JP2006516112A - 眼の遺伝子治療 - Google Patents
眼の遺伝子治療 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006516112A JP2006516112A JP2004532124A JP2004532124A JP2006516112A JP 2006516112 A JP2006516112 A JP 2006516112A JP 2004532124 A JP2004532124 A JP 2004532124A JP 2004532124 A JP2004532124 A JP 2004532124A JP 2006516112 A JP2006516112 A JP 2006516112A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- endostatin
- individual
- vector
- administered
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
- A61K9/0051—Ocular inserts, ocular implants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
- A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
- A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
本発明は、遺伝子治療を用いて網膜の障害を処置するための方法に関する。本発明はまた、網膜障害を処置するために用いられ得るベクター(より詳細には、レトロウイルスベクター)に関する。
本発明は、網膜障害に罹患した個体における、この個体の眼組織中のインビボでのエンドスタチン濃度の、網膜障害を処置するために有効な量までの増加をもたらす工程を包含する、個体における網膜障害の処置のための方法を提供する。
エンドスタチンは、腫瘍新脈管形成および腫瘍増殖を阻害することが見出されている、XVIII型コラーゲンの切断産物である。インターフェロンα2aもまた、腫瘍新脈管形成をブロックして、血管腫の後退を引き起こすが、脈絡膜血管新生(CNV)に対する効果は有さない。本発明者らは、驚くべきことに、そして予想外にも、個体の眼組織中のインビボでのエンドスタチン濃度の増加が、網膜障害(例えば、網膜剥離および網膜水腫(黄斑水腫が挙げられる))を処置し得ることを見出した。
ヒト骨髄細胞は、針吸引によって後部腸骨稜から入手され得る(例えば、Kodoら,1984,J.Clin.Invest.73:1377−1384を参照のこと)。HSCは、高度に富化され得るかまたは実質的に純粋な形態にされ得る。この富化は、長期培養の前、間または後に達成され得、そして当該分野で公知の任意の技術によって実施され得る。骨髄細胞の長期培養物は、例えば、改変されたDexter細胞培養技術(Dexterら,1977,J.Cell Physiol.91:335)またはWitlock−Witte培養技術(WitlockおよびWitte,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:3608−3612)を用いて確立および維持され得る。
マウスエンドスタチン(mEndo)cDNAを、プライマー5’−ACT GGT GAC GCG GCC CAT ACT CAT CAG GAC TTT CAG CC−3’(配列番号6)および5’−AAG GGC TAT CGA TCT AGC TGG CAG AGG CCT AT−3’(配列番号7)を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、Genome Systems(St.Louis,MO)からのマウスXVIII型コラーゲンクローンID 748987から増幅する(598bpのF1フラグメント)。このマウス免疫グロブリンk鎖リーダー配列(Ig−kリーダー)を、プライマー5’−CAC TGC TTA CTG GCT TAT CG−3’(配列番号8)および5’−CTG ATG AGT ATG GGC CGC GTC ACC AGT GG−3’(配列番号9)(147bpのF2フラグメント)を用いてpSecTag2(InVitrogen,Carlsbad,CA)からPCR増幅する。PCRを、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene,La Jolla,CA)を用いて、以下の条件下で35サイクル実施する:95℃のホットスタートを3分間、95℃の変性を1分間、55℃のアニーリングを1分間、および72℃の伸長を2分間。これらのDNAフラグメントをゲル精製する。sig−mEndoキメラDNA(718bp)を、上記で作製したF1 DNAフラグメントおよびF2 DNAフラグメントを、マウスIg−kリーダー配列およびマウスエンドスタチンcDNAをアセンブリするためのテンプレートとして用いて、PCRスプライスオーバーラップ伸長によって生成する。PCRを、プライマー5’−CAC TGC TTA CTG GCT TAT CG−3’(配列番号8)および5’−AAG GGC TAT CGA TCT AGC TGG CAG AGG CCT AT−3’(配列番号10)を用い、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて実施する。PCRを、以下の条件下で35サイクル行う:95℃のホットスタートを3分間、95℃の変性を1分間、60℃のアニーリングを1分間、および72℃の伸長を2分間。
マウスcDNAを、急速凍結した2週齡のC57BU6マウス(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)の肝臓からRNAを単離(RNeasy Miniキット;Qiagen,Valencia,CA)し、そしてモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD)によって処理することによって入手する。マウスエンドスタチン遺伝子を、センスプライマー5’−GATCTCTAGACCACCATGCATACTCATCAGGACTT−3’(配列番号11)およびアンチセンスプライマー5’−ACTGGAGAAAGAGGTTTATCTAGCTACTAG−3’(配列番号12)を用いたPCRによってTAクローニングベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA)中にクローニングする。18アミノ酸のE3/19Kシグナル配列MRYMILGLLALAAVCSAA(配列番号13)を、センスプライマー5’−GATCTCTAGACCACCATGAGGTACATGATTTTAGGCTTGCTCGCCCTTGCGGCAGTCTGCAGCGCGGCCCATACTCATACTCATCAGGACTTTCAG−3’(配列番号14)およびアンチセンスプライマー(上記の通り)を用いたPCRによってエンドスタチン配列から上流に挿入する。プラスミドDNAをDH5細胞(Life Technologies)中で増幅し、そしてシグナル配列−マウスエンドスタチン(ss−mEndo)配列を確認する(ABI Prism310自動シークエンサー;PE Applied Biosystems,Foster City,CA)。
