JP2006503800A - Hivに対する強化された免疫応答を誘導する方法 - Google Patents
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Abstract
特定のプライム・ブースト計画を利用する、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対する免疫応答を誘導する効果的な方法が開示される。その特定のプライム・ブースト計画では、一般的なHIV抗原をコードする外来性の遺伝物質を含む組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターを、その順番で投与するという異種のプライム・ブーストプロトコールが採用される。開示された計画に基づいて、脊椎動物の生きている組織内に、好ましくは哺乳動物(たとえば、ヒト、または市販されているかまたは家畜として獣医学的に重要な非ヒトの哺乳動物)の宿主にワクチンを投与することによって、HIV−1抗原(たとえばGag)が発現され、HIV−1を特異的に認識する細胞性免疫応答が誘導される。開示されたプライム/ブースト計画によって、今まで感染していない個体に対する予防上の利点および/または感染した個体内でのウイルス負荷レベルを減少させることによる治療効果が提供されること、そしてその結果、HIV−1感染の無症候期が延長することが考えられる。
Description
(関連出願についての相互参照)
本出願は、それぞれ2002年3月13日および2002年6月27日に出願された米国仮出願第60/363,870号および第60/392,581号についての優先権を主張するものであり、これらは参照して本明細書に組み込まれる。
(連邦政府から資金を受けている研究開発に関する陳述)
適用されない
(マイクロフィッシュ・アペンディクスへの言及)
適用されない
本出願は、それぞれ2002年3月13日および2002年6月27日に出願された米国仮出願第60/363,870号および第60/392,581号についての優先権を主張するものであり、これらは参照して本明細書に組み込まれる。
(連邦政府から資金を受けている研究開発に関する陳述)
適用されない
(マイクロフィッシュ・アペンディクスへの言及)
適用されない
本発明は、特定の順序で異種のプライム・ブースト投与を行う際に、HIV抗原をコードする外来性の遺伝物質を含む組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターを利用する、ヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)に対する免疫応答を誘導するための強化された方法に関する。本出願人らは、このスキームにてポックスウイルスを投与することによって、アデノウイルスでプライムされたHIVに対する免疫応答を極めて効果的にブーストできることを見出した。本発明で用いられるウイルスとしては、利用される特定のウイルスがそのウイルス配列内に導入された外来性の遺伝物質を発現させる能力を有する限り、あらゆるアデノウイルスまたはポックスウイルスが可能である。さらに、ウイルスは、複製能を欠くか、宿主が限定されるか、または処置された哺乳動物宿主細胞内でそのウイルスが自由に複製できなくなるように改変されることが必須である。本発明の特定の実施態様では、複製能を欠き、そしてプライム化投与の際にE1活性が特異的に奪われるアデノウイルス媒体が採用される。本発明のさらに特定の実施態様では、ブースト化投与において、改変されたワクシニアウイルス(たとえば、改変されたワクシニアウイルスのAnkara株(「MVA」)、またはワクシニアウイルスの高度弱毒株であるNYVAC株)が採用される。他に採り得る実施態様では、たとえば、(ALVACなどの)カナリアポックスウイルス、その他の鶏痘ウイルスおよび牛痘ウイルスからなる群より選択されるポックスウイルスが採用される。出願人らは、抗原(特にHIV抗原)をコードする外来性の遺伝物質を含む組み換えアデノウイルス媒体を投与し、次いでその抗原を含む組み換えポックスウイルスを投与すると、初期投与からの応答が、プライム化の投与およびブースト化の投与の両者のために組み換えアデノウイルスまたは組み換えポックスウイルスを介して独立に、抗原を独立して投与する場合に見られる以上に著しく増幅され、それゆえに、強化された免疫応答が提供されることを見出した。アデノウイルスでプライムされた免疫応答を、ポックスウイルスで効果的にブースト化を行うことで、細胞性免疫応答において特に明白な、HIVを特異的に認識することができる顕著に強化された免疫応答が導かれる。上記の発見事項に基づけば、開示されたプライム/ブースト計画によって、今まで感染していない個体に対する予防上の利点および/または感染した個体内でのウイルス負荷レベルを減少させることによる治療効果が提供されるだろうこと、そしてその結果、HIV−1感染の無症候期が延長すると考えられる。
ヒト免疫不全ウイルス−1(HIV−1)は、ヒト後天性免疫不全症候群(AIDS)および関連する疾患の病原因子である。HIV−1はレトロウイルス科のRNAウイルスであり、すべてのレトロウイルスの5’LTR−gag−pol−env−LTR3’の構成を示す。プロウイルスとして知られているHIV−1の完全型の長さは約9.8Kbである。ウイルスのゲノムのそれぞれの末端には、長末端反復(LTR)として知られているフランキング配列が含まれている。HIVの遺伝子は少なくとも九種のタンパク質をコードしており、そしてこの遺伝子は三種のクラスに分類される;主要構造タンパク質(Gag、PolおよびEnv)、調節タンパク質(TatおよびRev);ならびにアクセサリータンパク質(Vpu、Vpr、VifおよびNef)である。
HIV−1が感染した個体についての効果的な治療計画を利用できるようにはなった。しかしながら、これらの薬物は、世界の多くの地域の疾患に顕著な影響を与えることはなく、これらの薬物は、ヒト集団の範囲内での感染の広がりを食い止める最小限の効果しか与えない。その他の多くの感染症でそうであるように、効果的なワクチンの開発および導入の後にのみ、HIV−1感染の広がりに対して疫学的に顕著な効果を与える。現在までワクチンの開発が成功しないことに寄与する因子は数多く存在する。たとえば、慢性的な感染者ではHIV−1に対する体液性免疫応答および細胞性免疫応答が存在し、かつウイルス感染細胞が破壊されているにも拘らず、一定量のウイルス生産の存在が、現在では明らかになっている。その他の感染症の場合のように、疾患の成り行きは、免疫応答の速度論および規模、病原体の複製の速度、ならびに免疫応答に対する影響の受けやすさの間のバランスの結果である。成立した感染によって免疫応答を発達させることよりも、急性感染による、免疫を予め存在させる方がより効果的である。第二の因子は、ウイルスの遺伝的変異性の著しさである。HIV−1の感染力を中和することができる抗HIV−1抗体は細胞培養液中に存在するが、これらの抗体は一般的に、それらの活性において、単離されたウイルスに特異的である。従来の方法を用いてHIV−1の血清学上の分類を明らかにすることは不可能であることが分かった。より正確に言えば、このウイルスは血清学上の「連続体」を明らかにするようであり、従って個々の中和抗体の応答は、せいぜいわずかなウイルスの変異株に対してのみ効果的である。後者の見解を考えれば、抗HIV−1細胞性免疫応答を惹起させるであろう免疫原および関連する送達技術を特定することに役立つ。CTL応答を生じさせるためには、抗原を細胞内で合成するかまたは合成して細胞内に導入する必要があり、その後にプロテアソーム複合体によって小ペプチドに加工され、最終的に主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIタンパク質と結合のために、小胞体/ゴルジ複合体分泌経路内に移されることが知られている。CD8+Tリンパ球は、T細胞受容体(TCR)およびCD8細胞表面タンパク質とを介してクラスI MHCと結合した抗原を認識する。活性化したエフェクター細胞または記憶細胞内で未処置のCD8+T細胞を活性化させるには、一般的に、上記の抗原のTCRとの会合ならびに共刺激タンパク質の会合の両者が必要である。CTL応答の最適な惹起には、通常、CD4+Tリンパ球からのサイトカイン形態の「援助」が必要であり、ここでこのTリンパ球は、TCRおよびCD4の会合を介してMHCクラスII分子と結合した抗原を認識する。
アデノウイルスベクターは、HIVを含む種々の外来性の抗原を送達し発現させるための、生きているウイルスベクターとして開発され、そして処置された個体内でのCTL応答を効果的に惹起することが証明されてきた。アデノウイルスはエンベロープを持たないウイルスであり、約36kbの直鎖状二本鎖のゲノムを含む。このベクターは高いウイルス力価を達成し、幅広い細胞親和性を有し、そして非***細胞に感染することもできる。アデノウイルスベクターは遺伝子導入のための極めて効果的な媒体(vehicle)であり、臨床での遺伝子治療の研究に高い頻度で用いられている。さらに、アデノウイルスは、多数の有望なウイルス免疫化プロトコールの基礎を形成してきた。
(1995年2月15日に公開された)欧州特許出願第0 638 316号および(1994年3月9日に公開された)第0 586 076号(両者ともアメリカン・ホーム・プロダクツ社(American Home Products Corporation)に譲渡された)には、envまたはgagを含むHIV遺伝子を保持するアデノウイルスベクターを複製することが記載されている。チンパンジーおよびイヌを用いて、これらのベクターに基づいた種々の治療計画を行なつた。計画のうちのいくつかには、アデノウイルスまたはタンパク質のブーストに加えて、ミョウバン処理を行うことが含まれていた。
たとえばE1領域の欠失を宿している、複製能を欠くアデノウイルスベクターは、それらが複製する対応物に対するさらに安全な代替物を構成する。最近のアデノウイルスベクターでは、公知のパッケージングリピートがそれらのベクター内に組み込まれている;たとえば、塩基対459から3328のE1配列が欠失したアデノウイルスベクターが特に開示されているEP 0 707 071号;および塩基対459から3510が欠失したアデノウイルスベクターが特に開示されている米国特許第6,033,908号を参照すること。アデノウイルスのパッケージングの効率は、組み込まれた個々のA(パッケージング)リピートの数に依存すると教えられてきた;たとえば、グレーブルおよびヒアリング(Grable and Hearing)、1990 J.Virol.64 (5):2047−2056;グレーブルおよびヒアリング、1992 J.Virol.66(2):723−731を参照すること。
ワクシニアウイルスおよびその他のポックスウイルス(アビポックスウイルスなど)は、それらによるタンパク質の高レベルの発現を実証するための有望なワクチンの候補として開示され、最近になってHIV抗原の送達および発現に用いることが考えられた。ポックスウイルスはその末端が共有結合的に閉じられた二本鎖DNAを持つ、エンベロープに包まれた大型のウイルスである。これらのウイルスは複数の外来性の遺伝子を挿入する高い収容能力を持ち、そしてこれらのウイルスによって、外来性の外性遺伝物質の細胞質での高レベル発現が達成される。1980年代の前半から、ワクチンとしてこれらを用いることが知られていた;たとえば、パニカーリ(Panicali)ら、1983 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:5364−5368を参照すること。組み換え生ワクチンが臨床試験で試験されており、免疫応答を惹起させるために、HIV−1エンベロープ、エプスタイン−バーウイルスの主な膜糖タンパク質または狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現させるための組み換えワクシニアウイルスまたは組み換えカナリアポックスウイルスが用いられている;たとえば、パオレッティ(Paoletti)、1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11349−53;グ(Gu)ら、1995 Dev.Biol.Stand.84:171−7;およびフリース(Fries)ら、1996 Vaccine 14:428−34など。
現在までのウイルスワクチンベクターを用いた投与プロトコールでは、種々のプライム・ブースト接種法のスキームを採用してきた。二種の一般的なスキームが頻繁に用いられている:(1)同じウイルス媒体を用いて、哺乳動物宿主のプライム化およびブースト化の両者を成し遂げる、および(2)異なる媒体を利用してプライム化およびブースト化を実施し、ここではウイルス媒体に限定する必要はない。後者の例としては、具体的には、DNAでプライムしウイルスでブーストすることから構成されるスキーム、およびウイルスでプライムしウイルスでブーストすることから構成されるスキームであって、互いに異なるウイルスを用いるスキームである。最近になって、後者のスキームであるところの、上記2ウイルスの組み合わせ、つまりアデノウイルスおよびポックスウイルスの順番を変えた組み合わせ(すなわち、アデノウイルス−プライム、ポックスウイルス−ブースト;およびポックスウイルス−プライム、アデノウイルス−ブースト)を採用するプライム・ブースト法での投与計画を利用して、ネズミマラリア原虫(Plasmodium berghei)のCS遺伝子(Ad−PbCS)をマウスに送達して発現させた;ギルバート(Gilbert)ら、2002 Vaccine 20:1039−45。この計画では、マウスにおけるマラリアに対する保護作用が開示された;たとえば、ギルバートら、2002 Vaccine 20:1039−45を参照すること。
HIV感染に対する強力な細胞性免疫応答を生じさせることを可能とする、予防薬および/または治療薬に基づくHIVワクチン計画を開発することは、AIDSに対する戦いにおいて極めて重要となる。通常のHIV抗原をコードする外来性の遺伝物質を含む組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターを投与することに基づく異種のプライム・ブーストHIV免疫化計画を開示することによって、本発明はこれらの必要性に取り組み、満足させる。特定のプライム・ブーストワクチン計画は、組み換えアデノウイルスベクターで個体のプライム化を行い、次いでブースト化投与量の組み換えポックスウイルスベクターを与えるというものである。この内容に合致するワクチンプロトコールは、出願人が承知している限り、HIVについては実証されていない。このワクチン・プライム・ブースト計画では宿主、たとえばヒトに投与してもよい。
(発明の要旨)
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)に対する免疫応答を生じさせるための強化された方法に関する。この方法は、HIV抗原をコードする異種の遺伝物質を含む組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターによる異種のプライム・ブースト投与に基づくものであり、いずれかのベクターにより独自に単一様式のプライム・ブースト免疫化スキームにて得ることができる免疫応答よりも、HIVに対するより明白な免疫応答をもたらす。最初に、哺乳動物宿主に、プライム化投与量の、HIV抗原をコードする遺伝子を含むアデノウイルスを投与し、一定期間の後、ブースト化投与量の、HIV抗原をコードする遺伝子を保持するポックスウイルスを投与する。投与を区分する最低限の時間を予め定めてもよく、この時間は本質的に免疫的な休止を考慮に入れたものである。特定の実施態様において、この休止は少なくとも4ヶ月の期間である。複数回のプライム化、通常は1から4回が採用されるが、さらに多くてもよい。プライム化とブースト化との間の期間の長さは、通常、約四ヶ月から一年の間であるが、その他の期間を用いてもよい。出願人らは、アデノウイルスでプライムされた応答を、ポックスウイルスを用いてこのような方法でブースト化することによって、HIV抗原に対する免疫応答を著しく増幅させることを見出した。このように、本発明は、アデノウイルスおよびポックスウイルスによるHIVワクチンをこのような方法で投与することに関するものである。
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)に対する免疫応答を生じさせるための強化された方法に関する。この方法は、HIV抗原をコードする異種の遺伝物質を含む組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターによる異種のプライム・ブースト投与に基づくものであり、いずれかのベクターにより独自に単一様式のプライム・ブースト免疫化スキームにて得ることができる免疫応答よりも、HIVに対するより明白な免疫応答をもたらす。最初に、哺乳動物宿主に、プライム化投与量の、HIV抗原をコードする遺伝子を含むアデノウイルスを投与し、一定期間の後、ブースト化投与量の、HIV抗原をコードする遺伝子を保持するポックスウイルスを投与する。投与を区分する最低限の時間を予め定めてもよく、この時間は本質的に免疫的な休止を考慮に入れたものである。特定の実施態様において、この休止は少なくとも4ヶ月の期間である。複数回のプライム化、通常は1から4回が採用されるが、さらに多くてもよい。プライム化とブースト化との間の期間の長さは、通常、約四ヶ月から一年の間であるが、その他の期間を用いてもよい。出願人らは、アデノウイルスでプライムされた応答を、ポックスウイルスを用いてこのような方法でブースト化することによって、HIV抗原に対する免疫応答を著しく増幅させることを見出した。このように、本発明は、アデノウイルスおよびポックスウイルスによるHIVワクチンをこのような方法で投与することに関するものである。
従って、本発明は、哺乳動物宿主においてHIV−1抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法であって、(a)E1の少なくとも一部を欠失しE1の活性が奪われた、HIV−1抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程;およびその後に(b)HIV−1抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えポックスウイルスベクターを含むブースト化免疫物を該哺乳動物宿主に接種する工程、を含む方法に関する。
本発明の免疫化計画で利用されるアデノウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターには、複製能を欠くあらゆるアデノウイルスベクター、および複製能を欠くか、複製能が機能しないかまたは宿主が限定されるあらゆるポックスウイルスベクターが含まれてもよく、ウイルスの大規模な生産および精製を経験しても遺伝的に安定なもとする。換言すれば、本発明の方法に用いることに適した組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターは、複製能を欠くか、複製能が機能しないかまたは宿主が限定される、精製されたあらゆる組み換えウイルスでもよく、細胞培養で複数の継代を重ねても遺伝的に安定なことが示され、大規模な生産および精製処理の間でもそれを維持するウイルスである。このような組み換えウイルスベクターおよび収集されるウイルスワクチンは、効果的な一価または多価のHIVワクチンに求められる大規模な用量の充填およびそれに続く世界的な流通過程に適するものである。本発明では、複製能を欠く組み換えアデノウイルスベクターおよび病原性が弱められた組み換えポックスウイルスベクターの使用に基づいた免疫化計画の説明に従って、このような基本的な要求が達成される。
ポックスウイルスは、ウイルスの病原性を減少させることを意図する遺伝子工学上の種々の努力の対象であった。たとえば、ワクシニアウイルスを用いて、ウイルスのチミジンキナーゼの遺伝子、成長因子の遺伝子、赤血球凝集素の遺伝子、13.8kDの分泌性タンパク質の遺伝子およびリボヌクレオチドレダクターゼの遺伝子を標的化する努力がなされた;ブラー(Buller)ら、1985 Nature 317(6040):813−815;ブラーら、1988 J.Virol.62(3):866−74;フレクスナー(Flexner)ら、1987 Nature 330(6145):259−62;シダ(Shida)ら、1988 J.Virol.62(12):4474−80;コットワル(Kotwal)ら、1989 Virology.171(2):579−87;およびチャイルド(Child)ら、1990 Virology 174(2):625−9を参照すること。改変されたワクシニアウイルスは、特に米国特許第5,185,146号;第5,110,587号;第4,722,848号;第4,769,330号;第5,110,587号;および第4,603,112号の主題を形成する。アビポックスウイルスも対象である。というのは、これらの宿主範囲は限定的であり、それゆえにヒトの細胞内で自由に複製することはないからである。組み換えアビポックスウイルスは、特に米国特許第5,505,941号;第5,174,993号;第5,942,235号;第5,863,542号;および第5,174,993号の主題である。米国特許第5,266,313号では、アライグマのポックスウイルスに基づく、狂犬病ウイルス用のワクチンが開示されている。HIVのトランスジーンを保持するアデノウイルス媒体の事前投与により活性化された免疫応答を、最適なポックスウイルスベクターを投与してブーストする。
本発明で用いるアデノウイルスベクターは、E1の少なくとも一部を欠失し、E1の活性が奪われたものである。PER.C6(登録商標)細胞などのE1が補われたセルライン中で、本明細書に基づくベクターを容易に増殖させることができる。
