JP2006517916A - Rna干渉物質を用いてアポトーシス関連疾患を治療および予防する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、遺伝子発現またはタンパク質活性の調節、例えば阻害において有用な組成物および方法の発見に少なくとも一部基づいている。特に、本発明は、アポトーシス関連遺伝子または前炎症性サイトカインを標的として、それによって細胞におけるアポトーシス関連遺伝子発現または前炎症性サイトカインの発現の減少、例えば持続的な減少が起こる新規RNA干渉物質、例えばsiRNA分子に基づく。アポトーシス関連遺伝子発現もしくはタンパク質活性または前炎症性サイトカイン発現もしくはタンパク質活性の、例えば本発明のsiRNAによる阻害は、例えば、移植の拒絶、肝炎、肝損傷、敗血症、および癌を含む、アポトーシス媒介疾患もしくは障害および前炎症性サイトカイン媒介疾患もしくは障害を阻害する。
Description
関連出願
本出願は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、2002年10月30日に提出された米国特許出願第60/422,578号の利益を主張する。
本出願は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、2002年10月30日に提出された米国特許出願第60/422,578号の利益を主張する。
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所(NIH)によって与えられた助成金番号AI42510、AI45406、AI49792、およびAI45306によって政府の補助を受けて一部なされた。政府は本発明において一定の権利を保有する。
本発明は、米国国立衛生研究所(NIH)によって与えられた助成金番号AI42510、AI45406、AI49792、およびAI45306によって政府の補助を受けて一部なされた。政府は本発明において一定の権利を保有する。
発明の背景
アポトーシスとも呼ばれるプログラムされた細胞死(PCD)は、胚の発達および成体器官における組織恒常性において、望ましくない、損傷を受けた、加齢、および/または誤って配置された細胞を消失させる、進化的に保存されたプロセスである(Meier, P.ら(2000)Nature 407:796;Vaux, D.L. and Korsmeyer, S.J.(1999)Cell 96:245)。アポトーシスは、膜の小疱形成、染色質の濃縮および核の断片化を含む、明確な形態学的および生化学的特徴を有する能動的プロセスである。アポトーシスに関与するおよび/またはアポトーシスを調節するいくつかの分子ファミリーが同定されている。例えば、論評、Konopleva, M.ら(1999)、「Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma III」、Kaspersら編、プレナム出版、ニューヨーク、およびVermeulen, K.ら(2003)Cell Prolif. 36:165を参照されたい。カスパーゼは、死または生存シグナルに反応する分子によって活性化および/または調節される主なエフェクター分子である。カスパーゼは、これらのシグナルに反応して、それら自身が調節を受ける一連の細胞内段階または経路を通して活性化または不活化される。哺乳類細胞において定義される二つの主要なアポトーシス経路、すなわちデス受容体経路およびミトコンドリア経路が存在する。
アポトーシスとも呼ばれるプログラムされた細胞死(PCD)は、胚の発達および成体器官における組織恒常性において、望ましくない、損傷を受けた、加齢、および/または誤って配置された細胞を消失させる、進化的に保存されたプロセスである(Meier, P.ら(2000)Nature 407:796;Vaux, D.L. and Korsmeyer, S.J.(1999)Cell 96:245)。アポトーシスは、膜の小疱形成、染色質の濃縮および核の断片化を含む、明確な形態学的および生化学的特徴を有する能動的プロセスである。アポトーシスに関与するおよび/またはアポトーシスを調節するいくつかの分子ファミリーが同定されている。例えば、論評、Konopleva, M.ら(1999)、「Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma III」、Kaspersら編、プレナム出版、ニューヨーク、およびVermeulen, K.ら(2003)Cell Prolif. 36:165を参照されたい。カスパーゼは、死または生存シグナルに反応する分子によって活性化および/または調節される主なエフェクター分子である。カスパーゼは、これらのシグナルに反応して、それら自身が調節を受ける一連の細胞内段階または経路を通して活性化または不活化される。哺乳類細胞において定義される二つの主要なアポトーシス経路、すなわちデス受容体経路およびミトコンドリア経路が存在する。
デス受容体経路は、FAS抗原とも呼ばれるFAS受容体(Fas)を通して細胞表面で開始される。Fasは、様々な組織において発現され(Watanabe-Fukunaga, R.ら(1992)、J. Immunol. 148:1274〜1279)、TNF-RおよびNGF-Rを含む多くの細胞表面受容体と相同性を共有する。FasとFasリガンド(FasL)との相互作用は、アポトーシスの重要な調節因子である。FasおよびFasLはいずれも、典型的に膜に結合しているため、FasまたはFasLのいずれかを発現する細胞は一般的に、細胞死を誘導するためにその相手を発現する細胞と接触しなければならず(Rowe, P.M.、Lancet 1996、347:1398)、これによって下流の一連の事象およびカスパーゼの活性化が起こり、最終的に細胞死に至る(Ashkenazi, A. and Dixit, V.M.(1998)Science 281:1305)。
アポトーシスに対する抵抗性によって、不要な、自己特異的、感染または変異細胞が持続することにより、自己免疫障害、炎症、または癌のような障害が起こりうる(Green, D.R. and Evans, G.(2002)Cancer Cell 1:19;Thompson, C.B.(1995)Science 267:1456;Zornig, M.ら(2001)、Biochim. Biophys. Acta 1551:F1)。対照的に、アポトーシスの増強は、毒素産生微生物による感染症、虚血-再潅流損傷、または梗塞のような急性疾患のみならず、神経変性疾患、神経筋疾患、およびAIDSのような慢性的な病態に関与する(Mattson, M.P.(2002)Mol. Cell Biol. 1:120;Rathmell, J.C. and Thompson, C.B.(2002)Cell 109(補則):S97)。したがって、プログラムされた細胞死を調節することは、生命を救いうる。
発明の概要
本発明は、少なくとも一部、遺伝子発現またはタンパク質活性、例えばアポトーシス関連遺伝子発現またはタンパク質活性の調節、例えば阻害において有用な組成物および方法の発見に基づく。特に、本発明は、一つまたはそれ以上のアポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαを標的として、それによって細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または悪性細胞における、アポトーシス関連遺伝子発現、例えばFas、FasL、または前炎症性サイトカインの減少、例えばアポトーシス関連遺伝子発現、例えば、Fas、FasL、または前炎症性サイトカインの持続的な減少が起こる、新規RNA干渉物質、例えばsiRNA分子に基づく。
本発明は、少なくとも一部、遺伝子発現またはタンパク質活性、例えばアポトーシス関連遺伝子発現またはタンパク質活性の調節、例えば阻害において有用な組成物および方法の発見に基づく。特に、本発明は、一つまたはそれ以上のアポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαを標的として、それによって細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または悪性細胞における、アポトーシス関連遺伝子発現、例えばFas、FasL、または前炎症性サイトカインの減少、例えばアポトーシス関連遺伝子発現、例えば、Fas、FasL、または前炎症性サイトカインの持続的な減少が起こる、新規RNA干渉物質、例えばsiRNA分子に基づく。
一つの態様において、物質は、Fas、FasL、IL-1、もしくはTNFα遺伝子またはその断片と相同なRNAである。もう一つの態様において、物質は、表1(下記)に記載される一つまたはそれ以上のアポトーシス関連遺伝子、またはその断片と相同なRNAである。もう一つの態様において、物質は、表1に記載される任意のアポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1またはTNFαと相同である二本鎖の短い干渉RNA(siRNA)である。さらなる態様において、物質は、表1に記載される任意のアポトーシス関連遺伝子と相同である短いヘアピンRNA(shRNA)である。siRNAは、長さが約19ヌクレオチド〜約28ヌクレオチド、長さが約19ヌクレオチド〜約25ヌクレオチド、または例えば長さが約21ヌクレオチドであってもよい。一つの態様において、siRNAは二本鎖であり、かつそれぞれの鎖に3'突出末端を含む。突出末端は、それぞれの鎖に関して約1〜約6ヌクレオチドであってもよく、または例えばそれぞれの鎖に関して約2ヌクレオチドであってもよい。
一つの態様において、RNA干渉物質は、合成siRNAである。もう一つの態様において、siRNAの第一の鎖は、配列番号:1の配列を含み、siRNAの第二の鎖は、配列番号:2の配列を含む。さらなる態様において、siRNAの第一の鎖は、配列番号:3の配列を含み、siRNAの第二の鎖は配列番号:4の配列を含む。さらにもう一つの態様において、siRNAの第一の鎖は配列番号:9の配列を含み、siRNAの第二の鎖は配列番号:10の配列を含む。さらにもう一つの態様において、siRNAの第一の鎖は配列番号:11の配列を含み、siRNAの第二の鎖は配列番号:12の配列を含む。
もう一つの態様において、RNA干渉物質、例えばsiRNAは、アポトーシス関連mRNA、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαの分解を誘導または調節することができる。さらにもう一つの態様において、RNA干渉物質、例えばsiRNAは、アポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαを、転写サイレンシングによって不活化する。
もう一つの局面において、本発明は、アポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαと相同であり、かつアポトーシス関連遺伝子のRNA干渉、例えばFas、FasL、IL-1またはTNFαRNA干渉を促進することができるRNA干渉物質、例えばsiRNAを含むベクターを提供する。もう一つの態様において、本発明は、アポトーシス関連遺伝子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFα遺伝子と相同であり、かつアポトーシス関連遺伝子のRNA干渉、例えばFas、FasL RNA干渉、または前炎症性サイトカインのRNA干渉、例えばIL-1またはTNFαRNA干渉を促進することができるRNAをコードするDNA鋳型を含むベクターを提供する。もう一つの局面において、本発明は、アポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαと相同であり、かつアポトーシス関連遺伝子のRNA干渉、例えばFas、FasL、または前炎症性サイトカインのRNA干渉、例えばIL-1もしくはTNFαRNA干渉を促進することができるRNA干渉物質、例えばsiRNAを含むベクター、またはアポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαと相同であり、かつアポトーシス関連遺伝子のRNA干渉、例えばFas、FasL、IL-1もしくはTNFαのRNA干渉を行うことができるRNAをコードするDNA鋳型を含むベクターをトランスフェクトした細胞を提供する。
さらなる局面において、本発明は、RNA干渉物質、例えばアポトーシス関連遺伝子発現、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFα遺伝子発現を調節するsiRNAを細胞に投与することを含む、細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または悪性細胞においてアポトーシスを阻害する方法を提供する。なおさらなる局面において、本発明は、RNA干渉物質、例えばアポトーシス関連遺伝子発現を調節するsiRNAを被験者に投与することを含む、被験者におけるアポトーシス関連遺伝子発現、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαの遺伝子発現を阻害する方法を提供する。
なおもう一つの局面において、本発明は、アポトーシス関連遺伝子発現、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαの発現が阻害されるように、アポトーシス関連遺伝子発現、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαの遺伝子発現を調節するRNA干渉物質、例えばsiRNAの治療的または予防的有効量を被験者に投与することを含む、アポトーシス媒介疾患または障害を有する被験者を治療する方法を提供する。一つの態様において、疾患または病態は、免疫または炎症性疾患、例えば、敗血症、肝炎、線維症、癌、例えば肝臓癌、または移植の拒絶である。RNA干渉物質、例えばsiRNAは、例えば1回注射によって静脈内投与してもよく、または繰り返し静脈内注射によって投与してもよい。
もう一つの局面において、本発明は、アポトーシス関連遺伝子発現、例えばFas経路分子の発現を調節するRNA干渉物質、例えばsiRNAを同種異系移植片のレシピエントに投与することを含む、同種異系移植片のレシピエントにおける同種異系移植片、例えば肝移植片の拒絶を予防する方法を提供する。関連する局面において、本発明は、アポトーシス関連遺伝子発現、例えばFas分子の発現を調節するRNA干渉物質、例えばsiRNAをエクスビボで同種異系移植片に接触させることを含む、同種異系移植片のレシピエントによる同種異系移植片、例えば肝移植片の拒絶を予防する方法を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、前炎症性サイトカインの発現が阻害されるように、前炎症性サイトカイン発現を調節するsiRNAの治療的または予防的有効量を被験者に投与することを含む、被験者における前炎症性サイトカイン媒介疾患または障害を治療または予防する方法に向けられる。一つの態様において、前炎症性サイトカイン媒介疾患または障害は敗血症である。もう一つの態様において、前炎症性サイトカインは、IL-1もしくはTNFα、またはその断片である。
本発明の他の特徴および長所は、以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかであろう。
発明の詳細な説明
本発明は、遺伝子発現またはタンパク質活性、例えばアポトーシス関連遺伝子発現もしくはタンパク質活性、または前炎症性サイトカイン発現もしくは活性の調節、例えば阻害において有用な組成物および方法の発見に少なくとも部分的に基づいている。特に、本発明は、アポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαを標的として、その結果細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または悪性細胞におけるアポトーシス関連遺伝子発現、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFα遺伝子発現を減少させる、例えば持続的に減少させる新規RNA干渉物質、例えば小さい干渉RNA(siRNA)分子に基づく。さらにもう一つの態様において、本発明のRNA干渉物質は、アポトーシス関連疾患または障害、例えば免疫もしくは炎症疾患、例えば肝炎、線維症、癌、例えば肝臓癌、硬変、移植の拒絶、または敗血症を、例えば治療的または予防的に治療するために被験者に投与してもよい。
本発明は、遺伝子発現またはタンパク質活性、例えばアポトーシス関連遺伝子発現もしくはタンパク質活性、または前炎症性サイトカイン発現もしくは活性の調節、例えば阻害において有用な組成物および方法の発見に少なくとも部分的に基づいている。特に、本発明は、アポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαを標的として、その結果細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または悪性細胞におけるアポトーシス関連遺伝子発現、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFα遺伝子発現を減少させる、例えば持続的に減少させる新規RNA干渉物質、例えば小さい干渉RNA(siRNA)分子に基づく。さらにもう一つの態様において、本発明のRNA干渉物質は、アポトーシス関連疾患または障害、例えば免疫もしくは炎症疾患、例えば肝炎、線維症、癌、例えば肝臓癌、硬変、移植の拒絶、または敗血症を、例えば治療的または予防的に治療するために被験者に投与してもよい。
本明細書において用いられるように、プログラムされた細胞死(PCD)とも呼ばれる「アポトーシス」という用語は、核の異質染色質の濃縮、細胞収縮、細胞質濃縮、およびアポトーシスのより後期段階では、エンドヌクレアーゼによる細胞DNAの個々の断片への切断が含まれるがこれらに限定されない特徴を特徴とする細胞死である。アポトーシスが起こった細胞のDNA切断の電気泳動分析を行うと、特徴的な「梯子状の」個々のDNA断片が認められる可能性がある。
本明細書において用いられるように、「アポトーシス関連遺伝子」または「アポトーシス関連分子」には、アポトーシスシグナルの形質導入または調節に関係する任意の上流または下流の分子、例えば当業者に既知のアポトーシスまたは抗アポトーシス経路に関与または関係する分子が含まれる(例えば、Konopleva, M.ら、「Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma III」、第24章(Kaspersら編、1999、参照として本明細書に組み入れられる)を参照されたい)。
アポトーシス関連遺伝子には、表1(下記)に記載の分子が含まれるがこれらに限定されない。同様に、参照として本明細書に組み入れられる、Siegel, R.M. and Fleisher, T.A.(1999)J. Allergy Clin. Immunol. 103:729〜738も参照されたい。表1に記載の分子は、遺伝子の名称と共にGenbankGI番号によって同定される。それぞれのGenbank記録に含まれる配列情報は、参照として本明細書に組み入れられる。
本明細書において用いられるように、アポトーシス関連遺伝子は、Bcl-Xs、Bax、Fas、FasL、およびカスパーゼが含まれるがこれらに限定されない、アポトーシスまたは細胞死を促進する「前アポトーシス遺伝子」であってもよい。アポトーシス関連遺伝子は、Bcl-2、Bcl-xl、およびIAP分子が含まれるがこれらに限定されない、アポトーシスまたは細胞死を阻害する「抗アポトーシス遺伝子」であってもよい。
アポトーシス関連遺伝子には、Fas経路分子、例えばFas、FasL、およびTNF-R1;カスパーゼ、例えばグループIカスパーゼ、グループIIカスパーゼ、およびグループIIIカスパーゼ;ミトコンドリア経路分子、例えばBclファミリー分子、例えばBcl-2、Bcl-xl、BclXs、bag、bcl-w、A1、Mcl-1、Bax/Bak様タンパク質、Bax、Bak、Bok(Mtd)、BCL-Xs、Bcl rambo、bcl-G1、Bik、Blk、Nbk、Bad、Hrk/DP5、Bid、Bim(Bod)、Noxa、Puma/Bbc3、Bmf、BNip1、BNip2、BNip3、Nix、Hrk(DP5)、Noxa、Puma、p193、Bmf、Bcl-G BCL相互作用タンパク質;FOXOファミリーメンバー、例えばFOXO1aおよびFOXO3a;JAK/STATファミリーメンバー、例えばJAK1、JAK2、Stat1、Stat2、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、およびStat6等;ならびにキナーゼファミリーメンバー、例えばサイクリン依存的キナーゼ、マイトゲン活性化タンパク質キナーゼ(MAPキナーゼ)が含まれるがこれらに限定されない。
他のアポトーシス関連分子には、任意のアポトーシスもしくは抗アポトーシス経路の上流もしくは下流に存在する、または任意のアポトーシス関連分子によって活性化もしくは不活化される任意の分子が含まれる(例えば、表1を参照されたい)。
本明細書において用いられるように、「アポトーシス関連遺伝子活性」には、例えばFas活性、例えばアポトーシス、炎症の調節、または免疫応答の調節が含まれるがこれらに限定されない。
Fas経路分子
Fas経路分子には、Fasによって誘導されるアポトーシスまたはPCDに至る経路に関係または関連する任意の分子が含まれる。Fas経路分子には、Fas、Fasリガンド(FasL)、およびTNFR受容体スーパーファミリーメンバーが含まれるがこれらに限定されない。FADD、カスパーゼ8、bid、およびカスパーゼ3も同様に、Fas経路分子として含まれる。Fas経路分子はまた、本明細書において定義される他の群に含まれてもよい。
Fas経路分子には、Fasによって誘導されるアポトーシスまたはPCDに至る経路に関係または関連する任意の分子が含まれる。Fas経路分子には、Fas、Fasリガンド(FasL)、およびTNFR受容体スーパーファミリーメンバーが含まれるがこれらに限定されない。FADD、カスパーゼ8、bid、およびカスパーゼ3も同様に、Fas経路分子として含まれる。Fas経路分子はまた、本明細書において定義される他の群に含まれてもよい。
Fas経路は、FasLによる細胞上のFas受容体のライゲーションによってアポトーシスを誘導する。APO-1またはCD95としても知られるFas受容体は、TNFR受容体スーパーファミリーのメンバーである。TNFRファミリーの他のメンバーには、それぞれがアポトーシスを直接開始するデスドメインを有するTNF-R1、DR-3、DR-4、およびDR-5が含まれる(表1を参照されたい)。FasLのFas受容体への結合によって、細胞膜上の受容体の集合が起こり、DISCまたはデス誘導シグナル複合体として知られる細胞内シグナル伝達分子の特異的動員が起こる。アダプタータンパク質FADDは、Fasの細胞内デスドメインに結合して、それによってFLICEまたはMACHとしても知られるカスパーゼ-8が動員される。Fas誘導細胞死は、ミトコンドリアの透過性転移を変化させる経路を活性化させる可能性がある。
Fas受容体の関与は、炎症細胞の浸潤および二次的な壊死を伴い、同様に免疫細胞を動員して活性化し、それによって前炎症性環境において細胞、例えば肝細胞の死を引き起こす細胞ケモカイン、例えば肝ケモカインの発現を誘導することによって、炎症、例えば肝臓の炎症を誘発する。したがって、例えば本発明のsiRNAによるアポトーシス関連遺伝子発現またはタンパク質活性、例えばFas発現またはタンパク質活性の阻害は、アポトーシス、炎症、および免疫応答を阻害する。
カスパーゼ
カスパーゼ分子には、システインプロテアーゼとして機能し、アポトーシスのエフェクターとして作用する任意の酵素が含まれる。カスパーゼ分子は、参照として本明細書に組み入れられる、Nicholson, D.W.(1999)Cell Death Differentiation 6(11):1028において記述される。カスパーゼは、そのほとんどがタンパク質切断によって活性化される不活性なプロ酵素として存在する。カスパーゼ分子には、グループIカスパーゼ(カスパーゼ1、4および5)、グループIIカスパーゼ(カスパーゼ-2、-3、および-7)、グループIIIカスパーゼ(カスパーゼ-6、-8、-9、および-10)、FLIP(FLICE-阻害タンパク質)、ならびにカスパーゼ-9、-10、-11、-12、および-13が含まれるがこれらに限定されない。カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-3は、アポトーシス経路における肝要な接合部に位置している。
カスパーゼ分子には、システインプロテアーゼとして機能し、アポトーシスのエフェクターとして作用する任意の酵素が含まれる。カスパーゼ分子は、参照として本明細書に組み入れられる、Nicholson, D.W.(1999)Cell Death Differentiation 6(11):1028において記述される。カスパーゼは、そのほとんどがタンパク質切断によって活性化される不活性なプロ酵素として存在する。カスパーゼ分子には、グループIカスパーゼ(カスパーゼ1、4および5)、グループIIカスパーゼ(カスパーゼ-2、-3、および-7)、グループIIIカスパーゼ(カスパーゼ-6、-8、-9、および-10)、FLIP(FLICE-阻害タンパク質)、ならびにカスパーゼ-9、-10、-11、-12、および-13が含まれるがこれらに限定されない。カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-3は、アポトーシス経路における肝要な接合部に位置している。
ミトコンドリア経路の分子
ミトコンドリア経路は、チトクロームcおよび他のタンパク質の放出を通して細胞内で開始され、次にカスパーゼを活性化して、次にこれが一連の細胞タンパク質を切断して、デスプログラムを促進する(Thornberry, N.A. and Lazebnik, Y.(1998)Science 281:1312;Wang, X.(2001)Genes Dev. 15:2922)。Bcl-2タンパク質ファミリーは、アポトーシスおよび壊死の際のこれらのミトコンドリアの変化を調節する(Adams J.M. and Coreys S.(1992)、Science 281:1322;Tsujimoto, Y. and Shimizu, S.(2000a)、FEBS Lett. 466:6)。
ミトコンドリア経路は、チトクロームcおよび他のタンパク質の放出を通して細胞内で開始され、次にカスパーゼを活性化して、次にこれが一連の細胞タンパク質を切断して、デスプログラムを促進する(Thornberry, N.A. and Lazebnik, Y.(1998)Science 281:1312;Wang, X.(2001)Genes Dev. 15:2922)。Bcl-2タンパク質ファミリーは、アポトーシスおよび壊死の際のこれらのミトコンドリアの変化を調節する(Adams J.M. and Coreys S.(1992)、Science 281:1322;Tsujimoto, Y. and Shimizu, S.(2000a)、FEBS Lett. 466:6)。
bcl-2タンパク質ファミリーは、アポトーシスの阻害剤(抗アポトーシス分子)およびアポトーシスのプロモーター(前アポトーシス分子)の双方からなる。Bcl-2ファミリータンパク質は、BHドメインと呼ばれる保存された配列類似性の領域を、同定された四つのBHドメイン(BH1〜4)の少なくとも一つを共有する全てのメンバーと共有する。Bcl-2そのものは、細胞の生存を促進する抗アポトーシスタンパク質である。他の抗アポトーシスbclファミリーメンバーには、例えばbcl-xL、bag、bcl-w、A1、およびMcl-1が含まれる。bclファミリーには二つの前アポトーシスサブグループが存在する。一つの前アポトーシスサブグループは、多ドメイン相同性を有し、これには例えばBax/Bak様タンパク質、Bax、Bak、Bok(Mtd)、BCL-Xs、Bcl rambo、およびbcl-G1が含まれる。第二の前アポトーシスサブタイプは、BH3のみの相同性を有し、例えばBik、Blk、Nbk、Bad、Hrk/DP5、Bid、Bim(Bod)、Noxa、Puma/Bbc3、Bmf、BNip1、BNip2、BNip3、Nix、Hrk(DP5)、Noxa、Puma、p193、Bmf、およびBcl-Gが含まれる。ミトコンドリア経路分子にはまた、BCL相互作用タンパク質も含まれる。
FOXOファミリーメンバー
FOXOフォークヘッド転写因子ファミリーには、Foxo3a(FXHRL1)、Foxo1(FKHR)、およびFoxo4(AFX)が含まれ、その全てがPTEN/PI3K/AKT経路の下流のエフェクターであり、直接燐酸化されて、それによってタンパク質キナーゼAKTによって不活化される(細胞質に滞留することによって)(Tran, H.ら、2003、Sci. SKTE 2003、RE5;Ogg, S. and Ruvkun, G.、1998、Mol. Cell 2:887;Paradis, S. and Ruvkun, G. 1998、Genes Dev. 12:2488;Dorman, J.B.ら、1995、Genetics 141:1399、参照として本明細書に組み入れられる)。