BALB/cマウス由来の肝臓組織をホモジネートし、そして総RNAを抽出する(RNeasyキット;Qiagen,Chatsworth,CA)。第1鎖cDNAを、オリゴ(dT)プライマー(SuperScriptII;Life Technologies,Grand Island,NY)を用いた逆転写−PCRによって増幅する。全長マウスエンドスタチンcDNAを、pBluescript(Stratagene)へのサブクローニングのために、PCR(ClaIリンカーを有するセンスプライマー:5’−ATCGATCATACTCATCAGGACTTTCAGCC−3’(配列番号15);NotIリンカーを有するアンチセンスプライマー:5’−GCGGCCGCCTATTTGGAGAAAGAGGTCAT−3’(配列番号16))によって増幅する。ラットインスリンリーダー配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを、エンドスタチン遺伝子の前にクローニングする。配列を確認した後、このラットインスリンリーダー−エンドスタチンcDNAを、Bautista,D.S.ら(1991)Virology 182,578−596によって記載される通り、組換えアデノウイルスのレスキューのために組換えアデノウイルス(ADV)シャトルベクターpADV.hEF1−α(ヒト伸長因子1−α)中にクローングする。ウイルス粒子を吸収(A260)によって測定し、そしてプラーク形成単位を、293細胞において標準的なアガロース重層プラークアッセイによって決定する。ADV.hVEGF165の構築のためのこのcDNAを、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)から単離したRNAの逆転写PCRによって入手する。JC細胞株およびLLC細胞株を、American Type Culture Collectionから入手する。細胞をRPMI培地1640(JC)およびDMEM(LLC)中で培養する。全ての培地に、10% FBS、0.2mMグルタミンおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充する。HUVECを、室温にて20分間のIV型コラゲナーゼ(Sigma)灌流(ハンクス平衡塩溶液中0.2%)によって臍帯から単離する。次いで、細胞を、20% FBS、0.2mMグルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1ng/ml bFGFを補充したM199培地中で、コラーゲン(PBS中1%)でコーティングしたプレートで培養する。
ウイルスベクターを、成体C57BU6マウスの尾静脈に注射する。マウスに、Av3mEndo(n=18)もしくはAv3mNull(n=17)のいずれかを2×1011個の粒子、またはAv3CsmEndoもしくはAv3CsNullのいずれかを6×1010個の粒子を注射する。ウイルスベクター注射の4日後、これらのマウスに塩酸ケタミン(100mg/kg体重)を麻酔し、1%トロピカミドで瞳孔を拡大させ、そしてクリプトンレーザー光凝固を用いて、TobeらAm.J.Pathol.153,1641−1646(1998)によって以前に記載された通りに各マウスの各々の眼の3箇所でブルッフ膜を破断させる。手短に述べると、クリプトンレーザー光凝固(100μmのスポットサイズ、0.1秒間の持続時間、120mW)を、Coherent Model 920 Photocoagulatorの細隙灯送達系およびコンタクトレンズとして携帯型カバースライドを用いて送達する。熱傷を、視神経から2〜3ディスク直径にて、9時、12時および3時の位置において行う。ブルッフ膜の破断を示す、レーザーの際の気化泡の生成は、CNVを得る際に重要な因子であり、それゆえ、泡が生成された熱傷のみをこの研究に含める。泡は、Av3mEndoを注射したマウスにおける1つの熱傷、およびAv3mNullを注射したマウスにおける3つの熱傷については生成されない。Av3mEndoを注射したマウスの1つの眼の角膜は、角膜瘢痕を有し、このことが、レーザーの使用を妨げ、それゆえ、この眼を使用しない。
レーザー処置の2週間後、CNV損傷のサイズを、2つの異なる技術(Seoら,Amer.J.Pathol.154,1743−1753(1999)によって以前に報告された通りの連続切片についてのCNVの積分面積測定値またはEdelmanら,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.41,S834(2000)によって記載される通りの脈絡膜の平坦な積載のCNVの面積測定値)のうちの1つによって評価する。Av3mEndoを注射したマウスについては、10匹のマウスを、平坦積載技術によって評価し、そして8匹を連続切片によって評価し、そしてAv3mNullを注射したマウスについては、10匹のマウスを平坦積載技術によって評価し、そして7匹を連続切片によって評価する。
アデノウイルスベクターの全身投与が眼の有意な形質導入をもたらすか否かを決定するために、一群のマウスにAv3nBgを注射する。このベクターは、RSVプロモーターからβ−ガラクトシダーゼを発現する。5日後、これらのマウスを屠殺し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性を、化学発光アッセイを用いて眼および肝臓のホモジネートにおいて測定する。肝臓および眼を、マウスからの取り出し後、急速凍結する。アッセイの当日に、肝臓または眼を溶解緩衝液(40:1 v/v 1× Reporter Lysis Buffer(Promega,Madison Wl):Protease Inhibitor Cocktail(Sigma,St Louis MO))中でホモジネートする。タンパク質含有量を、Bradford Assay(Biorad,Hercules CA)によって決定する。β−ガラクトシダーゼ活性を、Galacto−Light系(Tropix,Bedford MA)を用いて決定する。
マウスに、Av3mEndo(n=10)もしくはAv3mNull(n=9)を2×10粒子、尾静脈に注射するか、またはこれらにAv3CsmEndo(n=11)もしくはAv3CsmNull(n=11)を6×1010粒子注射する。注射なしのコントロール群(n=11)もまた含める。注射の4日後、ブルッフ膜を、各々のマウスの各眼において3箇所、レーザーで破断する。注射の7日後、血液を各マウスの尾静脈から採血し、そして血清を、ELISAのために−80℃にて保存する。注射の18日後およびレーザーの14日後、CNVの面積を、脈絡膜平坦積載物について上記の通り評価する。