本出願で用いられる組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターには、HIV抗原をコードする遺伝子が含まれている。特定の実施態様において、HIV抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子には、哺乳動物宿主(ヒトなど)内での発現を最適化されたコドンが含まれている。好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターおよび/またはポックスウイルスベクターには、(a)HIV抗原(HIVタンパク質など)または生物活性的および/または免疫学的に関連するその部分/その改変体をコードする核酸;(b)a)部の核酸が作動可能に連結した異種(外来)プロモーターまたは改変された固有のプロモーター;ならびに(c)転写終結配列を含む遺伝子発現カセットが含まれている。ただし、組み換えポックスウイルスベクターについての遺伝子発現カセット内に含まれる核酸の発現を制御するために利用されるあらゆるプロモーターは、対象のポックスウイルスに固有のものか、もしくはそれに由来するものか、または別のポックスウイルスの一部分である、のいずれかであるものとする。ワクシニアウイルスについての、天然型でオーバーラップがなく、直列した中程度の強さの初期/後期プロモーターが記載されており(たとえば、コクラン(Cochran)ら、1985 J.Virol.54:30−37;およびレーゼル(Rosel)ら、1986 J.Virol.60:436−9を参照すること)、そしてかかるプロモーターが遺伝子発現に用いられている。改変された固有のプロモーターの一例としては、実施例2の合成の初期/後期プロモーターがあり、このものはチャクラバルティ(Chakrabarti)ら、1997 BioTechniques 23(6):1094−97にて既に記述されている。異種プロモーターとしては、用いる予定のウイルスに固有のものでないか、またはそれに由来するものではない、この世のありとあらゆる(改変されたまたは非改変の)プロモーターが可能である。組み換えポックスウイルス内で用いられる遺伝子発現カセットとしては、(a)HIV抗原(HIVタンパク質など)または生物活性的および/または免疫学的に関連するその部分/その改変体をコードする核酸;ならびに(b)(別のポックスウイルス種に由来する)異種プロモーター、または対象のポックスウイルスに固有のもしくはそれに由来するプロモーターを含むものが好ましい。
本発明において用いられるHIV抗原としては、種々のHIVタンパク質、免疫学的に関連する改変体、および免疫原性を有するその部分が挙げられる。従って、本発明には、コドンに最適化された種々の形態のHIV−1 gag(コドンに最適化された全長(「FL」)Gagのp55型およびtPA−Gag融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない)、HIV−1 pol、HIV−1 nef、HIV env、上記構築物の融合体、および上記の免疫学的に関連する選択された改変体が包含される。HIV−1 Gag、Pol、Envおよび/またはNefの融合タンパク質の具体例としては、ウイルス抗原のコーディング領域のNH2−末端部分におけるリーダーペプチドまたはシグナルペプチドの融合体が挙げられるが、これらに限定されない。このようなリーダーペプチドとしてはtPAリーダーペプチドが挙げられるが、これに限定されない。
本開示に基づく組み換えウイルスベクターは、本発明の一つの側面を形成する。本発明のその他の側面は、当該アデノウイルスベクターおよび/またはポックスウイルスベクターを含む宿主細胞;当該ベクターを含むワクチン組成物;ならびに(a)アデノウイルスベクターおよび/またはポックスウイルスベクターを宿主細胞内に導入する工程、および(b)その結果生じるベクターを回収する工程を含むベクターを作製する方法である。
本発明はプライム・ブースト計画にも関し、ここでは、組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターは上記HIV抗原の種々の組み合わせを含む。特にヒトMHCや循環するウイルスの遺伝的多様性を考えれば、このようなHIV免疫化計画によって、宿主への投与後に、強化された細胞性免疫応答が提供される。具体的には、二価ワクチン(たとえば、gagとnef、gagとpol、またはpolとnefの成分)組成物または三価ワクチン(たとえばgag、polとnefの成分)組成物を提供する多価ワクチン組成物であって、ウイルスベクターを基礎とするものが含まれるが、これに限定されない。このような多価ワクチンを単回投与用に調合してもよく、または個別に調合された成分のそれぞれを複数回接種するように作製してもよい。この目的のための、本発明の方法の範囲内で用いられる好ましいワクチン組成物は、複数かつ異なるクラスのHIV抗原を含むアデノウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターである。それぞれのクラスのHIV抗原は配列決定操作の対象となり、その結果、可能性のあるワクチンの多数の組み合わせが提供でき;そしてそのような組み合わせは本発明の範囲内である。このように組み合わされた様式を利用することによって、単一様式の計画による接種の場合と比較してはるかに強力な細胞性免疫応答を惹起する可能性が高まる。
本明細書に開示されたような「組み合わされた様式」の概念は、他に採り得る投与形式にまで及ぶものであり、その投与形式によって、複数のオープンリーディングフレームを含む組み換えウイルスベクターの作製に適したシャトルプラスミド内に、複数のHIV−1ウイルス抗原を連結させることができる。たとえば、三価のベクターにはgag−pol−nef融合体が含まれてもよく、あるいは、「2+1」二価ワクチンが含まれてもよい。ここで、この二価ワクチンは、たとえば、同じバックボーン内にgag−pol融合体(たとえば、コドンに最適化されたp55 gagおよび不活性化され最適化されたpol)を含み、異なるプロモーターおよび転写終結配列が作動可能に連結したそれぞれのオープンリーディングフレームを伴うものである。あるいは、内部リボソーム進入配列(IRES)が作動可能に連結したオープンリーディングフレームと共に、二つのオープンリーディングフレームが単一のプロモーターに作動可能に連結してもよい。
開示された異種の手段を介して、組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターを投与することによって、改良された細胞性免疫応答が提供され、これは単一様式の計画によって生じた応答よりも明白な応答である。改良されたワクチン(アデノウイルス性HIVでプライムし、そしてポックスウイルス性HIVでブーストするもの)の効果は、HIV−1感染の無症候期間が延長するように、今まで感染していない個体に対しては低い感染速度で(すなわち予防上の応用)、および/または感染した個体内ではウイルス負荷レベルを減少させる(すなわち治療上の応用)べきである。このような方法でワクチンの投与、細胞内送達および発現を行うことによって、宿主のCTL応答およびTh応答を惹起する。ワクチン接種を受けた個々の個体または(本明細書で述べられるような)哺乳動物宿主としては、市販されているかまたは家畜として獣医学的に重要な非ヒトの哺乳動物だけでなく、霊長類(ヒトおよび非ヒトの両方)が可能である。
本明細書の観点からは、本発明は、効果的な免疫学的予防を提供し、HIV−1に暴された後のこのウイルス感染の成立を妨げるためのアデノウイルスワクチンおよびポックスウイルスワクチンの投与についての方法論に関するものであり、または長期間の有利な結果を伴うウイルス負荷の減少を成立させるように、HIV−1の急性感染症を緩和するためのHIV感染後の治療用ワクチンとしての方法論に関するものである。このような治療計画には、一価もしくは多価の組成物、および/または種々に組み合わされた様式の応用が含まれてもよい。従って、本発明によって、開示されたHIVワクチンの投与スキームを利用する方法が提供され、該投与スキームは本明細書で開示された種々のパラメータの範囲内で利用され、ならびに哺乳動物の組織内に導入されると単数(または複数)のHIV抗原の細胞内発現と、単数(または複数)のHIV抗原のそれぞれに対して効果的な免疫応答とを誘導する、当分野で公知の任意の補助的なパラメータの範囲内でも利用される。
このために、本発明は一部、ワクチン接種を受けた個体、好ましくはワクチン接種を受けたヒトにおいて細胞性免疫応答を生じさせる方法に関する。ここで、この個体には、開示された異種のプライム・ブースト免疫化計画に従う組み換えアデノウイルスおよびポックスウイルスのHIVワクチンが投与される。
明細書および請求の範囲を通して用いられるように、次の定義および略語が用いられる:
「HAART」とは、−−高活性高レトロウイルス療法−−を表す。
「HAART」とは、−−高活性高レトロウイルス療法−−を表す。
「第一世代」のベクターには複製能を欠くという特徴がある。これらのE1遺伝子領域は通常、欠失しているか不活性であり、そのうえE3遺伝子領域も欠失しているか不活性であることが多い。
「AEX」とは、陰イオン交換クロマトグラフィーを表す。
「QPA」とは、Quick PCRに基づく効力検定を表す。
「bps」とは、塩基対を表す。
「s」または「str」とは、トランスジーンがE1と平行である、すなわち「直線」方向にあることを意味する。
「PBMCs」とは、末梢血単球を表す。
「FL」とは、全長を表す。
「FLgag」とは、図2に示されるような、最適化された全長gag遺伝子を表す。
「Ad5−Flgag」とは、血清型5のアデノウイルスであって、CMVプロモーターの制御下にある最適化された全長gag遺伝子を含む発現カセットを保持する、複製能を欠くウイルスを表す。
「プロモーター」とは、その部位にRNAポリメラーゼが結合するところの、DNA鎖上の認識部位を意味する。このプロモーターは、RNAポリメラーゼと共に開始複合体を形成し、そして転写活性を開始し駆動する。エンハンサーなどの配列を活性化させるか、またはサイレンサーなどの配列を抑制することによって、この複合体を改変することができる。
「リーダー」とは、構造遺伝子と共に転写される、その遺伝子の5’末端におけるDNA配列を意味する。これは通常、N−末端ペプチドの延長部を有するタンパク質となり、多くの場合、プロ配列と呼ばれる。
「イントロン」とは、遺伝子の中間に存在するDNAの区画であって、遺伝子産物におけるアミノ酸をコードしていないものを意味する。イントロンの前駆体RNAは切除されるため、mRNAに転写されたり、またはタンパク質に翻訳されることはない。
ウイルスタンパク質との関連で用いる場合の「免疫学的に関連する」または「生物活性的」とは、投与時に、ウイルスの増殖および/または拡散を遅延させたり、および/または個体内に存在するウイルス負荷を減少させるのに十分な測定できる程度の免疫応答を、タンパク質がその個体内で惹起させることができることを意味する。同じ用語がヌクレオチド配列に関連して用いられる場合、配列が、上記のことが可能なタンパク質をコードできることを意味する。
「カセット」とは、転写制御配列および翻訳制御配列と共にある、発現される核酸配列を表す。カセットを変更することによって、ベクターは異なる配列を発現させることができる。
「bGHpA」とは、ウシ成長ホルモンの転写終結/ポリアデニル化配列を表す。
「tPAgag」とは、組織プラスミノゲンアクチベーターのリーダー配列と、最適化されたHIVのgag遺伝子との融合体を表す。
「IA」または「inact」が用いられている場合、これらは、遺伝子の不活性型(たとえばIApol)を表す。
「MCS」とは「マルチクローニング部位」である。
一般的に、アデノウイルス構築物、遺伝子構築物の名称は、その中に含まれる遺伝子を引用して付けられる。たとえば:
「Ad5 HIV−1 gag」は、最初のHIV−1 gagアデノウイルスベクターとも呼ばれ、hCMVイントロンAプロモーター、ヒトのコドンに最適化された全長型のHIV−1 gag遺伝子、およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルからなるトランスジーンカセットを含むベクターである。
「Ad5 HIV−1 gag」は、最初のHIV−1 gagアデノウイルスベクターとも呼ばれ、hCMVイントロンAプロモーター、ヒトのコドンに最適化された全長型のHIV−1 gag遺伝子、およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルからなるトランスジーンカセットを含むベクターである。
「MRK Ad5 HIV−1 gag」は、「MRKAd5gag」または「Ad5gag2」とも呼ばれ、E1が欠失している、アデノウイルスの塩基対1から450と塩基対3511から3523を含むアデノウイルスベクターであり、このベクターは、イントロンAを含まないCMVプロモーターの制御下にある、E1と平行方向の遺伝子であって、ヒトのコドンに最適化されたHIV−1 gag遺伝子を伴う。この構築物にもウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルが含まれている。
「pV1JnsHIVgag」は、「HIVFLgagPR9901」とも呼ばれ、CMV即時型(IE)プロモーターおよびイントロンA、コドンに最適化された全長HIV gag遺伝子、ウシ成長ホルモンに由来するポリアデニル化・転写終結配列、ならびに最小限のpUCバックボーンを含むプラスミドである。
「pV1JnsCMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpA」は、CMVのイントロンA部分が欠失し、かつ全長HIV gag遺伝子を含むpV1JnsHIVgagに由来するプラスミドである。このプラスミドは、「pV1JnsHIVgag−bGHpA」、「pV1Jns−hCMV−FL−gag−bGHpA」および「pV1JnsCMV(イントロンなし)+FLgag+bGHpA」とも呼ばれている。
「pV1JnsCMV(イントロンなし)−FLgag−SPA」は、SPA終止配列がbGHpAの配列に取って代わった以外はpV1JnsCMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpAと同じ構成のプラスミドである。このプラスミドは、「pV1Jns−HIVgag−SPA」およびpV1Jns−hCMV−FLgag−SPA」とも呼ばれている。
「pdelE1sp1A」は、発現カセットを持たない(すなわちプロモーターまたはポリAがない)汎用的なシャトルベクターである。このベクターには、血清型5の野生型アデノウイルス(Ad5)のbp1からbp341とbp3524からbp5798の配列が含まれ、そして341bpで終わり3524bpで始まるAd5配列の間にマルチクローニング部位がある。このプラスミドは、最初のAd5シャトルベクターとも呼ばれている。
「MRKpdelE1sp1A」または「MRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)」または「MRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)Cla1」は、発現カセットを持たない(すなわちプロモーターまたはポリAがない)汎用的なシャトルベクターであり、血清型5の野生型アデノウイルス(Ad5)のbp1からbp450とbp3511からbp5798の配列を含む。このベクターには、450bpで終わり3511bpで始まるAd5配列の間にマルチクローニング部位がある。このシャトルベクターを用いて、CMVプロモーターおよびbGHpA断片を、両者とも直線(「str.」すなわちE1と平行)方向に挿入してもよく、または反対(opp.すなわちE1と逆平行)方向に挿入してもよい。
「MRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVmin+BGHpA(str.)」はさらに別のシャトルベクターであり、このベクターはCMVプロモーター(イントロンAなし)およびbGHpA断片を含む改変されたベクターである。選択した遺伝子を唯一のBglII部位に挿入することによって、MRKpAd5(E1/E3+)Cla1プレプラスミド内に挿入した時にトランスジーンがAd5 E1と平行になる転写方向が確実となるように、hCMVプロモーター(イントロンAなし)およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含む発現単位をシャトルベクター内に挿入した。
「MRKpdelE1−CMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpA」は、塩基対1から450および塩基対3511から5798のAd5配列を含むシャトルであり、イントロンAを含まないヒトCMV、ヒトのコドンに最適化された全長HIV gag遺伝子およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを伴う。このプラスミドは、「MRKpdelE1シャトル+hCMV−FL−gag−BGHpA」とも呼ばれている。
「MRKpAdHVE3+CMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpA」は、E1領域(451から3510)を包含するヌクレオチド以外のAd5配列のすべて、イントロンAを含まないヒトCMVプロモーター、ヒトのコドンに最適化された全長HIV gag遺伝子、およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含むアデノウイルスベクターである。このベクターは、「MRKpAdHVE3+hCMV−FL−gag−BGHpA」、「MRKpAd5HIV−1gag」、「MRKpAd5gag」、「pMRKAd5gag」または「pAd5gag2」とも呼ばれている。
(発明の詳細な説明)
ヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)に対する免疫応答を生じさせるための強化された方法を記載する。この方法は、対象の一つ(または複数)のHIV抗原をコードする外来性の遺伝物質を含む組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターを採用した、異種のプライム・ブースト免疫化スキームに基づく。プライム化投与量の一つ(または複数)のHIV抗原を、組み換えアデノウイルスベクターを用いて最初に運搬する。この投与量によって、効果的に免疫応答をプライムできるので、循環する免疫系においてその後に抗原が特定されるとすぐに、この免疫応答によって、宿主内の抗原を直ちに認識して応答することが可能となる。次いで、一回(または複数回)のプライム化投与量の後に、抗原をコードする外来性の遺伝物質を含有する、組み換えポックスウイルスベクターのブースト化投与量が続く。HIV抗原と関連するので、本明細書に基づく投与の結果、接種された哺乳動物宿主内で見られる免疫応答を著しく高める、相加効果ではなく有意な相乗効果が生じることが分かった。この効果は、接種後に生じる細胞性免疫応答において特に明白である。従って、開示された免疫化計画によって、今まで感染していない個体に対する予防上の利点、およびウイルスが既に感染した個体におけるウイルス負荷レベルを減少させることによる治療効果が提供され、それゆえにHIV−1感染の無症候期が延長する。
ヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)に対する免疫応答を生じさせるための強化された方法を記載する。この方法は、対象の一つ(または複数)のHIV抗原をコードする外来性の遺伝物質を含む組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターを採用した、異種のプライム・ブースト免疫化スキームに基づく。プライム化投与量の一つ(または複数)のHIV抗原を、組み換えアデノウイルスベクターを用いて最初に運搬する。この投与量によって、効果的に免疫応答をプライムできるので、循環する免疫系においてその後に抗原が特定されるとすぐに、この免疫応答によって、宿主内の抗原を直ちに認識して応答することが可能となる。次いで、一回(または複数回)のプライム化投与量の後に、抗原をコードする外来性の遺伝物質を含有する、組み換えポックスウイルスベクターのブースト化投与量が続く。HIV抗原と関連するので、本明細書に基づく投与の結果、接種された哺乳動物宿主内で見られる免疫応答を著しく高める、相加効果ではなく有意な相乗効果が生じることが分かった。この効果は、接種後に生じる細胞性免疫応答において特に明白である。従って、開示された免疫化計画によって、今まで感染していない個体に対する予防上の利点、およびウイルスが既に感染した個体におけるウイルス負荷レベルを減少させることによる治療効果が提供され、それゆえにHIV−1感染の無症候期が延長する。
