JP2006514614A5 - - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、ある化合物に関連する。特に、本発明は、１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１１β−ＨＳＤ）を阻害し得る化合物を提供する。 (Field of Invention)
The present invention relates to certain compounds. In particular, the present invention provides compounds that can inhibit 11β-hydroxysteroid dehydrogenase ( 11β- HSD).

１１β−ＨＳＤ１型は、特定の組織が、コルチゾンをコルチゾールに変換して、局所的な糖質コルチコイド活性を増加させ、適合応答を増強することを可能にし、糖質コルチコイドの活性の失敗を生じ得る２型活性を相殺する［１０］。ストレス応答の増強は、脳において特に重要であり、高レベルの１１β−ＨＳＤ１型が、海馬周辺で見られ、さらに、この酵素の役割を解明する。１１β−ＨＳＤ１型はまた、肝細胞成熟において重要な役割を果たすようである［８］。１１β−ＨＳＤ１型酵素の別の新生の役割は、多くの非ステロイド性カルボニル化合物の解毒プロセスにあり、多くの毒性化合物のカルボニル基の還元は、溶解性を高め、従って、その外分泌を増加させるための一般的な方法である。１１β−ＨＳＤ１型酵素は、最近、肺組織において活性であることが示されている［１１］。１型の活性は、生後までは見られず、従って、妊娠の間に喫煙する母親がその子供に対して、子供がこの化合物を代謝的に解毒し得るようになる前に、タバコの有害な作用を与える。 11β-HSD type 1 may allow certain tissues to convert cortisone to cortisol, increase local glucocorticoid activity, enhance the fit response, and cause failure of glucocorticoid activity. Offsets type 2 activity [10]. Enhancement of the stress response is particularly important in the brain, and high levels of 11β-HSD type 1 are found around the hippocampus and further elucidate the role of this enzyme. 11β-HSD type 1 also appears to play an important role in hepatocyte maturation [8]. Another emerging role for the 11β-HSD type 1 enzyme is in the detoxification process of many non-steroidal carbonyl compounds, since the reduction of the carbonyl group of many toxic compounds increases solubility and thus increases its exocrine secretion. Is a general method. The 11β-HSD type 1 enzyme has recently been shown to be active in lung tissue [11]. Type 1 activity is not seen until after birth, and therefore the harmful cigarettes of a mother who smokes during pregnancy before her child can metabolically detoxify this compound. Gives action.

を有する化合物を提供し、ここで、
Ｒ_１およびＲ_２のうちの１つは、以下の式：

Provides that of compounds having a, here,
One of R ₁ and R ₂ has the following formula:

代替的な観点から、本発明は、肝臓インシュリン抵抗性、脂肪組織のインシュリン抵抗性、筋肉のインシュリン抵抗性、糖質コルチコイドにより増強された神経毒に起因するニューロンの喪失または機能不全ならびに上記の状態の任意の組合せからなる群から選択される状態に罹患しているヒトもしくは動物被験体の処置方法を提供し、この方法は、上記患者に本発明に記載される化合物の薬学的に活性な量を含む医薬を投与する工程を包含する。 From an alternative perspective, the present invention relates to liver insulin resistance, adipose tissue insulin resistance, muscle insulin resistance, neuronal loss or dysfunction caused by glucocorticoid-enhanced neurotoxins, as well as the conditions described above. A method for the treatment of a human or animal subject suffering from a condition selected from the group consisting of any combination of the above, wherein the method comprises administering to the patient a pharmaceutically active amount of a compound described in the present invention. Administering a medicament comprising:

で置換された環を形成し、ここで、Ｒ_３は、Ｈまたは置換基である。

In forming the substituted ring, wherein, R ₃ is H or a substituent.

好ましくは、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４およびＲ_１５の各々は、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル（例えば、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、フェニル、Ｏ−アルキル、Ｏ−フェニル、ニトリル、ハロアルキル（例えば、ＣＦ_３、ＣＣｌ_３およびＣＢｒ _３）、カルボキシアルキル、−ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２アルキルおよびＮＨ−アセチル基から選択される。 Preferably, each of R ₁₁ , R ₁₂ , R ₁₃ , R ₁₄ and R ₁₅ is independently H, halogen, alkyl (eg, C ₁ -C ₆ alkyl, phenyl, O-alkyl, O-phenyl, Selected from nitrile, haloalkyl (eg CF ₃ , CCl ₃ and CB r ₃ ), carboxyalkyl, —CO ₂ H, CO ₂ alkyl and NH-acetyl groups.

（置換基）
本発明の化合物は、本明細書中に示される環系以外の置換基を有し得る。さらに、本明細書中の環系は、一般式として与えられ、このように解釈されるべきである。所定の環メンバー上に具体的に示される置換基が存在しない場合、環メンバーは、任意の置換基で置換されていてもよく、Ｈはほんの一例である。環系は、１以上の程度の不飽和を含み得、例えば、いくつかの局面において、環系の１つ以上の環は芳香族である。環系は、炭素環式であり得るか、または、１つ以上のヘテロ原子を含み得る。 (Substituent)
The compounds of the present invention may have substituents other than the ring systems shown herein. Furthermore, the ring systems herein are given as general formulas and should be interpreted in this way. In the absence of a specifically indicated substituent on a given ring member, the ring member may be substituted with any substituent and H is only one example. A ring system can contain one or more degrees of unsaturation, for example, in some aspects, one or more rings of the ring system are aromatic. The ring system can be carbocyclic or can contain one or more heteroatoms.

代表的なヒドロカルビル基は、炭化水素基である。ここで、用語「炭化水素」とは、基が直鎖状、分枝もしくは環状であり得るアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基のうちのいずれか１つを意味する。用語「炭化水素」はまた、必要に応じて置換されているこれらの基を含む。炭化水素が置換基を有する分枝構造である場合、置換は、炭化水素骨格上または分枝鎖上のいずれかであり得る；あるいは、置換は、炭化水素骨格および分枝鎖上にあり得る。 A typical hydrocarbyl group is a hydrocarbon group. Here, the term “hydrocarbon” means any one of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, or an aryl group, which may be linear, branched or cyclic . The term “hydrocarbon” also includes those groups that are optionally substituted. Where the hydrocarbon is a branched structure with substituents, the substitution can be either on the hydrocarbon backbone or on the branched chain; alternatively, the substitution can be on the hydrocarbon backbone and the branched chain.

本発明のいくつかの局面において、１つ以上のヒドロカルビル基は、独立して、アルケン基から選択される。代表的なアルケン基としては、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルケン基、Ｃ _１ −Ｃ _６ アルケン基、Ｃ_１−Ｃ_３アルケン基（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６またはＣ_７アルケン基）を含む。好ましい局面において、アルケン基は、１、２または３のＣ＝Ｃ結合を含む。好ましい局面において、アルケン基は、１つのＣ＝Ｃ結合を含む。いくつかの好ましい局面において、少なくとも１つのＣ＝Ｃ結合または１つのみのＣ＝Ｃ結合は、アルケン鎖のＣ末端にあり、すなわち、結合は、環系に対して鎖の遠位端にある。 In some aspects of the invention, the one or more hydrocarbyl groups are independently selected from alkene groups. Typical alkene groups include C ₁ -C ₁₀ alkene groups, C ₁ -C ₆ alkene groups, C ₁ -C ₃ alkene groups (eg, C ₁ , C ₂ , C ₃ , C ₄ , C ₅ , C _{5 6} or a _{C 7} alkene group). In preferred aspects, the alkene group contains 1, 2 or 3 C═C bonds. In a preferred aspect, the alkene group contains one C═C bond. In some preferred aspects, at least one C═C bond or only one C═C bond is at the C-terminus of the alkene chain, ie, the bond is at the distal end of the chain relative to the ring system. .

ここで、用語「酸素炭化水素」とは、基が直鎖、分枝鎖もしくは環状であり得るアルコキシ基、オキシアルケニル基、オキシアルキニル基、またはオキシアリール基のいずれか１つを意味する。用語「酸素炭化水素」はまた、必要に応じて置換されているこれらの基を含む。酸素炭化水素が、置換基を有する分枝構造である場合、置換は、炭化水素骨格上または分枝鎖上のいずれかであり得る；あるいは、置換は、炭化水素骨格上および分枝鎖上であり得る。 Here, the term “oxygen hydrocarbon” means any one of an alkoxy group, an oxyalkenyl group, an oxyalkynyl group, or an oxyaryl group whose group may be linear, branched or cyclic . The term “oxygen hydrocarbon” also includes those groups that are optionally substituted. When the oxygen hydrocarbon is a branched structure with substituents, the substitution can be either on the hydrocarbon backbone or on the branched chain; alternatively, the substitution is on the hydrocarbon backbone and on the branched chain possible.

