分後、１０分後、１５分後、２０分後、２５分後、３０分後、４０分後、５０分後、６０分後に目視することおよびＤＮＡ定量によって行った。   Next, the state of fixation was confirmed by immersing the immobilized biomolecule in PBS. Confirmation immediately after infiltration with PBS (0 minutes), 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes, 20 minutes, 25 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes, and 60 minutes And by DNA quantification.

（結果）
本発明の複合体と塩との混合物で調整した組成物を使用した例（ＮａＣｌ溶液、ＰＢＳ緩衝液、ダルベッコ培地）では、１５分後でも固定が破壊されていないことが確認されたのに対して、蒸留水で調製した組成物の例では、ＰＢＳの浸した直後に固定が破壊され、ＤＮＡが流出していたことが明らかになった。従って、本発明の方法の物質固定効果は、顕著であることが明らかになった。塩を使用した例のうち、単塩（ＮａＣｌ）では、固定が破壊される時間が比較的早かったが、複合塩を使用した例（ＰＢＳおよびダルベッコＭＥＭ培地）では、単塩よりも効果が持続した。特にダルベッコＭＥＭを使用した例では、その効果は顕著であり、３０分後でも固定の効果が持続した。 (result)
In the example (NaCl solution, PBS buffer solution, Dulbecco medium) using the composition prepared with the mixture of the complex of the present invention and the salt, it was confirmed that the fixation was not broken even after 15 minutes. In the example of the composition prepared with distilled water, it was revealed that the immobilization was broken immediately after soaking in PBS, and the DNA was flowing out. Therefore, it became clear that the substance fixing effect of the method of the present invention is remarkable. Among the examples using salt, the simple salt (NaCl) broke down relatively quickly, but the example using the composite salt (PBS and Dulbecco's MEM medium) lasted longer than the simple salt. did. In particular, in the example using Dulbecco MEM, the effect was remarkable, and the fixing effect was maintained even after 30 minutes.

（実施例２：細胞親和性の確認）
次に、本発明の細胞親和性の効果を確認するために、上記において調製したＤＮＡ固定固相支持体を用いて、細胞のトランスフェクション実験を行った。 (Example 2: Confirmation of cell affinity)
Next, in order to confirm the effect of cell affinity of the present invention, a cell transfection experiment was performed using the DNA-immobilized solid phase support prepared above.

本実施例では、以下の５種類の細胞を利用して、効果を確認した：ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ、ＰＴ−２、Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）、ヒト胚性腎細胞 （ＨＥＫ２９３、ＲＣＢ１６３７、ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，日本）、ＮＩＨ３Ｔ３−３細胞（ＲＣＢ０１５０，ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，日本）、ＨｅＬａ細胞（ＲＣＢ０００７、ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，日本）およびＨｅｐＧ２（ＲＣＢ１６４８、ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，日本）。   In this example, the effects were confirmed using the following five types of cells: human mesenchymal stem cells (hMSCs, PT-2, Cambrex BioScience Walkersville, Inc., MD, USA), human embryonic kidney cells (HEK293, RCB1637, RIKEN Cell Bank, Japan), NIH3T3-3 cells (RCB0150, RIKEN Cell Bank, Japan), HeLa cells (RCB0007, RIKEN Cell Bank, Japan) and HepG2 (RCB1648, RIKEN Cell Bank, Japan).

実施例１においてＤＮＡが固定されたプレートをディッシュに入れ、その上に、上記細胞を含む培地を各々滴下した。その後、プレートを含むディッシュをインキュベーターに移し、３７℃で、５％ＣＯ２の雰囲気下で２日または３日間そのプレートをインキュベートしてトランスフェクトさせた。 The plate on which DNA was fixed in Example 1 was placed in a dish, and the medium containing the cells was dropped onto the plate. The dish containing the plate was then transferred to an incubator and transfected by incubating the plate for 2 or 3 days at 37 ° C. in an atmosphere of 5% CO 2 .

（遺伝子発現の観察）
遺伝子発現の観察は、各々の遺伝子発現の発現産物（ＥＦＰ、ＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ２）が発する蛍光を観察することによって行った。蛍光の観察には、蛍光顕微鏡（ＩＸ−７１、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＰＲＯＭＡＲＫＥＴＩＮＧ Ｉｎｃ．，日本）を用いた。細胞は、反応後にパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定を行うこと（４％ ＰＦＡ、室温で１０分間処理）により、観察した。 (Observation of gene expression)
The gene expression was observed by observing the fluorescence emitted from the expression products (EFP, EGFP and DsRed2) of each gene expression. For observation of fluorescence, a fluorescence microscope (IX-71, Olympus PROMARKETING Inc., Japan) was used. The cells were observed by performing paraformaldehyde (PFA) fixation after the reaction (4% PFA, treated at room temperature for 10 minutes).

（結果）
図１にトランスフェクションの結果の一部を示す。図１は、複合体化していないＤＮＡ（上）と、正に荷電した物質と複合体化させたＤＮＡ（下、ＮＰ１０処理）とを対比した結果を示す。固相に対して複合体を添加した直後（０分）ならびに、添加の１分後、５分後および１０分後に細胞含有液を加えた後のトランスフェクションの様子を示す。 (result)
FIG. 1 shows a part of the transfection results. FIG. 1 shows the result of comparing uncomplexed DNA (top) with DNA complexed with a positively charged substance (bottom, NP10 treatment). The state of transfection is shown immediately after adding the complex to the solid phase (0 minute) and after adding the cell-containing solution 1 minute, 5 minutes and 10 minutes after the addition.

この結果から明らかなように、複合体の組成物および塩の固相支持体に固定された系では、組成物は固定され、ＤＮＡが徐放されることも明らかになった。   As is apparent from the results, in the system in which the complex composition and the salt were immobilized on a solid support, the composition was immobilized and the DNA was released gradually.

また、このほかの本発明の塩を含む混合物が固定された固相支持体を使用した場合はいずれも、トランスフェクションが起こっていたことが判明した。これは、トランスフェクションが起こるために必要なＤＮＡの細胞への移入が、いずれの例でも起こっていたことを示す。従って、本発明の組成物は、細胞親和性を維持または改善していたことになる。また、実施例１における放出のデータに加え、トランスフェクションが起こっていたことは固定された物質が徐々に放出されたことも間接的に示すことになる。   Further, it was found that transfection occurred in any case where a solid support on which a mixture containing the salt of the present invention was immobilized was used. This indicates that the transfer of DNA required for transfection to occur in the cells occurred in all cases. Therefore, the composition of the present invention maintained or improved cell affinity. Further, in addition to the release data in Example 1, the fact that transfection had occurred indirectly indicates that the immobilized substance was gradually released.

このような効果は、塩を用いない溶液では、観察されなかった。従って、この結果は、本発明の効果が顕著であることを示す。特に、固定の際に塩を培地において利用した系では、単塩を用いた系よりもトランスフェクション効率が高かったことから、固定の際に細胞に適合する塩類の組み合わせを用いることが、細胞親和性の維持または改善にも適切であることがわかる。   Such an effect was not observed in a solution without using salt. Therefore, this result shows that the effect of the present invention is remarkable. In particular, the system using salt in the medium during fixation had higher transfection efficiency than the system using a single salt, so it was recommended to use a combination of salts suitable for the cells during fixation. It can be seen that it is also suitable for maintaining or improving sex.


（実施例３：複合体パートナーと塩との比率の影響）
次に、複合体パートナーであるトランスフェクション試薬と塩との比率が、固定および細胞親和性の指標としてのトランスフェクションの効率に影響するかどうかを評価した。
(Example 3: Effect of the ratio of complex partner to salt)
Next, it was evaluated whether the ratio of complex partner transfection reagent and salt affects the efficiency of transfection as an indicator of fixation and cytocompatibility.

トランスフェクション試薬としては、Ｊｅｔ−ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を用い、塩としては実施例で用いたダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ、塩量：ＣａＣＬ（２００ｍｇ／Ｌ）、Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ（０．１ｍｇ／Ｌ）、ＫＣＬ（４００ｍｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４（９７．６７ｍｇ／Ｌ）、ＮａＣＬ（６４００ｍｇ／ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（３７００ｍｇ／Ｌ）、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（１２５ｍｇ／Ｌ））を用いた。 The transfection reagent, Jet-PEI using (polyethyleneimine), Dulbecco's modified MEM Salts used in Example (DMEM, mineral content: CaCL (200mg / L), Fe (NO 3) 3 · 9H 2 O (0.1 mg / L), KCL (400 mg / L), MgSO 4 (97.67 mg / L), NaCL (6400 mg / ml), NaHCO 3 (3700 mg / L), NaH 2 PO 4 .H 2 O (125 mg / L)).

ＤＮＡと、Ｊｅｔ−ＰＥＩと、培地との比率は以下の通りである。   The ratio of DNA, Jet-PEI, and culture medium is as follows.

ＤＮＡ量（１μｇ／μｌ） １．０μｌ １．５μｌ ２．０μｌ
（１）ＮＰ３
Ｊｅｔ−ＰＥＩ（７．５ｍＭ） １．２μｌ １．８μｌ ２．４μｌ
ＤＭＥＭ １２．８μｌ １１．７μｌ １０．６μｌ
（２）ＮＰ５
Ｊｅｔ−ＰＥＩ（７．５ｍＭ） ２μｌ ３μｌ ４μｌ
ＤＭＥＭ １２μｌ １０．５μｌ ９μｌ
（３）ＮＰ１０
Ｊｅｔ−ＰＥＩ（７．５ｍＭ） ４μｌ ６μｌ ８μｌ
ＤＭＥＭ １０μｌ ７．５μｌ ５μｌ
（４）ＮＰ１５
Ｊｅｔ−ＰＥＩ（７．５ｍＭ） ６μｌ ９μｌ １２μｌ
ＤＭＥＭ ８μｌ ４．５μｌ １μｌ。 DNA amount (1 μg / μl) 1.0 μl 1.5 μl 2.0 μl
(1) NP3
Jet-PEI (7.5 mM) 1.2 μl 1.8 μl 2.4 μl
DMEM 12.8 μl 11.7 μl 10.6 μl
(2) NP5
Jet-PEI (7.5 mM) 2 μl 3 μl 4 μl
DMEM 12 μl 10.5 μl 9 μl
(3) NP10
Jet-PEI (7.5 mM) 4 μl 6 μl 8 μl
DMEM 10 μl 7.5 μl 5 μl
(4) NP15
Jet-PEI (7.5 mM) 6 μl 9 μl 12 μl
DMEM 8 μl 4.5 μl 1 μl.