従って、本発明は、哺乳動物宿主においてHIV−1抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法であって、(a)E1の少なくとも一部を欠失しE1活性が奪われた、HIV−1抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程;およびその後に(b)HIV−1抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えポックスウイルスベクターを含むブースト化免疫物を、その哺乳動物宿主に接種する工程を含む方法に関し、ここで、当該組み換えポックスウイルスベクターは哺乳動物宿主における複製能が損なわれている。この文脈において「複製能が損なわれている」とは幅広い意味を持ち、一般的には、処置される特定の哺乳動物種において、(1)これらのベクターが複製が不可能なように弱められているか改変されている;(2)これらのベクターが複製が機能しないように弱められているか改変されている;および(3)これらのベクターが単に複製しないだけか、またはこれらのベクターの複製のレベルがはるかに減少している、と説明される。たとえば、アビポックスウイルスの複製は、鳥類の種に限定されると思われる。従って、アビポックスウイルスは、哺乳動物内で用いるための極めて安全なベクターとしての候補である。初期プロモーターのみを使用することを考慮すれば、複製は、恐らくはウイルスDNAが合成される前の工程で阻止されると思われる;たとえば、モス,ビー(Moss,B.)、1993 Curr.Opin.Genet.Devel.3:86−90;およびテイラー(Taylor)ら、1991 Vaccine 9:190−3を参照すること。しかしながら、このレベルの複製には注意を払われて予防的免疫接種が行われてきた;たとえば、ワイルド(Wild)ら、1990 Vaccine 8:441−442;および1992 Virology 187:321−28;ならびにカドッツ(Cadoz)ら、1992 Lancet 339:1429−32を参照すること。ポックスウイルスは本発明の方法に必須の要素を形成する。というのは、このウイルスは、アデノウイルスでプライムされたHIVに対する免疫応答を有意にブーストする驚くべき能力を発揮することが分かったからである。本発明の特定の実施態様では、本発明のブースト化での投与に、改変されたワクシニアウイルス(たとえば、改変されたワクシニアウイルスのAnkara株(「MVA」)、米国特許第5,185,146号の対象;および特に、タルタグリア(Tartaglia)ら、1992 Virology 188:217−232に開示されたワクシニアウイルスの高度弱毒株であるNYVACなど)が採用されるが、対象の抗原の送達と発現とを実現することができ、かつ意図された哺乳動物宿主内での病原性が弱められたあらゆるポックスウイルス、特にワクシニアウイルスが本発明に包含される。改変されたワクシニアウイルスおよび種々の方法におけるそれらの使用についても技術的に説明されており、たとえば、米国特許第5,185,146号;第5,110,587号;第4,722,848号;第4,769,330号;第5,110,587号;および第4,603,112号を参照すること。組み換えワクシニアウイルスを構築するための一般化された方法についても、このことは同じく正しい;たとえば、アール(Earl)ら、分子生物学における最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)、オースベル(Ausubel)ら編、ニューヨーク:グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ウィリー・インターサイエンス(Greene Publishing Associates and Wiley Interscience)社;1991年:16.16.1から16.16.7を参照すること。本出願のさらなる実施態様では、開示された方法のブースト化での投与において、他に採り得るポックスウイルスベクターが利用される。具体的に言及すると、(特に米国特許第5,505,941号;第5,174,993号;第5,942,235号;第5,863,542号;および第5,174,993号の対象である)ALVACなどのアビポックスウイルスである。既述のとおりALVACは、ニワトリの胚線維芽細胞内で200回継代した後の野生株から得られた弱毒化カナリアポックスウイルスに由来する、プラーク精製されたクローンである。ALVAC組み換え体およびその使用は、本発明の別の側面を形成する。このようなALVAC組み換え体の具体例としてはvCP205がある。vCP205(ATCC登録番号VR−2547)は、簡単に言えば、HIV1(IIIB)gag(およびプロテアーゼ)タンパク質、ならびにその中でgp120がgp41に由来する膜貫通アンカー配列と融合しているHIV1(MN)エンベロープ糖タンパク質の一つの型を発現するALVAC組み換え体(ALVAC−MN120TMG)である。ALVACバックボーン内にHIV遺伝子を組み込むことは、発行された米国特許第5,863,542号(たとえば実施例14を参照すること)に記載されている。pHIV32プラスミドとALVACのゲノムDNAとの間の相同組み換えによって、組み換えカナリアポックスウイルスALVAC−HIV(vCP205)を得た。pHIV32プラスミドは、HIV−1 gp120−MNおよびgp41のアンカー領域(HIV−1 gp41 LAIの膜貫通糖タンパク質)、その発現がそれぞれHGおよびI3Lワクシニアプロモーターの制御下にあるGag p55−ポリタンパク質およびプロテアーゼ−LAIをそれぞれコードしている。pHIV32内に含まれる、プロモーターがH6であるHIV1 gp120(+膜貫通)遺伝子のヌクレオチド配列およびプロモーターがI3LのHIV1gag(+pro)遺伝子のヌクレオチド配列は、参照して本明細書に組み込まれる米国特許第5,863,542号の図14Aから図14Cに開示されている。多くのHIVが感染した被験者では、vCP205内で正確に削除されたgp41の免疫優性領域に対して向けられた抗体が示されることから、gp41のエクトドメインの欠失によって、感染した被験者と予防接種を受けた被験者との区別が容易になると考えられている。
組み換えポックスウイルスの構築に必要な方針は公知であり、たとえば、パニカーリおよびパオレッティ(Panicali and Paoletti)、1982 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:4927−31;ナカノ(Nakano)ら、1982 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1593−96;ピッシーニ(Piccini)ら、酵素学における方法(Methods in Enzymology)、ウーおよびグロスマン(Wu and Grossman)編、アカデミック・プレス(Academic Press)社、サンディエゴ、153:545−63;米国特許第号4,603,112号;サッター(Sutter)ら、1994 Vaccine 12:1032−40;ならびにワイアット(Wyatt)ら、1996 Vaccine 15:1451−8を参照すること。合成の組み換えポックスウイルスを作製するための方法も、米国特許第4,769,330号;第4,722,848号;第4,603,112号;第5,110,587号;および第5,174,993号に開示されている;これらの開示は参照して本明細書に組み込まれる。HIV gagをコードする外来性の遺伝物質を含む組み換えMVAおよびALVAC組み換えウイルスの構築は、本明細書のそれぞれ実施例2および10に記載されている。当業者であれば、外来性の遺伝物質の挿入を、ポックスウイルスのゲノムの数え切れないほどの位置に向けることが可能であることを認識する。ただし、その位置が、遺伝物質を発現させるウイルスの能力を打ち消す位置でない限りにおいて。ウイルスの感染力を確保し、その結果として構築物を発現させるためには、挿入をゲノムのサイレント領域内または非必須遺伝子内に行う必要がある。本明細書で開示される組み換えMVA構築物には、たとえば、チミジンキナーゼ領域内および欠失II領域内(領域は、特にメイヤー(Meyer)ら、1991 J.Gen.Virol.72:1031−8で規定されている)に外来性の遺伝物質組み込まれている;実施例2を参照すること。
組み換えアデノウイルスベクターは本発明の方法に必須の要素を形成する。というのは、このウイルスは、対象の特定の抗原に対する免疫応答を極めて効果的にプライムすることが分かったからである。E1領域における欠失/E1領域の活性化がベクターのE1活性を奪う(すなわち本質的に奪う)という理由で、本発明の好ましい実施態様では複製能を欠くアデノウイルスベクターを採用する。哺乳動物宿主免疫応答のプライム化を十分に行うために外来性の遺伝物質(特にHIV抗原)を十分に発現させるという目的にとって、血清型5のアデノウイルスが、極めて効果的なアデノウイルス媒体であることが分かった。しかしながら、HIV抗原を発現させる能力を持ち、複製能を欠くアデノウイルス媒体の代替物も、本明細書にて用いるのに適している。
血清型5の野生型アデノウイルスの配列は公知であり、技術的に説明されている;参照して本明細書に組み込まれるクロボチェック(Chroboczek)ら、1992 J.Virology 186:280を参照すること。従って、本発明の好ましい実施態様は、プライム化での投与において、血清型5の野生型アデノウイルスの配列に基づくベクターを採用した免疫化スキームである;このウイルスの一つは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(「ATCC」)で、ATCC受託番号VR−5にて寄託されている。しかしながら、当業者であれば、代替可能な血清型(たとえば、血清型2、4、6、12、16、17、24、31、33および42)のアデノウイルスを容易に特定することができ、そして開示された異種のプライム・ブースト免疫化スキームにおいて同様に組み込むことができる。従って、本発明は、E1が部分的に欠失したアデノウイルスベクターのすべてを本発明の投与スキームに採用する方法を包含する。
E1領域内に含まれたもの以外に欠失を含む組み換えアデノウイルスベクターを、本発明の方法の範囲内で用いることも意図される。たとえば、E1およびE3の両方に欠失が含まれるベクターを、本発明の方法の範囲内で用いることが意図される。このようなベクターは、より多量の外来性のDNA挿入物(すなわち外来性の遺伝物質)を収容する能力を持つ。
公知の技術(たとえば、参照して本明細書に組み込まれるヒット(Hitt)ら、1997年、「哺乳動物細胞の中に遺伝子を導入するためのヒトアデノウイルスベクター(Human Adenovirus Vectors for Gene Transfer into Mammalian Cells)」、Advances in Pharmacology 40:137−206で概説された技術)を用いて、本発明の方法で用いられるアデノウイルスベクターを構築することができる。
アデノウイルスバックボーン(たとえばMRKHVE3)および適切なシャトルベクターを用いた相同組み換えによって、アデノウイルスプレプラスミド(たとえばpMRKAd5gag)を作製することができる。直鎖状のこのプラスミドは、PER.C6(登録商標)細胞に入った後に複製する能力を有するものであり、そしてウイルスが生産される。次いで、ウイルスの複製が完了した後で、感染細胞および培地を回収する。
公知のセルライン293およびPER.C6(登録商標)を含む種々のE1が相補化セルラインウイルスベクター中で増殖させることができる。これらのセルラインの両者は共に、アデノウイルスのE1の遺伝子産物を発現する。PER.C6(登録商標)は、WO97/00326号(1997年1月3日に公開されたもの)および発行された米国特許第6,033,908号に記載されており、これらの両者は参照して本明細書に組み込まれる。このものは、複製能を欠く(FG)アデノウイルスの産生を相補化するE1遺伝子セグメントが形質導入された初代ヒトレチノブラストのセルラインであるが、相同組み換えによって複製能を有するアデノウイルスが出現しないように設計されている。PER.C6(登録商標)の459bpから3510bpまでのような、AD5E1AおよびE1B遺伝子をコードするトランスジーンを用いて、特に対象となる細胞を安定して形質転換してきた。293細胞は、グラハム(Graham)ら、1977 J.Gen.Virol 36:59−72に記載されており、このものは参照して本明細書に組み込まれる。上述のように、用いられる、相補化セルラインに存在するアデノウイルスの配列には配慮を払う必要がある。組み換えの可能性を最小限にする場合、ベクター内に存在する配列と重複しない配列が好ましい。
本発明で用いられるアデノウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターには、HIV−1抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子が含まれている。対象のHIV抗原としては、Gag、Pol、およびEnvなどのHIVの主要な構造タンパク質、免疫学的に関連する改変体、および免疫原性を有するその部分が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明には、コドンに最適化された種々の形態のHIV−1 gag(コドンに最適化された全長(「FL」)Gagのp55型およびtPA−Gag融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない)、HIV−1 pol、HIV−1 nef、HIV env、および上記の免疫学的に関連する選択された改変体が包含される。対象のタンパク質をコードする外来性の遺伝物質は発現カセットの形態で存在することができる。遺伝子発現カセットとしては、(a)対象のタンパク質をコードする核酸;(b)そのタンパク質をコードする核酸が作動可能に連結した異種(外来)プロモーターまたは改変された固有のプロモーター;および(c)転写終結配列を含むものが好ましい;ただし、組み換えポックスウイルスベクターについての遺伝子発現カセット内に含まれる核酸の発現を駆動するために利用されるあらゆるプロモーターは、対象のポックスウイルスに固有のものか、もしくはそれに由来するものか、または別のポックスウイルスの一部分である、のいずれかである。ワクシニアウイルスについての、天然型でオーバーラップがなく、直列した中程度の強さの初期/後期プロモーターが記載されており(たとえば、コクランら、1985 J.Virol.54:30−37;およびレーゼルら、1986 J.Virol.60:436−9を参照すること)、そしてかかるプロモーターが遺伝子発現に用いられている。改変された固有のプロモーターの一例としては、実施例2の合成の初期/後期プロモーターがあり、このものはチャクラバルティら、1997 BioTechniques 23(6):1094−97にて既に記述されている。組み換えポックスウイルス内で用いられる遺伝子発現カセットとしては、(a)HIV抗原(HIVタンパク質など)をコードする核酸、または生物学的活性および/または免疫学的に関連するその部分をコードする核酸;ならびに(b)(別のポックスウイルス種に由来する)異種プロモーター、または対象のポックスウイルス固有のもしくはそれに由来するプロモーターを含むものが好ましい。
組み換えアデノウイルスベクターの転写プロモーターとしては、真核生物のRNAポリメラーゼによって認識されるものが好ましい。好ましい実施態様において、プロモーターは「強力」または「効果的」なプロモーターである。強力なプロモーターの一例は、ヒトサイトメガロウイルス即時型プロモーター(チャップマン(Chapman)ら、1991 Nucl.Acids Res 19:3979−3986、このものは参照して本明細書に組み込まれる)であり、イントロン配列がないものが好ましい。すぐに使えるアデノウイルスベクターの範囲内で最も好ましく用いられるものは、イントロンAのようなイントロン配列がないヒトCMVプロモーターである。出願人らは、イントロンA、すなわちヒトサイトメガロウイルスプロモーター(hCMV)の一部が、アデノウイルスベクターについての不安定な領域を構築していることを見出した。イントロンAがないCMVが、HIV gagの発現を駆動する場合に、インビトロで同程度の発現能力を発揮すること、そしてさらには、試験を行ったプラスミドDNAの両方の投与量(20μgおよび200μg)におけるそれらの抗体とT細胞の応答に関して、そのようなCMVが、インビボのBalb/cマウスにおけるイントロンAを含む構築物と同等に機能することが見出された。当業者であれば、その他の多数の公知のプロモーター(たとえば強力な免疫グロブリンプロモーター、またはその他の真核生物の遺伝子プロモーター)のいずれかを用いてもよいことを認識する。そしてEF1アルファプロモーター、マウスCMVプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、SV40初期/後期プロモーターおよびベータアクチンプロモーターも含まれる。好ましい実施態様において、プロモーターには、Tetオペレーター配列などの制御可能な配列が含まれてもよい。たとえば、遺伝子産物によって、望まれた結果以外の結果がもたらされ、抑制が求められる場合においては、このことは極めて有用なものとなる。遺伝子発現カセット内に存在する好ましい転写終結配列は、ウシ成長ホルモンの終結/ポリアデニル化シグナル(bGHpA)、および長さが50ヌクレオチドという短い合成ポリAシグナル(SPA)であり、このポリAシグナルは次のように規定される:AATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG(配列番号4)。CMVプロモーター(イントロンA領域は奪われている)を含む発現カセットを伴う組み換えアデノウイルスベクターとBGHターミネーターとによって、本発明の特定の側面が形成されるが、その他のプロモーター/ターミネーターの組み合わせを用いることもできる。その他の実施態様では、リーダーペプチドまたはシグナルペプチドがトランスジーン内に組み込まれる。好ましいリーダーは、組織特異的プラスミノゲンアクチベータータンパク質、すなわちtPAに由来するものである。
本開示に基づく組み換えウイルスベクターは、本発明の一つの側面を形成する。本発明のその他の側面は、当該アデノウイルスベクターおよび/またはポックスウイルスベクターを含む宿主細胞;当該ベクターを含むワクチン組成物;ならびに(a)アデノウイルスベクターおよび/またはポックスウイルスベクターを宿主細胞内に導入する工程、および(b)その結果生じるベクターを回収する工程を含むベクターを作製する方法である。
本発明の方法に従うウイルスベクターの投与によって、ウイルス感染が継続する可能性を小さくするところの、および/またはHIV感染の対象となるウイルス負荷を臨床的に有意に減少させることを確立させるところのHIVに対する細胞性免疫応答が強力かつ広範囲に惹起するはずであり、あるいはその投与をHAARTでの治療と組み合わせることで、既に成立したHIV感染の影響を緩和する(抗ウイルス免疫療法(ARI))。あらゆるHIV抗原(たとえば、gag、pol、nef、gp160、gp41、gp120、tat、revなど)を、本発明の方法で用いられる組み換えウイルスベクター内に組み込んでもよく、その一方、好ましい実施態様には、コドンに最適化されたp55 gag抗原、polおよびnefが挙げられる。本発明のアデノウイルスベクターおよび/またはポックスウイルス媒体では、コドンに最適化されてもよく、またはされていなくてもよい異種の核酸を利用することができる。本発明の特定の実施態様において、コドンに最適化された異種の核酸を含むアデノウイルスベクターで個体をプライムし、そしてコドンに最適化されていない核酸を含むポックスウイルスベクターでブーストすることができる。複数の抗原を投与することには、種々の異なる組み合わせの、コドンに最適化された配列およびコドンに最適化されていない配列を活用するための可能性がある。
HIV−1の異なるクレードに基づいた配列は、本発明での使用に適したものであり、特に好ましいものはクレードBおよびクレードCである。特に好ましい実施態様は、コンセンサスクレードB配列に基づいたそれらの配列(特に、コドンに最適化された配列)である。ウイルスワクチンの好ましい型は、polまたはnefの改変型をコードするものである。HIVエンベロープ遺伝子およびその改変体を保持するウイルスワクチンの好ましい実施態様のものには、それぞれ1997年8月28日(WO97/31115号)および1997年12月24日に公開されたPCT国際出願PCT/US97/02294号およびPCT/US97/10517号の、HIVコドンに最適化されたenv配列が含まれる;両文献は参照して本明細書に組み込まれる。
多数のHIV株の数多くの遺伝子配列は、GENBANKにおいて公的に入手可能であり、そして最初に野外から分離されたHIVは、これらの株が利用できるようにクオリティー・バイオロジカル(Quality Biological)社(ゲーサーズバーグ、メリーランド州)と契約を締結した国立アレルギー感染病研究所(NIAID)から入手することができる。世界保健機構(WHO)、ジュネーブ、スイスから株を入手することもできる。HIV−1の株(CAM−1;マイヤーズ(Myers)ら編、「ヒトレトロウイルスおよびAIDS(Human Retroviruses and AIDS):1995年、IIA3からIIA19、このものは参照して本明細書に組み込まれる)に由来するgag遺伝子が好ましい。この遺伝子は、クレードB(北米/欧州)配列についてのコンセンサスアミノ酸配列と極めてよく似ている。従って、特定のHIV gag抗原、または免疫学的に関連するその部分をコードするヌクレオチド配列を適切に選択することは、当業者の範囲内である。p55 gag抗原に基づくクレードBまたはクレードCは、地球的規模で有用となるかもしれない。開示された方法の範囲内で用いられたベクター内への挿入に最適なトランスジーンは、コドンに最適化された型のp55 gagである。
アデノウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターによって送達される、対象の単一のHIV抗原に加えて、別々の媒体または同じ媒体のいずれかを介して、二以上の抗原を送達することができる。たとえば、本発明に基づくプライム化投与量には、nefおよびpolの両方を、あるいは二以上の他に採り得るHIV−1抗原をコードする遺伝子を含む組み換えウイルスベクターが含まれ得る。次いで、ブースト化投与量には、nefおよびpolの両方をコードする遺伝子を含む組み換えポックスウイルスベクターが含まれ得た(二以上のHIV−1抗原のどちらかがプライム化投与量において用いられた)。他に採り得る筋書きにおいて、プライム化投与量には、異なるHIV−1抗原をコードする遺伝子をそれぞれ含む別々のアデノウイルス媒体の混合物が含まれ得る。このような場合において、ポックスウイルスのブースト化投与量には、別々のHIV−1抗原をコードする遺伝子をそれぞれ含むポックスウイルスベクターの混合物も含まれ得たが、これは、ブースト化投与量が、プライム化投与量にて送達されたのと同一の抗原をコードする遺伝物質を含む組み換えウイルスベクターを投与する場合に限られる。あるいは、HIV−1抗原のすべてを発現するポックスウイルスベクターを作製して、ワクチン接種用のブースト化剤として機能させることができるかもしれない。上記の技術を組み合わせることによって、これらの二価(たとえば、gagとnef、gagとpol、またはpolとnefの成分)ワクチンまたは三価(たとえばgag、polとnefの成分)ワクチンをさらに投与することができる。従って、本発明の好ましい側面は、本発明の方法によって投与することができる種々のワクチン製剤である。ある特定の抗原から複数であるが区別可能な成分を含む複合様式の計画に着手することも、本発明の範囲内である。