代表的には、オキシヒドロカルビル基は、式Ｃ_１〜６ Ｏ（例えば、Ｃ_１〜３Ｏ）のものである。 Typically, the oxyhydrocarbyl group is of the formula C _1-6 O (eg C _1-3 O).

レポーター分子の例としては、（β−ガラクトシダーゼ、インベルターゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、（−グルクロニダーゼ、エキソ−グルカナーゼおよびグルコアミラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、放射標識されるかまたは蛍光タグ標識されたヌクレオチドは、新生転写物に取り込まれ得、これは、次いで、オリゴヌクレオチドプローブに結合する場合に、同定される。 Examples of reporter molecules include (but are not limited to (β-galactosidase, invertase, green fluorescent protein, luciferase, chloramphenicol, acetyltransferase, (-glucuronidase, exo-glucanase and glucoamylase). Radiolabeled or fluorescent tag labeled nucleotides can be incorporated into nascent transcripts, which are then identified when bound to oligonucleotide probes.

異なる送達系に依存した異なる組成物／処方物の要求が存在し得る。例として、本発明の薬学的組成物は、処方されて、ミニポンプを用いてかまたは粘膜経路 によって（例えば、吸入のための経鼻スプレーもしくはエーロゾルまたは摂取可能溶液として）送達され得るか、または組成物が送達（例えば、静脈内経路によるか、筋内経路によるか、または皮下経路による）のために注射可能な形態で処方される非経口送達される。あるいは、処方物は両方の経路によって送達されるように設計され得る。 There may be different composition / formulation requirements dependent on different delivery systems. By way of example, a pharmaceutical composition of the invention can be formulated and delivered using a minipump or by a mucosal route (eg, as a nasal spray or aerosol for inhalation or an ingestible solution) or a composition The article is delivered parenterally formulated in an injectable form for delivery (eg, by intravenous, intramuscular or subcutaneous route). Alternatively, the formulation can be designed to be delivered by both routes.

さらに、または代替的に、本発明の化合物は、生物学的応答の修飾因子と組合わせて使用され得る。 Et al., Or alternatively of, the compounds of the present invention may be used in combination with modulators of biological response.

さらなる例として、本発明の薬剤は、一日あたり１〜４回、好ましくは１日あたり１回または２回のレジメンに従って投与され得る。任意の特定の患者に対する特定の用量レベルおよび投薬頻度は、変動し得、そして種々の因子（使用される特定の化合物の活性、この化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与形式および時間、排出速度、薬物の組み合わせ、特定の状態の重篤度、および宿主が受ける治療を含む）に依存する。 As a further example, the agents of the present invention may be administered according to a regimen of 1 to 4 times per day, preferably once or twice per day. The particular dose level and dosing frequency for any particular patient can vary, and various factors (activity of the particular compound used, metabolic stability and length of action of this compound, age, weight, systemic Health, sex, diet, mode of administration and time, elimination rate, combination of drugs, severity of specific condition, and treatment received by the host ).

従って、薬学的投与に関して、本発明の化合物は、従来の薬学的処方技術ならびに薬学的キャリア、アジュバント、賦形剤、希釈剤などを用いて任意の適切な様式で、通常非経口投与のために、処方され得る。おおよその有効用量の割合は、１〜１０００ｍｇ／日、例えば、１０〜９００ｍｇ／日またはさらに１００〜８００ｍｇ／日の範囲であり得、問題の化合物の個々の活性に依存し、そしてこれは、平均体重（７０Ｋｇ）の患者に対してである。好ましくそしてより活性である化合物に関する、より有用な投薬量の割合は、２００〜８００ｍｇ／日、より好ましくは２００〜５００ｍｇ／日、最も好ましくは２００〜２５０ｍｇ／日の範囲である。これらは、単一投薬レジメンで提供され得、分割された投薬レジメンおよび／または複数の投薬レジメンが、数日間にわたって続く。経口投与に関して、これらは、単一用量あたり１００〜５００ｍｇの化合物を含む錠剤、カプセル、溶液または懸濁液で処方され得る。あるいは、および好ましくは、この化合物は、適切な非経口的に投与可能なキャリア中に、非経口投与のために処方され、そして２００〜８００ｍｇ、好ましくは２００〜５００ｍｇ、より好ましくは２００〜２５０ｍｇの範囲の単一日投薬量の割合を提供する。しかし、このような有効日用量は、活性成分の本来の活性、患者の体重に依存して変動し、このような変動は、当該分野および医師の判断の範囲内である。 Thus, for pharmaceutical administration, the compounds of the present invention can be prepared for conventional parenteral administration, in any suitable manner using conventional pharmaceutical formulation techniques as well as pharmaceutical carriers, adjuvants, excipients, diluents, and the like. Can be prescribed. The approximate effective dose rate can range from 1-1000 mg / day, such as 10-900 mg / day or even 100-800 mg / day, depending on the individual activity of the compound in question, and this is average For patients with body weight (70 kg). More useful dosage rates for compounds that are preferred and more active range from 200 to 800 mg / day, more preferably from 200 to 500 mg / day, most preferably from 200 to 250 mg / day. These can be provided in a single dosing regimen, with a divided dosing regimen and / or multiple dosing regimes lasting for several days. For oral administration, they can be formulated in tablets, capsules, solutions or suspensions containing 100-500 mg of compound per single dose. Alternatively and preferably, the compound is formulated for parenteral administration in a suitable parenterally administrable carrier and is 200-800 mg, preferably 200-500 mg, more preferably 200-250 mg. Provides a range of single daily dosages. However, such effective daily doses will vary depending on the original activity of the active ingredient, the patient's weight, and such variations are within the judgment of the art and physician.

例えば、本発明の化合物または組成物は、ＷＯ−Ａ−９９／５２８９０に列挙される障害の処置において有用であり得る（すなわち）：
さらに（あるいは）本発明の化合物または組成物は、ＷＯ−Ａ−９８／０５６３５に列挙される障害の処置において有用であり得る。参照を容易にするために、そのリストの一部をここに挙げる：糖尿病（ＩＩ型糖尿病を含む）、肥満、癌、炎症または炎症性疾患、皮膚科障害、熱、心血管効果、出血、凝固および急性期反応、悪液質、拒食症、急性感染、ＨＩＶ感染、ショック状態、宿主対移植片反応、自己免疫疾患、再還流傷害、髄膜炎、片頭痛、およびアスピリン依存性抗血栓症；腫瘍増殖、侵入および伝播、新脈管形成、転移、悪性、腹水および悪性胸水；脳虚血、虚血性心疾患、変形性関節症、慢性関節リウマチ、骨粗しょう症、喘息、多発性硬化症、神経変性、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、発作、血管炎、クローン病および潰瘍性大腸炎；歯周炎、歯肉炎；乾癬、アトピー性皮膚炎、慢性潰瘍、表皮水疱症；角膜潰瘍、網膜症および外科創傷治癒；鼻炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、アナフィラキシー；再狭窄、うっ血性心不全、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症または内膜硬化症。 For example, the compounds or compositions of the invention may be useful in the treatment of disorders listed in WO-A-99 / 52890 (ie):
Additionally (or) the compounds or compositions of the invention may be useful in the treatment of disorders listed in WO-A-98 / 05635. For ease of reference, some of that list are listed here: diabetes (including type II diabetes), obesity, cancer, inflammation or inflammatory disease, dermatological disorders, fever, cardiovascular effects, bleeding, coagulation And acute phase reaction, cachexia, anorexia, acute infection, HIV infection, shock state, host versus graft reaction, autoimmune disease, reperfusion injury, meningitis, migraine, and aspirin-dependent antithrombosis; Tumor growth, invasion and spread, angiogenesis, metastasis, malignant, ascites and malignant pleural effusion; cerebral ischemia, ischemic heart disease, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, osteoporosis, asthma, multiple sclerosis, Neurodegeneration, Alzheimer's disease, atherosclerosis, stroke, vasculitis, Crohn's disease and ulcerative colitis; periodontitis, gingivitis; psoriasis, atopic dermatitis, chronic ulcer, epidermolysis bullosa; corneal ulcer, retina And surgical wound healing ; Rhinitis, allergic conjunctivitis, eczema, anaphylaxis; restenosis, congestive heart failure, endometriosis, atherosclerosis or intimal sclerosis.