（結果）
固定後の結果を図２に示す。より具体的には、図２は、ＮＰ３、ＮＰ５およびＮＰ１０のそれぞれの徐放の様子を示すグラフである。 (result)
The result after fixation is shown in FIG. More specifically, FIG. 2 is a graph showing the state of sustained release of NP3, NP5, and NP10.

図からも明らかなように、どの処方を用いても、徐放されることが明らかになった。   As is clear from the figure, it was revealed that any formulation was used for sustained release.

上記ＮＰ３、ＮＰ５、ＮＰ１０を用いた結果を比較すると、いずれの場合でも、徐放効果およびトランスフェクション活性はほぼ同じであることが明らかになった。従って、塩とトランスフェクション試薬（すなわち複合体）との量比は、本発明の効果に影響しないことがわかった。   Comparison of the results using NP3, NP5, and NP10 revealed that the sustained release effect and transfection activity were almost the same in any case. Therefore, it was found that the quantity ratio between the salt and the transfection reagent (ie, the complex) does not affect the effect of the present invention.

（実施例４：アレイを用いた応用）
次に、上述の効果がアレイを用いた場合でも実証されるかどうかを確認するために規模を拡大して実験を行った。 (Example 4: Application using array)
Next, in order to confirm whether or not the above-mentioned effect was demonstrated even when the array was used, an experiment was conducted at an enlarged scale.

（実験プロトコル）
（細胞供給源、培養培地、および培養条件）
この実施例では、５種類の異なる細胞株を使用した：ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ＰＴ−２５０１、Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）、ヒト胚性腎細胞ＨＥＫ２９３（ＲＣＢ１６３７、ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，日本）、ＮＩＨ３Ｔ３−３（ＲＣＢ０１５０、ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，日本）、ＨｅＬａ（ＲＣＢ０００７、ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，日本）、およびＨｅｐＧ２（ＲＣＢ１６４８、ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，日本）。ヒトＭＳＣ細胞の場合、この細胞を、市販のヒト間葉細胞基底培地（ＭＳＣＧＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ ＰＴ−３００１，Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）中で維持した。ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３−３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＨｅｐＧ２細胞の場合、これらの細胞を、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、２９−１６７−５４、Ｌｏｔ Ｎｏ．２０２５Ｆ、Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＣＯ．，ＬＴＤ．，日本）を有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを有する高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）；１４２４６−２５、Ｎａｋａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，日本）中で維持した。全ての細胞株を、３７℃、５％ ＣＯ２に制御されたインキュベーター中で培養した。ｈＭＳＣを含む実験において、本発明者らは、表現型の変化を回避するために、５継代未満のｈＭＳＣを使用した。 (Experiment protocol)
(Cell source, culture medium, and culture conditions)
In this example, five different cell lines were used: human mesenchymal stem cells (hMSC, PT-2501, Cambrex BioScience Walkersville, Inc., MD), human embryonic kidney cells HEK293 (RCB1637, RIKEN Cell Bank, Japan), NIH3T3-3 (RCB0150, RIKEN Cell Bank, Japan), HeLa (RCB0007, RIKEN Cell Bank, Japan), and HepG2 (RCB1648, RIKEN Cell Bank, Japan). In the case of human MSC cells, the cells were maintained in commercial human mesenchymal cell basal medium (MSCGM BulletKit PT-3001, Cambrex BioScience Walkersville, Inc., MD). In the case of HEK293 cells, NIH3T3-3 cells, HeLa cells and HepG2 cells, these cells were treated with 10% fetal calf serum (FBS, 29-167-54, Lot No. 2025F, Dainippon Pharmaceutical CO., LTD., Japan). Maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, high glucose with L-glutamine and sodium pyruvate (4.5 g / L); 14246-25, Nakarai Tesque, Japan). All cell lines were cultured in an incubator controlled at 37 ° C. and 5% CO 2 . In experiments involving hMSCs, we used hMSCs below passage 5 to avoid phenotypic changes.

（プラスミドおよびトランスフェクション試薬）
トランスフェクションの効率を評価するために、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターおよびｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１ベクター（カタログ番号６０８５−１、６９７３−１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）を使用した。共に遺伝子発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下であった。トランスフェクトされた細胞は、それぞれ、連続的にＥＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ２を発現した。プラスミドＤＮＡを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ＸＬ１−ｂｌｕｅ株（２００２４９，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＴＸ）を使用して増幅し、そしてＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ １２３６２、ＱＩＡＧＥＮ、ＣＡ）によって精製した。全ての場合において、プラスミドＤＮＡを、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを含まない水に溶解した。トランスフェクション試薬は以下のものを使用した：Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号３０１４２５、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）、ＴｆｘＴＭ−２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＡ）、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）、およびＥｘＧｅｎ ５００（Ｒ０５１１、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ）。 (Plasmid and transfection reagent)
To evaluate the efficiency of transfection, pEGFP-N1 and pDsRed2-N1 vectors (Catalog Nos. 6085-1, 6973-1, BD Biosciences Clontech, CA) were used. Both gene expression was under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter. Transfected cells continuously expressed EGFP or DsRed2, respectively. Plasmid DNA was amplified using Escherichia coli, XL1-blue strain (200409, Stratagene, TX) and purified by EndoFree Plasmid Kit (EndoFree Plasmid Max Kit 12362, QIAGEN, CA). In all cases, plasmid DNA was dissolved in water without DNase and RNase. The following transfection reagents were used: Effectene Transfection Reagent (catalog number 301425, Qiagen, CA), TransFast TM Transfection Reagent (E2431, Promega, WI), Tfx TM- 20 Reagent (E2391, Imag, Promega, F Transfection Reagent (301305, Qiagen, CA), PolyFect Transfection Reagent (301105, Qiagen, CA), LipofectAMINE 2000 Reagent (11668-019, Invitrogen corporation, CA), JetPEi (4) (101-30, Polyplus-translation, France), and ExGen 500 (R0511, Fermentas Inc., MD).

（固相系トランスフェクションアレイ（ＳＰＴＡ）の生成）
「リバーストランスフェクション」についてのプロトコルの詳細は、ウェブサイト ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｆｆａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓａｂａｔｉｎｉ＿ｐｕｂｌｉｃ／ｒｅｖｅｒｓｅ＿ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．ｈｔｍ の「Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｈｏｍｅｐａｇｅ」に記載されていた。本発明者らの固相系トランスフェクション（ＳＰＴＡ方法）において、疎水性フッ素樹脂コーティングによって分離した４８平方パターン（３ｍｍ×３ｍｍ）を有する３つの型のスライドガラス（シラン処理したスライドガラス；ＡＰＳスライド、およびポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたスライドガラス；ＰＬＬスライド、およびＭＡＳでコーティングしたスライド；Ｍａｔｓｕｎａｍｉ Ｇｌａｓｓ，日本）を研究した。 (Generation of solid phase transfection array (SPTA))
Details of the protocol for “reverse transfection” can be found at the website http: // stuffa. wi. mit. edu / sabatini_public / reverse_transfect. It is described in “Reverse Transfection Homepage” of htm. In our solid-phase transfection (SPTA method), three types of glass slides (Silane-treated glass slides; APS slides) with 48 square patterns (3 mm x 3 mm) separated by a hydrophobic fluororesin coating; And slides coated with poly-L-lysine; PLL slides, and slides coated with MAS; Matsunami Glass, Japan).

（プラスミドＤＮＡプリンティング溶液の調製）
ＳＰＴＡを生成するための２つの異なる方法を開発した。その主な違いは、プラスミドＤＮＡプリンティング溶液の調製にある。 (Preparation of plasmid DNA printing solution)
Two different methods have been developed for generating SPTA. The main difference is in the preparation of plasmid DNA printing solution.

（方法Ａ）
Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを使用する場合、プリンティング溶液は、プラスミドＤＮＡおよび細胞接着分子（４ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解したウシ血漿フィブロネクチン（カタログ番号１６０４２−４１、Ｎａｋａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ、日本））を含んだ。上記の溶液を、インクジェットプリンター（ｓｙｎＱＵＡＤＴＭ、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）を用いてか、または手動で０．５〜１０μＬチップを用いて、スライドの表面に適用した。このプリントしたスライドガラスを安全キャビネットの内側で室温にて１５分間かけて乾燥させた。トランスフェクションの前に、総Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬を、ＤＮＡプリントしたスライドガラス上に静かに注ぎ、そして室温にて１５分間インキュベートした。過剰のＥｆｆｅｃｔｅｎｅ溶液を、吸引アスピレーターを用いてスライドガラスから除去し、そして安全キャビネットの内側で室温にて１５分間かけて乾燥させた。得られたＤＮＡプリントしたスライドガラスを、１００ｍｍ培養ディッシュの底に置き、そして約２５ｍＬの細胞懸濁液（２〜４×１０４細胞／ｍＬ）を、このディッシュに静かに注いだ。次いで、このディッシュを３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに移し、２〜３日間インキュベートした。 (Method A)
When using the Effectene Transfection Reagent, the printing solution contained plasmid DNA and cell adhesion molecules (bovine plasma fibronectin (catalog number 16042-41, Nakarai Tesque, Japan) dissolved in ultrapure water at a concentration of 4 mg / mL). . The above solution was applied to the surface of the slide using an ink jet printer (synQUAD ™ , Cartesian Technologies, Inc., CA) or manually using a 0.5-10 μL tip. The printed slide glass was dried inside the safety cabinet for 15 minutes at room temperature. Prior to transfection, total Effectene reagent was gently poured onto a DNA printed glass slide and incubated for 15 minutes at room temperature. Excess Effectene solution was removed from the glass slide using a suction aspirator and allowed to dry at room temperature for 15 minutes inside the safety cabinet. The resulting DNA printed glass slide was placed on the bottom of a 100 mm culture dish and approximately 25 mL of cell suspension (2-4 × 10 4 cells / mL) was gently poured onto the dish. The dish was then transferred to an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 and incubated for 2-3 days.

