JP2006505766A - Multi-parameter tests including analytical discs and related methods - Google Patents
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Abstract
サンプルを標的分子または化学物質に関して試験する方法および装置。本装置は、反応チャンバを有し、少なくとも２つのビーズまたは微粒子グループを有する回転可能な光ディスクを備え、異なるビーズグループは、少なくとも２つの異なる密度、サイズ、形状、および／または色を有し、グループの各ビーズには異なるプローブが付着している。サンプルを反応チャンバに添加し、ディスクを回転させる。反応チャンバは、異なる密度のビーズをその密度に応じて異なる半径方向位置に留まらせる密度勾配媒体を有する。次に、電磁放射ビームをディスク上に送ることによって、ビーズを検査する。ビームはディスクから反射されても、あるいはディスクを透過してもよい。標的の量または有無は、ビームから戻ってきた信号を分析することによって判定される。関連する、検定を行う方法およびディスク装置を作製する方法を提供する。A method and apparatus for testing a sample for a target molecule or chemical. The apparatus comprises a rotatable optical disc having a reaction chamber and having at least two beads or particle groups, wherein the different bead groups have at least two different densities, sizes, shapes, and / or colors. A different probe is attached to each bead. Sample is added to the reaction chamber and the disc is rotated. The reaction chamber has a density gradient medium that keeps beads of different densities at different radial locations depending on their density. The beads are then inspected by sending an electromagnetic radiation beam over the disk. The beam may be reflected from the disk or transmitted through the disk. The amount or presence of the target is determined by analyzing the signal returning from the beam. Related methods of performing assays and methods of making disk devices are provided.
Description
［関連出願への相互参照］
本件出願は、２００１年４月１１日に出願された米国仮出願第６０／２８３，２１３号の優先権の利益を主張し、その内容全体を参照により本明細書中に援用する。
[Cross-reference to related applications]
This application claims the benefit of priority of US Provisional Application No. 60 / 283,213, filed Apr. 11, 2001, the entire contents of which are incorporated herein by reference.
［発明の背景］
１．発明の分野
本発明は、光バイオディスクに関連する検定を行う装置に関する。本発明はさらに、検定を行うために、密度勾配および／または遠心分離を用いて微粒子またはビーズ、細胞、標識、またはタグを分離、固定化および／または検出する方法に関する。
[Background of the invention]
1. The present invention relates to an apparatus for performing assays related to optical biodiscs. The invention further relates to methods for separating, immobilizing and / or detecting microparticles or beads, cells, labels, or tags using density gradients and / or centrifugation to perform the assay.
２．背景技術と本発明の説明
あらゆるタイプの診断検定および法医学検定をより迅速に、エンドユーザのより近くで行う必要性は大きい。理想的には、臨床医、患者、調査員、軍隊、他のヘルスケア職員、および消費者が、各々のシステムに或る種の因子または指標があるかどうか、また犯罪現場や戦場に或る種の生体物質があるかどうかを自分で試験できるべきである。現在では、核酸および／またはタンパク質が付着している、市販または開発中の、生物医学、化学、または生化学検定を行ういくつかのシリコンベースのチップがある。これらのチップは、エンドユーザが使用するものではなく、高度な専門的知識や高価な機器を有しない人または実体が使用するものでもない。本発明の目的は、専門的な訓練を受けていないエンドユーザが使用できる比較的安価な検定システムを使用することにより、これらの欠点のうちの少なくとも１つをなくすか、または軽減することである。
2. BACKGROUND AND DESCRIPTION OF THE INVENTION There is a great need to perform all types of diagnostic and forensic tests more quickly and closer to the end user. Ideally, clinicians, patients, investigators, troops, other healthcare personnel, and consumers have certain factors or indicators in their systems, and are in crime scenes or battlefields. You should be able to test yourself for the presence of certain biological materials. Currently, there are several silicon-based chips that perform biomedical, chemical, or biochemical assays that are attached to nucleic acids and / or proteins that are commercially available or in development. These chips are not used by end users, nor are they used by people or entities who do not have advanced expertise or expensive equipment. It is an object of the present invention to eliminate or mitigate at least one of these disadvantages by using a relatively inexpensive assay system that can be used by end users who are not professionally trained. .
多くの生化学技法が、抗原と抗体の相互作用、相補的なＤＮＡ鎖間のハイブリダイゼーション、またはタンパク質の親和性を利用する。これらのなかには、ストレプトアビジンおよびビオチン、ならびに標識試薬の使用が含まれる可能性がある。多様な標識またはタグが検出に使用されている。例としては、酵素、色ベース、放射性、リン光、蛍光および化学発光の試薬、ミクロスフェア、金属コロイド、ならびに蛍光ダイ（フルオレセインおよびローダミン等）がある。例えば、蛍光抗ヒトＩｇＧが標識試薬として日常的に使用されている。 Many biochemical techniques make use of antigen-antibody interactions, hybridization between complementary DNA strands, or protein affinity. Among these may include the use of streptavidin and biotin, and labeling reagents. A variety of labels or tags are used for detection. Examples include enzymes, color bases, radioactive, phosphorescent, fluorescent and chemiluminescent reagents, microspheres, metal colloids, and fluorescent dies (such as fluorescein and rhodamine). For example, fluorescent anti-human IgG is routinely used as a labeling reagent.
本発明の一実施形態では、特定の抗体または抗原を検出するように二層の手順を設計する「サンドイッチ」免疫検定が行われる。例えば、サンプル中の抗体の存在を検出するには、まず、対応する抗原を固体基板に固定化する。次に、固定化した抗原を試験中のサンプルに曝す。存在する抗体の一部または全部が固定化した抗原と結合する。余分なまたは非結合抗体は洗い流す。 In one embodiment of the invention, a “sandwich” immunoassay is performed in which a bilayer procedure is designed to detect a particular antibody or antigen. For example, in order to detect the presence of an antibody in a sample, first, the corresponding antigen is immobilized on a solid substrate. The immobilized antigen is then exposed to the sample under test. Some or all of the antibodies present bind to the immobilized antigen. Excess or unbound antibody is washed away.
次に、蛍光抗ＩｇＧ等の標識試薬をサンプルに添加する。標識試薬は抗体と結合し、余分な試薬は洗い流す。次に、蛍光強度を測定して、サンプル中に存在する抗体の量の指示を与える。 Next, a labeling reagent such as fluorescent anti-IgG is added to the sample. Labeling reagent binds to the antibody and excess reagent is washed away. The fluorescence intensity is then measured to give an indication of the amount of antibody present in the sample.
「サンドイッチ」免疫検定の問題の１つは、何回かの洗浄ステップが伴うことである。洗浄ステップは、余分な抗体および標識試薬を除去するために必要であり、そうしないと、結果の精度に悪影響を及ぼす。 One problem with “sandwich” immunoassays is that they involve several washing steps. A washing step is necessary to remove excess antibody and labeling reagent, otherwise it will adversely affect the accuracy of the results.
さらなる問題は、サンプルが一度に１つの標的に関してしか分析できないことである。したがって、サンプル中のいくつかの異なる標的を検出するには、別個のサンプル容器が必要である。その結果、多数回の洗浄ステップが必要となり、手順が面倒で時間のかかるものとなる。 A further problem is that the sample can only be analyzed for one target at a time. Thus, a separate sample container is required to detect several different targets in the sample. As a result, a large number of washing steps are required, making the procedure cumbersome and time consuming.
本発明の目的は、上記の欠点のうちの少なくとも１つをなくすか、または軽減することである。 The object of the present invention is to eliminate or alleviate at least one of the above-mentioned drawbacks.
本発明のさらなる目的は、免疫検定を行うために現在必要とされる洗浄ステップの回数を減らすか、またはなくすことである。 A further object of the present invention is to reduce or eliminate the number of wash steps currently required to perform an immunoassay.
上記の目的は、ディスクベースの走査デバイスとともに使用される化学、生化学、または生物医学検定を行うデバイスを提供することによって達成される。そのようなデバイスの１つが例えば、「Apparatus and Method for Carrying out Analysis of Samples」と
題する米国特許第５，８９２，５７７号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書中に援用する。
The above objective is accomplished by providing a device for performing chemical, biochemical, or biomedical assays for use with a disk-based scanning device. One such device is described, for example, in US Pat. No. 5,892,577 entitled “Apparatus and Method for Carrying out Analysis of Samples”, the entire contents of which are incorporated herein by reference. .
［発明の概要］
本発明は、検定を行うことに関し、特に、ディスク上で様々な濃度のビーズを個別にまたは複合体で使用することに関する。本発明は、ビーズまたは微粒子、ビーズの複合体、タグ、標識、またはビーズに付着した細胞を分離および検出する方法、検定を行うディスク、および関連する検出システムを含む。
[Summary of Invention]
The present invention relates to performing assays, and in particular, to using various concentrations of beads individually or in a complex on a disk. The invention includes a method of separating and detecting beads or microparticles, bead complexes, tags, labels, or cells attached to the beads, a disk for performing the assay, and an associated detection system.
本発明の第一の態様によれば、検定を行うデバイスが提供される。このデバイスは、少なくとも１つの反応チャンバおよび少なくとも１つの分離チャンバを画定する回転可能ディスクを含む。反応チャンバは、制御可能なバリア手段を介して分離チャンバまたはチャネルにつながっている。密度勾配形成媒体が、分離チャンバ内に位置し、使用時に、異なる密度を有する複数の粒子を媒体の密度勾配に沿って分離できるようになっている。 According to a first aspect of the invention, a device for performing an assay is provided. The device includes a rotatable disk that defines at least one reaction chamber and at least one separation chamber. The reaction chamber is connected to the separation chamber or channel via a controllable barrier means. A density gradient forming medium is located in the separation chamber so that, in use, a plurality of particles having different densities can be separated along the density gradient of the medium.
本発明の第２の態様において、検定を行う別のデバイスが提供される。この特定のデバイスは、少なくとも１つの分離チャンバを画定する回転可能ディスクを含む。分離チャンバまたはチャネルは、密度勾配形成媒体を含み、使用時に、異なる浮遊密度を有する複数の粒子を媒体の密度勾配に沿って分離できるようになっている。 In a second aspect of the invention, another device for performing the assay is provided. This particular device includes a rotatable disk that defines at least one separation chamber. The separation chamber or channel contains a density gradient forming medium so that, in use, a plurality of particles having different buoyant densities can be separated along the density gradient of the medium.
回転可能ディスクは、回転可能シャフトと取り外し可能に係合するようになっている中心開口を中心に回転するようになっている。また好ましくは、ディスクは、複数の半径方向に延在する反応チャンバおよび分離チャンバを画定する。カバーディスクが、反応チャンバを完成させるために用いられ、光透過性材料（例えば透明なプラスチック材料）で形成される。 The rotatable disc is adapted to rotate about a central opening adapted to removably engage the rotatable shaft. Also preferably, the disc defines a plurality of radially extending reaction chambers and separation chambers. A cover disk is used to complete the reaction chamber and is formed of a light transmissive material (eg, a transparent plastic material).
回転可能ディスクのベースは、コンパクトディスク（ＣＤ）、書き込み可能ＣＤ（ＣＤ−Ｒ）、ＣＤ−ＲＷ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、または蛍光および光磁気ディスクを含む他の標準的なあるいは専用の光ディスクフォーマットであってよい。 The base of the rotatable disc includes a compact disc (CD), a writable CD (CD-R), a CD-RW, a digital versatile disc (DVD), a DVD-R, a DVD-RW, or a fluorescent and magneto-optical disc. Other standard or dedicated optical disc formats may be used.
分離チャンバまたはチャネルには、密度勾配形成媒体が準備される。適切な媒体の例は、Pharmacia Biotech社によって商標Ｐｅｒｃｏｌｌとして提供されるゲルである。密度
勾配は、ゲル内に事前に形成されるか、あるいは求心力を与えることによって生じ得る。本発明の一実施形態において、密度勾配は、ディスクをその中心軸を中心に回転させることによって形成および維持される。有利には、密度勾配媒体は透明または光透過性である。
A density gradient forming medium is provided in the separation chamber or channel. An example of a suitable medium is a gel provided by Pharmacia Biotech under the trademark Percoll. The density gradient can be pre-formed in the gel or can be created by applying centripetal force. In one embodiment of the invention, the density gradient is formed and maintained by rotating the disk about its central axis. Advantageously, the density gradient medium is transparent or light transmissive.
ディスクデバイスの使用中、反応チャンバに、異なる密度および／またはサイズを有する複数の微粒子が導入される。適切な微粒子には、Pharmacia Biotech社から入手できる
密度マーカビーズがある。好ましくは、ビーズは所定の密度およびサイズである。ビーズはまた、識別の目的で色分けされていても、あるいは蛍光であってもよい。
During use of the disk device, a plurality of microparticles having different densities and / or sizes are introduced into the reaction chamber. Suitable microparticles include density marker beads available from Pharmacia Biotech. Preferably, the beads are of a predetermined density and size. The beads may also be color coded for identification purposes or fluorescent.
ディスクが回転され、制御可能なバリア手段が作動すると、ビーズまたは微粒子は、求心力下で反応チャンバから移動することができる。微粒子は、その密度が周囲媒体の密度と等しい分離チャンバまたはチャネルに沿った点に達すると、静止する。これが生じるとき、微粒子またはビーズは等密度点に達したと言われる。 When the disc is rotated and the controllable barrier means is activated, the beads or microparticles can move out of the reaction chamber under centripetal force. The microparticles become stationary when they reach a point along the separation chamber or channel whose density is equal to the density of the surrounding medium. When this occurs, the microparticles or beads are said to have reached an isodensity point.
微粒子の最低密度は密度勾配媒体の最低密度よりも高い。したがって、平衡状態では、反応チャンバに粒子は残っていない。 The minimum density of the microparticles is higher than the minimum density of the density gradient medium. Thus, at equilibrium, no particles remain in the reaction chamber.
本発明の特定の一実施形態では、特定の抗原および／または抗体がビーズ表面上に固定化され得る。例えば、抗体の選択のためにサンプルを分析するには、対応して選択した抗原を特定の密度のビーズ上に固定化してよい。 In one particular embodiment of the invention, specific antigens and / or antibodies may be immobilized on the bead surface. For example, to analyze a sample for antibody selection, the corresponding selected antigen may be immobilized on a specific density of beads.
上記のように、抗体および抗原を用いて互いを検出することができる。抗体は、対応する抗原と選択的に結合し、結合種は、標識または「タグ」を用いることによって識別することができる。例えば蛍光抗ＩｇＧの標識試薬を用いてよい。蛍光抗ＩｇＧは、標的抗体のエピトープに結合する。したがって、結果として生じる複合体は、抗ＩｇＧ標識の光学特性によって識別することができる。 As described above, antibodies and antigens can be used to detect each other. The antibody selectively binds to the corresponding antigen and the binding species can be distinguished by using a label or “tag”. For example, a fluorescent anti-IgG labeling reagent may be used. The fluorescent anti-IgG binds to the epitope of the target antibody. Thus, the resulting complex can be distinguished by the optical properties of the anti-IgG label.
本発明の別の実施形態では、反応チャンバに、蛍光抗ＩｇＧと、ビーズまたは微粒子の少なくとも２つのグループとをロードする。各グループは、異なる密度を有し、抗原が付着している。次に反応チャンバに、例えば血液または血清のサンプルを導入する。サンプル中の抗体は、固定化した抗原と蛍光抗ＩｇＧの両方と複合体を形成（complex）し得る
。
In another embodiment of the invention, the reaction chamber is loaded with fluorescent anti-IgG and at least two groups of beads or microparticles. Each group has a different density and has antigens attached. A sample of blood or serum, for example, is then introduced into the reaction chamber. The antibody in the sample can be complexed with both the immobilized antigen and the fluorescent anti-IgG.
本発明のさらに別の実施形態では、異なる所定の密度、形状、および／またはサイズの少なくとも２つの微粒子を含む結合パートナーが反応チャンバにロードされる。各微粒子または結合パートナーには、関心の抗原すなわち標的抗原に対して親和性を有する少なくとも１つの抗体が付着している。各特定の微粒子に付着した抗体は、標的抗原上の異なるエピトープに対して特異的な親和性を有する。標的抗原を含有するサンプルを反応チャンバに導入した場合、サンプルは次に、異なる結合パートナー上の両方の固定化された抗体と複合体を形成し、よって結合パートナー−微粒子複合体を形成する。本開示を与えられた当業者には明らかであるように、ビーズの複合体形成は、２つのビーズまたは結合パートナーに限定されず、異なる密度、形状、および／またはサイズの３つ以上の微粒子を伴う多粒子またはマルチパラメータ試験形式において行うことができる。 In yet another embodiment of the invention, a binding partner comprising at least two microparticles of different predetermined density, shape, and / or size is loaded into the reaction chamber. To each microparticle or binding partner is attached at least one antibody having affinity for the antigen of interest, ie the target antigen. Antibodies attached to each specific microparticle have specific affinity for different epitopes on the target antigen. When a sample containing the target antigen is introduced into the reaction chamber, the sample then forms a complex with both immobilized antibodies on different binding partners, thus forming a binding partner-microparticle complex. As will be apparent to those of skill in the art given this disclosure, bead complexation is not limited to two beads or binding partners, but can involve three or more microparticles of different densities, shapes, and / or sizes. It can be done in the accompanying multiparticulate or multiparameter test format.
本発明のさらに別の実施形態において、結合パートナーは、既知の密度の少なくとも１つのビーズまたは微粒子と、１つの細胞とを含んでよく、ビーズには、細胞の表面マーカ上の少なくとも１つのエピトープと結合する少なくとも１つの抗体が付着している。よって、反応チャンバにおいて細胞とビーズを混合すると、ビーズ上の抗原が細胞表面マーカと結合することにより、細胞−ビーズ複合体が形成される。複合体形成反応は、単一の細
胞またはビーズに限定されず、複数の細胞が単一のビーズに結合しても、複数のビーズが単一の細胞に結合してもよい。ビーズは、異なる細胞上の表面マーカに対して親和性を有する１つまたは複数のタイプの抗体を含んでよい。細胞表面マーカは、クラスタ指定マーカ、細胞表面タンパク質、細胞表面糖タンパク質、糖、または認識されることができるか、あるいは抗体に結合することができる細胞表面上の任意の物質を含む可能性がある。
In yet another embodiment of the invention, the binding partner may comprise a known density of at least one bead or microparticle and a cell, the bead comprising at least one epitope on a surface marker of the cell. At least one antibody that binds is attached. Thus, when the cells and beads are mixed in the reaction chamber, the antigen on the beads binds to the cell surface marker to form a cell-bead complex. The complex formation reaction is not limited to a single cell or bead, and multiple cells may bind to a single bead or multiple beads may bind to a single cell. The beads may contain one or more types of antibodies that have affinity for surface markers on different cells. Cell surface markers can include cluster-designated markers, cell surface proteins, cell surface glycoproteins, sugars, or any substance on the cell surface that can be recognized or that can bind to an antibody. .
本発明の別の実施形態では、ビーズまたは微粒子、細胞、およびタグを任意の組み合わせで含む複数の結合パートナーを用い、少なくとも２つの結合パートナを含む複合体を形成してマルチパラメータ試験を作り出すことにより、増幅検定を行ってもよい。微粒子および／または細胞は異なる物理的特性を有するため、本発明ではこれを有利に使用する。これらの特性は例えば、密度、サイズ、質量、形状、色、および／または表面特性の違いを含む可能性がある。 In another embodiment of the invention, a plurality of binding partners comprising beads or microparticles, cells, and tags in any combination are used to form a complex comprising at least two binding partners to create a multiparameter test. An amplification assay may be performed. Because microparticles and / or cells have different physical properties, this is advantageously used in the present invention. These properties can include, for example, differences in density, size, mass, shape, color, and / or surface properties.
反応チャンバにおける複合体形成反応は、ディスクが回転している間に行われてよい。別法として、回転は、複合体形成反応が終了してから開始されてもよい。いずれにせよ、回転は、分離チャンバの長さに沿って密度勾配を形成および／または維持する役目を果たす。複合体形成反応はまた、ディスクの外部で実行されてから、分析のために反応チャンバにロードされてもよい。 The complex formation reaction in the reaction chamber may be performed while the disk is rotating. Alternatively, the rotation may be initiated after the complex formation reaction is complete. In any case, the rotation serves to create and / or maintain a density gradient along the length of the separation chamber. The complex formation reaction may also be performed outside the disk and then loaded into the reaction chamber for analysis.
密度勾配が確立されたら、制御可能なバリアを除去する。回転によって生じる求心力により、ビーズまたは微粒子が反応チャンバから分離チャンバへ移動する。単数または複数のビーズに結合した所望の標的もまた、反応チャンバから分離チャンバへ運ばれる。ビーズ、ビーズ複合体、またはビーズ−細胞複合体は、異なる密度を有するために、分離チャンバの長さに沿って異なる位置で静止することになる。関連する光バイオディスクの様々な構成要素の一実施形態に関する詳細は、図面に関連して後述する。 Once the density gradient is established, the controllable barrier is removed. The centripetal force generated by the rotation moves the beads or particulates from the reaction chamber to the separation chamber. The desired target bound to the bead or beads is also transferred from the reaction chamber to the separation chamber. The beads, bead complex, or bead-cell complex will have different densities and therefore will rest at different locations along the length of the separation chamber. Details regarding one embodiment of the various components of the associated optical bio-disc are described below in connection with the drawings.
上記で説明したように、所望の抗体が結合しているビーズは、タグ付けあるいは標識されるか、または結合して２つ以上のビーズの複合体、あるいは２つ以上のビーズ−細胞複合体になる。したがって、それらのビーズは、以下でさらに詳述する光学手段によって見つけ出すか、または検出することができる。 As explained above, beads to which the desired antibody is bound may be tagged or labeled, or bound to a complex of two or more beads, or two or more bead-cell complexes. Become. Thus, these beads can be found or detected by optical means as described in further detail below.
反応チャンバ内の非結合および／または未反応物質は、求心力では分離チャンバまたはチャネルに引き込まれない。これは、非結合および／または未反応物質の密度が密度勾配媒体の最低密度よりも低いためである。したがって、面倒な洗浄ステップを必要とせずに、所望の物質を大量の反応混合液と分離することができる。 Unbound and / or unreacted material in the reaction chamber is not drawn into the separation chamber or channel by centripetal force. This is because the density of unbound and / or unreacted material is lower than the lowest density of the density gradient medium. Therefore, the desired substance can be separated from a large amount of the reaction mixture without requiring a cumbersome washing step.
分離されると、ディスクベースの走査デバイスを用いて、様々なビーズ、ビーズ複合体、またはビーズ−細胞複合体の位置を測定することができる。本件出願人の米国特許第５，８９２，５７７号は、本発明とともに用いることができる走査デバイスを記載する。 Once separated, a disk-based scanning device can be used to measure the location of various beads, bead complexes, or bead-cell complexes. Applicant's US Pat. No. 5,892,577 describes a scanning device that can be used with the present invention.
ディスクが回転している間に、電磁放射ビームでディスクの表面を走査することができる。このビームは、ディスクの光透過性カバーを透過し、分離チャンバ内の物質と相互作用する。下記のように、ディスクは、同一のまたは異なるサンプルがそれぞれ供給された複数の分離チャンバを備えていてよい。相互作用したすなわち「変調」ビームを検出して分析する。この分析は、ビームの位置に関する情報、ならびに分析中の物質の性質に関する情報を与える。標識ビーズ、複合体を形成したビーズ、またはビーズ−細胞複合体は、特徴的な方法で入射ビームと相互作用し、特徴的な変調信号を生成する。したがって、そのような変調信号が発生した場所を監視し、これらの信号を較正した対照の信号と比較することによって、サンプル中に存在する特定の標的の同一性（identity）を判定することができる。そのような信号の強度を測定することによって、特定の標的の量も推定するこ
とができる。
While the disk is rotating, the surface of the disk can be scanned with a beam of electromagnetic radiation. This beam passes through the light transmissive cover of the disk and interacts with the material in the separation chamber. As described below, the disc may comprise a plurality of separation chambers each fed with the same or different samples. An interacting or “modulated” beam is detected and analyzed. This analysis gives information about the position of the beam as well as information about the nature of the material under analysis. The labeled bead, complexed bead, or bead-cell complex interacts with the incident beam in a characteristic manner to produce a characteristic modulation signal. Thus, by monitoring where such modulated signals occur and comparing these signals to a calibrated control signal, the identity of a particular target present in the sample can be determined. . By measuring the intensity of such a signal, the amount of a particular target can also be estimated.
本発明のデバイスを用いて、上述の検定のいずれかの結果を比較することのできる対照を提供してもよい。 The device of the present invention may be used to provide a control that can compare the results of any of the above-described assays.
本発明の第３の態様によれば、検定を行う方法が提供される。本方法は、（１）少なくとも１つの反応チャンバおよび少なくとも１つの分離チャンバを画定する回転可能ディスクを準備するステップであって、反応チャンバは、制御可能なバリア手段を介して分離チャンバまたはチャネルにつながっており、分離チャンバは密度勾配形成媒体を有する、準備するステップと、（２）反応チャンバに、異なる所定の密度、形状、サイズ、および／または色を有する複数の粒子を導入するステップであって、粒子は特定の試薬を受け取るようになっている、ステップと、（３）反応チャンバに試験中のサンプルを導入するステップと、（４）ディスクを回転させるステップであって、それによって、求心力を与える、ステップと、（５）反応チャンバと分離チャンバの間の制御可能なバリアを制御するステップであって、複数の粒子が求心力下で反応チャンバから分離チャンバへ移動し、粒子を密度に応じて分離できるようにする、ステップと、（６）光学手段によって分離チャンバまたはチャネルの内容物を分析するステップとを含む。 According to a third aspect of the present invention, a method for performing an assay is provided. The method comprises (1) providing a rotatable disc defining at least one reaction chamber and at least one separation chamber, the reaction chamber being connected to a separation chamber or channel via a controllable barrier means. A separation chamber having a density gradient forming medium, and (2) introducing a plurality of particles having different predetermined densities, shapes, sizes, and / or colors into the reaction chamber. The particles are adapted to receive a specific reagent; (3) introducing the sample under test into the reaction chamber; and (4) rotating the disk, thereby reducing the centripetal force. And (5) a step for controlling a controllable barrier between the reaction chamber and the separation chamber. Allowing a plurality of particles to move from the reaction chamber to the separation chamber under centripetal force, allowing the particles to be separated according to density, and (6) analyzing the contents of the separation chamber or channel by optical means Including the step of.
本方法は、ディスクを回転させる前に反応チャンバに標識試薬を導入するステップをさらに含んでもよい。別法として、標識試薬は、反応チャンバに混合物を導入する前に試験サンプルと混合されてもよい。 The method may further comprise introducing a labeling reagent into the reaction chamber prior to rotating the disk. Alternatively, the labeling reagent may be mixed with the test sample prior to introducing the mixture into the reaction chamber.
本発明の様々な実施形態および態様の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付図面から明らかとなるだろう。 Other features and advantages of various embodiments and aspects of the present invention will become apparent from the following detailed description and the accompanying drawings.
本発明のさらなる目的、ならびにそれに貢献するさらなる特徴およびそこから生じる利点は、添付図面に示される以下の本発明の好適な実施形態の説明から明らかとなるだろう。図面において、同様の参照番号は一貫して同様の構成要素を示す。 Further objects of the present invention, as well as further features contributing thereto and advantages resulting therefrom, will become apparent from the following description of preferred embodiments of the invention shown in the accompanying drawings. In the drawings, like reference numbers generally indicate like elements.
［好適な実施形態の詳細な説明］
まず、本発明の一実施形態によるデバイスを示す図面の図１および図２を参照する。このデバイスは、米国特許第５，８９２，５７７号（その内容全体を本明細書中に援用する）に記載されているような光ディスクベースの走査デバイスと併せて使用するようになっている。
[Detailed Description of Preferred Embodiments]
Reference is first made to FIGS. 1 and 2 of the drawings illustrating a device according to an embodiment of the present invention. This device is intended to be used in conjunction with an optical disk based scanning device such as that described in US Pat. No. 5,892,577, the entire contents of which are incorporated herein.
図１および図２に示すように、デバイスは、カバー１４とベース１６の間に配置される本体１２からなるディスク１０を含む。本体１２、カバー１４、およびベース１６は接着されて、図１に示すような一体ディスクを形成する。ベース１６は、コンパクトディスク（ＣＤ）、書き込み可能ＣＤ（ＣＤ−Ｒ）、ＣＤ−ＲＷ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、または蛍光および磁気光学ディスクを含む他の標準的なあるいは専用の光ディスクフォーマットであってよい。カバー１４は、例えばポリカーボネートを含む透明なプラスチック材料で作られてよい。別法として、ディスクは逆に組み立てられてもよく、この場合、カバー１４が、コンパクトディスク（ＣＤ）、書き込み可能ＣＤ（ＣＤ−Ｒ）、ＣＤ−ＲＷ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、または任意の等価な光ディスクフォーマットとなる。本実施形態において、ベース１６は透明材料で作られる。ディスク１０には、例えば回転シャフトまたはスピンドルと取り外し可能に係合するようになっている中心穴１８（図１）が設けられる。
As shown in FIGS. 1 and 2, the device includes a
本体１２は、図２および図３に例示するような、複数の半径方向に延在する区画２０を
画定する。各区画２０は、反応チャンバ２２および分離チャンバまたはチャネル２４を含む（図３）。反応チャンバ２２には、デバイス１０のカバー１４の開口２８を介して物質を導入することができる。分離チャンバまたはチャネル２４には、求心力を与えると密度勾配を形成する媒体を事前にロードしておくことができる。このタイプの物質としては、例えばＰｅｒｃｏｌｌ密度媒体が含まれ得る。
The
本発明の一実施形態において、反応チャンバ２２は図２に例示するように、ディスクの中心に最も近いところに位置する。反応チャンバ２２は、制御可能なバリア２６（図３）を介して分離チャンバ２４と接続しており、分離チャンバには、密度勾配媒体が事前にロードされている。
In one embodiment of the invention, the
分離チャンバ２４の代替的な実施形態によれば、その形状は、直線で半径方向に向けられるのではなく、螺旋である（図３Ａ）。この実施形態では、実質的により長いチャンバまたはチャネルを形成することによって、単位長さ当たりのグラデーションをより微細にし、よって検定の分解能を高めることができる。よって本実施形態は、ディスクベースの密度クロマトグラフィシステム（本明細書中では「フロースルー（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）」システムとも呼ぶ）を提供する。本実施形態の代替的な実施態様は、図３Ｂに例示する蛇行構成、図３Ｃに示す正弦波形状、および図３Ｄに示す弓形も含む。図３Ｂに示す蛇行構成では、連続するコイルはそれぞれ、図示のように直径が増加していく。この構成において、個々のコイルは、ディスクの半径に沿ったそれぞれの点における対応する円周の弧と一致するわずかな弧形を有してもよい。図３Ｃに例示する正弦波構成では、連続するコイルはそれぞれ実質的に同じ直径を有する。図３Ｄに示す弓形の分離チャネル２４では、分離チャネル２４の長さは、ディスクの半径全体に及び、チャネル２４が実質的にディスクの中心から外縁まで延在するようにしてもよい。別法として、図３Ｄに示す弓形の分離チャネル２４の長さは、例えばディスクの半径の約半分のみに及んでもよい。この構成では、分離チャネルの２つの連続する環状部（annuli）をディスク上に設けてもよい。
According to an alternative embodiment of the
本発明の「フロースルー」システムの実施形態は、密度勾配クロマトグラフィに限定されず、例えば、サイズ排除、逆相、イオン交換、およびアフィニティクロマトグラフィを含むいかなるクロマトグラフィシステムを含んでもよい。代替的に、「フロースルー」システムは、ディスクベースのフローサイトメトリ用途において用いてもよい。 Embodiments of the “flow-through” system of the present invention are not limited to density gradient chromatography, and may include any chromatography system including, for example, size exclusion, reverse phase, ion exchange, and affinity chromatography. Alternatively, “flow-through” systems may be used in disk-based flow cytometry applications.
本発明の別の実施形態では、区画２０の向きを逆にしてもよく、この場合、反応チャンバ２２が今度はディスクの中心から最も遠くに位置する。この逆の反応チャンバの構成は、図３、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、および図３Ｄに例示する分離チャネル２４の実施形態のいずれにおいても実施することができる。これらの実施態様において、反応チャンバ２２および分離チャンバ２４は互いに流体連通している。区画２０には、密度媒体を事前にロードしておくか、あるいはディスクの外部で媒体を調製して微粒子および検定溶液と混合し、分析のために区画に加えることができる。本実施形態では、媒体の性質のために、求心力により密度勾配が生じ維持される。勾配が形成されると、ビーズは移動し、それぞれの浮遊密度に応じた媒体内の等密度点に定着する。この逆のチャンバシステムを本明細書中では、「浮遊密度分離システム」と呼ぶ。
In another embodiment of the invention, the orientation of the
次に、ディスク１０の区画２０に沿った断面図を示す図４を参照する。反応チャンバ２２は、制御可能なバリア２６によって分離チャンバ２４と分離している。バリア２６は、しきい値を超える求心力が与えられると破れる、壊れやすい膜から形成してよい。反応チャンバ２２は、異なる密度の複数のビーズ３０を収容する。本発明の一実施形態では、反応チャンバ２２は蛍光抗ＩｇＧも収容してよい。開口２８により、試験サンプルを反応チャンバ２２に導入することができる。
Reference is now made to FIG. 4, which shows a cross-sectional view along
次に、反応チャンバ２２内で生じる様々な抗原−抗体相互作用を、図５、図６、図７、および図８を参照して説明する。これらの図は、ビーズまたは微粒子３０ａ、３０ｂ、および３０ｃを示し、これらは一実施形態によれば、それぞれ色が異なる。ビーズ３０ａ、３０ｂ、または３０ｃは密度も異なり、図５のビーズ３０ａの密度が最も低く、図７のビーズ３０ｃの密度が最も高い。
Next, the various antigen-antibody interactions that occur in the
次に図５、図６、および図７を参照して、少なくとも１つの捕捉ビーズ、１つの抗原または標的物質（target agent）、および抗原−抗体相互作用により結合して複合体になった１つの標識タグを含むサンドイッチ型検定を例示する。各捕捉ビーズ３０ａ、３０ｂ、または３０ｃには、特定の抗体または捕捉プローブ３２ａ、３２ｂ、または３２ｃが付着している。抗体３２ａ、３２ｂ、および３２ｃは、サンプル中に存在する可能性のある抗原または標的物質３４ａ、３４ｂ、または３４ｃに対する親和性に基づいて具体的に選択される。抗体３２ａ、３２ｂ、および３２ｃはそれぞれ、ビーズ３０ａ、３０ｂ、および３０ｃの表面上に固定化される。図５ないし図８から分かるように、サンプル中に存在する任意の抗原３４ａ、３４ｂ、または３４ｃは、ビーズ３０ａ、３０ｂ、または３０ｃ上に固定化された抗体３２ａ、３２ｂ、または３２ｃと特異的に結合する。蛍光抗ＩｇＧ３８が結合抗原３４ａ、３４ｂ、または３４ｃと結合すると、サンドイッチ型の複合体３６ａ、３６ｂ、または３６ｃが形成される。
Referring now to FIG. 5, FIG. 6, and FIG. 7, at least one capture bead, one antigen or target agent, and one complex bound by antigen-antibody interaction 2 illustrates a sandwich type assay including a labeled tag. A specific antibody or
次に特に図８を参照して、少なくとも１つの捕捉ビーズまたは捕捉微粒子３０ｅ、１つの標的物質３４ｄ、および１つのレポータービーズまたはレポーター微粒子３０ｄを含む結合パートナービーズまたは微粒子の複合体３６ｄを示す。ビーズパートナー複合体は、標的抗原または標的物質３４ｄが、ビーズ結合パートナー３０ｅおよび３０ｄとそれぞれ結合した捕捉プローブ３２ｅおよびレポータープローブ３２ｄと特異的に結合することによって形成される。プローブ３２ｄおよび３２ｅはそれぞれ、標的３４ｄ上の異なるエピトープに対して親和性を有し、互いに対しては親和性を有しない。このサンドイッチ検定において結果として形成される結合パートナービーズ複合体３６ｄは、２つのビーズ３０ｄおよび３０ｅの平均密度にほぼ等しい密度を有する。したがって、結合パートナービーズ複合体３６ｄが分離チャンバ２４（図３、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、および図３Ｄ）内の密度勾配媒体に導入されると、複合体は、複合体を形成していないビーズ３０ｄおよび３０ｅの間の等密度点で静止することになる。別法として、ビーズ結合パートナーのうちの１つを細胞結合パートナーとしてもよく、この場合、捕捉ビーズ３０ｅまたはレポータービーズ３０ｄは、上記でおよび以下の図１２に関して述べるように、細胞上の細胞表面マーカに対して特異的な親和性を有するプローブを有する。
Referring now specifically to FIG. 8, a binding partner bead or
次に、図９、図１０、図１１、および図１２を参照してデバイス１０の動作を説明する。明確にするために、複合体３６ａ、３６ｂ、および３６ｃは図面から省いている。これらの複合体をここでは、図５、図６、および図７で示したそれぞれのビーズ番号で呼ぶ。
Next, the operation of the
まず図９を参照して、ロードされて使用できる状態になった区画２０を示す。本実施形態において、反応チャンバ２２は、蛍光抗ＩｇＧおよび異なる密度の捕捉ビーズ３０ａ、３０ｂ、および３０ｃを含む。制御可能なバリア２６は、反応チャンバ２２内の物質が分離チャンバ２４内へ移動することを防ぐ。
Referring first to FIG. 9, the
例として、限定するものではないが、血清のサンプルを反応チャンバ２２に導入する。このサンプル中に抗体または標的物質３４ａ、３４ｂ、または３４ｃが存在する場合、それらは固定化された抗原または捕捉プローブ３２ａ、３２ｂ、または３２ｃおよび蛍光抗ＩｇＧ３８と結合して、図５、図６、および図７に示したサンドイッチ型の複合体３６ａ、３６ｂ、または３６ｃを形成する。次にディスク１０を回転させる。Ｐｅｒｃｏｌｌ媒
体を含む密度媒体内に密度勾配が形成される。本実施形態では、媒体で最も濃度の高いところがディスク１０の中心の最も近くにある。ディスク１０の回転がしきい値速度を越え、求心力がしきい値を越えると、図１０に示すように、制御可能なバリア２６が破れる。
By way of example and not limitation, a sample of serum is introduced into the
ビーズ３０ａ、３０ｂ、および３０ｃは、求心力に応答して、反応チャンバ２２から分離チャンバ２４へ移動する。ビーズ３０ａ、３０ｂ、および３０ｃは、分離チャンバ２４の長さに沿って移動し、それぞれの等密度点で静止する。上で定義したように、ビーズ３０ａ、３０ｂ、または３０ｃは、その密度が周囲の媒体の密度と等しくなったとき、それぞれの等密度点に到達する。ビーズの等密度点の正確な位置はその密度により異なる。したがって、図５のビーズ３０ａはディスクの中心から最も離れたところで静止する。対照的に、図７の最も密度の高いビーズ３０ｃはディスクの中心に最も近いところで静止する。
未反応物質（すなわち、未反応サンプルと未反応の蛍光抗ＩｇＧ）は、Ｐｅｒｃｏｌｌ媒体よりも密度が低いため、反応チャンバ２２内に残る。
Unreacted material (ie, unreacted sample and unreacted fluorescent anti-IgG) remains in the
図１１に示すように、捕捉ビーズ３０ａ、３０ｂ、および３０ｃは、Ｐｅｒｃｏｌｌ媒体を含む密度勾配内で様々なバンドに分離される。これらのバンドは、蛍光抗ＩｇＧ３８が存在するために蛍光を発する。ビーズ３０ａ、３０ｂ、および３０ｃの位置は、例えば援用される米国特許第５，８９２，５７７号に記載されるようなタイプのディスクベースの走査デバイス、または任意の好適な蛍光タイプの光ディスクリーダあるいはスキャナを用いることによって測定してよい。
As shown in FIG. 11,
同様に、図１２は、上述し図８に示すように形成された異なる密度および／またはサイズのビーズを含む２つの結合パートナーを用いたサンドイッチ型検定を示す。図８に関連して述べ、またここで図１２に示すように、結果として得られる結合パートナービーズ複合体は、個々の成分ビーズの等密度点の間に等密度点を有する。ディスクが回転されると、ビーズは、密度勾配内で移動し、それぞれの等密度点で静止する。したがって、複合体３６ｄは、複合体を形成していないビーズ３０ｄおよび３０ｅの間で静止する。上記のように、ビーズの複合体形成は、結合パートナービーズ複合体に限定されず、３つ以上の異なる結合パートナーを有する複合体を含んでもよい。結果として得られる複合体は、複合体中の全ての結合パートナーの等密度点の平均に等しい等密度点を有する。結合パートナーは、ビーズに限定されず、ビーズ、細胞、および標識またはタグを任意の組み合わせで含んでもよい。
Similarly, FIG. 12 shows a sandwich-type assay using two binding partners comprising different density and / or size beads formed as described above and shown in FIG. As described in connection with FIG. 8 and now shown in FIG. 12, the resulting binding partner bead complex has isodensity points between the isodensity points of the individual component beads. As the disk is rotated, the beads move within the density gradient and rest at their respective isodensity points. Therefore, the complex 36d is stationary between the
再び図１１を参照して、ディスク１０が回転している間に、放射源４６からの電磁放射ビーム４０により、ディスク１０のカバー１４を走査してよい。ビーム４０は、カバー１４を透過し、分離チャンバ２４内の物質と相互作用する。相互作用した、戻りあるいは「変調」ビーム４２は、検出器４８によって検出し、その後、コンピュータ５０または他の分析器によって分析することができる。分析により、入射ビーム４０の位置に関する情報および／または分析中の物質の性質に関する情報を提供することができる。ディスクは、他のタイプの試験チャンバを含むことができ、システムによって読み取り可能なソフトウェアを有することができる。そのようなソフトウェアは動作中のコンピュータに、例えば放射源４６を制御して特定の特性を有する光を送るように、またはディスクを回転させるモータ５２（ディスク速度、方向、および加速度を含む）を制御するように指示することができる。図１に関連して述べたような、ディスクが逆に組み立てられる別の実施形態では、電磁放射ビームでディスクの下側からベース１６を介してカバー１４を走査することができる。さらに別の実施形態では、ビームがディスクアセンブリを通過し、ビーム源に対して反対側に位置する検出器によって検出できるようにしてもよい。この実施形態に関する詳細は米国特許第５，８９２，５７７号に関連して記載される。
Referring again to FIG. 11, the
本発明のさらなる代替的な実施形態において、入射ビームは静止状態に保持される。この代替的な実施形態の方法によれば、入射した電磁放射ビームを分離チャンバ内の定点へ送るステップが提供される。本方法はまた、粒子が分離チャンバを通って流動する間に微粒子または標識タグを検出するステップであって、それによって、媒体を通る微粒子の沈降速度または溶出時間を求める、検出するステップを含む。これにより、微粒子に結合した任意の標的の存在および量を有利に判定することもできる。微粒子または細胞を時間により分離および検出するこの方法は、本明細書中で「フロースルー」システムと呼ばれるもので、密度クロマトグラフィシステムと似ている。 In a further alternative embodiment of the invention, the incident beam is kept stationary. According to the method of this alternative embodiment, there is provided a step of sending an incident electromagnetic radiation beam to a fixed point in the separation chamber. The method also includes detecting a microparticle or label tag as the particle flows through the separation chamber, thereby determining the sedimentation rate or elution time of the microparticle through the medium. This can also advantageously determine the presence and amount of any target bound to the microparticles. This method of separating and detecting microparticles or cells by time is referred to herein as a “flow-through” system and is similar to a density chromatography system.
蛍光抗ＩｇＧ、ビーズ、ビーズ複合体、またはビーズ−細胞複合体は、特徴的な方法で入射ビームと相互作用し、特徴的な変調信号を生成する。したがって、これらの特徴的な変調信号を監視することによって、ビーズ、ビーズ複合体、およびビーズ−細胞複合体の正確な位置および量を求めることができる。これらの結果を対照実験の結果と比較することによって、試験中のサンプル中に存在する抗原の同一性および量を推定することができる。 A fluorescent anti-IgG, bead, bead complex, or bead-cell complex interacts with the incident beam in a characteristic manner to produce a characteristic modulation signal. Thus, by monitoring these characteristic modulation signals, the exact location and amount of beads, bead complexes, and bead-cell complexes can be determined. By comparing these results with the results of a control experiment, the identity and amount of antigen present in the sample under test can be estimated.
別の実施形態では、本発明のデバイスを用いて、サンプルを抗体に関して分析することができる。ここで、特定の抗原をビーズ上に固定化してもよい。標的抗体を含有するサンプルを抗原結合ビーズおよび蛍光ＩｇＧ等の標識試薬と混合する。ＩｇＧは、抗体の一部分（例えばＦｃ部分）に対して親和性を有する。次に、結合ＩｇＧからの信号を用いて、ビーズ上の抗原に結合した所望の抗体を検出することができる。ビーズ上に固定化することができる抗原の非限定的な例として、肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）（例えば米国特許第６，３１２，８８９号）、ヘルペス（例えば米国特許第６，１２６，９４４号）、またはＨＩＶ（例えば米国特許第５，８３４，２６７号）由来のウイルス抗原、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（例えば米国特許第６，２４５，３３１号）または炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（例えば米国特許第５，６７７，２７４号）由来の細菌抗原、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）（例えば米国特許第６，１２０，７７０号）、らい菌（Ｍ． ｌｅｐｒａｅ）（例えば米国特許第４，９０６，７４２号）、またはリーシュマニア（Ｌｅｉｃｈｍａｎｉａ）（例えば米国特許第５，４１１，８６５号）由来の寄生虫抗原、ならびに癌の疾患マーカ抗原（例えば米国特許第６，３５０，５８３号および第６，２４２，２０３号）がある。 In another embodiment, the device of the invention can be used to analyze a sample for antibodies. Here, a specific antigen may be immobilized on the beads. The sample containing the target antibody is mixed with antigen binding beads and a labeling reagent such as fluorescent IgG. IgG has an affinity for a portion of an antibody (eg, an Fc portion). The signal from the bound IgG can then be used to detect the desired antibody bound to the antigen on the bead. Non-limiting examples of antigens that can be immobilized on beads include hepatitis (eg, US Pat. No. 6,312,889), herpes (eg, US Pat. No. 6,126,944), or Viral antigens from HIV (eg, US Pat. No. 5,834,267), M. tuberculosis (eg, US Pat. No. 6,245,331) or Bacillus anthracis (eg, US Pat. , 677,274), Plasmodium (eg, US Pat. No. 6,120,770), M. leprae (eg, US Pat. No. 4,906,742), or Leichmania (eg, US Pat. No. 5,411,865) Parasite antigens years, as well as disease marker antigen for cancer (e.g., U.S. Pat. Nos. 6,350,583 and No. 6,242,203).
本明細書中のいくつかの実施形態は、捕捉および／または検出目的で免疫グロブリンＩｇＧを利用する。捕捉および／または検出目的でＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等の他の免疫グロブリンを用いることもできる。さらに、本発明の検定が用いる免疫グロブリンは、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体または組換え抗体もしくはその断片とすることもできる。 Some embodiments herein utilize immunoglobulin IgGs for capture and / or detection purposes. Other immunoglobulins such as IgM, IgA, IgE can also be used for capture and / or detection purposes. Furthermore, the immunoglobulin used in the assay of the present invention can be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a recombinant antibody or a fragment thereof.
本発明のシステムおよび方法は抗原−抗体相互作用に限定されないことに留意すべきである。本発明では、結合パートナーになることができる任意の部分を用いることができる。非限定的な例として、本発明の一実施形態は、ビーズに結合した受容体タンパク質を用い、これは、サンプルに曝されるとそれぞれのリガンドに結合する。次に、ビーズに付着した受容体結合リガンドを、このリガンドに特異的な蛍光ＩｇＧ等の標識試薬を用いて検出することができる。別法として、リガンドの存在は、同じリガンドの異なる部分に対して親和性を有する別の受容体タンパク質を有する第２のビーズを用いた結合パートナービーズ複合体の形成によっても検出することができる。別の例において、検定を酵素／基質の相互作用に基づいて行い、酵素または基質がビーズと結合するようにすることもできる。この場合、酵素または基質のいずれかの検出は、適切に標識されたいずれかの分子に対して適切な特異性を有する免疫グロブリンを用いて実現することができる。別法として、
ビーズと結合した酵素の検出は、酵素と反応して色や蛍光等の検出可能な生成物を生じる適切な基質を用いて行ってもよい。基質が、ビーズによって捕捉される標的である場合、基質と相互作用して検出可能な生成物を生じる検定混合物に適切な酵素を導入してもよい。さらに別の実施形態では、抗体を検定から完全に除外することができる。ビーズは、サンプル中の特定の糖部分と特異的に結合するレクチン分子でコーティングすることができる。その場合、結合糖の検出は、同じく糖と結合する標識した第２のレクチン、または同じく糖と結合するレクチンを有する第２のビーズを用いて実現することができる。
It should be noted that the systems and methods of the present invention are not limited to antigen-antibody interactions. In the present invention, any moiety that can be a binding partner can be used. As a non-limiting example, one embodiment of the present invention uses a receptor protein bound to a bead that binds to the respective ligand when exposed to a sample. Next, the receptor-bound ligand attached to the beads can be detected using a labeling reagent such as fluorescent IgG specific for this ligand. Alternatively, the presence of the ligand can also be detected by formation of a binding partner bead complex with a second bead having another receptor protein that has an affinity for a different portion of the same ligand. In another example, the assay can be based on an enzyme / substrate interaction such that the enzyme or substrate binds to the beads. In this case, detection of either the enzyme or the substrate can be achieved using an immunoglobulin with the appropriate specificity for any appropriately labeled molecule. Alternatively,
Detection of the enzyme bound to the beads may be performed using a suitable substrate that reacts with the enzyme to produce a detectable product such as color or fluorescence. If the substrate is a target that is captured by the beads, an appropriate enzyme may be introduced into the assay mixture that interacts with the substrate to produce a detectable product. In yet another embodiment, the antibody can be completely excluded from the assay. The beads can be coated with lectin molecules that specifically bind to specific sugar moieties in the sample. In that case, detection of bound sugar can be achieved using a second labeled lectin that also binds to the sugar or a second bead that also has a lectin that also binds to the sugar.
また、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む特定の核酸配列を検出する検定の使用も考えられる。例として、限定するものではないが、センス鎖またはアンチセンス鎖をビーズ上に固定化してサンプルに曝してもよい。サンプル中に対応するセンス分子またはアンチセンス分子が存在する場合、これは、センス分子とアンチセンス分子の間の水素結合を促す条件下で適切な時間後にビーズと結合したオリゴヌクレオチドプローブと結合する。この場合、検出は、サンプル中のスクリーニング中の核酸分子のみとハイブリダイズする抗体または第３の核酸分子等の適切に標識されたマーカに複合体を曝すことによって実現することができる。別法として、抗体または第３の核酸分子を、異なる密度および電磁特性の別のビーズ（結合パートナー）と結合させることもできる。この場合、結果として得られるビーズ複合体は、図８、図１１、および図１２に関連して上述した入射ビームによって検出することができる。 Also contemplated is the use of assays that detect specific nucleic acid sequences, including DNA or RNA. By way of example and not limitation, the sense strand or antisense strand may be immobilized on a bead and exposed to the sample. If the corresponding sense or antisense molecule is present in the sample, it will bind to the oligonucleotide probe bound to the bead after an appropriate time under conditions that promote hydrogen bonding between the sense and antisense molecules. In this case, detection can be achieved by exposing the complex to an appropriately labeled marker such as an antibody or third nucleic acid molecule that hybridizes only with the nucleic acid molecule being screened in the sample. Alternatively, the antibody or third nucleic acid molecule can be bound to another bead (binding partner) of different density and electromagnetic properties. In this case, the resulting bead complex can be detected by the incident beam described above in connection with FIGS. 8, 11 and 12.
本発明の範囲から逸脱することなく、上述の実施形態に対して様々な修正および変更を行ってもよい。例えば、制御可能なバリアを機械的または電子的に制御してもよい。別法として、バリアは、分離チャンバと反応チャンバの間に配置される***した突出部の形をとってもよい。本実施形態では、物質は、デバイスの回転がしきい値速度を越えてからでないと、反応チャンバから分離チャンバへ通過することができない。このしきい値未満では、求心力は、突出部を越えて物質を引き込むには不十分である。使用される回転は時計回りまたは反時計回りとするか、あるいは検定溶液を特定の方向または方法で移動させるかまたは攪拌することが望ましい場合には段階的に交替してもよい。上記の説明は、生物学的な例に関するものであったが、サンプルは化学的な目的（有毒金属、有機毒素、または無機毒素を含む特定の不純物に関して水を試験する等）で試験することもできる。 Various modifications and changes may be made to the above-described embodiments without departing from the scope of the present invention. For example, the controllable barrier may be controlled mechanically or electronically. Alternatively, the barrier may take the form of a raised protrusion disposed between the separation chamber and the reaction chamber. In this embodiment, the substance can only pass from the reaction chamber to the separation chamber after the device rotation exceeds the threshold speed. Below this threshold, the centripetal force is insufficient to draw material beyond the protrusion. The rotation used may be clockwise or counterclockwise, or may be phased out if it is desired to move or stir the assay solution in a particular direction or manner. Although the above description was for biological examples, samples can also be tested for chemical purposes (such as testing water for specific impurities including toxic metals, organic toxins, or inorganic toxins). it can.
［総括］
本明細書中で述べた方法および装置は、例えば以下の同一出願人に譲渡される同時係属中の出願または発行された特許に開示される方法、システム、およびデバイスのいずれにも容易に適応させ、それとともに用い、それに関して実施することができる。１９９９年６月１１日に出願された「Apparatus and Methods for Conducting Assays」と題する米
国特許出願第０９／２８４，４２１号、１９９９年９月１０日に出願された「Spatially Addressable, Cleavable Reflective Signal Elements, Assay Device and Method」と題する米国特許出願第０９／３９４，１３７号（現在は米国特許第６，３１２，９０１号）、１９９８年７月２１日に出願された「Optical Disk-based Assay Devices and Methods」と題する米国特許出願第０９／１２０，０４９号（現在は米国特許第６，３４２，３４９号）、１９９８年４月２１日に出願された「Laboratory in a Disk」と題する米国特許出願第０９／０６４，６３６号（現在は米国特許第６，０３０，５８１号）、１９９９年１０月２６日に出願された「Trackable Optical Discs with Concurrently Readable Nonoperational Structures」と題する米国特許出願第０９／４２１，８７０号、２００１年１１月２０日に出願された「Methods and Apparatus for Detecting and Quantifying Lymphocytes with Optical Biodiscs」と題する米国特許出願第０９／９８８，７２８号、
２００２年１月４日に出願された「Dual Bead Assays Including Covalent Linkages For
Improved Specificity And Related Optical Analysis Discs」と題する米国特許出願第１０／０３８，２９７号、２００２年３月１４日に出願された「Dual Bead Assays Using
Cleavable Spacers and/or Ligation to Improve Specificity and Sensitivity Including Related Methods and Apparatus」と題する米国特許出願第１０／０９９，２５６号
、および２００２年３月１４日に出願された「Use of Restriction Enzymes and Other Chemical Methods to Decrease Non-Specific Binding in Dual Bead Assays and Related
Bio-Discs, Methods, and System Apparatus for Detecting Medical Targets」と題す
る米国特許出願第１０／０９９，２６６号。これら全ての内容全体を参照により本明細書中に援用する。
[Summary]
The methods and apparatus described herein can be readily adapted to any of the methods, systems, and devices disclosed in, for example, the following co-pending applications or issued patents assigned to the same applicant: , Can be used with and implemented with it. US patent application Ser. No. 09 / 284,421 entitled “Apparatus and Methods for Conducting Assays” filed Jun. 11, 1999; “Spatially Addressable, Cleavable Reflective Signal Elements,” filed Sep. 10, 1999; US patent application Ser. No. 09 / 394,137 entitled “Assay Device and Method” (currently US Pat. No. 6,312,901), “Optical Disk-based Assay Devices and Methods” filed on July 21, 1998. No. 09 / 120,049 (currently US Pat. No. 6,342,349), US patent application 09 entitled “Laboratory in a Disk” filed April 21, 1998. / 064,636 (currently US Pat. No. 6,030,581), “Trackable Optical Discs with Concurrently Readable Nonoperational Structures” filed on October 26, 1999, US patent application Ser. No. 09 / 421,870, filed on November 20, 2001, entitled "Methods and Apparatus for Detecting and Quantifying Lymphocytes with Optical Biodiscs entitled" US patent application Ser. No. 09 / 988,728,
“Dual Bead Assays Including Covalent Linkages For” filed on January 4, 2002
US Patent Application No. 10 / 038,297 entitled “Improved Specificity And Related Optical Analysis Discs”, “Dual Bead Assays Using” filed on March 14, 2002
US patent application Ser. No. 10 / 099,256 entitled “Cleavable Spacers and / or Ligation to Improve Specificity and Sensitivity Including Related Methods and Apparatus” and “Use of Restriction Enzymes and Other Chemical Methods” filed on Mar. 14, 2002. to Decrease Non-Specific Binding in Dual Bead Assays and Related
No. 10 / 099,266 entitled “Bio-Discs, Methods, and System Apparatus for Detecting Medical Targets”. The entire contents of all of which are hereby incorporated by reference.
本明細書中で言及された他の全ての特許、特許出願、および刊行物もまた、その内容全体を参照により本明細書中に援用される。 All other patents, patent applications, and publications mentioned in this specification are also hereby incorporated by reference in their entirety.
本発明を、或る種の好適な実施形態および技術例を参照して詳細に説明してきたが、本発明は、それらの厳密な実施形態または例に限定されないことが理解されるべきである。むしろ、現時点で本発明を実施する最良の形態を説明する本開示を考慮すれば、当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく多くの修正および変形が思い浮かぶであろう。例えば、本発明では上述のように、密度クロマトグラフィ形式または「フロースルー」システムでの時間による微粒子または細胞の分離および検出が考えられる。本発明のこの実施態様において、微粒子または細胞は密度媒体よりも密度が高い。遠心力を与えると、微粒子または細胞は移動し、密度媒体内でそれぞれの沈降速度に応じて分離される。その場合、微粒子または細胞は、それらが固定された検出器を通過する際に検出することができる。異なる微粒子または細胞を異なる標識でタグ付けし、サンプル中に存在する異なる種の検出および識別を助けてもよい。本発明のこの態様はまた、上述した浮遊密度システムとともに実施してもよく、この場合、いくつかの微粒子または細胞は、分離チャンバの全長を通過するほど十分に密度が高くなく、それぞれの等密度点に留まる可能性がある。次に、上述したように、検出器を分離チャンバ内の様々な領域に移動させることによって、これらの粒子を検出することができる。したがって、本発明の範囲は、上記の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の等価物の意味および範囲に入る変更、修正、および変形は全て、特許請求の範囲に含まれるものとみなされる。 Although the present invention has been described in detail with reference to certain preferred embodiments and technical examples, it is to be understood that the invention is not limited to those precise embodiments or examples. Rather, many modifications and variations will occur to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the invention in light of the present disclosure, which describes the best mode of carrying out the invention at the present time. For example, the present invention contemplates separation and detection of microparticles or cells by time in a density chromatography format or “flow-through” system, as described above. In this embodiment of the invention, the microparticles or cells are denser than the density medium. When a centrifugal force is applied, the microparticles or cells move and are separated in the density medium according to their settling rates. In that case, microparticles or cells can be detected as they pass through a fixed detector. Different microparticles or cells may be tagged with different labels to aid in the detection and identification of different species present in the sample. This aspect of the invention may also be practiced with the buoyant density system described above, where some microparticles or cells are not dense enough to pass through the entire length of the separation chamber, and each isodensity is equal. It may stay on the spot. These particles can then be detected by moving the detector to various regions within the separation chamber, as described above. The scope of the invention is, therefore, indicated by the appended claims rather than by the foregoing description. All changes, modifications, and variations that fall within the meaning and range of equivalency of the claims are to be construed as being included within the scope of the claims.
Claims (117)
前記サンプルを収容するチャンバを有する回転可能ディスク、
密度勾配を形成する前記チャンバ内の媒体、および
少なくとも２つの異なるビーズグループを含む複数のビーズであって、各グループのビーズはそれぞれ、共通の物理的特性を有するとともに、特定の標的に対して親和性を有する少なくとも１つの捕捉プローブが付着している、複数のビーズ
を備える、ディスクシステム。 A disk system for testing samples,
A rotatable disk having a chamber for containing the sample;
A medium in the chamber forming a density gradient, and a plurality of beads comprising at least two different bead groups, each bead of each group having common physical properties and having an affinity for a particular target A disk system comprising a plurality of beads to which at least one capture probe having a property is attached.
少なくとも２つの異なるビーズグループを導入し、各グループのビーズはそれぞれ、共通の物理的特性を有するとともに、前記サンプル中の少なくとも１つの標的に対して親和
性を有する少なくとも１つの捕捉プローブが付着しており、
前記サンプルと前記ビーズを相互作用させ、それによって、前記サンプル中に存在する任意の標的の捕捉を容易にし、
反応チャンバに標識タグを添加し、該標識タグはそれぞれ、前記サンプル中に存在する任意の標的に対して親和性を有し、
前記標識タグを、前記ビーズのいずれかと結合した前記標的と結合させ、そして
前記ディスクを回転させ、それによって、前記ビーズを前記密度勾配媒体内へ半径方向外側に移動させる、ステップ
を含む、検定を行う方法。 Introducing at least one sample into the chambers of the disc, each chamber comprising a density gradient medium;
Introducing at least two different bead groups, each bead of each group having a common physical property and having attached at least one capture probe having affinity for at least one target in said sample And
Allowing the sample and the beads to interact, thereby facilitating the capture of any target present in the sample;
Adding a label tag to the reaction chamber, each label tag having an affinity for any target present in the sample;
Binding the labeled tag to the target bound to any of the beads and rotating the disk, thereby moving the beads radially outward into the density gradient medium. How to do.
前記反応チャンバに、少なくとも２つの異なるグループを含む複数の微粒子を導入し、各微粒子グループは、共通の物理的特性を有するとともに、特定の標的物質を受け取り、
前記反応チャンバに少なくとも１つの試験サンプルを導入し、
前記サンプル中に存在する任意の標的物質を前記微粒子と結合させ、
前記ディスクを回転させ、それによって、求心力を与え、
前記反応チャンバと前記分離チャンバの間の前記制御可能なバリア手段を制御し、それにより前記複数の微粒子が前記求心力下で前記反応チャンバから前記分離チャンバへ、また前記密度勾配媒体内へ移動し、前記微粒子をその物理的特性に応じて分離し、そして
光学手段によって前記分離チャンバの内容物を分析する、ステップ
を含む、検定を行う方法。 A rotatable disk is provided that defines at least one reaction chamber and at least one separation chamber, the reaction chamber being connected to the separation chamber by a controllable barrier means, the separation chamber having a density gradient forming medium. ,
Introducing a plurality of microparticles comprising at least two different groups into the reaction chamber, each microparticle group having a common physical property and receiving a specific target substance;
Introducing at least one test sample into the reaction chamber;
Any target substance present in the sample is bound to the microparticles;
Rotate the disk, thereby giving centripetal force,
Controlling the controllable barrier means between the reaction chamber and the separation chamber so that the plurality of particulates move from the reaction chamber to the separation chamber and into the density gradient medium under the centripetal force; Separating the microparticles according to their physical properties and analyzing the contents of the separation chamber by optical means.
前記分離チャンバ内に位置する密度勾配形成媒体であって、使用時に、異なる密度を有する複数の粒子を媒体の密度勾配に沿って分離できるようになっている、密度勾配形成媒体
を備える、検定を行うデバイス。 A rotatable disk defining at least one reaction chamber and at least one separation chamber, said reaction chamber being connected to said separation chamber via a controllable barrier means; and in said separation chamber A device for performing an assay comprising a density gradient-forming medium located at a position, wherein, in use, a plurality of particles having different densities can be separated along the density gradient of the medium.
供されるゲルである、請求項３６に記載のデバイス。 37. The device of claim 36, wherein the density gradient forming medium is a gel provided by Pharmacia Biotech under the trademark Percoll.
び維持される、請求項４０に記載のデバイス。 41. The device of claim 40, wherein the density gradient is formed and maintained by rotating the disk about its central axis.
前記反応チャンバに少なくとも２つのビーズグループを導入し、各グループのビーズはそれぞれ、共通の物理的特性を有するとともに、特定の細胞表面マーカに対して親和性を有する少なくとも１つの捕捉プローブが付着しており、
前記反応チャンバに試験中の細胞の少なくとも１つのサンプルを導入し、
前記サンプル中に存在する任意の標的細胞の任意の細胞表面マーカを前記ビーズのそれぞれの捕捉プローブと結合させ、それによって、ビーズ−細胞結合パートナー複合体を形成させ、
前記ディスクを回転させ、それによって、求心力を与え、
前記反応チャンバと前記分離チャンバの間の前記制御可能なバリア手段を制御し、前記複数のビーズおよび任意のビーズ−細胞結合パートナー複合体が前記求心力下で前記反応チャンバから前記分離チャンバへ、そして前記密度勾配媒体内へ移動し、前記ビーズおよび前記結合パートナー複合体を分離し、そして
光学手段によって前記分離チャンバの内容物を、ビーズ−細胞結合複合体の存在、位置、および量に関して分析する、ステップ
を含む、細胞検定を行う方法。 A rotatable disk defining at least one reaction chamber and at least one separation chamber is provided, the reaction chamber being connected to the separation chamber by a controllable barrier means, and the separation chamber receiving a density gradient forming medium. Have
At least two bead groups are introduced into the reaction chamber, each bead of each group having a common physical property and attached with at least one capture probe having an affinity for a particular cell surface marker. And
Introducing at least one sample of the cell under test into the reaction chamber;
Binding any cell surface marker of any target cells present in the sample to the respective capture probe of the bead, thereby forming a bead-cell binding partner complex;
Rotate the disk, thereby giving centripetal force,
Controlling the controllable barrier means between the reaction chamber and the separation chamber so that the plurality of beads and any bead-cell binding partner complex are under the centripetal force from the reaction chamber to the separation chamber, and Moving into a density gradient medium, separating the beads and the binding partner complex, and analyzing the contents of the separation chamber by optical means for the presence, location and amount of the bead-cell binding complex, A method for performing a cell assay, comprising:
中心と外縁を有するベースを準備し、
前記ベースに関連する情報層上に情報をエンコードし、該エンコードされた情報をディスクドライブアセンブリにより読み取って、前記ディスクの回転を制御することができ、
半径方向に延在する分析チャンバを画定する本体を準備し、前記分析チャンバは反応チャンバおよび少なくとも１つの分離チャンバを含み、前記反応チャンバは制御可能なバリア手段によって前記分離チャンバにつながっており、
前記分離チャンバ内に濃度勾配形成媒体を沈殿させ、
前記反応チャンバ内に、少なくとも２つの異なる微粒子グループを含む複数の微粒子を沈殿させ、各グループの微粒子はそれぞれ、共通の物理的特性を有するとともに、複数の捕捉プローブが付着しており、そして、
開口を含むカバーディスクを準備し、前記開口は前記反応チャンバに連結している、ステップ
を含む、方法。 A method of making an analysis disk and testing for the presence of at least one target substance in at least one sample comprising:
Prepare a base with a center and an outer edge,
Encoding information on an information layer associated with the base and reading the encoded information by a disk drive assembly to control rotation of the disk;
Providing a body defining a radially extending analysis chamber, the analysis chamber including a reaction chamber and at least one separation chamber, the reaction chamber being connected to the separation chamber by a controllable barrier means;
Precipitating a concentration gradient forming medium in the separation chamber;
A plurality of microparticles comprising at least two different groups of microparticles are precipitated in the reaction chamber, each group of microparticles having a common physical property and having a plurality of capture probes attached thereto; and
Providing a cover disk including an opening, the opening being coupled to the reaction chamber.
少なくとも１つのサンプルを前記開口を通して前記反応チャンバに添加し、
前記サンプル中に存在する任意の標的を、異なるグループの微粒子に付着したそれぞれの捕捉プローブと結合させ、
前記反応チャンバに標識タグを添加し、前記標識タグは溶液中に存在する前記標的に対して親和性を有し、
前記標識タグを、前記微粒子のいずれかと結合した任意の標識と結合させ、そして
前記分析ディスクを回転させ、前記複数の微粒子が求心力下で前記反応チャンバから前記制御可能なバリアを通って前記分離チャンバへ、また前記密度勾配媒体内へ移動し、前記微粒子をその物理的特性に応じて分離する、ステップ
を含む、ディスクの使用方法。 A method of using a disc made according to any one of claims 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, or 65, comprising:
Adding at least one sample to the reaction chamber through the opening;
Any target present in the sample is bound to each capture probe attached to a different group of microparticles;
Adding a label tag to the reaction chamber, the label tag having affinity for the target present in solution;
The label tag is coupled to any label coupled to any of the microparticles, and the analysis disk is rotated so that the plurality of microparticles pass from the reaction chamber through the controllable barrier under centripetal force. And moving into the density gradient medium and separating the microparticles according to their physical properties.
戻ってきた電磁エネルギーを分析し、それによって、捕捉微粒子、レポーター微粒子、標識タグ、微粒子−微粒子複合体、および微粒子−細胞複合体の位置および量を求める、ステップ
をさらに含む請求項６６ないし７６のいずれか１項に記載の方法。 Detect the presence of the target by scanning the separation chamber with an electromagnetic energy beam from a disk drive assembly and analyze the returned electromagnetic energy, thereby capturing particles, reporter particles, label tags, particle-particles 77. A method according to any one of claims 66 to 76, further comprising the step of determining the location and amount of the complex and the microparticle-cell complex.
を備える、検定を行うデバイス。 A rotatable disk comprising a top cover disk, a base, and a body disposed between the cover and the base, wherein the body defines an analysis chamber, the analysis chambers each comprising at least one reaction chamber and at least one A device for performing an assay comprising one separation chamber, wherein the reaction chamber comprises a rotatable disk in fluid communication with the separation chamber.
供されるゲルである、請求項７９に記載のデバイス。 80. The device of claim 79, wherein the density gradient forming medium is a gel provided by Pharmacia Biotech under the trademark Percoll.
中心と外縁を有するベースを準備し、
前記ベースに関連する情報層上に情報をエンコードし、該エンコードされた情報をディスクドライブアセンブリにより読み取って、前記ディスクの回転を制御することができ、
半径方向に延在する分析チャンバを画定する本体を準備し、前記分析チャンバは反応チャンバおよび少なくとも１つの分離チャンバを含み、前記反応チャンバは前記分離チャンバと流体連通し、
前記分離チャンバ内に濃度勾配形成媒体を沈殿させ、
前記反応チャンバ内に、少なくとも２つの異なる微粒子グループを含む複数の微粒子を沈殿させ、各グループの微粒子はそれぞれ、共通の物理的特性を有するとともに、複数の捕捉プローブが付着しており、そして
前記反応チャンバに連結している開口を含むカバーディスクを準備する、ステップ
を含む、前記方法。 A method of making an analysis disk and testing for the presence of at least one target substance in at least one sample comprising:
Prepare a base with a center and an outer edge,
Encoding information on an information layer associated with the base and reading the encoded information by a disk drive assembly to control rotation of the disk;
Providing a body defining a radially extending analysis chamber, the analysis chamber including a reaction chamber and at least one separation chamber, wherein the reaction chamber is in fluid communication with the separation chamber;
Precipitating a concentration gradient forming medium in the separation chamber;
A plurality of microparticles including at least two different groups of microparticles are precipitated in the reaction chamber, each group of microparticles having a common physical property and having a plurality of capture probes attached thereto; and Providing a cover disk including an opening connected to the chamber.
中心と外縁を有するベースを準備し、
前記ベースに関連する情報層上に情報をエンコードし、該エンコードされた情報をディスクドライブアセンブリにより読み取って、前記ディスクの回転を制御することができ、
半径方向に延在する分析チャンバを画定する本体を準備し、前記分析チャンバは反応チャンバおよび少なくとも１つの分離チャンバを含み、前記反応チャンバは前記分離チャンバと流体連通し、そして
前記反応チャンバに連結している開口を含むカバーディスクを準備する、ステップ
を含む、方法。 A method of making an analysis disk and testing for the presence of at least one target substance in at least one sample comprising:
Prepare a base with a center and an outer edge,
Encoding information on an information layer associated with the base and reading the encoded information by a disk drive assembly to control rotation of the disk;
Providing a body defining a radially extending analysis chamber, the analysis chamber including a reaction chamber and at least one separation chamber, wherein the reaction chamber is in fluid communication with the separation chamber and coupled to the reaction chamber; Providing a cover disk comprising an opening having a step.
少なくとも２つの異なる微粒子グループを含む複数の微粒子を調製し、各グループの微粒子はそれぞれ、共通の物理的特性を有するとともに、複数の捕捉プローブが付着しており、
前記複数の微粒子、少なくとも１つの試験サンプル、および密度勾配形成媒体を混合し、それによって、検定溶液を形成し、
前記試験サンプル中に存在する任意の標的に、前記微粒子と複合体を形成させ、
前記分析チャンバ内に前記検定溶液を沈殿させ、そして
前記ディスクを回転させ、それによって、遠心力を与えて、前記密度形成媒体に密度勾配を生じる、ステップ
を含む、前記使用方法。 A method of using an analytical disc made according to claim 95, comprising:
Preparing a plurality of microparticles comprising at least two different groups of microparticles, each group of microparticles having a common physical property and having a plurality of capture probes attached thereto;
Mixing the plurality of microparticles, at least one test sample, and a density gradient forming medium, thereby forming an assay solution;
Allowing any target present in the test sample to form a complex with the microparticle;
The method of use comprising the steps of precipitating the assay solution in the analysis chamber and rotating the disk, thereby providing a centrifugal force to create a density gradient in the density forming medium.
前記反応チャンバ内に、前記複数の微粒子を含む少なくとも１つの試験サンプルを添加し、
前記試験サンプル中に存在する任意の標的に、前記微粒子と複合体を形成させ、
少なくとも２つのグループを含む前記反応チャンバ内に複数の標識タグを添加し、各グループのタグはそれぞれ、共通の標識を有するとともに、前記試験サンプル中の１つの標
的に対して親和性を有し、
任意の標識タグを、前記微粒子のいずれかと結合したそれぞれの標的と結合させ、そして
前記ディスクを回転させ、それによって、遠心力を与えて、前記密度形成媒体に密度勾配を生じ、前記反応チャンバ内の前記微粒子を、前記制御可能なバリアを通って前記分離チャンバ内へ移動させて、前記微粒子を沈降速度または溶出時間に応じて分離する、ステップ
を含む、使用方法。 A method of using an analytical disc made according to claim 59, comprising:
Adding at least one test sample comprising the plurality of particulates into the reaction chamber;
Allowing any target present in the test sample to form a complex with the microparticle;
Adding a plurality of label tags into the reaction chamber comprising at least two groups, each tag of each group having a common label and having an affinity for one target in the test sample;
An arbitrary label tag is bound to the respective target bound to any of the microparticles, and the disk is rotated, thereby applying a centrifugal force to create a density gradient in the density-forming medium, within the reaction chamber Moving the particulates through the controllable barrier and into the separation chamber to separate the particulates according to sedimentation rate or elution time.
前記粒子が前記分離チャンバを通って流動する間に前記微粒子または前記標識タグを検出し、それによって、前記媒体を通る前記微粒子の沈降速度または溶出時間を求めるとともに、前記微粒子に結合した任意の標的の存在および量を判定する、ステップ
をさらに含む、請求項１０５に記載の方法。 An incident electromagnetic radiation beam is sent to a fixed point in the separation chamber, and the particulate or the tag is detected while the particle flows through the separation chamber, thereby settling the particulate through the medium. 106. The method of claim 105, further comprising determining a rate or elution time and determining the presence and amount of any target bound to the microparticle.
前記複数の微粒子を含む前記反応チャンバ内に少なくとも１つの試験サンプルを添加し、
前記試験サンプル中に存在する任意の標的に、前記微粒子と複合体を形成させ、
少なくとも２つのグループを含む前記反応チャンバ内に複数の標識タグを添加し、各グループのタグはそれぞれ、共通の標識を有するとともに、前記試験サンプル中の１つの標的に対して親和性を有し、
任意の標識タグを、前記微粒子のいずれかと結合したそれぞれの標的と結合させ、そして
前記ディスクを回転させ、それによって、遠心力を与えて、前記密度形成媒体に密度勾配を生じ、前記反応チャンバ内の前記微粒子を前記分離チャンバ内へ移動させて、前記微粒子を沈降速度または溶出時間に応じて分離する、ステップ
を含む、使用方法。 A method of using an analytical disc made according to any one of claims 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 or 94, comprising:
Adding at least one test sample into the reaction chamber containing the plurality of microparticles;
Allowing any target present in the test sample to form a complex with the microparticle;
Adding a plurality of label tags into the reaction chamber comprising at least two groups, each tag of each group having a common label and having an affinity for one target in the test sample;
An arbitrary label tag is bound to the respective target bound to any of the microparticles, and the disk is rotated, thereby applying a centrifugal force to create a density gradient in the density-forming medium, within the reaction chamber And moving the microparticles into the separation chamber to separate the microparticles according to sedimentation speed or elution time.
前記粒子が前記分離チャンバを通って流動する間に前記微粒子または前記標識タグを検出し、それによって、前記媒体を通る前記微粒子の沈降速度または溶出時間を求めるとともに、前記微粒子に結合した任意の標的の存在および量を判定する、ステップ
をさらに含む、請求項１０８に記載の方法。 An incident beam of electromagnetic radiation is sent to a fixed point in the separation chamber, and the particulate or the tag is detected while the particle flows through the separation chamber, thereby settling the particulate through the medium. 109. The method of claim 108, further comprising determining a rate or elution time and determining the presence and amount of any target bound to the microparticle.
前記反応チャンバ内に少なくとも１つの試験サンプルを沈殿させ、
前記試験サンプル中に存在する任意の標識に、前記反応チャンバ内の前記微粒子と複合体を形成させ、
少なくとも２つのグループを含む前記反応チャンバ内に複数の標識タグを添加し、各グループのタグはそれぞれ、共通の標識を有するとともに、前記試験サンプル中の１つの標
的に対して親和性を有し、
任意の標識タグを、前記微粒子のいずれかと結合したそれぞれの標的と結合させ、そして
前記ディスクを回転させ、それによって、遠心力を与えて、前記密度形成媒体に密度勾配を生じ、前記反応チャンバ内の前記微粒子を前記分離チャンバ内へ移動させて、前記微粒子を浮遊密度に応じて分離する、ステップ
を含む、使用方法。 90. A method of using an analytical disc made according to claim 88, comprising:
Precipitating at least one test sample in the reaction chamber;
Any label present in the test sample is complexed with the microparticles in the reaction chamber;
Adding a plurality of label tags into the reaction chamber comprising at least two groups, each tag of each group having a common label and having an affinity for one target in the test sample;
An arbitrary label tag is bound to the respective target bound to any of the microparticles, and the disk is rotated, thereby applying a centrifugal force to create a density gradient in the density-forming medium, within the reaction chamber And moving the fine particles into the separation chamber to separate the fine particles according to the floating density.
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