二以上の抗原から構成される融合構築物を採用する、開示される免疫化計画も、本明細書に包含される。たとえば、複数のオープンリーディングフレームを含むプレウイルスプラスミドの作製に適したシャトルプラスミド内に、複数のHIV−1ウイルス抗原が連結してもよい。たとえば、三価のベクターにはgag−pol−nef融合体が含まれてもよく、あるいは、「2+1」二価ワクチンが含まれてもよい。ここで、この二価ワクチンは、たとえば、gag−pol融合体(たとえば、コドンに最適化されたp55 gagおよび不活性化され最適化されたpol)を含み、異なるプロモーターおよび転写終結配列が作動可能に連結したそれぞれのオープンリーディングフレームを伴うものである。あるいは、国際公開番号WO95/24485号(このものは参照して本明細書に組み込まれる)に開示されたように、内部リボソーム進入配列(IRES)が作動可能に連結したオープンリーディングフレームと共に、同じ構築物における二つのオープンリーディングフレームが単一のプロモーターに作動可能に連結してもよい。IRESに基づく技術が使えない場合、ベクターの安定性を最も高く維持できるように、異なるプロモーターを用いて、それぞれのオープンリーディングフレームを個別に支持することが好ましい。可能性のある複数のトランスジーンワクチンとして、gagpol融合体およびnef遺伝子が同じベクター内に含まれ、gagpol融合体およびnef遺伝子について異なるプロモーター配列および終止配列が用いられるような、三種のトランスジーンベクターを挙げることができるが、例示としてであり、限定とすることはありえない。さらに、可能性のある本発明の「2+1」二価ワクチンは、gagおよびnefを含み別個のプロモーター配列および終止配列を伴った単一の構築物と、それに組み合わせて投与される、pol遺伝子を含みプロモーター配列および終止配列を伴った構築物であるかもしれない。上記のgag−pol融合体以外の融合体も、種々の二価ワクチン計画に用いることに適しており、そしてそのような融合体は、任意の二種のHIV抗原が互いに融合し合ったものから構成され得る(たとえば、nef−polおよびgag−nef)。接種時に生じる免疫応答を多様化させるためには、これらの組成物を、上記のように付加的なHIV抗原を含むウイルス組成物と一緒に送達することが好ましい。従って、単独で、またはもしかすれば第二のウイルスベクターと共に送達される多価ワクチンは、本発明の一部として確かに意図される。組み換えアデノウイルスベクターについての挿入物を決定することに関して、ウイルス媒体の制限されたパッケージングを効率的にするための正当な検討に専念すべきである、ということに言及することは重要である。たとえば、アデノウイルスのクローン化の容量の上限値は、野生型のAd5の配列の約105%を示すことが明らかにされている。
発現のために選択される遺伝子に関係なく、ある特定の実施態様では、哺乳動物(たとえば、ヒトの細胞環境内で発現するために「最適化」された配列が好ましく、アデノウイルス構築物が特に好ましい。考えられる四種のヌクレオチド塩基の「トリプレット」コドンが、64種の変異型内に存在し得る。これらの変異型によって、20種のみの異なるアミノ酸(ならびに転写開始および転写終結)のメッセージが与えられることは、いくつかのアミノ酸が二以上のコドンによってコードされていることがあることを意味する。実際のところ、いくつかのアミノ酸は六種もの「重複」した、代替可能なコドンを有している。その一方、その他のいくつかのものは唯一つの必須のコドンを有する。その理由が完全に理解されているわけではないが、異なるタイプの細胞の内因性DNAにおいて代替可能なコドンがすべて均等に存在しているわけではなく、そしてあるタイプの細胞における特定のコドンに関しての気まぐれな自然の階層性、すなわち「好み」が存在するようである。一例として、アミノ酸のロイシンでは、CTA、CTC、CTG、CTT、TTA、およびTTG(これらはそれぞれ、mRNAのコドンのCUA、CUC、CUG、CUU、UUAおよびUUGに対応する)を含む六種のDNAのコドンのいずれかが指定されている。微生物のゲノムのコドンの頻度の徹底的な分析から、大腸菌の内因性DNAではロイシンを指定するコドンとしてCTGが最も広く含まれ、その一方酵母および粘菌DNAではロイシンを指定するコドンとしてTTAが最も広く含まれていることが明らかになった。この階層性を考慮すると、大腸菌の宿主によってロイシンに富むポリペプチドを高レベルで発現させることの可能性は、コドンが用いられる頻度にある程度は依存するだろうことが一般的に考えられる。たとえば、TTAコドンに富む遺伝子の大腸菌内での発現は、ほぼ確実に弱い。それに対してCTGに富む遺伝子は、おそらくポリペプチドを多く発現する。同様に、ロイシンに富むポリペプチドを発現させるための宿主細胞として、酵母細胞を計画的に形質転換する場合、挿入されるDNAにおいて好ましく用いられるコドンはTTAとなる。
組み換えDNA技術に関する、コドンが選り好みされる現象の意味合いは明らかである。そしてこの現象が、形質転換が成功した宿主生物において、外来性の遺伝子を高レベルで発現させることに以前から数多く失敗していることの説明に役立つかもしれない、即ち、より「好み」ではないコドンが、挿入された遺伝子内に繰り返し存在するのかもしれず、そして発現のための宿主細胞の機構が効果的に機能しないのかもしれない。この現象は、宿主細胞の好ましいコドンが計画的に含まれるように設計された合成遺伝子によって、組み換えDNA技術を実施するために好ましい形態の外来性の遺伝物質の好ましい形態が提供されることを示唆する。従って、本発明の一つの側面はワクチン投与プロトコールであり、ここで、アデノウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターの両方は、ヒトの細胞環境内での発現に最適化されたコドンである遺伝子を特に含む。本明細書で述べたように、本発明での使用に好適な遺伝子はコドンに最適化されたHIV遺伝子であり、特にHIVgag、pol、envまたはnefであるが、上記で述べたように、本発明の一種以上のウイルス媒体は、コドンに最適化されてもよく、されていなくてもよい異種の核酸を利用することができる。本発明の特定の実施態様において、コドンに最適化された異種の核酸を含むアデノウイルスベクターを用いて個体をプライムすることができ、そしてコドンに最適化されていない核酸を含むポックスウイルスベクターを用いてブーストすることができる。複数の抗原を投与することによって、コドンに最適化された配列およびコドンに最適化されていない配列の種々の異なる組み合わせを利用するための可能性が生じる。
本発明に従う、プライム化またはブースト化のいずれかの投与量の組み換えウイルスベクターを含むワクチン組成物には、生理的に許容され得る成分、たとえば緩衝液、標準的な生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水、ショ糖、その他の塩類およびポリソルベートが含まれてもよい。組み換えアデノウイルスベクターに好ましい一つの製剤には:2.5から10mMのTRIS緩衝液、好ましくは約5mMのTRIS緩衝液;25から100mMのNaCl、好ましくは約75mMのNaCl;2.5から10%のショ糖、好ましくは約5%のショ糖;0.01から2mMのMgCl2;および0.001%から0.01%のポリソルベート80(植物に由来するもの)が含まれる。pHの範囲は約7.0から9.0とすべきであり、約8.0が好ましい。当業者であれば、その他の従来のワクチン用賦形剤を用いてこの製剤を調製してもよいことを認識する。好ましい製剤には、pHが8.0であって、5mMのTRIS、75mMのNaCl、5%のショ糖、1mMのMgCl2、0.005%のポリソルベート80が含まれる。このもののpHと二価カチオン組成は、Ad5が安定する最適条件に近く、そしてウイルスがガラスの表面に吸着する可能性を最小化している。このものが筋肉注射時に組織の炎症を生じさせることはない。使用まで凍結することが好ましい。
ワクチンを接種される個体に導入されるワクチン組成物内のウイルス粒子の量は、用いられる転写プロモーターおよび翻訳プロモーターの強さと、発現される遺伝子産物の免疫原性に依存することになる。一般的に、免疫学的または予防的に有効な投与量の1×107から1×1012粒子、好ましくは約1×1010から1×1011粒子を、筋肉組織に直接投与する。皮下注射、皮内注射、皮膚を介する圧着、およびその他の投与形式(たとえば、腹腔内投与、静脈内投与または吸入による投与)も検討される。本発明のワクチン組成物を非経口的に導入するのと同時にまたはその後に、インターロイキン−12タンパク質の非経口投与(たとえば、静脈内、筋肉内、皮下またはその他の投与手段)を行うことも有利である。
本発明の投与スキームは、一つ(または複数)のHIV抗原をコードする遺伝子を含むアデノウイルス媒体による免疫応答のプライム化と、所定の長さの時間の経過後における、アデノウイルスでプライムされた応答の、一つ(または複数)のHIV抗原をコードする遺伝子を含むポックスウイルスベクターによるブースト化に基づくものである。たいていの場合、複数回のプライム化(通常は1から4回)を用いるが、より多く用いてもよい。プライム化とブースト化との間の期間の長さは、通常、約四ヶ月から一年の間で変わることがあるが、その他の期間を用いてもよい。時間間隔を選択して、ブースト化の投与量を繰り返してもよい。
大型のヒトおよび動物のデータから、HIV感染の制御(または解消)時の細胞性免疫応答、特にCTLの重要性が支持される。ヒトにおいて、初感染後にCTLが極めて高レベルに発生し、ウイルス血症の制御と相関する。個体の小さな群のいくつかにおいて、繰り返しHIVにさらされるが、非感染を維持する者について記載されている;これらの一団のいくつかにおいて、CTLが言及されている。HIV感染のSIVモデルにおいて、初感染後にCTLが同様に発生し、そして抗CD8モノクローナル抗体の添加によって、このような感染の制御が破棄され、そして病気が進行に向かうことが実証されている。
次の非限定的な実施例を示して本発明をより良く説明する。
HIV−1 Gag遺伝子
ヒトにおいて頻繁に用いられるコドンを利用して、HIV−1株であるCAM−1からHIV gagについての合成遺伝子を構築した;ケルバー(Korber)ら、1998年、ヒトレトロウイルスおよびAIDS(Human Retroviruses and AIDS)、ロスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメキシコ州;ならびにレース,アール(Lathe,R.)、1985 J.Mol.Biol.183:1−12を参照すること。図2には、例示された、コドンに最適化された全長型p55 gagのヌクレオチド配列が図示されている。クレードB(北米/欧州)配列(ロスアラモスHIVデータベース)についてのコンセンサスアミノ酸配列と極めてよく似ているので、HIV−1株であるCAM−1のgag遺伝子を選択した。ワクチン成分としてのこの「コドンに最適化された」HIV gag遺伝子の利点は、マウスにおける免疫学的研究において実証されている。DNAワクチンとして送達した場合、野生型HIV gag遺伝子よりも、「コドンに最適化された」HIV gag遺伝子の方が、細胞性免疫を誘導することが50倍以上強いことが示された。
ヒトにおいて頻繁に用いられるコドンを利用して、HIV−1株であるCAM−1からHIV gagについての合成遺伝子を構築した;ケルバー(Korber)ら、1998年、ヒトレトロウイルスおよびAIDS(Human Retroviruses and AIDS)、ロスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメキシコ州;ならびにレース,アール(Lathe,R.)、1985 J.Mol.Biol.183:1−12を参照すること。図2には、例示された、コドンに最適化された全長型p55 gagのヌクレオチド配列が図示されている。クレードB(北米/欧州)配列(ロスアラモスHIVデータベース)についてのコンセンサスアミノ酸配列と極めてよく似ているので、HIV−1株であるCAM−1のgag遺伝子を選択した。ワクチン成分としてのこの「コドンに最適化された」HIV gag遺伝子の利点は、マウスにおける免疫学的研究において実証されている。DNAワクチンとして送達した場合、野生型HIV gag遺伝子よりも、「コドンに最適化された」HIV gag遺伝子の方が、細胞性免疫を誘導することが50倍以上強いことが示された。
発現を最適化するために、gag遺伝子の開始ATGの前にコザック配列(GCCACC)を導入した。V1Jns−HIV gagベクターからPCRにより、コザック配列を伴うHIV gag断片を増幅させた。pV1JnsHIVgagは、CMV即時型(IE)プロモーターおよびイントロンA、コドンに最適化された全長HIV gag遺伝子、ウシ成長ホルモンに由来するポリアデニル化・転写終結配列、ならびに最小限のpUCバックボーンを含むプラスミドである;プラスミドバックボーンの記述についてのモントゴメリー(Montgomery)ら、1993 DNA Cell Biol.12:777−783を参照すること。
組み換えMVAの構築と精製
コザック配列を伴うHIV gag遺伝子断片を用いて、二つの組み換えMVA構築物を構築した。ここで、この遺伝子断片は、制限酵素認識部位の適切なリンカー配列を伴うMVAゲノムの二箇所の異なる位置(それぞれウイルスのチミジンキナーゼ領域(MVA−HIV gag TK)および欠失II領域(MVA−HIV gag dII))内にクローン化されたものである。シャトルベクターpSC59(チャクラバルティら、1997 BioTechniques 23(6):1094−1097を参照すること)を、唯一のXhoI部位に挿入されたHIV gag断片と共に利用して、チミジンキナーゼ領域の挿入を達成した。HIV gag断片が唯一のPmeI部位に挿入されたpLW21を利用して、欠失II領域の挿入を達成させた。pLW21は基本的に、合成の初期/後期プロモーターを一つとクローン化用の唯一のPmeI部位とを含むpGEM4ベクター(プロメガ(Promega)社)由来のプラスミドである。相同組み換え事象の時に、MVAゲノムのセルラインII領域の中に標的を挿入するために、プロモーターおよびクローニング部位の両側はMVAウイルス配列に挟まれている。ワクシニアウイルスについて既に記載された合成の初期/後期プロモーター(チャクラバルティら、上掲)によって、両構築物内のトランスジーンの発現を駆動する。挿入物のフランキング領域に固有の配列は、一般的にランスジーンの転写物の転写終結・ポリアデニル化を行うことに十分であると考えられていたので、ウイルスの転写終結配列およびポリアデニル化シグナル配列は、挿入された断片内には含まれていなかった(ビー・モス(B Moss)、微生物学および免疫学における最新のトピックス(Current Topics in Microbiology and Immunology)、158:25、1992年を参照すること)。ポックスウイルスベクターを介して発現したトランスジーン産物の確実性は、トランスジーンのORFの3’末端における翻訳終止コドン(TAA)によって保証されているわけではなかった。DNAシークエンシングによって、挿入物の配向性および確実性を確認した。
コザック配列を伴うHIV gag遺伝子断片を用いて、二つの組み換えMVA構築物を構築した。ここで、この遺伝子断片は、制限酵素認識部位の適切なリンカー配列を伴うMVAゲノムの二箇所の異なる位置(それぞれウイルスのチミジンキナーゼ領域(MVA−HIV gag TK)および欠失II領域(MVA−HIV gag dII))内にクローン化されたものである。シャトルベクターpSC59(チャクラバルティら、1997 BioTechniques 23(6):1094−1097を参照すること)を、唯一のXhoI部位に挿入されたHIV gag断片と共に利用して、チミジンキナーゼ領域の挿入を達成した。HIV gag断片が唯一のPmeI部位に挿入されたpLW21を利用して、欠失II領域の挿入を達成させた。pLW21は基本的に、合成の初期/後期プロモーターを一つとクローン化用の唯一のPmeI部位とを含むpGEM4ベクター(プロメガ(Promega)社)由来のプラスミドである。相同組み換え事象の時に、MVAゲノムのセルラインII領域の中に標的を挿入するために、プロモーターおよびクローニング部位の両側はMVAウイルス配列に挟まれている。ワクシニアウイルスについて既に記載された合成の初期/後期プロモーター(チャクラバルティら、上掲)によって、両構築物内のトランスジーンの発現を駆動する。挿入物のフランキング領域に固有の配列は、一般的にランスジーンの転写物の転写終結・ポリアデニル化を行うことに十分であると考えられていたので、ウイルスの転写終結配列およびポリアデニル化シグナル配列は、挿入された断片内には含まれていなかった(ビー・モス(B Moss)、微生物学および免疫学における最新のトピックス(Current Topics in Microbiology and Immunology)、158:25、1992年を参照すること)。ポックスウイルスベクターを介して発現したトランスジーン産物の確実性は、トランスジーンのORFの3’末端における翻訳終止コドン(TAA)によって保証されているわけではなかった。DNAシークエンシングによって、挿入物の配向性および確実性を確認した。
組み換えMVAを作製する方法は既に記載されている(たとえば、サッターら、1994 Vaccine 12:1032−1040;ワイアットら、1996 Vaccine 15:1451−1458を参照すること)。簡単に言えば、25cm2の細胞培養フラスコ内のサブコンフルエントな初代ニワトリの胚線維芽細胞(CEF)を、二時間の感染効率(「m.o.i.」)が0.05での野生型MVAで感染させ、次いで、リポフェクチン(ギブコ・ビーアールエル(GIBCO BRL)社)で沈殿させたシャトルベクターDNAの約20mcgを用いて、この細胞にトランスフェクトした。この細胞を二日間培養し、次いで、1mLのPBS/BSA内で凍結−解凍を繰り返すことによって、細胞ペレットを溶解させた。細胞溶解物を用いて、6ウェルプレート内でCEFを感染させた。ここで、1:3、1:9および1:27に希釈したものを二通り用いた。二日後に培地を除去し、そして単層の細胞をPBSにて二回洗浄した。次いで、細胞の凍結と解凍を三回行い、そして組み換えMVAが感染した細胞を含むプラークを免疫染色法によって特定した。ここで、この方法は、HIV gagに対するモノクローナル抗体(アドバンスト・バイオテクノロジー(Advanced Biotechnology)社)およびペルオキシダーゼ(ピアース(Pierce)社)が結合したヤギの抗マウスIgG抗体、そして基質としてのo−ジアニシジンの連続的なインキュベーションを行って実施した。感染細胞によって形成される青色のプラークを倒立顕微鏡下で選び出し、そして1mLのPBSで細胞を希釈した。凍結−解凍によってこの細胞を溶解させ、そして1:5、1:20および1:80の希釈物を利用して、CEF内で組み換えMVAをさらに精製し、さらに5回行った。次いで、25cm2の組織培養フラスコ内で、CEF中にて組み換えMVAを展開し、そして異なる希釈度のMVAが感染したCV−1細胞内でのウエスタンブロット分析によって、HIV gagの発現を確認した。40から80個の150cm2のCEFのフラスコ内で、最終的なウイルスのストックを調製し、そして免疫染色法を利用するプラークアッセイによってウイルスの力価を測定した。
下記で検討する免疫化においては、欠失II領域内に挿入物を伴う組み換えMVA構築物を用いた。
アデノウイルスベクター構築物の作製
A.hCMVプロモーターのイントロンA部分の除去
hCMVプロモーターを増幅するための出発材料として、GMPグレードのpV1JnsHIVgagを用いた。hCMVプロモーターの横側に安定的に位置したプライマーを用いて増幅を実施した。5’プライマーは、hCMVプロモーターのMsc1部位の上流側に設けられ、そして(BglII認識配列を含むように設計された)3’プライマーはhCMVプロモーターの3’の位置に設けられた。(高忠実度Taqポリメラーゼを用いて)得られた、(イントロンAを除いた)hCMVプロモーターの全体を包含するPCR産物を、TOPO PCR平滑末端ベクター内にクローン化し、Msc1とBglIIとの二重消化によって除去した。次いで、この断片を当初のGMPグレードのpV1JnsHIVgagプラスミド内にクローン化して戻した。このプラスミドからは、Msc1およびBglII消化後に、当初のプロモーター、イントロンA、およびgag遺伝子が除去されていた。この連結反応の結果、当初のpV1JnsHIVgagベクターバックボーン内に、hCMVプロモーター(イントロンAを除いた)+bGHpA発現カセットが構築された。このベクターをpV1JnsCMV(イントロンなし)と称する。
A.hCMVプロモーターのイントロンA部分の除去
hCMVプロモーターを増幅するための出発材料として、GMPグレードのpV1JnsHIVgagを用いた。hCMVプロモーターの横側に安定的に位置したプライマーを用いて増幅を実施した。5’プライマーは、hCMVプロモーターのMsc1部位の上流側に設けられ、そして(BglII認識配列を含むように設計された)3’プライマーはhCMVプロモーターの3’の位置に設けられた。(高忠実度Taqポリメラーゼを用いて)得られた、(イントロンAを除いた)hCMVプロモーターの全体を包含するPCR産物を、TOPO PCR平滑末端ベクター内にクローン化し、Msc1とBglIIとの二重消化によって除去した。次いで、この断片を当初のGMPグレードのpV1JnsHIVgagプラスミド内にクローン化して戻した。このプラスミドからは、Msc1およびBglII消化後に、当初のプロモーター、イントロンA、およびgag遺伝子が除去されていた。この連結反応の結果、当初のpV1JnsHIVgagベクターバックボーン内に、hCMVプロモーター(イントロンAを除いた)+bGHpA発現カセットが構築された。このベクターをpV1JnsCMV(イントロンなし)と称する。
BglII消化を利用してpV1JnsHIVgagからFLgag遺伝子を切り出し、この1,526bpの遺伝子をゲルで精製し、そしてpV1JnsCMV(イントロンなし)のBglII部位内にクローン化した。Sma1制限酵素を用いてコロニーを選別し、正しい配向性にてFLgag遺伝子を保持するクローンを特定した。pV1JnsCMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpAと称するこのプラスミド全体の配列を決定して、配列の完全性を確認した。
B.改変されたシャトルベクター−「MRKpde1E1シャトル」の構築
当初のAd5シャトルベクター(pde1E1sp1A;塩基対1から341および塩基対3524から5798のAd5配列を含むベクターであって、Ad5のヌクレオチドの341から3524の間のマルチクローニング領域を伴うベクターの、次の三種の操作を含めた、次のような連続したクローン化工程にて行った:
