JP2006516196A - ハプロタイプ関連に基づく、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の診断方法 - Google Patents
ハプロタイプ関連に基づく、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の診断方法 Download PDFInfo
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Abstract
BMP2に関連するリスクのあるハプロタイプの検出に基づく、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の診断方法を開示する。
Description
関連技術
本願は、2003年1月16日に提出された米国仮出願第60/440,899号の利益を主張し、かつ2003年2月27日に提出された米国仮出願第60/450,652号の利益を主張する。上記出願の教示全体は、参考として本明細書中に援用される。
本願は、2003年1月16日に提出された米国仮出願第60/440,899号の利益を主張し、かつ2003年2月27日に提出された米国仮出願第60/450,652号の利益を主張する。上記出願の教示全体は、参考として本明細書中に援用される。
発明の背景
骨粗鬆症は、骨密度(BMD)の低下によって定義されるように、骨量が少ないことおよび骨組織の劣化を特徴とする衰弱性疾患である。直面する微細構造の劣化の直接の結果は、骨折しやすくなること、および骨格が脆くなりやすくなることであり、これらは、最終的には、世界的な規模での高い死亡率、高い罹患率、および高額な医療費を生じる。なかでも、更年期以降の女性は、エストロゲンの不足、およびこれに対応する月経の間の骨量の減少が、骨粗鬆症性の骨折の可能性、および骨折の可能性がある部位の数の両方を増大させるので、最もリスクが高い。しかし、高齢の女性だけが人口統計学上のリスクが高いグループではない。栄養失調、無月経、または運動不足の若い女性は、若年齢で骨量の増大を阻害するリスクがある。さらに、アンドロゲンは思春期の間に骨量を増やす役割を果たしており、骨が十分に発達しなかった高齢者または性腺機能低下症の男性は、骨粗鬆症のリスクに曝される。
骨粗鬆症は、骨密度(BMD)の低下によって定義されるように、骨量が少ないことおよび骨組織の劣化を特徴とする衰弱性疾患である。直面する微細構造の劣化の直接の結果は、骨折しやすくなること、および骨格が脆くなりやすくなることであり、これらは、最終的には、世界的な規模での高い死亡率、高い罹患率、および高額な医療費を生じる。なかでも、更年期以降の女性は、エストロゲンの不足、およびこれに対応する月経の間の骨量の減少が、骨粗鬆症性の骨折の可能性、および骨折の可能性がある部位の数の両方を増大させるので、最もリスクが高い。しかし、高齢の女性だけが人口統計学上のリスクが高いグループではない。栄養失調、無月経、または運動不足の若い女性は、若年齢で骨量の増大を阻害するリスクがある。さらに、アンドロゲンは思春期の間に骨量を増やす役割を果たしており、骨が十分に発達しなかった高齢者または性腺機能低下症の男性は、骨粗鬆症のリスクに曝される。
この疾患の治療法を見出すために必要なものは、骨粗鬆症をもたらす要因が多く存在するという事実から複雑である。栄養分(特に、カルシウム、ビタミンD、およびビタミンKの摂取)、ホルモン濃度、年齢、性別、人種、体重、活動レベル、および遺伝的要素の全てが、個体間の骨密度に見られる相違に影響を及ぼす。現在、骨粗鬆症を処置するための承認されている薬剤は、骨の再吸収の阻害因子として作用する。治療計画には、ホルモン補充療法(HRT)、選択的なエストロゲン受容体調節因子、カルシトニン、およびビスホスホネート(biophosphonate)の使用のような方法が挙げられる。しかし、これらの処置は個々にリスクを低下させて一貫した結果を伴うものではない。さらに、いくつかの治療薬が同時に投与された場合にBMDが改善され、他のものは、併用されても効力の改善またはさらに効力の低下を示さない。
明らかに、平均寿命が延び、骨粗鬆症に関する健康上および経済上の懸念が大きくなっているので、この晩期発症型疾患のリスクを解消する方法が非常に望まれている。そのため、この疾患またはこの疾患に対する罹患性の早期の診断が望まれている。
発明の要旨
本明細書中に記載されているように、特定の組み合わせの遺伝子マーカー(「ハプロタイプ」)は、骨粗鬆症および骨粗鬆症に対する罹患性に関連した表現型を有する患者において、予想以上の高頻度で存在することが発見された。本明細書中に記載されるハプロタイプに含まれるマーカーは、ヒト骨形成タンパク質2(BMP2)の発現を制御する(directs)ゲノム領域に関連する。
本明細書中に記載されているように、特定の組み合わせの遺伝子マーカー(「ハプロタイプ」)は、骨粗鬆症および骨粗鬆症に対する罹患性に関連した表現型を有する患者において、予想以上の高頻度で存在することが発見された。本明細書中に記載されるハプロタイプに含まれるマーカーは、ヒト骨形成タンパク質2(BMP2)の発現を制御する(directs)ゲノム領域に関連する。
ある態様において、本発明は、ハプロタイプI、ハプロタイプII、ハプロタイプa、ハプロタイプb、ハプロタイプc、ハプロタイプdおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるハプロタイプを含む、リスクのあるハプロタイプの有無を検出する工程を含み、ここでハプロタイプの存在が骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の指標となる、個体における骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法に関する。特定の態様において、本発明は、試料中の第一の核酸分子の存在に関する分析であって、該試料を、本明細書中に記載されるハプロタイプの1つ以上を含む第二の核酸分子に接触させる工程を含む分析に関する。ある態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は、個体由来の核酸の酵素的増幅を含む。特定の態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は、さらに電気泳動解析を含む。例えば、ある態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は、制限酵素断片長多型解析を含む。別の態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は、配列解析を含む。
別の態様において、本発明は、ハプロタイプIを含むリスクのあるハプロタイプの有無を検出する工程を含み、ここでハプロタイプの存在が骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の指標となる、個体における骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法に関する。特定の態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は、個体由来の核酸の酵素的増幅を含む。特定の態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は、電気泳動解析をさらに含む。例えば、ある態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は、制限酵素断片長多型解析を含む。別の態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は、配列解析を含む。
別の態様において、本発明は、ハプロタイプIIを含むリスクのあるハプロタイプの有無を検出する工程を含み、ここでハプロタイプの存在が骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の指標となる、個体における骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法に関する。特定の態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は、個体由来の核酸の酵素的増幅を含む。特定の態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は、電気泳動解析をさらに含む。例えば、ある態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は、制限酵素断片長多型解析を含む。別の態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は、配列解析を含む。
別の態様において、本発明は、骨粗鬆症に関連のあるハプロタイプの存在に関して試料を分析するためのキットであって、ここでハプロタイプが2つ以上の特定の対立遺伝子を含み、かつここでキットが2つ以上の特定の対立遺伝子の有無を検出することができる1つ以上の核酸を含み、それによって試料中のハプロタイプの有無を示すキットに関する。特定の態様において、核酸は、ハプロタイプの特定の対立遺伝子を含む領域に完全に相補的な連続したヌクレオチド配列を含む。
別の態様において、本発明は、ハプロタイプが2つ以上の特定の対立遺伝子を含み、別々の容器にa)ハプロタイプの1つ以上の特定の対立遺伝子を検出できる1つ以上の標識核酸;およびb)該標識の検出のための試薬;を含む、骨粗鬆症に関連のあるハプロタイプの存在に関して試料を分析するための試薬キットに関する。特定の態様において、標識核酸は、ハプロタイプの特定の対立遺伝子を含む領域に完全に相補的な連続したヌクレオチド配列を含む。
さらに別の態様において、本発明は、骨粗鬆症に関連のあるハプロタイプの存在に関して試料を分析するための試薬キットであって、ここでハプロタイプが2つ以上の特定の対立遺伝子を含み、ここで該キットがBMP2遺伝子のヌクレオチド配列の一部に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む1つ以上の核酸を含み、かつここで核酸が、ハプロタイプの特定の対立遺伝子の1つ以上を検出できるプライマー伸長反応のためのプライマーとして作用できる試薬キットに関する。
別の態様において、本発明は、骨粗鬆症に対して罹患性の高くない個体と比較して、骨粗鬆症に対して罹患性の高い個体においてより頻繁に存在する、BMP2に関連のある、リスクのあるハプロタイプをスクリーニングする工程であって、ここでリスクのあるハプロタイプがリスクを有意に上昇させる工程を含む、個体における骨粗鬆症に対する罹患性を診断および同定する方法に関する。特定の態様において、有意な上昇は、少なくとも約20%である。別の態様において、有意な上昇は、少なくとも約1.2のオッズ比として同定される。
別の態様において、本発明は、TSC0898956、B420、B8463、D20S846、TSC0191642、P4337、D20S892、B5048、B9082、D20S59、B7111/rs235764、B12845/rs15705、P9313、B10631、D35548、rs1116867、TSC0278787、D35548およびTSC0271643からなる群から選択される2つ以上の対立遺伝子を含むハプロタイプの個体における有無を決定する工程を含み、ここでハプロタイプの存在が骨粗鬆症に対する罹患性の指標となる、個体における骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法に関する。特定の態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は電気泳動解析をさらに含む。例えば、ある態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は制限酵素断片長多型解析を含む。別の態様において、ハプロタイプの有無を決定する工程は配列解析を含む。
さらに別の態様において、本発明は、個体から核酸試料を得る工程;およびTSC0898956、B420、B8463、D20S846、TSC0191642、P4337、D20S892、B5048、B9082、D20S59、B7111/rs235764、B12845/rs15705、P9313、B10631、D35548、rs1116867、TSC0278787、D35548およびTSC0271643からなる群から選択される2つ以上の対立遺伝子を含むハプロタイプの有無に関して核酸試料を解析する工程を含み、ここでハプロタイプの存在が骨粗鬆症に対する罹患性の指標である、個体における骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法に関する。特定の態様において、対立遺伝子は、TSC0898956、B420、B8463、D20S846およびTSC0191642からなる群から選択される。特定の態様において、対立遺伝子はP4337、D20S892、B5048、B9082およびD20S59からなる群から選択される。別の態様において、ハプロタイプはB7111/rs235764およびB12845/rs15705を含む。特定の態様において、対立遺伝子は、P9313、B10631およびD35548からなる群から選択される。特定の態様において、対立遺伝子はrs1116867、TSC0278787およびD35548からなる群から選択される。別の態様において、対立遺伝子はTSC0271643、P9313およびB7111からなる群から選択される。