（ラット肝臓およびラット腎臓のμｌあたりのタンパク質量）
ラット肝臓およびラット腎臓におけるタンパク質量を決定する必要があった。実験をＢｒａｄｆｏｒｄ法に従って行なった［１４］。以下の方法を用いた：第１に、ＢＳＡ（タンパク質）溶液を調製した（１ｍｇ／ｍｌ）。１０〜１００μｇのタンパク質を含むタンパク質溶液を、チューブ内にピペッティングし、蒸留水を用いて容量を調節した。次いで、５ｍｌのタンパク質試薬をチューブに添加し、激しく混合した。吸光度を、試薬ブランクに対して、３ｍｌのキュベットにて、５９５ｎｍにて１５分後および１時間前に測定した。タンパク質の重量を、対応する吸光度に対してプロットし、ラット肝臓およびラット腎臓の細胞質におけるタンパク質濃度を決定するために使用される標準曲線を得た。 (Amount of protein per μl of rat liver and rat kidney)
It was necessary to determine the amount of protein in rat liver and rat kidney. The experiment was performed according to the Bradford method [14]. The following method was used: First, a BSA (protein) solution was prepared (1 mg / ml). A protein solution containing 10 to 100 μg of protein was pipetted into a tube, and the volume was adjusted with distilled water. 5 ml of protein reagent was then added to the tube and mixed vigorously. Absorbance was measured against a reagent blank in a 3 ml cuvette 15 minutes and 1 hour before at 595 nm. The weight of the protein was plotted against the corresponding absorbance to obtain a standard curve used to determine the protein concentration in the cytoplasm of rat liver and rat kidney.

（アッセイ手順−１１β−ＨＳＤインヒビター）
これらのアッセイにおいて、還元型（１型）および酸化型（２型）の方向の両方で異なるインヒビターの１１β−ＨＳＤ活性に対する影響を評価した。還元型方向において、Ｅは、基質であり、Ｆは生成物であり、酸化型の場合には、逆である。ここで記載される方法は、酸化型の方向についてのものである。 (Assay Procedure-11 β-HSD Inhibitor)
In these assays, the effect of different inhibitors on 11β-HSD activity in both reduced (type 1) and oxidized (type 2) directions was evaluated. In the reduced direction, E is the substrate, F is the product, and vice versa for the oxidized form. The method described here is for the direction of the oxidation type.

基質溶液は、ＰＢＳ−スクロース中の５０，０００ｃｐｍ／ｍｌの^３Ｈ−Ｆおよび０．５μＭのＦを含んだ。１ｍｌの基質溶液を各チューブに添加し、インヒビターをまた、「コントロール」および「ブランク」のチューブを除いて、１０μＭの濃度にて、各チューブに添加した。１５０μＬを、ブランクを除く全てのチューブに添加し、これが、同時に形成された^３Ｈ−Ｆの量について補正を行なった。チューブを機械的に振盪する水浴中、３７℃にて６０分間インキュベートした。腎臓、肝臓のホモジネートの量および用いたインキュベーション時間を、酵素依存性アッセイおよび時間依存性アッセイから得たものであった。インキュベーションの後、５０００ｃｐｍ／５０μＬの^１４Ｃ−Ｅおよび５０μｇ／５０μＬの未標識Ｅを含有する５０μＬの回収物を添加して、次の工程において生じるロスを補正した（ＴＬＣプレート上のスポットを可視化するため）。次いで、水性混合物を、４ｍｌのエーテル（２×３０秒サイクル、激しい混合）で抽出した。水相を凍結した後、エーテル（上側）層を、小さなチューブにデカントし、４５℃にて、完全に乾燥するまで蒸発させた。次いで、残留物を、６滴のエーテルに再溶解させ、ＴＬＣプレートに移した。ＴＬＣプレートをクロロホルム：メタノール（９：１ ｖ／ｖ）溶媒系で展開させ、溶媒の先端が約１８ｃｍ移動するまで、約９０分間ＴＬＣプレートを展開させた。生成物Ｅの位置を、ＵＶ光下で可視化し、ＴＬＣプレートから切り出し、シンチレーションバイアルに入れた。放射活性を０．５ｍｌメタノールを用いて５分間にわたって溶離した。０．５ｍｌのＰＢＳ−スクロースおよび１０ｍｌのＥｃｏｓｃｉｎｔを次いで添加し、激しく混合し、その後、シンチレーションカウンター内でカウントした。サンプルをカウントする前に、２つの全活性バイアルを調製した。これらは、０．５ｍｌの基質溶液、５０μＬの回収物、０．５ｍｌのメタノールおよび１０ｍｌのＥｃｓｃｉｎｔを含んだ。これらの２つの全活性バイアルが、最初に添加された^１４Ｃ−Ｅおよび^３Ｈ−Ｆの量を決定して、計算を行なうために必要とされた。 The substrate solution contained 50,000 cpm / ml ³ H-F and 0.5 μM F in PBS-sucrose. 1 ml of substrate solution was added to each tube, and inhibitors were also added to each tube at a concentration of 10 μM, except for the “control” and “blank” tubes. 150 μL was added to all tubes except the blank, which corrected for the amount of ³ H-F formed simultaneously. The tube was incubated for 60 minutes at 37 ° C. in a mechanically shaking water bath. The amount of kidney, liver homogenate and incubation time used were obtained from enzyme-dependent and time-dependent assays. After incubation, 50 μL of recovery containing 5000 cpm / 50 μL of ¹⁴ C-E and 50 μg / 50 μL of unlabeled E was added to correct for losses that occurred in the next step (visualize spots on TLC plates) To do). The aqueous mixture was then extracted with 4 ml ether (2 × 30 sec cycle, vigorous mixing). After freezing the aqueous phase, the ether (upper) layer was decanted into a small tube and evaporated at 45 ° C. until completely dry. The residue was then redissolved in 6 drops of ether and transferred to a TLC plate. The TLC plate was developed with a chloroform: methanol (9: 1 v / v) solvent system, and the TLC plate was developed for about 90 minutes until the tip of the solvent moved about 18 cm. The position of product E was visualized under UV light, cut out from the TLC plate and placed in a scintillation vial. Radioactivity was eluted with 0.5 ml methanol over 5 minutes. 0.5 ml PBS-sucrose and 10 ml Ecoscint were then added, mixed vigorously and then counted in a scintillation counter. Two total active vials were prepared before counting the samples. These included 0.5 ml substrate solution, 50 μL harvest, 0.5 ml methanol and 10 ml Ecscint. These two all active vials were required to determine the amount of ¹⁴ C-E and ³ H-F initially added and perform the calculations.

酵素アッセイを、各実験について指定された１８１μＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ グルコース−６−リン酸およびコルチゾン濃度の存在下で行なった：
酵素アッセイ緩衝液：
１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．２
抗体結合緩衝液：
０．１Ｍ ＮａＣｌおよび０．１％ゼラチンを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ８。 Enzyme assays were performed in the presence of 181 μM NADPH, 1 mM glucose-6-phosphate and cortisone concentrations specified for each experiment:
Enzyme assay buffer:
30 mM Tris-HCl containing 1 mM EDTA, pH 7.2
Antibody binding buffer:
50 mM Tris-HCl, pH 8, containing 0.1 M NaCl and 0.1% gelatin.