FOXOフォークヘッド転写因子ファミリーには、Foxo3a(FXHRL1)、Foxo1(FKHR)、およびFoxo4(AFX)が含まれ、その全てがPTEN/PI3K/AKT経路の下流のエフェクターであり、直接燐酸化されて、それによってタンパク質キナーゼAKTによって不活化される(細胞質に滞留することによって)(Tran, H.ら、2003、Sci. SKTE 2003、RE5;Ogg, S. and Ruvkun, G.、1998、Mol. Cell 2:887;Paradis, S. and Ruvkun, G. 1998、Genes Dev. 12:2488;Dorman, J.B.ら、1995、Genetics 141:1399、参照として本明細書に組み入れられる)。
JAK/STATファミリーメンバー
STAT(シグナル伝達転写活性化因子)分子には、サイトカイン受容体からDNAの転写調節要素へとシグナルを伝達することができる分子が含まれる。STATsは、サイトカインおよび増殖因子に反応して正常な細胞シグナル伝達において基本的な役割を果たす。サイトカインまたは増殖因子が細胞表面上の受容体に結合した後、細胞質チロシンキナーゼ(特にJAKまたはSrcキナーゼファミリー)の活性化、または受容体固有のチロシンキナーゼ活性(EGFまたはPDGFに関するキナーゼ活性のような)の活性化のいずれかが起こる。いずれの経路によっても、チロシンの燐酸化によって、最初にSTAT単量体の活性化が起こり、その後SH-2と呼ばれる特定のドメインの相互作用を通して二量体を形成する。次に、二量体は、核に移動して、転写を誘導するために標的遺伝子のγ活性化部位(GAS)と呼ばれるSTAT-特異的DNAコンセンサスモチーフに結合する。現在、7個の既知のSTATファミリーメンバーが存在する。JAK/STATファミリーメンバーの例を表1に示す。
STAT(シグナル伝達転写活性化因子)分子には、サイトカイン受容体からDNAの転写調節要素へとシグナルを伝達することができる分子が含まれる。STATsは、サイトカインおよび増殖因子に反応して正常な細胞シグナル伝達において基本的な役割を果たす。サイトカインまたは増殖因子が細胞表面上の受容体に結合した後、細胞質チロシンキナーゼ(特にJAKまたはSrcキナーゼファミリー)の活性化、または受容体固有のチロシンキナーゼ活性(EGFまたはPDGFに関するキナーゼ活性のような)の活性化のいずれかが起こる。いずれの経路によっても、チロシンの燐酸化によって、最初にSTAT単量体の活性化が起こり、その後SH-2と呼ばれる特定のドメインの相互作用を通して二量体を形成する。次に、二量体は、核に移動して、転写を誘導するために標的遺伝子のγ活性化部位(GAS)と呼ばれるSTAT-特異的DNAコンセンサスモチーフに結合する。現在、7個の既知のSTATファミリーメンバーが存在する。JAK/STATファミリーメンバーの例を表1に示す。
キナーゼファミリーメンバー
キナーゼファミリーメンバーには、基質の燐酸化を行うことができる任意の酵素が含まれる。キナーゼファミリーメンバーは、触媒ドメインを含み、このドメインに基づいて分類されている(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、S. Hanks and A.M. Quinn(1991)、Methods in Enzymology 2000、38〜62を参照されたい)。近縁の触媒ドメインを有するキナーゼはまた、1)全体的な構造の位相学が類似である、2)類似の調節様式を有する、および3)類似の基質特異性を有する傾向がある。キナーゼファミリーメンバーの例を表1に記載する。
キナーゼファミリーメンバーには、基質の燐酸化を行うことができる任意の酵素が含まれる。キナーゼファミリーメンバーは、触媒ドメインを含み、このドメインに基づいて分類されている(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、S. Hanks and A.M. Quinn(1991)、Methods in Enzymology 2000、38〜62を参照されたい)。近縁の触媒ドメインを有するキナーゼはまた、1)全体的な構造の位相学が類似である、2)類似の調節様式を有する、および3)類似の基質特異性を有する傾向がある。キナーゼファミリーメンバーの例を表1に記載する。
「アポトーシス媒介疾患または障害」または「アポトーシス関連疾患または障害」には、その発生または発症、例えば進行が不適当もしくは過剰なアポトーシスもしくは細胞死、またはアポトーシスもしくは細胞死、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞死の減少のいずれかに関連する、またはそれによって調節される任意の疾患、障害、または感染症が含まれる。
一つの態様において、アポトーシス関連疾患または障害は、アポトーシスの予防または阻害に至る前アポトーシス遺伝子の阻害または発現が有用である一つまたはそれ以上の前アポトーシス遺伝子に関連するまたはそれによって媒介され、例えば感染症(例えば、ウイルス、細菌、または寄生虫)、自己免疫疾患および障害、ならびに移植片対宿主病である。
アポトーシス媒介疾患または障害の例には、感染疾患または障害、免疫疾患または障害、炎症疾患または障害、肝細胞の損傷または障害を含む肝損傷または障害を引き起こす疾患または障害、例えばウイルス性および自己免疫性肝炎によって誘導される急性および慢性的な肝損傷、線維症、急性および慢性肝不全、肝炎、例えばHBV、HCV、劇症肝炎、アルコール誘発性肝炎、胆汁うっ滞性肝炎、ウィルソン病および自己免疫性肝炎を含む免疫関連肝疾患のような多様な肝疾患、ならびに移植の拒絶、例えば肝臓移植の拒絶が含まれるがこれらに限定されない。
炎症または免疫系の疾患または障害の例には、敗血症、播種性血管内凝固、ウイルス感染症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、白血球接着不全II症候群、腹腔炎、慢性閉塞性肺疾患、肺炎症、喘息、急性虫垂炎、腎炎、アミロイドーシス、慢性気管支炎、サルコイドーシス、強皮症、狼瘡、多発筋炎、ライター症候群、乾癬、骨盤内炎症性疾患、炎症性乳腺疾患、眼窩炎症性疾患、免疫不全障害(例えば、HIV、後天性免疫グロブリン血症、先天性X連鎖乳児低γグロブリン血症、一過性の低γグロブリン血症、選択的IgA欠損、慢性粘膜皮膚カンジダ症、重症複合免疫不全)、および自己免疫疾患または障害が含まれるがこれらに限定されない。
自己免疫疾患または障害の例には、多発性硬化症、インスリン依存型真性糖尿病、関節炎(例えば、リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、変形性関節炎)、重症筋無力症(myesthenia gravis)、心筋炎、ギラン-バレ症候群、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー、皮膚紅斑性狼瘡、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい逆転反応、結節性紅斑らい、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音性難聴、再生不良性貧血、真正赤血球貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス-ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーヴス眼障害、サルコイドーシス、硬変、例えば原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、および間質性肺線維症が含まれる。
本明細書において用いられるように、「感染疾患または障害」という用語は、任意の感染物質による感染症によって引き起こされる、またはそれに関連する任意の疾患、障害、または感染症として定義される。例えば、感染疾患または障害には、ウイルス感染物質、細菌感染物質、真菌感染物質、または原虫感染物質による感染症によって引き起こされるまたは関連する疾患または障害が含まれる。感染疾患または障害の例には、ウイルス感染物質、例えばHIVによって引き起こされる、または関連する疾患または障害、AIDS関連痴呆、カポジ肉腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、および浸潤性扁平上皮癌のようなAIDS関連癌、AIDS関連疾患または障害、CMV、RSV、HSV、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、マレー谷脳炎、ポリオウイルス、インフルエンザ、ライノウイルス、西ナイルウイルス、エボラウイルス、***ウイルス、サイトメガロウイルス(特にヒト)、ロタウイルス、エプスタイン-バーウイルス、水痘-帯状疱疹ウイルス、パラミクソウイルス:呼吸合包体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、またはインフルエンザウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス(例えば、HPV6、11、16、18等)が含まれるがこれらに限定されないウイルス感染症、肝炎、例えばHBV、HCV、HGV、およびヘルペス(HSV-2)のような、しかしこれらに限定されない他の性的伝幡疾患感染症が含まれる。
アポトーシス媒介疾患および障害の他の例は、肺線維症、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、およびヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)関連慢性胃炎である。
もう一つの態様において、アポトーシス媒介疾患または障害は、アポトーシスの増加または増強が起こる抗アポトーシス遺伝子の発現の阻害が有用である一つまたはそれ以上の抗アポトーシス遺伝子によって媒介され、例えば癌である。アポトーシス媒介疾患および障害には、細胞増殖、増殖、分化、または遊走障害が含まれるがこれらに限定されない抗アポトーシス遺伝子に関連する疾患または障害、およびアポトーシスまたは細胞死が減少している疾患または障害が含まれる。そのような障害には、癌、例えば癌腫、肉腫、リンパ腫、または白血病が含まれ、それらの例には、卵巣癌、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、子宮癌、肝癌、消化器癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肝癌、および脳癌、腫瘍の血管新生および転移;骨格異形成;ならびに造血および/または骨髄増殖性障害が含まれるがこれらに限定されない。「新生物」、「過形成」、および「腫瘍」という用語はしばしば、「癌」として一般的に呼ばれているが、これは制御されない異常な細胞増殖を特徴とする100を超える疾患の一般名称である。本明細書において用いられるように、「腫瘍」には、正常な、良性、または悪性組織塊も含まれる。
さらなる態様において、本発明は、同種異系移植片レシピエントに、アポトーシス関連遺伝子、例えばFasの発現を調節する、例えば阻害するRNA干渉物質、例えばsiRNAを投与することを含む、同種異系移植片レシピエントにおける同種異系移植片の拒絶を予防する方法を提供する。RNA干渉物質、例えばsiRNAは、同種異系移植片の前、同種異系移植片技術の際に、もしくは移植後に被験者に投与してもよく、または同種異系移植片に直接投与してもよい。さらに、RNA干渉物質、例えばsiRNAは、細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞、または組織、例えば血液、もしくは肝組織にエクスビボまたはインビボで投与することができる。一つの態様において、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAは、例えば肝動脈または門脈カニューレによって局所的に輸送してもよい。
サイトカイン
アポトーシス関連遺伝子の他に、本発明のRNA干渉物質の他の標的には、サイトカイン、例えば前炎症性サイトカイン、例えばIL-1βおよびTNFα、ならびに抗炎症性サイトカイン、例えばCSF2、CSF3、TGFβが含まれる。
アポトーシス関連遺伝子の他に、本発明のRNA干渉物質の他の標的には、サイトカイン、例えば前炎症性サイトカイン、例えばIL-1βおよびTNFα、ならびに抗炎症性サイトカイン、例えばCSF2、CSF3、TGFβが含まれる。
前炎症性サイトカイン分子には、例えば、損傷、感染症、もしくは任意の免疫疾患もしくは障害により、またはアポトーシス関連遺伝子に反応して、炎症の任意の局面を加速または誘発する任意の免疫調節性サイトカインが含まれる。前炎症性サイトカインは、内因性の発熱物質(例えば、IL1、TNFα)として作用する可能性があり、マクロファージおよび間葉細胞(線維芽細胞、上皮細胞、および内皮細胞)の両者による二次メディエータおよび他の前炎症性サイトカインの合成をアップレギュレートする可能性があり、急性期タンパク質の産生を刺激する可能性があり、または炎症細胞を誘引する可能性がある。前炎症性サイトカインには、例えば、IL1α、IL1β、およびTNFα、LIF、IFNγ、OSM、CNTF、TGFβ、GM-CSF、IL11、IL12、IL17、IL18、IL8、および炎症細胞を化学誘引する多様な他のサイトカインが含まれるがこれらに限定されない。サイトカイン、例えば前炎症性サイトカインの他の例を、表1に含める。
前炎症性サイトカイン分子には、炎症の任意の局面、例えば細胞の活性化または前炎症性サイトカインの産生を中和して、このようにインビボで炎症反応の程度の制御に関与する任意の免疫調節性サイトカインが含まれ。一つの態様において、抗炎症性サイトカインは、前炎症性サイトカインの産生の阻害によって、または前炎症性メディエータの多くの生物作用を異なるように中和することによって作用する。抗炎症性サイトカインには、例えばIL4、IL10、およびIL13が含まれるがこれらに限定されない。他の抗炎症性メディエータには、IL16、IFNα、TGF、IL1ra、またはG-CSFが含まれる。
多くの微生物が、制御不良の免疫応答を活性化することによって間接的に死を引き起こす。この例は、その細胞壁の成分としてリポ多糖類(LPS)を有するグラム陰性菌、およびあまり十分に特徴付けされていない細胞壁成分を通してのグラム陽性菌による細菌感染症の際の敗血症ショックおよび播種性血管内凝固である。マクロファージ上のLPS受容体の関与は、マクロファージを活性化させて、前炎症性サイトカイン、例えばTNFαおよびIL-1βを合成および分泌させる。これらの高濃度の前炎症性サイトカインは、血管漏出症候群を誘導し、それによって、循環中の血液量を維持することが不可能となり、それによってショックに至る。TNFαはまた、敗血症ショックの際の肝不全における原因因子として関係している。
タンパク質合成の前に前炎症性サイトカイン発現を標的とするためにRNAiを用いることは、敗血症を治療および/または予防するために有効となる可能性がある。一つの態様において、一つより多い炎症性メディエータ、例えば一つより多い前炎症性サイトカインを標的とすることは、単に一つの前炎症性サイトカイン、例えばIL-1またはTNFα単独を標的とするより有効となる可能性がある。もう一つの態様において、一つより多い転写物を産生するためにリボソーム内部認識配列を用いることによって、またはループによって隔てられた一つより多い相補的配列を有する単一の転写物を構築することによって、一つより多いサイトカインを標的とすることができる輸送ベクターを構築する。
その上、感染に関して、予防的介入のために十分に早期の段階で(おそらく感染症の曝露前または症状が明らかとなる前に)敏感な人を同定することができる可能性がある。したがって、本発明の一つの局面は、例えばリスクを有する個体における様々な前炎症性サイトカイン関連疾患および障害に関与する前炎症性サイトカイン、例えばIL-1またはTNFαの発現をサイレンシングするために、本発明のRNA干渉物質、例えばsiRNAを用いるインビトロおよびインビボ法を提供する。
前炎症性サイトカイン媒介疾患および障害には、前炎症性サイトカイン遺伝子またはタンパク質の発現または活性に関連する、またはそれによって引き起こされる任意の疾患、障害、または病態が含まれる。前炎症性サイトカイン関連疾患および障害には、例えば、敗血症および敗血症ショックを含む炎症疾患および障害、自己免疫疾患および障害、感染疾患および障害が含まれる。
一つの態様において、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAは、ベクターを用いなくとも静脈内注射、例えば流体力学的注射後にインビボで細胞によって能動的に取り込まれることが示されており、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAが効率的にインビボで輸送されることを示している。例えば、Fas遺伝子を標的とするsiRNAは、肝細胞において投与後少なくとも数日間、例えば5日間、1週間、10日間、または2週間もしくはそれ以上、Fas mRNAおよびタンパク質レベルの有効な持続的抑制を示すことが発見されている。理論に拘束されることを意図していないが、肝細胞におけるサイレンシングの期間は、肝細胞における治療的サイレンシングを維持するために、プラスミドまたはウイルスベクターからのsiRNA発現を必要としないことを示唆している。肝細胞と細胞株との差は、おそらく、肝細胞はほとんどが非***細胞であり、細胞***によってsiRNAの希釈が起こらないためである。しかし。肝細胞における発現の持続は、より下等種において起こるsiRNA増幅によって起こる可能性(Ketting, R.F.ら(2001)、Genes Dev. 15:2654〜9;Lipardi, C.(2001)、Cell 107:297〜307)(Schwarz, D.S.(2002)Mol Cell 10:537〜48)は、除外できない。二本鎖siRNA注射後のサイレンシングは、持続的ではあるが永続的ではなく、fas変異を有するヒトおよびlprマウスにおいて認められているリンパ増殖または自己免疫疾患のような長期毒性(Takahashi, T.ら(1994)Cell 76:969〜76)は、懸念されない。
例えばベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターによる輸送のような、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAまたはshRNAを輸送するための他の戦略も同様に用いてもよい。他の輸送法には、RNA干渉物質と塩基性ペプチド、例えばTATペプチド断片を結合させるもしくは混合すること、陽イオン脂質と混合させること、または粒子に製剤化することによって塩基性ペプチドを用いて、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAまたはshRNAを輸送することが含まれる。
一つの態様において、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAは、細胞、例えば培養細胞に導入することができ、これらを次に、例えば移植もしくは移植片移植することによって被験者に移植する、またはドナー(すなわち最終的なレシピエント以外の起源)から得て、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAを細胞に投与した後、例えば移植もしくは移植片移植によってレシピエントに適用することができる。または、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAは、それらが標的細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞に向けられ、取り込まれて、標的遺伝子、例えばアポトーシス関連遺伝子、例えばFasのRNA干渉を調節または促進するように被験者に直接導入することができる。RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAは、単独で輸送してもよく、または、例えば肝炎ウイルス遺伝子のようなウイルス遺伝子に向けられるsiRNA、または他の細胞遺伝子、例えば他のアポトーシス関連遺伝子もしくはサイトカインに向けられるsiRNAのような、他のRNA干渉物質、例えばsiRNAと併用して輸送してもよい。RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAはまた、アポトーシス媒介疾患または障害、前炎症性サイトカイン関連疾患または障害、アポトーシス媒介組織損傷、例えばアポトーシス関連遺伝子活性によって引き起こされるまたはそれに関連する肝または肝細胞損傷、アポトーシス媒介炎症、またはアポトーシス媒介免疫応答を治療または予防するために用いられる他の薬剤、例えばインターフェロン治療のような抗ウイルス剤、抗炎症剤、癌治療、または免疫抑制物質と併用して投与してもよい。
本明細書において用いられるように、「造血細胞」は血液細胞、例えば赤血球、顆粒球、リンパ球、マクロファージおよび単球を含む白血球、血小板および/または樹状細胞である。本明細書において用いられる「T細胞」には、胸腺細胞、未成熟Tリンパ球、成熟Tリンパ球、休止期Tリンパ球、または活性化Tリンパ球が含まれると意図される。T細胞は、Tヘルパー(Th)細胞、例えばTヘルパー1(Th1)、またはTヘルパー2(Th2)細胞となりうる。T細胞は、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD4+CD8+ T細胞、CD4-CD8-T細胞、またはT細胞の他の任意のサブセットとなりうる。
腫瘍細胞は、例えば肺、肝臓、乳腺、結腸、骨等の腫瘍のような、臓器の固形腫瘍から得ることができる。固形臓器の悪性疾患には、癌腫、肉腫、黒色腫、および神経芽腫が含まれるがこれらに限定されない。腫瘍細胞はまた、リンパ腫、骨髄腫、または白血病のような血液伝幡(すなわち散在性)悪性疾患からも得ることができる。
神経細胞には、神経細胞と共に支持細胞、例えば神経膠細胞、例えばシュワン細胞が含まれると意図される。
本明細書において用いられる「RNA干渉物質」は、RNA干渉(RNAi)によって標的遺伝子またはゲノム配列の発現を妨害または阻害する任意の物質であると定義される。そのようなRNA干渉物質には、標的遺伝子またはゲノム配列と相同であるRNA配列またはその断片を含む核酸分子、短い干渉RNA(siRNA)、短いヘアピンまたは小さいヘアピンRNA(shRNA)、およびRNA干渉(RNAi)によって標的遺伝子の発現を妨害または阻害する低分子が含まれるがこれらに限定されない。
「RNA干渉(RNAi)」は、標的遺伝子と同一または高度に類似である配列のRNAを発現または導入することによって、その標的遺伝子から転写されたメッセンジャーRNA(mRNA)の配列特異的分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)が起こり(Coburn, G, and Cullen, B.(2002)、J. Virology 76(18):9225を参照されたい)、それによってその標的遺伝子の発現を阻害する、進化的に保存されたプロセスである。一つの態様において、RNAは、二本鎖RNA(dsRNA)である。このプロセスは植物、無脊椎動物、および哺乳類細胞において記述されている。本質的にRNAiは、dsRNA特異的エンドヌクレアーゼであるダイサーによって開始され、これは長いdsRNAをsiRNAと呼ばれる二本鎖断へと前進的に切断することを促進する。siRNAは、標的mRNAを認識して切断するタンパク質複合体に組み入れられる。RNAiはまた、標的遺伝子の発現を阻害またはサイレンシングするために、核酸分子、例えば合成siRNAまたはRNA干渉物質を導入することによって開始することができる。本明細書において用いられるように、「標的遺伝子発現の阻害」には、標的遺伝子または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現またはタンパク質活性もしくはレベルの如何なる減少も含まれる。減少は、RNA干渉物質によって標的とされていない標的遺伝子の発現または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%もしくはそれ以上であってもよい。
本明細書において「小さい干渉RNA」とも呼ばれる「短い干渉RNA」(siRNA)は、標的遺伝子の発現を阻害するように機能する物質、例えばRNAiであると定義される。siRNAは、化学合成してもよく、インビトロ転写によって産生してもよく、または宿主細胞内で産生してもよい。一つの態様において、siRNAは、長さが約15〜約40ヌクレオチド、好ましくは約15〜約28ヌクレオチド、より好ましくは長さが約19〜約25ヌクレオチド、およびより好ましくは長さが約19、20、21、または22ヌクレオチドである二本鎖RNA(dsRNA)分子であり、それぞれの鎖が約0、1、2、3、4、または5ヌクレオチドの長さを有する3'および/または5'突出末端を含んでもよい。突出末端の長さは二つの鎖のあいだで無関係であり、すなわち一つの鎖の突出末端の長さは、第二の鎖の突出末端の長さに依存しない。好ましくはsiRNAは、標的メッセンジャーRNA(mRNA)の分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)を通してRNA干渉を促進することができる。
siRNAにはまた、小さいヘアピン(ステムループとも呼ばれる)RNA(shRNA)が含まれる。一つの態様において、これらのshRNAは、短い(例えば、約19〜約25ヌクレオチド)アンチセンス鎖からなり、その後に約5〜約9ヌクレオチドのヌクレオチドループおよび類似のセンス鎖が続く。または、センス鎖は、ヌクレオチドループ構造の前に存在して、アンチセンス鎖がその後に続いてもよい。これらのshRNAは、プラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルスに含まれてもよく、例えばpol III U6プロモーターまたは他のプロモーターから発現させてもよい(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Stewartら(2003)、RNA Apr. 9(4):493〜501を参照されたい)。
一つの態様において、siRNAは、標的遺伝子における特異的遺伝子変異を標的としてもよい。もう一つの態様において、siRNAは、一つまたはそれ以上の標的遺伝子において保存されている配列を標的としてもよい。
標的遺伝子またはゲノム配列は、ウイルス遺伝子もしくはゲノム配列、または細胞遺伝子もしくはゲノム配列であってもよい。siRNAは、標的遺伝子もしくはゲノム配列、またはその断片と実質的に相同であってもよい。本明細書において用いられるように、「相同である」という用語は、標的のRNA干渉を引き起こすために標的mRNA、またはその断片と実質的に同一である、十分に相補的である、または類似であると定義される。天然のRNA分子の他に、標的配列の発現を阻害または干渉するために適したRNAには、RNA誘導体および類似体が含まれる。siRNA分子は、RNAのみを含む分子に限定される必要はないが、例えば化学改変されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに含み、同様にリボース糖分子がもう一つの糖分子または類似の機能を行う分子の代わりに用いられている分子が含まれる。その上、ヌクレオチド残基間に、ホスホロチオエート結合のような非天然の結合を用いてもよい。RNA鎖は、蛍光体のようなレポーター基の反応性官能基によって誘導体化することができる。特に有用な誘導体は、RNA鎖の末端または複数の末端、典型的にセンス鎖の3'末端で改変される。例えば、3'末端の2'-ヒドロキシルは、多様な基によって容易かつ任意に誘導体化することができる。
他の有用なRNA誘導体は、2'O-アルキル化残基または2'O-メチルリボシル誘導体および2'O-フルオロリボシル誘導体のような、改変された糖質部分を有するヌクレオチドを組み入れる。
RNAの骨格も同様に改変してもよい。標的配列の発現を阻害するまたは干渉するために有用な如何なる改変された基本骨格も用いてもよい。例えば、5-ブロモウラシルおよび5-ヨードウラシルのようなハロゲン添加基本骨格を組み入れてもよい。基本骨格はまたアルキル化してもよく、例えば7-メチルグアノシンを、グアノシン残基の代わりに組み入れることができる。阻害の成功が得られる非天然基本骨格も同様に組み入れることができる。
本発明の様々な局面を、以下の小章においてさらに詳しく説明する。
I.本発明の短い干渉RNA(siRNA)
特に、本発明は、アポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαと相同であり、かつアポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαのRNAiを媒介する、長さが約15〜約40、または約15〜約28ヌクレオチドのsiRNA分子に関する。好ましくは、siRNA分子の長さは約19〜約25ヌクレオチドである。より好ましくは、siRNA分子の長さは約19、20、21、または22ヌクレオチドである。本発明のsiRNA分子はまた3'ヒドロキシル基を含みうる。本発明のsiRNA分子は、一本鎖または二本鎖となりうる;そのような分子は、平滑末端にすることができ、または突出末端(例えば、5'、3')を含みうる。特定の態様において、RNA分子は二本鎖であり、かつ平滑末端であるか、または突出末端を含む。