発明の詳細な説明
本明細書中に記載されるように、出願人は、骨粗鬆症表現型と、第20染色体上に位置する、ヒト骨形成タンパク質2(BMP2)の発現に関する遺伝子領域に関連する遺伝子マーカーの特定の組み合わせ(「ハプロタイプ」)との連鎖解析を完了した。本明細書中に示される結果は、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性を示すために用いられるハプロタイプの、最初の証明を表す。行われた関連研究に基づき、出願人は、BMP2関連ハプロタイプと骨粗鬆症との直接の関係を発見した。特に、特定のハプロタイプが、予想より高い頻度で、骨粗鬆症および骨粗鬆症の罹患性と関連のある表現型を有する患者に現れることが発見された。この関連に基づいた、例えば骨ターンオーバーマーカー分析(例えば骨スキャン)と組み合わせた骨粗鬆症の診断方法が、本明細書中に記載される。さらに、本明細書中に記載される少なくとも1つのハプロタイプの検出に基づいた方法は、骨粗鬆症に対する罹患性の診断となる。
本明細書中に記載されるように、出願人は、骨粗鬆症表現型と、第20染色体上に位置する、ヒト骨形成タンパク質2(BMP2)の発現に関する遺伝子領域に関連する遺伝子マーカーの特定の組み合わせ(「ハプロタイプ」)との連鎖解析を完了した。本明細書中に示される結果は、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性を示すために用いられるハプロタイプの、最初の証明を表す。行われた関連研究に基づき、出願人は、BMP2関連ハプロタイプと骨粗鬆症との直接の関係を発見した。特に、特定のハプロタイプが、予想より高い頻度で、骨粗鬆症および骨粗鬆症の罹患性と関連のある表現型を有する患者に現れることが発見された。この関連に基づいた、例えば骨ターンオーバーマーカー分析(例えば骨スキャン)と組み合わせた骨粗鬆症の診断方法が、本明細書中に記載される。さらに、本明細書中に記載される少なくとも1つのハプロタイプの検出に基づいた方法は、骨粗鬆症に対する罹患性の診断となる。
本発明の診断およびスクリーニングアッセイ
本発明は、骨粗鬆症を有する個体または骨粗鬆症に対する罹患性の高い個体により高頻度で現れる特定の遺伝子マーカーを検出することによる、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の診断、またはそのような診断を補助する方法に関する。診断アッセイは、BMP2を評価するために設計され得る。遺伝子マーカーの組み合わせは、本明細書中で「ハプロタイプ」と呼ばれ、本発明は、特定のハプロタイプの検出が骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の指標である方法を記載する。特定のハプロタイプを構成する特定の遺伝子マーカーの検出は、本明細書中に記載の種々の方法および当該分野で公知の種々の方法によって行われ得る。例えば、遺伝子マーカーは、核酸レベルで、例えば直接の配列決定によって検出され得るか、または遺伝子マーカーがBMP2のコード配列に影響を及ぼす場合はアミノ酸レベルで、例えばBMP2タンパク質もしくは特定のBMP2変異体タンパク質を認識する抗体に基づく免疫学的測定法によって検出され得る。
本発明は、骨粗鬆症を有する個体または骨粗鬆症に対する罹患性の高い個体により高頻度で現れる特定の遺伝子マーカーを検出することによる、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の診断、またはそのような診断を補助する方法に関する。診断アッセイは、BMP2を評価するために設計され得る。遺伝子マーカーの組み合わせは、本明細書中で「ハプロタイプ」と呼ばれ、本発明は、特定のハプロタイプの検出が骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の指標である方法を記載する。特定のハプロタイプを構成する特定の遺伝子マーカーの検出は、本明細書中に記載の種々の方法および当該分野で公知の種々の方法によって行われ得る。例えば、遺伝子マーカーは、核酸レベルで、例えば直接の配列決定によって検出され得るか、または遺伝子マーカーがBMP2のコード配列に影響を及ぼす場合はアミノ酸レベルで、例えばBMP2タンパク質もしくは特定のBMP2変異体タンパク質を認識する抗体に基づく免疫学的測定法によって検出され得る。
ある態様では、このアッセイは、生物学的試料(例えば、血液、血清、細胞、組織)の状況で使用され、それによって個体が骨粗鬆症に罹患しているかどうか、または骨粗鬆症を発症するリスクがある(骨粗鬆症の素因または骨粗鬆症に対する罹患性を有している)かどうかが決定される。本発明により、また、個体が骨粗鬆症を発症しやすいかどうかを決定するための予後の(すなわち、予測)アッセイも提供される。例えば、核酸配列の変化は、生物学的試料中でアッセイされ得る。このようなアッセイは、それによって骨粗鬆症に関係する症状の発症の前に個体の予防的な処置を可能にする、予後または予測目的のために使用され得る。
診断アッセイ
本発明のある態様において、骨粗鬆症に対する罹患性の診断は、本明細書中に記載される、BMP2に関連のあるハプロタイプを検出することによって行われる。BMP2関連ハプロタイプは、BMP2に関連のある一連の遺伝子マーカーを記す。ある態様において、ハプロタイプは、1つ以上のマーカー、2つ以上のマーカー、3つ以上のマーカー、4つ以上のマーカーまたは5つ以上のマーカーを含み得る。遺伝子マーカーは、BMP2に関連のある「多型部位(polymorphic site)」における特定の「対立遺伝子」である。集団内(天然の集団または合成の集団のいずれか、例えば合成の分子のライブラリー)で1つより多い配列があり得るヌクレオチド位置は、本明細書中で「多型部位」と呼ばれる。多型部位が一ヌクレオチド長である場合、該部位は、一塩基多型(「SNP」)と呼ばれる。例えば、特定の染色体上の位置で集団の1つのメンバーがアデニンを有し、集団の別のメンバーが同じ位置にチミンを有する場合、この位置は多型部位であり、さらに具体的には、多型部位はSNPである。多型部位は、置換、挿入または欠失に基づく配列における差異を考慮に入れ得る。多型部位に関する配列の各バージョンは、本明細書中で、多型部位の「対立遺伝子」と呼ばれる。したがって、前の例において、SNPはアデニン対立遺伝子およびチミン対立遺伝子の両方を考慮に入れる。
本発明のある態様において、骨粗鬆症に対する罹患性の診断は、本明細書中に記載される、BMP2に関連のあるハプロタイプを検出することによって行われる。BMP2関連ハプロタイプは、BMP2に関連のある一連の遺伝子マーカーを記す。ある態様において、ハプロタイプは、1つ以上のマーカー、2つ以上のマーカー、3つ以上のマーカー、4つ以上のマーカーまたは5つ以上のマーカーを含み得る。遺伝子マーカーは、BMP2に関連のある「多型部位(polymorphic site)」における特定の「対立遺伝子」である。集団内(天然の集団または合成の集団のいずれか、例えば合成の分子のライブラリー)で1つより多い配列があり得るヌクレオチド位置は、本明細書中で「多型部位」と呼ばれる。多型部位が一ヌクレオチド長である場合、該部位は、一塩基多型(「SNP」)と呼ばれる。例えば、特定の染色体上の位置で集団の1つのメンバーがアデニンを有し、集団の別のメンバーが同じ位置にチミンを有する場合、この位置は多型部位であり、さらに具体的には、多型部位はSNPである。多型部位は、置換、挿入または欠失に基づく配列における差異を考慮に入れ得る。多型部位に関する配列の各バージョンは、本明細書中で、多型部位の「対立遺伝子」と呼ばれる。したがって、前の例において、SNPはアデニン対立遺伝子およびチミン対立遺伝子の両方を考慮に入れる。
典型的には、参照配列は特定の配列について参照される。参照とは異なる対立遺伝子は、「変異体」対立遺伝子と呼ばれる。例えば、参照BMP2配列は、本明細書中で、配列番号1によって記される。用語「変異体BMP2」は、本明細書中で用いられる場合、配列番号1とは異なるが他は実質的に同様であるBMP2配列をいう。本明細書中に記載されるハプロタイプを構成する遺伝子マーカーは、BMP2変異体である。本発明の明細書中に開示されるハプロタイプの決定に用いられるBMP2の変異体は、多数の骨粗鬆症表現型に対する罹患性と関連がある。
さらなる変異体は、ポリペプチド、例えばBMP2ポリペプチドに影響を与える変化を含み得る。これらの配列の相違は、参照ヌクレオチド配列と比較した場合、フレームシフトをもたらす、単一のヌクレオチドまたは1つより多いヌクレオチドの挿入または欠失;コードされるアミノ酸の変化をもたらす、少なくとも1つのヌクレオチドの変化;未成熟な終止コドンの生成をもたらす、少なくとも1つのヌクレオチドの変化;ヌクレオチドによってコードされる1つ以上のアミノ酸の欠失をもたらす、数個のヌクレオチドの欠失;リーディングフレームのコード配列の中断をもたらす、不均等な(unequal)組み換えまたは遺伝子変換によるような1つまたは数個のヌクレオチドの挿入;配列の全てまたは一部の複製;転位;またはヌクレオチド配列の再配列を含み得る。かかる配列変化は、BMP2核酸によってコードされるポリペプチドを変化させる。例えば、核酸配列における変化がフレームシフトを引き起こす場合、フレームシフトは、コードされるアミノ酸の変化をもたらし得、かつ/またはトランケートされたポリペプチドの生成を引き起こす未成熟な終止コドンの生成をもたらし得る。あるいは、骨粗鬆症に対する罹患性に関連のある多型は、1つ以上のヌクレオチドにおける同義の変化(すなわち、BMP2アミノ酸配列の変化をもたらさない変化)であり得る。かかる多型は、例えば、スプライス部位を変化させ得、mRNAの安定性または移動に影響し得、またはそうでなければポリペプチドの転写または翻訳に影響し得る。参照ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、特定の参照アミノ酸配列を有する「参照」ポリペプチドであり、変異体対立遺伝子によってコードされるポリペプチドは、変異体アミノ酸配列を有する「変異体」ポリペプチドと呼ばれる。
ハプロタイプは、遺伝子マーカーの組み合わせ、例えば多型部位における特定の対立遺伝子である。本明細書中に記載されるハプロタイプは、骨粗鬆症および/または骨粗鬆症に対する罹患性と関連がある。したがって、本明細書中のハプロタイプの有無の検出は骨粗鬆症、骨粗鬆症に対する罹患性またはそれらを欠くことの指標である。したがって、これらのハプロタイプの有無の検出は、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性を検出するために、本発明の目的のために必要である。本明細書中に記載されるハプロタイプは、種々の遺伝子マーカーの組み合わせ、例えばSNPおよびマイクロサテライトである。したがって、ハプロタイプの検出は、多型部位における配列を検出するための公知の方法によって達成され得る。
第1の骨粗鬆症に対する罹患性の診断方法においては、サザン分析、ノーザン分析、またはインサイチュハイブリダイゼーションのようなハイブリダイゼーション方法が使用され得る(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,F.ら,編、John Wiley & Sons(1999年からの全ての追補を含む)を参照のこと)。例えば、ゲノムDNA、RNA、またはcDNAの試験被験体に由来する生物学的試料(「試験試料」)は、骨粗鬆症を有していると疑われるか、骨粗鬆症に対して罹患性を有している、または骨粗鬆症の素因がある、あるいは骨粗鬆症の障害を有している個体(「試験個体」)から得られる。個体は、成人、子供、また、胎児でもあり得る。試験試料は、血液試料、羊水の試料、脳脊髄液の試料、あるいは、皮膚、筋肉、頬粘膜もしくは結膜粘膜、胎盤、消化管、または他の器官に由来する組織試料のような、ゲノムDNAを含む任意の供給源に由来し得る。胎児の細胞または組織に由来するDNAの試験試料は、適切な方法によって、例えば、羊水穿刺または絨毛膜標本採取によって、得ることができる。DNA、RNA、またはcDNA試料が、次いで、BMP2中に多型が存在するかどうかを決定するために試験される。ハプロタイプの対立遺伝子の存在は、特定の対立遺伝子に特異的な核酸プローブの配列特異的ハイブリダイゼーションによって示され得る。配列特異的プローブは、ゲノムDNA、RNAまたはcDNAへのハイブリダイズを対象とし得る。「核酸プローブ」は、本明細書中で用いられる場合、相補配列にハイブリダイズするDNAプローブまたはRNAプローブであり得る。試験試料由来のゲノム配列中に特定の対立遺伝子が存在する場合にのみ配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるプローブを設計する方法は、当業者に公知である。
骨粗鬆症に対する罹患性を診断するために、ハイブリダイゼーション試料が、BMP2を含む試験試料を少なくとも1つの核酸プローブと接触させることによって形成される。mRNAまたはゲノムDNAを検出するためのプローブの限定的ではない例は、本明細書中に記載されるmRNAまたはゲノムDNA配列にハイブリダイズすることができる標識された核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、全長の核酸分子またはその一部であり得、例えば、少なくとも15、30、50、100、250、または500ヌクレオチドの長さの、適切なmRNAまたはゲノムDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするために十分なオリゴヌクレオチドである。例えば、核酸プローブは、配列番号1全体またはその一部であり得、これには、任意に、本明細書中に記載されるハプロタイプに含まれる少なくとも1つの対立遺伝子が含まれるか、あるいはプローブは、かかる配列の相補配列であり得る。本発明の診断アッセイでの使用に適切な他のプローブは、本明細書中に記載される。