ヒトエンドスタチンcDNAを、ヒトα1(XVIII)コラーゲンのcDNAからPCR増幅する。ヒト肝臓cDNAを、ヒト肝臓ポルA RNA(Clonetech,Palo Alto,CA)から、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって作製する。逆転写を、プライマー5’−TTT TTT TTT CAG TGT AAA AGG TC−3’(配列番号17)を用い、Perkin Elmer RT−PCRキット(Perkin Elmer Applied Biosystems,Foster City,CA)を用いて、以下の条件で1サイクル実施する:室温にて10分間、42℃で逆転写を3分間、99℃で変性を5分間、5℃での冷却を5分間、そしてcDNAをエタノール沈殿して再懸濁するまでは、4℃で保つ。790bpのヒトエンドスタチンcDNAフラグメントを、プライマー5’−CAG ATG ACA TCC TGG CCA G−3’(配列番号18)および5’−CTA TAC AGG AAA GTA TGG CAG C−3’(配列番号19)を用いて、この調製されたcDNAからPCR増幅する。PCRを以下の条件で35サイクル実施する:95℃でのホットスタートを3分間、80℃にて3分間、続いてPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene,La Jolla,CA)の添加、95℃での変性を1分間、55℃でのアニーリングを1分間、および72℃での伸長を3分間。790bpのヒトエンドスタチンcDNAフラグメントをゲル精製し、そして58℃のアニーリング温度であること以外は記載の通りに再度増幅する。790bpのヒトエンドスタチンcDNAフラグメントをゲル精製し、そしてPCR−Script Cloning Kits(Stratagene)を製造業者の手順に従って用いてPCR−Script Amp SK+中にクローニングして、pcrhendIを作製する。pcrhendIプラスミドのヒトエンドスタチンcDNA領域を、Genetic Therapy,Inc.Gaithersburg,MDにおけるGene Therapy Core Technologies Molecular Core Laboratoryによって直接的配列決定分析を用いて確認する。
eGFPをコードするウシ免疫不全ウイルス(BIV)ベクターを、3成分系(その開示全体が本明細書中に参考として援用される、公開された国際特許出願番号W00144458に記載される)から作製する。移入ベクターBIVエンドスタチンを、Takahashi,K.ら,Hum.Gene Ther.13,1305−1316(2002)に従って、MND U3プロモーターの下でeGFPをコードするBIVに基づく移入ベクター構築物であるpBSV4MGpptGAGから誘導した。このeGFPコード配列を、マウスエンドスタチン(mEndo)で置換した。具体的には、eGFPを親プラスミドpBSV4MGpptGAGから欠失させるために、eGFPおよびいくつかの隣接配列をPCRによって増幅した。用いたプライマーは以下であった:eGFP1FOR5’−GCGCATGTCGACAGAATATGGGCCAAAC−3’(これは、PCR産物の5’末端にSalI部位を組み込む)およびeGFP1REV 5’−GCGCTACTGCAGAGCTAATGAGCTACAC−3’(これは、PCR産物の3’末端にPstI部位を組み込む)。このフラグメントをSalIおよびPstIで切断し、そしてpBSII(KS+)と連結して、pBS2eGFPを作製した。pBSII(KS+)もまた、SalIおよびPstIで予め消化した。ExSite PCR−Based Site−Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,LaJolla,CA)を用いて、eGFPをpBS2eGFPから欠失させた。eGFP遺伝子の外側の部分に隣接して外側に向き、従ってeGFP以外の隣接配列およびプラスミドの全体を含む全体を増幅するPCRプライマーを設計した。用いたプライマーは以下であった:DELeGFP1FOR:5’−CCGGCTAGCTTAAGGGTGGCGACCGGT−3’(これは、NheI制限部位およびAflII制限部位を付加した)およびDELeGFPIREV:5’−GCTTCGAACGCGTAGCGGCCAACCCTC−3’(これは、BstBI制限部位およびMluI制限部位を付加した)。このアンプリコンを、製造業者の指示に従って処理し、そして連結して、eGFPが欠失しているが、親プラスミド由来の隣接配列が残っているpBS2deleGFPを形成した。このストラテジーはまた、4つの新たな制限部位を中間部に作製した。このフラグメントを配列決定して、変異が導入されていないことを確認した。mEndo遺伝子挿入物をアデノウイルスシャトルプラスミドpAVmEndolxrから、Mori,K.ら,Amer.J.Pathol.159,313−320(2001)に従って調製した。このプラスミドをNheIおよびClaIで消化して、mEndoフラグメントを遊離させた。このフラグメントを、NheIおよびBstBI(ClaIと適合性の末端)で予め消化したpBS2deleGFPと連結して、pBS2deleGFPmEndoを作製した。ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)を、MluI部位においてmEndoの下流に挿入して、pBS2deleGFPmEndoPREを作製した。最後に、このプラスミドpBS2deleGFPmEndoPREをBsu36IおよびBbvClによって消化して、mEndoコード配列および元々のeGFP隣接配列を放出し、そしてこのフラグメントを、Bsu36IおよびBbvCIで予め消化したpBS4MGpptGAGと連結して、pBvMNDmEndoPREを作製した。ヌルBIVベクターであるpBvMNDPREもまた作製し、そしてネガティブコントロールベクターとして供した。PBvMNDPREは、mEndoコード配列が存在しないこと以外、pBvMNDmEndPREと同一であった。
アデノウイルスベクターを用いた研究のために、成体マウスに、一方の眼にはAGVC7mEndoおよびAGVas521の1:1混合物を6×107粒子、他方の眼にはAGVnullを6×107粒子、網膜下注射によって与えた。レンチウイルスベクターを用いた研究については、これらのマウスは、5×106形質導入単位(TU)のBIVエンドスタチンを一方の眼に、そして5×106TUのBIVNullを他方の眼に受け取った。引っ張ったガラスマイクロピペットを、足踏みスイッチを踏んだ際に1μlのビヒクルを送達するために較正した。解剖顕微鏡における集光レンズ系(condensing lens system)およびコンタクトレンズを用いて注射を行った。このことは、注射の間の網膜の可視化を可能にした。これらのマウスを麻酔し、瞳孔を拡大させ、そして解剖顕微鏡下で、マイクロピペットの尖らせた先端を、縁部の前の強膜を通して通過させ、そして網膜のすぐ上に配置した。足踏みスイッチを踏むことにより、注射流体のジェットを網膜に浸透させた。この技術は非常に無外傷性であり、直接的可視化は、小さな網膜剥離(小水胞)の出現により、この注射が成功したかの確認を可能にする。この小水胞は、サイズが極めて均一であり、そして網膜の半分よりわずかに少なく含まれていた。