特に、本発明は、アポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαと相同であり、かつアポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαのRNAiを媒介する、長さが約15〜約40、または約15〜約28ヌクレオチドのsiRNA分子に関する。好ましくは、siRNA分子の長さは約19〜約25ヌクレオチドである。より好ましくは、siRNA分子の長さは約19、20、21、または22ヌクレオチドである。本発明のsiRNA分子はまた3'ヒドロキシル基を含みうる。本発明のsiRNA分子は、一本鎖または二本鎖となりうる;そのような分子は、平滑末端にすることができ、または突出末端(例えば、5'、3')を含みうる。特定の態様において、RNA分子は二本鎖であり、かつ平滑末端であるか、または突出末端を含む。
一つの態様において、RNA分子の少なくとも一つの鎖は、長さが約0〜約6ヌクレオチド(例えば、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオチド)の3'突出末端を有する。他の態様において、3'突出末端は、長さが約1〜約5ヌクレオチド、約1〜約3ヌクレオチド、および長さが約2〜約4ヌクレオチドである。一つの態様において、RNA分子は二本鎖であり、一つの鎖が3'突出末端を有し、もう一つの鎖が平滑末端または突出末端を有しうる。RNA分子が二本鎖であり、かつ双方の鎖が突出末端を含む態様において、突出末端の長さは、それぞれの鎖に関して同じまたは異なっていてもよい。特定の態様において、本発明のRNAは、対応のある約19、20、21、または22ヌクレオチドを含み、RNAの双方の3'末端において約1〜約3、特に約2ヌクレオチドの突出末端を有する。一つの態様において、3'突出末端は、分解に対して安定化することができる。好ましい態様において、RNAは、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドのようなプリンヌクレオチドを含めることによって安定化される。または、改変類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えばウリジン2ヌクレオチド3'突出末端の2'-デオキシチミジンによる置換は許容されて、RNAiの有効性に影響を及ぼさない。2'ヒドロキシルが存在しないことは、組織培養培地における突出末端のヌクレアーゼ抵抗性を有意に増強する。
A.siRNA分子の設計と調製
本発明のshRNA分子を含む合成siRNA分子は、当業者に既知の多くの技術を用いて得ることができる。例えばsiRNA分子は、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトまたは通常のDNA/RNAシンセサイザーを用いるような、当技術分野で既知の方法を用いて化学合成または組換えによって産生することができる(例えば、Elbashir, S.M.ら(2001)、Nature 411:494〜498;Elbashir, S.M., W. Lendeckel and T. Tuschl(2001)、Genes & Development 15:188〜200;Harborth, J.ら(2001)、J. Cell Science 114:4557〜4565;Masters, J.R.ら(2001)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8012〜8017;およびTuschl, T.ら(1999)、Genes & Development 13:3191〜3197を参照されたい)。または、プロリゴ(Proligo、ハンブルグ、ドイツ)、ダーマコン・リサーチ(Dharmacon Research、ラファイエット、コロラド州、アメリカ)、ピアスケミカル(Pierce Chemical、ペルビオサイエンスの一部、ロックフォード、イリノイ州、アメリカ)、グレンリサーチ(Glen Research、スターリング、バージニア州、アメリカ)、ケムジーンズ(ChemGenes、アシュランド、マサチューセッツ州、アメリカ)およびクルアケム(Cruachem、グラスゴー、イギリス)が含まれるがこれらに限定されないいくつかの民間のRNA合成供給企業を利用できる。そのため、siRNA分子は、合成することがそれほど難しくなく、RNAiにとって適した量で容易に提供される。さらに、dsRNAsはプラスミドベクター、レトロウイルス、およびレンチウイルスによってコードされるステムループ構造として発現されうる(Paddison, P.J.ら(2002)、Genes Dev. 16:948〜958;McManus, M.T.ら(2002)RNA 8:842〜850;Paul, C.P.ら(2002)、Nat. Biotechnol. 20:505〜508;Miyagishi, M.ら(2002)Nat. Biotechnol. 20:497〜500;Sui, G.ら(2002)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515〜5520;Brummelkamp, T.ら(2002)、Cancer Cell 2:243;Lee, N.S.ら(2002)、Nat. Biotechnol. 20:500〜505;Yu, J.Y.ら(2002)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047〜6052;Zeng, Y.ら(2002)Mol. Cell. 9:1327〜1333;Rubinson, D.A.ら(2003)、Nat. Genet. 33:401〜406;Stewart, S.A.ら(2003)、RNA 9:493〜501)。これらのベクターは、一般的にdsRNAの上流のpolIIIプロモーターを有し、センスおよびアンチセンスRNA鎖を個別におよび/またはヘアピン構造として発現することができる。細胞において、ダイサーは、短いヘアピンRNA(shRNA)を有効なsiRNAへと加工する。
本発明のshRNA分子を含む合成siRNA分子は、当業者に既知の多くの技術を用いて得ることができる。例えばsiRNA分子は、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトまたは通常のDNA/RNAシンセサイザーを用いるような、当技術分野で既知の方法を用いて化学合成または組換えによって産生することができる(例えば、Elbashir, S.M.ら(2001)、Nature 411:494〜498;Elbashir, S.M., W. Lendeckel and T. Tuschl(2001)、Genes & Development 15:188〜200;Harborth, J.ら(2001)、J. Cell Science 114:4557〜4565;Masters, J.R.ら(2001)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8012〜8017;およびTuschl, T.ら(1999)、Genes & Development 13:3191〜3197を参照されたい)。または、プロリゴ(Proligo、ハンブルグ、ドイツ)、ダーマコン・リサーチ(Dharmacon Research、ラファイエット、コロラド州、アメリカ)、ピアスケミカル(Pierce Chemical、ペルビオサイエンスの一部、ロックフォード、イリノイ州、アメリカ)、グレンリサーチ(Glen Research、スターリング、バージニア州、アメリカ)、ケムジーンズ(ChemGenes、アシュランド、マサチューセッツ州、アメリカ)およびクルアケム(Cruachem、グラスゴー、イギリス)が含まれるがこれらに限定されないいくつかの民間のRNA合成供給企業を利用できる。そのため、siRNA分子は、合成することがそれほど難しくなく、RNAiにとって適した量で容易に提供される。さらに、dsRNAsはプラスミドベクター、レトロウイルス、およびレンチウイルスによってコードされるステムループ構造として発現されうる(Paddison, P.J.ら(2002)、Genes Dev. 16:948〜958;McManus, M.T.ら(2002)RNA 8:842〜850;Paul, C.P.ら(2002)、Nat. Biotechnol. 20:505〜508;Miyagishi, M.ら(2002)Nat. Biotechnol. 20:497〜500;Sui, G.ら(2002)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515〜5520;Brummelkamp, T.ら(2002)、Cancer Cell 2:243;Lee, N.S.ら(2002)、Nat. Biotechnol. 20:500〜505;Yu, J.Y.ら(2002)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047〜6052;Zeng, Y.ら(2002)Mol. Cell. 9:1327〜1333;Rubinson, D.A.ら(2003)、Nat. Genet. 33:401〜406;Stewart, S.A.ら(2003)、RNA 9:493〜501)。これらのベクターは、一般的にdsRNAの上流のpolIIIプロモーターを有し、センスおよびアンチセンスRNA鎖を個別におよび/またはヘアピン構造として発現することができる。細胞において、ダイサーは、短いヘアピンRNA(shRNA)を有効なsiRNAへと加工する。
本発明のsiRNA分子の標的領域は、開始コドンの下流の約25〜50ヌクレオチド、約50〜75ヌクレオチド、または約75〜100ヌクレオチドから始まる、所定の標的遺伝子配列、例えばアポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαから選択されうる。ヌクレオチド配列は、5'または3' UTRsおよび開始コドン近傍領域を含んでもよい。本発明のsiRNA分子を設計する一つの方法は、23ヌクレオチド配列モチーフAA(N19)TT(Nは任意のヌクレオチドとなりうる)を同定すること、およびG/C含有量が少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、または75%であるヒットを選択することを含む。配列の「TT」部分は任意である。または、そのような配列が認められない場合、Nが任意のヌクレオチドとなりうるモチーフNA(N21)を用いて検索を拡大してもよい。この状況において、センスsiRNAの3'末端は、センスおよびアンチセンス3'突出末端の配列組成に関して対称的な二本鎖を産生させるようにTTに変換してもよい。次に、アンチセンスsiRNA分子を、23ヌクレオチド配列モチーフのヌクレオチド1位〜21位に対する相補体として合成してもよい。対称的な3' TT突出末端を用いることは、センスおよびアンチセンス標的RNA切断siRNPsの比がほぼ等しい小さい干渉リボヌクレオタンパク質粒子(siRNPs)を確実に形成するために都合がよい可能性がある(Elbashirら(2001)、上記、およびElbashirら(2001)、上記)。NCBI、BLAST、Derwent、およびGenSeqと共にOligoengine(登録商標)のような市販のオリゴ合成企業が含まれるがこれらに限定されない配列データベースの分析を用いて、唯一の遺伝子が確実に標的化されるようにESTライブラリに対してsiRNA配列を選択してもよい。
II.RNA干渉物質の輸送
RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNA、またはRNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAを含むベクターを標的細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞に取り込ませるために輸送する方法には、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAを含む組成物を注射すること、または細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞、または生物を、RNA干渉物質、例えばsiRNAを含む組成物に直接接触させることが含まれる。もう一つの態様において、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAを、門脈または肝動脈に直接注射してもよい。投与は1回注射であってもよく、または2回もしくはそれ以上の注射であってもよい。
RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNA、またはRNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAを含むベクターを標的細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞に取り込ませるために輸送する方法には、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAを含む組成物を注射すること、または細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞、または生物を、RNA干渉物質、例えばsiRNAを含む組成物に直接接触させることが含まれる。もう一つの態様において、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAを、門脈または肝動脈に直接注射してもよい。投与は1回注射であってもよく、または2回もしくはそれ以上の注射であってもよい。
ウイルス媒介輸送メカニズムを同様に用いて、Xia, H.ら(2002)、Nat. Biotechnol. 20(10):1006に記述されるようにインビトロおよびインビボで細胞にsiRNAを輸送してもよい。shRNAのプラスミドまたはウイルス媒介輸送メカニズムはまた、Rubinson, D.A.ら((2003)、Nat. Genet. 33:401〜406)およびStewart, S.A.ら((2003)、RNA 9:493〜501)に記述されるようにインビトロおよびインビボで細胞にshRNAを輸送するために用いてもよい。本発明のsiRNA分子を標的細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞に導入する他の方法には、燐酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔が含まれるがこれらに限定されない多様な当技術分野で認識される技術と共に、多くの市販のトランスフェクションキット(例えば、インビトロジェン(Invitrogen)からのOLIGOFECTAMINE(登録商標)試薬)(例えば、Sui, Gら(2002)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515〜5520;Calegari, F.ら(2002)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10月21日、2002[印刷前の電子出版];J-M Jacque, K. Triques, and M. Stevenson(2002)、Nature 418:435〜437;およびElbashir, S.M.ら(2001)上記、を参照されたい)が含まれる。標的細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞をトランスフェクトする適した方法はまた、Sambrookら(「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第二版、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1989)および他の実験マニュアルに認められうる。トランスフェクションの効率は、細胞タイプ、継代数、細胞のコンフルエンシーと共にsiRNAまたはshRNAのリポソーム複合体形成の時期および方法(例えば、倒置対攪拌)を含む多くの要因に依存する可能性がある。これらの因子は、当業者によって過度の実験を行うことなく評価および調節することができる。
RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAまたはshRNAは、以下の活性:RNA干渉物質、例えばsiRNAの細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞による取り込みを増強する、一本鎖のアニーリングを阻害する、一本鎖を安定化させる、またはそうでなければ標的細胞への輸送を促進する、およびアポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαの阻害を増加させること、の一つまたはそれ以上を行う成分と共に導入してもよい。
RNA干渉物質、例えばsiRNAは、細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞に直接導入してもよく、または腔、間質腔、生物の循環中に細胞外に導入してもよく、経口によって導入してもよく、またはRNA干渉物質、例えばsiRNAを含む溶液中に細胞もしくは生物を浴することによって導入してもよい。RNA干渉物質、例えばsiRNAはまた、粘膜への局所適用によって、または経皮的に細胞に導入してもよい。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液も同様に、物質を導入してもよい部位である。
細胞をsiRNAによって処置するさらなる方法はRNA干渉物質、例えばsiRNAによって治療される細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞を、既知の方法を用いて個体から得て、標的遺伝子発現を媒介する一つまたはそれ以上のRNA干渉物質を細胞に導入し、次に、これを個体に再度導入するエクスビボ法である。もう一つの態様において、T細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞は、ドナー(すなわち最終的なレシピエント以外の起源)から得て、RNA干渉物質を投与することによって改変し、移植または移植片移植によって再度レシピエントに適用することができる。
例えば、細胞、例えば肝細胞は、一般的に臓器、例えば肝臓の全てまたは一部を切除して、そこから細胞、例えば肝細胞をコラゲナーゼ溶液のインサイチュー還流によって採取することによって、個体またはドナーから得てもよい。無傷の肝臓から肝細胞を単離する場合、肝臓から離れるまたは肝臓に入る静脈にカテーテルを挿入して、コラゲナーゼ溶液をその中に還流して、肝細胞を放出させる。切断または露出表面を有する肝生検の場合、より小さいカテーテル(または複数のカテーテル)を開いたまたは切断表面上の血管に挿入する。コラゲナーゼ溶液をカテーテル挿入血管を通して還流して、それによって、肝細胞が放出される。除去または単離された後、肝細胞を播種して、トランスフェクションに適した条件(例えば、適当な培地、正確な温度等で)で維持する。
例えば、ラット肝細胞の非常に濃縮された集団を単離するため、およびこれらの細胞を長期間にわたって培養において維持するためにいくつかの方法が記述されている。Koch, K.S and H.L. Leffert、Ann. N.Y. Acad. Sci. 349:111〜127(1980);McGowan, J.A.ら、J.Cell Physiol. 108:353〜363(1981);Bissell, D.M. and P.S. Guzelian、Ann. N.Y. Acad. Sci. 349:85〜98(1981);およびEnat, R.ら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:1411〜1415(1984))。そのような方法は、本発明の方法によって形質導入される肝細胞を単離して維持するために用いることができる。肝細胞はまた、米国特許第5,580,776号に記述される技術を用いて、Leffert(その全文が参照として本明細書に組み入れられる、Leffert, H.L.ら、Methods Enzymol. 58:536〜544(1979))に記述される還流混合物によって調製することができる。
本発明の組み入れられたRNA干渉物質を含む細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞を、組織培養容器においてコンフルエンスまで増殖させ;培養容器から回収して;および体内に導入する。これは、例えば外科的に行うことができる。この場合、対象ヌクレオチド配列を発現することができる形質導入された肝細胞で構成される組織を体内に移植片移植または移植する。例えば、肝臓においてまたは肝臓に非常に近位に接触/移植して腹腔に埋め込むことができる。または、形質導入された肝細胞含有組織を、微小担体ビーズに結合させて、これをレシピエントとの腹腔に導入する(例えば注射によって)ことができる。このアプローチは、アルブミン合成を欠損するラット系統(ナガセ無アルブミン血症ラット)に野生型肝細胞を移植して、移植した動物の血清においてアルブミンの中等度のレベルが示されることによって成功することが示されている。遺伝子改変された肝細胞の肝臓への直接注射も同様に、例えば門脈注入によって可能となる可能性がある。
必要であれば、RNAiが起こるために必要な生化学成分も同様に、細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞に導入することができる。
本発明のもう一つの局面は、本発明のsiRNA、例えばアポトーシス関連siRNA、例えばFasもしくはFasL siRNA、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαsiRNAをコードする核酸を含むベクター、例えば組換え型発現ベクターに関する。本明細書において用いられるように、「ベクター」という用語は、それが連結しているもう一つの核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これはさらなる核酸セグメントをライゲーションすることができる環状の二本鎖DNAループを指す。もう一つのタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、この場合、さらなる核酸セグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。特定のベクターは、それらが導入される宿主(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター)において自律増幅を行うことができる。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳類ベクター)は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み入れられて、それによって宿主ゲノムと共に複製される。その上特定のベクターは、それらが機能的に結合する遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」、またはより単純に「発現ベクター」と呼ばれる。一般的に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターはしばしば、プラスミドの形である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形のベクターであることから、互換的に用いることができる。しかし、本発明には、同等の機能を示すウイルスベクター(例えば、複製欠損、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)のような、そのような他の型の発現ベクターも含まれると意図される。好ましい態様において、レンチウイルスは本発明の一つまたはそれ以上のsiRNA分子を細胞に輸送するために用いられる。遺伝子材料を肝細胞に導入するために有用なベクターは、例えば米国特許第5,580,776号に記述されている。
発現ベクターにおいて、「機能的に結合した」とは、対象ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にするように調節配列に結合していることを意味すると意図される(例えば、インビトロ転写/翻訳系、またはベクターが標的細胞に導入されている場合には標的細胞において)。「調節配列」という用語には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)が含まれると意図される。そのような調節配列は、例えばGoeddel:「Gene Expression Technology」、Methods in Enzymology 185、アカデミック出版、サンジエゴ、カリフォルニア州(1990)に記述されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列および特定の宿主細胞に限ってヌクレオチド配列の発現を指示する配列(例えば、組織特異的調節配列)が含まれる。さらに、RNA干渉物質は、特定の間隔または特定の期間、本発明のsiRNAの合成を指示するために調節配列を含むベクターによって輸送してもよい。発現ベクターの設計は、標的細胞の選択、望ましいsiRNAの発現レベル等のような要因に依存しうることは当業者によって認識されるであろう。
本発明の発現ベクターは、それによって本発明のsiRNA分子を産生するために標的細胞に導入することができる。一つの態様において、DNA鋳型、例えばアポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1またはTNFαをコードするDNA鋳型を、RNAポリメラーゼIII(Pol III)の制御下で発現ベクターにライゲーションして、これを標的細胞に輸送してもよい。Pol IIIは、3'末端がチミジン4〜5個の枝において終止することによって定義される、小さい非コード転写物の合成を指示する。したがって、DNA鋳型を用いて、インビボで、RNAiを行うsiRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の双方を合成してもよい(Suiら(2002)、PNAS 99(8):5515)。
本発明の発現ベクターはまた、shRNAを標的細胞に導入するために用いてもよい。
本明細書において用いられるように、「標的細胞」という用語は、その中に本発明のsiRNAをコードする組換え型発現ベクターを含む本発明のsiRNA分子が導入されている細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞を指すと意図される。「標的細胞」および「宿主細胞」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。そのような用語は特定の被験細胞のみならず、そのような細胞の子孫または可能性がある子孫も指すと理解すべきである。変異または環境の影響により、特定の改変がその後の世代に起こる可能性があるために、そのような子孫は、親細胞と実際には同一でない可能性があるが、なおも本明細書において用いられる用語の範囲内に含まれる。好ましくは、標的細胞は哺乳類細胞、例えばヒト細胞である。特に好ましい態様において、これは肝細胞である。
用いる発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、ごく小さい分画の細胞がsiRNA分子を有効に取り込む可能性があることは知られている。これらの細胞を同定して選択するために、細胞標的に対する抗体を用いて免疫蛍光を通して有効にトランスフェクションを決定することができる。好ましい細胞標的には、ラミンA/Cのように、宿主細胞タイプに存在してその発現が比較的一定である標的が含まれる。または、CMV促進EGFP発現プラスミド、ルシフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、BirA、B-ガラクトシダーゼ等のような細胞マーカーを含むプラスミドの同時トランスフェクションも同様に用いてトランスフェクション効率を評価してもよい。次に、siRNA分子をトランスフェクトされている細胞を免疫蛍光、位相差顕微鏡、および蛍光顕微鏡のような日常的な技術によって同定することができる。
標的化タンパク質の量および寿命(または代謝回転)に応じて、ノックダウン表現型、例えば標的遺伝子、例えばアポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαのsiRNA阻害に関連した表現型は、1〜3日後、またはさらに後に明らかとなる可能性がある。表現型を認めない場合、免疫蛍光またはウェスタンブロッティングによってタンパク質の枯渇が観察される可能性がある。タンパク質が3日後でもなおも豊富である場合、細胞は***することができ、再トランスフェクションのために新しい24ウェルプレートに移すことができる。
標的タンパク質のノックダウンが認められない場合、標的mRNAがトランスフェクトしたsiRNA二本鎖によって有効に破壊されたか否かを分析することが望ましいかもしれない。トランスフェクションの2日後、総RNAを調製して、標的特異的プライマーを用いて逆転写して、プレmRNAの増幅に関して制御するために、少なくとも一つのエキソン-エキソン接合部を含むプライマー対によってPCR増幅することができる。非標的mRNAのRT/PCRも同様に対照として必要である。mRNAを有効に枯渇したが標的タンパク質の減少をなおも検出できない場合、安定なタンパク質の大きい貯蔵庫が細胞に存在する可能性があることを示しているかも知れない。標的タンパク質が、表現型が明白になる可能性がある点まで最終的に枯渇されるまで、十分に長い期間における多数のトランスフェクションが必要であるかも知れない。