ハイブリダイゼーション試料は、BMP2に対する核酸プローブの特異的ハイブリダイゼーションを行うために十分な条件下で維持される。「特異的ハイブリダイゼーション」は、本明細書中で使用される場合は、正確なハイブリダイゼーション(例えば、ミスマッチを含まない)を示す。特異的ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシーの条件または中程度のストリンジェンシーの条件下で行われ得る(下記参照)。ある態様では、特異的ハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション条件は、高ストリンジェンシーである。
特異的ハイブリダイゼーションは、存在する場合には、次いで、標準的な方法を使用して検出される。特異的ハイブリダイゼーションが核酸プローブと試験試料中のBMP2との間で生じる場合は、試料は対立遺伝子を含み、これは核酸プローブ中に存在する。この工程がハプロタイプを構成する他のマーカーについて繰り返され得るか、または複合のプローブを同時に用いて1つより多いマーカーを同時に検出し得る。試料中のハプロタイプの特定のマーカーの検出は、試料の供給源が特定のハプロタイプを有し、そのため骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性を有することの指標である。
別のハイブリダイゼーション方法では、ノーザン分析(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,F.ら編、John Wiley & Sons,(前出)を参照のこと)が、骨粗鬆症に対する罹患性と関係している多型の存在を同定するために使用される。ノーザン分析については、RNAの試験試料は適切な手段によって個体から得られる。上記のような、核酸プローブの、個体に由来するRNAに対する特異的ハイブリダイゼーションは、プローブに相補的な特定の対立遺伝子の指標である。
核酸プローブの使用の代表的な例については、例えば、米国特許第5,288,611号および同第4,851,330号を参照のこと。
あるいは、ペプチド核酸(PNA)プローブが、上記のハイブリダイゼーション方法において核酸プローブの代わりに使用され得る。PNAは、ペプチド様の無機骨格を有しているDNA模倣物であり、例えば、メチレンカルボニルリンカーを介してグリシン窒素に結合させられた有機塩基(A、G、C、T、またはU)を有しているN-(2-アミノエチル)グリシン単位である(例えば、Nielsen,P.ら, 1994. Bioconjug. Chem., 5: 3-7を参照のこと)。PNAプローブは、骨粗鬆症に対する罹患性に関係しているハプロタイプの遺伝子マーカーの1つを含んでいる疑いがある試料中の分子に特異的にハイブリダイズするように設計され得る。PNAプローブのハイブリダイゼーションは、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の診断である。
本発明のある態様では、BMP2または骨粗鬆症に関係しているハプロタイプに関係している骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の診断は、定量的PCR(動的温度循環)を使用する発現分析によって行われ得る。ある態様では、骨粗鬆症の診断は、少なくとも1つのBMP2に関係している対立遺伝子を検出することによって、骨の代謝マーカーのアッセイ(例えば、骨スキャン)と組み合わせて行われる。この技術には、例えば、TaqMan(登録商標)(Applied Biosystems, Foster City, CA)のような市販されている技術を利用することができ、これにより、多型およびハプロタイプが同定され得る。この技術により、BMP2によってコードされるポリペプチドの発現または組成に変化が存在するかどうか、またはスプライシング変異体が存在するかどうかが評価され得る。さらに、変異体の発現は、物理的または機能的な差として定量され得る。
本発明の別の方法においては、対立遺伝子が参照配列に関連のある制限部位を生成または排除をもたらす場合には、制限消化による分析が、特定の対立遺伝子を検出するために使用され得る。ゲノムDNAを含む試験試料は、個体から得られる。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、試験個体に由来する試験試料中のゲノムBMP2領域(必要である場合には、隣接配列を含む)を増幅するために使用され得る。RFLP分析が、記載されているように行われる(Current Protocols in Molecular Biology(前出)を参照のこと)。関連するDNA断片の消化パターンは、試料中に特定の対立遺伝子が存在するかまたは存在しないかを示す。
配列解析はまた、BMP2に関係する多型部位における特定の対立遺伝子を検出するためにも使用され得る。DNAまたはRNAの試験試料は、試験個体から得られる。PCRまたは他の適切な方法は、所望される場合には、BMP2、および/またはその隣接配列を増幅するために使用され得る。このようにして、特定の対立遺伝子の存在は、試料中のゲノムDNAの多型部位の配列決定によって直接検出される。
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドもまた、BMP2に関係する多型部位における特定の対立遺伝子の存在を検出するために、増幅されたオリゴヌクレオチドの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)プローブとのドット-ブロットハイブリダイゼーションの使用を通じて使用され得る(例えば、Saiki,R.ら, 1986, Nature, 324:163-166を参照のこと)。「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」(本明細書中では、「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ」とも呼ばれる)は、およそ10〜50塩基対、またはおよそ15〜30塩基対のオリゴヌクレオチドであり、これは、BMP2に特異的にハイブリダイズし、これには、本明細書中に記載のハプロタイプによって示されるような多型部位における特定の対立遺伝子が含まれる。BMP2中の特定の多型に対して特異的な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、標準的な方法を使用して調製され得る(Current Protocols in Molecular Biology(前出)を参照のこと)。PCRが、BMP2全体またはその断片、およびゲノムの隣接配列を増幅するために使用され得る。増幅されたBMP2(またはその遺伝子の断片)を含むDNAが、標準的な方法を使用してドット-ブロットされ(Current Protocols in Molecular Biology(前出)を参照のこと)、そしてブロットがオリゴヌクレオチドプローブと接触させられる。次いで、増幅されたBMP2に対するプローブの特異的なハイブリダイゼーションの存在が検出される。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの個体に由来するDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションは、BMP2に関係する多型部位における特定の対立遺伝子の指標である。
対立遺伝子特異的プライマーは、多型部位と重複する標的DNA上の部位にハイブリダイズし、およびそれに対して完全な相補性を示すプライマーの対立遺伝子形態の増幅だけをプライムする(Gibbs,R.ら, 1989. Nucleic Acids Res., 17:2437-2448)。このプライマーは、反対の鎖の上のはなれた部位にハイブリダイズする第2のプライマーと組み合わせて使用される。増幅は2つのプライマーから進行して、検出可能な産物を生じ、これが特定の対立遺伝子形態が存在することを示す。対照は、通常、プライマーの第2の対を用いて行われる。この対の一方は多型部位で1塩基のミスマッチを示し、他方は離れた部位に対して完全な相補性を示す。1塩基のミスマッチは増幅を妨げ、検出可能な産物は形成されない。ミスマッチが多型とともにアラインメントされるオリゴヌクレオチドの最も3'位置に含まれる場合には、この方法は最も良好に機能する。なぜなら、この位置は、プライマーからの伸張を最も不安定化させるからである(例えば、国際公開番号WO93/22456を参照のこと)。
ロックト核酸(LNA)のような類似体を加えることにより、プライマーおよびプローブの大きさが、8塩基程度の小ささにまで縮小させられ得る。LNAは、フラノース環の2'および4'位置がO-メチレン(オキシ-LNA)、S-メチレン(チオ-LNA)、またはアミノメチレン(アミノ-LNA)部分を介して接続されている2環式DNA類似体の新規のクラスである。全てのこれらのLNA変異体について、相補的核酸に対する親和性が共通しており、これは、DNA類似体について報告されている最大をはるかに上回る。例えば、特定の全てのオキシ-LNA九量体は、相補的なDNAまたはRNAとの複合体の場合には、対応するDNA九量体に関してのDNAおよびRNAの両方についての28℃とは対照的に、それぞれ、64℃および74℃の融点を有することが示されている。Tmの実質的な上昇は、LNA単量体が標準的なDNAまたはRNA単量体と組み合わせて使用された場合にも得られる。プライマーおよびプローブについて、どこにLNA単量体が含まれるか(例えば、3'末端、5'末端、または中間に)に依存して、Tmはかなり上昇させられ得る。
別の態様では、個体に由来する標的核酸配列セグメントに相補的であるオリゴヌクレオチドプローブのアレイが、BMP2核酸における多型を同定するために使用され得る。例えば、ある態様では、オリゴヌクレオチドアレイが使用され得る。オリゴヌクレオチドアレイには、通常、種々の既知の位置の基質の表面に結合させられた複数の種々のオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。これらのオリゴヌクレオチドアレイはまた、「Genechip(登録商標)」としても記載されており、当該分野において、例えば、米国特許第5,143,854号およびPCT国際特許公開番号WO90/15070および同92/10092に一般的に記載されている。これらのアレイは、通常、機械による合成方法、またはフォトリソグラフィー法と固相オリゴヌクレオチド合成方法の組み合わせが組み込まれている光特異的合成方法(Fodor,S.ら,1991. Science, 251:767-773;Pirrungら, 米国特許第5,143,854号(PCT出願番号WO90/15070もまた参照のこと);およびFodor,S.ら, PCT国際公開番号WO92/10092および米国特許第5,424,186号、これらのそれぞれの教示全体が引用により本明細書中に組み込まれる)を使用して、生産され得る。機械による合成方法を使用するこれらのアレイの合成のための技術は、例えば、米国特許第5,384,261号(その教示全体が引用により本明細書中に組み込まれる)に記載されている。別の例では、直線的なアレイが利用され得る。
一旦、オリゴヌクレオチドアレイが調製されると、目的の核酸がアレイとハイブリダイズできるようになる。ハイブリダイゼーションの検出は、目的の核酸中の特定の対立遺伝子の検出である。ハイブリダイゼーションおよびスキャンは、通常、本明細書中、ならびに例えば、公開されたPCT出願番号WO92/10092および同WO95/11995、および米国特許第5,424,186号(それらの教示全体が、引用により本明細書中に組み込まれる)に記載されている方法によって行われる。簡潔にいうと、1つ以上の以前に同定された多型性マーカーを含む標的核酸配列が、周知の増幅技術、例えば、PCRによって増幅される。通常は、この技術には、標的配列の二本鎖に相補的であるプライマー配列(多型部位の上流と下流の両方)の使用が含まれる。非対称PCR技術もまた、使用され得る。増幅された標的には、通常、標識が組み込まれており、これは次いで、配列特異的ハイブリダイゼーションが可能である適切な条件下でアレイとハイブリダイズさせられる。アレイのハイブリダイゼーションと洗浄が完了すると、アレイは、標的配列がハイブリダイズしたアレイ上の位置を決定するためにスキャンされる。スキャンによって得られたハイブリダイゼーションデータは、通常は、アレイの位置の関数としての蛍光強度の形態である。
単一の検出ブロックに関して、例えば、単一の多型部位の検出について主に記載されているが、アレイには複数の検出ブロックが含まれ得、したがって、複数の特異的な多型を分析することができる。別のアレンジでは、検出ブロックが単一のアレイの中または複数の異なるアレイの中でグループ分けされ得、その結果、種々の最適な条件が、アレイに対する標的のハイブリダイゼーションの間に使用され得る。例えば、A-Tリッチセグメントに含まれる多型とは別の、ゲノム配列のG-Cリッチストレッチに含まれるこれらの多型の検出を提供することが、多くの場合に望まれる。これにより、それぞれの状況についてのハイブリダイゼーション条件を別々に最適化することができる。