基質の調製：
必要とされるアッセイ濃度（１７５μＭ）の６００倍でエタノール中のコルチゾン溶液を調製する。アッセイ緩衝液中に５０分の１で希釈する。
ＮＡＤＰＨを、アッセイ緩衝液中１．８ｍｇ／ｍｌの溶液として調製する。
Ｇ−６−Ｐを、アッセイ緩衝液中３．６５ｍｇ／ｍｌの溶液として調製する。
これらの３つの溶液を１：１：１で混合して、各サンプルへの２５μｌの添加に十分な量の溶液を作製する。２５μｌあたり０．５μＣｉに滴定したコルチゾンを添加し、溶液を十分に混合する。 Substrate preparation:
Prepare a cortisone solution in ethanol at 600 times the required assay concentration (175 μM). Dilute 1:50 in assay buffer.
NADPH is prepared as a 1.8 mg / ml solution in assay buffer.
G-6-P is prepared as a 3.65 mg / ml solution in assay buffer.
These three solutions are mixed 1: 1: 1 to make enough solution for the addition of 25 μl to each sample. Was added titrated cortisone to 0.5 mu Ci per 25 [mu] l, the solution is mixed thoroughly.

（ラジオイムノアッセイ）
１１β−ＨＳＤ１酵素アッセイを、各実験について所定のｕ底ポリプロピレン９６ウェルプレートまたは１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中にて、上記の標準的な操作手順に従って行なった。酵素反応を停止した後、他に示されない限り、緩衝液３中で調製した１００μｌの抗体を、試験サンプルに添加し、１００μｌの緩衝液３をＮＳＢサンプルに添加した。サンプルを３７℃にて１時間インキュベートし、氷上で１５分間冷やした。緩衝液３中で所定の濃度に調製したデキストランでコーティングしたチャコール（５０μｌ／サンプル）を加え、サンプルを混合し（チューブについてはボルテックスし、９６ウェルプレートについては８チャネルピペットで５回吸引した）、さらに１０分間冷ました。サンプルを４℃にて２０００×ｇで１５分間遠心分離し、炭を沈殿させた。上清のアリコート（１００μｌ）をＯｐｔｉｐｌａｔｅに移し、１５０〜２００μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ４０中でＴｏｐｃｏｕｎｔ上でカウントした。いくつかの実験において、上清のアリコートをシンチレーションバイアルに移し、５ｍｌ Ｕｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄシンチラント中、Ｔｉｃａｒｂ ＬＳＣ上でカウントした。 (Radioimmunoassay)
The 11β-HSD1 enzyme assay was performed according to the standard operating procedure described above in either u-bottom polypropylene 96 well plates or 1.5 ml Eppendorf tubes for each experiment. After stopping the enzymatic reaction, unless otherwise indicated, 100 μl of antibody prepared in buffer 3 was added to the test sample and 100 μl of buffer 3 was added to the NSB sample. Samples were incubated at 37 ° C. for 1 hour and chilled on ice for 15 minutes. Add dextran- coated charcoal (50 μl / sample) adjusted to the prescribed concentration in buffer 3 and mix the sample (vortex for tubes and aspirate 5 times for 8-well pipettes for 96-well plates) Cooled for another 10 minutes. The sample was centrifuged at 2000 × g for 15 minutes at 4 ° C. to precipitate charcoal. An aliquot (100 μl ) of the supernatant was transferred to an Optiplate and counted on a Topcount in 150-200 μl Microscint 40. In some experiments, aliquots of the supernatant were transferred to scintillation vials and counted on a Ticarb LSC in 5 ml Ultima Gold scintillant .

文献は、いくつかの水溶液からのコルチゾールの抽出法を詳述する［１６，１７］。使用方法を選択するために、［ ^１４ Ｃ］−標識したコルチゾールをＮＥＮから入手した。ストックを、５０μｌ中の４０００ ＤＰＭを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で、冷やしたコルチゾール（１μｇ）をキャリアとして添加して調製した。最終エタノール濃度は０．４％であった。この溶液のアリコートをガラス管（１００μｌ）に添加し、以下の抽出を行なった：１． １ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２、ボルテックスし、相分離濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ，ＩＰＳ）を通過させる、２．１ｍｌの酢酸エチル、ボルテックスし、相分離濾紙を通す、３． １ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２および２００μｌの０．０５％ ＣａＣｌ_２、ボルテックスし、遠心分離（５００ｇで５分間）し、そして、上側の水相を除去する、４． １ｍｌの酢酸エチルおよび２００μｌの０．０５％ ＣａＣｌ_２、ボルテックスし、遠心分離（５００ｇで５分間）し、そして、上側の有機層を回収する。有機相を乾燥させ、残留物を１００μｌのＩＭＳ中に取った。このアリコートをＴＬＣプレート上にスポットし、前としてプレートを展開させた。ローダミンＢで可視化した後、スポットをシンチレーションバイアルにスクレープし、５ｍｌのＵｌｔｔｉｍａゴールドシンチラント中、液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ ＴｒｉＣａｒｂ）でカウントした。抽出効率を算出し、図４に示す。 The literature details the extraction of cortisol from several aqueous solutions [16, 17]. [ ¹⁴ C] -labeled cortisol was obtained from NEN to select the method of use. Stocks were prepared by adding chilled cortisol (1 μg) as a carrier in phosphate buffered saline (PBS) containing 4000 DPM in 50 μl. The final ethanol concentration was 0.4%. An aliquot of this solution was added to a glass tube (100 μl) and the following extractions were performed: 2. 1 ml CH ₂ Cl ₂ , vortexed and passed through phase separation filter paper (Whatman, IPS), 2.1 ml ethyl acetate, vortexed and passed through phase separation filter paper _3. Vortex 1 ml CH ₂ Cl ₂ and 200 μl 0.05% CaCl ₂ , centrifuge (500 g for 5 min) and remove the upper aqueous phase. Vortex 1 ml ethyl acetate and 200 μl 0.05% CaCl ₂ , centrifuge (500 g for 5 min) and collect upper organic layer. The organic phase was dried and the residue was taken up in 100 μl IMS. This aliquot was spotted on a TLC plate and the plate was developed as before. After visualization with rhodamine B, the spots were scraped into scintillation vials and counted in a liquid scintillation counter (Packard TriCarb) in 5 ml of Ultima Gold scintillant. The extraction efficiency is calculated and shown in FIG.

（ヒトおよびラットの肝臓ミクロソームの１１β−ＨＳＤ１活性）
ラットおよびヒト肝臓ミクロソームにおける１１β−ＨＳＤ１活性を評価して、酵素活性の測定に必要とされる最小限のミクロソームタンパク質濃度を決定した。実験を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に従って行った［１４］。これらのアッセイを、緩衝液２中で実施し、用いたコルチゾンの濃度は、インキュベーションあたり、０．５μＣｉの［^３Ｈ］−コルチゾンを含有する２μＭであった。ミクロソームを、インキュベーションあたり、１００μｌの最終インキュベーション容量にて、ガラス管内で５０μｇ〜４００μｇの範囲の濃度にて試験した。サンプルを１時間３７℃の振盪水浴中にてインキュベートし、１ｍｌの酢酸エチルを添加してアッセイを停止した。回収物を回収するために、５０μｌの［^１４Ｃ］−コルチゾールをサンプルに添加し、その後、２００μｌの０．０５％ ＣａＣｌ_２を添加した。サンプルを激しく混合し、上記のように遠心分離した。上側の有機相を除去し、乾燥させ、残留物を１００μｌのメタノールに溶解し、そして５０μｌのアリコートをＴＬＣプレート上にスポットさせた。これを、上記のように展開させた。サンプルを二重標識プログラムを用いてＴｒｉＣａｒｂ液体シンチレーションカウンター上でカウントした。回収効率を、５０μｌの［^１４Ｃ］−コルチゾール溶液中に得たＤＰＭから決定し、これを、サンプルを用いてカウントした。結果を図５に示す。 (11β-HSD1 activity of human and rat liver microsomes)
11β-HSD1 activity in rat and human liver microsomes was evaluated to determine the minimum microsomal protein concentration required to measure enzyme activity. Experiments were performed according to the Bradford method [14]. These assays were performed in buffer 2 and the concentration of cortisone used was 2 μM containing 0.5 μCi [ ³ H] -cortisone per incubation. Microsomes were tested at concentrations ranging from 50 μg to 400 μg in glass tubes at a final incubation volume of 100 μl per incubation. Samples were incubated for 1 hour in a 37 ° C. shaking water bath and 1 ml of ethyl acetate was added to stop the assay. To recover the collected substance, ^[14 C] of 50 [mu] l - added cortisol in the sample, followed by addition of 0.05% CaCl ₂ in 200 [mu] l. Samples were mixed vigorously and centrifuged as above. The upper organic phase was removed, dried, the residue was dissolved in 100 μl methanol , and a 50 μl aliquot was spotted on a TLC plate. This was developed as described above. Samples were counted on a TriCarb liquid scintillation counter using a double labeling program. Recovery efficiency was determined from DPM obtained in 50 μl of [ ¹⁴ C] -cortisol solution, which was counted with the sample. The results are shown in FIG.