本発明のRNA干渉物質にはまた、例えば標的遺伝子の発現を干渉または阻害する小さい分子が含まれる。例えば、そのような低分子には、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子量が約10,000グラム/モル未満である有機または無機化合物(すなわちヘテロ有機および有機金属化合物を含む)、分子量が約5,000グラム/モル未満である有機または無機化合物、分子量が約1,000グラム/モル未満である有機または無機化合物、分子量が約500グラム/モル未満である有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形が含まれるがこれらに限定されない。
特定のRNA干渉物質の用量は、特定の標的遺伝子のRNA干渉、例えば翻訳後遺伝子サイレンシング(PTGS)を行って、それによって標的遺伝子の発現の阻害または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルの阻害が起こるために必要な量であろう。標的遺伝子、例えばアポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαの発現、および標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性またはレベルを決定するためのアッセイは、当技術分野で既知である。例えば、標的遺伝子mRNAのレベルの減少はインサイチューハイブリダイゼーションによって測定してもよい(Montgomeryら(1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15502〜15507)、またはノザンブロット分析(Ngoら(1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14687〜14692)によって測定してもよい。
アポトーシス関連ポリペプチド活性、例えばFasポリペプチド活性、例えばアポトーシスはまた、例えば、細胞死遺伝子に関する一過性のトランスフェクションアッセイ(例えばMiura, M.ら(2000)、Methods in Enzymol. 322:480〜92に記述されるような);アポトーシス細胞におけるDNA切断を検出するアッセイ(例えばKauffman, S.H.ら(2000)、Methods in Enzymol. 322:3〜15に記述されるような);アネキシンV標識によるアポトーシスの検出(例えば、Bossy-Wetzel, E.ら(2000)、Methods in Enzymol. 322:15〜18に記述されるような);アポトーシスヌクレアーゼアッセイ(例えば、Hughes, F.M.(2000)、Methods in Enzymol. 322:47〜62);およびフローおよびレーザースキャンサイトメトリーによるアポトーシス細胞の分析(例えば、Darzynkiewicz, Z.ら(2000)、Methods in Enzymol. 322:18〜39に記述されるような)のような、例えば細胞死またはアポトーシスに関する当技術分野で既知のアッセイによってアッセイしてもよい。
もう一つの態様において、本発明の組成物は、リポソームのような脂質集合体の表面成分として提供される、またはリポソームに封入される。単層または多層となりうるリポソームは、異なるメカニズムによって封入された材料を細胞に導入することができる。例えば、リポソームは、細胞膜と融合させることによってその封入された材料を細胞の細胞質に直接導入することができる。または、リポソームは、酸性の液胞(すなわち、エンドソーム)に区画化されることができ、その内容物をリポソームおよび酸性の液胞から細胞質に放出させる。一つの態様において、本発明は、ホスファチジルコリン(多様な鎖の長さの;例えば卵黄のホスファチジルコチン)、コレステロール、陽イオン脂質、および1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ3-ホスホエタノールアミン-ポリエチレングリコール-2000(DSPE-PEG2000)を含む、本明細書に記述の化合物の脂質集合製剤を特徴とする。この脂質集合体の陽イオン脂質成分は、ジオレイル1,2-ジアシルトリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)のような当技術分野で既知の任意の陽イオン脂質となりうる。もう一つの態様において、ポリエチレングリコール(PEG)を本発明の組成物に共有結合させる。結合したPEGは、任意の分子量となりうるが、好ましくは2000〜50,000ダルトンのあいだである。RNA干渉物質を輸送するためにマクロファージを標的とする一つの態様において、ホスファチジルセリン受容体によるマクロファージの貪食は、TGF-β1分泌を増加させることによって抗炎症反応を促進することから、ホスファチジルセリンを含むリポソームを用いてもよい(Huynh, M.L.ら(2002)、J.Cell Biol. 155、649)。したがって、マクロファージを首尾よくトランスフェクトした場合、標的遺伝子がサイレンシングされるのみならず、マクロファージは抗炎症サイトカインを分泌するように誘導されるであろう。
マクロファージへの輸送に関するもう一つの態様において、ポリGテール、例えばヌクレオチドテール5〜10個をsiRNAのセンス鎖の5'末端に加えてもよく、これはマクロファージスキャベンジャー受容体を通しての取り込みを増強するであろう。
本発明のもう一つの態様において、本発明のRNA干渉物質は、例えば、隣接した塩基性サブユニットを含む担体ポリマーを用いて、担体ポリマーに会合していないRNA干渉物質、例えばsiRNA分子の輸送速度より高い速度で生体膜を超えて輸送また導入してもよい。担体ポリマーを陽イオントランスフェクション物質と共に、またはこれを用いないでRNA干渉物質、例えばsiRNAと併用することによって、担体ポリマーとRNA干渉物質、例えばsiRNAとの会合が起こる。担体ポリマーは、インビトロおよびインビボでRNA干渉物質、例えばsiRNAを生体膜を超えて効率よく輸送する可能性がある。したがって、本発明は、担体ポリマーを用いて、RNA干渉物質、例えばsiRNAを生体膜、例えば核膜を含む細胞膜を超えて輸送する方法を提供する。本発明はまた、担体ポリマーと会合させたRNA干渉物質、例えばsiRNAを含む組成物を提供する。
RNA干渉物質と担体ポリマーとの会合または相互作用に関連して本明細書において用いられる「会合」または「相互作用」という用語は、RNA干渉物質、例えばsiRNAと担体ポリマー、例えばペプチドポリマーとの、直接結合または間接的結合のいずれかによる任意の会合または相互作用を指す。
間接的な結合には、RNA干渉物質と担体ポリマーがリンカー部分を通して結合される、例えばそれらが直接結合しない、RNA干渉物質と担体ポリマーとの会合が含まれる。リンカー部分には、例えば核酸リンカー分子、例えば生体分解可能な核酸リンカー部分が含まれるがこれらに限定されない。核酸リンカー分子は、例えば二量体、三量体、四量体、またはそれより長い核酸分子であってもよく、例えば長さが約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25ヌクレオチドまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドであってもよい。
直接結合には、リンカー部分を必要としない任意の結合が含まれる。一つの態様において、直接結合には、二つの部分、例えばRNA干渉物質と担体ポリマーとが互いに結合するように相互作用する化学的または物理的相互作用が含まれる。直接相互作用の例には、非共有結合相互作用、疎水性/親水性、イオン性(例えば、静電気的、クーロンによる誘引、イオン双極子、電荷移動)、ファンデルワールス力、または水素結合、および共有結合の形成を含む化学結合が含まれる。したがって、一つの態様において、RNA干渉物質と担体ポリマーとは、リンカーによって結合されない、例えばそれらは直接結合される。さらなる態様において、RNA干渉物質と担体ポリマーとは、互いに静電気的に会合する。
本明細書において用いられるように、「ポリマー」という用語は、共有結合によって結合した二つまたはそれ以上の同一の、または同一でないサブユニットの直線的な鎖を指す。ペプチドは、ペプチド結合によって結合した同一または非同一アミノ酸サブユニットで構成されうるポリマーの一例である。
本明細書において用いられるように、「ペプチド」という用語は、D-もしくはL-アミノ酸の単一の鎖、またはペプチド結合によって結合したD-およびL-アミノ酸の混合物によって構成された化合物を指す。一般的に、ペプチドは、少なくとも二つのアミノ酸残基を含み、長さがアミノ酸約50個未満である。
本明細書において用いられるように、「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって結合した直線状に配置されたアミノ酸からなるが、ペプチドとは対称的に十分に定義された立体配置を有する化合物を指す。タンパク質は、ペプチドとは異なり、一般的にアミノ酸50個またはそれ以上の鎖からなる。
本明細書において用いられるように、「ポリペプチド」という用語は、一つまたはそれ以上のペプチド結合を含む少なくとも二つのアミノ酸残基のポリマーを指す。「ポリペプチド」は、ポリペプチドが十分に定義された立体配座を有するか否かによらず、ペプチドおよびタンパク質を含む。
一つの態様において、本発明に従う担体ポリマーは、約6〜約25サブユニットまでの長さの短いポリマーを含む。担体は、生体物質単独の輸送速度と比較して、RNA干渉物質の生体膜を超えての輸送速度を増強するために有効である。例としてのポリマー組成物はペプチドであるが、ポリマーは、非ペプチド骨格および/または下記でさらに考察するサブユニットを含んでもよい。
本発明の重要な局面において、本発明の担体ポリマーは、RNA干渉物質がその生物作用を発揮するために膜を超えての輸送を必要とするタイプである場合、細胞またはオルガネラの膜を超えて生体活性物質を輸送するために特に有用である。一般的な問題として、本発明の方法において用いられる担体ポリマーには、好ましくは直線状のサブユニット骨格が含まれる。骨格は通常、炭素、窒素、酸素、硫黄、および燐から選択されるヘテロ原子を含み、骨格鎖の原子の大多数は通常、炭素からなる。それぞれのサブユニットは、末端のグアニジノまたはアミジノ基を含む側鎖部分を含んでもよい。
隣接する側鎖部分との間隔は、通常、サブユニットからサブユニットについて一貫しているが、本発明において用いられるポリマーにはまた、骨格に沿って側鎖間の多様な間隔が含まれてもよい。
側鎖部分は、中心のグアニジノまたはアミジノ炭素原子(それに対してNH2基が結合する)が、好ましくは少なくとも2個のリンカー鎖原子を含む、より好ましくは鎖の原子2〜5個を含む側鎖リンカーによって骨格に結合されるように、中心の炭素原子が骨格から離れた第三から第六鎖原子であるように、骨格から伸長する。鎖の原子は好ましくは、酸素、硫黄、または窒素のような一つまたはそれ以上の他の原子が存在することができるがメチレン炭素原子として提供される。好ましくは、骨格とグアニジノまたはアミジノ基の中心炭素原子との側鎖リンカーは、アルギニン側鎖によって例示されるように、長さが鎖の原子4個である。
本発明の担体ポリマー配列は、例えばグリシン、アラニン、およびシステインのような対応するポリマー含有結合体の膜輸送速度に有意な影響を及ぼさない、一つまたはそれ以上の非グアニジノ/非アミジノサブユニット、またはアミノカプロン酸基のようなリンカーに隣接されうる。同様に、任意の遊離のアミノ末端基を、インビボでのユビキチン化を防止するために、アセチルまたはベンジル基のようなブロッキング基によってキャップすることができる。
本発明の担体ポリマーは、単純な合成スキームによって調製することができる。さらに、担体ポリマーは通常、それらがその作用に関して不均一な混合物より大きい一貫性および再現性を提供するように長さおよび組成が実質的に均一である。
本発明の重要な局面に従って、単一の担体ポリマーとRNA干渉物質、例えばsiRNAとの会合は、結合物に大きい疎水性部分が存在する必要なく、生体膜を超えて物質の取り込み速度を実質的に増強するために十分である。実際に、大きい疎水性部分を結合させることによって、脂質二重層に対する疎水性部分の接着により経膜輸送が有意に妨害または防止される可能性がある。したがって、本発明には、脂質および脂肪酸分子のような大きい疎水性部分を含まない担体ポリマーが含まれる。
一つの態様において、輸送ポリマーは、D-またはL-アミノ酸残基からなる。輸送ポリマーにおいて天然に存在するL-アミノ酸残基を用いることは、切断産物が細胞または生物に対して比較的非毒性であるはずであるという長所を有する。好ましいアミノ酸サブユニットはアルギニン(α-アミノ-デルタ-グアニジ-ノバレリン酸)、およびα-アミノ-ε-アミジノヘキサン酸(等配電子類似体)である。アルギニンにおけるグアニジニウム基は、pKa約12.5を有する。
より一般的に、それぞれのポリマーサブユニットは、(i)pKaが11より大きい、より好ましくは12.5またはそれ以上である、および(ii)その水素添加状態で、その部分に二座特徴を与える共鳴安定化陽電荷を共有する少なくとも二つのジェミナルアミノ基(NH2)を含む、非常に塩基性の側鎖部分を含むことが好ましい。
α-アミノ-β-グアニジノプロピオン酸、α-アミノ-γ-グアニジノ酪酸、またはα-アミノ-ε-グアニジノカプロン酸のような他のアミノ酸も同様に用いることができる(骨格鎖と中心グアニジニウム炭素とのあいだにそれぞれ、リンカー原子2、3、または5個を含む)。
D-アミノ酸はまた輸送ポリマーにおいて用いてもよい。D-アミノ酸のみを含む組成物は、酵素的分解が減少するという長所を有する。しかし、それらは標的細胞内でほぼ無傷のままで留まる可能性がある。そのような安定性は一般的に、ポリマーが結合していても物質が生物学的に活性であれば、問題ではない。結合型が不活性である物質の場合、細胞またはオルガネラにおける物質の放出を促進するために、活性部位で切断可能であるリンカー(例えば、細胞内での酵素または溶媒媒介切断によって)を含めるべきである。
インビボまたはインビトロのいずれかで生体膜を通過することができる任意のペプチド、例えば塩基性ペプチドまたはその断片は、本発明に含まれる。これらのペプチドは、当業者に既知の方法によって合成することができる。例えば、本発明の方法において、生体膜を超えてRNA干渉物質を輸送するための担体ペプチドとして用いてもよいいくつかのペプチドが同定されている。これらのペプチドには、例えばアンテナペディアのホメオドメイン、ショウジョウバエ転写因子(Wangら(1995)、PNAS USA 92:3318〜3322);NLSドメインを有するまたは有さないカポジ線維芽細胞増殖因子のシグナル配列の疎水性領域を表す断片(Antopolskyら(1999)、Bioconj. Chem. 10:598〜606);ケイマン・クロコジルス(Caiman crocodylus)のIg(5)軽鎖のシグナルペプチド配列(Chaloinら(1997)、Biochem. Biophys. Res. Comm. 243:601〜608);HIVエンベロープ糖タンパク質gp4114の融合配列(Morrisら(1997)、Nucleic Acids Res. 25:2730〜2736);トランポータンA−神経ペプチドガラニンのN末端断片と、膜相互作用ハチ毒ペプチドであるマストポランからなる無キメラ27量体(Lindgrenら(2000)、Bioconjugate Chem. 11:619〜626);インフルエンザウイルス血液凝集素エンベロープ糖タンパク質に由来するペプチド(Bongartzら、1994、Nucleic Acids Res. 22:468 1 4688);RGDペプチド;およびヒト1型免疫不全ウイルス(「HIV-1」)に由来するペプチドが含まれる。精製HIV-1 TATタンパク質は、培養において増殖するヒト細胞によって周囲の培地から取り込まれる(A.D. Frankel and C. O. Pabo(1988)、Cell 55:1189〜93)。TATタンパク質は、特定のHIV遺伝子をトランス活性化して、ウイルス複製にとって必須である。完全長のHIV-1 TATタンパク質は、アミノ酸残基86個を有する。HIV tat遺伝子は二つのエキソンを有する。TATアミノ酸1〜72位は、エキソン1によってコードされ、アミノ酸73〜86位はエキソン2によってコードされる。完全長のTATタンパク質は、リジン2個とアルギニン6個とを含む塩基性領域(アミノ酸47〜57位)、およびシステイン残基7個を含むシステインリッチ領域(アミノ酸22〜37位)を特徴とする。塩基性領域(すなわち、アミノ酸47〜57位)は、核の局在にとって重要であると考えられている。Ruben, S.ら、J. Virol. 63:1〜8(1989);Hauber, J.ら、J. Virol. 63:1181〜1187(1989);Rudolphら(2003)、278(13):11411。システインリッチ領域は、インビトロで金属結合二量体の形成を媒介し(Frankel, A.D.ら、Science 240:70〜73(1988);Frankel, A.Dら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6297〜6300(1988))、トランス活性化剤としてその活性にとって必須である(Garcia, J.A.ら、EMBO J. 7:3143(1988);Sadaie, M.R.ら、J. Virol. 63:1(1989))。他の調節タンパク質の場合と同様に、N末端領域は、細胞内プロテアーゼに対する保護に関係する可能性がある(Bachmair, A.ら、Cell 56:1019〜1032(1989))。
本発明の一つの態様において、塩基性ペプチドは、HIV-1 TATペプチドのアミノ酸47〜57位を含む。もう一つの態様において、塩基性ペプチドは、HIV-1 TATペプチドのアミノ酸48〜60位を含む。さらにもう一つの態様において、塩基性ペプチドはHIV-1 TATペプチドのアミノ酸49〜57位を含む。さらにもう一つの態様において、塩基性ペプチドはHIV-1 TATペプチドのアミノ酸49〜57、48〜60、または47〜57位を含み、HIV-1 TATペプチドのアミノ酸22〜36位を含まず、HIV-1 TATペプチドのアミノ酸73〜86位を含まない。さらにもう一つの態様において、下記の表2に示す特定のペプチドまたはその断片を、本発明の方法および組成物における担体ペプチドとして用いてもよい。
さらにもう一つの態様において、センス鎖の5'末端での活性なチオールは、サイトゾルに輸送するための塩基性ペプチドのC末端に付加されるシステイン残基に結合させてもよい(tat断片またはショウジョウバエアンテナペディアペプチドの断片のような)。これらのペプチドによるインターナリゼーションは、エンドサイトーシス経路を迂回して、したがって遊離のオリゴヌクレオチドと比較して生物学的有効性にとって必要な濃度を低下させる可能性がある。
他のアルギニンに富む塩基性ペプチドも同様に、本発明において用いるために含まれる。例えば、D-アミノ酸およびアルギニン置換TAT(47-60)を含むTAT類似体、HIV-1 Revのようなウイルスタンパク質に由来するRNA結合ペプチド、フロックハウスウイルス外皮タンパク質、癌関連タンパク質c-Fosおよびc-Junのようなロイシンジッパータンパク質のDNA結合配列、ならびに酵母転写因子GCN4は、その全てがいくつかのアルギニン残基を含む(参照として本明細書に組み入れられる、Futakiら(2001)、J. Biol. Chem. 276(8):5836〜5840、およびFutaki, S.(2002)、Int. J. Pharm. 245(12):1〜7を参照されたい)。一つの態様において、アルギニンリッチペプチドは、アルギニン残基約4〜約11個を含む。もう一つの態様において、アルギニン残基は隣接する残基である。
アミノ酸以外のサブユニットも同様に、輸送ポリマーを形成するために用いるために選択してもよい。そのようなサブユニットには、ヒドロキシアミノ酸、N-メチルアミノ酸アミノアルデヒド等が含まれてもよいがこれらに限定されず、それによってペプチド結合が減少したポリマーが得られる。選択した骨格の特性に応じて、他のサブユニット型を用いることができる。
側鎖グアニジノおよび/またはアミノ部分を整列させて配置するために、チオエーテルまたはスルホニル基によって結合したアルキル骨格部分、ヒドロキシ酸エステル(アミド結合のエステル結合による置換と同等)、α炭素を窒素に置換してアザ類似体を形成する、カルバメート基を結合させたアルキル骨格部分、ポリエチレンイミン(PEIs)、および二級アミンからなるポリマーが得られるアミノアルデヒドのような多様な骨格型を用いることができる。
より詳細な骨格リストには、N-置換アミド(CONRをCONH結合の代わりに用いる)、エステル(CO2)、ケトメチレン(CONH2)還元、またはメチレンアミノ(CH2NH)、チオアミド(CSNH)、ホスフィン酸塩(PO2RCH2)、ホスホナミデートおよびホスホナミニデートエステル(PO2RNH)、レトロペプチド(NHCO)、トランスアルケン(CR.dbd.CH)、フルオロアルケン(CF.dbd.CH)、ジメチレン(CH22CH2)、チオエーテル(CH2S)、ヒドロキシエチレン(CH(OH)CH2)、メチレンオキシ(CH2O)、テトラゾール(CN24)、レトロチオアミド(NHCS)、レトロ還元(NHCH2)、スルホンアミド(SO2NH)、メチレンスルホンアミド(CHRSO2NH)、レトロスルホンアミド(NHSO2)、およびペプトイド(N-置換グリシン)が含まれ、ならびに例えば、Fletcherら(1998)によって論評され、その論文で引用された参考文献に詳細に説明されるマロネートおよび/またはジェム-ジアミノアルキルサブユニットを有する骨格が含まれる。ペプトイド骨格(N-置換グリシン)も同様に用いることができる。前述の多くの置換によって、αアミノ酸から形成された骨格と比較しておおよそ等配電子のポリマー骨格が得られる。
ポリマーは、当技術分野で既知の任意の方法によって構築される。例としてのペプチドポリマーは、好ましくはペプチドシンセサイザー(アプライドバイオシステムズモデル433)を用いて合成によって産生することができ、または当技術分野で周知の方法によって組換えによって合成することができる。
固相ペプチド合成において、N-メチルおよびヒドロキシアミノ酸を通常のアミノ酸の代わりに用いることができる。しかし、ペプチド結合が減少したポリマーを産生するためは、減少したペプチド結合を含むアミノ酸の二量体を合成する必要がある。そのような二量体は、標準的な固相合成技術を用いてポリマーに組み入れられる。他の合成技術は当技術分野で周知である。
本発明の一つの態様において、RNA干渉物質と担体ポリマーとを、生体膜に接触させる前に混合する。RNA干渉物質と担体ポリマーとを混合することによって、物質と担体との会合が起こる。一つの態様において、RNA干渉物質と担体ポリマーは間接的に結合されない。したがって、二本鎖を形成するためにリンカーは必要でない。もう一つの態様において、RNA干渉物質と担体ポリマーとは、静電気的結合によって結合される。
用いた発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、ごく小さい分画の細胞のみがsiRNA分子を有効に取り込む可能性があることが知られている。これらの細胞を同定して選択するために、細胞標的に対する抗体を用いて、免疫蛍光を通してトランスフェクション効率を決定することができる。好ましい細胞標的には、ラミンA/Cのような、宿主細胞タイプに存在して、その発現が比較的一定である標的が含まれる。または、CMV促進EGFP発現プラスミド、ルシフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、BirA、β-ガラクトシダーゼ等のような細胞マーカーを含むプラスミドとの同時トランスフェクトを用いて、トランスフェクション効率を評価してもよい。siRNA分子をトランスフェクトした細胞は、免疫蛍光、位相差顕微鏡、および蛍光顕微鏡のような通常の技術によって同定することができる。
III.治療法
本発明は、アポトーシス、炎症、免疫応答、肝損傷、またはアポトーシス媒介疾患もしくは障害を有する、リスクがある、または感受性を有する被験者を治療する予防および治療法の双方を提供する。本明細書において用いられるように、「治療」または「治療する」とは、炎症、免疫応答、肝損傷、サイトカイン媒介疾患もしくは障害、またはアポトーシス媒介疾患もしくは障害またはサイトカイン媒介疾患もしくは疾患の症状を治癒(cure)、治癒(heal)、緩和、軽減、変化、治療、改善(ameliorate)、改善(improve)、または影響を及ぼす目的で、炎症、免疫応答、肝損傷、サイトカイン媒介疾患もしくは障害、またはアポトーシス媒介疾患もしくは障害を有する患者に対する、本発明の干渉物質(例えば、siRNA、例えばアポトーシス関連遺伝子siRNAまたは前炎症性サイトカインsiRNA)の適用もしくは投与、または患者からの単離組織もしくは細胞株への治療物質の適用もしくは投与であると定義される。
本発明は、アポトーシス、炎症、免疫応答、肝損傷、またはアポトーシス媒介疾患もしくは障害を有する、リスクがある、または感受性を有する被験者を治療する予防および治療法の双方を提供する。本明細書において用いられるように、「治療」または「治療する」とは、炎症、免疫応答、肝損傷、サイトカイン媒介疾患もしくは障害、またはアポトーシス媒介疾患もしくは障害またはサイトカイン媒介疾患もしくは疾患の症状を治癒(cure)、治癒(heal)、緩和、軽減、変化、治療、改善(ameliorate)、改善(improve)、または影響を及ぼす目的で、炎症、免疫応答、肝損傷、サイトカイン媒介疾患もしくは障害、またはアポトーシス媒介疾患もしくは障害を有する患者に対する、本発明の干渉物質(例えば、siRNA、例えばアポトーシス関連遺伝子siRNAまたは前炎症性サイトカインsiRNA)の適用もしくは投与、または患者からの単離組織もしくは細胞株への治療物質の適用もしくは投与であると定義される。
予防的および治療的治療法に関して、そのような治療は、薬学ゲノム学の分野から得られた知識に基づいて、特別に調整または改変してもよい。本明細書において用いられるように「薬学ゲノム学」とは、臨床開発中および市場の薬剤に対する遺伝子のシークエンシング、統計的遺伝学、および遺伝子発現分析のようなゲノム学技術の適用を指す。より詳しく述べると、この用語は、患者の遺伝子が薬剤に対する彼または彼女の反応をどのように決定するかに関する研究を指す(例えば、患者の「薬物反応表現型」または「薬物反応遺伝子型」)。このように、本発明のもう一つの局面は、一つまたはそれ以上のRNA干渉物質、例えばsiRNAまたはshRNAによる個々の予防的または治療的治療を調整する方法を提供する。薬学ゲノム学によって、臨床医または医師は、治療から最善の利益を受けるであろう患者に対して予防的または治療的治療を標的とすることができ、毒性の薬物関連副作用を経験するであろう患者の治療を回避することができる。
1.予防法
一つの局面において、本発明は、被験者に一つまたはそれ以上の治療物質、例えば本明細書に記述のRNA干渉物質(例えば、一つまたはそれ以上のsiRNA、例えばアポトーシス関連遺伝子、例えばFasもしくはFasL siRNA、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαsiRNA)を投与することによって、被験者におけるアポトーシス媒介疾患もしくは障害またはサイトカイン媒介疾患もしくは障害、組織損傷、例えばアポトーシス関連遺伝子活性、例えばアポトーシスまたは前炎症性サイトカイン活性、例えば炎症の調節、もしくは免疫応答の調節によって引き起こされたまたはそれに関連する肝臓またはT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または悪性細胞損傷を予防する方法を提供する。アポトーシス媒介疾患もしくは障害または前炎症性サイトカイン疾患もしくは障害、組織損傷、例えばアポトーシス関連遺伝子活性または前炎症性サイトカイン活性、例えばFas活性、炎症の調節、または免疫応答によって引き起こされたまたはそれに関連する肝臓またはT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞の損傷のリスクを有する被験者は、例えば、アポトーシス媒介疾患もしくは障害または前炎症性サイトカイン疾患もしくは障害、組織損傷、例えばアポトーシス関連遺伝子活性、例えばFas活性、炎症の調節、または免疫応答によって引き起こされたまたはそれに関連する肝臓またはT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞の損傷、例えば肝炎、例えばアルコール性肝炎、または他の型の肝炎に関する任意の既知の危険因子、または移植の拒絶、癌、または敗血症のリスクを有する被験者によって同定することができる。予防物質の投与は、アポトーシス媒介疾患もしくは障害、組織損傷、炎症、または免疫応答が予防される、またはその進行が遅れるように、アポトーシス媒介疾患もしくは障害、前炎症性サイトカイン疾患もしくは障害、例えば敗血症、組織損傷、例えばアポトーシス関連遺伝子活性または前炎症性サイトカイン活性、例えばFas活性、炎症、または免疫応答によって引き起こされたまたはそれに関連する肝臓またはT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞の損傷の特徴である症状の発現前に行うことができる。移植の場合、移植された臓器または組織、例えば肝臓を、移植前に本発明のRNA干渉物質によって治療してもよく、またはRNA干渉物質は、本明細書に記述の既知の方法または任意の方法によって移植後に投与してもよい。