多型の検出のためにオリゴヌクレオチドアレイを使用することについてのさらなる記載は、例えば、米国特許第5,858,659号および同第5,837,832号(それらの教示全体が引用により本明細書中に組み込まれる)に見出され得る。
他の核酸分析方法が、BMP2に関係する多型部位における特定の対立遺伝子を検出するために使用され得る。代表的な方法としては、例えば、直接的な手作業による配列決定(ChurchおよびGilbert, 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1991-1995;Sanger,F.ら, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74:5463-5467;Beavisら, 米国特許第5,288,644号);自動蛍光配列決定;一本鎖立体構造多型アッセイ(SSCP);クランプ変性ゲル電気泳動(CDGE);変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)(Sheffield,V.ら, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:232-236);移動度シフト分析(Orita,M.ら, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2766-2770)、制限酵素分析(Flavell, R.ら, 1978. Cell, 15:25-41;Geever, R.ら, 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:5081-5085);ヘテロ二本鎖分析;化学的なミスマッチ切断(CMC)(Cotton, R.ら, 1985. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397-4401);RNase保護アッセイ(Myers,R.ら, 1985. Science, 230:1242-1246);大腸菌(E.coli)mutSタンパク質のようなヌクレオチドのミスマッチを認識するポリペプチドの使用;ならびに対立遺伝子特異的PCRが挙げられる。
本発明の別の態様では、骨粗鬆症に対する罹患性の診断は、本明細書中に記載されるハプロタイプに含まれる遺伝子マーカーがポリペプチドの発現の変化をもたらす場合(例えば、アミノ酸配列の変化または発現レベルの変化)、BMP2ポリペプチドの発現および/または組成を試験することによっても行われ得る。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を含む種々の方法を用いてかかる検出を行い得る。個体に由来する試験試料が、BMP2によってコードされるポリペプチドの発現に変化が、および/またはBMP2によってコードされるポリペプチドの組成に変化が存在するかどうかが、評価される。BMP2によってコードされるポリペプチドの発現の変化は、例えば、定量的なポリペプチドの発現(すなわち、生産されるポリペプチドの量)の変化であり得、BMP2によってコードされるポリペプチドの組成の変化は、定性的なポリペプチドの発現の変化(例えば、変異BMP2ポリペプチドの発現、または別のスプライシング変異体の発現)である。ある態様では、骨粗鬆症に対する罹患性の診断は、BMP2によってコードされる特定のスプライシング変異体、または特定のパターンのスプライシング変異体を検出することによって行われる。
このような変化(定量的および定性的)の両方ともが存在し得る。ポリペプチドの発現または組成の「変化」は、本明細書中で使用される場合は、対照試料中のBMP2によってコードされるポリペプチドの発現または組成と比較した、試験試料中の発現または組成の変化をいう。対照試料は、試験試料に対応する試料であり(例えば、同じタイプの細胞に由来する)、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性に罹患していない個体に由来する試料である。同様に、対照試料と比較した、試験試料中の1つ以上の異なるスプライシング変異体の存在、または試験試料中の有意に異なる量の複数の異なるスプライシング変異体の存在は、骨粗鬆症に対する罹患性の指標である。対照試料と比較した試験試料中のポリペプチドの発現または組成の変化は、参照に関連する対立遺伝子がスプライス部位を変化させる場合、特定の対立遺伝子の指標であり得る。BMP2によってコードされるポリペプチドの発現または組成を試験する種々の手段が使用され得、これには、分光分析、比色分析、電気泳動、等電点電気泳動、および免疫ブロッティング(Current Protocols in Molecular Biology, 特に、第10章もまた参照のこと)のような免疫アッセイ(例えば、Davidら, 米国特許第4,376,110号)が含まれる。
例えば、ある態様では、(例えば、上記の)ポリペプチドに結合することができる抗体(例えば、検出可能な標識を有している抗体)が使用され得る。抗体は、ポリクローナルでも、モノクローナルでもよい。完全な抗体、またはその断片(例えば、FabまたはF(ab')2)が使用され得る。用語「標識された」は、プローブまたは抗体に関して用いられる場合は、プローブまたは抗体に対して検出可能な物質を結合させる(すなわち、物理的に連結させる)ことによるプローブまたは抗体の直接的な標識、ならびに、直接標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的な標識を含むように意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することができるようにするためのビオチンでのDNAプローブの末端標識を使用する一次抗体の検出が含まれる。
変異体BMP2によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する上記抗体、または参照対立遺伝子によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体を使用するウェスタンブロット分析が、変異体BMP2対立遺伝子によってコードされるポリペプチドが試験試料中に存在すること、あるいは参照対立遺伝子によってコードされるポリペプチドが試験試料中には存在しないことを識別するために使用され得る。
この方法のある態様では、試験試料中のBMP2によってコードされるポリペプチドのレベルまたは量が、対照試料中のBMP2によってコードされるポリペプチドのレベルまたは量と比較される。統計学的に有意であるような、対照試料中のポリペプチドのレベルまたは量よりも多いかまたは少ない試験試料中のポリペプチドのレベルまたは量は、BMP2によってコードされるポリペプチドの発現の変化の指標であり、発現の差を引き起こす原因である特定の対立遺伝子の診断である。あるいは、試験試料中のBMP2によってコードされるポリペプチドの組成が、対照試料中のBMP2によってコードされるポリペプチドの組成と比較される。別の態様では、ポリペプチドのレベルまたは量および組成が、試験試料中、および対照試料中で評価され得る。
診断方法において有用なキットには、本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて有用である成分が含まれ、これらとしては、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、制限酵素(例えば、RFLP解析用)、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、変化しているBMP2ポリペプチドまたは変化していない(天然の)BMP2ポリペプチド(例えば、配列番号2であって、本明細書中に記載されるハプロタイプに含まれる少なくとも1つの遺伝子マーカーを含むもの)に結合する抗体、BMP2を含む核酸の増幅のための手段、またはBMP2の核酸配列を分析するため、もしくはBMP2ポリペプチドのアミノ酸配列を分析するための手段などが挙げられる。さらに、キットにより、本発明の方法、例えば、骨の代謝マーカーのアッセイ(例えば、骨スキャン)と組み合わせて使用されるアッセイのための試薬が提供され得る。
診断方法において有用であるキット(例えば、試薬キット)には、本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて有用である成分が含まれ、これらとして、例えば、本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションプローブまたはプライマー(例えば、標識されたプローブまたはプライマー)、標識された分子の検出のための試薬、制限酵素(例えば、RFLP解析用)、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、変化しているBMP2ポリペプチドまたは変化していない(天然の)BMP2ポリペプチドに結合する抗体、BMP2を含む核酸の増幅のための手段、または、本明細書中に記載されるような、BMP2核酸の核酸配列を分析するため、もしくはBMP2ポリペプチドのアミノ酸配列を分析するための手段などが挙げられる。ある態様では、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性を診断するためのキットには、骨粗鬆症を有しているかまたは骨粗鬆症に対する罹患性がある個体において、より頻繁に存在するリスクのあるハプロタイプを含む、BMP2核酸中の領域の核酸増幅のためのプライマーが含まれ得る。プライマーは、骨粗鬆症の指標であるSNPに隣接している核酸の一部を使用して設計され得る。ある態様において、プライマーは、表1に示される骨粗鬆症のリスクのあるハプロタイプ、すなわち、より具体的にはハプロタイプI、ハプロタイプII、ハプロタイプa、ハプロタイプb、ハプロタイプcまたはハプロタイプdに関連するBMP2核酸の領域を増幅するように設計される。さらに、キットにより、本発明の方法、例えば、骨の代謝マーカーのアッセイ(例えば、骨スキャン)と組み合わせて使用されるアッセイのための試薬が提供され得る。
ハプロタイプスクリーニング
本発明はさらに、BMP2中のリスクのあるハプロタイプを同定することにより、個体における骨粗鬆症に対する罹患性を診断および同定するための方法にも関する。ある態様では、リスクのあるハプロタイプは、骨粗鬆症の有意なリスクを与えるものである。ある態様では、ハプロタイプに関連する有意性は、オッズ比によって測定される。さらなる態様では、有意性は割合(%)によって測定される。ある態様では、有意なリスクは、少なくとも約2.2であって、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、および1.9を含むがこれらに限定されないオッズ比として測定される。さらなる態様では、少なくとも1.2のオッズ比が有意である。さらなる態様では、少なくとも約1.5のオッズ比が有意である。さらなる態様では、リスクの有意な増大は、少なくとも約1.7が有意である。さらなる態様では、リスクの有意な増大は、少なくとも約20%であり、約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、および98%が含まれるがこれらに限定されない。さらなる態様では、リスクの有意な増大は、少なくとも約50%である。しかし、リスクが医学的に有意であるかどうかの識別はまた、特定の疾患、ハプロタイプ、そして多くの場合には環境的要因を含む種々の要因によって変化し得ることが理解される。
本発明はさらに、BMP2中のリスクのあるハプロタイプを同定することにより、個体における骨粗鬆症に対する罹患性を診断および同定するための方法にも関する。ある態様では、リスクのあるハプロタイプは、骨粗鬆症の有意なリスクを与えるものである。ある態様では、ハプロタイプに関連する有意性は、オッズ比によって測定される。さらなる態様では、有意性は割合(%)によって測定される。ある態様では、有意なリスクは、少なくとも約2.2であって、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、および1.9を含むがこれらに限定されないオッズ比として測定される。さらなる態様では、少なくとも1.2のオッズ比が有意である。さらなる態様では、少なくとも約1.5のオッズ比が有意である。さらなる態様では、リスクの有意な増大は、少なくとも約1.7が有意である。さらなる態様では、リスクの有意な増大は、少なくとも約20%であり、約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、および98%が含まれるがこれらに限定されない。さらなる態様では、リスクの有意な増大は、少なくとも約50%である。しかし、リスクが医学的に有意であるかどうかの識別はまた、特定の疾患、ハプロタイプ、そして多くの場合には環境的要因を含む種々の要因によって変化し得ることが理解される。
本発明はまた、個体における骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法に関する。この方法には、健常な個体(対照)中でのその存在の頻度と比較して、骨粗鬆症に罹患しやすい個体(罹患)においてより頻繁に存在する、BMP2核酸と関係しているリスクのあるハプロタイプをスクリーニングする工程が含まれる。ここでは、ハプロタイプの存在は、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の指標である。骨粗鬆症と関係しているSNPおよび/またはマイクロサテライトマーカーの存在についての遺伝子型決定のための標準的技術、例えば、蛍光に基づく技術(Chen, X.ら, 1999. Genome Res., 9:492-498)、PCR、LCR、ネステッドPCR、および核酸増幅のための他の技術が使用され得る。ある態様では、この方法には、骨粗鬆症に関係しているBMP2核酸と関係している、特定のSNP対立遺伝子またはマイクロサテライト対立遺伝子の存在または頻度を個体において評価する工程が含まれる。ここでは、健常な対照個体と比較してハプロタイプが過剰であるかハプロタイプの頻度が高いことは、個体が骨粗鬆症を有しているか、または骨粗鬆症に対する罹患性があることの指標である。