ラットおよびヒトのミクロソームにおける１１β−ＨＳＤ１活性は類似しており、ラットおよびヒトのミクロソームについて、それぞれ、０．７ｐｍｏｌ／ｍｇ／分および０．５ｐｍｏｌ／ｍｇ／分であった。ヒトミクロソームにおける活性は、ミクロソームタンパク質濃度とは無関係であるようで、このことは、抽出されたタンパク質濃度範囲が高すぎることを示唆し得る。 11β-HSD1 activity in rat and human microsomes was similar, with 0.7 and 0.5 pmol / mg / min for rat and human microsomes, respectively. Activity in human microsomes appears to be independent of microsomal protein concentration, which may suggest that the extracted protein concentration range is too high.

活性に対する基質濃度の影響を試験した。［^３Ｈ］−コルチゾン濃度を０．５μＣｉ／サンプルに一定に保ち、未標識のコルチゾンを、４４ｎＭから２μＭまで変化させた。アッセイを、３７℃にて、サンプルあたり１０μｇのミクロソームタンパク質、３０分のインキュベーション時間で実施した。結果を図８に示す。これらのデータの二重逆数プロット（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅ）は、６６０ｎＭのコルチゾンについての見かけのＫｍを与える、図９。 The effect of substrate concentration on activity was tested. [ ³ H] -cortisone concentration was kept constant at 0.5 μCi / sample, and unlabeled cortisone was varied from 44 nM to 2 μM. The assay was performed at 37 ° C. with 10 μg microsomal protein per sample, 30 min incubation time. The results are shown in FIG. These data double reciprocal plot (Lineweaver-Burke) gives the Km apparent for cortisone 660 n M, FIG.

グリシレチン酸およびカルベノキソロンは、それぞれ、４０ｎＭおよび１１９ｎＭのＩＣ_５０値を生じる。ＳＰＡ形式および組換え１１β−ＨＳＤを用いてＢａｒｆらによって、カルベノキソロンについて報告されたＩＣ_５０は、３３０ｎＭであり［１５］、およそ３倍強力でない。この２つのアッセイ系における能力の差は、おそらく、異なるアッセイ条件（ｔｌｃ終点と比較したＳＰＡ、また、酵素供給源：組換え酵素に対して天然の肝臓酵素）によるものである。 Glycyretic acid and carbenoxolone yield IC ₅₀ values of 40 nM and 119 nM, respectively. The IC ₅₀ reported for carbenoxolone by Barf et al. Using the SPA format and recombinant 11β-HSD is 330 nM [15], which is approximately 3 times less potent. The difference in capacity between the two assay systems is probably due to different assay conditions (SPA compared to the tlc endpoint and also the enzyme source: natural liver enzyme versus recombinant enzyme).

このアッセイは、予測されていた通りに、標準曲線（３１３ｐｇ／ｍｌ〜１０，０００ｐｇ／ｍｌ）においてコルチゾールを検出したが、酵素アッセイサンプルから得られたシグナルは、ミクロソームタンパク質濃度の増加と共に減少し、このことは、ミクロソームタンパク質がイムノアッセイに影響し得ることを示唆する、図１２（Ａ）。外因性コルチゾンの添加が、酵素アッセイサンプルにおいて検出されたコルチゾールのレベルに影響を有さず、これは、抗体が、コルチゾンと交差反応しないことを示唆する、図１２（Ｂ）。酵素アッセイ緩衝液中に界面活性剤を含めても、影響はほとんどなかった、図１２（Ｃ）。 This assay detected cortisol in the standard curve ( 313 pg / ml-10,000 pg / ml ), as expected, but the signal obtained from the enzyme assay sample decreased with increasing microsomal protein concentration, This suggests that microsomal proteins can affect immunoassays (FIG. 12 (A)). The addition of exogenous cortisone has no effect on the level of cortisol detected in the enzyme assay sample, suggesting that the antibody does not cross-react with cortisone (FIG. 12 (B)). Inclusion of a surfactant in the enzyme assay buffer had little effect, FIG. 12 (C).

１１β−ＨＳＤ１活性を検出するためのイムノアッセイ系を用いることが実行可能であるかを決定するために、このアッセイ条件を変更した；サンプルあたり２４μｇのミクロソームタンパク質および緩衝液２中、２μＭのコルチゾン基質。酵素活性をまた、サンプル内に存在する場合、ステロイド置換試薬（コルチゾール結合タンパク質からコルチゾールを放出するキット成分）の添加後にサンプル中で測定した。アッセイは、標準曲線（３１３ｐｇ／ｍｌ〜１０，０００ｐｇ／ｍｌ）内のコルチゾールを検出した。図１３は、異なる群について得られた、４０６ｎｍにおける吸光度を示す。 The assay conditions were changed to determine if it was feasible to use an immunoassay system to detect 11β-HSD1 activity; 2 μM cortisone substrate in 24 μg microsomal protein and buffer 2 per sample. Enzyme activity was also measured in the sample after addition of a steroid displacement reagent (kit component that releases cortisol from the cortisol-binding protein) if present in the sample. The assay detected cortisol within a standard curve ( 313 pg / ml to 10,000 pg / ml ). FIG. 13 shows the absorbance at 406 nm obtained for the different groups.

コルチゾール標準の最低濃度および最高濃度は、図１３において、３１３ｐｇ／ｍｌおよび１０，０００ｐｇ／ｍｌであると示され、ＮＳＢ吸光度は、このアッセイにおいて得られるダイナミックレンジを示す。 The minimum and maximum concentrations of the cortisol standard are shown in FIG. 13 as 313 pg / ml and 10,000 pg / ml , and NSB absorbance indicates the dynamic range obtained in this assay.

ミクロソームタンパク質と共にインキュベートしたサンプルから取った反応混合物の存在下で得られた吸光度（「酵素」）は、ミクロソームタンパク質を含まない反応混合物の存在下で得られた吸光度（「酵素なし」）よりも低く、コルチゾールのレベルの増加を示す。 The absorbance (“enzyme”) obtained in the presence of the reaction mixture taken from the sample incubated with the microsomal protein is lower than the absorbance obtained in the presence of the reaction mixture without the microsomal protein (“no enzyme”). , Showing increased levels of cortisol.

０．６７μｇ／ウェル〜６．７μｇ／ウェルの濃度における抗体力価を試験した。１１β−ＨＳＤ１アッセイを、２０μｇ／ウェルのヒトミクロソームタンパク質を用いて実施し、最適なシグナルバックグラウンド比を生じた。各抗体濃度を、「酵素なし」ブランク（ミクロソームから構成される緩衝液）、「ＧＡブランク」（ミクロソームの前に１０μｌの停止溶液を添加した）およびコントロール群に対して試験した。結果を図１６および１７に示す。 Antibody titers at concentrations from 0.67 μg / well to 6.7 μg / well were tested. The 11β- HSD1 assay was performed with 20 μg / well of human microsomal protein, producing an optimal signal background ratio. Each antibody concentration was tested against a “no enzyme” blank (buffer composed of microsomes), a “GA blank” (10 μl stop solution added before microsomes) and a control group. The results are shown in FIGS.

ＲＩＡ検出を用いて、ヒト肝臓ミクロソームタンパク質濃度との酵素活性の直線性を試験する。１１β−ＨＳＤ１アッセイを、ミクロソームタンパク質濃度を１μｇ／ウェルから４０μｇ／ウェルに変化させて実施した。１１β−ＨＳＤ１活性は、２０μｇ／ウェルまではタンパク質と直線性であり（図１８）、従来の酵素アッセイで得られた結果（図７）
を確認した。 RIA detection is used to test the linearity of enzyme activity with human liver microsomal protein concentrations. The 11β- HSD1 assay was performed with the microsomal protein concentration changed from 1 μg / well to 40 μg / well. 11β- HSD1 activity is linear with protein up to 20 μg / well (FIG. 18) and results obtained with conventional enzyme assays (FIG. 7)
It was confirmed.