一つの局面において、本発明は、被験者に一つまたはそれ以上の治療物質、例えば本明細書に記述のRNA干渉物質(例えば、一つまたはそれ以上のsiRNA、例えばアポトーシス関連遺伝子、例えばFasもしくはFasL siRNA、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαsiRNA)を投与することによって、被験者におけるアポトーシス媒介疾患もしくは障害またはサイトカイン媒介疾患もしくは障害、組織損傷、例えばアポトーシス関連遺伝子活性、例えばアポトーシスまたは前炎症性サイトカイン活性、例えば炎症の調節、もしくは免疫応答の調節によって引き起こされたまたはそれに関連する肝臓またはT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または悪性細胞損傷を予防する方法を提供する。アポトーシス媒介疾患もしくは障害または前炎症性サイトカイン疾患もしくは障害、組織損傷、例えばアポトーシス関連遺伝子活性または前炎症性サイトカイン活性、例えばFas活性、炎症の調節、または免疫応答によって引き起こされたまたはそれに関連する肝臓またはT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞の損傷のリスクを有する被験者は、例えば、アポトーシス媒介疾患もしくは障害または前炎症性サイトカイン疾患もしくは障害、組織損傷、例えばアポトーシス関連遺伝子活性、例えばFas活性、炎症の調節、または免疫応答によって引き起こされたまたはそれに関連する肝臓またはT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞の損傷、例えば肝炎、例えばアルコール性肝炎、または他の型の肝炎に関する任意の既知の危険因子、または移植の拒絶、癌、または敗血症のリスクを有する被験者によって同定することができる。予防物質の投与は、アポトーシス媒介疾患もしくは障害、組織損傷、炎症、または免疫応答が予防される、またはその進行が遅れるように、アポトーシス媒介疾患もしくは障害、前炎症性サイトカイン疾患もしくは障害、例えば敗血症、組織損傷、例えばアポトーシス関連遺伝子活性または前炎症性サイトカイン活性、例えばFas活性、炎症、または免疫応答によって引き起こされたまたはそれに関連する肝臓またはT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞の損傷の特徴である症状の発現前に行うことができる。移植の場合、移植された臓器または組織、例えば肝臓を、移植前に本発明のRNA干渉物質によって治療してもよく、またはRNA干渉物質は、本明細書に記述の既知の方法または任意の方法によって移植後に投与してもよい。
本発明のsiRNAの局所投与を含む、本明細書に記述のまたは当技術分野で既知の本発明の治療物質の任意の投与様式を、アポトーシス媒介疾患もしくは障害または前炎症性サイトカイン疾患もしくは障害、組織損傷、例えばアポトーシス関連遺伝子活性または前炎症性サイトカイン活性、例えばFas活性、炎症、または免疫応答によって引き起こされたまたはそれに関連する肝臓またはT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞の損傷の予防的治療のために利用してもよい。
2.治療法
本発明のもう一つの局面は、アポトーシス媒介疾患もしくは障害、または前炎症性サイトカイン媒介疾患もしくは障害、組織損傷、炎症、または免疫応答を治療するために、遺伝子発現もしくはタンパク質活性、例えばアポトーシス関連遺伝子発現、例えば抗アポトーシス遺伝子発現もしくは前アポトーシス遺伝子発現、例えばFas遺伝子発現もしくはタンパク質活性、または前炎症性サトカイン遺伝子発現もしくはタンパク質活性を調節する方法に関する。したがって、例としての態様において、本発明の調節法は、アポトーシス関連遺伝子、例えば抗アポトーシス遺伝子もしくは前アポトーシス遺伝子、例えばFas、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαの発現が調節されるように、アポトーシス関連遺伝子、例えばFasを発現する細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞を、標的遺伝子、例えばアポトーシス関連遺伝子、例えば抗アポトーシス遺伝子もしくは前アポトーシス遺伝子、例えばFasまたは前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαに対して特異的である一つまたはそれ以上のRNA干渉物質(例えば、siRNA、例えばアポトーシス関連遺伝子siRNA、例えばFasまたは前炎症性サイトカイン遺伝子siRNA、例えばIL-1もしくはTNFαsiRNA)に接触させることを含む。例えば、抗アポトーシス遺伝子活性は、例えば、癌を治療するために阻害される;または前アポトーシス遺伝子活性は、例えば肝炎、肝損傷、または移植の拒絶を治療するために阻害される。これらの方法は、インビトロで(例えば、細胞を培養することによって)行うことができ、またはインビボで(例えば、物質を被験者に投与することによって)行うことができる。
本発明のもう一つの局面は、アポトーシス媒介疾患もしくは障害、または前炎症性サイトカイン媒介疾患もしくは障害、組織損傷、炎症、または免疫応答を治療するために、遺伝子発現もしくはタンパク質活性、例えばアポトーシス関連遺伝子発現、例えば抗アポトーシス遺伝子発現もしくは前アポトーシス遺伝子発現、例えばFas遺伝子発現もしくはタンパク質活性、または前炎症性サトカイン遺伝子発現もしくはタンパク質活性を調節する方法に関する。したがって、例としての態様において、本発明の調節法は、アポトーシス関連遺伝子、例えば抗アポトーシス遺伝子もしくは前アポトーシス遺伝子、例えばFas、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαの発現が調節されるように、アポトーシス関連遺伝子、例えばFasを発現する細胞、例えばT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞を、標的遺伝子、例えばアポトーシス関連遺伝子、例えば抗アポトーシス遺伝子もしくは前アポトーシス遺伝子、例えばFasまたは前炎症性サイトカイン、例えばIL-1もしくはTNFαに対して特異的である一つまたはそれ以上のRNA干渉物質(例えば、siRNA、例えばアポトーシス関連遺伝子siRNA、例えばFasまたは前炎症性サイトカイン遺伝子siRNA、例えばIL-1もしくはTNFαsiRNA)に接触させることを含む。例えば、抗アポトーシス遺伝子活性は、例えば、癌を治療するために阻害される;または前アポトーシス遺伝子活性は、例えば肝炎、肝損傷、または移植の拒絶を治療するために阻害される。これらの方法は、インビトロで(例えば、細胞を培養することによって)行うことができ、またはインビボで(例えば、物質を被験者に投与することによって)行うことができる。
当業者は、個々の患者において所望の「有効レベル」を得るために、用いる組成物の正確な製剤に関して、適当な用量、スケジュールおよび投与方法を容易に決定することができる。当業者はまた、適当な患者試料(例えば、血液および/または組織)の直接(例えば分析化学分析)、または間接的な分析によって、本発明の化合物の「有効レベル」に関する適当な指標を容易に決定して用いることができる。
本発明の治療組成物はまた、エクスビボで細胞に投与することができ、例えば細胞を被験者から採取して、本発明のsiRNAまたはshRNAを含む組成物を細胞に投与し、細胞を被験者に再度導入する。ベクター、例えば遺伝子治療ベクターを用いて、治療物質を細胞に輸送することができる。細胞は、例えば静脈内注射によって被験者に再導入してもよい。
本発明の予防的または治療的薬学的組成物は、アポトーシス媒介疾患もしくは障害、または前炎症性サイトカイン媒介疾患もしくは障害、組織損傷、炎症、または免疫応答を治療的に治療または予防するために用いる場合、本発明に従うベクターと共に他の薬剤を含むことができ、同様に、アポトーシス媒介疾患もしくは障害、または前炎症性サイトカイン媒介疾患もしくは障害、組織損傷、炎症、または免疫応答を治療または予防するために用いられる他の薬剤と共に投与することができる。例えば、本発明の予防的または治療的薬学的組成物は、アポトーシス関連遺伝子、例えばFas、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-4の発現または活性を調節する他の薬剤と併用して用いることができる。
例えば、アポトーシス媒介疾患または障害、組織損傷、例えばアポトーシス関連遺伝子活性、例えばFas活性によって引き起こされるまたはそれに関連する肝臓、またはT細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞、および/または腫瘍細胞の損傷を治療または予防するために用いられる薬剤の例には、肝炎の治療、例えばコルチコステロイドによる免疫抑制剤治療、組換え型インターフェロンα、リボビリン、ウルソデオキシコール酸、およびビタミンEと共に、移植の拒絶を阻害するための免疫抑制剤治療、または他の抗炎症剤、癌治療、例えば肝癌治療等が含まれるがこれらに限定されない。
3.薬学ゲノム学
本明細書に記述のRNA干渉物質(例えば、siRNA、例えばアポトーシス関連遺伝子siRNA、例えばFas siRNAまたはサイトカインsiRNA)は、アポトーシス媒介疾患もしくは障害、前炎症性サイトカイン媒介疾患もしくは障害、組織損傷、炎症、または免疫応答を治療するために個体に投与することができる。そのような治療と共に、薬学ゲノム学(すなわち、個体の遺伝子型と外来薬物または化合物に対するその個体の反応との関係の研究)を検討してもよい。治療の代謝における差によって、薬理学的に活性な薬剤の用量と血中濃度との関係を変化させることによって、重度の毒性または治療の失敗が起こりうる。このように、医師または臨床医は、本明細書に記述の一つまたはそれ以上の治療的RNA干渉物質(例えばsiRNA、例えばアポトーシス関連遺伝子siRNA、例えばFas siRNAまたは前炎症性サイトカインsiRNA)を投与するか否かを決定するためのみならず、RNA干渉物質、例えばsiRNA、例えばアポトーシス関連遺伝子siRNA、例えばFas siRNAまたは前炎症性サイトカインsiRNAによる治療の用量および/または治療レジメを調整するために、関連する薬学ゲノム学研究において得られた知識を適用することを検討してもよい。
本明細書に記述のRNA干渉物質(例えば、siRNA、例えばアポトーシス関連遺伝子siRNA、例えばFas siRNAまたはサイトカインsiRNA)は、アポトーシス媒介疾患もしくは障害、前炎症性サイトカイン媒介疾患もしくは障害、組織損傷、炎症、または免疫応答を治療するために個体に投与することができる。そのような治療と共に、薬学ゲノム学(すなわち、個体の遺伝子型と外来薬物または化合物に対するその個体の反応との関係の研究)を検討してもよい。治療の代謝における差によって、薬理学的に活性な薬剤の用量と血中濃度との関係を変化させることによって、重度の毒性または治療の失敗が起こりうる。このように、医師または臨床医は、本明細書に記述の一つまたはそれ以上の治療的RNA干渉物質(例えばsiRNA、例えばアポトーシス関連遺伝子siRNA、例えばFas siRNAまたは前炎症性サイトカインsiRNA)を投与するか否かを決定するためのみならず、RNA干渉物質、例えばsiRNA、例えばアポトーシス関連遺伝子siRNA、例えばFas siRNAまたは前炎症性サイトカインsiRNAによる治療の用量および/または治療レジメを調整するために、関連する薬学ゲノム学研究において得られた知識を適用することを検討してもよい。
薬学ゲノム学は、罹患した人における変化した薬物処置および異常な作用のために薬物に対する反応における臨床的に有意な遺伝性の変化を扱う。例えば、Eichelbaum, M.ら(1996)、Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10〜11):983〜985、およびLinder, M.W.ら(1997)、Clin. Chem. 43(2):254〜266を参照されたい。一般的に、二つのタイプの薬学遺伝学状態を区別することができる。すなわち、薬物が体に及ぼす方法を変化させる(薬物作用の変化)唯一の要因として伝搬される遺伝子状態、または体が薬物に作用する方法を変化させる(薬物代謝の変化)唯一の要因として伝搬される遺伝子状態。これらの薬学遺伝学状態は、まれな遺伝子欠損として、または天然に存在する多形のいずれかとして起こりうる。例えば、グルコース-6-燐酸デヒドロゲナーゼ(G6PD)欠損は、主な臨床合併症が酸化剤薬物(抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン)の摂取およびソラマメの摂取後の溶血である一般的な遺伝性酵素症である。
「ゲノム全体の関連」として知られる薬物反応を予測する遺伝子を同定するための一つの薬物ゲノム学アプローチは、既知の遺伝子関連マーカー(例えば、そのそれぞれが二つの変種を有するヒトゲノム上の多形または可変部位60,000〜100,000個からなる「双対立遺伝子」遺伝子マーカーマップ)からなるヒト遺伝子の高解像度マップに主に依存する。そのような高解像度遺伝子マップを、特に認められた薬物反応または副作用に関連したマーカーを同定するためにフェーズII/III薬物臨床試験に参加する患者の統計学的に有意な数のそれぞれのゲノムのマップと比較することができる。または、そのような高解像度マップは、ヒトゲノムにおける既知の一ヌクレオチド多形(SNPs)数千万個の組み合わせから作製することができる。本明細書において用いられるように、「SNP」は、DNAの枝における一ヌクレオチド塩基に起こる一般的な変化である。例えば、SNPは、DNA鋳型の1000塩基毎に1回起こる可能性がある。SNPは、疾患のプロセスに関与する可能性があるが、大多数は疾患に関連しない可能性がある。そのようなSNPsの発生に基づく遺伝子マップを考慮して、個体を、その個々のゲノムにおけるSNPsの特定のパターンに応じて、遺伝子カテゴリーに分類することができる。そのような方法において、治療レジメは、そのような遺伝的に類似の個体において共通である可能性がある形質を考慮に入れて、遺伝的に類似の個体の群に合わせて調整することができる。
または、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法を利用して、薬物反応を予測する遺伝子を同定することができる。この方法に従って、薬物標的をコードする遺伝子が既知であれば、その遺伝子の全ての共通の変種は、集団においてかなり容易に同定することができ、遺伝子の一つの型を有することが、もう一つの型を有することと比較して、特定の薬物反応に関連するか否かを決定することができる。
説明的な態様として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および期間の双方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素(例えば、N-アセチルトランスフェラーゼ2(NAT2)およびチトクロームP450酵素CYP2D6およびCYP2C19)の遺伝子多形の発見は、薬物の標準的で安全な用量を摂取後に、数人の患者が予想される薬物効果を得ない理由、または過剰な薬物反応および重篤な毒性を示す理由を提供した。これらの多形は、集団における二つの表現型、すなわち広範な代謝体(EM)および不良な代謝体(PM)において発現される。PMの発生は、集団が異なれば異なる。例えば、CYP2D6をコードする遺伝子は、非常に多形であり、いくつかの変異がPMにおいて同定されているが、その全員に機能的CYP2D6が存在しない。CYP2D6およびCYP2C19の不良代謝体は、標準用量を投与された場合に、過度の薬物反応および副作用をかなり頻繁に経験する。代謝物が活性な治療部分である場合、PMは、そのCYP2D6形成代謝物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛作用に関して証明されているように、治療反応を示さない。他の極端は、標準用量には反応しないいわゆる超急速代謝体である。最近、超急速代謝体の分子的基礎は、CYP2D6遺伝子の増幅によると同定されている。
または、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法を利用して薬物反応を予測する遺伝子を同定することができる。例えば、薬物を投与された動物の遺伝子発現は、毒性に関連する遺伝子経路のスイッチが入ったか否かの指標を示すことができる。
上記の一つより多い薬物ゲノム学アプローチから生成された情報を用いて、個体の予防的または治療的治療のための適当な用量および治療レジメを決定することができる。この知識を投与または薬物選択に適用すると、有害反応または治療失敗を回避することができ、このように本明細書に記述のように治療的RNA干渉物質(例えば、siRNA、例えばアポトーシス関連遺伝子siRNA、例えばFas siRNA)によって被験者を治療する場合に、治療的または予防的有効性を増強することができる。
IV.薬学的組成物
RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAは、投与に適した薬学的組成物に組み入れることができる。そのような組成物は典型的に、アポトーシス関連遺伝子siRNA、例えばFas siRNAのようなRNA干渉物質、例えばsiRNAと、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」という用語には、薬学的投与に適合性の、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が含まれると意図される。薬学的に活性な物質に関してそのような媒体および物質を用いることは、当技術分野で周知である。任意の通常の媒体または物質が活性化合物と非適合性である場合を除き、組成物におけるその使用が企図される。補助活性化合物も同様に組成物に組み入れることができる。
RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAは、投与に適した薬学的組成物に組み入れることができる。そのような組成物は典型的に、アポトーシス関連遺伝子siRNA、例えばFas siRNAのようなRNA干渉物質、例えばsiRNAと、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」という用語には、薬学的投与に適合性の、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が含まれると意図される。薬学的に活性な物質に関してそのような媒体および物質を用いることは、当技術分野で周知である。任意の通常の媒体または物質が活性化合物と非適合性である場合を除き、組成物におけるその使用が企図される。補助活性化合物も同様に組成物に組み入れることができる。
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように製剤化される。一般的に、本発明の組成物は、安定化剤、緩衝剤等を用いてまたは用いずに、任意の標準的な手段によって導入され、薬学的組成物を形成する。リポソーム輸送メカニズムにおいて用いるために、リポソーム形成に関する標準的なプロトコールに従うことができる。本発明の組成物はまた、経口投与のための錠剤、カプセル剤、またはエリキシル剤;直腸投与のための坐剤:滅菌溶液;注射による投与のための懸濁剤等として用いることができる。
一つの態様において、本発明は、ポリ(エチレングリコール)脂質(PEG-改変、長い循環中リポソーム、またはステルスリポソーム)を含む表面改変リポソームを含む組成物において本発明の化合物を用いることを特徴とする。もう一つの態様において、本発明は、ポリエチレングリコールに共有結合させて本発明の化合物を用いることを特徴とする。これらの製剤は、標的組織における薬物の蓄積を増加させる方法を提供する。このクラスの薬物担体は、単核球の貪食系(MPSまたはRES)によるオプソニン化および***に耐え、それによって封入された薬物はより長い血液循環時間および組織曝露の増強が可能となる(Lasicら、Chem. Rev. 1995、95:2601〜2627;Ishiwataら、Chem. Pharm, Bull 1995、43:1005〜1011)。血液循環時間が長い組成物は、特に、MPSの組織において蓄積することが知られている通常の陽イオンリポソームと比較して、DNAおよびRNAのような治療化合物の薬動力学および薬力学を増強する(Liuら、J. Biol. Chem. 1995、42:2486424870;Choiら、国際公開公報第96/10391号;Ansellら、国際公開公報第96/10390号;Hollandら、国際公開公報第96/10392号)。血液循環時間が長い組成物はまた、肝臓および脾臓のような代謝的に攻撃的なMPS組織における蓄積を回避できることに基づいて、陽イオンリポソームと比較してより大きい程度にヌクレアーゼ分解から薬物を保護する可能性がある。
投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、筋肉内、皮内、皮下、経口(例えば吸入)、経皮(局所)、経粘膜、膣内、および直腸投与が含まれる。非経口投与、皮内、または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液には、以下の成分が含まれうる:注射用水、生理食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤;ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤;アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤;酢酸塩、クエン酸塩、または燐酸塩のような緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性調節剤が含まれうる。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基によって調節することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の多用量バイアルに封入することができる。化合物はまた、坐剤の形で調製することができる(例えば、カカオバターおよび他のグリセリドのような通常の坐剤基剤と共に)、または直腸輸送のための浣腸の形で調製することができる。
全身投与は、経粘膜または経皮手段によって行うことができる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透させるべき障壁にとって適当な浸透剤を製剤において用いる。そのような浸透剤は、一般的に当技術分野で既知であり、例えば経粘膜投与のために、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、点鼻スプレー、または坐剤を用いることによって行うことができる。経皮投与の場合、活性化合物を、当技術分野で一般的に既知の軟膏(ointments)、軟膏(salves)、ゲル、またはクリームに調製する。
一つの態様において、インプラントおよび微量封入輸送系を含む徐放製剤のような、体からの迅速な***に対して化合物を保護する担体と共に、活性化合物を調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生体分解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤を調製する方法は、当業者に明らかであろう。材料はまた、アルザ社(Alza Corporation)およびノバファーマシューティカルズインク(Nova Pharmaceuticals, Inc.)から購入することができる。リポソーム浮遊液(肝細胞を標的としたリポソームを含む)も同様に薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、例えば、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,522,811号、米国特許第5,643,599号に記述されるように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。
リポソーム浮遊液(例えばホスファチジルセリンを含むマクロファージを標的とするリポソームを含む)も同様に、薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,522,811号、米国特許第5,643,599号に記述されるように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。または、本発明の治療物質は、標的細胞に取り込ませるためにsiRNAの一つまたはそれ以上の末端にポリ-Gテールを付加することによって調製してもよい。その上、siRNAは、Capodiciら(2002)、J. Immunol. 169(9):5196に記述されるように、フルオロ誘導体化して、標的細胞に輸送してもよい。
注射可能な用途に適した薬学的組成物には、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製物のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適した担体には、生理食塩液、静菌水、Cremophor EL(商標)(BASF、パーシッパニー、ニュージャージー州)、または燐酸緩衝生理食塩液(PBS)が含まれる。全ての場合において、組成物は、滅菌でなければならず、容易な注入操作性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、およびその適した混合物を含む溶媒または分散媒体となりうる。例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の保護は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサル等によって得ることができる。多くの場合、等張剤、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムのような糖、多価アルコールを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって行うことができる。
滅菌注射用溶液は、上記の成分の一つまたは成分の組み合わせと共に必要量のsiRNAを適当な溶媒に組み入れて、必要に応じて濾過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散液は、基礎分散媒体を含む滅菌溶媒に、活性化合物および先に列挙した成分からの必要な他の成分を組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、予め濾過滅菌したその溶液から活性成分粉末プラス任意のさらなる所望の成分を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
経口組成物には一般的に、不活性希釈剤または食用担体が含まれる。それらは、ゼラチンカプセルに封入することができ、または錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的に関して、活性化合物を賦形剤と共に組み入れて、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形で用いることができる。経口組成物はまた、液体担体における化合物が経口適用され、うがいしてはき出すまたは飲み込まれる、マウスウォッシュとして用いるための液体担体を用いて調製することができる。薬学的に適合性の結合剤、および/またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、トローチ剤等は、任意の以下の成分または類似の特性の化合物を含みうる:微結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンのような結合剤;デンプンもしくは乳糖のような賦形剤;アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチのような崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムもしくはステローツのような潤滑剤;コロイド状二酸化ケイ素のようなグライダント;蔗糖もしくはサッカリンのような甘味料;またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料のような着香料。
吸入投与の場合、化合物は、適した噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形で輸送される。
投与の容易さおよび用量の均一性のために単位用量剤形で経口または非経口組成物を調製することが特に都合がよい。本明細書において用いられる単位用量型は、それぞれの単位が、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の規定量を含む、治療すべき被験者に関して単位用量として適した物理的に個別の単位を指す。本発明の単位投与剤形の明細は、活性化合物の独自の特徴および得られる特定の治療効果、および個体を治療するためにそのような活性化合物を合成する際の固有の制限によって指示され、それらに直接依存する。