ハプロタイプ解析は、ロッド値を用いて候補となる罹患性遺伝子座を定義する工程を含む。次いで定義された領域は、100kb未満のマーカー間の平均間隔を有するマイクロサテライトマーカーを用いて超微細にマッピングされる。公共のデータベースに見られ、その領域内にマッピングされる使用可能な全てのマイクロサテライトマーカーが用いられ得る。さらに、ヒトゲノムのdeCODE Genetics 配列集合内で同定されたマイクロサテライトマーカーが用いられ得る。
期待値最大化アルゴリズムを用いた患者および対照群におけるハプロタイプの頻度が評価され得る(Dempster, A.ら, 1977. J. R. Stat. Soc. B, 39: 1-389)。失われた遺伝子型および相の不確定性を操作し得るこのアルゴリズムの実行が用いられ得る。ヌル仮説の下で、患者および対照は、同一の頻度を有すると想定される。尤度アプローチを用いて、候補となるリスクのあるハプロタイプが対照よりも患者においてより高い頻度を有することができる一方で他のハプロタイプの頻度の割合が両方の群において同じであると想定される代替の仮説が試験される。尤度は、両方の仮説の下で別々に最大化され、相当する1-df尤度比統計を用いて統計上の有意性を評価する。
1ロッドの低下(1-lod drop)におけるリスクのあるハプロタイプを探すために、例えば、遺伝子型マーカー(genotyped marker)の、可能性のある全ての組み合わせの関連が、これらのマーカーが実質的な領域に渡る場合、研究され得る。組み合わされた患者群と対照群は、無作為に、患者および対照の元々の群とサイズに関して同じである2つの組に分けられ得る。次いでハプロタイプ解析が繰り返され、記録された最も有意なp値が測定される。この無作為化スキームは、100回を超えて繰り返されて、経験的なp値の分布を構成し得る。
本発明の核酸およびポリペプチド
全てのヌクレオチドの位置は、示されるように、配列番号1またはGenBank番号AL035668に関連する。本明細書中に記載される核酸、ポリペプチドおよび抗体は、骨粗鬆症に対する罹患性の診断方法において、および骨粗鬆症に対する罹患性の診断に有用なキットにおいて用いられ得る。BMP2の参照アミノ酸配列は、配列番号2によって記されている。
全てのヌクレオチドの位置は、示されるように、配列番号1またはGenBank番号AL035668に関連する。本明細書中に記載される核酸、ポリペプチドおよび抗体は、骨粗鬆症に対する罹患性の診断方法において、および骨粗鬆症に対する罹患性の診断に有用なキットにおいて用いられ得る。BMP2の参照アミノ酸配列は、配列番号2によって記されている。
「単離された」核酸分子は、本明細書中で使用される場合は、その遺伝子またはヌクレオチド配列に通常は隣接している(ゲノム配列中で)核酸から分離され、そして/または他の転写された配列(例えば、RNAライブラリーにおいて)から完全にもしくは部分的に精製されている核酸分子である。例えば、本発明の単離された核酸は、その天然に存在している複雑な細胞環境、または組み換え技術によって生産される場合には培養培地、あるいは、化学合成される場合には化学的前駆体もしくは他の化合物に関して実質的に単離され得る。いくつかの例では、単離された材料は、組成物(例えば、他の物質を含む粗抽出物)、緩衝液システム、または試薬混合物の一部を形成する。他の状況では、材料は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)またはHPLCのようなカラムクロマトグラフィーによって測定されるように、本質的に均質であるように精製され得る。本発明の単離された核酸分子は、存在する全ての高分子種のうちの少なくとも約50、80、または90%(モル基準で)を占め得る。ゲノムDNAに関して、用語「単離された」はまた、ゲノムDNAが天然において会合している染色体から分離されている核酸分子をも意味し得る。例えば、単離された核酸分子は、核酸分子が由来する細胞のゲノムDNAにおいて核酸分子に隣接している、約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、または0.1kb未満のヌクレオチドを含み得る。
核酸分子は、他のコード配列または調節配列に融合させられ得、なおも単離されているとみなされ得る。したがって、ベクター中に含まれる組み換えDNAは、本明細書中で使用される「単離された」の定義に含まれる。また、単離された核酸分子には、異種宿主細胞または異種生物中の組み換えDNA分子、さらには、溶液中の部分的または実質的に精製されたDNA分子も含まれる。「単離された」核酸分子には、また、本発明のDNA分子のインビボおよびインビトロRNA転写物も含まれる。単離された核酸分子またはヌクレオチド配列には、化学的に、または組み換え手段によって合成される、核酸分子またはヌクレオチド配列が含まれ得る。したがって、ベクター中に含まれる組み換えDNAは、本明細書中で使用される「単離された」の定義に含まれる。このような単離されたヌクレオチド配列は、例えば、コードされるポリペプチドの製造において、(例えば、他の哺乳動物種から)相同配列を単離するため、(例えば、染色体を用いるインサイチュハイブリダイゼーションによる)遺伝子マッピングのため、または組織(例えば、ヒト組織)中での遺伝子の発現を、例えば、ノーザンブロット分析もしくは他のハイブリダイゼーション技術によって検出するためのプローブとして、有用である。
本発明はまた、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件(例えば、選択的ハイブリダイゼーション用の条件)下で、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸分子(例えば、本明細書中に記載されるハプロタイプに関係する多型部位を含むヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする核酸分子)に関する。ある態様では、本発明には、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件(例えば、選択的ハイブリダイゼーション用の条件)下で、本明細書中に記載されるハプロタイプの少なくとも1つに含まれる多型部位における少なくとも1つの対立遺伝子を含む配列番号1から選択されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはその相補物、あるいは、本明細書中に記載されるハプロタイプに含まれる対立遺伝子によってもたらされる組成または発現レベルの変化を含む配列番号2のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対してハイブリダイズする、本明細書中に記載される変異体が含まれる。
そのような核酸分子は、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションまたは配列特異的ハイブリダイゼーション(例えば、高ストリンジェンシーの条件下での)によって検出、および/または単離され得る。「特異的ハイブリダイゼーション」は、本明細書中で使用される場合は、第1の核酸が第2の核酸以外のいずれの核酸に対してもハイブリダイズしない様式(例えば、第1の核酸が、ハイブリダイゼーションが行われる試料中の他の全ての核酸に対してよりも第2の核酸に対して高い相補性を有する場合)で、第1の核酸が第2の核酸にハイブリダイズする能力をいう。ハイブリダイゼーションについての「ストリンジェンシーの条件」は、特定の核酸の第2の核酸に対するハイブリダイゼーションを可能にするインキュベーション条件および洗浄条件、例えば、温度および緩衝液濃度の条件について言及する専門用語である。第1の核酸は、第2の核酸に対して完全に(すなわち、100%)相補的であっても、また、第1の核酸と第2の核酸は、完全には満たないある程度の相補性(例えば、70%、75%、85%、95%)を共有していてもよい。例えば、特定の高ストリンジェンシーの条件は、完全に相補的な核酸を相補性の低い核酸から識別するために使用され得る。核酸のハイブリダイゼーションについての「高ストリンジェンシーの条件」、「中程度のストリンジェンシーの条件」、および「低ストリンジェンシーの条件」は、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,F.ら, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, (1998)、その教示全体が引用により本明細書中に援用される)の2.10.1〜2.10.16ページ、および6.3.1〜6.3.6ページに説明されている。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件は、イオン強度(例えば、0.2×SSC、0.1×SSC)、温度(例えば、室温、42℃、68℃)、およびホルムアミドのような脱安定化剤またはSDSのような変性剤の濃度だけではなく、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチの割合(%)、および他の同一ではない配列内においてその配列のサブセットが出現する頻度のような要因によっても変化する。したがって、同等の条件は、2つの核酸分子の間で同程度の同一性または類似性を維持したまま、これらのパラメーターの1つ以上を変化させることによって決定され得る。通常は、互いに少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%、あるいはそれ以上同一である配列が互いにハイブリダイズしたままである条件が使用される。ハイブリダイゼーションが生じないストリンジェンシーのレベルから、ハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルにまでハイブリダイゼーション条件を変化させることにより、所定の配列を、試料中の最も相補的な配列と(例えば、選択的に)ハイブリダイズさせる条件が決定され得る。
中程度または低ストリンジェンシーの条件についての洗浄条件の決定が記載されている例示的な条件は、Kraus,M.およびAaronson, S., Methods Enzymol., 200:546-556(1991);およびAusubel, F.ら, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, (1998)に記載されている。洗浄は、通常は、その条件がハイブリッドの相補性の最低レベルを決定するように設定される工程である。一般的には、相同なハイブリダイゼーションしか生じない最も低い温度から開始して、最終的な洗浄温度がそれぞれ1℃下がると(SSC濃度を一定に保ったまま)、ハイブリダイズする配列間の最大のミスマッチの割合(%)が1%増大する。通常は、SSCの濃度を2倍にすることによって、Tmが約17℃上昇する。これらの指針を用いると、洗浄温度は、想定されるミスマッチのレベルに応じて、高ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、または低ストリンジェンシーについて経験的に決定され得る。
例えば、低ストリンジェンシーの洗浄には、0.2×SSC/0.1%のSDSを含む溶液中での室温で10分間の洗浄が含まれ得る。中程度のストリンジェンシーの洗浄には、0.2×SSC/0.1%のSDSを含む予め温められた(42℃)溶液中での、42℃で15分間の洗浄が含まれ得る。そして、高ストリンジェンシーの洗浄には、0.1×SSC/0.1%のSDSを含む予め温められた(68℃)溶液中での、68℃で15分間の洗浄が含まれ得る。さらに、洗浄は、当該分野で公知であるように、所望される結果が得られるまで繰り返して、または連続して行われ得る。同等の条件は、使用される標的核酸分子とプライマーまたはプローブ(例えば、ハイブリダイズされる配列)との間で同程度の相補性を維持したまま、当該分野で公知であるように、例として挙げられる1つ以上のパラメーターを変化させることによって決定され得る。