（方法Ｂ）
他のトランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ、ＴｆｘＴＭ−２０、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ、ＰｏｌｙＦｅｃｔ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．またはＥｘＧｅｎ）の場合、プラスミドＤＮＡ、フィブロネクチン、およびトランスフェクション試薬を、製造業業者が配布する指示書に示される比率に従って１．５ｍＬのマイクロチューブ中で均一に混合し、そしてチップ上にプリンティングする前に室温にて１５分間インキュベートした。プリンティング溶液を、インクジェットプリンターまたは０．５〜１０μＬチップを用いてスライドガラスの表面上に適用した。このプリントしたスライドガラスを、安全キャビネットの内側で室温にて１０分間かけて完全に乾燥させた。プリントしたスライドガラスを１００ｍｍ培養ディッシュの底に置き、そして約３ｍＬの細胞懸濁液（２〜４×１０４細胞／ｍＬ）を添加し、安全キャビネットの内側で室温にて１５分間にわたってインキュベートした。インキュベーション後、新鮮な培地をこのディッシュに静かに注いだ。次いで、このディッシュを３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに移し、２〜３日間インキュベートした。インキュベーション後、本発明者らは、蛍光顕微鏡（ＩＸ−７１、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＰＲＯＭＡＲＫＥＴＩＮＧ，ＩＮＣ．，日本）を用いて、増強された蛍光タンパク質（ＥＦＰ、ＥＧＦＰ、およびＤｓＲｅｄ２）の発現に基づいてトランスフェクト体を観察した。位相差画像を同じ顕微鏡を用いて撮った。両プロトコルにおいて、細胞をパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定方法（ＰＢＳ中の４％ ＰＦＡ、処理時間は、室温にて１０分間）を用いることによって固定した。 (Method B)
For other transfection reagents (TransFast ™ , Tfx ™ -20, SuperFect, PolyFect, LipofectAMINE 2000, JetPEI (x4) conc. Or ExGen), plasmid DNA, fibronectin, and transfection reagents are distributed by the manufacturer Were mixed evenly in 1.5 mL microtubes according to the ratios indicated in the instructions and incubated for 15 minutes at room temperature before printing on the chip. The printing solution was applied on the surface of the glass slide using an inkjet printer or a 0.5-10 μL chip. The printed glass slide was completely dried for 10 minutes at room temperature inside the safety cabinet. The printed glass slide was placed on the bottom of a 100 mm culture dish and approximately 3 mL of cell suspension (2-4 × 10 4 cells / mL) was added and incubated inside the safety cabinet for 15 minutes at room temperature. After incubation, fresh medium was gently poured into the dish. The dish was then transferred to an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 and incubated for 2-3 days. After incubation, we used the fluorescence microscope (IX-71, Olympus PROMARKETING, INC., Japan) to transfect the transfectants based on the expression of enhanced fluorescent proteins (EFP, EGFP, and DsRed2). Observed. Phase contrast images were taken using the same microscope. In both protocols, cells were fixed by using the paraformaldehyde (PFA) fixation method (4% PFA in PBS, treatment time 10 minutes at room temperature).

（レーザー走査および蛍光強度定量）
トランスフェクション効率を定量するために、本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイスキャナ（ＧｅｎｅＴＡＣ ＵＣ４×４、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，ＭＩ）を使用した。総蛍光強度（任意の単位）を測定した後、表面積あたりの蛍光強度を計算した。 (Laser scanning and fluorescence intensity determination)
To quantify transfection efficiency, we used a DNA microarray scanner (GeneTAC UC4x4, Genomic Solutions Inc., MI). After measuring the total fluorescence intensity (arbitrary units), the fluorescence intensity per surface area was calculated.

（結果）
（ヒト間葉系幹細胞の固相系トランスフェクションアレイ）
多様な種類の細胞に分化するヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の能力は、組織再生および組織復活を標的化する研究にとって特に興味深いものになっている。特に、これらの細胞の形質転換体についての解析は、ｈＭＳＣの多能性を制御する因子を解明する上で、関心が高まっている。従来のｈＭＳＣの研究における重大な障害は、所望の遺伝物質を用いたトランスフェクションが不可能（または、非常に困難）な点にある。 (result)
(Solid phase transfection array of human mesenchymal stem cells)
The ability of human mesenchymal stem cells (hMSCs) to differentiate into a wide variety of cells has been of particular interest for studies targeting tissue regeneration and tissue revival. In particular, analysis of transformants of these cells has been of increasing interest in elucidating factors that control pluripotency of hMSC. A significant hindrance in conventional hMSC studies is that transfection with the desired genetic material is impossible (or very difficult).

これを達成するための従来の方法は、ウイルスベクターまたはエレクトロポレーションのいずれかの技術を含む。本発明者らが開発した複合体−塩という系を用いることにより、種々の細胞株（ｈＭＳＣを含む）に対して高いトランスフェクション効率ならびに密集したアレイ中での空間的な局在の獲得を可能にする固相系トランスフェクションが達成された。固相系トランスフェクションの概略を、図３Ａに示す。   Conventional methods for accomplishing this include either viral vector or electroporation techniques. By using the complex-salt system developed by the present inventors, it is possible to obtain high transfection efficiency for various cell lines (including hMSC) and spatial localization in a dense array. Solid phase transfection was achieved. An outline of solid phase transfection is shown in FIG. 3A.

固相系トランスフェクションにより、インビボ遺伝子送達のために使用され得る「トランスフェクションパッチ」の技術的な達成ならびにｈＭＳＣにおける高スループットの遺伝子機能研究のための固相系トランスフェクションアレイ（ＳＰＴＡ）が可能になることが判明した。   Solid phase transfection enables the technical achievement of “transfection patches” that can be used for in vivo gene delivery as well as solid phase transfection arrays (SPTA) for high-throughput gene function studies in hMSCs Turned out to be.

哺乳動物細胞をトランスフェクトするための多数の標準的な方法が存在するが、遺伝物質のｈＭＳＣへの導入については、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａなどの細胞株と比較して不便かつ非常に困難であることが知られている。従来使用されるウイルスベクター送達またはエレクトロポレーションのいずれも重要であるが、潜在的な毒性（ウイルス技術）、ゲノムスケールでの高スループット分析を受けにくいこと、およびインビボ研究に対して制限された適用性（エレクトロポレーションに関して）のような不便さが存在する。   There are a number of standard methods for transfecting mammalian cells, but the introduction of genetic material into hMSCs can be inconvenient and very difficult compared to cell lines such as HEK293 and HeLa. Are known. Either previously used viral vector delivery or electroporation is important, but potential toxicity (viral technology), insensitive to high-throughput analysis at the genomic scale, and limited applications for in vivo studies There are inconveniences like sex (with respect to electroporation).

本発明者らにより、固相支持体に簡便に固定することができ、かつ徐放性および細胞親和性を保持した固相支持体固定系が開発されたことにより、これらの欠点のほとんど克服することができた。   The inventors have developed a solid phase support immobilization system that can be easily immobilized on a solid phase support and that maintains sustained release and cell affinity, thereby overcoming most of these drawbacks. I was able to.

上述の実験の結果の一例を、図３Ｂに示す。マイクロプリンティング技術を使用する本発明者らの技術を用いて、選択された遺伝物質、トランスフェクション試薬および適切な細胞接着分子、ならびに塩を含む混合物を、固体支持体上に固定化し得た。混合物を固定化した支持体の上での細胞培養は、その培養細胞に対する、混合物中の遺伝子の取り込みを可能にした。その結果、支持体−接着細胞における、空間的に分離したＤＮＡの取り込みを可能にした（図３Ｂ）。   An example of the results of the above experiment is shown in FIG. 3B. Using our technique using microprinting techniques, a mixture containing selected genetic material, transfection reagents and appropriate cell adhesion molecules, and salts could be immobilized on a solid support. Cell culture on the support on which the mixture was immobilized allowed the uptake of genes in the mixture for the cultured cells. As a result, it was possible to incorporate spatially separated DNA in the support-adherent cells (FIG. 3B).

本実施例の結果、いくつかの重要な効果が達成された：高いトランスフェクション効率（その結果、統計学的に有意な細胞集団が研究され得る）、異なるＤＮＡ分子を支持する領域間の低い相互夾雑（その結果、個々の遺伝子の効果が、別々に研究され得る）、トランスフェクト細胞の長期生存、高スループットの互換性のある形式および簡便な検出方法。これらの基準を全て満たすＳＰＴＡの開発は、さらなる研究のための適切な基盤となる。   As a result of this example, several important effects were achieved: high transfection efficiency (so that statistically significant cell populations can be studied), low reciprocity between regions supporting different DNA molecules Contamination (so that the effects of individual genes can be studied separately), long-term survival of transfected cells, high-throughput compatible formats and convenient detection methods. The development of an SPTA that meets all of these criteria provides an appropriate basis for further research.