(1)左側のITR領域を延長して、ベクターバックボーンとアデノウイルスの左側のITR配列との間にある接合部でPac1部位を含むようにした。これによって、細菌の相同組み換え系を用いてさらに簡単に操作することができる。
当初のAd5シャトルベクター(pde1E1sp1A;塩基対1から341および塩基対3524から5798のAd5配列を含むベクターであって、Ad5のヌクレオチドの341から3524の間のマルチクローニング領域を伴うベクターの、次の三種の操作を含めた、次のような連続したクローン化工程にて行った:
(1)左側のITR領域を延長して、ベクターバックボーンとアデノウイルスの左側のITR配列との間にある接合部でPac1部位を含むようにした。これによって、細菌の相同組み換え系を用いてさらに簡単に操作することができる。
(2)パッケージング領域を延長して、野生型(WT)アデノウイルスの342bpから450bpまでの配列を含むようにした。
(3)pIXの下流領域を13ヌクレオチド分(すなわちヌクレオチド3511から3523まで)延長した。
これらの改変(図4)によって、形質転換されたPER.C6(登録商標)セルライン内に存在するE1A/E1B遺伝子の部分を少しもオーバーラップさせることなく、E1欠失のサイズを効果的に縮小した。AdシャトルベクターpdelE1sp1Aを改変することによって、すべての操作を実施した。
一旦シャトルベクターに改変を行うと、化学的なコンピテント細胞の大腸菌BJ5183を用いる細菌の相同組み換えによって、当初のAd5アデノベクターバックボーンpAdHVE3の中にその変化が組み込まれた。
C.改変されたアデノベクターバックボーンの構築
E1領域への改変が含まれるように、(E1領域を包含するヌクレオチド以外のすべてのAd5配列を含む)当初のアデノベクターpADHVE3を再構築した。新たに改変されたシャトルベクター(MRKpdelE1シャトル)を、Pac1およびBstZ1101を用いて消化し、そしてアデノウイルス配列に対応する2,734bpの断片を単離することによって、このことを達成した。Cla1で直線化されたpAdHVE3(E3+アデノベクター)からのDNAと共に、この断片を、大腸菌BJ5183コンピテント細胞内に同時形質転換を行った。形質転換から少なくとも二つのコロニーを選択し、そしてTerrific(商標)ブロス内で、濁度が到達するまで6から8時間培養した。それぞれの細胞ペレットからDNAを抽出し、次いで大腸菌XL1コンピテント細胞内に形質転換した。形質転換からの一つのコロニーを選択し、プラスミドDNAを精製するために培養した。制限消化によってプラスミドを分析し、正しいクローンを特定した。改変されたアデノベクターをMRKpAdHVE3(E3+プラスミド)と称した。PER.C6(登録商標)セルライン内で、昔の型と同じく新規アデノベクター(MRKHVE3)からウイルスを作製した。さらに、当初のシャトルベクターのマルチクローニング部位には、ClaI部位、BamHI部位、XhoI部位、EcoRV部位、HindIII部位、SalI部位、およびBglII部位が含まれていた。このMCSは、NotI部位、ClaI部位、EcoRV部位およびAscI部位を含む新たなMCSに取って代わられた。この新規MCSは、パッケージング領域およびpIX遺伝子になされた変異と共にMRKpAdHVE3プレプラスミドに導入された。
E1領域への改変が含まれるように、(E1領域を包含するヌクレオチド以外のすべてのAd5配列を含む)当初のアデノベクターpADHVE3を再構築した。新たに改変されたシャトルベクター(MRKpdelE1シャトル)を、Pac1およびBstZ1101を用いて消化し、そしてアデノウイルス配列に対応する2,734bpの断片を単離することによって、このことを達成した。Cla1で直線化されたpAdHVE3(E3+アデノベクター)からのDNAと共に、この断片を、大腸菌BJ5183コンピテント細胞内に同時形質転換を行った。形質転換から少なくとも二つのコロニーを選択し、そしてTerrific(商標)ブロス内で、濁度が到達するまで6から8時間培養した。それぞれの細胞ペレットからDNAを抽出し、次いで大腸菌XL1コンピテント細胞内に形質転換した。形質転換からの一つのコロニーを選択し、プラスミドDNAを精製するために培養した。制限消化によってプラスミドを分析し、正しいクローンを特定した。改変されたアデノベクターをMRKpAdHVE3(E3+プラスミド)と称した。PER.C6(登録商標)セルライン内で、昔の型と同じく新規アデノベクター(MRKHVE3)からウイルスを作製した。さらに、当初のシャトルベクターのマルチクローニング部位には、ClaI部位、BamHI部位、XhoI部位、EcoRV部位、HindIII部位、SalI部位、およびBglII部位が含まれていた。このMCSは、NotI部位、ClaI部位、EcoRV部位およびAscI部位を含む新たなMCSに取って代わられた。この新規MCSは、パッケージング領域およびpIX遺伝子になされた変異と共にMRKpAdHVE3プレプラスミドに導入された。
D.改変されたgagトランスジーンを含む新規シャトルベクター−「MRKpdelE1−CMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpA」の構築
改変されたプラスミドpV1JnsCMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpAをMsc1で一晩消化し、次いでSfi1で50℃にて2時間消化した。次いで、DNAをヤエナリのヌクレアーゼで30℃にて30分間処理した。Qiaex IIキットを用いてDNA混合物を脱塩し、次いでクレノウ処理を37℃で30分間実施し、トランスジーン断片の末端をすべて平滑化した。次いで、2,559bpのトランスジーン断片をゲルで精製した。改変されたシャトルベクター(MRKpdelE1シャトル)を、EcoRVによる消化によって直線化し、仔ウシの腸のホスファターゼで処理し、次いで、得られた6,479bpの断片をゲルで精製した。次いで、二種の精製断片を互いに連結し、そして数ダースのクローンを選別してシャトルベクター内のトランスジーンの挿入について点検した。診断のための制限消化を実施して、E1と平行方向にてトランスジーンを保持するクローンを特定した。
改変されたプラスミドpV1JnsCMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpAをMsc1で一晩消化し、次いでSfi1で50℃にて2時間消化した。次いで、DNAをヤエナリのヌクレアーゼで30℃にて30分間処理した。Qiaex IIキットを用いてDNA混合物を脱塩し、次いでクレノウ処理を37℃で30分間実施し、トランスジーン断片の末端をすべて平滑化した。次いで、2,559bpのトランスジーン断片をゲルで精製した。改変されたシャトルベクター(MRKpdelE1シャトル)を、EcoRVによる消化によって直線化し、仔ウシの腸のホスファターゼで処理し、次いで、得られた6,479bpの断片をゲルで精製した。次いで、二種の精製断片を互いに連結し、そして数ダースのクローンを選別してシャトルベクター内のトランスジーンの挿入について点検した。診断のための制限消化を実施して、E1と平行方向にてトランスジーンを保持するクローンを特定した。
E.MRK FGアデノベクターの構築
E1と平行方向にてHIV−1 gagトランスジーンを含むシャトルベクターであるMRKpdelE1−CMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpAをPac1で消化した。反応混合物をBsfZ171で消化した。5,291bpの断片をゲル抽出によって精製した。MRKpAdHVE3プラスミドをCla1で37℃にて一晩消化し、そしてゲルで精製した。約100ngの5,290bpのシャトル+トランスジーン断片と、約100ngの直線化されたMRKpAdHVE3 DNAで、化学的なコンピテント細胞の大腸菌BJ5183を同時形質転換した。いくつかのクローンを選択し、そして2mLのTerrific(商標)ブロス内で、濁度が到達するまで6から8時間培養した。Qiagenアルカリ溶解およびフェノールクロロホルム法を用いて、細胞ペレットからの全DNAを精製した。イソプロパノールにてDNAを沈殿させ、そして20μLのdH2O内に再懸濁した。このDNAの2μLのアリコートで、大腸菌XL−1コンピテント細胞を形質転換した。形質転換から単一のコロニーを選択し、そして3mLのLB+100μg/mLのアンピシリン内で一晩培養した。Qiagenカラムを用いてこのDNAを単離した。プラスミドバックボーンだけでなくgag遺伝子の内部も切断するという制限酵素BstEIIでの消化によって、一つの陽性クローンを特定した。このプレプラスミドクローンをMRKpAdHVE3+CMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpAと称し、そしてそのサイズは37,498bpである。
E1と平行方向にてHIV−1 gagトランスジーンを含むシャトルベクターであるMRKpdelE1−CMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpAをPac1で消化した。反応混合物をBsfZ171で消化した。5,291bpの断片をゲル抽出によって精製した。MRKpAdHVE3プラスミドをCla1で37℃にて一晩消化し、そしてゲルで精製した。約100ngの5,290bpのシャトル+トランスジーン断片と、約100ngの直線化されたMRKpAdHVE3 DNAで、化学的なコンピテント細胞の大腸菌BJ5183を同時形質転換した。いくつかのクローンを選択し、そして2mLのTerrific(商標)ブロス内で、濁度が到達するまで6から8時間培養した。Qiagenアルカリ溶解およびフェノールクロロホルム法を用いて、細胞ペレットからの全DNAを精製した。イソプロパノールにてDNAを沈殿させ、そして20μLのdH2O内に再懸濁した。このDNAの2μLのアリコートで、大腸菌XL−1コンピテント細胞を形質転換した。形質転換から単一のコロニーを選択し、そして3mLのLB+100μg/mLのアンピシリン内で一晩培養した。Qiagenカラムを用いてこのDNAを単離した。プラスミドバックボーンだけでなくgag遺伝子の内部も切断するという制限酵素BstEIIでの消化によって、一つの陽性クローンを特定した。このプレプラスミドクローンをMRKpAdHVE3+CMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpAと称し、そしてそのサイズは37,498bpである。
F.強化されたアデノウイルス構築物−「MRK Ad5 HIV−1gag」のウイルスによる作製
MRK Ad5 HIV−1 gagには、新規E3+アデノベクターバックボーンであるMRKpAdHVE3内に、E1と平行方向に挿入されたhCMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpAトランスジーンが含まれる。我々は、このアデノベクターをMRK Ad5 HIV−1 gagと命名した。以下にこの構築物の調製についての概略を説明する:
プレプラスミドMRKpAdHVE3+CMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpAをPac1で消化してベクターバックボーンを開放し、そしてリン酸カルシウム法(アマシャム・ファルマシア・バイオテク(Amersham Pharmacia Biotech.)社)によって、約60%のコンフルエンスのPER.C6(登録商標)細胞を含む6cmの皿内で、3.3μgをトランスフェクトした。一旦CPEが(7から10日に)到達すると、培養物の凍結/解凍を三回行って、そして細胞残屑をペレット化した。この細胞溶解物の1mLを用いて、6cmの皿の中の、80から90%のコンフルエンスのPER.C6(登録商標)細胞を感染させた。一旦CPEが到達すると、培養物の凍結/解凍を三回行い、細胞残屑をペレット化した。次いで、細胞溶解物を用いて、15cmの皿に含まれる80から90%のコンフルエンスのPER.C6(登録商標)細胞を感染させた。この感染の手順を続けて行い、6回の継代にまで拡大した。次いで、CsCl法によって細胞ペレットからウイルスを抽出した。バンド形成を二回実施した(3種の勾配のCsClに続けて、CsClの連続的な勾配)。第二のバンド形成の直後に、A105緩衝液内でウイルスを透析した。プロナーゼ処理を利用し、次いでフェノール・クロロホルムによってウイルスDNAを抽出した。次いで、HindIIIを用いてウイルスDNAを消化し、そして[33P]dATPを用いて放射標識化した。ゲル電気泳動で消化産物を分離した後、そのゲルをワットマンろ紙上で乾燥させ、次いでオートラジオグラフィーに供した。この消化産物を、プレプラスミドからの消化産物(標識化の前にPac1/HindIIIで消化されたもの)と比較した。予想されたサイズが観察され、このことは、ウイルスのレスキューが成功したことを示した。
MRK Ad5 HIV−1 gagには、新規E3+アデノベクターバックボーンであるMRKpAdHVE3内に、E1と平行方向に挿入されたhCMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpAトランスジーンが含まれる。我々は、このアデノベクターをMRK Ad5 HIV−1 gagと命名した。以下にこの構築物の調製についての概略を説明する:
プレプラスミドMRKpAdHVE3+CMV(イントロンなし)−FLgag−bGHpAをPac1で消化してベクターバックボーンを開放し、そしてリン酸カルシウム法(アマシャム・ファルマシア・バイオテク(Amersham Pharmacia Biotech.)社)によって、約60%のコンフルエンスのPER.C6(登録商標)細胞を含む6cmの皿内で、3.3μgをトランスフェクトした。一旦CPEが(7から10日に)到達すると、培養物の凍結/解凍を三回行って、そして細胞残屑をペレット化した。この細胞溶解物の1mLを用いて、6cmの皿の中の、80から90%のコンフルエンスのPER.C6(登録商標)細胞を感染させた。一旦CPEが到達すると、培養物の凍結/解凍を三回行い、細胞残屑をペレット化した。次いで、細胞溶解物を用いて、15cmの皿に含まれる80から90%のコンフルエンスのPER.C6(登録商標)細胞を感染させた。この感染の手順を続けて行い、6回の継代にまで拡大した。次いで、CsCl法によって細胞ペレットからウイルスを抽出した。バンド形成を二回実施した(3種の勾配のCsClに続けて、CsClの連続的な勾配)。第二のバンド形成の直後に、A105緩衝液内でウイルスを透析した。プロナーゼ処理を利用し、次いでフェノール・クロロホルムによってウイルスDNAを抽出した。次いで、HindIIIを用いてウイルスDNAを消化し、そして[33P]dATPを用いて放射標識化した。ゲル電気泳動で消化産物を分離した後、そのゲルをワットマンろ紙上で乾燥させ、次いでオートラジオグラフィーに供した。この消化産物を、プレプラスミドからの消化産物(標識化の前にPac1/HindIIIで消化されたもの)と比較した。予想されたサイズが観察され、このことは、ウイルスのレスキューが成功したことを示した。
Gagの発現に関しては、ウエスタンブロット分析によって、すべてのウイルス構築物(アデノウイルスおよびポックスウイルス)を確認した。
免疫化
アカゲザルの体重を3から10kgの間とした。すべてのケースにおいて、それぞれのワクチンを1mLの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とした。アカゲザルを(ケタミン/キシラジンで)麻酔して、ワクチンを筋肉内に(「i.m.」)、すなわちツベルクリン用のシリンジ(ベクトン−ディッキンソン(Becton−Dickinson)社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)を用いて、0.5mLのアリコートを両方の三角筋内に投与した。免疫化計画の期間中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単球(PBMC)を調製した。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行った。
アカゲザルの体重を3から10kgの間とした。すべてのケースにおいて、それぞれのワクチンを1mLの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とした。アカゲザルを(ケタミン/キシラジンで)麻酔して、ワクチンを筋肉内に(「i.m.」)、すなわちツベルクリン用のシリンジ(ベクトン−ディッキンソン(Becton−Dickinson)社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)を用いて、0.5mLのアリコートを両方の三角筋内に投与した。免疫化計画の期間中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単球(PBMC)を調製した。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行った。
ELISPOTアッセイ
既に記述されたプロトコール(アレン(Allen)ら、2001 J.Virol.75(2):738−749)に従い、いくつかの変更を加えて、アカゲザルについてのIFN−γ ELISPOTアッセイを実施した。抗原特異的な刺激のために、10−アミノ酸(「aa」)のオーバーラップを伴った、HIV−1 gag配列の全体(シンペップ(Synpep)社、ダブリン、カリフォルニア州)を包含する20−aaのペプチドから、ペプチドのプールを調製した。それぞれのウェルに、50μLの2〜4×105の末梢血単球(PBMCs)を添加した。80フェムトリットル(「fL」)より小さいサイズを切り捨てるように設定したBeckman Coulter Z2粒子アナライザーを用いて、細胞数を計数した。50μLの培地、またはペプチドあたり8μg/mLの濃度のgagペプチドプールのいずれかを、PBMCに添加した。このサンプルのインキュベーションを37℃、5%のCO2にて20から24時間行った。それに応じて、スポットを展開し、そして特別注文のイメージング装置と、イメージプロ(ImagePro)(シルバースプリング、メリーランド州)のプラットフォームに基づいた自動計数サブルーチンを用いてプレートを処理した。細胞の投入量を106として計測値を正規化した。
既に記述されたプロトコール(アレン(Allen)ら、2001 J.Virol.75(2):738−749)に従い、いくつかの変更を加えて、アカゲザルについてのIFN−γ ELISPOTアッセイを実施した。抗原特異的な刺激のために、10−アミノ酸(「aa」)のオーバーラップを伴った、HIV−1 gag配列の全体(シンペップ(Synpep)社、ダブリン、カリフォルニア州)を包含する20−aaのペプチドから、ペプチドのプールを調製した。それぞれのウェルに、50μLの2〜4×105の末梢血単球(PBMCs)を添加した。80フェムトリットル(「fL」)より小さいサイズを切り捨てるように設定したBeckman Coulter Z2粒子アナライザーを用いて、細胞数を計数した。50μLの培地、またはペプチドあたり8μg/mLの濃度のgagペプチドプールのいずれかを、PBMCに添加した。このサンプルのインキュベーションを37℃、5%のCO2にて20から24時間行った。それに応じて、スポットを展開し、そして特別注文のイメージング装置と、イメージプロ(ImagePro)(シルバースプリング、メリーランド州)のプラットフォームに基づいた自動計数サブルーチンを用いてプレートを処理した。細胞の投入量を106として計測値を正規化した。
抗p24のELISA
Coulter p24抗原アッセイキット(ベックマン・クールター(Beckman Coulter)社、フラートン、カリフォルニア州)からの試薬を用いて、改変された競合的抗p24アッセイを開発した。簡単に言えば、250μLの血清サンプルに、20μLの溶解緩衝液およびCoulterキットからの15μLのp24抗原(9.375pg)を加えた。混合後、200μLのそれぞれのサンプルを、Coulterキットからのマウス抗p24 mAbで被覆したウェルに添加し、37℃で1.5時間のインキュベーションを行った。次いで、このウェルを洗浄し、そしてCoulterキットからのビオチン試薬(ポリクローナル抗p24ビオチン)の200μLを、それぞれのウェルに添加した。37℃でのインキュベーションの1時間後、ストレプトアビジン結合ホースラディシュペルオキシダーゼとTMB基質とを用いて、Coulterキットに記載されたようにして検出を行った。OD450nmの値を記録した。HIV−血清反応陽性の個体からの血清を連続的に2倍ずつ希釈したものを用いて、7点の標準曲線を作製した。アッセイについての切捨ての下限値は、自由に裁量して、血清反応陽性なヒトの血清の希釈によって規定される10ミリメルク単位/mL(mMU/mL)に設定する。この切捨てによって、希釈物の対照のみから得られ、陽性の分析物では得られないシグナルに対応する最大限に結合した対照シグナルの約65%にまで低下する。
Coulter p24抗原アッセイキット(ベックマン・クールター(Beckman Coulter)社、フラートン、カリフォルニア州)からの試薬を用いて、改変された競合的抗p24アッセイを開発した。簡単に言えば、250μLの血清サンプルに、20μLの溶解緩衝液およびCoulterキットからの15μLのp24抗原(9.375pg)を加えた。混合後、200μLのそれぞれのサンプルを、Coulterキットからのマウス抗p24 mAbで被覆したウェルに添加し、37℃で1.5時間のインキュベーションを行った。次いで、このウェルを洗浄し、そしてCoulterキットからのビオチン試薬(ポリクローナル抗p24ビオチン)の200μLを、それぞれのウェルに添加した。37℃でのインキュベーションの1時間後、ストレプトアビジン結合ホースラディシュペルオキシダーゼとTMB基質とを用いて、Coulterキットに記載されたようにして検出を行った。OD450nmの値を記録した。HIV−血清反応陽性の個体からの血清を連続的に2倍ずつ希釈したものを用いて、7点の標準曲線を作製した。アッセイについての切捨ての下限値は、自由に裁量して、血清反応陽性なヒトの血清の希釈によって規定される10ミリメルク単位/mL(mMU/mL)に設定する。この切捨てによって、希釈物の対照のみから得られ、陽性の分析物では得られないシグナルに対応する最大限に結合した対照シグナルの約65%にまで低下する。