2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の同一性の割合(%)は、最適な比較の目的のために配列をアラインメントすることによって決定され得る(例えば、第1の配列の配列中にギャップが導入され得る)。次いで、対応する位置のヌクレオチドまたはアミノ酸が比較され、2つの配列間の同一性の割合(%)は、これらの配列によって共有される同一の位置の数の関数(すなわち、同一性の割合(%)=同一である位置の数/位置の総数×100)である。特定の態様では、比較の目的のためにアラインメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%である。2つの配列の実際の比較は、周知の方法によって、例えば、数学的アルゴリズムを使用して行われ得る。このような数学的アルゴリズムの限定的ではない例は、Karlin, S.およびAltschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877(1993)に記載されている。このようなアルゴリズムは、Altschul, S.ら, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402(1997)に記載されているように、NBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。BLASTおよびGapped BLASTプログラムが利用される場合には、それぞれのプログラム(例えば、NBLAST)についてのデフォルトパラメーターが使用され得る。ワールドワイドウェブ(World Wide Web)上のncbi.nlm.nih.govのウェブサイトを参照のこと。ある態様では、配列比較のためのパラメーターは、スコア=100、文字長=12に設定され得るか、または変化させることもできる(例えば、W=5、またはW=20)。
配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の限定的ではない例は、MyersおよびMiller, CABIOS(1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれており、これは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムが利用される場合は、PAM120重み残基表、12のギャップ長ペナルティー、および4のギャップペナルティーが使用され得る。配列解析のためにさらなるアルゴリズムは当該分野で公知であり、これには、Torellis, A.およびRobotti, C., 1994. Comput. Appl. Biosci., 10:3-5に記載されているADVANCEおよびADAM、ならびにPearson, W.およびLipman, D., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-8に記載されているFASTAが含まれる。
別の態様では、2つのアミノ酸配列の間での同一性の割合(%)は、Blossom 63マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、および12、10、8、6、または4のギャップ重み、および2、3、または4の長さ重みのいずれかを使用するGCGソフトウェアパッケージ(Accelrys, Cambridge, UK)のGAPプログラムを使用して行われ得る。さらに別の態様では、2つの核酸配列の間での同一性の割合(%)は、50のギャップ重みおよび3の長さ重みを使用して、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを使用して行われ得る。
本発明により、また、配列番号1から選択されるヌクレオチド配列を含み、本明細書中に記載される1つ以上のハプロタイプに含まれる少なくとも1つの対立遺伝子を含むヌクレオチド配列、およびその相補物に対して、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする断片または部分を含む、単離された核酸分子が提供される。また、本発明により、配列番号2から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、その多型変異体、またはその断片もしくは一部に対して、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする断片または部分を含む単離された核酸分子も提供される。本発明の核酸断片は、少なくとも約15、少なくとも約18、20、23、または25ヌクレオチドであり、30、40、50、100、200、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。本明細書中に記載される抗原性ポリペプチドをコードするより長い断片、例えば、30以上のヌクレオチド長は、例えば、以下に記載されるような抗体の作成に、特に有用である。
本発明の核酸断片は、本明細書中に記載されるアッセイのようなアッセイにおいて、プローブまたはプライマーとして使用される。「プローブ」または「プライマー」は、核酸分子の相補鎖に対して塩基特異的様式でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。DNAおよびRNAに加えて、このようなプローブおよびプライマーとして、Nielsen, P.ら, 1991. Science, 254: 1497-1500に記載されているような、ポリペプチド核酸(PNA)が挙げられる。
プローブまたはプライマーには、配列番号1であって、本明細書中に記載される1つ以上のハプロタイプに含まれる少なくとも1つの対立遺伝子を含むもの、およびその相補物由来の連続するヌクレオチド配列を含む核酸分子の、少なくとも約15、典型的には、約20〜25、そしてある態様では、約40、50、または75個の連続するヌクレオチドに対してハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域が含まれる。本発明はまた、配列番号2から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする断片もしくは部分、その多型変異体またはその断片もしくは部分を含む、単離された核酸分子を提供する。特定の態様では、プローブまたはプライマーには、100個またはそれ未満のヌクレオチドが含まれ得る。例えば、特定の態様では、6個から50個のヌクレオチド、または、例えば12個から30個のヌクレオチドが含まれる。他の態様では、プローブまたはプライマーは、連続するヌクレオチド配列に対して、または連続するヌクレオチド配列の相補物に対して、少なくとも70%同一であり、例えば、特定の態様では、少なくとも80%同一であり、他の態様では、少なくとも85%同一であり、少なくとも90%同一であり、そして他の態様では、少なくとも95%同一であるか、あるいは、連続するヌクレオチド配列に対して、または連続するヌクレオチド配列の相補物に対して選択的にハイブリダイズすることさえできる。多くの場合、プローブまたはプライマーには、さらに、標識、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子が含まれる。
上記に記載されたような本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学的技術および配列番号1に提供される配列情報を使用して同定および単離され得る。例えば、核酸分子は、配列番号1に提供される1つ以上の配列(および、任意に、本明細書中に記載される1つ以上のハプロタイプに含まれる少なくとも1つの対立遺伝子を含む)および/またはその相補物に基づいて設計された合成のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅および単離され得る。一般的には、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification(H.A.Erlich編, Freeman Press, NY, NY, 1992);PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Innisら編、Academic Press, San Diego, CA, 1990);Mattila, P.ら, 1991. Nucleic Acids Res., 19:4967-4973;Eckert, K.およびKunkel, T., 1991. PCR Methods and Applications, 1:17-24;PCR(McPhersonら編, IRL Press, Oxford);および米国特許第4,683,202号を参照のこと。核酸分子は、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAを鋳型として使用して増幅され得、適切なベクターにクローニングされ得、そしてDNA配列解析によって特徴付けられ得る。
他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応(LCR; Wu, D.およびWallace, R., 1989. Genomics, 4:560-469、Landegren, U.ら, 1988. Science, 241:1077-1080を参照のこと)、転写増幅(Kwoh, D.ら, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173-1177)、および自己維持配列の複製(Guatelli, J.ら, 1990. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:1874-1878)、および核酸に基づいた配列増幅法(NASBA)が挙げられる。後者の2つの増幅方法には、等温転写に基づく等温反応が含まれ、これにより、一本鎖RNA(ssRNA)と二本鎖DNA(dsDNA)の両方が、それぞれ、約30および100対1の割合で増幅産物として生じる。
増幅されたDNAは標識、例えば、放射標識され得、そしてヒト細胞に由来するcDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用され得る。cDNAは、mRNAから誘導され得、これは、zap express(Stratagene, La Jolla, CA)、ZIPLOX(Gibco BRL, Gaithesburg, MD)、または他の適切なベクターに含まれ得る。対応するクローンが単離され得、インビボでの切り出しの後にDNAが得られ得、そしてクローニングされた挿入物が、適切な分子量のポリペプチドをコードする正確なリーディングフレームを同定するための当該分野で認識されている方法によって、いずれかの方向で、または両方の方向で配列決定され得る。例えば、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列の直接的な分析は、市販されている周知の方法を使用して行われ得る。例えば、Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(第2版、CSHP, New York 1989);Zyskindら, Recombinant DNA Laboratory Manual,(Acad. Press, 1988)を参照のこと)。さらに、蛍光法もまた、核酸(Chen, X.ら, 1999. Genome Res. 9:492-498)およびポリペプチドを分析するために利用できる。これらの方法または類似する方法を用いて、ポリペプチドおよびポリペプチドをコードするDNAが単離され得、配列決定され得、さらに特徴付けられ得る。
一般的には、本発明の単離された核酸配列は、サザンゲル上の分子量マーカーとして、および関連する遺伝子位置をマッピングするために標識される染色体マーカーとして、使用され得る。核酸配列はまた、遺伝的障害(例えば、骨粗鬆症の素因、または骨粗鬆症に対する罹患性)を同定するために、患者の内因性DNA配列と比較するため、および例えば、関連するDNA配列にハイブリダイズさせ、関連するDNA配列を発見するためのプローブとして、あるいは、試料に由来する既知の配列を差し引くためにも、使用され得る。核酸配列は、さらに、遺伝子のフィンガープリントのためのプライマーを導き出すため、免疫化技術を使用して抗ポリペプチド抗体を惹起させるため、および抗DNA抗体を惹起させるかまたは免疫応答を誘発させるための抗原として、使用され得る。
本明細書中で使用される場合は、2つのポリペプチド(またはポリペプチドの領域)は、アミノ酸配列が少なくとも約45〜55%、特定の態様では、少なくとも約70〜75%、他の態様では、少なくとも約80〜85%、そして他の態様では、約90%またはそれ以上相同であるかあるいは同一である場合に、実質的に相同または同一である。実質的に相同であるアミノ酸配列は、本発明によれば、配列番号1であって、任意に、本明細書中に記載されるハプロタイプに含まれる少なくとも1つの対立遺伝子を含むものに対して、上記により具体的に記載されているストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるか、あるいは、配列番号2もしくはその一部、またはその多型変異体をコードする核酸配列に対して、それについてより具体的に記載されているストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる。
変異体ポリペプチドは、1つ以上の置換、欠失、挿入、逆位、融合、および短縮、またはこれらのいずれかの組み合わせによってアミノ酸配列が異なり得る。さらに、変異体ポリペプチドは、完全に機能性であり得るか、また、1つ以上の活性において機能を欠失している場合もある。完全な機能を有している変異体には、通常、保存的変化または重要ではない残基もしくは重要ではない領域中の変化のみが含まれる。機能性変異体には、また、機能においては変化を生じないか重要ではない変化を生じる、類似のアミノ酸の置換も含まれ得る。あるいは、このような置換は、機能に対してある程度の正または負の影響を与え得る。非機能性変異体には、通常、1つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、逆位、または短縮、あるいは重要な残基もしくは重量な領域内での置換、挿入、逆位、または欠失が含まれる。