アデノウイルスベクター送達系を用いたインビボでのエンドスタチンの調節された発現を、Xuら,Molecular Therapy;3:262(2001)によって記載された方法に従って達成する。タモキシフェン誘導性キメラ転写因子をコードするAGVベクターであるAGVas521および調節性エンドスタチン導入遺伝子をコードするAGVベクターであるAGVC7mEndoを、それぞれ、プラスミドpAGVas521およびpAGVC7mEndoから作製した。導入遺伝子発現カセット(以下を参照のこと)に加え、AGVプラスミドは、独特のPacI部位が隣接した左および右のITR(Ad5のパッケージングシグナル)およびReddy,P.S.ら,Molec.Ther.5,63−73(2002)による約25kbのヒトαシヌクレイン(synuclein)イントロン領域をDNA「スタッファー(stuffer)」として含む。プラスミドpAGVas521は、独特のジンクフィンガーDNA結合ドメイン、ヒトエストロゲンレセプターに基づく改変されたリガンド結合ドメイン、およびVP16由来のトランス活性化領域から構成され、CMVプロモーターによって駆動される、タモキシフェン誘導性キメラ転写因子を含む。pAGVas521を構築するために、キメラ転写因子発現カセットを、NruIおよびBamHIを用いた消化によってpAvCv−C7LBDから単離し、そしてpBLSV2中に挿入した。このプラスミドpBLSV2を、pBluescript(Strategene,La Jolla,CA)から誘導した。このプラスミドpBLSV2は、2つのマルチプルクローニングサイトポリリンカーを含む。得られたプラスミドpBLSV2as521をBspeIで消化し、そしてXmaIで消化したpGTI.24aPL2に連結して、pGTI24as521を作製した。pGTI24aPL2は、ヒトシヌクレインスタッファーDNAが隣接したマルチプルクローニング部位ポリリンカーを含む。次にpGTI24as521をPacIで消化して、プラスミド骨格を遊離させ、そしてPmeI−MluIで消化したpBV2と組み合わせ、Toietta,G.ら,Mol.Ther.5,204−210(2002)に従ってBJ5138 E.coliにおける相同組換えを用いて、pAGVas521を作製した。プラスミドpBV2は、26625bpのヒトシヌクレインスタッファーDNAを含む。
Ohno−Matsui,K.らAm.J.Pathol.160,711−719 (2002)によって作製された網膜におけるVEGFの誘導性発現を有する2系統の二重トランスジェニックマウスを本研究に用いた。これらの系統のうちの1つにおいて、内部光受容体レチノイド結合タンパク質(IRBP)プロモーターを、逆テトラサイクリントランスアクチベーター(rtTA)系と合わせて、光受容体におけるVEGFのドキシサイクリン誘導性発現を指向する。これらを、IRBP/rtTA−TRE/VEGFマウスという。第2系統の二重トランスジェニックマウスにおいて、IRBPプロモーターというよりはロドプシンプロモーターを逆テトラサイクリントランスアクチベーター系と合わせて、光受容体におけるVEGFのドキシサイクリン誘導性発現を指向する。これらを、rho/rtTA−TRE/VEGFマウスという。
眼に穿刺し、そして4%パラホルムアルデヒド/5%スクロース中に配置し、次いで0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)中で一晩、4℃にて1.5時間インキュベートする。次いで、眼をリンスし、そしてOCT中の0.1Mリン酸緩衝液/20%スクロースの2:1混合物において迅速に凍結する。10μmの凍結切片を乾燥し、そして冷4%パラホルムアルデヒド中で30分間事後固定した。リンス後、スライドを、6.25% H2O2含有冷メタノールで15分間ブロックし、次いででTris緩衝化生理食塩水(TBS)中の2%スキムミルクで室温にて30分間ブロックした。スライドを、2%乳汁/TBS中のマウスエンドスタチンに対するポリクローナルヤギgG(R & D Systems,Minneapolis,MN)(1.5μg/ml)中で室温にて1時間インキュベートした。0.1%乳汁/TBS中で10分間洗浄した後、スライドを、2%乳汁/TBS中の2μg/mlビオチン結合体化抗ヤギIgG(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)中で室温にて30分間インキュベートした。0.1%乳汁/TBS中で10分間洗浄した後、スライドを、ストレプトアビジン−ホスファターゼ(KirkegaardおよびPerry,Cabin John,MD)中で室温にて30分間インキュベートした。0.05M Tris HCl中での3回の5分間の洗浄後、スライドを、HistoMark Red(KirkegaardおよびPerry)を用いて発色させ、積載した。
成体二重トランスジェニックIRBP/rtTA−TRE/VEGFマウス(n=11)に、右眼にはAGVC7mEndoおよびAGVas521の1:1混合物を6×107粒子、そして左眼にはAGVNullを6×107粒子、網膜下注射によって与えた。翌日、マウスを、ヒマワリ油中5% DMSO中の500μgのタモキシフェンの毎日の腹腔内注射を開始し、そして3日後に、これらにそれらの飲料水中で2mg/mlのドキシサイクリンを与えた。ドキシサイクリンを開始してから3日後、網膜脈管透過性を、[3H]マンニトールを用いて測定した。手短に述べると、マウスに、1μCi/g体重の[3H]マンニトール(New England Nuclear,Boston,MA)の腹腔内注射を与えた。1時間後、マウスを屠殺し、そして眼を取り出した。角膜および水晶体を取り出し、そして網膜全体をアイカップから注意深く切開し、そして予め計量したシンチレーションバイアル中に配置した。胸腔を開け、そして左の上葉を取り出し、そして別の計量したシンチレーションバイアル中に配置した。左の背側切開部を作製し、そして腹腔に入ることなく腹膜後隙に入った。腎臓脈管を鉗子でとめ、そして左腎臓を取り出し、全ての脂肪を除去し、そして予め計量したシンチレーションバイアル中に配置した。全ての液体をバイアルから除去し、そして残りの小滴を20分間かけてエバポレートさせた。バイアルを計量し、そして組織の重量を記録した。1mlのNCSII可溶化溶液(Amersham,Chicago,IL)を各バイアルに添加し、そしてこれらのバイアルを50℃の水浴中で一晩インキュベートした。可溶化した組織を室温にし、そして50℃の水浴においてトルエン中の20%過酸化ベンゾイルで脱色した。これらのバイアルを室温にし、そして5mlのCytoscint ES(ICN,Aurora,OH)および30μlの氷酢酸を添加した。これらのバイアルを暗所で4℃にて数時間保存して、化学発光を除去した。Wallac 1409 Liquid Scintillation Counter(Gaithersburg,MD)を用いて放射能をカウントした。
成体rho/rtTA−TRE/VEGF二重トランスジェニックマウスに、右眼には1.5×106形質導入単位(TU)のBIVエンドスタチンを、そして左眼には1.5×106TUのBIVNullを網膜下注射によって与えた。ベクター注射の4週間後、マウスを、それらの飲料水中0.5mg/mlのドキシサイクリンを開始した。7日後、マウスに、12μl/g体重の1%フルオレセインナトリウム(Alcon,Fort Worth,Texas)の腹腔内注射を与え、そして1分後、インビボでの蛍光顕微鏡法を用いて各眼の写真を撮った。VEGF発現を開始してから7日後に、別のマウスを安楽死させ、そして網膜凍結切片を、各眼において同じ位置にある視神経に隣接する網膜の後ろ部分全体を通して切断した。これらの切片をGriffonia simplicifoliaレクチン、ヘマトキシリン、およびエオシンで染色した。BIVNullを注射した眼における網膜(FおよびH)は、BIVエンドスタチンを注射した眼における網膜(EおよびG)よりもずっと厚い。