酵素アッセイおよびＲＩＡステージの両方が、同じ緩衝液中で行なわれ、両方の相が、酵素アッセイ緩衝液（緩衝液２）中または緩衝液３（ＲＩＡ緩衝液）中のいずれかで行なわれるように、プロトコールを単純化する。用いたミクロソームタンパク質濃度は、１０μｇ／ウェルであり、コルチゾン濃度は、１７５ｎＭであった。酵素アッセイおよびＲＩＡの両方を緩衝液３中で実施すると、データがわずかに改善するようである、図２０。 Both enzyme assay and RIA stage are performed in the same buffer, and both phases are performed either in enzyme assay buffer (buffer 2) or buffer 3 (RIA buffer). Simplify the protocol. The microsomal protein concentration used was 10 μg / well and the cortisone concentration was 175 nM . When both the enzyme assay and RIA are performed in buffer 3, the data appears to improve slightly, FIG.

１０μｇ／ウェルのミクロソームタンパク質および１７５ｎＭの基質を用いると、反応は、３０分までの時点では直線性である。これらの結果は、１７５ｎＭの基質濃度が、低すぎることを示す。従来の１１β−ＨＳＤ１アッセイにおいて観察された見かけのＫｍは、６６０ｎＭであった（図８および９）が、これらのアッセイは、終点での測定値であり、従って、最初の速度が、３０分間のインキュベーション時間で、低基質群において測定されたかどうかは定かではない。しかし、ヒト肝臓ミクロソーム１１β−ＨＳＤ１アッセイにおけるコルチゾンについて公開されているＫｍ値は、μｍｏｌ濃度の範囲内である［１８，１９］。１７５ｎＭの基質は、見かけのＫｍより十分に低いが、以下の２つの理由から、濃度を有意に増加する可能性はない：
（ｉ）化合物がコルチゾンと競合する場合、測定される阻害は、基質が参考文献１において用いられた濃度を上回って増える場合に落ちる
（ｉｉ）基質濃度を増加することが、標識の特異的活性を減少し、アッセイの感度を低下させる。このことは、より高い濃度の［^３Ｈ］−コルチゾンを添加することによって克服され得るが、このプロトコールは０．５μＣｉ／ウェルを用い、より高いレベルの放射活性が用いられる場合に、コストの影響が存在する。 With 10 μg / well microsomal protein and 175 nM substrate, the reaction is linear up to 30 minutes. These results indicate that the substrate concentration of 175 nM is too low. The apparent Km observed in the conventional 11β-HSD1 assay was 660 nM (FIGS. 8 and 9), but these assays were endpoint measurements, so the initial rate was 30 min. It is not clear whether the incubation time was measured in the low substrate group. However, published Km values for cortisone in the human liver microsome 11β-HSD1 assay are in the μmol concentration range [18, 19]. The 175 nM substrate is well below the apparent Km, but there is no possibility of significantly increasing the concentration for two reasons:
(I) When the compound competes with cortisone, the measured inhibition falls when the substrate increases above the concentration used in ref. 1 (ii) Increasing the substrate concentration increases the specific activity of the label Decrease the sensitivity of the assay. This can be overcome by adding higher concentrations of [ ³ H] -cortisone, but this protocol uses 0.5 μCi / well and the cost impact when higher levels of radioactivity are used. Exists.

図２３中に示されるこれらのデータのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロットから決定した見かけのＫｍ（７００ｎＭ）は、ｔｌｃ形式の１１β−ＨＳＤ１アッセイ（図９、見かけのＫｍ 約６６０ｎＭ）において決定したものと非常に類似する。これらのデータは、１０μｇのミクロソームタンパク質では、酵素が、３０分のインキュベーションの時間にわたって、１７５ｎＭのコルチゾンにおいても飽和していないことを示唆する。 The apparent Km (700 nM) determined from the Lineweaver-Burke plot of these data shown in FIG. 23 is very similar to that determined in the tlc- format 11β-HSD1 assay (FIG. 9, apparent Km approximately 660 nM). To do. These data suggest that at 10 μg of microsomal protein, the enzyme is not saturated even at 175 nM cortisone over a 30 minute incubation period.

グリシレチン酸は、４１ｎＭのＩＣ_５０で酵素の濃度関連阻害を生じ、良好なフィット値（ｒ ^２ ＝０．９６２）およびヒルスロープ（Ｈｉｌｌｓｌｏｐｅ）を有する。これは、ｔｌｃ形式アッセイを用いて生じた４０ｎＭの値に類似する（図１０を参照のこと）。３０ｎＭのＩＣ_５０値は、基質としてデヒドロ−デキサメタゾンを用いて、ヒト肝臓ミクロソームにおける１１β−ＨＳＤ１のグリシレチン酸阻害について報告されている［１９］。しかし、これらの値は、Ｂａｒｆらにより報告された値よりも低い［１５］。 Glycyretic acid produces a concentration-related inhibition of the enzyme with an IC ₅₀ of 41 nM and has a good fit value ( r ² = 0.962) and Hillslope. This is similar to the 40 nM value generated using the tlc format assay (see FIG. 10). An IC ₅₀ value of 30 nM has been reported for glycyrrhetinic acid inhibition of 11β-HSD1 in human liver microsomes using dehydro-dexamethasone as a substrate [19]. However, these values are lower than those reported by Barf et al. [15].

ＤＧＳ０３１３０Ｂ（ＳＴＸ７０１）
淡黄色結晶ＤＧＳ０３１３０Ａ（４５ｍｇ；１４％）。ｍｐ１６９ Ｃ；ＴＬＣ Ｒ_ｆ：０．４２ ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＥｔＯＡｃ（４：１）；

DGS03130B (STX701)
Pale yellow crystalline DGS03130A (45 mg; 14%). mp 169 C; TLC R _f : 0.42 CH ₂ Cl ₂ / EtOAc (4: 1);

（２−［６−（３−クロロ−２−メチルベンゼンスルホニルアミノ）−ベンゾチアゾール−２−イルスルファニル］−Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド（ＳＴＸ７５５，ＸＤＳ０１１４５）および２−［６−（３−クロロ−２−メチルベンゼンスルホニルアミノ）−ベンゾチアゾール−２−イル］−Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド（ＳＴＸ７６３，ＸＤＳ０１１４５Ｂ））
ＤＭＣ（５ｍｌ）中のＡｌＣｌ_３（５０ｍｇ）の懸濁液に、ジエチルアミン（０．４ｍｌ）を添加した。溶液を窒素下、室温にて１０分間撹拌した。［６−（３−クロロ−２−メチルベンゼンスルホニルアミノ）−ベンゾチアゾール−２−イルスルファニル］−酢酸エチルエステル（ＳＴＸ７５２，１００ｍｇ）を添加し、混合物を室温にて３０分間撹拌し続けた。反応を水でクエンチし、ＤＣＭと５％ ＮａＨＣＯ_３との間で分配した。有機層を水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、真空下でエバポレートして、黄色の残留物を生じ、これを、溶離溶媒として２０〜３０％ 酢酸エチル−ＤＣＭを用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。ＳＴＸ７５５（５０ｍｇ，４７％）を白色固体として得た。ＴＬＣ Ｒ_ｆ ０．６０の単一スポット（２５％ ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ）；ＨＰＬＣ純度 ８９％（ｔ_Ｒ １０％ 水−メタノール中２．７分）；

(2- [6- (3-Chloro-2-methylbenzenesulfonylamino) -benzothiazol-2-ylsulfanyl] -N, N-diethylacetamide (STX755, XDS01145) and 2- [6- (3-chloro- 2-methylbenzenesulfonylamino) -benzothiazol-2-yl] -N, N-diethylacetamide (STX763, XDS01145B))
To a suspension of AlCl ₃ (50 mg) in DMC (5 ml) was added diethylamine (0.4 ml). The solution was stirred at room temperature for 10 minutes under nitrogen. [6- (3-Chloro-2-methylbenzenesulfonylamino) -benzothiazol-2-ylsulfanyl] -acetic acid ethyl ester (STX752,100 mg) was added and the mixture continued to stir at room temperature for 30 minutes. The reaction was quenched with water and partitioned between DCM and 5% NaHCO ₃ . The organic layer is washed with water, dried over MgSO ₄ and evaporated under vacuum to give a yellow residue which is purified by flash column chromatography using 20-30% ethyl acetate-DCM as the eluting solvent. did. STX755 (50 mg, 47%) was obtained as a white solid. TLC R _f 0.60 single spot (25% EtOAc / DCM); HPLC purity 89% (t _R 10% water-2.7 min in methanol);

３−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−ベンゾチアゾール−６−イル）−２−メチルベンゼンスルホンアミド（ＳＴＸ８３１，ＸＤＳ０１１６３）
アセトン（３ｍＬ）中のＳＴＸ７５３（６６ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（６６ｍｇ）を添加し、その後、ヨウ化メチル（６６ｍｇ）を添加した。混合物を室温にて２時間撹拌し、ＤＣＭ中に抽出し、ブラインで洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を真空下で除去して、油状の残留物を得、これを、フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。オフホワイトの固体（５９ｍｇ、８０％）を得た。ＴＬＣ Ｒ_ｆ ０．３７の単一スポット（１００％ ＤＣＭ）；ＨＰＬＣ純度 ９９％（ｔ_Ｒ １０％ 水−メタノール中２．０分）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，

3-Chloro-N-methyl-N- (3-methyl-2-oxo-2,3-dihydro-benzothiazol-6-yl) -2-methylbenzenesulfonamide (STX831, XDS01163)
To a solution of STX753 (66 mg, 0.19 mmol) in acetone (3 mL) was added potassium carbonate (66 mg) followed by methyl iodide (66 mg). The mixture was stirred at room temperature for 2 hours, extracted into DCM and washed with brine. After drying over sodium sulfate, the solvent was removed in vacuo to give an oily residue that was purified by flash chromatography. An off-white solid (59 mg, 80%) was obtained . TLC R _f 0.37 single spot (100% DCM); HPLC purity 99% (2.0% in t _R 10% water-methanol); ¹ H NMR (400 MHz,

３−クロロ−Ｎ−（２，６−ジメチル−ベンゾチアゾール−７−イル）−２−メチル−ベンゼンスルホンアミド（ＳＴＸ１０２１，ＸＤＳ０２０６９）
オフホワイトの結晶固体。ＴＬＣ Ｒ_ｆ ０．４９の単一スポット（１０％ ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ）；ＨＰＬＣ純度 ９８％（ｔ_Ｒ ２０％ 水−メタノール中２．０分）；

3-Chloro-N- (2,6- dimethyl -benzothiazol-7-yl) -2-methyl-benzenesulfonamide (STX1021, XDS02069)
Off-white crystalline solid. TLC R _f 0.49 single spot (10% EtOAc / DCM); HPLC purity 98% (t _R 20% water-2.0 min in methanol);

３−クロロ−Ｎ−（２，５−ジメチル−ベンゾチアゾール−４−イル）−２−メチル−ベンゼンスルホンアミド（ＳＴＸ９９６，ＸＤＳ０２０４７）
白色結晶固体。ＴＬＣ Ｒ_ｆ ０．７６の単一スポット（１０％ ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ）；ＨＰＬＣ純度＞９９％（ｔ_Ｒ １０％ 水−メタノール中２．９分）；

3-Chloro-N- (2,5- dimethyl -benzothiazol-4-yl) -2-methyl-benzenesulfonamide (STX996, XDS02047)
White crystalline solid. TLC R _f 0.76 single spot (10% EtOAc / DCM); HPLC purity> 99% (t _R 10% water-2.9 min in methanol);

Ｎ−（２，５−ジメチルベンゾチアゾール−６−イル）−Ｎ（−３−クロロ−２−メチルフェニルスルホニル）−３−クロロ−２−メチルベンゼンスルホンアミド（ＳＴＸ９９７，ＸＤＳ０２０４８Ａ）
オフホワイトのシロップ。ＴＬＣ Ｒ_ｆ ０．７８の単一スポット（１０％ ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ）；ＨＰＬＣ純度 ８５％（ｔ_Ｒ １０％ 水−メタノール中４．２分）；

N- (2,5- dimethylbenzothiazol -6-yl) -N (-3-chloro-2-methylphenylsulfonyl) -3-chloro-2-methylbenzenesulfonamide (STX997, XDS02048A)
Off-white syrup. TLC R _f 0.78 single spot (10% EtOAc / DCM); HPLC purity 85% (t _R 10% water-4.2 min in methanol);

（５−（３−クロロ−２−メチル−ベンゼンスルホンアミノ）−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸メチルエステル，ＳＴＸ１０５０（ＫＲＢ０１１３２）の合成）

(Synthesis of 5- (3-chloro-2-methyl-benzenesulfonamino) -1H -indole-3-carboxylic acid methyl ester, STX1050 (KRB01132))

（Ｎ−ベンズイミダゾールアリールスルホンアミド誘導体の合成のための一般法）
ＤＣＭ中のアリールスルホニルクロリド（１．１当量）の溶液に、ピリジン（２．２当量）および触媒量のＤＭＡＰを添加し、その後、対応するアミン（１当量）を添加した。反応混合物を窒素下、室温にて、４〜１６時間撹拌し、ＴＬＣが反応の完了を示した後、次いで、酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウムとの間で分配した。有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮して、固体または粘性シロップとして粗生成物を生じた。次いで、化合物をフラッシュクロマトグラフィー（メタノール−ＤＣＭ勾配溶出）により精製して、結晶固体として所望のアリールスルホンアミドを生じた。収率は、５０〜８０％の範囲である。

(General method for the synthesis of N-benzimidazole arylsulfonamide derivatives)
To a solution of arylsulfonyl chloride (1.1 eq) in DCM was added pyridine (2.2 eq) and a catalytic amount of DMAP followed by the corresponding amine (1 eq). The reaction mixture was stirred at room temperature under nitrogen for 4-16 hours and then partitioned between ethyl acetate and 5% sodium bicarbonate after TLC showed the reaction was complete. The organic layer was washed with brine, dried over sodium sulfate and concentrated under vacuum to give the crude product as a solid or viscous syrup. The compound was then purified by flash chromatography (methanol-DCM gradient elution) to yield the desired arylsulfonamide as a crystalline solid. The yield is in the range of 50-80%.

３−クロロ−Ｎ−（１，２−ジメチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−６−イル）−２−メチルベンゼンスルホンアミド（ＳＴＸ９７５，ＸＤＳ０２００１）
白色結晶固体。Ｍｐ２６５−２６６ Ｃ；ＴＬＣ Ｒ_ｆ ０．４３の単一スポット（５％ メタノール／ＤＣＭ）；ＨＰＬＣ純度＞９９％（ｔ_Ｒ １０％ 水−メタノール中２．分）； 3-Chloro-N- ( 1,2-dimethyl-1H-benzimidazol-6-yl) -2-methylbenzenesulfonamide (STX975, XDS02001)
White crystalline solid. Mp265-266 C; single spot of TLC R _f 0.43 (5% methanol / DCM); HPLC purity> 99% (t _R 10% water-2.min in methanol);

３−クロロ−Ｎ−（１，２−ジメチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−２−メチルベンゼンスルホンアミド（ＳＴＸ９７６，ＸＤＳ０２００３）
白色結晶固体。Ｍｐ ２８３−２８３℃。ＴＬＣ Ｒ _ｆ ０．３８の単一スポット（５％ メタノール／ＤＣＭ）；ＨＰＬＣ純度＞９９％（ｔ_Ｒ １０％ 水−メタノール中２．０分）；

3-Chloro-N- (1,2-dimethyl-1H-benzimidazol-5-yl) -2-methylbenzenesulfonamide (STX976, XDS02003)
White crystalline solid. Mp 283-283 ° C. TLC R _f 0.38 single spot (5% methanol / DCM); HPLC purity> 99% (t _R 10% water-2.0 min in methanol);

Ｎ−（２−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）−アセトアミド：
Ｎ’−フェニル−ベンゼン−１，２，４−トリアミン（８００ｍｇ，４ｍｍｏｌ）を、酢酸（１０ｍＭＬ）中に溶解させ、無水酢酸（１．０ｍＬ）をこの溶液に添加した。混合物を８０℃にて６時間撹拌し、室温まで冷却して、５％炭酸ナトリウムで中和し、次いで、酢酸エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して残留物を生じ、これをエタノールから結晶化した。褐色の結晶固体（０．８５ｇ，８０％）を得た。Ｍｐ ２３１〜２３２℃；ＴＬＣ Ｒ_ｆ ０．３９の単一スポット（１０％ メタノール／ＤＣＭ）；

N- (2-Methyl-1-phenyl-1H-benzimidazol-5-yl) -acetamide:
N′-phenyl-benzene-1,2,4-triamine (800 mg, 4 mmol) was dissolved in acetic acid (10 mM L) and acetic anhydride (1.0 mL) was added to this solution. The mixture was stirred at 80 ° C. for 6 hours, cooled to room temperature, neutralized with 5% sodium carbonate, and then extracted with ethyl acetate. The organic phase was washed with brine, dried over magnesium sulfate and concentrated to give a residue that was crystallized from ethanol. A brown crystalline solid (0.85 g, 80%) was obtained. Mp 231-232 ° C; TLC R _f 0.39 single spot (10% methanol / DCM);

本発明は、例としてのみ添付の図面を参照することによって、さらに詳細に記載される。
図１は、ラット肝臓およびラット腎臓の１μＬあたりのタンパク質量を示すグラフ１である。 図２は、ラット肝臓における、１１β−ＨＳＤ１型活性の、酵素濃度および時間依存性の経過（ＥからＦ）を示すグラフ２である。 図３は、ラット腎臓における、１１β−ＨＳＤ２型活性の、酵素濃度および時間依存性の経過（ＦからＥ）を示すグラフ３である。 図４は、４つの抽出方法により得られる抽出効率を示すグラフである。 図５は、ラットおよびヒトの肝臓ミクロソームにおける１１β−ＨＳＤ１活性の比較を示すグラフである。 図６は、ヒトミクロソーム１１β−ＨＳＤ１活性に対する、インキュベーション時間の効果を示す一連のグラフである。 図７は、ヒトミクロソーム１１β−ＨＳＤ１活性に対する、ミクロソームタンパク質濃度の効果を示す一連のグラフである。 図８は、ヒト肝臓ミクロソーム１１β ＨＳＤ１についての基質（コルチゾン）飽和曲線を示すグラフである。 図９は、ヒト肝臓ミクロソーム１１β ＨＳＤ１についての基質飽和データのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロットである。 図１０は、グリシレチン酸についてのＩＣ_５０決定を示すグラフである。 図１１は、カルベノキソロンについてのＩＣ_５０決定を示すグラフである。 図１２Ａは、イムノアッセイにより測定した１１β−ＨＳＤ１活性を示すグラフである。図１２Ａは、タンパク質の効果を示す。 図１２Ｂは、イムノアッセイにより測定した１１β−ＨＳＤ１活性を示すグラフである。図１２Ｂは、コルチゾンの効果を示す。 図１２Ｃは、イムノアッセイにより測定した１１β−ＨＳＤ１活性を示すグラフである。図１２Ｃは、Ｔｗｅｅｎ−８０の効果を示す。 図１３は、Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ Ｃｏｒｔｉｓｏｌイムノアッセイの評価を示すグラフである。 図１４は、Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓイムノアッセイにより検出した１１β−ＨＳＤ１活性の測定に対する、ミクロソームタンパク質増加の効果を示すグラフである。 図１５は、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ抗コルチゾール抗体を用いるＲＩＡによる１１β ＨＳＤ１活性の検出を示すグラフである。 図１６は、信号対雑音比に対するＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ抗体濃度の低減効果を示すグラフである（ＧＡブランク群と比較したミクロソーム群）。 図１７は、ＲＩＡによる、１１β ＨＳＤ１活性の検出についてのＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ抗体飽和曲線を示すグラフである。 図１８は、ＲＩＡによる、ヒト肝臓ミクロソーム１１β ＨＳＤ１活性の直線性を示すグラフである。 図１９は、ＲＩＡによる、ヒト肝臓ミクロソーム１１β ＨＳＤ１活性の検出に対する、Ｔｗｅｅｎ ８０の効果を示すグラフである。 図２０は、ＲＩＡによる、ヒト肝臓ミクロソーム１１β ＨＳＤ１活性の検出に対する緩衝液系の効果を示すグラフである。 図２１は、ＲＩＡにより検出されたヒト肝臓ミクロソーム１１β ＨＳＤ１活性のインキュベーション時間との直線性を示すグラフである。 図２２は、ＲＩＡにより検出されたヒト肝臓ミクロソーム１１β−ＨＳＤ１活性についての基質飽和曲線を示すグラフである。 図２３は、ＲＩＡにより検出されたヒト肝臓ミクロソーム１１β−ＨＳＤ１活性についての基質飽和データのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロットである。 図２４は、ヒト肝臓ミクロソーム１１β−ＨＳＤ１活性のＤＭＳＯ耐性を示すグラフである。 図２５は、グリシレチン酸によるヒト肝臓ミクロソーム１１β−ＨＳＤ１活性の阻害についてのＩＣ_５０曲線である。 The invention will now be described in further detail, by way of example only, with reference to the accompanying drawings.
FIG. 1 is a graph 1 showing the amount of protein per 1 μL of rat liver and rat kidney. FIG. 2 is a graph 2 showing the enzyme concentration and time-dependent course (E to F) of 11β-HSD type 1 activity in rat liver. FIG. 3 is a graph 3 showing the enzyme concentration and time-dependent course (F to E) of 11β-HSD type 2 activity in rat kidney. FIG. 4 is a graph showing the extraction efficiency obtained by the four extraction methods. FIG. 5 is a graph showing a comparison of 11β-HSD1 activity in rat and human liver microsomes. FIG. 6 is a series of graphs showing the effect of incubation time on human microsomal 11β-HSD1 activity. FIG. 7 is a series of graphs showing the effect of microsomal protein concentration on human microsomal 11β-HSD1 activity. FIG. 8 is a graph showing a substrate (cortisone) saturation curve for human liver microsomes 11β HSD1. FIG. 9 is a Lineweaver-Burke plot of substrate saturation data for human liver microsome 11β HSD1. FIG. 10 is a graph showing IC ₅₀ determination for glycyrrhetinic acid. FIG. 11 is a graph showing IC ₅₀ determinations for carbenoxolone. FIG. 12A is a graph showing 11β-HSD1 activity measured by immunoassay. FIG. 12A shows the effect of the protein. FIG. 12B is a graph showing 11β-HSD1 activity measured by immunoassay. FIG. 12B shows the effect of cortisone. FIG. 12C is a graph showing 11β-HSD1 activity measured by immunoassay. FIG. 12C shows the effect of Tween-80. FIG. 13 is a graph showing the evaluation of the Assay Designs Cortisol immunoassay. FIG. 14 is a graph showing the effect of increasing microsomal protein on the measurement of 11β-HSD1 activity detected by Assay Designs immunoassay. FIG. 15 is a graph showing detection of 11β HSD1 activity by RIA using an Immunotech anti-cortisol antibody. FIG. 16 is a graph showing the effect of reducing Immunotech antibody concentration on the signal-to-noise ratio (microsome group compared to GA blank group). FIG. 17 is a graph showing an Immunotech antibody saturation curve for detection of 11β HSD1 activity by RIA. FIG. 18 is a graph showing the linearity of human liver microsomal 11β HSD1 activity by RIA. FIG. 19 is a graph showing the effect of Tween 80 on the detection of human liver microsomal 11β HSD1 activity by RIA. FIG. 20 is a graph showing the effect of a buffer system on the detection of human liver microsomal 11β HSD1 activity by RIA. FIG. 21 shows human liver microsomes 11β detected by RIA. It is a graph which shows linearity with the incubation time of HSD1 activity. FIG. 22 is a graph showing a substrate saturation curve for human liver microsome 11β-HSD1 activity detected by RIA. FIG. 23 is a Lineweaver-Burke plot of substrate saturation data for human liver microsomal 11β-HSD1 activity detected by RIA. FIG. 24 is a graph showing DMSO resistance of human liver microsome 11β-HSD1 activity. FIG. 25 is an IC ₅₀ curve for inhibition of human liver microsomal 11β-HSD1 activity by glycyrrhetinic acid.