機能に不可欠なアミノ酸は、当該分野で公知の方法、例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発(Cunningham, B.およびWells, J., 1989. Science, 244:1081-1085)によって同定され得る。後者の手順により、分子中のそれぞれの残基に単一のアラニン変異が導入される。得られる変異分子は、その後、インビトロで生物学的活性について試験される。ポリペプチド活性に重要な部位は、構造分析によって、例えば、結晶解析、核磁気共鳴、または光親和性標識(Smith, L.ら, 1992. J. Mol. Biol., 244:899-904;de Vos, A.ら, 1992. Science, 255:306-312によっても決定され得る。
単離されたポリペプチドは、それを自然界において発現する細胞から精製され得るか、それを発現するように変化させられている細胞(組み換え体)から精製され得るか、または公知のタンパク質合成方法を使用して合成され得る。ある態様では、ポリペプチドは、組み換えDNA技術によって生産される。例えば、ポリペプチドをコードする核酸分子は発現ベクターにクローニングされ、発現ベクターが宿主細胞に導入され、ポリペプチドが宿主細胞中で発現させられる。その後、ポリペプチドは標準的なタンパク質精製技術を使用して適切な精製図式によって細胞から単離され得る。
一般的には、本発明のポリペプチドは、SDS-PAGEゲル上で、または当該分野で認識されている方法を使用する分子篩ゲル濾過カラム上で、分子量マーカーとして使用され得る。本発明のポリペプチドは、抗体を惹起させるため、または免疫応答を誘発するために使用され得る。ポリペプチドはまた、生物学的な液体中のそれに結合するポリペプチドまたは分子(例えば、受容体またはリガンド)のレベルを定量的に決定するためのアッセイにおいて、試薬、例えば、標識試薬としても使用され得る。ポリペプチドは、細胞または組織についてのマーカーとしても使用され得、ここで対応するポリペプチドは、構成的に、組織の分化の間にまたは疾患状態においてのいずれかで優先的に発現される。ポリペプチドは、対応する結合パートナー、例えば、受容体またはリガンドを、例えば、相互作用捕捉アッセイにおいて単離するために、および結合相互作用のペプチドまたは低分子アンタゴニストまたはアゴニストをスクリーニングするために、使用され得る。
本発明の抗体
遺伝子産物の1つの形態に特異的に結合するが、他の形態の遺伝子産物には結合しない、ポリクローナルおよび/またはモノクローナル抗体もまた、提供される。多型部位(単数または複数)を含む変異体または対照遺伝子産物のいずれかの一部に結合する抗体もまた、提供される。本発明により、配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは変異体BMP2ポリペプチドに対する抗体が提供される。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合は、免疫グロブリン分子を意味し、免疫グロブリン分子、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子の免疫学的に活性な部分をいう。本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子は、そのポリペプチドまたはその断片に結合するが、試料、例えば、自然な状態で上記ポリペプチドを含む生物学的試料中の他の分子には実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的活性のある部分の例として、ペプシンのような酵素で抗体を処理することによって作成することができる、F(ab)およびF(ab')2断片が挙げられる。本発明により、本発明のポリペプチドに結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が提供される。用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中で使用される場合は、本発明のポリペプチドの特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の1種のみを含む、抗体分子の集団をいう。したがって、モノクローナル抗体組成物は、通常は、それと免疫反応する本発明の特定のポリペプチドについて、単一の結合親和性を提示する。
遺伝子産物の1つの形態に特異的に結合するが、他の形態の遺伝子産物には結合しない、ポリクローナルおよび/またはモノクローナル抗体もまた、提供される。多型部位(単数または複数)を含む変異体または対照遺伝子産物のいずれかの一部に結合する抗体もまた、提供される。本発明により、配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは変異体BMP2ポリペプチドに対する抗体が提供される。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合は、免疫グロブリン分子を意味し、免疫グロブリン分子、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子の免疫学的に活性な部分をいう。本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子は、そのポリペプチドまたはその断片に結合するが、試料、例えば、自然な状態で上記ポリペプチドを含む生物学的試料中の他の分子には実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的活性のある部分の例として、ペプシンのような酵素で抗体を処理することによって作成することができる、F(ab)およびF(ab')2断片が挙げられる。本発明により、本発明のポリペプチドに結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が提供される。用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中で使用される場合は、本発明のポリペプチドの特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の1種のみを含む、抗体分子の集団をいう。したがって、モノクローナル抗体組成物は、通常は、それと免疫反応する本発明の特定のポリペプチドについて、単一の結合親和性を提示する。
ポリクローナル抗体は、所望される免疫原、例えば、本発明のポリペプチドまたはその断片で適切な被験体を免疫化することによって、上記のように調製され得る。免疫化された被験体の抗体力価は、標準的な技術によって、例えば、固定されたポリペプチドを使用する酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて、経時的にモニターされ得る。所望される場合は、ポリペプチドに対する抗体分子が哺乳動物から(例えば、血液から)単離され得、周知の技術、例えば、IgG画分を得るためのプロテインAクロマトグラフィーによってさらに精製され得る。免疫化後、適切な時間(例えば、抗体力価が最大である時)に、抗体を生産する細胞を被験体から得ることができ、これは標準的な技術、例えば、ハイブリドーマ技術(Kohler, G.およびMilstein, C., 1975. Nature, 256:495-497)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, D.ら, 1983. Immunol. Today, 4:72)、EBV-ハイブリドーマ技術(Coleら, 1985. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp77-96)、またはトリオーマ技術によって、モノクローナル抗体を調製するために使用され得る。
ハイブリドーマを生産するための技術は周知である(一般的には、Current Protocols in Immunology(1994)Coliganら,(編)John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照のこと)。簡潔には、不死化細胞(通常は、骨髄腫細胞)が、上記のように免疫原で免疫化された哺乳動物に由来するリンパ球(通常は、脾臓細胞)に融合させられ、得られるハイブリドーマ細胞の培養上清が、本発明のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングされる。
リンパ球を融合させるために使用される多くの周知のプロトコールのいずれかと不死化細胞が、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を作製するために利用され得る(例えば、Current Protocols in Immunology, 前出;Galfre, G.ら, 1977. Nature, 266:550-552; Kenneth, R., Monoclonal Antibodies A New Dimension In Biological Analysis, Plenum Publishing Corp., New York, New York(1980);およびLerner, E. 1981. Yale J. Biol. Med., 54:387-402を参照のこと)。さらに、それらもまた有用である、このような方法の多くのバリエーションが存在することは、当業者によって理解されるであろう。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代わりに、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、組み換えの組み合わせ免疫グロブリンライブラリー(例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー)を上記ポリペプチドを用いてスクリーニングして、上記ポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することによって、同定され、単離され得る。ファージディスプレイライブラリーを作成し、スクリーニングするためのキットは市販されている(例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, カタログ番号27-9400-01;およびStratagene SurfZAP(登録商標)Phage Display Kit, カタログ番号240,612)。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを作成およびスクリーニングすることにおける使用に特に適している方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号;PCT国際公開番号WO92/18619;PCT国際公開番号WO91/17271;PCT国際公開番号WO92/20791;PCT国際公開番号WO92/15679;PCT国際公開番号WO93/01288;PCT国際公開番号WO92/01047;PCT国際公開番号WO92/09690;PCT国際公開番号WO90/02809;Fuchs, P.ら, 1991. Biotechnology (NY), 9:1369-1372;Hay, B.ら, 1992. Hum. Antibodies Hibridomas, 3:81-85;Huse, W.ら, 1989. Science, 246:1275-1281;Griffiths, A.ら, 1993. EMBO J., 12:725-734に見ることができる。
さらに、ヒト部分およびヒト以外の両方の部分を含む、キメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体のような組み換え抗体、(これは、標準的な組み換えDNA技術を使用して作成され得る)が、本発明の範囲に含まれる。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組み換えDNA技術によって生産され得る。
一般的には、本発明の抗体(例えば、モノクローナル抗体)は、ポリペプチドの発現の量およびパターンを評価するために、ポリペプチドを検出する(例えば、細胞溶解物、細胞上清、または組織試料中で)ために使用され得る。抗体は、例えば、所定の処置レジュメの有効性を決定するために、臨床試験手順の一部として組織中のタンパク質濃度をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、検出可能な物質に対する抗体の結合によって容易にすることができる。検出可能な物質の例として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生体発光物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチン、およびアビジン/ビオチンが挙げられる。適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、またはフィコエリスリンが挙げられる。発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる;生体発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、適切な放射活性物質の例としては、125I、131I、35S、32P、33P、14C、または3Hが挙げられる。