成体rho/rtTA−TRE/VEGF二重トランスジェニックマウスに、右眼には1.5×106TUのBIVエンドスタチンを、そして左眼には1.5×106TUのBIVNullを網膜下注射によって与えた。ベクター注射の4週間後、マウスを、それらの飲料水中0.5mg/mlのドキシサイクリンについて開始した。ドキシサイクリンを開始してから7日後、マウスを安楽死させ、そして10μmの網膜凍結切片を、各眼において同じ位置にある視神経に隣接する網膜の後ろ部分全体を通して切断した。これらの切片を、ビオチン化Griffonia simplicifoliaレクチンB4(GSA,Vector Laboratories,Burlingame,CA)で染色した。このレクチンは、脈幹細胞22に選択的に結合する。スライドを、4℃にてメタノール/H2O2中で10分間インキュベートし、0.05M Tris緩衝化生理食塩水(pH7.6)(TBS)で洗浄し、そして10%正常ブタ血清中で30分間インキュベートした。スライドを、ビオチン化GSAとともに室温にて2時間インキュベートし、そして0.05M TBSでリンスした後、これらをペルオキシダーゼに結合したアビジン(Vector Laboratories)とともに室温いて45分間インキュベートした。これらのスライドをHistoMark Red(Kirkegaard and Perry)で発色させて、赤色反応産物を得て、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。網膜の厚さを、視神経の各縁部から300μmの部分での画像解析によって測定し、そして平均化して単一の実験値を得た。
3匹のrho/rtTA−TRE/VEGFマウスを用いて、VEGF誘発性網膜血管新生に対するエンドスタチンの効果を評価した。右眼での1.5×106TUのBIVエンドスタチン、そして左眼での1.5×106TUのBIVNullの網膜下注射の4週間後、マウスを、それらの飲料水中0.5mg/mlのドキシサイクリンについて開始した。ドキシサイクリンを開始してから7日後、マウスを安楽死させ、そして各眼を、虹彩の末梢縁部から180°離れた他の末梢縁部への切片(10μm切片)とした。切片を、Griffonia simplicifoliaレクチン(GSA)、ヘマトキシリン、およびエオシンで染色した。
11匹の成体rho/rtTA−TRE/VEGF二重トランスジェニックマウスに、右眼には1.5×106TUのBIVエンドスタチンを、そして左眼には1.5×106TUのBIVNullを網膜下注射によって与えた。ベクター注射の4週間後、マウスを、それらの飲料水中にて2mg/mlのドキシサイクリンについて開始した。4日後、マウスに麻酔し、瞳孔を拡大させ、そして全網膜剥離もしくは部分的網膜剥離が存在するかまたは剥離が存在しないかに注目する検眼鏡検査を各眼について、2人の独立した観察者によって実施した。
Claims (48)
- 網膜剥離または網膜水腫に罹患した個体における網膜剥離または網膜水腫の処置のための方法であって、以下の工程:
網膜剥離または網膜水腫に罹患した個体の眼組織中のエンドスタチンの量の、網膜剥離阻害有効量または網膜水腫阻害有効量への増加をもたらす工程
を包含する、方法。 - 前記エンドスタチンが、請求項1に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記エンドスタチンが、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドのポリペプチドフラグメント、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体、または配列番号1に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの改変体である、請求項1に記載の方法。
- 前記増加が、外因性エンドスタチンを前記個体に投与することによってもたらされる、請求項1に記載の方法。
- 前記増加が、エンドスタチンを前記個体内で産生させることによってもたらされる、請求項1に記載の方法。
- 前記増加が、エンドスタチンをコードする核酸を含む有効量のウイルスベクターを前記個体に投与することによってもたらされる、請求項5に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、およびレンチウイルスからなる群より選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項7に記載の方法。
- 前記増加が、前記個体内に、少なくとも1つのマイクロカプセルを移植することによってもたらされ、ここで、該マイクロカプセルが、エンドスタチンを分泌する細胞を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記マイクロカプセルが、アルギン酸塩を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記マイクロカプセルが、アルギン酸ナトリウムを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記マイクロカプセルが、アルギン酸カルシウムを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記マイクロカプセルが、ポリL−リジンを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記細胞が、外因性エンドスタチンをコードする核酸を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞が、内因性エンドスタチンコード遺伝子を過剰発現する、請求項9に記載の方法。
- 約2.5mg/kg/日と約20mg/kg/日との間のエンドスタチンが、前記個体に投与される、請求項4に記載の方法。
- 前記アデノウイルスベクターが、前記個体の血清中で1,000,000ng/mlまでのエンドスタチン濃度をもたらす、該個体によるエンドスタチンの発現を提供するに有効な量で投与される、請求項8に記載の方法。
- 前記アデノウイルスベクターが、前記個体の血清中で少なくとも約300ng/mlのエンドスタチン濃度をもたらす、該個体によるエンドスタチンの発現を提供するに有効な量で投与される、請求項8に記載の方法。
- 前記エンドスタチンが、前記個体の血清中で約300ng/ml〜約3000ng/mlのエンドスタチン濃度をもたらすに充分な量にて該個体中で発現される、請求項18に記載の方法。
- 前記エンドスタチンが、前記個体の血清中で約300ng/ml〜約1500ng/mlのエンドスタチン濃度をもたらすに充分な量にて該個体中で発現される、請求項19に記載の方法。
- 前記ベクターが、約108プラーク形成単位〜約1014プラーク形成単位の量で投与される、請求項6に記載の方法。
- 前記ベクターが、約108プラーク形成単位〜約1014プラーク形成単位の量で投与される、請求項8に記載の方法。
