JP2006517934A - 置換複素環 - Google Patents
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Abstract
Description
R1は、水素、ヒドロキシまたはメチルカルボニルオキシを表し、
R2は、シクロヘキシルまたはシクロヘキサ−2−エニル(ここで、シクロヘキシルは0〜2個のヒドロキシ基で置換されていてもよい)を表し、
そして、
R3は、水素またはヒドロキシを表す]
の化合物に関する。
図1:30リットルスケールでの菌株JS360(strain JS360)の醗酵の時間経過。
図2:30リットルスケールでの菌株JS360の醗酵の粗抽出物からの実施例1〜7の単離スキーム。
図3:分取HPLC後の実施例1のHPLCクロマトグラム、HPLC−UVおよびHPLC−ESI LC−MSスペクトル。
図4:実施例1のプロトンスペクトル。
図5:配列番号1:部分的16S rDNA、菌株JS360/DSM 15324の部分配列。
図6:サリノスポラsp.およびJS360の関係を示す樹状図。
ツリー(tree)の下のスケールは、配列間の距離を示す。単位は、置換現象(substitution events)の数を示す。サリノスポラsp.は、上方の枝でクラスター形成しており、一方、JS360および同様の配列は、下方の枝でクラスター形成している。
図7:水素原子以外を番号付与した、実施例1のオルテップ−プロット(Ortep-Plot)(50%)。
図8:極性および非極性層を示しているaおよびc軸に沿って見た実施例1の結晶充填(crystal packing)。
[式中、
R1が、水素またはヒドロキシを表し、
R2が、シクロヘキシルまたはシクロヘキサ−2−エニル(ここで、シクロヘキシルは0〜2個のヒドロキシ基で置換されていてもよい)を表し、
そして、
R3が、水素またはヒドロキシを表す]
の式(I)による化合物に関する。
(1R,4R,5S)−1−[(S)−(1S)−2−シクロヘキセン−1−イル(ヒドロキシ)メチル]−4−ヘキシル−5−メチル−6−オキサ−2−アザビシクロ[3.2.0]ヘプタン−3,7−ジオン:
(1R,4R,5S)−1−[(1R)−2−シクロヘキセン−1−イルメチル]−4−ヘキシル−5−メチル−6−オキサ−2−アザビシクロ[3.2.0]ヘプタン−3,7−ジオン:
R4は、水素またはヒドロキシを表し、
R5は、シクロヘキシルまたはシクロヘキサ−2−エニル(ここで、シクロヘキシルは0〜2個のヒドロキシ基で置換されていてもよい)を表し、
R6は、水素またはヒドロキシを表し、
そして、
R7は、ヒドロキシまたは
そして、*は、分子に結合する位置を表す)
から成る群の式の置換基を表す]
による化合物に関する。
R4は、水素またはヒドロキシを表し、
R5は、シクロヘキシルまたはシクロヘキサ−2−エニル(ここで、シクロヘキシルは0〜2個のヒドロキシ基で置換されていてもよい)を表し、
R6は、水素またはヒドロキシを表し、
そして、
R7は、ヒドロキシまたは、式:
そして、*は、分子に結合する位置を表す)
の置換基を表す]
による化合物に関する。
(3S,4R)−2−[(S)−(1S)−2−シクロヘキセン−1−イル(ヒドロキシ)メチル]−3−ヒドロキシ−4−[1−ヒドロキシ−ヘキシル]−3−メチル−5−オキソ−D−プロリン:
メチル−N−アセチル−S−({(2R,3S,4R)−2[(S)−(1S)−2−シクロヘキセン−1−イル(ヒドロキシ)メチル]−4−ヘキシル−3−ヒドロキシ−3−メチル−5−オキソ−2−ピロリジニル}カルボニル)システイナート(cysteinate):
[A]配列番号1を有するストレプトミセス属の放線菌JS360(DSM 15324)から醗酵および単離によって化合物を製造することを特徴とする、一般式:
の化合物を合成する方法、
または、
の化合物を合成する方法、
または、
の化合物を合成する方法、
または、
の化合物を合成する方法、
または、
R7は、ヒドロキシまたは式:
の置換基を表す]
の化合物を合成する方法、
または、
の化合物をチオールと反応させて、化合物を製造することを特徴とする、一般式:
R7は、
の化合物を合成する方法に関する。
式(II)は、式(IIb)、(IIc)および(IId)の化合物を含む。
化学薬品を、Merck(Darmstadt, Germany)または Sigma-Aldrich(Deisenhofen, Germany)から分析グレードで得る。NMRスペクトルは、Bruker DRX 500 スペクトロメータ(500.13MHzプロトン周波数(proton frequency)で作動)を用いて、DMSO−d6で記録される。
培地
酵母−麦芽−グルコース(YMG)培地:D−グルコース0.4%、麦芽抽出物1%、酵母抽出物0.4%、pH7.2。
Q6培地:D−グルコース0.4%、グリセロール2%、綿実ミール1%、水道水、pH7.2。
C培地:D−グルコース1%、酵母抽出物1%、NZアミン(Sheffield Chemicals, Sheffield, U,.K., Lot ONA 20 2)0.5%、可溶性デンプン2%、pH調整なし。
GS培地:D−グルコース2%、脱油大豆ミール(Soyamin 50T, Degussa, Duesseldorf, Germany)2%、可溶性デンプン2%、炭酸カルシウム0.5%、塩化ナトリウム0.25%、硫酸マグネシウム0.05%、リン酸二水素カリウム0.025%、pHは6.5〜6.8に調整。
MC培地:D−グルコース1%、酵母抽出物0.5%、脱油大豆ミール(Soyamin 50T, Degussa, Duesseldorf, Germany)1%、可溶性デンプン1%、塩化ナトリウム0.5%、炭酸カルシウム0.3%、pHは7.2に調整(0.1N水酸化ナトリウム溶液)。
MS培地:マンニトール2%、脱脂大豆ミール(Soyamin 50T, Degussa, Duesseldorf, Germany)2%、炭酸カルシウム0.3%、pHは7.5に調整。