本発明は、以下の限定的ではない実施例によってさらに記載される。本明細書中で引用される全ての刊行物の教示は、それらの全体が引用により本明細書中に援用される。
BMP2ハプロタイプの同定
骨粗鬆症に関連する、BMP2核酸配列にわたるハプロタイプを同定した。
骨粗鬆症に関連する、BMP2核酸配列にわたるハプロタイプを同定した。
「ハプロタイプI」、「ハプロタイプII」、「ハプロタイプa」、「ハプロタイプb」、「ハプロタイプc」および「ハプロタイプd」を、下に表1において記す。各ハプロタイプは、1つ以上の多型部位における対立遺伝子を含む(ハプロタイプIは4つのSNPおよび1つのマイクロサテライトを含み;ハプロタイプIIは3つのSNPおよび2つのマイクロサテライトを含み;ハプロタイプaは2つのSNPを含み;ハプロタイプbは3つのSNPを含み;ハプロタイプcは3つのSNPを含み;かつハプロタイプdは3つのSNPを含む)。
実際のハプロタイプは、表1に挙げられるマーカーを含む。
対立遺伝子番号:SNP対立遺伝子に対して、A=0、C=1、G=2、T=3;マイクロサテライト対立遺伝子に対して:CEPH試料1347-02(CEPH genomics repository)が参照として用いられ、この試料中の各マイクロサテライトの低いほうの対立遺伝子(the lower allele)を0に設定し、他の試料中の他の全ての対立遺伝子は、この参照に関して番号を付ける。したがって、CEPH試料1347-02において対立遺伝子1は低いほうの対立遺伝子よりも1bp長く、CEPH試料1347-02において対立遺伝子2は低いほうの対立遺伝子よりも2bp長く、CEPH試料1347-02において対立遺伝子3は低いほうの対立遺伝子よりも3bp長く、CEPH試料1347-02において対立遺伝子4は低いほうの対立遺伝子よりも4bp長く、CEPH試料1347-02において対立遺伝子-1は低いほうの対立遺伝子よりも1bp短く、CEPH試料1347-02において対立遺伝子-2は低いほうの対立遺伝子よりも2bp短い、等。
ハプロタイプ解析
ハプロタイプは上述のように同定し、ハプロタイプ解析は、他で記載されているように(Stefansson, H.ら, 2002, Am. J. Hum. Genet., 71: 877-92)行った。
ハプロタイプは上述のように同定し、ハプロタイプ解析は、他で記載されているように(Stefansson, H.ら, 2002, Am. J. Hum. Genet., 71: 877-92)行った。
骨粗鬆症の表現型および対照試料
ハプロタイプ解析において、連鎖解析に用いた表現型および他の骨粗鬆症関連表現型を含むいくつかの種々の骨粗鬆症表現型を用いた。種々の表現型とハプロタイプa、bおよびcとの間の関係を図1および図3に示す。ハプロタイプIおよびIIを図2に示す。
ハプロタイプ解析において、連鎖解析に用いた表現型および他の骨粗鬆症関連表現型を含むいくつかの種々の骨粗鬆症表現型を用いた。種々の表現型とハプロタイプa、bおよびcとの間の関係を図1および図3に示す。ハプロタイプIおよびIIを図2に示す。
関連性解析のために、連鎖解析のために集められた物質、および-1 SDより低いZ値を有する全ての散発性の個体(sporadic individuals)を用いた。対照群は、一般集団由来の無作為に集めた2つの群を含み、一方の群はBMD測定および質問事項情報を用い、もう一方の群は医療情報を用いなかった。これらの群は、対照に基づいて無作為に集められた、5つの減数***事象の内に関連のない集団として働き;両方の群におけるメンバーの総数は1272であった。
全ての参加者、患者および親類のBMDを、前後方向撮影における腰椎(L2-L4)ならびに全股関節(大腿の近位)および全身における二重エネルギーX線吸光光度分析法を用いて測定した(QDR 4500A, Hologic, Waltham, MA)。BMD測定の時に体重および身長を測定した。全ての参加者は、その病歴、月経期間、現在および過去の薬物療法(ホルモン補充療法(HRT)を含む)ならびに全ての骨折および外傷の前歴に関する詳細な質問事項を完了した。
本発明は、その好ましい態様に関して具体的に示され記載されているが、形式および詳細における種々の変更が、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、その中で行われ得ることが、当業者に理解されるであろう。
【配列表】
Claims (38)
- ハプロタイプI、ハプロタイプII、ハプロタイプa、ハプロタイプb、ハプロタイプc、ハプロタイプdおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるハプロタイプを含む少なくとも1つのリスクのあるハプロタイプの有無を検出する工程を含み、ここでハプロタイプの存在が骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の指標である、個体における骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法。
- 試料中の第一の核酸分子の存在を分析するための方法であって、前記試料を、請求項1記載のハプロタイプを含む第二の核酸分子と接触させる工程を含む方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が個体由来の核酸の酵素的増幅を含む、請求項1記載の方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が電気泳動解析をさらに含む、請求項3記載の方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が制限酵素断片長多型解析をさらに含む、請求項1記載の方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が配列解析を含む、請求項1記載の方法。
- ハプロタイプIを含む少なくとも1つのリスクのあるハプロタイプの有無を検出する工程を含み、ここでハプロタイプの存在が骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の指標である、個体における骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法。
- 試料中の第一の核酸分子の存在を分析するための方法であって、前記試料を、請求項7記載のハプロタイプを含む第二の核酸分子と接触させる工程を含む方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が個体由来の核酸の酵素的増幅を含む、請求項7記載の方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が電気泳動解析をさらに含む、請求項9記載の方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が制限酵素断片長多型解析を含む、請求項7記載の方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が配列解析を含む、請求項7記載の方法。
- ハプロタイプIIを含む少なくとも1つのリスクのあるハプロタイプの有無を検出する工程を含み、ここでハプロタイプの存在が骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の指標となる、個体における骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法。
- 試料中の第一の核酸分子の存在を分析するための方法であって、前記試料を、請求項13記載のハプロタイプを含む第二の核酸分子と接触させる工程を含む方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が個体由来の核酸の酵素的増幅を含む、請求項13記載の方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が電気泳動解析をさらに含む、請求項15記載の方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が制限酵素断片長多型解析を含む、請求項13記載の方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が配列解析を含む、請求項13記載の方法。
- 骨粗鬆症と関連のある少なくとも1つのハプロタイプの存在に関して試料を分析するためのキットであって、ここでハプロタイプが2つ以上の特定の対立遺伝子を含み、かつここで前記キットが1つ以上の特定の対立遺伝子の有無を検出することができる1つ以上の核酸を含み、それによって試料中のハプロタイプの有無を示すキット。
- 前記核酸が、ハプロタイプの特定の対立遺伝子を少なくとも1つ含む領域に完全に相補的な連続したヌクレオチド配列を少なくとも1つ含む、請求項19記載のキット。
- ハプロタイプが2つ以上の特定の対立遺伝子を含み、別々の容器に
a)ハプロタイプの1つ以上の特定の対立遺伝子を検出できる1つ以上の標識核酸;および
b)前記標識の検出のための試薬
を含む、骨粗鬆症に関連する少なくとも1つのハプロタイプの存在に関して試料を分析するための試薬キット。 - 標識核酸が、ハプロタイプの特定の対立遺伝子を少なくとも1つ含む領域に完全に相補的な連続したヌクレオチド配列を少なくとも1つ含む、請求項21記載の試薬キット。
- 骨粗鬆症に関連のある少なくとも1つのハプロタイプの存在に関して試料を分析するための試薬キットであって、ここでハプロタイプが2つ以上の特定の対立遺伝子を含み、前記キットが、BMP2のヌクレオチド配列の一部に対して少なくとも部分的に相補的な少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む1つ以上の核酸を含み、かつ核酸が、ハプロタイプの2つ以上の特定の対立遺伝子を検出することができるプライマー伸長反応のためのプライマーとして作用できる試薬キット。
- 骨粗鬆症に対する罹患性が高くない個体に比べて骨粗鬆症に対する罹患性が高い個体により頻繁に存在する、BMP2に関連のある少なくとも1つのリスクのあるハプロタイプに関してスクリーニングする工程を含み、ここでリスクのあるハプロタイプがリスクを有意に上昇させる、個体における骨粗鬆症に対する罹患性の診断および同定のための方法。
- 有意な上昇が少なくとも約20%である、請求項24記載の方法。
- 有意な上昇が少なくとも約1.2のオッズ比として同定される請求項25記載の方法。
- TSC0898956、B420、B8463、D20S846、TSC0191642、P4337、D20S892、B5048、B9082、D20S59、B7111/rs235764、B12845/rs15705、P9313、B10631、D35548、rs1116867、TSC0278787、D35548およびTSC0271643からなる群から選択される2つ以上の対立遺伝子を含む少なくとも1つのハプロタイプの個体における有無を決定する工程を含み、ここでハプロタイプの存在が骨粗鬆症に対する罹患性の指標となる、個体における骨粗鬆症に対する罹患性を診断するための方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が個体由来の核酸の酵素的増幅を含む、請求項27記載の方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が電気泳動解析をさらに含む、請求項28記載の方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が制限酵素断片長多型解析をさらに含む、請求項27記載の方法。
- ハプロタイプの有無を決定する工程が配列解析をさらに含む、請求項27記載の方法。
- 核酸試料を個体から得る工程;およびTSC0898956、B420、B8463、D20S846、TSC0191642、P4337、D20S892、B5048、B9082、D20S59、B7111/rs235764、B12845/rs15705、P9313、B10631、D35548、rs1116867、TSC0278787、D35548およびTSC0271643からなる群から選択される2つ以上の対立遺伝子を含む少なくとも1つのハプロタイプの有無に関して核酸試料を解析する工程を含み、ここでハプロタイプの存在が骨粗鬆症に対する罹患性の指標となる、個体における骨粗鬆症に対する罹患性を診断するための方法。
- ハプロタイプが、TSC0898956、B420、B8463、D20S846およびTSC0191642からなる群から選択される2つ以上の対立遺伝子を含む、請求項32記載の方法。
- ハプロタイプが、P4337、D20S892、B5048、B9082およびD20S59からなる群から選択される2つ以上の対立遺伝子を含む、請求項32記載の方法。
- ハプロタイプが、B7111/rs235764またはB12845/rs15705を含む、請求項32記載の方法。
- ハプロタイプが、P9313、B10631およびD35548からなる群から選択される2つ以上の対立遺伝子を含む、請求項32記載の方法。
- ハプロタイプが、rs1116867、TSC0278787およびD35548からなる群から選択される2つ以上の対立遺伝子を含む、請求項32記載の方法。
- ハプロタイプが、TSC0271643、P9313およびB7111からなる群から選択される2つ以上の対立遺伝子を含む、請求項32記載の方法。
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