- マイクロカプセルが、前記個体の血清中で1,000,000ng/mlまでのエンドスタチン濃度をもたらす、前記細胞によるエンドスタチンの発現を提供するに有効な量で移植される、請求項9に記載の方法。
- マイクロカプセルが、前記個体の血清中で少なくとも約1,000,000ng/mlのエンドスタチン濃度をもたらす、該個体によるエンドスタチンの発現を提供するに有効な量で移植される、請求項8に記載の方法。
- 前記マイクロカプセルが、前記個体の血清中で約300ng/ml〜約1,000,000ng/mlのエンドスタチン濃度をもたらすに充分な量で該個体中に移植される、請求項18に記載の方法。
- マイクロカプセルが、前記個体の血清中で約300ng/ml〜約1500ng/mlのエンドスタチン濃度をもたらすに充分な量で該個体中に移植される、請求項19に記載の方法。
- エンドスタチンをコードする核酸が、配列番号2に示す配列を有する、請求項6に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、眼内に投与される、請求項6に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、網膜下に投与される、請求項28に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、硝子体内に投与される、請求項28に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項7に記載の方法。
- 前記レンチウイルスベクターが、前記個体の血清中で少なくとも約1,000,000ng/mlのエンドスタチン濃度をもたらす、該個体によるエンドスタチンの発現を提供するに有効な量で投与される、請求項33に記載の方法。
- 前記レンチウイルスベクターが、前記個体の血清中で少なくとも約300ng/mlのエンドスタチン濃度をもたらす、該個体によるエンドスタチンの発現を提供するに有効な量で投与される、請求項32に記載の方法。
- エンドスタチンが、前記個体の血清中で約300ng/ml〜約3000ng/mlのエンドスタチン濃度をもたらすに充分な量にて該個体中で発現される、請求項33に記載の方法。
- エンドスタチンが、前記個体の血清中で約300ng/ml〜約1500ng/mlのエンドスタチン濃度をもたらすに充分な量にて該個体中で発現される、請求項34に記載の方法。
- 前記レンチウイルスベクターが、ウシ免疫不全ウイルスベクターである、請求項31に記載の方法。
- 前記ウシ免疫不全ウイルスベクターが、眼内に投与される、請求項36に記載の方法。
- 前記ウシ免疫不全ウイルスベクターが、網膜下に投与される、請求項37に記載の方法。
- 前記ウシ免疫不全ウイルスベクターが、硝子体内に投与される、請求項48に記載の方法。
- 前記増加が、エンドスタチンをコードする核酸の発現を誘導する、該個体中での産生を引き起こし得るウイルスベクターの、前記個体への投与によって誘導的にもたらされる、請求項6に記載の方法。
- 前記ウシ免疫不全ウイルスベクターが、眼周囲に投与される、請求項36に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、眼周囲に投与される、請求項6に記載の方法。
- 網膜剥離または網膜水腫に罹患した個体における網膜剥離または網膜水腫の処置のための医薬の製造におけるエンドスタチンの使用であって、該エンドスタチンが、特に、番号1に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドである、使用。
- 前記エンドスタチンが、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドのポリペプチドフラグメント、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体、または配列番号1に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの改変体である、請求項43に記載の使用。
- 眼組織におけるエンドスタチン量の増加がもたらされる、請求項43に記載の使用。
- 前記増加が、エンドスタチンをコードする核を含む有効量のウイルスベクターを投与することによってもたらされる、請求項45に記載の使用。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、およびレンチウイルスからなる群より選択される、請求項46に記載の使用。
- 前記増加が、網膜剥離または網膜水腫に罹患した前記個体内に、少なくとも1つのマイクロカプセルを移植することによってもたらされ、該マイクロカプセルが、エンドスタチンを分泌する細胞を含む、請求項46に記載の使用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US40647002P | 2002-08-28 | 2002-08-28 | |
PCT/EP2003/009497 WO2004020469A2 (en) | 2002-08-28 | 2003-08-27 | Ocular gene therapy |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006516112A true JP2006516112A (ja) | 2006-06-22 |
JP2006516112A5 JP2006516112A5 (ja) | 2010-06-24 |
JP4612417B2 JP4612417B2 (ja) | 2011-01-12 |
Family
ID=31978303
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004532124A Expired - Fee Related JP4612417B2 (ja) | 2002-08-28 | 2003-08-27 | 眼の遺伝子治療 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070104684A1 (ja) |
EP (1) | EP1534751B1 (ja) |
JP (1) | JP4612417B2 (ja) |
CN (2) | CN101637611A (ja) |
AT (1) | ATE464321T1 (ja) |
AU (1) | AU2003258675B2 (ja) |
CA (1) | CA2496820A1 (ja) |
DE (1) | DE60332122D1 (ja) |
HK (1) | HK1077306A1 (ja) |
IL (1) | IL166950A (ja) |
NZ (1) | NZ538958A (ja) |
WO (1) | WO2004020469A2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100475270C (zh) * | 2006-01-20 | 2009-04-08 | 清华大学 | 一种***的药物及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6267954B1 (en) * | 1999-11-24 | 2001-07-31 | Universite De Paris V Rene-Descartes | Intraocular transplantation of encapsulated cells |