細胞内サイトカインの染色
抗−hCD28モノクローナル抗体(クローンL293、ベクトン−ディッキンソン社)および抗hCD49dモノクローナル抗体(クローンL25、ベクトン−ディッキンソン社)を、最終濃度が1μg/mLとなるように、(17×100mmの丸底のポリプロピレン製試験管(ザルステット(Sarstedt)社、ニュートン、ノースカロライナ州)の中にある)2×106PBMC/mLの完全RPMI培地の1mLに添加した。gag特異的な刺激のために、10μLのペプチドプール(ペプチドにつき0.4mg/mL)を添加した。この試験管のインキュベーションを37℃で1時間行った。その後、20μLの5mg/mLのブレフェルジンA(シグマ(Sigma)社)を添加した。細胞のインキュベーションを37℃で16時間、5%のCO2、90%の湿度にて行った。4mLの冷PBS/2%のFBSをそれぞれの試験管に添加し、そして細胞を1200rpmにて10分間でペレット化した。細胞をPBS/2%のFBS中に再懸濁させ、そしていくつかの蛍光性のタグが付けられたmAbsを用いて表面マーカーのために染色した(30分間、4℃):試験管あたり20μLの抗hCD3−APC・クローンFN−18(バイオソース(Biosource)社);20μLの抗hCD8−PerCP・クローンSK1(ベクトン−ディッキンソン社);および20μLの抗hCD4−PE・クローンSK3(ベクトン−ディッキンソン社)。この段階から、暗所でサンプルを扱った。細胞を洗浄し、そして750μLの1×FACS Perm緩衝液(ベクトン−ディッキンソン社)中で10分間、室温にてインキュベーションを行った。細胞をペレット化し、そしてPBS/2%のFBS中に再懸濁させ、そして0.1μgのFITC−抗hIFN−γ・クローンMD−1(バイオソース社)を添加した。30分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄してPBS中に再懸濁させた。ベクトン−ディッキンソン社のFACS Calibur装置の四色のチャネルのすべてを用いて、サンプルを分析した。データを解析するために、最初に、リンパ球の集団を底部の側方散乱光および前方散乱光のゲートで制御し、そしてサイトカインに陽性な事象について遮断される共通する蛍光を、CD4+およびCD8+の両集団のために、ならびにサンプルの試験管の偽薬およびgag−ペプチドの両者のために使用した。
抗−hCD28モノクローナル抗体(クローンL293、ベクトン−ディッキンソン社)および抗hCD49dモノクローナル抗体(クローンL25、ベクトン−ディッキンソン社)を、最終濃度が1μg/mLとなるように、(17×100mmの丸底のポリプロピレン製試験管(ザルステット(Sarstedt)社、ニュートン、ノースカロライナ州)の中にある)2×106PBMC/mLの完全RPMI培地の1mLに添加した。gag特異的な刺激のために、10μLのペプチドプール(ペプチドにつき0.4mg/mL)を添加した。この試験管のインキュベーションを37℃で1時間行った。その後、20μLの5mg/mLのブレフェルジンA(シグマ(Sigma)社)を添加した。細胞のインキュベーションを37℃で16時間、5%のCO2、90%の湿度にて行った。4mLの冷PBS/2%のFBSをそれぞれの試験管に添加し、そして細胞を1200rpmにて10分間でペレット化した。細胞をPBS/2%のFBS中に再懸濁させ、そしていくつかの蛍光性のタグが付けられたmAbsを用いて表面マーカーのために染色した(30分間、4℃):試験管あたり20μLの抗hCD3−APC・クローンFN−18(バイオソース(Biosource)社);20μLの抗hCD8−PerCP・クローンSK1(ベクトン−ディッキンソン社);および20μLの抗hCD4−PE・クローンSK3(ベクトン−ディッキンソン社)。この段階から、暗所でサンプルを扱った。細胞を洗浄し、そして750μLの1×FACS Perm緩衝液(ベクトン−ディッキンソン社)中で10分間、室温にてインキュベーションを行った。細胞をペレット化し、そしてPBS/2%のFBS中に再懸濁させ、そして0.1μgのFITC−抗hIFN−γ・クローンMD−1(バイオソース社)を添加した。30分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄してPBS中に再懸濁させた。ベクトン−ディッキンソン社のFACS Calibur装置の四色のチャネルのすべてを用いて、サンプルを分析した。データを解析するために、最初に、リンパ球の集団を底部の側方散乱光および前方散乱光のゲートで制御し、そしてサイトカインに陽性な事象について遮断される共通する蛍光を、CD4+およびCD8+の両集団のために、ならびにサンプルの試験管の偽薬およびgag−ペプチドの両者のために使用した。
結果
A.免疫化計画
相同性と、同じコドンに最適化されたHIV−1 gagを発現するMRKAd5ベクターおよびMVAベクターに関する同種および異種のプライム・ブースト計画とに従って、3から6匹のアカゲザルの一団を免疫化した。免疫化のスケジュールを表1に記載する。
A.免疫化計画
相同性と、同じコドンに最適化されたHIV−1 gagを発現するMRKAd5ベクターおよびMVAベクターに関する同種および異種のプライム・ブースト計画とに従って、3から6匹のアカゲザルの一団を免疫化した。免疫化のスケジュールを表1に記載する。
B.T細胞免疫応答
ワクチンで誘導されるHIV−1 gagに対するT細胞の応答を、タンパク質配列の全体を包含する20−aaのペプチドプールに対するIFN−γ ELISPOTアッセイを利用して定量した。結果を図5および図6に示す。100万の末梢血単球(PBMCs)あたりのスポット形成細胞(SFC)の数として表しており、ペプチドプールから偽薬の対照を差し引いたものに対応する。
ワクチンで誘導されるHIV−1 gagに対するT細胞の応答を、タンパク質配列の全体を包含する20−aaのペプチドプールに対するIFN−γ ELISPOTアッセイを利用して定量した。結果を図5および図6に示す。100万の末梢血単球(PBMCs)あたりのスポット形成細胞(SFC)の数として表しており、ペプチドプールから偽薬の対照を差し引いたものに対応する。
図5は、(a)10e9 vp MRKAd5 HIV gagによる二回のプライム化免疫と、それに続く、10e9 vp MRKAd5 HIV gagでのブースト(「10e9 vp MRKAd5−10e9 vp MRKAd5」)によって;(b)二回のプライム化投与量の10e9 pfu MVA HIV−1 gagと、10e9 pfu MVA HIV−1 gagでの一回のブースト(「10e9 pfu MVA−10e9 pfu MVA」)によって;または(c)二回のプライム化投与量の10e9 vp MRKAd5 HIV−1 gagと、それに続く、10e9 pfu MVA HIV−1 gagでの一回のブースト投与(「10e9 vp MRKAd5−10e9 pfu MVA」)によって誘導されるT細胞の応答を示す図である。最後のプライム化投与量と、ブースト化投与量との間の休止期間は、20から23週間の間で変化した(MVA−MVAの対象物については20週間;MRKAd5−MRKAd5群の対象物の99D262、99C117、および99D227については22週間;そして残りの対象物については23週間)。約6ヶ月目に同じ投与量のMRKAd5 HIV−1 gagを投与した結果、ブーストの直前のレベルよりもわずかに上昇した;ブースト後のレベルは、ブースト前の最高値のレベルにおおむね匹敵していたか、そのレベルよりも小さい場合はなかった。このことは、最初の二回の免疫化によって作製されたベクターに対する免疫を中和する存在が原因かもしれない。ブースト後の応答は、6匹のサルのすべてについての平均として10e6のPBMCあたり275SFCであり、10e6のPBMCあたり500のgag特異的T細胞を上回ることはなかった。10e9 pfu MVA HIV−1 gagを三回(0ヶ月目、1ヶ月目、6ヶ月目)にサルに与えた場合、10e6のPBMCあたり100SFCを超えない程度の極めてわずかなHIV特異的T細胞の応答が現れた。対照的に、二回のプライム化投与量の10e9 vp MRKAd5 HIV−1 gagと、10e9 pfu MVA HIV−1 gagでのブーストの一回接種を動物に与えるという両者の様式を組み合わせると、3匹のサルのすべてについての平均として10e6のPBMCあたり1200SFCを超える最高値の応答にまで、gag特異的T細胞のレベルが上昇した。MVA HIV−1 gagはどちらかと言えば弱い免疫原であること;同じMRKAd5 HIV−1 gagによるブースト化と比較して極めて大きな利益も提供することを考えれば、MRKAd5−gagでプライムされた免疫応答を、さらに効果的にブーストするというMVA HIV−1 gagの能力は極めて著しい。プライムされた応答をブーストするというポックスウイルスベクターの能力も、より少量のプライム化投与量の107 vp MRKAd5 HIV−1 gagを用いることで明らかとなった(図6)。
異種のMRKAd5でプライムされMVAブーストする計画のワクチン接種を受けた個体からのPBMCsを、プライム化免疫(13週目)の後、およびブースト化免疫(31週目)の後の細胞内IFN−γ染色について分析した。このアッセイから、末梢血におけるCD4+gag特異的T細胞およびCD8+gag特異的T細胞の相対量に関する情報が提供された(表2)。この結果から、異種のプライム・ブースト免疫化のアプローチによって、アカゲザルのHIV特異的CD4+T細胞およびHIV特異的CD8+T細胞の両者を惹起できることが示された。
C.体液性免疫応答
それぞれの動物についてのいくつかの時点におけるp24特異的抗体の力価を測定した。それぞれの一団の幾何平均力価を計算し、図10に示した。MRKAd5 HIV−1 gagの二種の投与量によって、中程度のレベルの抗p24抗体(約1000mMU/mL)を誘導することができたのに対して、MVAの二種の投与量によって、検出可能なレベルの抗p24抗体を誘導することはできないようであった。MVA HIV−1 gagの投与によって、MRKAd5 HIV−1 gagにてプライムされた体液性免疫応答の約6倍(約7000mMU/mLまで)にまで高めた。このブースト効果は、10^9vpの投与量のMRKAd5 HIV−1 gagにより誘導される効果と類似している。しかしながら、これらの動物で見られる、10^9 vp MRKAd5 HIV−1 gagによるブースト効果は、Ad5に向けられたより高いレベルの中和活性を対象が持つ場合は(最初の二回のMRKAd5の投与量に対する既往反応のせいで)より小さいと予想される。他方、MVA HIV−1 gagのブースト効果は、予め存在する、Ad5に向けられた中和力価によっては影響を受けないであろう。
それぞれの動物についてのいくつかの時点におけるp24特異的抗体の力価を測定した。それぞれの一団の幾何平均力価を計算し、図10に示した。MRKAd5 HIV−1 gagの二種の投与量によって、中程度のレベルの抗p24抗体(約1000mMU/mL)を誘導することができたのに対して、MVAの二種の投与量によって、検出可能なレベルの抗p24抗体を誘導することはできないようであった。MVA HIV−1 gagの投与によって、MRKAd5 HIV−1 gagにてプライムされた体液性免疫応答の約6倍(約7000mMU/mLまで)にまで高めた。このブースト効果は、10^9vpの投与量のMRKAd5 HIV−1 gagにより誘導される効果と類似している。しかしながら、これらの動物で見られる、10^9 vp MRKAd5 HIV−1 gagによるブースト効果は、Ad5に向けられたより高いレベルの中和活性を対象が持つ場合は(最初の二回のMRKAd5の投与量に対する既往反応のせいで)より小さいと予想される。他方、MVA HIV−1 gagのブースト効果は、予め存在する、Ad5に向けられた中和力価によっては影響を受けないであろう。
複製能力が高いワクシニアウイルスを用いる免疫化計画
次の免疫化計画のうちの一つのやり方で、BALB/cマウスの筋肉内にワクチンを接種した:(1)一回のプライム化の投与量が5×10e8 vp Ad5−gag(参照して本明細書に組み込まれるPCT国際出願PCT/US00/18332号に開示されたアデノウイルスベクター)である;(2)一回のプライム化の投与量が5×10e8 vp Ad5−gagであって、次いで一回のブースト化投与量が5×10e6 pfuワクシニア−gagである;または(3)一回のプライム化の投与量が5×10e6 pfuワクシニア−gagである。完全な未処置の動物における応答のアッセイも行った。図7は、BALB/cマウスにおける、明確なgag CD8+エピトープ(AMQMLKETI)に特異的なT細胞の、偽薬補正がなされた頻度を示す図である。この結果から、ワクシニア−gagの投与によって、Ad5でプライムされた免疫応答(100万あたり約300)が、有意にブーストされたこと(100万あたり約1400まで)が示される。
次の免疫化計画のうちの一つのやり方で、BALB/cマウスの筋肉内にワクチンを接種した:(1)一回のプライム化の投与量が5×10e8 vp Ad5−gag(参照して本明細書に組み込まれるPCT国際出願PCT/US00/18332号に開示されたアデノウイルスベクター)である;(2)一回のプライム化の投与量が5×10e8 vp Ad5−gagであって、次いで一回のブースト化投与量が5×10e6 pfuワクシニア−gagである;または(3)一回のプライム化の投与量が5×10e6 pfuワクシニア−gagである。完全な未処置の動物における応答のアッセイも行った。図7は、BALB/cマウスにおける、明確なgag CD8+エピトープ(AMQMLKETI)に特異的なT細胞の、偽薬補正がなされた頻度を示す図である。この結果から、ワクシニア−gagの投与によって、Ad5でプライムされた免疫応答(100万あたり約300)が、有意にブーストされたこと(100万あたり約1400まで)が示される。
このウイルスの複製能力は高いため、(改変せずに)本発明の方法に用いることは適切ではないが、出願人らは、アデノウイルスでプライムされた応答を、どのようにしてポックスウイルスが極めて効果的にブーストするのかについての証明に、異なるポックスウイルス株によるこの例が役立つと考えている。
本実施例におけるマウスは、一回のプライムしか施していなかったことを言及しておきたい。当業者であれば、このような小動物系には、より大型の非ヒトの霊長類と比較して、免疫化の回数はわずかしか必要でないこと、および/または免疫をプライムするための投与量はより少量しか必要でないこと、という一般的な観察に対して適切な考慮を払う必要があることを認識する。
組み換えALVACの構築と精製
コドンに最適化されたヒトHIV−1 gagオープンリーディングフレーム(配列番号1)を発現する組み換えALVAC構築物を、技術的に十分に理解され、評価された基本的な手法に従って作製した;たとえば、米国特許第5,863,542号および第5,766,598号を参照すること。この手法は一般的に、対象のプロモーター(H6ワクシニアウイルス初期プロモーターなど)が機能するように、対象の遺伝子配列(ここでは配列番号1)がそのプロモーターと連結または結合した配置を、挿入が望まれるポックスウイルス内のDNA区画と相同なDNAを含むプラスミド構築物内に配置することを包含する。既に記述したように、この部位には必須の遺伝子座が含まれるべきではない。この第一の(一回または複数回の)段階の後に、大腸菌内での増殖によって得られたプラスミド構築物を増幅させ、そして単離する。次いで、対象の挿入物を含む単離されたプラスミドを、対象のポックスウイルス(ここではALVAC)と一緒に、細胞培養物、たとえばニワトリの胚線維芽細胞などの中にトランスフェクトする。次いで、組み換えウイルスを選択し、一連のプラーク精製によって精製する。
コドンに最適化されたヒトHIV−1 gagオープンリーディングフレーム(配列番号1)を発現する組み換えALVAC構築物を、技術的に十分に理解され、評価された基本的な手法に従って作製した;たとえば、米国特許第5,863,542号および第5,766,598号を参照すること。この手法は一般的に、対象のプロモーター(H6ワクシニアウイルス初期プロモーターなど)が機能するように、対象の遺伝子配列(ここでは配列番号1)がそのプロモーターと連結または結合した配置を、挿入が望まれるポックスウイルス内のDNA区画と相同なDNAを含むプラスミド構築物内に配置することを包含する。既に記述したように、この部位には必須の遺伝子座が含まれるべきではない。この第一の(一回または複数回の)段階の後に、大腸菌内での増殖によって得られたプラスミド構築物を増幅させ、そして単離する。次いで、対象の挿入物を含む単離されたプラスミドを、対象のポックスウイルス(ここではALVAC)と一緒に、細胞培養物、たとえばニワトリの胚線維芽細胞などの中にトランスフェクトする。次いで、組み換えウイルスを選択し、一連のプラーク精製によって精製する。
血清型6のアデノウイルスのベクター構築物の作製
A.Ad6プレアデノウイルスプラスミドの構築
第一世代のAd6ベクターを作製するために用いることができる、Ad6に基づくプレアデノウイルスプラスミドを、Ad5とAd6との間の広範囲の配列の相同性(約98%)を利用して構築した。相同組み換えを用いて、wtAd6配列を細菌のプラスミド内にクローン化した。
A.Ad6プレアデノウイルスプラスミドの構築
第一世代のAd6ベクターを作製するために用いることができる、Ad6に基づくプレアデノウイルスプラスミドを、Ad5とAd6との間の広範囲の配列の相同性(約98%)を利用して構築した。相同組み換えを用いて、wtAd6配列を細菌のプラスミド内にクローン化した。
pAd6E1−E3+を細菌プラスミドとして回収するために用いる一般的な計画を、図11で説明する。wtAd6の精製ウイルスDNA(ATCC登録番号VR−6)と、Ad5 ITRカセットと呼ばれる第二のDNA断片とによる細菌BJ5183の同時形質転換によって、相同組み換えによるウイルスゲノムの環状化が達成された。ITRカセットは、細菌の複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列によって切り離されたAd5ゲノムの末端の右側(bp33798から35935)および左側(bp1から341およびbp3525から5767)の配列を含んでいる。このITRカセットは、Ad5の342から3524のE1配列が欠失している。ITRカセット内のAd5配列によって、その中で組み換えが起こり得るAd6の精製ウイルスDNAとの相同性領域が提供される。
可能性のあるクローンを制限分析によって選別し、そして一つのクローンをpAd6E1−E3+として選択した。次いで、このクローン全体の配列を決定した。pAd6E1−E3+には、Ad5配列のbp1から341およびbp3525から5548、Ad6のbp5542から33784、およびAd5のbp33967から35935(bpの数は、Ad5およびAd6についての野生型の配列を引用している)が含まれる。pAd6E1−E3+には、その血清型の特異性を構成するAd6ビリオンのすべての構造タンパク質についてのコード配列が含まれる。
B.HIV−1 gag遺伝子を含むAd6プレアデノウイルスプラスミドの構築
(1)アデノウイルスシャトルベクターの構築:
コドンに最適化された全長HIV−1 gag合成遺伝子を、MRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVmin+BGHpA(str.)の中に挿入することによって、シャトルプラスミドMRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVminFL−gag−bGHpAを構築した。MRKpdelE1(Pac/pIX/Pack450)+CMVmin+BGHpA(str.)には、E1配列のbp451から3510が欠失したAd5配列のbp1から5792が含まれている。HCMVプロモーターおよびBGH pAをE1の欠失部の中に、E1と平行方向にて、唯一のBglII部位が両者を引き離すように挿入した。プラスミドpV1Jns−HIV−FLgag−optのBglII消化、ゲルでの精製、およびMRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVmin+BGHpA(str.)中のBglII制限エンドヌクレアーゼ部位内への連結から、コドンに最適化された全長HIV−1 gag合成遺伝子を得、プラスミドMRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVminFL−gag−BGHpAを作製した。MRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVminFL−gag−BGHpAの遺伝子構造をPCR分析、制限酵素分析およびDNA配列分析によって確認した。
(1)アデノウイルスシャトルベクターの構築:
コドンに最適化された全長HIV−1 gag合成遺伝子を、MRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVmin+BGHpA(str.)の中に挿入することによって、シャトルプラスミドMRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVminFL−gag−bGHpAを構築した。MRKpdelE1(Pac/pIX/Pack450)+CMVmin+BGHpA(str.)には、E1配列のbp451から3510が欠失したAd5配列のbp1から5792が含まれている。HCMVプロモーターおよびBGH pAをE1の欠失部の中に、E1と平行方向にて、唯一のBglII部位が両者を引き離すように挿入した。プラスミドpV1Jns−HIV−FLgag−optのBglII消化、ゲルでの精製、およびMRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVmin+BGHpA(str.)中のBglII制限エンドヌクレアーゼ部位内への連結から、コドンに最適化された全長HIV−1 gag合成遺伝子を得、プラスミドMRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVminFL−gag−BGHpAを作製した。MRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVminFL−gag−BGHpAの遺伝子構造をPCR分析、制限酵素分析およびDNA配列分析によって確認した。