これらの目的の達成を確立するために、上述のように本発明者らは、５種類の異なる細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２およびｈＭＳＣ）を、本発明者らの方法論（固相系でのトランスフェクション）（図３Ａを参照のこと）および従来の液相系トランスフェクションの両方を用いて一連のトランスフェクション条件下で研究した。ＳＰＴＡの場合、相互夾雑を評価するために、本発明者らは、チェック模様のパターンでガラス支持体上にプリントした赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用し、一方、従来の液相系トランスフェクションを含む実験の場合（ここで、本来、トランスフェクト細胞の自発的な空間的分離は達成され得ない）、本発明者らは、ＧＦＰを使用した。いくつかのトランスフェクション試薬を評価した：４つの液体トランスフェクション試薬（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ、ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ、ＴｆｘＴＭ−２０、ＬｏｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００）、２つのポリアミン（ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ、ＰｏｌｙＦｅｃｔ）、ならびに２つの型のポリイミン（ＪｅｔＰＥＩ（×４）およびＥｘＧｅｎ ５００）。 In order to establish the achievement of these objectives, as described above, we have developed five different cell lines (HEK293, HeLa, NIH3T3, HepG2 and hMSC) from our methodology (solid phase system). ) (See FIG. 3A) and conventional liquid phase transfection were used to study under a series of transfection conditions. In the case of SPTA, in order to assess mutual contamination, we used red fluorescent protein (RFP) and green fluorescent protein (GFP) printed on a glass support in a checkered pattern, whereas traditionally In the case of experiments involving the following liquid phase transfections (where essentially no spontaneous spatial separation of the transfected cells could be achieved) we used GFP. Several transfection reagents were evaluated: four liquid transfection reagents (Effectene, TransFast ™ , Tfx ™ -20, LopfectAMINE 2000), two polyamines (SuperFect, PolyFect), and two types of polyimines (JetPEI (× 4) and ExGen 500).

トランスフェクション効率：トランスフェクション効率を、単位面積あたりの総蛍光強度として決定した（図４Ａ）。使用した細胞株に従って、最適な液相の結果を、異なるトランスフェクション試薬を用いて得た（図４Ｃ〜Ｄを参照のこと）。次いで、これらの効率的なトランスフェクション試薬を、固相系プロトコルの最適化に使用した。いくつかの傾向が観察された：容易にトランスフェクト可能な細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３）の場合、固相系プロトコルで観察されたトランスフェクション効率は、標準的な液相系プロトコルと比較してわずかに優れていたが、本質的に類似したレベルで達成されている（図４Ｂ
）。 Transfection efficiency: Transfection efficiency was determined as total fluorescence intensity per unit area (FIG. 4A). Depending on the cell line used, optimal liquid phase results were obtained with different transfection reagents (see FIGS. 4C-D). These efficient transfection reagents were then used to optimize the solid phase protocol. Several trends were observed: For easily transfectable cell lines (eg, HEK293, HeLa, NIH3T3), the transfection efficiency observed with the solid phase protocol was comparable to that of the standard liquid phase protocol. Slightly better compared to, but achieved at an essentially similar level (FIG. 4B).
).

しかし、細胞をトランスフェクトするのが困難な場合（例えば、ｈＭＳＣおよびＨｅｐＧ２）においてＳＰＴＡ方法論に最適化した条件を用いることによって、本発明者らは、細胞の特徴を維持しながら、トランスフェクション効率が４０倍まで増加したことを観察した（上述のプロトコルおよび図４Ｃ〜Ｄを参照のこと）。結果を、図４Ｂに示す。   However, by using conditions optimized for SPTA methodology in cases where it is difficult to transfect cells (eg, hMSC and HepG2), we have achieved transfection efficiency while maintaining cell characteristics. An increase of 40-fold was observed (see protocol above and FIGS. 4C-D). The results are shown in FIG. 4B.

ｈＭＳＣの場合（図５Ａおよび図５Ｂ）、最良条件は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション試薬の使用を含んだ。予想したように、高いトランスフェクション効率を実現するための重要な因子は、ポリマー内の窒素原子（Ｎ）の数とプラスミドＤＮＡ内のリン酸残基（Ｐ）の数との間の電荷バランス（Ｎ／Ｐ比率）、ならびにＤＮＡ濃度である。一般的に、Ｎ／Ｐ比率および濃度における増大は、トランスフェクション効率の増大を生じる。並行して、本発明者らは、ｈＭＳＣの溶液トランスフェクション実験における高いＤＮＡおよび高いＮ／Ｐ比率の場合に、細胞生存率の有意な低下を観察した。これら２つの拮抗因子に起因して、ｈＭＳＣの液相系トランスフェクションは、相対的に低い細胞生存率（Ｎ／Ｐ比率＞１０で観察された）であった。しかし、ＳＰＴＡプロトコルは、細胞生存率にも細胞形態にも有意に影響を与えることなく、非常に高い（固体支持体に固定された）Ｎ／Ｐ比率およびＤＮＡ濃度を許容し（おそらく、細胞膜に対する固体支持体の安定化効果に起因する）、従って、このことがおそらく、トランスフェクション効率の劇的な改善の原因となっている。ＳＰＴＡの場合、１０のＮ／Ｐ比率が最適であることが見出され、細胞毒性を最小化しながら十分なトランスフェクションレベルを提供する。ＳＰＴＡプロトコルにおいて観察されたトランスフェクション効率の増大に関するさらなる理由は、高い局所的なＤＮＡ濃度／トランスフェクション試薬濃度（これは、液相系トランスフェクション実験において使用される場合は細胞死を生成する）の達成である。   In the case of hMSC (FIGS. 5A and 5B), the best conditions included the use of polyethyleneimine (PEI) transfection reagent. As expected, an important factor for achieving high transfection efficiency is the charge balance between the number of nitrogen atoms (N) in the polymer and the number of phosphate residues (P) in the plasmid DNA ( N / P ratio), as well as DNA concentration. In general, an increase in N / P ratio and concentration results in an increase in transfection efficiency. In parallel, we observed a significant reduction in cell viability for high DNA and high N / P ratio in hMSC solution transfection experiments. Due to these two antagonists, liquid phase transfection of hMSCs was a relatively low cell viability (observed with an N / P ratio> 10). However, the SPTA protocol tolerates very high (fixed to a solid support) N / P ratio and DNA concentration (possibly relative to the cell membrane) without significantly affecting cell viability or cell morphology. This is probably responsible for a dramatic improvement in transfection efficiency) (due to the stabilizing effect of the solid support). In the case of SPTA, an N / P ratio of 10 has been found to be optimal and provides sufficient transfection levels while minimizing cytotoxicity. An additional reason for the increase in transfection efficiency observed in the SPTA protocol is the high local DNA concentration / transfection reagent concentration (which produces cell death when used in liquid phase transfection experiments). Achievement.

チップ上での高いトランスフェクション効率の達成のための重要な点は、使用されるコーティングに使用する物質の種類である。ガラスチップを使用した際のコーティング剤として、ＰＬＬがトランスフェクション効率および相互夾雑の両方に関して、最良の結果を提供することを発見した（下記に考察する）。フィブロネクチンコーティングしない場合、少数のトランスフェクト体を観察した（他のすべての実験条件は一定に保った）。完全に確立したわけではないが、フィブロネクチンの役割はおそらく、細胞接着プロセスを加速し（データは示していない）、ゆえに、表面を離れたＤＮＡ拡散が可能になる時間を制限するということである。   The key to achieving high transfection efficiency on the chip is the type of material used for the coating used. As a coating agent when using glass chips, we have found that PLL provides the best results in terms of both transfection efficiency and mutual contamination (discussed below). In the absence of fibronectin coating, a few transfectants were observed (all other experimental conditions were kept constant). Although not fully established, the role of fibronectin is probably to accelerate the cell adhesion process (data not shown) and thus limit the time allowed for DNA diffusion off the surface.

低い相互夾雑：ＳＰＴＡプロトコルで観察されたより高いトランスフェクション効率は別として、本技術の重要な利点は、別個に分離された細胞アレイの実現であり、その各位置では、選択した遺伝子が発現する。本発明者らは、フィブロネクチンでコーティングしたガラス表面上に、ＪｅｔＰＥＩ（「実験プロトコル」を参照のこと）およびフィブロネクチンと混合した２つの異なるレポーター遺伝子（ＲＦＰおよびＧＦＰ）をプリントした。得られたトランスフェクションチップを適切な細胞培養に供した。最良であると見出された実験条件下において、発現されたＧＦＰおよびＲＦＰは、それぞれのｃＤＮＡがスポットされた領域に局在した。相互夾雑はほとんど観察されなかった（図６Ａ〜図６Ｄ）。しかし、フィブロネクチンまたはＰＬＬの非存在下において、相互夾雑は重大な障害であり、そしてトランスフェクション効率は、有意に低かった（図７）。このことは、細胞接着および支持体表面から離れて拡散するプラスミドＤＮＡの相対的な割合が、高いトランスフェクション効率および高い相互夾雑の両方に対して重要な因子であるという仮説を立証する。   Low reciprocal contamination: Apart from the higher transfection efficiency observed with the SPTA protocol, an important advantage of this technology is the realization of a separately isolated cell array, at each position where the selected gene is expressed. We printed JetPEI (see “Experimental Protocol”) and two different reporter genes (RFP and GFP) mixed with fibronectin on a glass surface coated with fibronectin. The resulting transfection chip was subjected to appropriate cell culture. Under the experimental conditions found to be best, the expressed GFP and RFP were localized in the region where the respective cDNA was spotted. Almost no mutual contamination was observed (FIGS. 6A to 6D). However, in the absence of fibronectin or PLL, reciprocal contamination was a significant obstacle and transfection efficiency was significantly lower (FIG. 7). This confirms the hypothesis that cell adhesion and the relative proportion of plasmid DNA that diffuses away from the support surface are important factors for both high transfection efficiency and high reciprocal contamination.

相互夾雑のさらなる原因は、固体支持体上のトランスフェクション細胞の移動性であり得る。本発明者らは、数個の支持体上での細胞接着速度（図６Ｃ）およびプラスミドＤＮＡの拡散速度の両方を測定した。その結果は、最適条件下においてＤＮＡ拡散はほとんど生じなかった。しかし、高い相互夾雑条件下では、細胞接着が完了するまでの時間に、相当の量のプラスミドＤＮＡが固相表面から拡散して枯渇した。   A further cause of mutual contamination may be the mobility of the transfected cells on the solid support. We measured both the cell adhesion rate (FIG. 6C) and the diffusion rate of plasmid DNA on several supports. The result showed that almost no DNA diffusion occurred under optimal conditions. However, under high reciprocal conditions, a considerable amount of plasmid DNA diffused from the surface of the solid phase and was depleted during the time until cell adhesion was completed.