WO2001093897A2 (en) * | 2000-06-02 | 2001-12-13 | Entremed, Inc. | Angiostatin and endostatin binding proteins and methods of use |
WO2002030982A2 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Entremed, Inc. | Endostatin and pitslre protein kinases as angiogenesis-inhibiting peptides and method of use |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6174861B1 (en) | 1996-10-22 | 2001-01-16 | The Children's Medical Center Corporation | Methods of inhibiting angiogenesis via increasing in vivo concentrations of endostatin protein |
ES2245042T3 (es) * | 1997-09-24 | 2005-12-16 | The Regents Of The University Of California | Vectores de lentivirus de no primates y sistemas de empaquetamiento. |
US6106826A (en) * | 1997-12-17 | 2000-08-22 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Replication competent, avirulent Herpes simplex virus as a vector for neural and ocular gene therapy |
US6670321B1 (en) * | 1998-12-30 | 2003-12-30 | The Children's Medical Center Corporation | Prevention and treatment for retinal ischemia and edema |
JP2003531609A (ja) * | 2000-05-01 | 2003-10-28 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 目に関する形質導入用ベクターおよび遺伝子治療を目的とするその用途 |
US20020183253A1 (en) * | 2001-02-22 | 2002-12-05 | Brazzell Romulus Kimbro | Method of treating ocular neovascularization |
EP1476581A4 (en) * | 2002-02-04 | 2006-06-21 | Novartis Ag | GENERIC TRANSFER SYSTEM BASED ON RECOMBINANT IMPLANT IMMUNE VIRUS |
CA2480809A1 (en) * | 2002-04-11 | 2003-10-23 | Children's Medical Center Corporation | Methods for inhibiting vascular hyperpermeability |
WO2004028635A1 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-08 | Novartis Ag | Ocular gene therapy |
-
2003
- 2003-08-27 DE DE60332122T patent/DE60332122D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-27 CN CN200910150526A patent/CN101637611A/zh active Pending
- 2003-08-27 AU AU2003258675A patent/AU2003258675B2/en not_active Ceased
- 2003-08-27 NZ NZ538958A patent/NZ538958A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-08-27 AT AT03790928T patent/ATE464321T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-08-27 WO PCT/EP2003/009497 patent/WO2004020469A2/en active Application Filing
- 2003-08-27 CA CA002496820A patent/CA2496820A1/en not_active Abandoned
- 2003-08-27 US US10/526,127 patent/US20070104684A1/en not_active Abandoned
- 2003-08-27 JP JP2004532124A patent/JP4612417B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-27 CN CNB038231344A patent/CN100526332C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-27 EP EP03790928A patent/EP1534751B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-02-17 IL IL166950A patent/IL166950A/en active IP Right Grant
- 2005-12-01 HK HK05110989.7A patent/HK1077306A1/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6267954B1 (en) * | 1999-11-24 | 2001-07-31 | Universite De Paris V Rene-Descartes | Intraocular transplantation of encapsulated cells |
WO2001093897A2 (en) * | 2000-06-02 | 2001-12-13 | Entremed, Inc. | Angiostatin and endostatin binding proteins and methods of use |