(2)プレアデノウイルスプラスミドの構築:
シャトルプラスミドMRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVminFL−gag−BGHpAを、制限酵素Pac1およびBst1107Iで消化し、次いで、直線化された(ClaIで消化された)アデノウイルスバックボーンプラスミドであるpAd6E1−E3+と共に、大腸菌のBJ5183株内に同時形質転換した。得られたpMRKAd6gagの遺伝子構造を、制限酵素分析およびDNA配列分析によって確認した。大規模に生産するために、このベクターをコンピテントな大腸菌XL−1 Blue内に形質転換した。回収されたプラスミドを、制限酵素消化分析とDNA配列分析によって、および一時的なトランスフェクション細胞の培養でのgagトランスジーンの発現によって確認した。
シャトルプラスミドMRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVminFL−gag−BGHpAを、制限酵素Pac1およびBst1107Iで消化し、次いで、直線化された(ClaIで消化された)アデノウイルスバックボーンプラスミドであるpAd6E1−E3+と共に、大腸菌のBJ5183株内に同時形質転換した。得られたpMRKAd6gagの遺伝子構造を、制限酵素分析およびDNA配列分析によって確認した。大規模に生産するために、このベクターをコンピテントな大腸菌XL−1 Blue内に形質転換した。回収されたプラスミドを、制限酵素消化分析とDNA配列分析によって、および一時的なトランスフェクション細胞の培養でのgagトランスジーンの発現によって確認した。
pMRKAd6gagには、Ad5のbp1から450とbp3511から5548、Ad6のbp5542から33784、およびAd5のbp33967から35935(bpの数は、Ad5およびAd6についての野生型の配列を引用している)が含まれる。プラスミドにおいて、ウイルスのITRsは細菌の複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列によって結合している。
C.リサーチグレードの組み換えMRKAd6gagの作製
前臨床的な免疫原性を研究するためのウイルスを作製するために、PER.C6(登録商標)の粘着性単層細胞培養の際に、プレアデノウイルスプラスミドpMRKAd6gagを感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするために、10μgのpMRKAd6gagを制限酵素PacI(ニュー・イングランド・バイオラブズ(New England Biolabs)社)で消化し、そしてリン酸カルシウム共沈法(Cell Phectトランスフェクションキット、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社)を利用して、6cmの皿の中のPER.C6(登録商標)細胞内にトランスフェクトした。PacI消化によってプラスミド配列からウイルスのゲノムが開放され、PER.C6(登録商標)細胞の中に入った後に、ウイルスの複製が可能になる。完全ウイルスによる細胞障害性効果(CPE)が観察された後で、感染細胞および培地を回収した。PER.C6(登録商標)細胞を複数回継代することによって、ウイルスのストックを増幅させた。最後の継代では、CsCl超遠心分離法によって、細胞ペレットからウイルスを精製した。精製ウイルスDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析と、インビトロで培養した、ウイルス感染哺乳動物細胞に由来する培養上清のgagのELISAによって、精製ウイルスの特定と純度を確認した。制限分析のために、消化されたウイルスDNAの末端をP33−dATPで標識化し、アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画し、そしてオートラジオグラフィーによって可視化した。
前臨床的な免疫原性を研究するためのウイルスを作製するために、PER.C6(登録商標)の粘着性単層細胞培養の際に、プレアデノウイルスプラスミドpMRKAd6gagを感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするために、10μgのpMRKAd6gagを制限酵素PacI(ニュー・イングランド・バイオラブズ(New England Biolabs)社)で消化し、そしてリン酸カルシウム共沈法(Cell Phectトランスフェクションキット、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社)を利用して、6cmの皿の中のPER.C6(登録商標)細胞内にトランスフェクトした。PacI消化によってプラスミド配列からウイルスのゲノムが開放され、PER.C6(登録商標)細胞の中に入った後に、ウイルスの複製が可能になる。完全ウイルスによる細胞障害性効果(CPE)が観察された後で、感染細胞および培地を回収した。PER.C6(登録商標)細胞を複数回継代することによって、ウイルスのストックを増幅させた。最後の継代では、CsCl超遠心分離法によって、細胞ペレットからウイルスを精製した。精製ウイルスDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析と、インビトロで培養した、ウイルス感染哺乳動物細胞に由来する培養上清のgagのELISAによって、精製ウイルスの特定と純度を確認した。制限分析のために、消化されたウイルスDNAの末端をP33−dATPで標識化し、アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画し、そしてオートラジオグラフィーによって可視化した。
Gagの発現に関しては、ウエスタンブロット分析によってすべてのウイルス構築物を確認した。
免疫化
アカゲザルの体重を3から10kgの間とした。すべてのケースにおいて、それぞれのワクチンを1mLの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とした。アカゲザルを(ケタミン/キシラジンで)麻酔して、ワクチンを筋肉内に(「i.m.」)、すなわちツベルクリン用のシリンジ(ベクトン−ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)を用いて、0.5mLのアリコートを両方の三角筋内に投与した。免疫化計画の期間中のいくつかの時点(通常は四週間ごと)で集めた血液サンプルから末梢血単球(PBMC)を調製した。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行った。
アカゲザルの体重を3から10kgの間とした。すべてのケースにおいて、それぞれのワクチンを1mLの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とした。アカゲザルを(ケタミン/キシラジンで)麻酔して、ワクチンを筋肉内に(「i.m.」)、すなわちツベルクリン用のシリンジ(ベクトン−ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)を用いて、0.5mLのアリコートを両方の三角筋内に投与した。免疫化計画の期間中のいくつかの時点(通常は四週間ごと)で集めた血液サンプルから末梢血単球(PBMC)を調製した。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行った。
ELISPOTアッセイ
既に記述されたプロトコール(アレンら、2001 J.Virol.75(2):738−749;カシミロ(Casimiro)ら、2002 J.Virol.76:185−94)に従い、いくつかの変更を加えて、アカゲザルについてのIFN−γ ELISPOTアッセイを実施した。抗原特異的な刺激のために、10−アミノ酸(「aa」)オーバーラップを伴った、HIV−1 gag配列の全体(シンペップ社、ダブリン、カリフォルニア州)を包含する20−aaのペプチドから、ペプチドのプールを調製した。それぞれのウェルに、50μLの2−4×105の末梢血単球(PBMCs)を添加した。80フェムトリットル(「fL」)より小さいサイズを切り捨てるように設定したBeckman Coulter Z2粒子アナライザーを用いて、細胞を計数した。50μLの培地、またはペプチドあたり8μg/mLの濃度のgagペプチドプールのいずれかを、PBMCに添加した。このサンプルのインキュベーションを37℃、5%のCO2にて20から24時間行った。それに応じて、スポットを展開し、そして顕微鏡下で計数した。細胞の投入量を106として計測値を正規化した。
既に記述されたプロトコール(アレンら、2001 J.Virol.75(2):738−749;カシミロ(Casimiro)ら、2002 J.Virol.76:185−94)に従い、いくつかの変更を加えて、アカゲザルについてのIFN−γ ELISPOTアッセイを実施した。抗原特異的な刺激のために、10−アミノ酸(「aa」)オーバーラップを伴った、HIV−1 gag配列の全体(シンペップ社、ダブリン、カリフォルニア州)を包含する20−aaのペプチドから、ペプチドのプールを調製した。それぞれのウェルに、50μLの2−4×105の末梢血単球(PBMCs)を添加した。80フェムトリットル(「fL」)より小さいサイズを切り捨てるように設定したBeckman Coulter Z2粒子アナライザーを用いて、細胞を計数した。50μLの培地、またはペプチドあたり8μg/mLの濃度のgagペプチドプールのいずれかを、PBMCに添加した。このサンプルのインキュベーションを37℃、5%のCO2にて20から24時間行った。それに応じて、スポットを展開し、そして顕微鏡下で計数した。細胞の投入量を106として計測値を正規化した。
細胞内サイトカインの染色
抗−hCD28モノクローナル抗体(クローンL293、ベクトン−ディッキンソン社)および抗hCD49dモノクローナル抗体(クローンL25、ベクトン−ディッキンソン社)を、最終濃度が1μg/mLとなるように、(17×100mmの丸底のポリプロピレン製試験管(ザルスタット社、ニュートン、ノースカロライナ州)の中にある)2×106PBMC/mLの完全RPMI培地の1mLに添加した。gag特異的な刺激のために、10μLのペプチドプール(ペプチドにつき0.4mg/mL)を添加した。この試験管のインキュベーションを37℃で1時間行った。その後、20μLの5mg/mLのブレフェルジンA(シグマ社)を添加した。細胞のインキュベーションを37℃で16時間、5%のCO2、90%の湿度にて行った。4mLの冷PBS/2%のFBSをそれぞれの試験管に添加し、そして細胞を1200rpmにて10分間でペレット化した。細胞をPBS/2%のFBS中に再懸濁させ、そしていくつかの蛍光性のタグが付けられたmAbsを用いて表面マーカーのために染色した(30分間、4℃):試験管あたり20μLの抗hCD3−APC・クローンFN−18(バイオソース社);20μLの抗hCD8−PerCP・クローンSK1(ベクトン−ディッキンソン社);および20μLの抗hCD4−PE・クローンSK3(ベクトン−ディッキンソン社)。この段階から、暗所でサンプルを扱った。細胞を洗浄し、そして750μLの1×FACS Perm緩衝液(ベクトン−ディッキンソン社)中で10分間、室温にてインキュベーションを行った。細胞をペレット化し、そしてPBS/2%のFBS中に再懸濁させ、そして0.1μgのFITC−抗hIFN−γ・クローンMD−1(バイオソース社)を添加した。30分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄してPBS中に再懸濁させた。ベクトン−ディッキンソン社のFACS Calibur装置の四色のチャネルのすべてを用いて、サンプルを分析した。データを解析するために、最初に、リンパ球の集団を底部の側方散乱光および前方散乱光のゲートで制御し、そしてサイトカインに陽性な事象について遮断される共通する蛍光を、CD4+およびCD8+の両集団のために、ならびにサンプルの試験管の偽薬およびgag−ペプチドの両者のために使用した。
抗−hCD28モノクローナル抗体(クローンL293、ベクトン−ディッキンソン社)および抗hCD49dモノクローナル抗体(クローンL25、ベクトン−ディッキンソン社)を、最終濃度が1μg/mLとなるように、(17×100mmの丸底のポリプロピレン製試験管(ザルスタット社、ニュートン、ノースカロライナ州)の中にある)2×106PBMC/mLの完全RPMI培地の1mLに添加した。gag特異的な刺激のために、10μLのペプチドプール(ペプチドにつき0.4mg/mL)を添加した。この試験管のインキュベーションを37℃で1時間行った。その後、20μLの5mg/mLのブレフェルジンA(シグマ社)を添加した。細胞のインキュベーションを37℃で16時間、5%のCO2、90%の湿度にて行った。4mLの冷PBS/2%のFBSをそれぞれの試験管に添加し、そして細胞を1200rpmにて10分間でペレット化した。細胞をPBS/2%のFBS中に再懸濁させ、そしていくつかの蛍光性のタグが付けられたmAbsを用いて表面マーカーのために染色した(30分間、4℃):試験管あたり20μLの抗hCD3−APC・クローンFN−18(バイオソース社);20μLの抗hCD8−PerCP・クローンSK1(ベクトン−ディッキンソン社);および20μLの抗hCD4−PE・クローンSK3(ベクトン−ディッキンソン社)。この段階から、暗所でサンプルを扱った。細胞を洗浄し、そして750μLの1×FACS Perm緩衝液(ベクトン−ディッキンソン社)中で10分間、室温にてインキュベーションを行った。細胞をペレット化し、そしてPBS/2%のFBS中に再懸濁させ、そして0.1μgのFITC−抗hIFN−γ・クローンMD−1(バイオソース社)を添加した。30分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄してPBS中に再懸濁させた。ベクトン−ディッキンソン社のFACS Calibur装置の四色のチャネルのすべてを用いて、サンプルを分析した。データを解析するために、最初に、リンパ球の集団を底部の側方散乱光および前方散乱光のゲートで制御し、そしてサイトカインに陽性な事象について遮断される共通する蛍光を、CD4+およびCD8+の両集団のために、ならびにサンプルの試験管の偽薬およびgag−ペプチドの両者のために使用した。
結果
A.免疫化計画
0週目、4週目、26週目に、4匹のアカゲザルの一団に、MRKAd5−HIVgagまたはMRKAd6−HIVgagのいずれかを三(3)種の投与量にて与えた。五十六(56)週目に、10^8 pfuのALVAC−HIVgagの一回量のブースターを筋肉内に与えた。比較のために、0週目、4週目、27週目に、三(3)匹のサルの別の一団に、同じALVAC−HIVgag(10^9pfu)を三(3)種の投与量にて与えた。すべてのウイルスベクターは、同じコドンに最適化されたHIV−1 gagを発現した。免疫化のスケジュールを表3に記載する。
A.免疫化計画
0週目、4週目、26週目に、4匹のアカゲザルの一団に、MRKAd5−HIVgagまたはMRKAd6−HIVgagのいずれかを三(3)種の投与量にて与えた。五十六(56)週目に、10^8 pfuのALVAC−HIVgagの一回量のブースターを筋肉内に与えた。比較のために、0週目、4週目、27週目に、三(3)匹のサルの別の一団に、同じALVAC−HIVgag(10^9pfu)を三(3)種の投与量にて与えた。すべてのウイルスベクターは、同じコドンに最適化されたHIV−1 gagを発現した。免疫化のスケジュールを表3に記載する。
B.T細胞免疫応答
ワクチンで誘導されるHIV−1 gagに対するT細胞の応答を、タンパク質配列の全体を包含する20−aaのペプチドプールに対するIFN−γ ELISPOTアッセイを利用して定量した。結果を図12に示す。100万の末梢血単球(PBMCs)あたりのスポット形成細胞(SFC)の数として表されており、ペプチドプールから偽薬の対照を差し引いたものに対応する。
ワクチンで誘導されるHIV−1 gagに対するT細胞の応答を、タンパク質配列の全体を包含する20−aaのペプチドプールに対するIFN−γ ELISPOTアッセイを利用して定量した。結果を図12に示す。100万の末梢血単球(PBMCs)あたりのスポット形成細胞(SFC)の数として表されており、ペプチドプールから偽薬の対照を差し引いたものに対応する。
図12は、10^7から10^9vpの投与量のMRKAd5−HIVgagまたはMRKAd6− HIVgagによって、gag特異的T細胞の応答が600SFC/10^PBMCを超えないレベルに誘導されたことを示す図である。アデノウイルスに基づくワクチンを二回投与した後の、四匹の動物のうちの三匹のレベルは300SFC/10^6PBMCを下回っていた。最後のアデノウイルスの投与から約半年の時点でALVACブーストして免疫化すると、抗原特異的な応答が、これらの動物における検出可能な範囲である10から114SFC/10^6PBMCを維持した。しかしながら、ALVACを投与した結果、ブーストを行った時点のレベルと比較して、T細胞の応答が約10から80倍高くなった。ALVACは本来、どちらかと言えば、アカゲザルにおける初代T細胞の免疫応答を誘導することに関して弱いワクチンベクターであることを考えれば、これらの結果は非常に驚くべきものである。ALVAC−HIVgagによる複数回の免疫化が行われた、さらに投与レベルが高い(10^9pfu)三匹のサルは、抗原に対して(100SFC/10^6PBMCを下回る)極めて弱い応答を示した(図12)。
同じアデノウイルスで、等価の投与レベル(たとえば最初の三回に与えられたもの)による四回目の免疫化によってこれらの大きな応答が惹起される可能性はない、と考えられている。というのは、最初の三回の投与によって、潜在的に効果が大きく、予め存在する抗アデノウイルス免疫が生じるからである。さらにここで留意すべきことは、これらのサルにおいて三回目のアデノウイルスの投与によって生じたレベルは、その後のALVACのブーストで見られるレベルとは比較にならないということである。これらの結果から、ALVACに基づくベクターは、初回の免疫応答には弱い誘導因子であるものの、かかるベクターはHIV抗原に対して既に存在している免疫応答の優れたブースターとして役立つことが明示される。MRKAdに基づくベクターとALVACとの間には相乗効果が存在することも、それは示している。
異種のMRKAd5/MRKAd6−ALVACブースト計画のワクチン接種を受けた個体からのPBMCsを分析した。ここでは、ブースト化(60週目)後の細胞内IFN−γ染色について分析した。このアッセイの結果から、末梢血におけるCD4+gag特異的T細胞およびCD8+gag特異的T細胞の相対量に関する情報が提供された(表4)。この結果から、異種のプライム・ブースト免疫化のアプローチによって、アカゲザルのHIV特異的CD4+T細胞およびHIV特異的CD8+T細胞の両者を惹起できることが示された。
免疫化と結果
A.免疫化
アカゲザルの体重を3から10kgの間とした。すべてのケースにおいて、それぞれのワクチンを1mLの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とした。アカゲザルを(ケタミン/キシラジンで)麻酔して、ワクチンをi.m.にて、すなわちツベルクリン用のシリンジ(ベクトン−ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)を用いて、0.5mLのアリコートを両方の三角筋内に投与した。免疫化計画の期間中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単球(PBMC)を調製した。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行った。
A.免疫化
アカゲザルの体重を3から10kgの間とした。すべてのケースにおいて、それぞれのワクチンを1mLの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とした。アカゲザルを(ケタミン/キシラジンで)麻酔して、ワクチンをi.m.にて、すなわちツベルクリン用のシリンジ(ベクトン−ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)を用いて、0.5mLのアリコートを両方の三角筋内に投与した。免疫化計画の期間中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単球(PBMC)を調製した。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行った。
B.ELISPOTアッセイ
既に記述されたプロトコール(アレンら、2001 J.Virol.75(2):738−749)に従い、いくつかの変更を加えて、アカゲザルについてのIFN−γ ELISPOTアッセイを実施した。抗原特異的な刺激のために、10−aaのオーバーラップを伴った、HIV−1 gag配列の全体(シンペップ社、ダブリン、カリフォルニア州)を包含する20−aaのペプチドから、ペプチドのプールを調製した。それぞれのウェルに、50μLの2〜4×105の末梢血単球(PBMCs)を添加した;80fLより小さいサイズを切り捨てるように設定したBeckman Coulter Z2粒子アナライザーを用いて、細胞を計数した。50μLの培地、またはペプチドあたり8μg/mLの濃度のgagペプチドプールのいずれかを、PBMCに添加した。このサンプルのインキュベーションを37℃、5%のCO2にて20から24時間行った。それに応じて、スポットを展開し、そして特別注文のイメージング装置と、イメージプロ(シルバースプリング、メリーランド州)のプラットフォームに基づいた自動計数サブルーチンを用いてプレートを処理した;細胞の投入量を106として計測値を正規化した。