そのような化合物の毒性および治療効率は、LD50(集団の50%に対して致死である用量)、およびED50(集団の50%において治療的に有効である用量)によって決定することができる。毒性対治療効果の用量比が治療指数であり、LD50/ED50の比で表記することができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用いてもよいが、非感染細胞に対する起こりうる障害を最小限にするために、そのような化合物を罹患組織部位に標的化して、それによって副作用を減少させる輸送系を設計するように注意しなければならない。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて用いるための用量範囲を処方するために用いることができる。そのような化合物の用量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性を示さないED50が含まれる循環中の濃度範囲内に存在する。用量は、用いられる投与剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化してもよい。本発明の方法において用いられる如何なる化合物に関しても、治療的有効量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養において決定されるように、IC50(すなわち症状の半最大阻害を得る試験化合物の濃度)を含む循環中の血漿濃度範囲を得るために動物モデルにおいて調製してもよい。そのような情報を用いてヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
本明細書において定義されるように、RNA干渉物質の治療的有効量(すなわち、有効量)の範囲は約0.001〜3,000 mg/kg体重、好ましくは約0.01〜2500 mg/kg体重、より好ましくは約0.1〜2000、約0.1〜1000 mg/kg体重、0.1〜500 mg/kg体重、0.1〜100 mg/kg体重、0.1〜50 mg/kg体重、0.1〜25 mg/kg体重、およびさらにより好ましくは約1〜10 mg/kg、2〜9 mg/kg、3〜8 mg/kg、4〜7 mg/kg、または5〜6 mg/kg体重の範囲である。当業者は、特定の要因が、疾患または障害の重症度、これまでの治療、被験者の全身健康および/または年齢、および存在する他の疾患が含まれるがこれらに限定されない、被験者を有効に治療するために必要な用量に影響を及ぼす可能性があることを認識するであろう。その上、RNA干渉物質の治療的有効量による被験者の治療には、1回治療が含まれうる、または好ましくは一連の治療が含まれうる。
好ましい例において、被験者は、約1〜10週間のあいだ、好ましくは2〜8週間、より好ましくは約3〜7週間、およびさらにより好ましくは約4、5、または6週間のあいだ毎週1回、約0.1〜20 mg/kg体重の範囲のRNA干渉物質によって治療する。同様に、治療に用いられるRNA干渉物質の有効量は、特定の治療経過のあいだに増加または減少させてもよいと認識されるであろう。用量の変化は、本明細書に記述の診断アッセイの結果に起因し、それらから明らかとなるであろう。
RNA干渉物質、例えばsiRNAまたはshRNAの適当な用量は、当業者の医師、獣医師、または研究者の能力範囲内の多くの要因に依存すると理解される。物質の用量は、例えば治療される被験者または試料の同一性、体格、および状態に応じて変化して、応用可能であれば、それによって組成物が投与される投与経路、および医師が物質、例えばsiRNAが標的遺伝子、例えばアポトーシス関連遺伝子、例えばFas遺伝子に対して有することを望む効果にさらに依存するであろう。
RNA干渉物質、例えば、本発明のsiRNAをベクターに挿入することができる。これらの構築物は、例えば静脈内注射、局所投与(米国特許第5,328,470号を参照されたい)によって、または定位固定注射(例えば、Chenら(1994)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054〜3057を参照されたい)によって被験者に輸送することができる。ベクターの薬学的調製物には、RNA干渉物質、例えば許容される希釈剤におけるsiRNAベクターが含まれうる、または遺伝子輸送媒体が抱埋されている徐放性マトリクスを含みうる。または、完全な遺伝子輸送ベクター、例えばレトロウイルスベクターを組換え型細胞から無傷で産生することができる場合、薬学的調製物には、遺伝子輸送系を産生する一つまたはそれ以上の細胞が含まれうる。
薬学的組成物には、投与のための説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーが含まれうる。
本発明は、制限的に解釈してはならない以下の実施例によってさらに説明する。本明細書を通して引用した全ての参考文献、特許、および出版された特許出願の内容物は、図および配列表と共に参照として本明細書に組み入れられる。
実施例
実施例1 RNA干渉標的化Fasは、インビボでFas発現を阻害して、劇症肝炎および線維症からマウスを保護する
合成21〜23ヌクレオチドsiRNAによるRNA干渉(RNAi)は、インビトロで哺乳類細胞における細胞およびウイルス遺伝子発現をサイレンシングさせる(Elbashir, S.M.(2001)、Nature 411:494〜8;Caplen, N.J.ら(2001)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9742〜7)。マウスの尾静脈にパルス注射されたsiRNA二本鎖は、同時トランスフェクトさせた発光性飛翔昆虫ルシフェラーゼ遺伝子発現を阻害する(McCaffrey, A.P.ら(2002)、Nature 418:38〜9;Lewis, D.L.ら(2002)、Nat. Genet. 32:107〜8)。インビボでのsiRNAのウイルス媒介輸送は、外因性のGFPおよび内因性のグルクロニダーゼ発現を減少させる(Xia, H.ら(2002)、Nat. Biotechnol. 20:1006〜10)。これらの研究において、RNAサイレンシングは肝臓において顕著であり、このことは、肝臓がsiRNAの治療可能性を調べるための理想的な臓器であることを示している。肝細胞は、Fasを高度に発現していることから、Fas媒介アポトーシスに対して非常に感受性が高い(Kondo, T.ら(1997)、Nat. Med. 3:409〜13)。その結果、Fas媒介アポトーシスは、ウイルス、自己免疫、および移植の拒絶を含む多様な障害による肝損傷において重要な役割を果たす(Rust, C. & Gores, G.J.(2000)、Am. J. Med. 108:567〜74;Siegel, R.M. & Fleisher, T.A.(1999)、J. Allergy Clin. Immunol. 103:729〜38)。Fas欠損lprマウスは、劇症肝炎を誘発する要因のチャレンジから生存して(Ogasawara, J.ら(1993)、Nature 364:806〜9;Li, X.K.ら(2001)、Transplantation 71:503〜8)、慢性肝炎の障害後の線維症を減少させる(Canbay, A.ら(2002)、Gastroenterology 123:1323〜30)。このように、Fasを標的とする静脈内siRNA注射が、インビボでマウス肝細胞上のFas発現を阻害できるか否か、ならびに劇症肝炎および線維症から肝臓を保護できるか否かを調べる。
実施例1 RNA干渉標的化Fasは、インビボでFas発現を阻害して、劇症肝炎および線維症からマウスを保護する
合成21〜23ヌクレオチドsiRNAによるRNA干渉(RNAi)は、インビトロで哺乳類細胞における細胞およびウイルス遺伝子発現をサイレンシングさせる(Elbashir, S.M.(2001)、Nature 411:494〜8;Caplen, N.J.ら(2001)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9742〜7)。マウスの尾静脈にパルス注射されたsiRNA二本鎖は、同時トランスフェクトさせた発光性飛翔昆虫ルシフェラーゼ遺伝子発現を阻害する(McCaffrey, A.P.ら(2002)、Nature 418:38〜9;Lewis, D.L.ら(2002)、Nat. Genet. 32:107〜8)。インビボでのsiRNAのウイルス媒介輸送は、外因性のGFPおよび内因性のグルクロニダーゼ発現を減少させる(Xia, H.ら(2002)、Nat. Biotechnol. 20:1006〜10)。これらの研究において、RNAサイレンシングは肝臓において顕著であり、このことは、肝臓がsiRNAの治療可能性を調べるための理想的な臓器であることを示している。肝細胞は、Fasを高度に発現していることから、Fas媒介アポトーシスに対して非常に感受性が高い(Kondo, T.ら(1997)、Nat. Med. 3:409〜13)。その結果、Fas媒介アポトーシスは、ウイルス、自己免疫、および移植の拒絶を含む多様な障害による肝損傷において重要な役割を果たす(Rust, C. & Gores, G.J.(2000)、Am. J. Med. 108:567〜74;Siegel, R.M. & Fleisher, T.A.(1999)、J. Allergy Clin. Immunol. 103:729〜38)。Fas欠損lprマウスは、劇症肝炎を誘発する要因のチャレンジから生存して(Ogasawara, J.ら(1993)、Nature 364:806〜9;Li, X.K.ら(2001)、Transplantation 71:503〜8)、慢性肝炎の障害後の線維症を減少させる(Canbay, A.ら(2002)、Gastroenterology 123:1323〜30)。このように、Fasを標的とする静脈内siRNA注射が、インビボでマウス肝細胞上のFas発現を阻害できるか否か、ならびに劇症肝炎および線維症から肝臓を保護できるか否かを調べる。
第一に、Cy5-標識Fas(配列1)-siRNA(50 μg、2.0〜2.5 mg/kg)の流体力学的尾静脈注射による合成siRNA二本鎖のインビボでのマウス肝細胞への輸送(Zhang, G.ら(1999)、Hum Gene Ther. 10:1735〜7)を確認した。3回注射の最後から24時間後に、肝細胞の88±6%がsiRNAを取り込み、フローサイトメトリーによってCy5+であった(図1a)。有効な輸送は、siRNA二本鎖がインビボでほとんどの肝細胞によって取り込まれうることを確認する(McCaffrey, A.Pら(2002)、Nature 418:38〜9;Lewis, D.L.(2002)、Nat. Genet. 32:107〜8)。形質導入は。レポータープラスミドDNAの1回注射の場合に認められた40%効率より高い(Zhang, G.(1999)、Hum. Gene Ther. 10:1735〜7)。肝細胞におけるFas mRNAおよびタンパク質発現はそれぞれ、注射後の様々な時点でRNアーゼ保護アッセイ(RPA)およびイムノブロットによって測定した。Fas(配列1)-siRNAによる治療は、最後の注射の24時間後に、生理食塩液またはGFP-siRNA注射と比較してFas mRNA発現を8〜10倍減少させた(fas/GAPDHシグナル:0.0024±0.0004対0.022±0.002生理食塩液または0.022±0.002 GFP-siRNA、n=3/群、いずれかの対照と比較してp<0.001)(図1b)。平行して、イムノブロット分析はまた、Fas(配列1)-siRNAが肝細胞におけるFasタンパク質をほぼバックグラウンドまで減少させることを示した(図1c)。GFPを標的とする対照siRNAの注射はFas発現を変化させなかったこと、およびFas(配列1)-siRNA治療がFasL、FADD、FAF、TRAIL、およびTNF受容体p55のような他のFas関連遺伝子の発現に影響を及ぼさなかったことから(図1b)、作用は特異的であった。特異性はまた、fasの他の領域を標的とするsiRNAを注射したマウスからの肝細胞のRPAによっても証明された。さらに二つのsiRNA、配列5および6は、配列1と同程度の有効性でfas発現を〜81〜86%までサイレンシングしたが、配列6の下流の唯一のヌクレオチドから始まる配列2は、fas発現を38%減少させたに過ぎなかった(図4e)。二つの配列(配列3および4)は、fas発現を全く抑制しなかった。siRNAは、明らかにアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)の腹腔内注射より有効に発現を抑制する。これまでの報告では、マウスをより高用量(6 mg/kg)の抗-fas ODNによって連続12日間処置した。Fas発現を同様に減少させるために、本明細書ではおよそ14倍少ない核酸の全量(体重約24 gのマウスに50 μgを3回注射)を投与した。最近の研究において、siRNAは、同時トランスフェクトしたGFP発現をインビトロおよびインビボの双方において抑制するためにアンチセンスODNより定量的に有効であった(Zhang, H.ら、(2000)、Nat. Biotechnol. 18:862〜7;Bertrand, J.ら(2002)、Biochem. Biophys. Res.Commun. 296:1000)。
siRNAを治療的に応用する場合の主な懸念は、生理的条件におけるサイレンシングの安定性である。二本鎖siRNAは、仔ウシ胎児血清およびヒト血清における生体分解に耐えるが(Bertrand, J.ら(2002)、Biochem. Biophys. Res. Commun. 296:1000)、一つの研究において、インビボでマウス肝臓において同時トランスフェクトした遺伝子のsiRNAによる抑制は、数日間維持された(Lewis, D.L.ら(2002)、Nat. Genet. 32:107〜8)。本研究において、mRNAおよびタンパク質Fasレベルはいずれも、最後の注射後10日間安定に減少した(fas/GAPDHシグナル、1日目:0.0024±0.0004、5日目:0.0035±0.0006、10日目:0.0029±0.0004、p>0.05)(図1bおよび1c)。Fas mRNAおよびタンパク質発現は、14日目において対照動物の値のなおも40%に過ぎなかったが、最後の注射後20日目に正常に回復した。
理論に拘束されることを意図しないが、形質転換した細胞株におけるより一過性のサイレンシング(Elbashir, S.M.(2001)、Nature 411:494〜8)とは対照的に、肝細胞におけるサイレンシングの期間は、肝細胞における持続的な治療的サイレンシングが、プラスミドまたはウイルスベクターからのsiRNA発現を必要としないことを示唆している。肝細胞と細胞株との差は、おそらく、肝細胞がほとんどが非***細胞であることから、細胞***によるsiRNAの希釈がないためである。しかし、より下等種において起こる肝細胞における持続的な抑制がsiRNA増幅によって起こる可能性(Ketting, R.F.ら(2001)、Genes Dev. 15:2654〜9;Lipardi, C.(2001)、Cell 107:297〜307)(Schwarz, D.S.(2002)、Mol. Cell 10:537〜48)は除外されない。二本鎖siRNA注射後のサイレンシングは、持続的であるが永続的ではないことから、fas変異を有するヒトおよびlprマウスにおいて認められる、リンパ増殖性または自己免疫疾患のような長期毒性(Takahashi, T.ら(1994)、Cell 76:969〜76)は重要ではない。
二つの既知のメカニズムがFas媒介劇症肝炎の基礎となる。肝細胞におけるFas受容体のライゲーションは、炎症細胞の浸潤および二次的な壊死を伴う大量のアポトーシスを誘導する(Ryo, K.ら(2000)、Am. J. Gastroenterol. 95:2047〜55)。Fasの関与はまた、免疫細胞を動員して活性化する肝ケモカインの発現を誘導し、前炎症性環境において肝細胞の死を引き起こすことによって肝臓の炎症を誘発する(Faouzi, S.ら(2001)、J. Biol. Chem. 276:49077〜82)。二本鎖siRNAの注射後の肝臓におけるFas発現の効率的な抑制がFas媒介アポトーシスから肝細胞を保護するか否かを決定するために、Fas(配列1)-siRNA処置または偽注射マウスからの肝細胞に、アゴニスト抗Fas抗体(Jo2)またはconA処置マウスから採取した活性化肝単核球(MNC)をインビトロでチャレンジした。無処置または偽処置マウスからの肝細胞をJo2抗体(500 ng.ml)にインビトロで24時間曝露すると、FITC-TUNEL染色によって測定したアポトーシス細胞87.8±6.8%(n=5)が得られた(図2a)。対照的に、Fas(配列1)-siRNA処置マウスからの培養肝細胞ではTUNELによって染色されたのはわずか7.9±1.5%(n=5)に過ぎなかった(P<0.0001)。その上、他のfas-siRNAの尾静脈注射後のインビトロfas誘導アポトーシスからの保護は、fas抑制と相関した;サイレンシングしなかったfas-siRNAは、アポトーシスに対して全く作用を及ぼさなかったが、ごく部分的な保護が部分的サイレンシングによって提供された。最近の研究は、FasL-発現ナチュラルキラーT(NKT)細胞が、ConA誘発肝炎において肝細胞損傷を誘導する肝単核球(MNC)であることを示している(Seino, K.ら、(1997)、Gastroenterology 113:1315〜22;Takeda, K.ら(2000)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:5498〜503)。したがって、Fas(配列1)-siRNA処置マウスからのマウス肝細胞が、ConA-処置マウスから単離した肝MNCによる細胞溶解に抵抗性であるか否かをALT放出アッセイによって調べた(図2b)。Fas siRNA処置マウスからの肝細胞は、肝MNCによって溶解されなかったが、偽処置または無処置対照からの肝細胞は溶解された。したがって、Fasサイレンシングは、インビトロで肝細胞のアポトーシスを有効に阻害する。
Fas-siRNA処置が二つのモデルのFas媒介肝損傷において劇症肝炎からマウスを保護するか否かも同様に調べた。Fas(配列1)-siRNA、GFP(配列1)-siRNA、または生理食塩液を処置したマウスに、1日後にconAの静脈内注射をチャレンジした。血清トランスアミナーゼレベルおよび肝臓の病理を、conAチャレンジの20時間後に分析した。対照生理食塩液およびGFP-siRNA処置マウスは全て、架橋を伴う融合性の肝細胞壊死による広範囲の肝損傷を有し、炎症細胞が門脈および中心静脈周辺に浸潤した(図3a)。ほとんどの生存肝細胞は、細胞質の膨張を示し、アポトーシスの指標である頻繁な核染色質濃縮を認めた。対照的に、Fas-siRNAによる前処置は、肝細胞壊死を防止して、軽度の肝細胞腫脹が検出されたものの、炎症性の浸潤を消失させた。conA-誘導肝炎において、損傷した肝細胞からのトランスアミナーゼアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)は、注射の20時間後に血清においてピークに達し、肝損傷の程度に関する良好な指標である(Miyazawa, Y.ら(1998)、Hepatology 27:497〜506)。形態学的知見と一致して、Fas-siRNA処置は、血清ALT(142±58 IU/L対生理食塩液処置対照における2150±312 IU/L、n=5、p<0.001(正常、30 IU/L))およびAST(270±90 IU/L対生理食塩液処置対照における4120±876 IU/L、n=5、p<0.001(正常値、50 IU/L))の上昇をほぼ完全に阻害した(図3b)。
Fas媒介肝細胞アポトーシスはまた、慢性肝炎における肝線維症の発症にも関与する(Canbay, A.ら(2002)、Gactroenterology 123:1323〜30;Galle, P.R.ら(1995)、J. Exp. Med. 182:1223〜30)。Fas-siRNAが慢性的な肝損傷を治療できるか否か、および侵害的傷害後に投与されたsiRNAがより臨床的に関連するシナリオにおいて保護できるか否かをさらに評価するために、siRNA処置をConAの減少用量の週1回全6回注射を2回行った後24時間まで遅らせた。siRNA注射は2週間後に1回繰り返した。マウスを7週目、すなわち最後のConA注射の1週間後に屠殺した。偽処置およびGFP-siRNA処置マウスは全て、肝実質において架橋線維症を発症したが、Fas(配列1)-siRNA処置動物では肝線維症または壊死を認めなかった(図3c)。さらに、Fas-siRNA処置は、活動的線維症の二つの化学物質指標、すなわち肝ヒドロキシプロリン(Takahashi, S. & Lee, M.J.(1987)、Biochem. J. 241:49〜54)(Fas-siRNA処置マウスにおいて0.56±0.17 mmol/g肝組織対偽処置対照における2.13±0.95 mmol/g;n=3、p<0.05;正常値、0.5 mmol/g)および血清プロコラーゲンIII型(PIIINP)(Badawy, A.A.ら(1996)、Phamacol. Res. 33:319〜25)(Fas-siRNA処置マウスにおける5.6±1.5 ng/L対生理食塩液処置対照における39.2±2.1 ng/L、n=3、p<0.01;正常値、5 ng/L)を有意に減少させた。さらに、長期のfasサイレンシングによるリンパ増殖、脾腫、または他の臓器損傷を含む毒性の証拠は、注射を繰り返しても認められなかった。これらの結果は、Fas-siRNA処置が、慢性的な肝損傷の開始後であっても保護を提供することを示唆している。
Fas-siRNAが劇症肝炎において生存を促進するか否かをさらに評価するために、マウスをより激しい肝炎モデル(Ogasawara, J.ら(1993)、Nature 364:806〜9)においてFas抗体の腹腔内注射によってチャレンジした。対照動物(n=40)は全て3日以内、ほとんどが抗体注射の24時間以内に死亡した。その上、発現を38%サイレンシングするに過ぎないfas-siRNA(配列2、4)を処置したマウスも同様に、保護されなかった。しかし、発現を81〜86%サイレンシングするFas-siRNA(配列1、5、6)を前処置したマウスは、致死的なチャレンジから保護され、動物40匹中33匹が10日間の観察のあいだ生存した(対数階級検定、p<0.0001)(図3e)。Fas-siRNA処置群における致死は、肝不全に二次的な出血であった。致死的な劇症肝炎における肝損傷は、最初の数週間のあいだに最高に達するが、生存マウスはその後回復する(Dhiman, R.K.ら(1998)、Dig. Dis. Sci. 43:1311〜6)。実際に、生存マウスからの肝臓および他の臓器は、観察期間終了時に屠殺したところ、正常に見えた。したがって、急性の傷害の際のFasサイレンシングは劇症肝炎による死亡から保護する。
Fas媒介アポトーシスが広汎なスペクトルの免疫関連肝疾患において果たす重要な役割に基づいて、siRNA指示Fasサイレンシングは、ウイルスおよび自己免疫性肝炎(Rust, C. & Gores, G.J.(2000)、Am. J. Med. 108:567〜74;Siegel, R.M. & Fleisher, T.A.(1999)、J. Allergy Clin. Immunol. 103:729〜38)、アルコール性肝疾患、急性および慢性肝不全(Ryo, K.ら(2000)、Am J. Gastroenterol. 95:2047〜55;Galle, P.R.ら(1995)、J. Exp. Med. 182:1223〜30)および肝臓移植の拒絶(Rust, C. & Gores, G.J(2000)、Am. J. Med. 108:567〜74)によって誘導される急性および慢性的な肝損傷を予防および治療するために治療的価値を有する可能性がある。さらに、流体力学的注射は、ヒトにおいて難しい可能性があるが、高濃度のsiRNAの肝動脈または門脈カニューレによる限局的な輸送は実行可能な代用法である。
方法
siRNAの調製
siRNAは2'-O-ACE-RNAホスホラミダイト(ダーマコンリサーチ(Dharmacon Research)(商標)、ラファイエット、コロラド州)を用いて合成した。siRNAのセンスおよびアンチセンス鎖は以下の通りである。
ヌクレオチド364位で始まるFas配列1:
ヌクレオチド874位で始まるFas配列2:
ヌクレオチド137位で始まるFas配列3:
ヌクレオチド501位で始まるFas配列4:
ヌクレオチド667位で始まるFas配列5:
ヌクレオチド873位で始まるFas配列6:
GFP配列1:
GFP配列2:
siRNAの調製
siRNAは2'-O-ACE-RNAホスホラミダイト(ダーマコンリサーチ(Dharmacon Research)(商標)、ラファイエット、コロラド州)を用いて合成した。siRNAのセンスおよびアンチセンス鎖は以下の通りである。
ヌクレオチド364位で始まるFas配列1:
ヌクレオチド874位で始まるFas配列2:
ヌクレオチド137位で始まるFas配列3:
ヌクレオチド501位で始まるFas配列4:
ヌクレオチド667位で始まるFas配列5:
ヌクレオチド873位で始まるFas配列6:
GFP配列1:
GFP配列2:
RNAを、製造元の説明書に従って脱保護してアニールした。センス鎖の3'末端に蛍光体を結合させたCy5-標識Fas-siRNAはDharmacon Research(商標)によって製造された。
siRNA処置
雄性BALB/cマウス、8〜10週齢、体重20〜25 gをジャクソン研究所(バーハーバー、メイン州)から購入した。合成siRNAを、改変「流体力学的トランスフェクション法」(Zhang, G.ら(1999)、Hum. Gene Ther. 10:1735〜7)を用いてインビボで輸送し、この場合PBS 1 mlに溶解したsiRNA 50 μgが尾静脈から急速に注射された。注射を8および24時間後に繰り返した。対照マウスに等量の生理食塩液またはGFP-siRNAを注射した。
雄性BALB/cマウス、8〜10週齢、体重20〜25 gをジャクソン研究所(バーハーバー、メイン州)から購入した。合成siRNAを、改変「流体力学的トランスフェクション法」(Zhang, G.ら(1999)、Hum. Gene Ther. 10:1735〜7)を用いてインビボで輸送し、この場合PBS 1 mlに溶解したsiRNA 50 μgが尾静脈から急速に注射された。注射を8および24時間後に繰り返した。対照マウスに等量の生理食塩液またはGFP-siRNAを注射した。
肝細胞の単離
肝細胞を、改変された肝門脈還流技術によって単離した(Klauning, J.E.ら(1981)、In vitro 17:913〜925)。フルオレセイン結合ヤギ抗マウスアルブミン抗体(ベチルラボラトリーズインク(Bethyl Laboratories, Inc.)、モンゴメリー、テキサス州)を用いる細胞内アルブミン染色のフローサイトメトリー分析によって決定した肝細胞の純度は、>90%であった(示していない)。いくつかの実験に関して、10%ウシ胎児血清、15 mmol/L HEPES(pH 7.4)、1 μmol/Lインスリン、2 mmol/L L-グルタミン、100単位/mLペニシリン、および100 μg/mlストレプトマイシンを添加したウィリアムズ培地E(ギブコBRL、グランドアイランド、ニューヨーク州)において2×106個/60 mmコラーゲンコーティング培養皿で播種した後、細胞を短く培養した。
肝細胞を、改変された肝門脈還流技術によって単離した(Klauning, J.E.ら(1981)、In vitro 17:913〜925)。フルオレセイン結合ヤギ抗マウスアルブミン抗体(ベチルラボラトリーズインク(Bethyl Laboratories, Inc.)、モンゴメリー、テキサス州)を用いる細胞内アルブミン染色のフローサイトメトリー分析によって決定した肝細胞の純度は、>90%であった(示していない)。いくつかの実験に関して、10%ウシ胎児血清、15 mmol/L HEPES(pH 7.4)、1 μmol/Lインスリン、2 mmol/L L-グルタミン、100単位/mLペニシリン、および100 μg/mlストレプトマイシンを添加したウィリアムズ培地E(ギブコBRL、グランドアイランド、ニューヨーク州)において2×106個/60 mmコラーゲンコーティング培養皿で播種した後、細胞を短く培養した。
RNアーゼ保護アッセイ
総RNAをトリゾール試薬(モレキュラーリサーチセンター(Molecular Research Center)、シンシナティ、オハイオ州)を用いて肝細胞から抽出して、総RNA 15μgおよびインビトロ転写キットおよびマウスmAPO-3多プローブ鋳型セット(BDファーミンゲン(BD Pharmingen)、サンジエゴ、カリフォルニア州)を用いて、製造元の説明書に従ってRNアーゼ保護アッセイ(RPA)を行った。保護されたバンドの強度を、調べた遺伝子のGAPDH(内部対照)に対する比に基づくホスホロイメージング(Fuji-BAS 1500;フジ、東京、日本)によって定量した。
総RNAをトリゾール試薬(モレキュラーリサーチセンター(Molecular Research Center)、シンシナティ、オハイオ州)を用いて肝細胞から抽出して、総RNA 15μgおよびインビトロ転写キットおよびマウスmAPO-3多プローブ鋳型セット(BDファーミンゲン(BD Pharmingen)、サンジエゴ、カリフォルニア州)を用いて、製造元の説明書に従ってRNアーゼ保護アッセイ(RPA)を行った。保護されたバンドの強度を、調べた遺伝子のGAPDH(内部対照)に対する比に基づくホスホロイメージング(Fuji-BAS 1500;フジ、東京、日本)によって定量した。