WO2002030982A2 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Entremed, Inc. | Endostatin and pitslre protein kinases as angiogenesis-inhibiting peptides and method of use |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HK1077306A1 (en) | 2006-02-10 |
CN1708513A (zh) | 2005-12-14 |
WO2004020469A3 (en) | 2004-04-29 |
EP1534751A2 (en) | 2005-06-01 |
US20070104684A1 (en) | 2007-05-10 |
WO2004020469A2 (en) | 2004-03-11 |
AU2003258675B2 (en) | 2009-03-26 |
CA2496820A1 (en) | 2004-03-11 |
JP4612417B2 (ja) | 2011-01-12 |
NZ538958A (en) | 2006-09-29 |
DE60332122D1 (de) | 2010-05-27 |
IL166950A (en) | 2011-04-28 |
ATE464321T1 (de) | 2010-04-15 |
EP1534751B1 (en) | 2010-04-14 |
CN100526332C (zh) | 2009-08-12 |
CN101637611A (zh) | 2010-02-03 |
AU2003258675A1 (en) | 2004-03-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8338384B2 (en) | Method for treating ocular neovascularization | |
US7989426B2 (en) | Selective induction of apoptosis to treat ocular disease by expression of PEDF | |
US20070098692A1 (en) | Materials and methods for treating ocular-related disorders | |
US20100172871A1 (en) | Muller Cell Specific Gene Therapy | |
JP2002502608A (ja) | 血管新生促進因子である血管内皮細胞成長因子:vegfの変異体 | |
US20090018100A1 (en) | Materials and methods for treating ocular-related disorders | |
US20060251621A1 (en) | Ocular gene therapy | |
JP3920928B2 (ja) | 移植片拒絶反応の防止法および普遍的遺伝子治療宿主細胞の生産法 | |
AU780634C (en) | Gene Therapy for treating ocular-related disorders | |
Kreppel et al. | Long-term transgene expression in the RPE after gene transfer with a high-capacity adenoviral vector | |
Chaum et al. | Gene therapy for genetic and acquired retinal diseases | |
JP4612417B2 (ja) | 眼の遺伝子治療 | |
JP7179010B2 (ja) | 血管新生阻害剤としてのc型レクチンであるレベセチン | |
WO1999003999A1 (en) | Methods and compositions for inhibiting the proinflammatory response | |
KR20230092954A (ko) | Plvap를 유효성분으로 포함하는 망막 또는 맥락막 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
EP1170373A1 (en) | Peptide-mediated ocular cell transfection | |
AU2005202935A1 (en) | Gene therapy for treating ocular-related disorders |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060621 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090723 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20091022 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091022 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20091022 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20091022 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091120 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091217 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091221 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100104 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100122 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100122 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100309 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20100506 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100601 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100827 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100917 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101015 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131022 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4612417 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |