JP2006514932A - 皮膚、または髪に結合するペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
APQQRPMXTXXX 配列番号25
PPWXXXL 配列番号26
XXTXLTS 配列番号27
XPPLLXL 配列番号28
SXPSGAX 配列番号29
XQATFXXNXXXX 配列番号30
VXTSQLXXXXXX 配列番号31
LXXXRMK 配列番号32
HXXXYLT 配列番号33
Xは、あらゆるL−アミノ酸を示す。特に好適な皮膚に結合するペプチドは、APQQRPMXTXXX(配列番号25)の配列集団または、XQATFXXNXXXX(配列番号30)の配列集団または、LXXXRMK(配列番号32)の配列集団を有するペプチドである。
NTPXXNX 配列番号57
PXXXLST 配列番号58
TXPTHRX 配列番号59
LXTXSTP 配列番号60
TPLTXXT 配列番号61
XQXHNPP 配列番号62
Xは、あらゆるL−アミノ酸を示す。
a)皮膚に結合するペプチドを、皮膚軟化剤の潤いを与えるという性質の向上に結びつく可能性がある皮膚軟化剤と一緒に使用すること。
b)皮膚に結合するペプチドを、皮膚を白くし、または日焼けをさせる性質の向上に結びつく可能性がある漂白、または日焼け剤と組み合わせること。
c)皮膚に結合するペプチドを、局所用処方のための日焼け防止薬と組み合わせること。
d)髪に結合するペプチドを、髪を染める製剤の髪を染める性質を向上させる可能性がある染料、または酸化剤と組み合わせること。
人間の皮膚を標的にし、髪を標的にしないように選ばれたペプチドのスクリーニング。
インターナショナル・ヘア・インポーターズ・アンド・プロダクツ(ホワイトプレインズ、ニューヨーク州)から入手した濃い人の髪を編んだ3インチの長さの2つのふさを、DI水の2%のニュートロゲナ(登録商標)入浴ジェル(ニュートロゲナ社)溶液10mlを含む50mlの円錐形の管に塞がれたBSAの中に置いた。環式の7−構造単位、または線形の12−構造単位のペプチド・ライブラリー(1010pfu/μl)の10μl、または野生型ファージ(109pfu/μl)を加えた。そして、この試料を室温で15分間回転する振り混ぜ(30回転数/分)によって混ぜた。結合していない上澄みを、付加された濃い髪を編んだ3インチの2つのふさを含む新しい管へ移した。そして、室温で15分間回転する振り混ぜによって培養した。この第2の髪培養後、その溶液から500μlを、0.9mlの組織培養培地(マットテク社、アシュランド、マサチューセッツ州)を含んでいる6槽培養プレートの人間の皮膚組織(エピデルム、登録商標、マットテク社、アシュランド、マサチューセッツ州)の表面に移し、室温で30分間ゆるやかな振動下においた。この皮膚組織を取り除き、2%入浴ジェル50mlで2回それぞれ5分間洗い流した。そして、塞がれた50mlの円錐形の管の中で、PBS50mlで3回それぞれ5分間洗い流した。PBSで洗い流した後に、この皮膚組織を、リガンド・ファージが結合した標的のPCRに従って、−20℃で凍らせた。表1は、標的である皮膚に結合するペプチドが、この実施例に従って、スクリーニングされたことを示す。
人間の髪を標的にし、皮膚を標的にしないように選ばれたペプチドのスクリーニング。
予め平衡にさせた皮膚組織を、新鮮な0.9mlの組織培養培地を含んでいる6槽培養プレートの中に置いた。そして、2%ニュートロゲナ(登録商標)入浴ジョルを含む300μlと、環式の7−構造単位、または線形の12−構造単位ペプチド・ライブラリー(1010pfu/μl)の10μl、または野性型ファージ(109pfu/μl)を、皮膚表面に加えた。この試料を、室温でゆるやかな振動下において15分間培養した。結合していない上澄みを、皮膚組織を含んでいる新しい槽へ移し、前記方法を繰り返した。この培養溶液は、2%のボディ・ジェル10mlを含んでいる50mlの管の中の濃い人の髪(インターナショナル・ヘア・インポーターズ・アンド・プロダクツ、ホワイトプレインズ、ニューヨーク州)を編んだ3インチの長さの9つのふさへ移し、室温で30分間回転する振り混ぜ(30回転数/分)を行ったそれから、この髪試料を2%入浴ジェル50mlで1回、または2回、または4回洗い流した。PBSの洗浄サイクルを、5分間に25mlを1回、2分間に25mlを1回、5分間に50mlを各2回の150mlとした。PBSで洗い流した後に、結合したファージ・ペプチドを含む髪の試料を、−20℃で凍らせた。表2は、標的である髪に結合するペプチドが、この実施例に従ってスクリーニングされたことを示す。
高い親和性ファージ・ペプチド複製の同定のためのPCRを使用する髪、または皮膚に結合するファージ・ペプチドの選抜。
皮膚見本と髪試料を、−20℃でPCRまで凍らせた。一つの実施例において、PCRを、以下の試薬を有する0.5mlPCR管の以下の条件を用いる髪と皮膚の試料に直接に行った。
50μl反応混合物(ホットスタート)
2μlCB05プライマー(25μM)
2μlCB12プライマー(25μM)
46μl無菌のdH2O
10mg/mlのBSA5μlと鉱油50μlを加えた。PCR増幅を、開始後15分間95℃で行った。30秒間94℃で30サイクルの変性と、30秒間58℃の徐冷と、60秒間72℃の合成とをもちいた。拡張が、10分間72℃で予め形成された。プライマーは、オペロン・テクノロジーズ社(アラメダ、カリフォルニア州からの入手した。このプライマーの配列は、以下のとおりである。
CB05 CGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAAGG(5’−3’)配列番号63
CB12 CGAGAGGGTTGATATAAGTATAGCCCGGAATAGG(5’−3’)配列番号64
さらに、別のPCR生成物の1μlを、同じプログラムを用いるPCRの他のPCRラウンドにかけた。しかし、以下の成分を加えた。
50μl反応混合物(ホットスタート)
1μlCM13 01プライマー(50μM)
1μlCM13 02プライマー(50μM)
47μl無菌のdH2O
10mg/mlのBSA50μlと鉱油μlを加えた。プライマーは、オペロン・テクノロジーズ社(アラメダ、カリフォルニア州からの入手した。このプライマーの配列は、以下のとおりである。
CM13 01 CCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCG(5’−3’)配列番号65
CM13 02 CATTCCACAGACAACCCTCATAG(5’−3’)配列番号66
PCR生成物のクローニング
選抜の第1の循環(ラウンド)からのPCR生成物を、以下の通りに複製した。
M13KEベクター(ニューイングランド・バイオラボズ(以下、NEBという)、ベヴァリー、マサチューセッツ州)10μgを37℃で一晩中(16時間)消化させた。この消化を、NEBが勧める条件に従い、総量400μlの中で以下の通りに行った。この総量の内訳は、M13KE,10μlと、Eag1,10μlと、Acc651,10μlと、10xNEN緩衝液3,40μlと、100xBSA,4μlと、dH2O,326μlである。この消化されたベクターを、溶離緩衝液(EB)30μlを用いるキアゲンPCR精製キット(キアゲン)を用いて精製した。この精製された消化物を−20℃で保存した。
選抜の第1のラウンドからのPCR生成物を、キアゲンPCR精製キットを用いて精製し、EB緩衝液30μlの中で溶離させた。この精製した物質15μlを、一晩中、総量100μlの中で消化させた。この総量の内訳は、PCR生成物,15μlと、Eag1,1μlと、Acc651,1μlと、10xNEN緩衝液3,10μlと、100xBSA,1μlと、dH2O,64μlである。この消化の後に、20分間60℃で熱ショック療法を行った。そして、この生成物を、使用するまで−20℃で保存した。
ライゲーション混合物5μlを、商業上のプロトコルに従うTOP10Fの化学的に要求にかなう細胞(インビトロゲン)50μlの変換のために用いた。この細胞を、37℃で一晩中LBプレートの上で育てた。
シャンプーと入浴ジェルのファージ・ペプチド・ライブラリーの安定性
商業的に入手可能なニュートロゲナ(登録商標)反残留物シャンプーの2%溶液と、ニュートロゲナ(登録商標)入浴ジェルの2%溶液における3つのファージ表示ライブラリー(Ph.D.−7 とPh.D.−C7Cと,Ph.D.−12、ニューイングランド・バイオラボズ)の安定性を評価した。各ファージ表示ライブラリー10μlを、マイクロ滴定濃度プレート(MTP)の中のシャンプー150μl、または入浴ジェル溶液150μlに加えた。20μlの分割量を、30分後と60分後と120分後に各槽からの取り除き、LB肉汁180μlの中で連続的に希釈した。106から104PFU/mlのファージ・ペプチド・ライブラリーを含む希釈した試料を、20mg/mlイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)20μlとLB肉汁の中の大腸菌ER2537細胞培養200μlに加え、混合し、1から5分間培養した。感染した細胞を、40mg/mlXガル(DSMOの)20μlを含む予め55℃に加熱したLB寒天3mlの表面に加え、かき回し、すぐに予め37℃に加熱したLA寒天プレートの上に注いだ。このプレートをさまし、37℃で一晩中培養した。各プレート上のコロニーの数を数えた。そして、ml(pfu/ml)につき斑を形成するユニットの数を、プレートごとに算出した。
Claims (24)
- 皮膚に結合するペプチドであって、
前記ペプチドが(a)配列番号1から24のいずれか一つ、
または(b)配列番号1から24のいずれか一つと少なくとも50%の配列同一性を有し、
APQQRPMXTXXX (配列番号25)と、PPWXXXL (配列番号26)と、 XXTXLTS(配列番号27)と、XPPLLXL (配列番号28)と、 SXPSGAX (配列番号29)と、 XQATFXXNXXXX(配列番号30)と、VXTSQLXXXXXX (配列番号31)と、 LXXXRMK(配列番号32)と、HXXXYLT(配列番号33 )とからなる集団から選ばれる配列集団を含み、
前記XがあらゆるL−アミノ酸であることを特徴とする。 - 請求項1に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列番号1から24のいずれかと少なくとも90%の配列同一性を有することを特徴とする。
- 請求項1に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列番号1から24のいずれかと少なくとも95%の配列同一性を有することを特徴とする。
- 請求項1に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号1を含むことを特徴とする。
- 請求項1に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号3を含むことを特徴とする。
- 請求項1に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号5を含むことを特徴とする。
- 請求項1に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号6を含むことを特徴とする。
- 請求項1に記載の皮膚も結合するペプチドであって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号8を含むことを特徴とする。
- 請求項1に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号15を含むことを特徴とする。
- 請求項1に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団APQQRPMXTXXX(配列番号25)を含むことを特徴とする。
- 請求項1に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団XQATFXXNXXXX(配列番号30)を含むことを特徴とする。
- 請求項1に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団LXXXRMK(配列番号32)を含むことを特徴とする。
- 請求項1に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドがC−C誘導体を含むことを特徴とする。
- 請求項1に記載の皮膚に結合するペプチドのいずれか一つを含む組成物。
- 髪に結合するペプチドであって、
前記ペプチドが(a)配列番号34から56のいずれか一つ、
または(b)配列番号34から56のいずれか一つと少なくとも50%の配列同一性を有し、
NTPXXNX (配列番号57)と、PXXXLST(配列番号58)と、TXPTHR(配列番号59)と、 LXTXSTP(配列番号60)と、 TPLTXXT(配列番号61)と、 XQXHNPP(配列番号62)とからなる集団から選ばれる配列集団を含み、
前記XがあらゆるL−アミノ酸であることを特徴とする。 - 請求項15に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列番号34から56のいずれかと少なくとも90%の配列同一性を有することを特徴とする。
- 請求項15に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列番号34から56のいずれかと少なくとも95%の配列同一性を有することを特徴とする。
- 請求項15に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団NTPXXNX(配列番号57)を含むことを特徴とする。
- 請求項15に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団PXXXLST(配列番号58)を含むことを特徴とする。
- 請求項15に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団TXPTHR(配列番号59)を含むことを特徴とする。
- 請求項15に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団LXTXSTP(配列番号60)を含むことを特徴とする。
- 請求項15に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団TPLTXXT(配列番号61)を含むことを特徴とする。
- 請求項15に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団XQXHNPP(配列番号62)を含むことを特徴とする。
- 請求項15に記載の髪に結合するペプチドを少なくとも一つ含む組成物。
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