イムノブロット
マウス肝細胞のタンパク質抽出物を、12%SDS-ポリアクリルアミドゲルに対して分離して、ニトロセルロースメンブレンに転写して、ウサギポリクローナル抗マウスFas抗体、およびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体(オンコジーンリサーチプロダクト(Oncogene Research Product)、ボストン、マサチューセッツ州)によってプロービングして、化学発光(アマシャムライフサイエンス(Amersham Life Science)、アーリントンハイツ、イリノイ州)によって可視化した。
マウス肝細胞のタンパク質抽出物を、12%SDS-ポリアクリルアミドゲルに対して分離して、ニトロセルロースメンブレンに転写して、ウサギポリクローナル抗マウスFas抗体、およびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体(オンコジーンリサーチプロダクト(Oncogene Research Product)、ボストン、マサチューセッツ州)によってプロービングして、化学発光(アマシャムライフサイエンス(Amersham Life Science)、アーリントンハイツ、イリノイ州)によって可視化した。
アポトーシスアッセイ
無処置マウスまたはFas-siRNAもしくは生理食塩液を処置したマウスからの初代肝細胞を、12ウェルプレートに1×105個/mlで播種した。翌日、Jo2 mAb(500 ng/ml;BDファーミンゲン、サンジエゴ、カリフォルニア州)を加えて、24時間後、肝細胞のアポトーシスを、LYSIS IIソフトウェア(日本ベクトンディッキンソン(Nippon Becton Dickinson)、東京、日本)によるFACスキャンフローサイトメーターでのフローサイトメトリーによって分析したFITC-標識ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ-媒介dUTPニック末端標識(TUNEL)アッセイ(ベーリンガーマンハイム、GmbH、マンハイム、ドイツ)によって評価した。
無処置マウスまたはFas-siRNAもしくは生理食塩液を処置したマウスからの初代肝細胞を、12ウェルプレートに1×105個/mlで播種した。翌日、Jo2 mAb(500 ng/ml;BDファーミンゲン、サンジエゴ、カリフォルニア州)を加えて、24時間後、肝細胞のアポトーシスを、LYSIS IIソフトウェア(日本ベクトンディッキンソン(Nippon Becton Dickinson)、東京、日本)によるFACスキャンフローサイトメーターでのフローサイトメトリーによって分析したFITC-標識ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ-媒介dUTPニック末端標識(TUNEL)アッセイ(ベーリンガーマンハイム、GmbH、マンハイム、ドイツ)によって評価した。
ALT放出アッセイ
1×104個/ウェルで12ウェルに播種した標的肝細胞を、表記のエフェクター対標的比でconA(15 mg/kg)処置マウスの肝臓から単離した肝単核球(MNC)と共に一晩培養した。肝細胞からのALTの放出は、ALTアッセイキット(ベーリンガーマンハイム、GmbH、マンハイム、ドイツ)を用いて上清において測定した。細胞障害性は、洗浄剤溶解細胞における総ALTと比較して、上清におけるALTの百分率として表記した。
1×104個/ウェルで12ウェルに播種した標的肝細胞を、表記のエフェクター対標的比でconA(15 mg/kg)処置マウスの肝臓から単離した肝単核球(MNC)と共に一晩培養した。肝細胞からのALTの放出は、ALTアッセイキット(ベーリンガーマンハイム、GmbH、マンハイム、ドイツ)を用いて上清において測定した。細胞障害性は、洗浄剤溶解細胞における総ALTと比較して、上清におけるALTの百分率として表記した。
肝炎の誘導
マウスの尾静脈に、発熱物質不含生理食塩液(Takeda, K.ら、(2000)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5498〜503)において溶解したconA(15 mg/kg;シグマ(Sigma)、セントルイス、ミズーリ州)を静脈内注射した。20時間後、血清ALTおよびASTを標準的な自動アナライザ(ヒタチ、7150型、東京、日本)を用いて測定して、パラフィン抱埋肝切片をヘマトキシリン/エオジン(HE)によって染色した。他のマウスにJo2 mAb 8μgを腹腔内注射して、10日間観察してから屠殺して肝組織学の検査を行った。
マウスの尾静脈に、発熱物質不含生理食塩液(Takeda, K.ら、(2000)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5498〜503)において溶解したconA(15 mg/kg;シグマ(Sigma)、セントルイス、ミズーリ州)を静脈内注射した。20時間後、血清ALTおよびASTを標準的な自動アナライザ(ヒタチ、7150型、東京、日本)を用いて測定して、パラフィン抱埋肝切片をヘマトキシリン/エオジン(HE)によって染色した。他のマウスにJo2 mAb 8μgを腹腔内注射して、10日間観察してから屠殺して肝組織学の検査を行った。
肝線維症の誘導
発熱物質不含生理食塩液に溶解したConA(8 mg/kg)の減少用量を、6週間連続して毎週尾静脈に静脈内注射した(Kimura, K.ら、Int. Immunol. 11:1491〜500(1999))。マウスを上記のように2回目および4回目のCon A注射の24時間後から始めるsiRNAの3回注射によって治療して、ConAの最後の注射の1週間後に屠殺した。肝線維症は、記述のように(Badawy, A.A.ら、「Evaluation of colchicine with or without praziquantel therapy in the control of hepatic fibrosis in murine schistosomiasis」、Pharmacol. Res. 33:319〜25(1996))、連続的飽和ラジオイムノアッセイ(カルビオケム(Calbiochem.)、ラホヤ、カリフォルニア州)を用いてHE染色ならびに肝ヒドロキシプロリン(Takahashi, S. & Lee, M.J.、Collagen Biochem. J. 241:49〜54(1987))および血清プロコラーゲンIII型の測定によって評価した。
発熱物質不含生理食塩液に溶解したConA(8 mg/kg)の減少用量を、6週間連続して毎週尾静脈に静脈内注射した(Kimura, K.ら、Int. Immunol. 11:1491〜500(1999))。マウスを上記のように2回目および4回目のCon A注射の24時間後から始めるsiRNAの3回注射によって治療して、ConAの最後の注射の1週間後に屠殺した。肝線維症は、記述のように(Badawy, A.A.ら、「Evaluation of colchicine with or without praziquantel therapy in the control of hepatic fibrosis in murine schistosomiasis」、Pharmacol. Res. 33:319〜25(1996))、連続的飽和ラジオイムノアッセイ(カルビオケム(Calbiochem.)、ラホヤ、カリフォルニア州)を用いてHE染色ならびに肝ヒドロキシプロリン(Takahashi, S. & Lee, M.J.、Collagen Biochem. J. 241:49〜54(1987))および血清プロコラーゲンIII型の測定によって評価した。
実施例2 細胞タイプおよび組織の形質導入のための有効な方法の同定
本実施例は、ヘアピンsiRNAをコードするプラスミドDNA、レトロウイルスもしくはレンチウイルスの流体力学的注射、または注射によって輸送されるRNA干渉物質が、インビボで異なる細胞タイプおよび組織におけるサイレンシング状態を確立できるか否かを比較する。サイレンシングの程度はまた、全ての細胞においてレポーター遺伝子(eGFP)を全体的に発現するトランスジェニックマウスにおいてsiRNAがヘアピントランスジーンから発現された場合(特定の組織において構成的にまたはCre-リコンビナーゼによって誘導的に)に得られる程度と比較する。GFP発現物をサイレンシングするために必要な全ての構築物が産生され、インビトロで多様な初代培養細胞(マクロファージ、樹状細胞、Tリンパ球)においてGFP発現を有効にサイレンシングすることが示されている。それぞれの輸送法に関して、GFPサイレンシングのための輸送プロトコールを、全体的にGFPを発現する成体トランスジェニック-GFPマウス3〜5匹の群において最適化する。対照マウスを無関係な二本鎖siRNA、空のベクター、または無関係な(すなわち、CCR5)ヘアピンsiRNAを発現するベクターによって処置する。GFPサイレンシングの有効性の分析は、上記のように全マウス切片および単離した特異的細胞集団の蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、イムノブロット、ノザンブロット、および改変ノザンブロットによって行う。
本実施例は、ヘアピンsiRNAをコードするプラスミドDNA、レトロウイルスもしくはレンチウイルスの流体力学的注射、または注射によって輸送されるRNA干渉物質が、インビボで異なる細胞タイプおよび組織におけるサイレンシング状態を確立できるか否かを比較する。サイレンシングの程度はまた、全ての細胞においてレポーター遺伝子(eGFP)を全体的に発現するトランスジェニックマウスにおいてsiRNAがヘアピントランスジーンから発現された場合(特定の組織において構成的にまたはCre-リコンビナーゼによって誘導的に)に得られる程度と比較する。GFP発現物をサイレンシングするために必要な全ての構築物が産生され、インビトロで多様な初代培養細胞(マクロファージ、樹状細胞、Tリンパ球)においてGFP発現を有効にサイレンシングすることが示されている。それぞれの輸送法に関して、GFPサイレンシングのための輸送プロトコールを、全体的にGFPを発現する成体トランスジェニック-GFPマウス3〜5匹の群において最適化する。対照マウスを無関係な二本鎖siRNA、空のベクター、または無関係な(すなわち、CCR5)ヘアピンsiRNAを発現するベクターによって処置する。GFPサイレンシングの有効性の分析は、上記のように全マウス切片および単離した特異的細胞集団の蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、イムノブロット、ノザンブロット、および改変ノザンブロットによって行う。
流体力学的注射
二本鎖siRNAは、宿主ゲノムに組み入れられて、したがって細胞の生命のために発現されうる、または偶然でない位置での組込みによって細胞の形質転換をおそらく引き起こすベクターとは異なり、サイレンシングの効果が長期毒性を示さず短命である可能性があることから、遺伝子サイレンシング、例えば生体に対する暴力の適用を誘導するために特に魅力的である。
二本鎖siRNAは、宿主ゲノムに組み入れられて、したがって細胞の生命のために発現されうる、または偶然でない位置での組込みによって細胞の形質転換をおそらく引き起こすベクターとは異なり、サイレンシングの効果が長期毒性を示さず短命である可能性があることから、遺伝子サイレンシング、例えば生体に対する暴力の適用を誘導するために特に魅力的である。
形質導入は、組織および細胞において有意に異なる可能性があり、肝臓および肺のような非常に血管密度の高い臓器において最も有効であり、容易にトランスフェクトされる細胞(筋細胞、貪食細胞(組織マクロファージのような)、および肝細胞)は効率よく形質導入されるが、トランスフェクトされることがより難しい細胞(リンパ球のような)は、流体力学的注射によってインビボで形質導入されない。どの組織が容易に形質導入されるかを決定する実験において、fas-siRNAのために用いたプロトコールと同じプロトコールを用いて、上記のように、形質導入細胞を検出するために、センス鎖の5'末端に結合させたCy5を有する蛍光標識された二本鎖GFP-siRNAを注射する。センス鎖の改変は、サイレンシング状態の誘導に影響を及ぼさなかった。最後の注射の24時間後のCy5とGFP蛍光を比較することによって、最も容易に形質導入される細胞および組織を同定することができ、平均蛍光強度の測定による形質導入およびサイレンシングのレベルを定量することができ、ならびに全ての形質導入細胞がサイレンシング状態を確立できるか否かを決定することができる。注射したsiRNAの濃度、注射容積、注射速度、注射回数、および最後の注射からの時間を独立して変化させた後にサイレンシング効率の変化を調べる。これらの変化が肝細胞およびマクロファージの形質導入に影響を及ぼすか否か、ならびに大量の注入(マウスの血液量と比較して)は、ヒトに対する応用性を制限する可能性があることから、形質導入を実質的に危険に曝すことなく注射容積を減少させることができるか否かを決定することに特に重点を置く。
肝細胞は、流体力学的注射によって効率よく形質導入されうるが、マクロファージは形質導入がより難しい可能性がある。マクロファージの独自の特性を利用して、環境試料を絶えず採取して、アポトーシス細胞上の陰イオンポリマーおよびホスファチジルセリン(PS)を取り込むための特異的受容体を有するマクロファージを特異的にターゲティングするためにいくつかの戦略を調べる。これらの戦略を、記述のように接着PBMCをGM-CSFと共に培養することによって調製したMDMsを用いてインビトロで調べる。
活性化MDMsをこれらの戦略のいずれかによってインビトロで形質導入する場合、MDMsの形質導入を、新たに単離した接着PBMCsおよびLPS-活性化マクロファージの形質導入と比較して、マクロファージの活性化がインビトロでのトランスフェクション効率およびサイレンシングにどのように影響を及ぼすかを決定する。フローサイトメトリーを用いて形質導入効率を分析して、組み入れられたCy5-標識siRNAを検出してMFIを定量する。可溶性siRNAの取り込み効率を、脂質対siRNAの異なる比率を用いて、記述のように調製されたリポソームにパッケージングされたsiRNAの効率と比較する。リポソーム組成物はまた、変化させた濃度のPSを組み入れるように改変させ、これはアポトーシス細胞の認識および貪食のために用いられるマクロファージPS受容体による取り込みを増強させるはずである(Fadok, V.A.ら(2000)、Nature 405:85〜90;Fadok, VA and Chimini, G.(2001)、Semin. Immunol. 13:365〜372;Hoffmann, PR.ら(2001)、J. Cell Biol. 155:649〜659;Huynh, ML.ら(2002)、J. Clin. Invest. 109:41〜50)。
リポソームを産生するために、クロロホルム/メタノール(90:10)中の燐脂質を窒素ガス下で乾燥させて、様々な濃度の二本鎖Cy5-標識siRNAを含むPBSに再浮遊させて、4℃で3秒間超音波処理する。リポソームを、約1 μM脂質/ウェルを用いて、播種したMDMs(-105個/ウェル)に振とうさせながら1時間添加する(Huynh, ML、Fadok, VA., and Henson, PM.(2002)、J. Clin. Invest. 109:41〜50)。一晩培養後にトランスフェクション効率を決定して、エピ蛍光顕微鏡によって洗浄して、フローサイトメトリーによって定量する。トランスフェクション条件は、PS/ホスファチジルコリン(PC)の比、脂質/siRNAの比、および細胞105個あたり添加した脂質量に関して最適にする。前炎症性サイトカインをサイレンシングする後の目的のために、PSリポソームを用いることは特に適している。これは、PS受容体によるマクロファージの抱き込みが、TGF-β1分泌を増加させることによって抗炎症反応を促進するためである(Huynh, MLら(2002)、J. Clin. Invest. 109:41〜50)。したがって、マクロファージを首尾よくトランスフェクトすれば、前炎症性サイトカインがサイレンシングされるのみならず、マクロファージは、抗炎症性サイトカインを分泌するように誘導されるであろう。
次に、インビトロで最適なリポソーム調製物をマウスへの尾静脈流体力学注射によって調べる。取り込みおよびサイレンシング機能は相関しない可能性があることから(特に、siRNAが細胞内空胞において不安定である場合)、Cy5蛍光によって測定した取り込みを、最も魅力的な輸送法に関するGFPサイレンシングと比較する。次に、最もよい輸送法を尾静脈注射によってインビボで調べ、上記のように最適化する。マクロファージの活性化状態がトランスフェクションまたはサイレンシング効率に対して重要な影響を有することが、インビトロ試験によって示唆されれば、非炎症および炎症組織へのリポソームの局所注入によって誘導されるインビボサイレンシングも同様に比較される。
非炎症組織のモデルとして、記述のように気管内点滴を用いる(Huynh, M.L.ら(2002)、J. Cell Biol. 155:649)。炎症組織のモデルとして、1%チオグリコレートブロス1 mlを腹腔内に注射して、リポソームを3日後に注射する。PBSを注入して回収することによって1日後にマクロファージを腹腔から回収する。
調べたもう一つの改変は、長さが5〜10ヌクレオチドのポリGテールをsiRNAのセンス鎖の5'末端に加えることであり、これはマクロファージスキャベンジャー受容体による取り込みを増強するはずである(Srividya, S.ら(2000)、Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:772〜777)。もう一つのアプローチは、センス鎖の5'末端で活性化チオールを、分子をサイトゾルに輸送する陽イオンペプチドの一つ(tatの残基49〜57位、またはショウジョウバエのアンテナペディアペプチドの残基43〜58位のような)のC末端に添加したシステイン残基に結合させることである(Prochiantz, A.(1996)、Curr. Opin. Neurobiol. 6:629〜634;Moy, P.ら(1996)、Molecular Biotechnology 6:105〜113;Kim, DT.ら(1997)、J. Immunol. 159:1666〜1668;Suzuki, T.ら(2002)、J. Biol. Chem. 277:2437〜2443)。これらのペプチドによるインターナリゼーションは、エンドサイトーシス経路を迂回して、苛酷なライソゾーム環境において迅速に分解する危険を回避する。その上、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して、アンテナペディアペプチドとの結合は、遊離のオリゴヌクレオチドと比較して生物学的有効性のために必要な濃度を1,000倍より大きく減少させる(Allinquant B.ら(1995)、J. Cell Biol. 128:919〜927)。5'末端との結合によって、Cy5標識siRNAを用いる必要がないであろうことから、これらのアプローチに関して、Tg-GFPマウスに由来するマウスMDMにおけるGFPサイレンシングを、有効な輸送の指標として用いる。さらに、tatペプチドに対するsiRNAの共有結合は、インターナリゼーションにとって不要であるかも知れない(Sandgren, S.ら(2002)、J. Biol. Chem. 277:38877〜38883)。塩基性ペプチドは酸性siRNAに対して堅固に結合することから、tatペプチドとCy5-siRNAとの混合物(室温で様々な比で30秒間プレインキュベートする)がMDMsにインターナライズされるか否かも同様に調べる。これがインビトロで有効である場合、tat-siRNA混合物がインビボで肺マクロファージを形質導入することができるか否かを、チオグリコレート処置マウスへの気管内点滴または腹腔内注射後に調べるであろう。
さらに、二本鎖siRNAの化学改変によって全ての細胞のインビボトランスフェクションを増強することが可能であるかも知れない。RNアーゼAに対して抵抗性にするためにフッ素誘導体化シチジン5J-三燐酸およびUTPによって産生された裸のsiRNAは、血清の存在下で活性化された初代培養Tリンパ球においてもインビトロでルシフェラーゼおよびHIV gag発現をサイレンシングすることができた(Capodici, J.、Kariko, K.、およびWeissman, D.(2002)、J. Immunol. 169:5196〜5201)。したがって、分解に抵抗するために二本鎖RNAを合成することができれば、トランスフェクション物質がなくともこれを細胞に効率よく組み入れられる可能性がある。
ヘアピン構築物によってコードされるsiRNAのベクターによる輸送
最近のまたは切迫した感染症に直面して急性の処置としてRNAiを用いることに関して、外因性のsiRNAに対する短期間の曝露は、ウイルスベクターによって提供されるより長期の発現にとって好ましい可能性がある。この戦略の決定は、部分的にレンチウイルスおよびレトロウイルス挿入後の遺伝子の破壊および悪性の形質転換の可能性に関する懸念に基づく(Bushman, FD.(2002)、Curr. Top. Microbiol. Immunol. 261:165〜177)。しかし、ウイルスベクターを用いることは状況によっては望ましい。
最近のまたは切迫した感染症に直面して急性の処置としてRNAiを用いることに関して、外因性のsiRNAに対する短期間の曝露は、ウイルスベクターによって提供されるより長期の発現にとって好ましい可能性がある。この戦略の決定は、部分的にレンチウイルスおよびレトロウイルス挿入後の遺伝子の破壊および悪性の形質転換の可能性に関する懸念に基づく(Bushman, FD.(2002)、Curr. Top. Microbiol. Immunol. 261:165〜177)。しかし、ウイルスベクターを用いることは状況によっては望ましい。
HIV遺伝子発現を標的とする小さいヘアピンを発現するレンチウイルスが産生され、細胞株においてHIV複製をサイレンシングするために用いられている。最近の研究から、肝臓(8〜30%)および脾臓(24%)において自己不活化HIVに基づくレンチウイルスベクターがかなり効率的に形質導入されることが示されている(Naldini, L.(1996)、Science 272:263〜267;Vanden Driessche, T.(2002)、Blood 100:813〜822;Follenzi, A.ら(2002)、Hum Gene Ther. 13:243〜260)。本明細書において記述される標的である肝細胞とマクロファージはいずれも、記述のように40 ng/mlポリブレンの存在下で、マウスに高力価のウイルス(RevおよびRREヘルパープラスミドとVSV-エンベローププラスミドとの同時トランスフェクションによって293T細胞において産生)を注射した場合に、効率よく形質導入された。Bリンパ球は効率よく形質導入されたが、Tリンパ球は形質導入されなかった。
T細胞受容体複合体に結合して活性化する一本鎖抗体をコードするレンチウイルスenvを用いる最近の戦略は、Tリンパ球に感染するために有用となる可能性がある(Maurice, M.(2002)、Blood 99:2342〜2350)。トランスジェニックマウス試験においてfasをサイレンシングするためにfasLのサイレンシングが好ましい場合、このベクターを用いて劇症肝炎を予防するためにfasL-shRNAを発現させてもよい。注射したプラスミドDNA、レトロウイルス(pBpU6-sIGFPI)およびレンチウイルス(pRRLU6GFP1sin)のインビボ輸送によって肝細胞およびマクロファージに形質導入するための最善の流体力学アプローチを比較する。GFPサイレンシングの有効性に関する分析は、全マウス切片および単離された特異的細胞集団(肝臓、脾臓、肝細胞、マクロファージ、BおよびTリンパ球)の蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、イムノブロット、ノザンブロット、および改変ノザンブロットによって行う。
実施例3 マクロファージにおける前炎症性サイトカイン遺伝子発現のサイレンシング
19ヌクレオチドが後に続く「AA」を同定することによってsiRNA配列を選択して、次に可能であれば、「TT」を同定する(最後の特徴は任意である)。候補配列は、GC含有量約35%〜約70%を有する可能性があり、ATG開始部位から少なくとも75ヌクレオチド下流であってもよい。最終的な要件は、配列が他の遺伝子との相同性を欠損することである。相同性は、est配列データベースを含む全てのライブラリを用いるBlast検索を用いて決定することができる。このアルゴリズムを用いて、それぞれの標的化サイトカイン遺伝子(TNFα、IL-1)に関して配列3または4個を選択して、二本鎖siRNAを合成する(ダーマコン)。いくつかの齧歯類モデルにおいてIL-6産生は保護的であり、かつこれを遮断すると、敗血症ショックの際により致死的となることから、前炎症性サイトカインIL-6はターゲティングされない(Barton, BE., and Jackson, JV.(1993)、Infect. Immun. 61:1496〜1499)。それぞれの配列を、HIV感染症をサイレンシングするために既に最適化されている方法を用いて、オリゴフェクタミンによるMDMsへのトランスフェクションによって調べる。トランスフェクションの1日後、MDMsをLPSによって活性化して、翌日、タンパク質およびmRNA発現に関してそれぞれ、細胞内サイトカイン染色(ICC)およびウェスタンブロット、ならびにノザンブロットおよびRNアーゼ保護アッセイによって調べる。siRNAの組み合わせがサイレンシングを増強するか否かを決定するために、同じ遺伝子を標的とするsiRNAの組み合わせも同様に調べる。
19ヌクレオチドが後に続く「AA」を同定することによってsiRNA配列を選択して、次に可能であれば、「TT」を同定する(最後の特徴は任意である)。候補配列は、GC含有量約35%〜約70%を有する可能性があり、ATG開始部位から少なくとも75ヌクレオチド下流であってもよい。最終的な要件は、配列が他の遺伝子との相同性を欠損することである。相同性は、est配列データベースを含む全てのライブラリを用いるBlast検索を用いて決定することができる。このアルゴリズムを用いて、それぞれの標的化サイトカイン遺伝子(TNFα、IL-1)に関して配列3または4個を選択して、二本鎖siRNAを合成する(ダーマコン)。いくつかの齧歯類モデルにおいてIL-6産生は保護的であり、かつこれを遮断すると、敗血症ショックの際により致死的となることから、前炎症性サイトカインIL-6はターゲティングされない(Barton, BE., and Jackson, JV.(1993)、Infect. Immun. 61:1496〜1499)。それぞれの配列を、HIV感染症をサイレンシングするために既に最適化されている方法を用いて、オリゴフェクタミンによるMDMsへのトランスフェクションによって調べる。トランスフェクションの1日後、MDMsをLPSによって活性化して、翌日、タンパク質およびmRNA発現に関してそれぞれ、細胞内サイトカイン染色(ICC)およびウェスタンブロット、ならびにノザンブロットおよびRNアーゼ保護アッセイによって調べる。siRNAの組み合わせがサイレンシングを増強するか否かを決定するために、同じ遺伝子を標的とするsiRNAの組み合わせも同様に調べる。
Stat1およびStat3は、全ての全炎症性サイトカインの産生を活性化するために用いられることから、Stat1が一つのsiRNA構築物を用いて三つ全てのサイトカインの分泌をサイレンシングするための標的となる可能性があるか否かも同様に調べる。Stat1およびStat3は同様に、LPSシグナルを形質導入するための重要なメッセンジャーであり、それらを標的化するためのさらなる根拠を提供する。
炎症性サイトカインが直接または間接的にターゲティングされる場合に炎症性サイトカイン産生を抑制する有効性を、培養上清のICCおよびELISA分析によって比較する(R&Dシステムズ)。もう一つのアプローチは、IL-1βおよびもう一つの前炎症性サイトカインIL-18をその活性化型に処理するために用いられるプロテアーゼであるカスパーゼ-1の発現をサイレンシングすることである。その上、これは、カスパーゼ-1阻害剤がラットをLPS誘導死から保護することから意味をなす。最近の研究は、IL-1βプロセシングはカスパーゼ-1を必要とするのみならず、高分子複合体(炎症性)を必要とすることを示唆している(Martinon, F.ら(2002)、Mol. Cell 10:417〜426)。この複合体がどのように機能するかに関する詳細が同定されれば、Pycardのような他の成分を標的としてもよい。もう一つのアプローチは、一つより多い転写物を産生するためにリボソーム内部認識配列を用いることによって、またはループによって分離された一つより多い相補的配列によって単一の転写物を構築することによって、一つより多いサイトカインをターゲティングすることができる輸送ベクターを構築することである。
免疫応答を開始するためにマクロファージの重要な保護的役割を妨害することなく前炎症性サイトカインの致死的な結末を阻害することは重要であり、したがって、Stat1または前炎症性サイトカイン産生の阻害がIL-12およびIFNγのような有害でないサイトカインをマクロファージが産生する能力、および抗原を処理して提示してTリンパ球を活性化する能力を妨害するか否かを決定する。ICC染色は、IFNyおよびIL-12に対する抗体を用いてLPS刺激の1日後に行う。抗体のプロセシングおよび提示を調べるために、siRNA-トランスフェクトMDMsに、HIV gagを発現する組換え型ワクシニアウイルスを感染させて、HIV血清陽性ドナーからの融解したPBMCsと共にインキュベートする。サイレンシングしたマクロファージが二次T細胞反応を活性化できるか否かを、非トランスフェクトマクロファージまたは通常の方法を用いて無関係なsiRNAを処置したマクロファージの場合と比較して、7日後にgag特異的細胞障害性の増強を測定することによって調べる。