SP培地:マンニトール3%、酵母抽出物0.75%、可溶性デンプン0.2%、大豆ペプトン(Merck, Darmstadt, Germany # 107212.0500)0.5%、pHは6.0に調整(塩酸)。
菌株JS360の形態学的、培養的および生理学的特徴は、この菌株がストレプトマイセス属の未記載種に相当することを示している。
28℃で12日間インキュベーションすると、YMG培地で菌株JS360の一つのコロニーは直径24mmに達する。このコロニーは、白色のふわふわした空中の菌糸体を作り出すが、一方、培養基(substrate)の菌糸体はクリーム状である。培養物の裏面は赤褐色であり、そして、赤色素は、培地中に放出される。
菌株JS360をその分類学上の位置において更に特徴付けるために、16S rDNA(配列番号1)配列の比較が行われる。したがって、Mincer TJ, Jensen PR, Kaufmann CA, Fenical W. 2002. Appl. Environ. Microbiology 60 (10) 5005-5011 a PCR using primers 41f and 1486r-P(未発表)に準じて、50℃のアニーリング温度で標準熱プロフィールを適用して、DNA抽出および16S rRNA遺伝子の主要な部分のシーケンシングを増幅させる。増幅産物を、DNA結合常磁性ビーズ(Mag Prep PCR Clean Up Kit, Tecan Schweiz AG, Hornbrechtikon, Switzerland)を用い、製造業者によって提供されているプロトコールを使用して精製する。
1:シード(seed)培養
2mlの10%グリセロール培養物を使用して、無菌YMG培地150mlを含む1リットルのエルレンマイヤーフラスコに接種し、28℃、240rpmで、回転振とう機(rotary shaker)によって72〜96時間増殖させる。
十分増殖したYMGシード培養(フラスコあたり2ml接種)で接種後、菌株JS360を、150mlのQ6培地(上記参照)を含んでいる、10個の1リットルエルレンマイヤーフラスコ内で増殖させ、次いで、28℃、240rpmで、回転振とう機によって118時間増殖させる。醗酵の間、毎日、サンプルをとる。pHを決定し、次いで、遊離のグルコースを Bayer Diastix Harnzuckerstreifen を用いて評価する。湿った菌糸体を液体から遠心分離(10分、3000×g)によって分離し、2リットルのアセトンで抽出する。このアセトンを真空内(40℃)で蒸発させる。残存している水性残渣を水で500mlまで希釈し、等量の酢酸エチルで3回抽出する。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空内(40℃)で蒸発させ、830mgの粗抽出物を得、それを、その後、下記(単離)で述べるように分取HPLCにかける。
30リットルのQ6培地が入っている40リットルのバイオスタットP醗酵槽(Biostat P fermentor)(Braun Bioengeneering, Melsungen, Germany)をインサイツ(in situ)滅菌し(121℃、1時間、1.1バール)、76時間増殖させた二つの十分生育した150mlのYMGシード培養液を接種する。産生用培養物(production culture)を、攪拌(240rpm)および通気(0.3vvm)のもとで生育させる。pHを決定し、遊離のグルコースを Bayer Diastix Harnzuckerstreifen を用いて評価する。更に、醗酵槽に Braun 酸素電極を設置し、培養ブロスの酸素飽和度を決定する。無菌状態のもとで取得され、同量の酢酸エチルで抽出された50mlのサンプルから調製された粗抽出物の分析HPLCは、実施例1の検出手段として供される。実施例2〜5および7は、また醗酵の間にもHPLC−MSによって検出されるが、量が乏しいことと使用するHPLCシステムにおける類似した保持時間を有する共溶出する他の代謝産物のため、天然粗抽出物中では評価することはできない。酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾燥し、メタノールに再度溶解し、次に、全般的実験手順に述べられているHPLC−UVシステムを用いて分析する。30リットルのQ6培地におけるJS360の醗酵の典型的な時間過程が、図1に示されている。酸素飽和値から推定して、培養が十分に飽和状態になる間、pHは、約4.5の値まで下がる。培地内の遊離のグルコースが消費された後、実施例1の産生は、分析HPLC方法によって評価されるように、約60時間の醗酵で開始され、114時間後、最適条件に達する。次いで、後半の段階になると、実施例1の分解が見られるので、培養物は回収される。培養物の回収の後、液を菌糸体から遠心分離(10分、3000×g)によって分離し、次いで、Bayer Lewapol CA9225 吸着レジンが詰められたカラムにアプライし、5リットルの水ですすぐ。このカラムは、その後、6リットルのアセトン:メタノール4:1で溶出される。溶出液を真空内(40℃)で蒸発させ、水性残渣を得、そして、これを水で1リットルに希釈し、1リットルの酢酸エチルで3回抽出する。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、真空内(40℃)で蒸発させる。その結果生じる抽出物(22.7g)を、その後、下記(単離)に述べられているように分取HPLCにかける。
菌株JS360を、実施例1および化学的関連代謝産物の産生を最適化する試みで、様々な他の培地で増殖する。この目的のために、振とうフラスコ醗酵が、Q6培地におけるものについて述べられたのと同様な方法で行われる(上記2参照)。150mlの培地が入っている1リットルのエルレンマイアーフラスコを、28℃、240rpmで、回転振とう機によって118時間まで増殖させる。醗酵の間、毎日、サンプルとる。pHを決定し、次いで、遊離のグルコースを Bayer Diastix Harnzuckerstreifen を用いて評価する。一定量の培養ブロス(50ml)を酢酸エチルで抽出する。こうした酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾燥し、メタノールに再度溶解し、次に、全般的実験手順に述べられているHPLC−UVおよびHPLC−MSシステムを用いて分析する。保持時間とスペクトルを比較することにより、実施例1および関連化合物を次の培地:YM培地、C培地、GS培地、MC培地、MCPM培地、MS培地およびSP培地で72〜96時間の醗酵後、検出する。しかしながら、実施例1の最も高い収量は、Q6およびGS培地で観察される。
(1R,4R,5S)−1−[(S)−(1S)−2−シクロヘキセン−1−イル(ヒドロキシ)メチル]−4−ヘキシル−5−メチル−6−オキサ−2−アザビシクロ[3.2.0]ヘプタン−3,7−ジオン
(1R,4R,5S)−1−[(S)−(1S)−2−シクロヘキセン−1−イル(ヒドロキシ)メチル]−4−[1−ヒドロキシ−ヘキシル]−5−メチル−6−オキサ−2−アザビシクロ[3.2.0]ヘプタン−3,7−ジオン
(3S,4R)−2−[(S)−(1S)−2−シクロヘキセン−1−イル(ヒドロキシ)メチル]−3−ヒドロキシ−4−[1−ヒドロキシ−ヘキシル]−3−メチル−5−オキソ−D−プロリン
N−アセチル−S−({(2R,3S,4R)−2−[(S)−(1S)−2−シクロヘキセン−1−イル(ヒドロキシ)メチル]−4−ヘキシル−3−ヒドロキシ−3−メチル−5−オキソ−2−ピロリジニル}カルボニル)システイン
メチル−N−アセチル−S−({(2R,3S,4R)−2−[(S)−(1S)−2−シクロヘキセン−1−イル(ヒドロキシ)メチル]−4−ヘキシル−3−ヒドロキシ−3−メチル−5−オキソ−2−ピロリジニル}カルボニル)システイナート
1.振とうフラスコ醗酵からの物質
粗抽出物(それぞれ、菌糸体から620mgおよび培養液から830mg)を5mlのメタノールに溶解し、そして、Bond Elut C18 500mg 固相抽出カートリッジ (Baker, Deventer, The Netherlands)によって濾過し、MZ Analysentechnik (Mainz, Germany) Kromasil RP18 カラム(粒子径、7μm;250×40mm)にアプライする。移動相として、0.01%TFA:アセトニトリルのグラジエントを、流量10ml/分:t=0分で20%アセトニトリル;直線グラジエント:20%〜50%アセトニトリル(40分で);その後50%〜100%アセトニトリル(20分で)の直線グラジエント;その後、30分間、75%アセトニトリル(均一溶媒条件)で使用し、その後、このカラムを再生する。フラクションを210nmでのUV吸着(adsorption)に従って合わせる。実施例1は、保持時間(Rt)80〜83分で溶出され、菌糸体抽出物から14mg、培養液抽出物から1.5mgの量でそれぞれ得られる。実施例2〜5および7は、少ない方の中間フラクション中に存在し、この抽出物から精製するために単離せず、一方、実施例6は、まったく検出されない。
上記に述べられているように調製された粗抽出物(菌糸体から13.4g、培養液から22.7g)の2.5〜3グラムの試料を、メタノール5mlに溶解し、そして、Bond ElutC18 500mg 固相抽出カートリッジ(Baker, Deventer, The Netherlands)によって濾過し、MZ Analysentechnik(Mainz, Germany) Kromasil RP18 カラム(粒子径、7μm;250×40mm;移動相、0.01%TFA:アセトニトリル)にアプライする。移動相として、0.01%TFA:アセトニトリルのグラジエントを、流量10ml/分:t=0分で20%アセトニトリル;直線グラジエント:20%〜50%アセトニトリル(40分で);その後50%〜100%アセトニトリル(20分で)の直線グラジエント;その後、30分間、75%アセトニトリル(均一溶媒条件)で使用し、その後、このカラムを再生する。フラクションを210nmでのUV吸着に従って合わせる。5つの生物学的活性のある中間生成物(intermediate product)がこのようにして得られる。このグラジエントシステムにおいて保持時間(Rt)が次のように確認される:61〜64分、中間生成物1(実施例4および7を含む)、65〜71分、中間生成物2(実施例5および6を含む)、72〜79分、中間生成物3(実施例2を含む)、79〜85分、中間生成物4(実施例1を含む)および86〜93分、中間生成物5(実施例3を含む)。
実施例1〜6は、全般的実験手順に述べられた方法を用いてHPLC−UVおよびHPLC−MSによって検出される。分析HPLCシステムでのこうした特徴を、表2にまとめる。使用グラジエントでの実施例1の検出が、図3に図解されている。実施例1、2、4および7は、それらの分子ピークに関して確定的な結果を提供しているが、実施例3のLC−MSは、単にポジティブESIモードにおける分子ピークを明らかにしているのみであり、一方、ネガティブESIモードにおける二酸化炭素の低下によって、より小さな主要なマスフラグメントが観察される。実施例5と6においては、使用されたHPLC−MSの条件下でダイマーが容易に形成され、主要なLC−MSシグナルはこうしたダイマーに関するものであり、一方、分子ピークは単にマイナーなシグナルを構成するに過ぎない。こうした特徴はまた、醗酵ブロス、および抽出、下流の加工処理(downstream processing)およびクロマトグラフィーの間に得られる中間フラクションの分析HPLCによって実施例を同定するのに役に立つ。
実施例1
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.87 (t), 1.28 (m), 1.29 (m), 1.23 (m), 1.40 (m), 1.45 (m), 1.47 (m), 1.54 (m), 1.58 (m), 1.68 (m), 1.74 (s), 1.80 (m), 1.90 (m), 2.29 (m), 2.41 (t), 3.65 (m), 5.47 (m), 5.73 (m), 5.81 (m), 8.92 (s).
13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13.8, 21.7, 21.8, 24.2, 25.2, 26.1, 26.8, 28.5, 30.8, 37.3, 47.5, 69.3, 78.4, 86.4, 127.8, 128.6, 169.1, 174.1.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.88 (t), 1.27 (m), 1.29 (m), 1.35 (s), 1.37 (m), 1.49 (m), 1.58 (m), 1.59 (m), 1.71 (m), 1.75 (m), 1.93 (m), 2.35 (d), 2.76 (m), 3.49 (m), 4.00 (d), 4.68 (m), 5.70 (m), 5.91 (m), 6.11 (br.), 8.52 (s).
13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13.4, 21.0, 21.4, 23.7, 24.2, 29.6, 30.1, 31.5, 36.1, 54.6, 69.4, 75.0, 76.0, 76.5, 127.9, 170.9, 172.3.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.88 (t), 1.27 (m), 1.30 (m), 1.31 (m), 1.33 (m), 1.46 (m), 1.48 (m), 1.50 (m), 1.61 (s), 1.62 (m), 1.63 (m), 1.76 (m), 1.92 (m), 2.27 (m), 2.55 (t), 5.45 (m); 5.68 (m), 8.98 (s).
13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13.3, 19.6, 21.4, 24.0, 24.2, 26.5, 28.2, 28.5, 29.9, 30.9, 32.5, 46.7, 74.0, 86.1, 127.7, 130.9, 170.4, 170.8.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.82 (m), 1.17 (m), 1.20 (m), 1.24 (m), 1.32 (m), 1.47 (m), 1.60 (m), 1.62 (m), 1.63 (m), 1.84 (m), 2.08 (m) 2.44 (d), 3.68 (m), 3.80 (m), 5.60 (m), 5.76 (m).
13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13.1, 20.1, 20.6, 21.0, 23.5, 23.6, 30.5, 33.5, 37.7, 52.7, 67.1, 73.6, 75.2, 80.1, 126.3, 128.6, 171.2, 176.5.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.87 (m), 1.09 (m), 1.24 (m), 1.25 (m), 1.27 (m), 1.33 (m), 1.35 (m), 1.37 (m), 1.44 (m), 1.46 (m), 1.50 (m), 1.61 (m), 1.64 (m), 1.84 (s), 1.87 (m), 2.13 (m), 2.47 (t), 2.96 (m), 3.30 (m), 3.78 (m), 4.36 (m), 5.64 (m), 5.79 (m).
13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13.9, 20.8, 21.7, 22.0, 22.1, 22.2, 23.4, 24.3, 26.8, 27.7, 28.7, 29.2, 31.1, 38.1, 50.3, 51.0, 75.3, 79.7, 80.6, 127.0, 129.3, 169.3, 178.9, 201.2.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.87 (m), 1.09 (m), 1.24 (m), 1.25 (m), 1.27 (m), 1.33 (m), 1.35 (m), 1.37 (m), 1.44 (m), 1.46 (m), 1.50 (m), 1.61 (m), 1.64 (m), 1.84 (s), 1.87 (m), 2.13 (m), 2.47 (t), 3.00 (m), 3.24 (m), 3.64 (s), 3.78 (m), 4.39 (m), 5.64 (m), 5.79 (m).
13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13.6, 20.8, 21.7, 22.0, 22.1, 23.4, 24.3, 26.8, 27.7, 28.7, 29.3, 31.1, 38.1, 50.3, 51.4, 51.8, 75.3, 79.7, 80.6, 127.0, 129.3, 169.3, 171.0, 178.9, 201.2.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.86 (t), 1.25 (m), 1.26 (m), 1.33 (m), 1.34 (m), 1.36 (m), 1.44 (m), 1.46 (s), 1.51 (m), 1.66 (m), 1.67 (m), 1.88 (m), 2.12 (m), 2.45 (t), 3.77 (d), 5.64 (m), 5.82 (m), 7.66 (s).
13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13.8, 20.3, 21.5, 21.7, 23.3, 24.4, 26.5, 27.9, 28.9, 31.0, 38.5, 50.5, 74.6, 75.5, 80.4, 127.4, 129.7, 177.5.
実施例1:ESI−;質量実測値:334.1977、計算値:334.2014(分子式C19H28NO4につき4.1mDaの偏差に相当する)。
実施例2:ESI−;質量実測値:350.1968、計算値:350.1967(分子式C19H28NO5につき0.1mDaの偏差に相当する)。
実施例3:ESI+;質量実測値:276.2388、計算値:276.2327(分子式C18H30NOにつき6.1mDaの偏差に相当する)。ここで、フラグメント(M−CO2)のみが、ESI条件で観察される。
実施例4:ESI+;質量実測値:368.2107、計算値:368.2073(分子式C19H31NO6につき3.3mDaの偏差に相当する)。
実施例5:ESI−;質量実測値:497.2322、計算値:497.2321(分子式C24H38N2O7Sにつき0.0mDaの偏差に相当する)。
実施例6:ESI−;質量実測値:511.2594、計算値:511.2478(分子式C25H40N2O7Sにつき11.6mDaの偏差に相当する)。
実施例7:ESI+;質量実測値:354.2268、計算値:354.2280(分子式C19H32NO5につき1.3mDaの偏差に相当する)。
実施例1のいくつかの結晶を、46℃でプロパノール/ジアセトンアルコール97:3の飽和溶液をゆっくり蒸発させて結晶化させる。X線源としてCukα−放射を用いて、−183.5℃、寸法(dimension)0.30×0.20×0.03mm3で、全データセットを適切な結晶から集める。構造プロポーザルが、キラルスペースグループP212121(図7参照)を用いて、斜方晶セル内で得られる。この結晶セルは、非常に大きな軸(extreme large axes)を有し、同一のキラリティを持つ実施例1の12の独立した分子を含んでいる。分子のすべては、異なる立体配座を示す。この分子を、極性層および無極性層内に入れる(図8参照)。一つの極性層は、水素結合に沿って、二次元的に結合される。実施例1の絶対立体配置は、このようにして、R(C2);S(C4);R(C5);S(C6);S(C7)で決定され、標準偏差0.2で0.0の Flack パラメーターを得る(H.-D. Flack, Acta Cryst., 1983, A39, 876-881)。期待値は、真の(correct)絶対構造の場合は0であり(3 esd's 以内で)、逆の(inverted)絶対構造の場合は+1である。
液体クロマトグラフィー−質量分析法(LC−MS):アセトニトリル−水(9:1〜1:9)の混合物を1ml/分の流速で流す Micromass Platform LC (Shimadzu Phenomenex ODS カラム(4.6mmφX30mm)付)。マススペクトルは、エレクトロスプレー(ES)イオン化法を用いて得られた。
質量決定(Mass determination):Finnigan MAT MAT95。
融点は補正されていない。
1−(シクロヘキサ−2−エニル−ヒドロキシ−メチル)−4−ヘキシル−5−メチル−6−オキサ−2−アザ−ビシクロ[3.2.0]ヘプタン−3,7−ジオン
融点:157℃;
LCMS(4分の方法):Rt=2.56分、m/z=336(M+H)+;
1H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.87 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.10-1.70 (13H, m), 1.74 (3H, s), 1.82 (1H, m), 1.92 (2H, m), 2.29 (1H, m), 2.41 (1H, d, J = 5.8 Hz), 3.66 (1H, t, J = 8.9 Hz), 5.49 (1H, d, J = 7.9 Hz), 5.70 (1H, m), 5.80 (1H, d, J = 11.5 Hz), 8.91 (1H, s).
1−(シクロヘキサ−2−エニル−ヒドロキシ−メチル)−4−(1−ヒドロキシ−ヘキシル)−5−メチル−6−オキサ−2−アザ−ビシクロ[3.2.0]ヘプタン−3,7−ジオン
融点:144℃;
LCMS(4分の方法):Rt=2.55分、m/z=352(M+H)+;
1H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.87 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.17-1.33 (6H, m), 1.46-1.52 (3H, m), 1.77 (3H, s), 1.54-1.86 (3H, m), 1.92 (2H, m), 2.29 (1H, m), 2.57 (1H, d, J = 5.7 Hz), 3.65 (1H, t, J = 8.8 Hz), 3.92 (1H, m), 4.77 (1H, d, J = 3.8 Hz), 5.48 (1H, d, J = 7.9 Hz), 5.72 (1H, m), 5.80 (1H, d, J = 10.4 Hz), 9.07 (1H, s).
1−(シクロヘキシル−ヒドロキシ−メチル)−4−ヘキシル−5−メチル−6−オキサ−2−アザ−ビシクロ[3.2.0]ヘプタン−3,7−ジオン
融点:167℃;
LCMS(4分の方法):Rt=2.73分、m/z=338(M+H)+;
1H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.87 (3H, t, J = 6.9 Hz), 0.90-1.35 (12H, m), 1.73 (3H, s), 1.40-1.86 (9H, m), 2.40 (1H, t, J = 7.6 Hz), 3.67 (1H, t, J = 7.9 Hz), 5.23 (1H, d, J = 7.9 Hz), 8.85 (1H, s).
(1S)−シクロヘキサ−2−エン−1−イル[(1R,4R,5S)−4−ヘキシル−5−メチル−3,7−ジオキソ−6−オキサ−2−アザビシクロ[3.2.0]ヘプタ−1−イル]メチルアセタート
MS:m/z=378(M+H)+;
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 0.87 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.22-1.34 (6H, m), 1.40-1.85 (8H, m), 1.70 (3H, s), 1.85-2.02 (3H, m), 2.07 (3H, s), 2.67 (1H, dd, J = 8.0, 5.5 Hz), 5.19 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.41 (1H, dd, J = 10.5, 2.1 Hz), 5.74 (1H, m), 8.17 (1H, s).
2−(シクロヘキサ−2−エニル−ヒドロキシ−メチル)−4−ヘキシル−3−ヒドロキシ−3−メチル−5−オキソ−ピロリジン−2−チオカルボン酸S−ベンジルエステル
融点:138℃;
LCMS(4分の方法):Rt=2.92分、m/z=460(M+H)+;
1H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.86 (3H, t, J = 6.9 Hz), 0.98 (1H, m), 1.46 (3H, s), 1.12-1.58 (13H, m), 1.81 (2H, m), 2.07 (1H, m), 2.43 (1H, m), 3.79 (1H, t, J = 6.5 Hz), 4.00 (1H, d, J = 13.8 Hz), 4.09 (1H, d, J = 13.8 Hz), 4.84 (1H, s), 5.00 (1H, d, J = 7.6 Hz), 5.60 (1H, m), 5.76 (1H, d, J =12.0 Hz), 7.18-7.32 (5H, m), 8.14 (1H, s).
2−(シクロヘキサ−2−エニル−ヒドロキシ−メチル)−4−ヘキシル−3−ヒドロキシ−3−メチル−5−オキソ−ピロリジン−2−チオカルボン酸S−(2−アセチルアミノ−エチル)エステル
融点:82℃;
LCMS(4分の方法):Rt=2.38分、m/z=455(M+H)+;
1H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ =0.86 (3H, t, J = 6.8 Hz), 1.09 (1H, m), 1.44 (3H, s), 1.19-1.55 (11H, m), 1.62 (2H, m), 1.79 (3H, m), 1.85 (2H, m), 2.13 (1H, m), 2.44 (1H, m), 2.82 (2H, m), 3.13 (2H, m), 3.79 (1H, t, J = 7.0 Hz), 4.76 (1H, s), 5.02 (1H, d, J = 7.6 Hz), 5.63 (1H, m), 5.79 (1H, d, J = 10.1 Hz), 7.93 (1H, m), 8.18 (1H, s).
3−[2−(シクロヘキサ−2−エニル−ヒドロキシ−メチル)−4−ヘキシル−3−ヒドロキシ−3−メチル−5−オキソ−ピロリジン−2−カルボニルスルファニル]−プロピオン酸メチルエステル
融点:64℃;
LCMS(4分の方法):Rt=2.64分、m/z=456(M+H)+;
1H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.86 (3H, t, J = 6.9 Hz), 1.09 (1H, m), 1.43 (3H, s), 1.15-1.54 (11H, m) 1.61 (2H, m), 1.86 (2H, m), 2.12 (1H, m), 2.44 (1H, t, J = 5.9 Hz), 2.56 (2H, t, J = 6.8 Hz), 2.95 (2H, t, J = 7.1 Hz), 3.60 (3H, s), 3.77 (1H, t, J = 7.1 Hz), 4.76 (1H, s), 5.01 (1H, d, J = 7.7 Hz), 5.63 (1H, m), 5.78 (1H, d, J = 11.9 Hz), 8.18 (1H, s).
2−(シクロヘキサ−2−エニル−ヒドロキシ−メチル)−4−ヘキシル−3−ヒドロキシ−3−メチル−5−オキソ−ピロリジン−2−チオカルボン酸S−シクロヘキシルエステル
融点:85℃;
LCMS(4分の方法):Rt=3.04分、m/z=452(M+H)+;
1H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.86 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.43 (3H, s), 1.09-1.56 (18H, m), 1.56-1.73 (4H, m), 1.74-1.89 (4H, m), 2.15 (1H, m), 2.42 (1H, m), 3.36 (1H, m), 3.79 (1H, t, J = 6.6 Hz), 4.69 (1H, s), 4.94 (1H, d, J = 7.6 Hz), 5.64 (1H, m), 5.78 (1H,d, J = 10.1 Hz), 8.02 (1H, s).
2−(シクロヘキサ−2−エニル−ヒドロキシ−メチル)−3−ヒドロキシ−4−(1−ヒドロキシ−ヘキシル)−3−メチル−5−オキソ−ピロリジン−2−チオカルボン酸S−ベンジルエステル
融点:123℃;
LCMS(4分の方法):Rt=2.84分、m/z=476(M+H)+;
1H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.87 (3H, t, J = 7.0 Hz), 0.94 (1H, m), 1.49 (3H, s), 1.14-1.56 (9H, m), 1.71 (2H, m), 1.81 (2H, m), 2.08 (1H, m), 2.48 (1H, m), 3.77 (1H, t, J = 7.3 Hz), 3.82 (1H, m), 4.01 (1H, d, J = 13.8 Hz), 4.11 (1H, d, J = 13.9 Hz), 5.11 (1H, d, J = 7.3 Hz), 5.20 (1H, d, J = 2.9 Hz), 5.48 (1H, s), 5.61 (1H, m), 5.75 (1H, d, J =10.7 Hz), 7.17-7.32 (5H, m), 8.45 (1H, s).
2−(シクロヘキサ−2−エニル−ヒドロキシ−メチル)−3−ヒドロキシ−4−(1−ヒドロキシ−ヘキシル)−3−メチル−5−オキソ−ピロリジン−2−チオカルボン酸S−(2−アセチルアミノ−エチル)エステル
融点:80℃;
LCMS(4分の方法):Rt=2.19分、m/z=471(M+H)+;
1H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.87 (3H, t, J = 6.3 Hz), 1.48 (3H, s), 1.01-1.75 (12H, m), 1.79 (3H, s), 1.87 (2H, m), 2.14 (1H, m), 2.48 (1H, m), 2.84 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.13 (2H, m), 3.77 (1H, t, J = 7.0 Hz), 3.82 (1H, m), 5.11 (1H, d, J = 7.3 Hz), 5.19 (1H, m), 5.41 (1H, s), 5.64 (1H, m), 5.77 (1H, d, J = 10.1 Hz), 7.93 (1H, m), 8.49 (1H, s).
[2−(シクロヘキサ−2−エニル−ヒドロキシ−メチル)−3−ヒドロキシ−4−(1−ヒドロキシ−ヘキシル)−3−メチル−5−オキソ−ピロリジン−2−カルボニルスルファニル]−酢酸メチルエステル
融点:75℃;
LCMS(4分の方法):Rt=2.46分、m/z=458(M+H)+;
1H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.86 (3H, t, J = 6.9 Hz), 1.02 (1H, m), 1.19-1.39 (7H, m), 1.46 (3H, s), 1.56-1.76 (4H, m), 1.86 (2H, m), 2.17 (1H, m), 2.48 (1H, m), 3.61 (3H, s), 3.68 (2H, s), 3.74 (1H, t, J = 7.2 Hz), 3.80 (1H, m), 5.13 (1H, d, J = 7.3 Hz), 5.17 (1H, d, J = 2.8 Hz), 5.45 (1H, s), 5.64 (1H, m), 5.78 (1H, d, J = 10.4 Hz), 8.57 (1H, s).
2−(シクロヘキシル−ヒドロキシ−メチル)−4−ヘキシル−3−ヒドロキシ−3−メチル−5−オキソ−ピロリジン−2−チオカルボン酸S−ベンジルエステル
融点:181℃;
LCMS(4分の方法):Rt=2.89分、m/z=462(M+H)+;
1H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.86 (3H, t, J = 7.0 Hz), 0.87-1.05 (4H, m), 1.20-1.50 (15H, m), 1.45 (3H, s), 1.56 (1H, m), 1.79 (1H, m), 2.42 (1H, t, J = 6.3 Hz), 3.75 (1H, dd, J = 5.4, 7.0 Hz), 4.00 (1H, d, J = 13.9 Hz), 4.10 (1H, d, J = 13.9 Hz), 4.79-7.83 (2H, m), 7.20-7.30 (5H, m), 7.85 (1H, s).
3−[2−(シクロヘキシル−ヒドロキシ−メチル)−4−ヘキシル−3−ヒドロキシ−3−メチル−5−オキソ−ピロリジン−2−カルボニルスルファニル]−プロピオン酸メチルエステル
融点:132℃;
LCMS(4分の方法):Rt=2.66分、m/z=458(M+H)+;
1H-NMR (500Mz, DMSO-d6): δ = 0.86 (3H, t, J = 6.9 Hz), 1.43 (3H, s), 0.85-1.90 (21H, m), 2.41 (1H, m), 2.55 (2H, m), 2.96 (2H, m), 3.23 (3H, s), 3.73 (1H, t, J = 5.6 Hz), 4.73 (1H, s), 4.83 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.95 (1H, s).
本発明による化合物のインビトロでの効果を次のアッセイで示すことができる:
HTSアッセイ
試験化合物を150μMのSuc−Leu−Leu−Val−Tyr−MCAを含んでいる50mM Tris−HCl(pH8.0)、0.5mM EDTA、0.005% TritonX−100および0.075%SDSで6倍に希釈する。
試験化合物を、ポリプロピレン96ウエルプレートにおいて2.5%DMSO中で種々の濃度に希釈する。内部コントロールとして、MG−132(Cat.#3175-v;ペプチド研究所;大阪;日本)を、試験化合物についてと同じ手順を用いて希釈する。希釈ワーキング溶液(10μl/ウエル)をポリプロピレン96ウエルプレートに移す。アッセイバッファーは、50mM Tris−HCl(pH8.0)、0.5mM EDTA、0.005% TritonX−100、0.005%SDSからなり、ストック溶液として10×濃度に調製される。ペプチド基質(Suc−Leu−Leu−Val−Tyr−MCA;3120v;ペプチド研究所;大阪;日本)は、100%DMSO内で10mMで保存される。このペプチド基質を1.25×濃度のアッセイバッファー中で125μMに希釈し、この基質溶液40μlを化合物溶液に加える。この化合物と基質を室温で10分間プリインキュベートする。次いで、化合物と基質の混合物(10μl/ウエル)を黒色非被覆384ウエルアッセイプレート(Nunc)に移し、自己蛍光放出を460nm(λex、360nm)で ARVO 蛍光プレートリーダー(Perkin Elmer、東京、日本)を使用して測定する。
試験化合物をポリプロピレン96ウエルプレート内で2.5%DMSO中で種々の濃度に希釈する。内部コントロールとして、キモスタチン(Cat.#4063, ペプチド研究所;大阪;日本)を、試験化合物についてと同じ手順を用いて希釈する。希釈ワーキング溶液(10μl/ウエル)をポリプロピレン96ウエルプレートに移す。アッセイバッファーは、50mM TES(pH8.0)、10mM CaCl2、0.1mg/ml BSAからなり、ストック溶液として10×濃度に調製される。ペプチド基質(Suc−Leu−Leu−Val−Tyr−MCA;3120v;ペプチド研究所;大阪;日本)は、100%DMSO中、10mMで保存される。このペプチド基質を1.25×濃度のアッセイバッファー中で50μMに希釈し、この基質溶液40μlを化合物溶液に加える。この化合物と基質を室温で10分間予めインキュベートする。次いで、化合物と基質の混合物(10μl/ウエル)を黒色非被覆384ウエルアッセイプレート(Nunc)に移し、自己蛍光放出を460nm(λex、360nm)で ARVO 蛍光プレートリーダー(Perkin Elmer、東京、日本)を使用して測定する。
試験化合物をポリプロピレン96ウエルプレート内で、2.5%DMSO中、種々の濃度に希釈する。内部コントロールとして、ロイペプチン(Cat.# 4041-v;ペプチド研究所;大阪;日本)を、試験化合物についてと同じ手順を用いて希釈する。希釈ワーキング溶液(10μl/ウエル)をポリプロピレン96ウエルプレートに移す。アッセイバッファーは、50mM Tris−HCl(pH8.0)、150mM NaCl、1mM CaCl2、0.1mg/ml BSA 50mMからなり、ストック溶液として10×濃度に調製される。ペプチド基質(Boc−Gln−Ala−Arg−MCA;3135-v ペプチド研究所;大阪;日本)は、100%DMSO中、1mMで保存される。このペプチド基質を1.25×濃度のアッセイバッファー中で15μMに希釈し、この基質溶液40μlを化合物溶液に加える。この化合物と基質を室温で10分間予めインキュベートする。次いで、化合物と基質の混合物(10μl/ウエル)を黒色非被覆384ウエルアッセイプレート(Nunc)に移し、自己蛍光放出を460nm(λex、360nm)で ARVO 蛍光プレートリーダー(Perkin Elmer、東京、日本)を使用して測定する。
A549ヒト肺上皮細胞株(ATCC #CCL-885)を、10%FCS(Gibco)、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび2mMグルタミンを補充したダルベッコ変法イーグル培地(D-MEM, Nikken Biomedical Institute)中で維持する。A549細胞(80μl/ウエル内で4×104細胞)を、96ウエル平底組織培養プレート内で1時間、溶剤(0.1%DMSO)または試験化合物で処理する。次いで、細胞を100ng/mlTNF−αで24時間刺激する。24時間後に回収される上清のRANTESの濃度を、製造業者の推奨(R&D Systems, Oxon, UK)に従って、定量的サンドイッチ蛍光免疫アッセイ技法を用いて決定する。