この確立された技術は、経済的な高スループットの遺伝子機能スクリーニングの状況において特に重要である。実際に、必要とされる少量のトランスフェクション試薬およびＤＮＡ、ならびに全プロセス（プラスミドの単離から検出まで）を自動化する可能性は、上記の方法の有用性を増大する。   This established technique is particularly important in the context of economical high-throughput gene function screening. Indeed, the small amount of transfection reagent and DNA required and the possibility of automating the entire process (from plasmid isolation to detection) increases the usefulness of the above method.

結論として、本発明者らは、複合体−塩を用いた系で、ｈＭＳＣトランスフェクションアレイを好首尾に実現した。このことは、多能性幹細胞の分化を制御する遺伝子機構の解明など、固相系トランスフェクションを利用した種々の研究における高スループット研究を可能にすることになる。固相系トランスフェクションの詳細な機構ならびに高スループットのリアルタイム遺伝子発現モニタリングに対するこの技術の使用に関する方法論は種々の目的に応用可能であることが明らかになった。   In conclusion, we have successfully realized an hMSC transfection array in a complex-salt system. This will enable high-throughput studies in various studies using solid-phase transfection, such as elucidating the genetic mechanisms that control the differentiation of pluripotent stem cells. The detailed mechanism of solid-phase transfection as well as the methodology relating to the use of this technique for high-throughput real-time gene expression monitoring has been found to be applicable for various purposes.


（実施例５：ＲＮＡｉトランスフェクションマイクロアレイ）
上記実施例に記載のようにアレイを作製し、今度は、遺伝物質として、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）とｓｈＲＮＡの混合物を使用した。その組成を以下の表１に示す。
(Example 5: RNAi transfection microarray)
Arrays were prepared as described in the above examples, this time using a mixture of plasmid DNA (pDNA) and shRNA as genetic material. The composition is shown in Table 1 below.

結果を図８に示す。この図の結果を数値化したデータを、５種類の細胞について、図９Ａ〜図９Ｅにまとめた。   The results are shown in FIG. The data obtained by quantifying the results in this figure are summarized in FIGS. 9A to 9E for five types of cells.

このように、どのような細胞を用いたとしても、本発明の技術が適用可能であることが判明した。   Thus, it has been found that the technique of the present invention can be applied regardless of the type of cells used.


（実施例６：ＲＮＡｉマイクロアレイ＝ｓｉＲＮＡを用いた場合）
上記実施例と同様のプロトコルを用いて、今度はｓｈＲＮＡの代わりにｓｉＲＮＡを用いて、ＲＮＡｉトランスフェクションマイクロアレイを構築した。
(Example 6: RNAi microarray = when siRNA is used)
An RNAi transfection microarray was constructed using siRNA instead of shRNA, using the same protocol as in the above example.

以下の表の１８種類の転写因子レポーターおよびＡｃｔｉｎプロモータベクターを用いて、各転写因子に対して２８種類のｓｉＲＮＡを合成した。また、コントロールとして、ＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡが標的転写因子をノックアウトするか評価した。また、ネガティブコントロールとしては、ｓｃｒａｍｂｌｅ ＲＮＡを用いて、これらの比を取って評価した。   28 types of siRNA were synthesized for each transcription factor using 18 types of transcription factor reporters and Actin promoter vectors in the following table. As a control, siRNA against EGFP was used to evaluate whether siRNA knocks out the target transcription factor. Further, as a negative control, scramble RNA was used to evaluate these ratios.

各細胞を固相系トランスフェクション後、２日間培養し、蛍光イメージスキャナにて画像取得後、蛍光量を定量化した。   Each cell was cultured for 2 days after solid-phase transfection, and after acquiring an image with a fluorescence image scanner, the amount of fluorescence was quantified.

（結果）
結果を図１０に示す。この結果を遺伝子ごとにまとめたものを図１１Ａ〜図１１Ｄに示す。 (result)
The results are shown in FIG. The results summarized for each gene are shown in FIGS. 11A to 11D.

図１０および図１１Ａ〜図１１Ｄから明らかなように、ＲＮＡｉを用いた場合、各遺伝子は特異的に発現が抑制されていることが示された。ＲＮＡｉを用いた複数の遺伝物質のアレイを実現することができ、ＲＮＡｉであっても、塩の固定効果およびそれによる遺伝子導入の増強効果が確認された。   As is clear from FIG. 10 and FIGS. 11A to 11D, when RNAi was used, it was shown that the expression of each gene was specifically suppressed. An array of a plurality of genetic materials using RNAi can be realized, and even with RNAi, the effect of fixing a salt and the effect of enhancing gene transfer thereby were confirmed.


（実施例７：ＰＣＲ断片を用いたトランスフェクションアレイ）
次に、ＰＣＲ断片を遺伝物質として用いた場合でも、本発明が実現可能であることを実証した。以下にその手順を示す。
(Example 7: Transfection array using PCR fragments)
Next, it was demonstrated that the present invention can be realized even when PCR fragments are used as genetic material. The procedure is shown below.

ＰＣＲにより、図１２に記載のような核酸断片を取得し、トランスフェクションマイクロアレイに用いる遺伝物質とした。その手順を以下に示す。   A nucleic acid fragment as shown in FIG. 12 was obtained by PCR, and used as genetic material used for the transfection microarray. The procedure is shown below.

ＰＣＲプライマーとしては、
GG ATAACCGTAT TACCGCCATG CAT（配列番号１）と
ccctatctcggtctattcttttg CAAAAGAATAGACCGAGATA GGG（配列番号２）とを使用して、テンプレートとして、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１を用いた（図１３を参照）。ＰＣＲの条件は、以下の表３に記載される。 As PCR primers,
GG ATAACCGTAT TACCGCCATG CAT (SEQ ID NO: 1) and
Using ccctatctcggtctattcttttg CAAAAGAATAGACCGAGATA GGG (SEQ ID NO: 2), pEGFP-N1 was used as a template (see FIG. 13). PCR conditions are listed in Table 3 below.


サイクル条件：９４℃２ｍｉｎ→（９４℃ １５ｓｅｃ→６０℃３０ｓｅｃ→６８℃ ３ｍｉｎ）→ ４℃（括弧内を３０サイクル）
Cycle condition: 94 ° C. 2 min → (94 ° C. 15 sec → 60 ° C. 30 sec → 68 ° C. 3 min) → 4 ° C. (30 cycles in parentheses)

得られたPCR フラグメントは、フェノール/クロロフォルム抽出を行い、エタノール沈殿法にて精製した。そのＰＣＲ断片の配列は、   The obtained PCR fragment was subjected to phenol / chloroform extraction and purified by ethanol precipitation. The sequence of the PCR fragment is


に記載のとおりである。
It is as described in.

ＰＣＲフラグメントを用いて作製したチップに、ＭＣＦ７を播種し、２日後に蛍光イメージスキャナにて画像を取得した。その結果を図１４に示す。図１４では、環状ＤＮＡとＰＣＲフラグメントとの比較を行っている。どちらの場合も、トランスフェクションがうまく行われており、ＰＣＲ断片を遺伝物質として使用した場合でも、全長プラスミドと同様に細胞にトランスフェクションされ、塩の固定効果およびそれによる遺伝子導入の増強効果が確認された。   MCF7 was seeded on a chip prepared using the PCR fragment, and images were acquired with a fluorescent image scanner two days later. The result is shown in FIG. In FIG. 14, the circular DNA and the PCR fragment are compared. In both cases, transfection was successful, and even when PCR fragments were used as genetic material, cells were transfected like the full-length plasmid, confirming the effect of salt fixation and the resulting gene transfer enhancement. It was done.

（実施例８：支持体の種類）
次に、固相支持体として、ガラスの他に、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチックを用いた場合に、同様の塩の効果が見られることを確認する。 (Example 8: Type of support)
Next, it is confirmed that the same salt effect is observed when silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, or plastic is used in addition to glass as the solid support.

これらの材料を松浪硝子などから入手する。そして、上記実施例に記載されるように、アレイを作製する。   These materials are obtained from Matsunami Glass. An array is then produced as described in the above examples.

その結果、使用した材料において、同様の塩の効果が見られることが示される。   As a result, it is shown that the same salt effect is seen in the used material.

（実施例９：支持体のコーティングの種類）
次に、ガラス上に、ポリ−Ｌ−リジン、シラン、ＡＰＳ、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂をそれぞれコーティングした支持体を用いて、同様の塩の効果が見られることを確認する。 (Example 9: Types of coating on support)
Next, it is confirmed that the same salt effect is observed using a support in which poly-L-lysine, silane, APS, MAS, and a hydrophobic fluororesin are coated on glass.

これらの材料を松浪硝子などから入手する。そして、上記実施例に記載されるように、アレイを作製する。   These materials are obtained from Matsunami Glass. An array is then produced as described in the above examples.

その結果、使用した材料において、同様の塩の効果が見られることが示される。   As a result, it is shown that the same salt effect is seen in the used material.

（実施例１０：塩の種類）
次に、塩の種類として、単塩である塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミン（ここでは、ビタミンBおよびビタミンC）を用いた場合に同様の効果が見られるかどうかを確認する。 (Example 10: Types of salt)
Next, as salt types, calcium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium hydrogen carbonate, sodium pyruvate, HEPES, Tris, calcium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfide, iron nitrate, amino acids and vitamins which are simple salts (Here, vitamin B and vitamin C) to see if similar effects are seen.

これらの材料を和光純薬（大阪、日本）などから入手する。そして、上記実施例に記載されるように、アレイを作製する。   These materials are obtained from Wako Pure Chemical (Osaka, Japan). An array is then produced as described in the above examples.

その結果、使用した材料において、同様の塩の効果が見られることが示される。   As a result, it is shown that the same salt effect is seen in the used material.

（実施例１１：負に荷電した物質の種類）
次に、負に荷電した物質の種類として、ＤＮＡ以外にＲＮＡ、ＰＮＡ、ポリペプチドおよび糖ペプチドを用いて、上記実施例に記載されるような実験を行って同じ固定効果があるかどうかを確認する。 (Example 11: Type of negatively charged substance)
Next, as the kind of negatively charged substance, RNA, PNA, polypeptide and glycopeptide other than DNA were used to conduct experiments as described in the above examples to confirm whether the same fixing effect was obtained. To do.

固定効果があるかどうかは、目視および特異的な抗体の支持体への付着により確認することができる。   Whether there is a fixing effect can be confirmed by visual observation and attachment of a specific antibody to the support.

その結果、使用した材料において、同様の塩の効果が見られることが示される。   As a result, it is shown that the same salt effect is seen in the used material.

以上のように、本発明の特定の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。   As mentioned above, although this invention has been illustrated using the specific preferable embodiment of this invention, this invention should not be limited and limited to this embodiment. It is understood that the scope of the present invention should be construed only by the claims. It is understood that those skilled in the art can implement an equivalent range based on the description of the present invention and the common general technical knowledge from the description of specific preferred embodiments of the present invention. Patents, patent applications, and documents cited herein should be incorporated by reference in their entirety, as if the contents themselves were specifically described herein. Understood.

本発明により、予想外に簡便で、生体適合性（例えば、細胞親和性）および／または徐放性を提供する物質の固相支持体への固定方法が提供された。このような効果を利用することにより、種々の生体現象、例えば、遺伝子導入、シグナル伝達、薬効などを、固相支持体を用いて発揮させることができる。   The present invention provides a method for immobilizing a substance on a solid support that is unexpectedly simple and provides biocompatibility (eg, cell affinity) and / or sustained release. By utilizing such effects, various biological phenomena such as gene transfer, signal transduction, and drug efficacy can be exhibited using the solid support.