実施例4 肝細胞におけるFas経路遺伝子のサイレンシング
本実施例において、fasLおよびfas媒介アポトーシスに関与するより遠位の遺伝子のサイレンシングを、fasのサイレンシングと比較する。ヒトおよびマウスfasLにおける標的配列FADD、カスパーゼ8、bid、およびカスパーゼ3を同定して、これらの遺伝子の全てを発現するJurkat細胞、ならびにfasLを除く全てを発現する肝細胞株および精製マウス肝細胞において、ウェスタンブロット、ノザンブロット、およびRNアーゼ保護アッセイ(ファーミンゲン社のAPOマルチプローブマウスおよびヒト鋳型セットを用いる)によってタンパク質およびmRNA発現に関して最初に調べる。次に、有効にサイレンシングされている細胞を、アゴニストマウスおよびヒト抗fas抗体を用いてfas媒介アポトーシスの抵抗能に関して、ならびにカスパーゼ媒介アポトーシスの他の形(例えば、エトポシド対紫外線照射)に対するその感受性に関して対照細胞と比較する。アポトーシスアッセイは、アネキシンV染色、TUNEL染色、およびヨウ化プロピジウム取り込みと共に、フローサイトメトリーによる蛍光発生検出CytoxiluxおよびPhiphilux-Gキット(オンコルムニン)(Liu Lら(2002)、Nat. Mod. 8:185〜189)を用いてカスパーゼ3および8活性化を測定する。
本実施例において、fasLおよびfas媒介アポトーシスに関与するより遠位の遺伝子のサイレンシングを、fasのサイレンシングと比較する。ヒトおよびマウスfasLにおける標的配列FADD、カスパーゼ8、bid、およびカスパーゼ3を同定して、これらの遺伝子の全てを発現するJurkat細胞、ならびにfasLを除く全てを発現する肝細胞株および精製マウス肝細胞において、ウェスタンブロット、ノザンブロット、およびRNアーゼ保護アッセイ(ファーミンゲン社のAPOマルチプローブマウスおよびヒト鋳型セットを用いる)によってタンパク質およびmRNA発現に関して最初に調べる。次に、有効にサイレンシングされている細胞を、アゴニストマウスおよびヒト抗fas抗体を用いてfas媒介アポトーシスの抵抗能に関して、ならびにカスパーゼ媒介アポトーシスの他の形(例えば、エトポシド対紫外線照射)に対するその感受性に関して対照細胞と比較する。アポトーシスアッセイは、アネキシンV染色、TUNEL染色、およびヨウ化プロピジウム取り込みと共に、フローサイトメトリーによる蛍光発生検出CytoxiluxおよびPhiphilux-Gキット(オンコルムニン)(Liu Lら(2002)、Nat. Mod. 8:185〜189)を用いてカスパーゼ3および8活性化を測定する。
治療操作は、細胞溶解性の顆粒の放出によって媒介され、その大部分がカスパーゼ非依存的である抗原特異的T細胞媒介細胞溶解を妨害してはならない。したがって、Cr放出アッセイを用いて、サイレンシング構築物の全てをトランスフェクトした細胞がPHA活性化T細胞株(標的種に応じてヒトPBMCまたはマウス脾細胞から作製)による溶解に対して等しく感受性があるか否かを調べる。これらのアッセイを行うために、トラスフェクトした標的細胞に4 μg/ml conAを加えて、それらを普遍的T細胞標的とする。他の型のアポトーシスまたはT細胞溶解に影響を及ぼすことなくfas媒介殺細胞を最もよくサイレンシングする構築物を用いて、上記のようにDNAおよびウイルスベクターを作製する。これらを、インビトロでのサイレンシング状態の確立能に関して調べる。
実施例5 マウス劇症肝炎モデルにおけるRNAi戦略の試験
本実施例において、実施例4からの最も有効なsiRNAをマウス劇症肝炎モデルにおいてさらに調べる。第一の劇症肝炎実験は、fasが肝細胞に限ってサイレンシングされ、fasLがTリンパ球に限ってサイレンシングされトランスジェニックマウスにおいて行う。トランスジェニックマウスにおいて致死的な結末を回避することができれば、siRNAを輸送するためのより翻訳可能な方法を調べる。トランスジェニックマウスが保護されない場合、他の遺伝子または標的遺伝子の組み合わせを標的とするトランスジェニックマウスを作製する。マウスには、サイレンシングのピークで形質導入後最初にチャレンジする。侵害的な傷害後の処置によって保護を提供できるか否かも同様に調べる。
本実施例において、実施例4からの最も有効なsiRNAをマウス劇症肝炎モデルにおいてさらに調べる。第一の劇症肝炎実験は、fasが肝細胞に限ってサイレンシングされ、fasLがTリンパ球に限ってサイレンシングされトランスジェニックマウスにおいて行う。トランスジェニックマウスにおいて致死的な結末を回避することができれば、siRNAを輸送するためのより翻訳可能な方法を調べる。トランスジェニックマウスが保護されない場合、他の遺伝子または標的遺伝子の組み合わせを標的とするトランスジェニックマウスを作製する。マウスには、サイレンシングのピークで形質導入後最初にチャレンジする。侵害的な傷害後の処置によって保護を提供できるか否かも同様に調べる。
これらの標的は、急性の状況では死を予防しないが、より一般的な免疫応答を妨害しないであろうと考えられる。選択した遺伝子のサイレンシングが免疫的防御を妨害するか否かを決定するために、サイレンシングマウスも同様に、二つの感染物質(グラム陽性菌であるリステリア菌(Listeria monocytogenes)とワクシニアウイルス)に対して防御することができるか否かを調べる。これらの病原体に対する免疫の保護は、適当な用量が選択される限り、fasまたは前炎症性サイトカイン産生をサイレンシングすることによって有意に損なわれないと予想される。fas経路は、保護的エフェクター機能において重要な役割を有さないが、感染に対する免疫応答を低下させて終了させるために主に用いられる。したがって、fasのサイレンシングは、保護的免疫応答に対して有意な作用を示さないであろうと予想される。しかし、可溶型TNF受容体を発現するトランスジェニックマウスは、リステリア菌を含むいくつかの病原体に対して非常に感受性が高いことから、前炎症性サイトカインのサイレンシングは、保護反応の生成を妨害する可能性がある。
RNAi干渉の目標は、保護免疫を実質的に低下させることなく炎症の有害な作用を可能な限り多く遮断することによって免疫応答におけるバランスをシフトさせることである。これが行われたか否かをモニターする最善の方法は、病原性のチャレンジ後の生存および毒性を調べることである。
conAおよび抗fas抗体誘導自己免疫性肝炎からマウスを保護するために、二本鎖fas-siRNAの流体力学的注射を用いる実験を、他のfas経路遺伝子を標的とした場合の保護作用を調べることおよび、他の輸送法のpros and consを評価することによって拡大する。幹細胞においてfasがサイレンシングし、Tリンパ球においてfasLがサイレンシングしたトランスジェニックマウスを用いる。次に、最も有望な標的siRNAのいくつかを選択して、肝細胞を標的化するために同定された最善の輸送戦略の一つまたは二つを選択する。fasLをリンパ球およびナチュラルキラー(NK)細胞、肝損傷に関与する細胞へとターゲティングするsiRNAのレンチウイルスによる輸送も同様に、肝細胞においてアポトーシス経路をサイレンシングさせるためのもう一つのアプローチである。分析は、マクロファージから肝細胞またはリンパ球への座のシフトが起こった先の章の分析と同等である。
この治療的技法がチャレンジ後に投与した場合に保護を提供できるか否か、およびfasまたはアポトーシス遺伝子を標的とするsiRNAがリステリアまたはワクシニアウイルスに対する保護反応を妨害するか否かも同様に決定する。暴露後の治療はまた、conAによって誘導されるあまり劇症でない肝炎の場合に提供することができる可能性があり、このモデルにおいて線維症/硬変の発症を予防する可能性がある。抗fas抗体モデルでは死亡は非常に早いため(ほとんどのマウスにおいて6〜8時間以内に起こる)、抗fas抗体に対する暴露後のマウスの保護は期待されない。これらの実験は、RNAiをヒトで用いるために後の霊長類を用いた研究を行うための指針を提供する。
実施例6 マウス敗血症モデルにおけるRNAi戦略の試験
前炎症性サイトカインに関するサイレンシング戦略を、敗血症ショックに関する二つのマウスモデル、すなわちLPS注射とグラム陰性菌である大腸菌O111:B4による腹腔内感染症とによって調べる(Barton, BE., and Jackson, JV.(1993)、Infect. Immun. 61:1496〜1499)。用いたマウスモデルは、C57BI/6マウスに感作物質D-グルコサミン(20 mg)プラス低用量大腸菌O111:B4 LPS(シグマ(Sigma))を腹腔内注射したLampingら(参照として本明細書に組み入れられる、(1998)J. Clin.Invest. 101:2065〜2071)の研究に基づいている。このモデルにおいて、血清中IL-1β、TNFα、およびIL-6の上昇を75分後にELISAによって検出したが、7時間までにこれはほぼ寛解し、それらの時点で肝損傷を血清中のトランスアミナーゼ上昇によってモニターすることができる。12時間以内にほとんどのマウスが死亡し、残る約35%のマウスが生存する。用いたもう一つのモデルは、生きた大腸菌O111:B4 107個の腹腔内注射であり、これによってマウスの約90%が数日以内に死亡する。インビボでマクロファージを有効に形質導入する一つまたは少数のsiRNA輸送系を選択する。他のマクロファージ機能に影響を及ぼすことなく、前炎症性遺伝子をサイレンシングさせるいくつかのsiRNA標的も同様に選択する。これらのサイトカインは活性化後に限って発現されることから、健康な非チャレンジマウスにおけるインビボサイレンシングの有効性をモニターすることは難しい。したがって、最初に、LPSまたは細菌の致死下用量を処置したBL/6マウスにおいて、RNAiの作用を調べる。
前炎症性サイトカインに関するサイレンシング戦略を、敗血症ショックに関する二つのマウスモデル、すなわちLPS注射とグラム陰性菌である大腸菌O111:B4による腹腔内感染症とによって調べる(Barton, BE., and Jackson, JV.(1993)、Infect. Immun. 61:1496〜1499)。用いたマウスモデルは、C57BI/6マウスに感作物質D-グルコサミン(20 mg)プラス低用量大腸菌O111:B4 LPS(シグマ(Sigma))を腹腔内注射したLampingら(参照として本明細書に組み入れられる、(1998)J. Clin.Invest. 101:2065〜2071)の研究に基づいている。このモデルにおいて、血清中IL-1β、TNFα、およびIL-6の上昇を75分後にELISAによって検出したが、7時間までにこれはほぼ寛解し、それらの時点で肝損傷を血清中のトランスアミナーゼ上昇によってモニターすることができる。12時間以内にほとんどのマウスが死亡し、残る約35%のマウスが生存する。用いたもう一つのモデルは、生きた大腸菌O111:B4 107個の腹腔内注射であり、これによってマウスの約90%が数日以内に死亡する。インビボでマクロファージを有効に形質導入する一つまたは少数のsiRNA輸送系を選択する。他のマクロファージ機能に影響を及ぼすことなく、前炎症性遺伝子をサイレンシングさせるいくつかのsiRNA標的も同様に選択する。これらのサイトカインは活性化後に限って発現されることから、健康な非チャレンジマウスにおけるインビボサイレンシングの有効性をモニターすることは難しい。したがって、最初に、LPSまたは細菌の致死下用量を処置したBL/6マウスにおいて、RNAiの作用を調べる。
マウスを、その時点で前炎症性サイトカインが検出可能であろう致死下用量のチャレンジの1、2、および4時間後に採血する。対照マウスにおいてこの時点で何も検出されなければ、用量を変更して、必要であれば、マウスを屠殺して、腹腔マクロファージおよび肝臓におけるサイトカインタンパク質およびmRNAを追跡するためのICCおよびRNアーゼ保護アッセイを用いて最適な検出時間を決定する。サイトカイン発現は、全マウス切片の免疫蛍光顕微鏡および肝臓、脾臓、および肺から単離した組織マクロファージの細胞内サイトカイン染色に関するフローサイトメトリー分析によって検出する。ノザンブロットおよびRPAも同様に単離されたマクロファージについて行う。異なる輸送媒体およびsiRNAインサートによって処置したマウスを偽処置マウス、および無関係なsiRNA(すなわち、GFP-siRNA)を処置したマウスと比較する。
致死チャレンジ実験に関して、血清中の前炎症性サイトカインおよび肝酵素を測定する(ELISA、R & Dシステムズ(R & D Systems)および臨床化学)最適な時間を最初に決定して、組織全炎症性サイトカインmRNAおよびタンパク質発現を決定して、死亡を決定する。マウスを最適な検出時間と共に、その最も早い死亡の4〜6時間前でそれぞれ測定するために屠殺して、腹腔および血清中の細菌数を計数する。組織学的分析は、血液の漏出および血管内凝固の定量的評価を提供する。血液の漏出は、定量的分析によって情報に富むことが示唆されれば、蛍光FITC-アルブミンの尾静脈内注射によって定量する。サイレンシングが致死下チャレンジ実験において確認される場合、形質導入の1日後(またはサイレンシングのピーク時)に、標的化および対照マウスに致死量のLPSまたは細菌の腹腔内注射をチャレンジする。
対照およびサイレンシングマウス5匹の群を、全炎症性サイトカインタンパク質およびmRNA発現、サイトカインの血清レベル、ならびに細菌数をモニターするために、予め決定した時間で屠殺する。IL-12およびIFNγのような他のサイトカインの発現を同時に分析する。各群においてさらにマウス10〜20匹を死亡するまで追跡する。最終的な剖検を行って、敗血症の兆候、臓器不全、および血液漏出を調べるであろう。生存マウスは全て10日後に屠殺して、単離された肝臓および脾臓のマクロファージをインビトロでIPSによって刺激して、前炎症性サイトカイン産生が抑制されたままであるか否かを決定する。
保護が認められない、または不完全である場合、治療回数または用量を増加させること、注射経路を変更すること、または異なる前炎症性サイトカインを標的とするsiRNAの組み合わせを用いることを含む、サイレンシングを増強する方法を調べる。保護が認められれば、チャレンジとsiRNAによる治療の順序を入れ替えて、RNAiが曝露後に保護できるか否か、そしてそれが暴露後のその期間をどこまで延長することが可能であるかを決定する。これは、死亡する動物の比率がより低く、死亡までの時間が増加するように、細菌/LPSチャレンジを減少させることを必要とするであろう。血清および細胞内サイトカイン発現に関する同じ分析を、これまでに記述されたように行う。
同様に、前炎症性サイトカイン産生の抑制が病原体の***および抗原特異的T細胞反応の発症を妨害するか否かを調べる。siRNA処置および対照C57BL/6マウスに、BL/6マウスにおけるT細胞によって認識されるLCMV gp33 T細胞ペプチドを発現する致死下用量のリステリア菌(Lm-gp 33、5×106個)またはワクシニアウイルス(vv-gp33、105 pfu)を腹腔内注射する(Manjunath, N.ら(2001)、J. Clin. Invest. 108:871〜878;Pircher, H.ら(1989)、Nature 342:559〜561)。感染症を制御する能力に関して調べるために、一群5匹のマウスを感染のあ6日後に屠殺して、それぞれ、肝臓または卵巣における細菌またはウイルスのコロニー数またはプラーク形成アッセイによって分析する。免疫コンピテンスを調べるために、同じマウスから採取したマウス脾細胞をインビトロで1 μg/ml gp33ペプチドによって刺激して、記述のようにgp33ペプチドに反応したIFNγ産生に関して7〜10日後に調べる。前炎症性サイトカインは貪食に関するマクロファージの活性化に関与することから、これらの感染症の阻止能は、サイレンシングの量が完全である場合いくぶん損なわれる可能性がある。しかし、サイレンシングが部分的である場合、これらの病原体の***に関して検出可能な効果を認めない可能性がある。効果を認めれば、siRNAのより低い用量が死亡から保護するが、それでも生得のおよび養子の抗ウイルスおよび抗菌防御をなおも保持することができるか否かを決定する。
遺伝的に多様な動物は、感染症および免疫に基づく治療に対して異なるように反応する可能性があることから、siRNAの有効性および毒性における起こりうる差を調べ始めるために、本章において記述される実験をもう一つのマウス系統(BALB/c)において繰り返す。これらの二つのマウス系統(BALB/cおよびC57BL/6)は、感染症に反応してそれらが産生するTH1およびTH2サイトカインの比が異なり、したがって、感染症を異なるように取り扱う。これは、リーシュマニア感染症モデルにおいて説明されている(Muller, I.ら(1989)、Immunol. Rev. 112:95〜113;Lohoff, M.ら(1989)、Immunobiology 179:412〜421)。gp33ペプチドは、BALB/cマウスにおいて認識されないことから、T細胞免疫を調べる実験において、BALB/cマウスにおけるCD8 T細胞によって認識される免疫優性リステリアリステリオシンペプチドGYKDGNEYI(残基91〜99位)を置換する(Villanueva, MS., Sijts, AJ, and Pamer, EG.(1995)、J. Immunol. 155:5227〜5233)。それぞれのマウス系統に関して、有用な比較を行うことができるように、治療アプローチを独立して最適化する。
実施例7 インビボでのRNA干渉の持続および起こりうる長期毒性の決定
上記の二本鎖RNAiを用いてfasを標的化するRNAiのインビボ試験において、肝細胞におけるサイレンシングは、これらのほとんど休止期の細胞では少なくとも10日間減少しなかった。持続的なサイレンシングはまた、インビトロでトランスフェクトした非***マクロファージにおいて3週間まで認められた。
上記の二本鎖RNAiを用いてfasを標的化するRNAiのインビボ試験において、肝細胞におけるサイレンシングは、これらのほとんど休止期の細胞では少なくとも10日間減少しなかった。持続的なサイレンシングはまた、インビトロでトランスフェクトした非***マクロファージにおいて3週間まで認められた。
二本鎖siRNAが、組み入れられたベクターからの内因性の発現が存在しない場合に、インビボでどれほどの期間サイレンシング状態を維持することができるかを決定するために、全身にGFPを発現するトランスジェニック-GFP(Tg-GFP)マウスに、蛍光の読み出しが最も単純な利用できるツールであることから、二本鎖GFP-siRNAを尾静脈によって注射する。GFP-siRNAおよび無関係なsiRNA-処置マウスを、注射の1、10、および25日後、ならびに2ヶ月後に屠殺して、全マウス切片におけるGFPタンパク質およびmRNA発現に関して蛍光顕微鏡およびインサイチューハイブリダイゼーションによって、ならびに選択された単離細胞集団におけるGFP発現に関してフローサイトメトリー、ノザンブロット、および定量的RT-PCRによって分析する。アッセイは全て、β-アクチンのような非サイレンシング遺伝子の発現に関する試験によって制御される。サイレンシングが2ヶ月間安定であれば、6ヶ月目に調べ、陽性であれば、サイレンシングがマウスの一生の間持続すると仮定することができる。分析した特定の細胞には、サイレンシングされることが既に示されている細胞を含む、肝臓および他の細胞からの肝細胞およびマクロファージが含まれる。これらの試験は、サイレンシング状態が持続するか否かのみならず、それが例えば同じ組織における肝細胞から組織マクロファージへと伝搬するか否かを説明する。
この分析を、可能性があるヒトでの使用に関して開発するために最も魅力的であることが先に示された前炎症性サイトカインおよびfas経路遺伝子をサイレンシングする方法によって処置したマウスにおいて繰り返す。サイレンシングが持続する場合、持続的な保護も同様に、siRNA処置後の時間をますます遅らせてマウスにチャレンジすることによって調べる。
サイレンシングの期間が1〜2ヶ月より長く持続する場合、前炎症性サイトカインまたはfas経路のサイレンシングが有害な結果を有するか否かも同様に決定する。マウスは、6週齢の時点で処置して、年老いて(約2.5年齢)、天然の加齢に伴う免疫機能の低下を経験し始めてから、リステリアおよびワクシニアウイルスをチャレンジする。その感染制御能は記述されるように、肝臓および卵巣においてそれぞれ、コロニー数およびプラーク形成アッセイによって、ならびに病原体のそれぞれに反応してIFNγを産生するように活性化されたT細胞数を測定することによって評価する。死亡の年齢および原因を、最終的な剖検によって、処置マウス、野生型マウスと比較する。臓器の重量および組織学を比較する。fas遺伝子サイレンシングマウスに関して、免疫応答の調節におけるfas経路の重要性のために、特にリンパ球および他の造血細胞の腫瘍および増殖性疾患の発症、ならびに関節および腎臓における自己免疫の兆候に関しては特に注意を払う。fasサイレンシングおよび対照マウスの1群10匹を2.5年齢の時点で屠殺して、血液、脾臓、およびリンパ節細胞数と共に肝組織学を比較する。
同等物
当業者は、単なる日常的な実験を用いて、本明細書に記述の本発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識する、または確認することができるであろう。そのような同等物は以下の請求の範囲に含まれると意図される。
当業者は、単なる日常的な実験を用いて、本明細書に記述の本発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識する、または確認することができるであろう。そのような同等物は以下の請求の範囲に含まれると意図される。
Claims (71)
- アポトーシス関連遺伝子の発現を阻害するRNA干渉物質を含む組成物。
- 前炎症性サイトカインの発現を阻害するRNA干渉物質を含む組成物。
- アポトーシス関連遺伝子が抗アポトーシス遺伝子である、請求項1記載の組成物。
- アポトーシス関連遺伝子が前アポトーシス遺伝子である、請求項1記載の組成物。
- 物質が、アポトーシス関連遺伝子またはその断片と相同であるRNAである、請求項1記載の組成物。
- 物質が、前炎症性サイトカインまたはその断片と相同であるRNAである、請求項1記載の組成物。
- 前アポトーシス遺伝子がFas経路分子またはその断片である、請求項4記載の組成物。
- Fas経路分子がFasもしくはFasL、またはその断片である、請求項7記載の組成物。
- 前炎症性サイトカインがIL-1もしくはTNFα、またはその断片である、請求項6記載の組成物。
- 物質が、アポトーシス関連遺伝子またはその断片と相同である二本鎖の短い干渉RNA(siRNA)である、請求項6記載の組成物。
- 物質が、前炎症性サイトカインまたはその断片と相同である二本鎖の短い干渉RNA(siRNA)である、請求項5記載の組成物。
- アポトーシス関連遺伝子が抗アポトーシス遺伝子である、請求項10記載の組成物。
- アポトーシス関連遺伝子が前アポトーシス遺伝子である、請求項10記載の組成物。
- 短い干渉RNA(siRNA)がその断片のFas経路分子と相同である、請求項13記載の組成物。
- Fas経路分子がFasもしくはFasL、またはその断片である、請求項14記載の組成物。
- 前炎症性サイトカイン分子がIL-1もしくはTNFα、またはその断片である、請求項11記載の組成物。
- siRNAの長さが約21ヌクレオチドである、請求項10または11記載の組成物。
- siRNAが二本鎖であり、かつそれぞれの鎖に3'突出末端を含む、請求項10または11記載の組成物。
- 突出末端がそれぞれの鎖に約1〜約6ヌクレオチドを含む、請求項18記載の組成物。
- 突出末端がそれぞれの鎖に約2ヌクレオチドを含む、請求項18記載の組成物。
- 第一の鎖が配列番号:1の配列を含み、かつ第二の鎖が配列番号:2の配列を含む、請求項15記載の組成物。
- 第一の鎖が配列番号:3の配列を含み、かつ第二の鎖が配列番号:4の配列を含む、請求項15記載の組成物。
- 第一の鎖が配列番号:9の配列を含み、かつ第二の鎖が配列番号:10の配列を含む、請求項15記載の組成物。
- 第一の鎖が配列番号:11の配列を含み、かつ第二の鎖が配列番号:12の配列を含む、請求項15記載の組成物。
- siRNAがアポトーシス関連遺伝子mRNAの分解を誘導する、または調節することができる、請求項10記載の組成物。
- siRNAが転写サイレンシングによってアポトーシス関連遺伝子を不活化する、請求項10記載の組成物。
- 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項10または11記載の組成物。
- アポトーシス関連遺伝子と相同であり、かつアポトーシス関連遺伝子RNA干渉を促進することができるRNAをコードするDNA鋳型を含むベクター。
- アポトーシス関連遺伝子と相同であり、かつアポトーシス関連遺伝子のRNA干渉を促進することができるRNAをコードするDNA鋳型を含むベクター。
- アポトーシス関連遺伝子が抗アポトーシス遺伝子である、請求項28記載のベクター。
- アポトーシス関連遺伝子が前アポトーシス遺伝子である、請求項28記載のベクター。
- アポトーシス関連遺伝子がFas経路分子である、請求項31記載のベクター。
- Fas経路分子がFasもしくはFasL、またはその断片である、請求項32記載のベクター。
- 前炎症性サイトカイン分子がIL-1もしくはTNFα、またはその断片である、請求項29記載のベクター。
- レンチウイルスベクターである、請求項28または29記載のベクター。
- レトロウイルスベクターである、請求項28または29記載のベクター。
- 請求項28〜36のいずれか一項に記載のベクターをトランスフェクトした細胞。
- アポトーシス関連遺伝子発現を調節するsiRNAを細胞に投与して、それによって細胞におけるアポトーシスを阻害することを含む、細胞におけるアポトーシスを阻害する方法。
- アポトーシス関連遺伝子発現が阻害される、請求項38記載の方法。
- アポトーシス関連遺伝子が抗アポトーシス遺伝子である、請求項38記載の方法。
- アポトーシス関連遺伝子が前アポトーシス遺伝子である、請求項38記載の方法。
- アポトーシス関連遺伝子がFas経路分子またはその断片である、請求項41記載の分子。
- Fas経路分子がFasもしくはFasL、またはその断片である、請求項42記載の方法。
- 細胞が肝細胞、T細胞、造血細胞、神経細胞、または悪性細胞である、請求項38記載の方法。
- アポトーシス関連遺伝子発現の阻害が長時間持続する、請求項38記載の方法。
- 発現が少なくとも10日間持続する、請求項45記載の方法。
- アポトーシス関連遺伝子の発現が阻害されるように、アポトーシス関連遺伝子発現を調節するsiRNAの治療的または予防的有効量を被験者に投与することを含む、被験者におけるアポトーシス媒介疾患または傷害を治療または予防する方法。
- アポトーシス関連遺伝子発現を調節するsiRNAを同種異系移植片レシピエントに投与することを含む、同種異系移植片レシピエントにおける同種異系移植片拒絶を予防する方法。
- アポトーシス関連遺伝子発現が阻害される、請求項47または48記載の方法。
- アポトーシス関連遺伝子が抗アポトーシス遺伝子である、請求項47または48記載の方法。
- アポトーシス関連遺伝子が前アポトーシス遺伝子である、請求項47または48記載の方法。
- アポトーシス関連遺伝子がFas経路分子またはその断片である、請求項51記載の方法。
- Fas経路分子がFasもしくはFasL、またはその断片である、請求項52記載の方法。
- 疾患または障害が免疫または炎症疾患である、請求項47記載の方法。
- 免疫または炎症疾患が肝炎である、請求項54記載の方法。
- 疾患または病態が癌である、請求項51記載の方法。
- 癌が肝臓癌である、請求項56記載の方法。
- 疾患または病態が硬変である、請求項47記載の方法。
- 疾患または病態が移植の拒絶である、請求項47記載の方法。
- 被験者がヒトである、請求項47記載の方法。
- siRNAが静脈内投与される、請求項47または48記載の方法。
- siRNAが繰り返し静脈内注射によって投与される、請求項61記載の方法。
- RNA干渉物質が、アポトーシス関連疾患または障害の発病後に投与される、請求項47記載の方法。
- 同種異系移植片が肝移植片である、請求項48記載の方法。
- アポトーシス関連遺伝子発現を調節するsiRNAをエクスビボで同種異系移植片に接触させることを含む、同種異系移植片レシピエントによる同種異系移植片の拒絶を予防する方法。
- アポトーシス関連遺伝子がFasまたはFasLである、請求項65記載の方法。
- 同種異系移植片が肝移植片である、請求項65記載の方法。
- 前炎症性サイトカインの発現が阻害されるように、前炎症性サイトカイン発現を調節するsiRNAの治療的または予防的有効量を被験者に投与することを含む、被験者における前炎症性サイトカイン媒介疾患または障害を治療または予防する方法。
- 前炎症性サイトカイン媒介疾患または障害が敗血症である、請求項68記載の方法。
- 前炎症性サイトカインがIL-1もしくはTNFα、またはその断片である、請求項69記載の組成物。
- 被験者がヒトである、請求項68記載の方法。
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