6ウエルプレート内で増殖しているサブコンフルエントなA549細胞を37℃で30分間、様々な濃度の阻害剤または溶剤(vehicle)(0.1%DMSO)で前処理する。次いで、細胞を処理せずにおくか、または10ng/ml TNF−αで所定の時間刺激する。この細胞を冷却したPBSで2回洗浄し、100μl SDS−PAGEサンプルバッファーによって氷上で溶解する。細胞溶解物を少しの間超音波処理し、遠心分離し、次に、抗IκBα(New England Biolabs #9242)を製造業者の推奨に従って用いて、上清をSDS−PAGEおよびウエスタンブロット分析に付す。
10%ウシ胎児血清を含んでいる完全培地にウエルあたり3000細胞で、96ウエルアッセイプレート内に細胞(3000)を播き、37℃で24時間インキュベートする。播いた後24時間たってから、化合物を、DMSOの最終濃度は0.1%として、最終濃度範囲が10μMから10nMまでで連続的に希釈して、加える。細胞は、化合物添加後、完全増殖培地中、37℃で72時間インキュベートする。Promega Cell TiterGlo ATP Luminescent アッセイキット (Promega Corp)を使用して、細胞数の間接的測定としての細胞ATP量に基づいて、ウエルあたりの生存細胞の数を発光シグナルの測定によって決定する。試験化合物とのインキュベーション後72時間たってから読み取られた値は、0日の値から差し引かれる。IC50値は、Analyze 5 プログラムで決定される。
細胞型にわたる平均シグナル/ノイズ比=3〜5倍。
本発明による化合物は、次のように医薬製剤に変換することができる:
錠剤
組成
実施例1の化合物100mg、乳糖(一水和物)50mg、トウモロコシ澱粉(天然)50mg、ポリビニルピロリドン(PVP25)(BASF, Ludwigshafen, Germany)10mgおよびステアリン酸マグネシウム2mg。
錠剤重量212mg、直径8mm、曲率半径12mm。
製造
活性成分、乳糖および澱粉の混合物を、水に溶かした5%PVP溶液(m/m)で顆粒化する。顆粒を、乾燥し、次いで、5分間、ステアリン酸マグネシウムと混合する。この混合物を、慣用の錠剤圧縮機で、成型する(錠剤のフォーマット:上記参照)。適用される成型力(moulding force)は、標準的には15kNである。
組成
実施例1の化合物1000mg、エタノール(96%)1000mg、Rhodigel(FMC、ペンシルバニア、USAのキサンタンゴム)400mgおよび水99g。
本発明による化合物の単回服用容量である100mgは、経口用懸濁液10mlによって提供される。
製造
Rhodigel をエタノール中で懸濁し、そして、活性成分を懸濁液に加える。水を攪拌しながら加える。ロジゲルが完全に膨潤するまで、約6時間攪拌を継続する。
Claims (16)
- (1R,4R,5S)−1−[(S)−(1S)−2−シクロヘキセン−1−イル(ヒドロキシ)メチル]−4−ヘキシル−5−メチル−6−オキサ−2−アザビシクロ[3.2.0]ヘプタン−3,7−ジオン:
(1R,4R,5S)−1−[(1R)−2−シクロヘキセン−1−イルメチル]−4−ヘキシル−5−メチル−6−オキサ−2−アザビシクロ[3.2.0]ヘプタン−3,7−ジオン:
- (3S,4R)−2−[(S)−(1S)−2−シクロヘキセン−1−イル(ヒドロキシ)メチル]−3−ヒドロキシ−4−[1−ヒドロキシヘキシル]−3−メチル−5−オキソ−D−プロリン:
メチル−N−アセチル−S−({(2R,3S,4R)−2−[(S)−(1S)−2−シクロヘキセン−1−イル(ヒドロキシ)−メチル]−4−ヘキシル−3−ヒドロキシ−3−メチル−5−オキソ−2−ピロリジニル}カルボニル)システイナート:
- 請求項1または2に記載の、一般式(I)および(Ia)[ここで、式(I)は式(Ib)、(Ic)、(Id)および(Ie)を含む]の化合物を合成する方法、並びに請求項4または5に記載の一般式(II)および(IIa)[ここで、式(II)は式(IIb)、(IIc)および(IId)を含む]の化合物を合成する方法であって、
[A]一般式:
の化合物を、配列番号1を有するストレプトミセス属の放線菌から醗酵および単離によって製造すること、
または、
[B]一般式:
の化合物を、式(Ib)の化合物における二重結合の水素添加によって製造すること、
または、
[C]一般式:
の化合物を、式(Ib)の化合物における二重結合の水和反応によって製造すること、
または、
[D]一般式:
の化合物を、式(Ib)の化合物における二重結合の酸化によって製造すること、
または、
[E]一般式:
R7は、ヒドロキシまたは式:
の置換基を表す]
の化合物を、配列番号1を有するストレプトミセス属の放線菌から醗酵および単離によって製造すること、
または、
[F]一般式:
R7は、
の化合物を、式:
の化合物をチオールと反応させて製造すること、
を特徴とする、上記方法。 - 請求項1〜6に記載の一般式(I)、(Ia)、(II)または(IIa)の少なくとも一つの化合物と薬理学的に許容される賦形剤を含む組成物。
- 急性および慢性炎症過程または癌の処置のための請求項8記載の組成物。
- 請求項1〜6に記載の一般式(I)、(Ia)、(II)および(IIa)の化合物を、慣習的な補助剤とともに適切な適用形態にすることを特徴とする、請求項8および9に記載の組成物の製造方法。
- 薬剤を製造するための、請求項1〜6に記載の一般式(I)、(Ia)、(II)または(IIa)の化合物の使用。
- 急性および慢性炎症過程または癌を処置する薬剤を製造するための請求項11記載の使用。
- 抗炎症に有効な量の請求項1〜6のいずれかに記載の少なくとも一つの化合物を投与することによって、ヒトおよび動物の急性および慢性炎症過程を制御する方法。
- 癌に有効な量の請求項1〜6のいずれかに記載の少なくとも一つの化合物を投与することによって、ヒトおよび動物の癌の過程を制御する方法。
- 寄託番号DSM 15324および配列番号1を有する微生物。
- 式(I)、(Ia)、(II)および(IIa)の化合物の製造のための寄託番号DSM 15324および配列番号1を有する微生物。
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