図１は、実施例２における代表的な結果例である。図１は、複合体化していないＤＮＡ（上）と、正に荷電した物質と複合体化させたＤＮＡ（下、ＮＰ１０処理）とを対比した結果を示す。固相に対して複合体を添加した直後（０分）ならびに、添加の１分後、５分後および１０分後に細胞含有液を加えた後のトランスフェクションの様子を示す。FIG. 1 is a typical result example in the second embodiment. FIG. 1 shows the result of comparing uncomplexed DNA (top) with DNA complexed with a positively charged substance (bottom, NP10 treatment). The state of transfection is shown immediately after adding the complex to the solid phase (0 minute) and after adding the cell-containing solution 1 minute, 5 minutes and 10 minutes after the addition. 図２は、実施例３（種々の処方）における代表的な結果例である。図２は、ＮＰ３、ＮＰ５およびＮＰ１０のそれぞれの徐放の様子を示すグラフである。FIG. 2 is a representative example of results in Example 3 (various formulations). FIG. 2 is a graph showing the state of sustained release of NP3, NP5, and NP10. 図３Ａは、実施例４における本発明の固相トランスフェクションによって、空間的に分離したＤＮＡの細胞内への取り込みを示す図である。図３Ａは、固相系トランスフェクションアレイ（ＳＰＴＡ）作製方法を模式的に示した図である。この図は、固相トランスフェクションの方法論を示す。FIG. 3A is a diagram showing the uptake of DNA spatially separated into cells by solid-phase transfection of the present invention in Example 4. FIG. 3A is a diagram schematically showing a method for preparing a solid phase transfection array (SPTA). This figure shows the solid phase transfection methodology. 図３Ｂは、固相トランスフェクションの結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞株を用いてＳＰＴＡを作製した結果を示す。緑色の部分は、トランスフェクションされた付着細胞を示す。この結果から、本発明の方法によって、空間的に分離された、異なる遺伝子によってトランスフェクトされた細胞の集団を調製することが可能となった。FIG. 3B shows the results of solid phase transfection. The result of producing SPTA using HEK293 cell line is shown. The green part shows transfected adherent cells. From this result, the method of the present invention made it possible to prepare a population of cells that were spatially separated and transfected with different genes. 図３Ｃは、従来の液相トランスフェクションとＳＰＴＡとの間の差をしめす。FIG. 3C shows the difference between conventional liquid phase transfection and SPTA. 図４Ａおよび図４Ｂは、液相トランスフェクションとＳＰＴＡの比較を示す結果である。図４Ａは、実験に用いた５つの細胞株について、ＧＦＰ強度／ｍｍ２を測定した結果を示す。図４Ａは、トランスフェクション効率を、単位面積あたりの総蛍光強度として決定する方法を示す。4A and 4B are results showing a comparison of solution phase transfection and SPTA. FIG. 4A shows the results of measuring GFP intensity / mm 2 for the five cell lines used in the experiment. FIG. 4A shows a method for determining transfection efficiency as total fluorescence intensity per unit area. 図４Ａおよび図４Ｂは、液相トランスフェクションとＳＰＴＡの比較を示す結果である。図４Ｂは、図４Ａの示すデータに対応する、ＥＧＦＰを発現する細胞の蛍光画像である。図４Ｂにおいて、白丸で示された領域は、プラスミドＤＮＡを固定化した領域を示す。プラスミドＤＮＡを固定化した領域以外の領域では、細胞が固相に固定化されたにもかかわらず、ＥＧＦＰを発現する細胞は観察されなかった。白棒は、５００μｍを示す。4A and 4B are results showing a comparison of solution phase transfection and SPTA. FIG. 4B is a fluorescence image of cells expressing EGFP corresponding to the data shown in FIG. 4A. In FIG. 4B, a region indicated by a white circle indicates a region where plasmid DNA is immobilized. In the region other than the region where the plasmid DNA was immobilized, cells expressing EGFP were not observed even though the cells were immobilized on the solid phase. The white bar indicates 500 μm. 図４Ｃは、固相トランスフェクション法の代表的プロトコル例を示す。FIG. 4C shows a representative protocol example of the solid phase transfection method. 図４Ｄは、固相トランスフェクション法の代表的プロトコル例を示す。FIG. 4D shows a representative protocol example of a solid phase transfection method. 図５Ａおよび５Ｂは、チップのコーティングによって相互夾雑が低減された結果を示す。 図５Ａおよび５Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＴ３Ｔ３細胞（「３Ｔ３」として示す）、ＨｅｐＧ２細胞、およびｈＭＳＣを用いて、液相トランスフェクション法およびＳＰＴＡを行った結果を示す。トランスフェクション効率を、ＧＦＰ強度で示す。FIGS. 5A and 5B show the result of reduced mutual contamination by chip coating. FIGS. 5A and 5B show the results of liquid phase transfection and SPTA using HEK293 cells, HeLa cells, NIT3T3 cells (shown as “3T3”), HepG2 cells, and hMSC. Transfection efficiency is expressed as GFP intensity. 図６Ａおよび６Ｂは、各スポット間の相互夾雑に関する様子を示す図である。ＡＰＳまたはＰＬＬ（ポリ−Ｌ−リジン）でコーティングしたチップに対して、所定の濃度のフィブロネクチンを含む核酸混合物を固定化し、その固定化したチップを用いて細胞トランスフェクションした結果、相互夾雑は観察されなかった（上段および中段）。これに対して、チップをコーティングしなかった場合、固定化核酸の有意な相互夾雑が観察された（下段）。FIGS. 6A and 6B are diagrams showing a state related to mutual contamination between spots. As a result of immobilizing a nucleic acid mixture containing a predetermined concentration of fibronectin on a chip coated with APS or PLL (poly-L-lysine) and cell transfection using the immobilized chip, mutual contamination was observed. None (upper and middle). On the other hand, when the chip was not coated, significant mutual contamination of the immobilized nucleic acid was observed (lower row). 図６Ａおよび６Ｂは、各スポット間の相互夾雑に関する様子を示す図である。ＡＰＳまたはＰＬＬ（ポリ−Ｌ−リジン）でコーティングしたチップに対して、所定の濃度のフィブロネクチンを含む核酸混合物を固定化し、その固定化したチップを用いて細胞トランスフェクションした結果、相互夾雑は観察されなかった（上段および中段）。これに対して、チップをコーティングしなかった場合、固定化核酸の有意な相互夾雑が観察された（下段）。FIGS. 6A and 6B are diagrams showing a state related to mutual contamination between spots. As a result of immobilizing a nucleic acid mixture containing a predetermined concentration of fibronectin on a chip coated with APS or PLL (poly-L-lysine) and cell transfection using the immobilized chip, mutual contamination was observed. None (upper and middle). On the other hand, when the chip was not coated, significant mutual contamination of the immobilized nucleic acid was observed (lower row). 図６Ｃは、核酸の固定化において使用する混合物中に使用される物質の種類と、細胞接着速度との相関関係を示す。FIG. 6C shows the correlation between the types of substances used in the mixture used in the immobilization of nucleic acids and the cell adhesion rate. 図６Ｄは、時間経過に伴う、接着細胞の割合の増加を示す。グラフの傾きが緩やかな場合は、グラフの傾き急な場合と比較して、より多くの時間が細胞接着に必要なことを示す。FIG. 6D shows the increase in the percentage of adherent cells over time. When the slope of the graph is gentle, it indicates that more time is required for cell adhesion than when the slope of the graph is steep. 図６Ｅは、ＨＥＫ２９３細胞を用いた場合の種々のアクチン作用物質およびコントロールとしてのゼラチンを用いた結果の一例を示す。図Ｅは、トランスフェクション効率に関する各接着物質（ＨＥＫ細胞）の効果を示す。ＨＥＫ細胞は、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬を用いて、ｐＥＧＦＤ−Ｎ１と共にトランスフェクトした。 図６Ｃおよび図６Ｄの結果と、図６Ｅの結果は、最適条件下においてＤＮＡ拡散がほとんど生じなかったことを示す。しかし、高い相互夾雑条件下では、細胞接着が完了するまでの時間に、相当の量のプラスミドＤＮＡが固相表面から拡散して枯渇したことを示す。FIG. 6E shows an example of the results using various actin acting substances and gelatin as a control when HEK293 cells are used. FIG. E shows the effect of each adhesive substance (HEK cells) on transfection efficiency. HEK cells were transfected with pEGFD-N1 using Effectene reagent. The results of FIGS. 6C and 6D and FIG. 6E show that little DNA diffusion occurred under optimal conditions. However, under high reciprocal conditions, a substantial amount of plasmid DNA is diffused from the solid surface and depleted during the time until cell adhesion is complete. 図７は、ＡＰＳコーティングも、ＰＬＬコーティングも行わない、相互夾雑を生じる条件下では、ＡＰＳコーティングまたはＰＬＬコーティングを行った場合と比較して、トランスフェクション効率が有意に低かったことを示す図である。FIG. 7 is a graph showing that the transfection efficiency was significantly lower under the conditions where mutual contamination occurred without the APS coating or the PLL coating, as compared with the case where the APS coating or the PLL coating was performed. . 図８は、実施例５におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を示す。固相基板上に表３に示す各レポーター遺伝子を一遺伝子あたり４スポットになるようプリントし、乾燥後、各転写因子に対してのｓｉＲＮＡ（２８種類）を対応したレポーター遺伝子がプリントされている座標上にプリントし、乾燥させた。また、コントロールとして、ＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを用い、ネガティブコントロールとしては、ｓｃｒａｍｂｌｅ ＲＮＡをもちいた。その後、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００を各遺伝子プリント同一座標にプリントし乾燥させた。その後、フィブロネクチン溶液を同一座標に重ねてプリントし乾燥させた。これに、ＨｅＬａ−Ｋ細胞を播種し、２日間培養を行った後に、蛍光イメージスキャナにて画像を取得した。FIG. 8 shows the transfection results of the RNAi transfection array in Example 5. Coordinates where reporter genes shown in Table 3 are printed on a solid phase substrate so that there are 4 spots per gene, dried, and reporter genes corresponding to siRNA (28 types) for each transcription factor are printed Printed on top and dried. Moreover, siRNA for EGFP was used as a control, and scramble RNA was used as a negative control. Thereafter, LipofectAMINE2000 was printed on the same coordinates as each gene print and dried. Thereafter, the fibronectin solution was printed on the same coordinates and dried. HeLa-K cells were seeded on this and cultured for 2 days, and then images were acquired with a fluorescent image scanner. 図９Ａ〜９Ｅは、実施例５におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光輝度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルRNAをプリントした各レポーターの輝度に対する比率を算出した。これを、各レポーター・各細胞に対してすべて行った結果を示している。9A to 9E show the transfection results of the RNAi transfection array in Example 5 for each cell. After quantifying the fluorescence luminance of each reporter by image analysis, the ratio to the luminance of each reporter printed with scrambled RNA as a negative control was calculated. The results are shown for all reporters and cells. 図９Ａ〜９Ｅは、実施例５におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光輝度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルRNAをプリントした各レポーターの輝度に対する比率を算出した。これを、各レポーター・各細胞に対してすべて行った結果を示している。9A to 9E show the transfection results of the RNAi transfection array in Example 5 for each cell. After quantifying the fluorescence luminance of each reporter by image analysis, the ratio to the luminance of each reporter printed with scrambled RNA as a negative control was calculated. The results are shown for all reporters and cells. 図９Ａ〜９Ｅは、実施例５におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光輝度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルRNAをプリントした各レポーターの輝度に対する比率を算出した。これを、各レポーター・各細胞に対してすべて行った結果を示している。9A to 9E show the transfection results of the RNAi transfection array in Example 5 for each cell. After quantifying the fluorescence luminance of each reporter by image analysis, the ratio to the luminance of each reporter printed with scrambled RNA as a negative control was calculated. The results are shown for all reporters and cells. 図９Ａ〜９Ｅは、実施例５におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光輝度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルRNAをプリントした各レポーターの輝度に対する比率を算出した。これを、各レポーター・各細胞に対してすべて行った結果を示している。9A to 9E show the transfection results of the RNAi transfection array in Example 5 for each cell. After quantifying the fluorescence luminance of each reporter by image analysis, the ratio to the luminance of each reporter printed with scrambled RNA as a negative control was calculated. The results are shown for all reporters and cells. 図９Ａ〜９Ｅは、実施例５におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光輝度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルRNAをプリントした各レポーターの輝度に対する比率を算出した。これを、各レポーター・各細胞に対してすべて行った結果を示している。9A to 9E show the transfection results of the RNAi transfection array in Example 5 for each cell. After quantifying the fluorescence luminance of each reporter by image analysis, the ratio to the luminance of each reporter printed with scrambled RNA as a negative control was calculated. The results are shown for all reporters and cells. 図１０は、実施例６におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を示す。固相基板上に表３に示す各レポーター遺伝子発現ユニットＰＣＲ断片を一遺伝子あたり４スポットになるようプリントし、乾燥後、各転写因子に対してのｓｉＲＮＡ（２８種類）を対応したレポーター遺伝子がプリントされている座標上にプリントし、乾燥させた。また、コントロールとして、ＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを用い、ネガティブコントロールとしては、スクランブルＲＮＡをもちいた。その後、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００を各遺伝子プリント同一座標にプリントし乾燥させた。その後、フィブロネクチン溶液を同一座標に重ねてプリントし乾燥させた。これに、各細胞を播種し、２日間培養を行った後に、蛍光イメージスキャナにて画像を取得した。FIG. 10 shows the transfection results of the RNAi transfection array in Example 6. Each reporter gene expression unit PCR fragment shown in Table 3 is printed on a solid phase substrate so that there are 4 spots per gene, and after drying, reporter genes corresponding to siRNA (28 types) for each transcription factor are printed. Printed on the printed coordinates and dried. Moreover, siRNA for EGFP was used as a control, and scrambled RNA was used as a negative control. Thereafter, LipofectAMINE2000 was printed on the same coordinates as each gene print and dried. Thereafter, the fibronectin solution was printed on the same coordinates and dried. Each cell was seed | inoculated to this, and after culturing for 2 days, the image was acquired with the fluorescence image scanner. 図１１Ａ〜１１Ｄは、実施例６におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光輝度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルRNAをプリントした各レポーターの輝度に対する比率を算出した。これを、各レポーター・各細胞に対してすべて行った結果を示している。11A to 11D show the transfection results of the RNAi transfection array in Example 6 for each cell. After quantifying the fluorescence luminance of each reporter by image analysis, the ratio to the luminance of each reporter printed with scrambled RNA as a negative control was calculated. The results are shown for all reporters and cells. 図１１Ａ〜１１Ｄは、実施例６におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光輝度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルRNAをプリントした各レポーターの輝度に対する比率を算出した。これを、各レポーター・各細胞に対してすべて行った結果を示している。11A to 11D show the transfection results of the RNAi transfection array in Example 6 for each cell. After quantifying the fluorescence luminance of each reporter by image analysis, the ratio to the luminance of each reporter printed with scrambled RNA as a negative control was calculated. The results are shown for all reporters and cells. 図１１Ａ〜１１Ｄは、実施例６におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光輝度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルRNAをプリントした各レポーターの輝度に対する比率を算出した。これを、各レポーター・各細胞に対してすべて行った結果を示している。11A to 11D show the transfection results of the RNAi transfection array in Example 6 for each cell. After quantifying the fluorescence luminance of each reporter by image analysis, the ratio to the luminance of each reporter printed with scrambled RNA as a negative control was calculated. The results are shown for all reporters and cells. 図１１Ａ〜１１Ｄは、実施例６におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光輝度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルRNAをプリントした各レポーターの輝度に対する比率を算出した。これを、各レポーター・各細胞に対してすべて行った結果を示している。11A to 11D show the transfection results of the RNAi transfection array in Example 6 for each cell. After quantifying the fluorescence luminance of each reporter by image analysis, the ratio to the luminance of each reporter printed with scrambled RNA as a negative control was calculated. The results are shown for all reporters and cells. 図１２は、実施例７において得たＰＣＲ断片の構造を示す。FIG. 12 shows the structure of the PCR fragment obtained in Example 7. 図１３は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１の構造を示す。FIG. 13 shows the structure of pEGFP-N1. 図１４は、環状ＤＮＡとＰＣＲ断片とを用いたトランスフェクションマイクロアレイのトランスフェクト効率の比較を示す。FIG. 14 shows a comparison of the transfection efficiency of transfection microarrays using circular DNA and PCR fragments.

（配列の説明）
配列番号１は、実施例７で使用したプライマー１である。
配列番号２は、実施例７で使用したプライマー２である。
配列番号３は、実施例７で作製したＰＣＲ断片である。 (Description of array)
SEQ ID NO: 1 is primer 1 used in Example 7.
SEQ ID NO: 2 is primer 2 used in Example 7.
SEQ ID NO: 3 is the PCR fragment prepared in Example 7.

Claims (43)

物質を固相支持体に固定するための組成物であって、
ａ）正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体；および
ｂ）塩、
を含む、組成物。 A composition for immobilizing a substance on a solid support,
a) a complex of a positively charged substance and a negatively charged substance; and b) a salt,
A composition comprising: 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の少なくとも一方は、細胞親和性を有する、請求項１に記載の組成物。   The composition according to claim 1, wherein at least one of the positively charged substance and the negatively charged substance has cell affinity. 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の両方が、細胞親和性を有する、請求項１に記載の組成物。   The composition of claim 1, wherein both the positively charged substance and the negatively charged substance have cytophilic properties. 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の少なくとも一方は、生体分子を含む、請求項１に記載の組成物。   The composition of claim 1, wherein at least one of the positively charged substance and the negatively charged substance comprises a biomolecule. 前記生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、脂質、糖、有機低分子、およびこれらの複合体からなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。   The composition according to claim 4, wherein the biomolecule is selected from the group consisting of DNA, RNA, polypeptide, lipid, sugar, small organic molecule, and complexes thereof. 前記負に荷電した物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ポリペプチド、化学化合物、及びその複合体からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。   The composition according to claim 1, wherein the negatively charged substance is selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, polypeptide, chemical compound, and complex thereof. 前記正に荷電した物質は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミノ酸及びその複合体からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。   The composition of claim 1, wherein the positively charged substance is selected from the group consisting of cationic polymers, cationic lipids, cationic polyamino acids and complexes thereof. 前記塩は、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。   The salt is selected from the group consisting of calcium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium bicarbonate, sodium pyruvate, HEPES, calcium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfide, iron nitrate, amino acids and vitamins. 2. The composition according to 1. 前記生体分子は、細胞に導入されて生物学的活性を有する、請求項４に記載の組成物。   5. The composition of claim 4, wherein the biomolecule is introduced into a cell and has biological activity. 前記複合体および塩は薬学的に受容可能である、請求項１に記載の組成物。   2. The composition of claim 1, wherein the complex and salt are pharmaceutically acceptable. 目的の物質が固定されたデバイスであって、
ａ）正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体；
ｂ）塩；および
ｃ）該複合体および該塩が固定された固相支持体、
を含み、該目的の物質は、該正に荷電した物質および／または該負に荷電した物質である、デバイス。 A device to which a target substance is fixed,
a) a complex of a positively charged substance and a negatively charged substance;
b) a salt; and c) a solid support on which the complex and the salt are immobilized,
Wherein the target substance is the positively charged substance and / or the negatively charged substance. 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の少なくとも一方は、細胞親和性を有する、請求項１１に記載のデバイス。   The device of claim 11, wherein at least one of the positively charged substance and the negatively charged substance has cytophilicity. 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の両方が、細胞親和性を有する、請求項１１に記載のデバイス。   The device of claim 11, wherein both the positively charged substance and the negatively charged substance have cytophilicity. 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の少なくとも一方は、生体分子を含む、請求項１１に記載のデバイス。   The device of claim 11, wherein at least one of the positively charged substance and the negatively charged substance comprises a biomolecule. 前記生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、脂質、糖、有機低分子、およびこれらの複合体からなる群より選択される、請求項１４に記載のデバイス。   15. The device of claim 14, wherein the biomolecule is selected from the group consisting of DNA, RNA, polypeptides, lipids, sugars, small organic molecules, and complexes thereof. 前記負に荷電した物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ポリペプチド、化学化合物、およびその複合体からなる群より選択される、請求項１１に記載のデバイス。   The device of claim 11, wherein the negatively charged substance is selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, polypeptide, chemical compound, and complexes thereof. 前記正に荷電した物質は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミノ酸及びその複合体からなる群より選択される、請求項１１に記載のデバイス。   The device of claim 11, wherein the positively charged substance is selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a cationic polyamino acid and a complex thereof. 前記塩は、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンからなる群より選択される、請求項１１に記載のデバイス。   The salt is selected from the group consisting of calcium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium bicarbonate, sodium pyruvate, HEPES, calcium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfide, iron nitrate, amino acids and vitamins. 11. The device according to 11. 前記固相支持体は、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属、天然ポリマーおよび合成ポリマーからなる群より選択される材料を含む、請求項１１に記載のデバイス。   The device of claim 11, wherein the solid support comprises a material selected from the group consisting of glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal, natural polymer, and synthetic polymer. 前記固相支持体は、コーティングによって処理される、請求項１１に記載のデバイス。   The device of claim 11, wherein the solid support is treated with a coating. 前記コーティングは、ポリ−Ｌ−リジン、シラン、ＡＰＳ、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂および金属からなる群より選択される物質を含むコーティング剤によって行われる、請求項２０に記載のデバイス。   21. The device of claim 20, wherein the coating is performed by a coating agent comprising a material selected from the group consisting of poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin and metal. 前記固相支持体はチップである、請求項１１に記載のデバイス。   The device of claim 11, wherein the solid support is a chip. 前記固相支持体はチップであり、前記複合体は該チップ上にアレイ状に配列される、請求項１１に記載のデバイス。   The device of claim 11, wherein the solid support is a chip, and the complex is arranged in an array on the chip. 前記生体分子は、細胞に導入されて生物学的活性を有する、請求項１４に記載のデバイス。   15. The device of claim 14, wherein the biomolecule is introduced into a cell and has biological activity. 前記複合体、前記塩および前記固体支持体に含まれる材料は薬学的に受容可能である、請求項１１に記載のデバイス。   12. The device of claim 11, wherein the materials included in the complex, the salt, and the solid support are pharmaceutically acceptable. 物質を固相支持体に固定する方法であって、
ａ）固相支持体を提供する工程；
ｂ）正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体を提供する工程；
ｃ）塩と該複合体との混合物を提供する工程；および
ｄ）該塩と該複合体との該混合物を固相支持体に付着させる工程、
を包含する、方法。 A method of immobilizing a substance on a solid support,
a) providing a solid support;
b) providing a complex of a positively charged substance and a negatively charged substance;
c) providing a mixture of the salt and the complex; and d) attaching the mixture of the salt and the complex to a solid support.
Including the method. 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の少なくとも一方は、細胞親和性を有する、請求項２６に記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein at least one of the positively charged substance and the negatively charged substance has cytophilicity. 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の両方が、細胞親和性を有する、請求項２６に記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein both the positively charged substance and the negatively charged substance have cytophilic properties. 前記正に荷電した物質および前記負に荷電した物質の少なくとも一方は、生体分子を含む、請求項２６に記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein at least one of the positively charged substance and the negatively charged substance comprises a biomolecule. 前記生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、脂質、糖、有機低分子、およびこれらの複合体からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。   30. The method of claim 29, wherein the biomolecule is selected from the group consisting of DNA, RNA, polypeptides, lipids, sugars, small organic molecules, and complexes thereof. 前記負に荷電した物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ポリペプチド、化学化合物、及びその複合体からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the negatively charged substance is selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, polypeptide, chemical compound, and complexes thereof. 前記正に荷電した物質は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミノ酸及びその複合体からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the positively charged substance is selected from the group consisting of cationic polymers, cationic lipids, cationic polyamino acids and complexes thereof. 前記塩は、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。   The salt is selected from the group consisting of calcium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium bicarbonate, sodium pyruvate, HEPES, calcium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfide, iron nitrate, amino acids and vitamins. 26. The method according to 26. 前記固相支持体は、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属、天然ポリマーおよび合成ポリマーからなる群より選択される材料を含む、請求項２６に記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the solid support comprises a material selected from the group consisting of glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal, natural polymer, and synthetic polymer. 前記固相支持体は、コーティングによって処理される、請求項２６に記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the solid support is treated with a coating. 前記コーティングは、ポリ−Ｌ−リジン、シラン、ＡＰＳ、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂および金属からなる群より選択される物質を含むコーティング剤によって行われる、請求項３５に記載の方法。   36. The method of claim 35, wherein the coating is performed by a coating agent comprising a material selected from the group consisting of poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin and metal. 前記固相支持体はチップである、請求項２６に記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the solid support is a chip. 前記固相支持体はチップであり、前記複合体は該チップ上にアレイ状に配列される、請求項２６に記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the solid support is a chip and the complexes are arranged in an array on the chip. 前記生体分子は、細胞に導入されて生物学的活性を有する、請求項２９に記載の方法。   30. The method of claim 29, wherein the biomolecule is introduced into a cell and has biological activity. 前記複合体および塩は薬学的に受容可能である、請求項２６に記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the complex and salt are pharmaceutically acceptable. 前記工程ｂ）は、生体分子を破壊しない条件下で行われる、請求項２９に記載の方法。   30. The method of claim 29, wherein step b) is performed under conditions that do not destroy the biomolecule. 前記工程ｃ）は、生体分子を破壊しない条件下で行われる、請求項２９に記載の方法。   30. The method of claim 29, wherein step c) is performed under conditions that do not destroy the biomolecule. 前記混合物を前記固相支持体に付着した後、該混合物中の溶媒を低減または除去する工程をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。

27. The method of claim 26, further comprising the step of reducing or removing the solvent in the mixture after attaching the mixture to the solid support.

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008111281A1 (en) * 2007-03-12 2008-09-18 The University Of Tokushima Determination method for allergic disease
WO2011096408A1 (en) * 2010-02-02 2011-08-11 国立大学法人 東京大学 Fine composite particles and method of producing same, and pharmaceutical composition using fine composite particles
JP2015501934A (en) * 2011-11-23 2015-01-19 ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント Versatile and sensitive biosensor

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007043523A1 (en) * 2005-10-11 2007-04-19 Cytopathfinder, Inc. Transfection device
JP2007236224A (en) * 2006-03-06 2007-09-20 Cytopathfinder Inc Transfection device
ES2636664T3 (en) 2008-09-02 2017-10-06 The Governing Council Of The University Of Toronto Nanostructured microelectrodes and biodetection devices that incorporate them
ES2704685T3 (en) 2011-01-11 2019-03-19 Governing Council Univ Toronto Method for protein detection

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020006664A1 (en) * 1999-09-17 2002-01-17 Sabatini David M. Arrayed transfection method and uses related thereto
WO2002000870A2 (en) * 2000-06-26 2002-01-03 Christian Plank Method for transfecting cells using a magnetic field
FR2820434A1 (en) * 2001-02-05 2002-08-09 Centre Nat Rech Scient USE OF OLIGONUCLEOTIDES TO IMPROVE THE TRANSFECTION OF PLASMIDS INTO CELLS, TRANSFECTION METHOD AND KIT
US6905878B2 (en) * 2002-12-19 2005-06-14 The Scripps Research Institute DNA array for high throughput solid-phase transfection and method for producing the same

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008111281A1 (en) * 2007-03-12 2008-09-18 The University Of Tokushima Determination method for allergic disease
WO2011096408A1 (en) * 2010-02-02 2011-08-11 国立大学法人 東京大学 Fine composite particles and method of producing same, and pharmaceutical composition using fine composite particles
JP2015501934A (en) * 2011-11-23 2015-01-19 ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント Versatile and sensitive biosensor

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