既に記述されたプロトコール(アレンら、2001 J.Virol.75(2):738−749)に従い、いくつかの変更を加えて、アカゲザルについてのIFN−γ ELISPOTアッセイを実施した。抗原特異的な刺激のために、10−aaのオーバーラップを伴った、HIV−1 gag配列の全体(シンペップ社、ダブリン、カリフォルニア州)を包含する20−aaのペプチドから、ペプチドのプールを調製した。それぞれのウェルに、50μLの2〜4×105の末梢血単球(PBMCs)を添加した;80fLより小さいサイズを切り捨てるように設定したBeckman Coulter Z2粒子アナライザーを用いて、細胞を計数した。50μLの培地、またはペプチドあたり8μg/mLの濃度のgagペプチドプールのいずれかを、PBMCに添加した。このサンプルのインキュベーションを37℃、5%のCO2にて20から24時間行った。それに応じて、スポットを展開し、そして特別注文のイメージング装置と、イメージプロ(シルバースプリング、メリーランド州)のプラットフォームに基づいた自動計数サブルーチンを用いてプレートを処理した;細胞の投入量を106として計測値を正規化した。
C.細胞内サイトカインの染色
抗−hCD28モノクローナル抗体(クローンL293、ベクトン−ディッキンソン社)および抗hCD49dモノクローナル抗体(クローンL25、ベクトン−ディッキンソン社)を、最終濃度が1μg/mLとなるように、(17×100mmの丸底のポリプロピレン製試験管(ザルスタット社、ニュートン、ノースカロライナ州)の中にある)2×106PBMC/mLの完全RPMI培地の1mLに添加した。gag特異的な刺激のために、10μLのペプチドプール(ペプチドにつき0.4mg/mL)を添加した。この試験管のインキュベーションを37℃で1時間行った。その後、20μLの5mg/mLのブレフェルジンA(シグマ社)を添加した。細胞のインキュベーションを37℃で16時間、5%のCO2、90%の湿度にて行った。4mLの冷PBS/2%のFBSをそれぞれの試験管に添加し、そして細胞を1200rpmにて10分間でペレット化した。細胞をPBS/2%のFBS中に再懸濁させ、そしていくつかの蛍光性のタグが付けられたmAbsを用いて表面マーカーのために染色した(30分間、4℃):試験管あたり20μLの抗hCD3−APC・クローンFN−18(バイオソース社);20μLの抗hCD8−PerCP・クローンSK1(ベクトン−ディッキンソン社);および20μLの抗hCD4−PE・クローンSK3(ベクトン−ディッキンソン社)。この段階から、暗所でサンプルを扱った。細胞を洗浄し、そして750μLの1×FACS Perm緩衝液(ベクトン−ディッキンソン社)中で10分間、室温にてインキュベーションを行った。細胞をペレット化し、そしてPBS/2%のFBS中に再懸濁させ、そして0.1μgのFITC−抗hIFN−γ・クローンMD−1(バイオソース社)を添加した。30分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄してPBS中に再懸濁させた。ベクトン−ディッキンソン社のFACS Calibur装置の四色のチャネルのすべてを用いて、サンプルを分析した。データを解析するために、最初に、リンパ球の集団を底部の側方散乱光および前方散乱光のゲートで制御した;サイトカインに陽性な事象について遮断される共通する蛍光を、CD4+およびCD8+の両集団のために、ならびにサンプルの試験管の偽薬およびgag−ペプチドの両者のために使用した。
抗−hCD28モノクローナル抗体(クローンL293、ベクトン−ディッキンソン社)および抗hCD49dモノクローナル抗体(クローンL25、ベクトン−ディッキンソン社)を、最終濃度が1μg/mLとなるように、(17×100mmの丸底のポリプロピレン製試験管(ザルスタット社、ニュートン、ノースカロライナ州)の中にある)2×106PBMC/mLの完全RPMI培地の1mLに添加した。gag特異的な刺激のために、10μLのペプチドプール(ペプチドにつき0.4mg/mL)を添加した。この試験管のインキュベーションを37℃で1時間行った。その後、20μLの5mg/mLのブレフェルジンA(シグマ社)を添加した。細胞のインキュベーションを37℃で16時間、5%のCO2、90%の湿度にて行った。4mLの冷PBS/2%のFBSをそれぞれの試験管に添加し、そして細胞を1200rpmにて10分間でペレット化した。細胞をPBS/2%のFBS中に再懸濁させ、そしていくつかの蛍光性のタグが付けられたmAbsを用いて表面マーカーのために染色した(30分間、4℃):試験管あたり20μLの抗hCD3−APC・クローンFN−18(バイオソース社);20μLの抗hCD8−PerCP・クローンSK1(ベクトン−ディッキンソン社);および20μLの抗hCD4−PE・クローンSK3(ベクトン−ディッキンソン社)。この段階から、暗所でサンプルを扱った。細胞を洗浄し、そして750μLの1×FACS Perm緩衝液(ベクトン−ディッキンソン社)中で10分間、室温にてインキュベーションを行った。細胞をペレット化し、そしてPBS/2%のFBS中に再懸濁させ、そして0.1μgのFITC−抗hIFN−γ・クローンMD−1(バイオソース社)を添加した。30分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄してPBS中に再懸濁させた。ベクトン−ディッキンソン社のFACS Calibur装置の四色のチャネルのすべてを用いて、サンプルを分析した。データを解析するために、最初に、リンパ球の集団を底部の側方散乱光および前方散乱光のゲートで制御した;サイトカインに陽性な事象について遮断される共通する蛍光を、CD4+およびCD8+の両集団のために、ならびにサンプルの試験管の偽薬およびgag−ペプチドの両者のために使用した。
D.結果
4匹のサルの一団に、次のブースト用ワクチンの一つを0週目に与えた:(A)ALVAC vcp205、10^8pfu;(B)ALVAC vcp205、10^7pfu;(C)ALVAC HIV−1 gag、10^8pfu;(D)ALVAC HIV−1 gag、10^7pfu、または(E)MRKAd5 HIV−1 gag、10^9vp。ALVAC vcp205は、HIV−1 IIIB gagについての遺伝子をコードしている。ALVAC HIV−1 gagは、コドンに最適化されたHIV−1 CAM−1 gagをコードしている。この免疫化を行う前に、動物には予め、少なくとも10^9 vp Ad5 HIV−1 gagの投与量を3回与えておいた。Ad5 HIV−1 gagの最後の投与は1年以上前であった。0週目の時点のほんの少し前に、Ad5ベクターに対する中和力価を、すべての動物について測定した。ワクチンで誘導されるHIV−1 gagに対するT細胞の応答を、タンパク質配列の全体を包含する20−aaのペプチドプールに対するIFN−γ ELISPOTアッセイを利用して定量した。結果を表6に示す;100万の末梢血単球(PBMCs)あたりのスポット形成細胞(SFC)の数として表されており、ペプチドプールから偽薬の対照を差し引いたものに対応する。
4匹のサルの一団に、次のブースト用ワクチンの一つを0週目に与えた:(A)ALVAC vcp205、10^8pfu;(B)ALVAC vcp205、10^7pfu;(C)ALVAC HIV−1 gag、10^8pfu;(D)ALVAC HIV−1 gag、10^7pfu、または(E)MRKAd5 HIV−1 gag、10^9vp。ALVAC vcp205は、HIV−1 IIIB gagについての遺伝子をコードしている。ALVAC HIV−1 gagは、コドンに最適化されたHIV−1 CAM−1 gagをコードしている。この免疫化を行う前に、動物には予め、少なくとも10^9 vp Ad5 HIV−1 gagの投与量を3回与えておいた。Ad5 HIV−1 gagの最後の投与は1年以上前であった。0週目の時点のほんの少し前に、Ad5ベクターに対する中和力価を、すべての動物について測定した。ワクチンで誘導されるHIV−1 gagに対するT細胞の応答を、タンパク質配列の全体を包含する20−aaのペプチドプールに対するIFN−γ ELISPOTアッセイを利用して定量した。結果を表6に示す;100万の末梢血単球(PBMCs)あたりのスポット形成細胞(SFC)の数として表されており、ペプチドプールから偽薬の対照を差し引いたものに対応する。
ワクチン接種を受けた個体からのPBMCsを分析した。ここでは、ブースト化免疫から2週間後の細胞内IFN−γ染色について分析した。このアッセイから、末梢血におけるCD4+gag特異的T細胞およびCD8+gag特異的T細胞の相対量に関する情報が提供された(表6)。この結果から、異種のプライム・ブースト免疫化のアプローチによって、アカゲザルのHIV特異的CD4+T細胞およびHIV特異的CD8+T細胞の両者を惹起できることが示された。ALVACによるブーストによって、MRKAd5gagによるものと同程度のgag特異的なCD8+ T細胞が誘導されることも示される。しかしながら、ALVACによるブーストによって、MRKAd5−gagよりも高レベルのヘルパー応答が誘導されてしまう。このアッセイによって測定されるような、誘導された抗原特異的CD3+ T細胞の総量に基づいて、ALVAC HIV−1 gagのブーストによって、MRKAd5−gagのブーストよりも統計的に有意な6倍の向上(P=0.004)が示される。
免疫化計画
次の同種と異種のプライム・ブースト免疫化のスケジュール(表7)に基づいて、3から6匹のアカゲザルの一団を免疫する。ここで、このスケジュールは、コドンに最適化されたHIV−1 gag、polおよびnefをそれぞれ発現するAD5−gagベクター、−polベクター、および−nefベクター、ならびに、一つのウイルス中の、別個のプロモーターの制御下にある三遺伝子のすべてを発現するALVAC−gag、pol、nefに関するものである。それぞれのワクチンを1mLの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とする。アカゲザルを(ケタミン/キシラジンで)麻酔して、ワクチンを筋肉内に(「i.m.」)、すなわちツベルクリン用のシリンジ(ベクトン−ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)を用いて、0.5mLのアリコートを両方の三角筋内に投与する。免疫化計画の期間中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単球(PBMC)を調製する。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行う。
次の同種と異種のプライム・ブースト免疫化のスケジュール(表7)に基づいて、3から6匹のアカゲザルの一団を免疫する。ここで、このスケジュールは、コドンに最適化されたHIV−1 gag、polおよびnefをそれぞれ発現するAD5−gagベクター、−polベクター、および−nefベクター、ならびに、一つのウイルス中の、別個のプロモーターの制御下にある三遺伝子のすべてを発現するALVAC−gag、pol、nefに関するものである。それぞれのワクチンを1mLの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とする。アカゲザルを(ケタミン/キシラジンで)麻酔して、ワクチンを筋肉内に(「i.m.」)、すなわちツベルクリン用のシリンジ(ベクトン−ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)を用いて、0.5mLのアリコートを両方の三角筋内に投与する。免疫化計画の期間中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単球(PBMC)を調製する。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行う。
SIVのチャレンジ実験
次の異種プライム・ブースト免疫化のスケジュール(表8)に基づいて、3から6匹のサルの一団を免疫化する。ここで、このスケジュールは、コドンに最適化されたSIV gag、polおよびnefをそれぞれ発現するAd5−SIV−gagベクター、−polベクター、および−nefベクター、ならびに、一つのウイルス中の、別個のプロモーターの制御下にある三遺伝子のすべてを発現するALVAC−SIV gag、pol、nefに関するものである。mamuA01対立遺伝子の存在について、動物を予め選別し、そして分配しておく。それぞれのワクチンを1mLの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とする。アカゲザルを(ケタミン/キシラジンで)麻酔して、ワクチンを筋肉内に(「i.m.」)、すなわちツベルクリン用のシリンジ(ベクトン−ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)を用いて、0.5mLのアリコートを両方の三角筋内に投与する。免疫化計画の期間中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単球(PBMC)を調製し、SIV特異的T細胞の応答をモニターする。ALVACによるブースターの後、動物にSIVmac239株を全身的に接種する。ウイルス学的(すなわちウイルス負荷)および免疫パラメータ(たとえばウイルス特異的T細胞の応答、CD4の数、およびリンパ組織の構造)の両方について、動物をモニターする。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行う。
次の異種プライム・ブースト免疫化のスケジュール(表8)に基づいて、3から6匹のサルの一団を免疫化する。ここで、このスケジュールは、コドンに最適化されたSIV gag、polおよびnefをそれぞれ発現するAd5−SIV−gagベクター、−polベクター、および−nefベクター、ならびに、一つのウイルス中の、別個のプロモーターの制御下にある三遺伝子のすべてを発現するALVAC−SIV gag、pol、nefに関するものである。mamuA01対立遺伝子の存在について、動物を予め選別し、そして分配しておく。それぞれのワクチンを1mLの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とする。アカゲザルを(ケタミン/キシラジンで)麻酔して、ワクチンを筋肉内に(「i.m.」)、すなわちツベルクリン用のシリンジ(ベクトン−ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)を用いて、0.5mLのアリコートを両方の三角筋内に投与する。免疫化計画の期間中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単球(PBMC)を調製し、SIV特異的T細胞の応答をモニターする。ALVACによるブースターの後、動物にSIVmac239株を全身的に接種する。ウイルス学的(すなわちウイルス負荷)および免疫パラメータ(たとえばウイルス特異的T細胞の応答、CD4の数、およびリンパ組織の構造)の両方について、動物をモニターする。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行う。
Claims (29)
- (a)E1の少なくとも一部を欠失しE1の活性が奪われた、HIV−1抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程;およびその後に
(b)HIV−1抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えポックスウイルスベクターを含むブースト化免疫物を該哺乳動物宿主に接種する工程;ただし、該ポックスウイルスベクターは哺乳動物宿主おける複製能が損なわれているものとする、
を含む、哺乳動物宿主においてHIV−1抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。 - アデノウイルスベクターが血清型5のものである、請求項1に記載の方法。
- 組み換えアデノウイルスベクターが野生型血清型5のアデノウイルスゲノムの塩基対451から3510に対応する塩基対が欠失しているものである、請求項2に記載の方法。
- アデノウイルスベクターが血清型6のものである、請求項1に記載の方法。
- HIV−1抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子の少なくとも一つが、ヒトにおける発現に最適化されたコドンを含む、請求項1に記載の方法。
- 組み換えアデノウイルスベクターが、
(a)HIV−1抗原をコードする核酸;
(b)前記抗原をコードする核酸に作動可能に連結した異種プロモーター;および
(c)転写終結配列:
を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項1に記載の方法。 - 組み換えポックスウイルスベクターが、
(a)HIV−1抗原をコードする核酸;および
(b)前記抗原をコードする核酸に作動可能に連結したプロモーター;ただし、該プロモーターはポックスウイルスに由来するものかまたはそれに固有のものとする:
を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項1に記載の方法。 - 組み換えアデノウイルスベクターにおける遺伝子発現カセットがE1領域内に挿入されている、請求項6に記載の方法。
- 組み換えアデノウイルスベクターにおける遺伝子発現カセットがE1と平行方向にある、請求項8に記載の方法。
- プロモーターがイントロン配列を欠くサイトメガロウイルスのプロモーターである、請求項6に記載の方法。
- プロモーターがヒトサイトメガロウイルス即時型プロモーターである、請求項10に記載の方法。
- プロモーターがワクシニアウイルスの合成の初期/後期プロモーターである、請求項7に記載の方法。
- 転写終結配列がウシ成長ホルモンのポリアデニル化および転写終結配列である、請求項6に記載の方法。
- HIV−1抗原がHIV−1 gagである、請求項6に記載の方法。
- HIV−1抗原がHIV−1 gagである、請求項7に記載の方法。
- 遺伝子発現カセットが、HIV−1 gagタンパク質または免疫学的に関連するその改変体をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項6に記載の方法。
- 遺伝子発現カセットが、HIV−1 gagタンパク質または免疫学的に関連するその改変体をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項7に記載の方法。
- ポックスウイルスベクターが弱毒化されている、請求項1に記載の方法。
- ポックスウイルスベクターが、処置された哺乳動物宿主内でウイルスが複製能欠損性であるように改変されたワクシニアウイルスベクターである、請求項1に記載の方法。
- ポックスウイルスベクターがアビポックスウイルスである、請求項1に記載の方法。
- ポックスウイルスベクターが鶏痘ウイルスである、請求項1に記載の方法。
- ポックスウイルスベクターがMVAである、請求項1に記載の方法。
- ポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスのNYVAC株である、請求項1に記載の方法。
- ポックスウイルスベクターがALVACである、請求項1に記載の方法。
- (a)E1の少なくとも一部を欠失しE1の活性が奪われた、HIV−1 gag抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む血清型5の組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程;およびその後に
(b)HIV−1 gag抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えポックスウイルスベクターを含むブースト化免疫化物を該哺乳動物宿主に接種する工程;ただし、該ポックスウイルスベクターは哺乳動物宿主における複数能が損なわれているものとする、
を含む、哺乳動物宿主においてHIV−1 gag抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。 - (a)E1の少なくとも一部を欠失しE1の活性が奪われた、HIV−1抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程;およびその後に
(b)HIV−1抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えALVACベクターを含むブースト化免疫物を該哺乳動物宿主に接種する工程、
を含む、哺乳動物宿主においてHIV−1抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。 - (a)E1の少なくとも一部を欠失しE1の活性が奪われた、HIV−1 gag抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程;およびその後に
(b)HIV−1 gag抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えALVACベクターを含むブースト化免疫物を該哺乳動物宿主に接種する工程、
を含む、哺乳動物宿主においてHIV−1 gag抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。 - (a)E1の少なくとも一部を欠失しE1の活性が奪われた、HIV−1抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程;およびその後に
(b)HIV−1 gag抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えMVAベクターを含むブースト化免疫物を該哺乳動物宿主に接種する工程、
を含む、哺乳動物宿主においてHIV−1抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。 - (a)E1の少なくとも一部を欠失しE1の活性が奪われた、HIV−1 gag抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程;およびその後に
(b)HIV−1 gag抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えMVAベクターを含むブースト化免疫物を該哺乳動物宿主に接種する工程、
を含む、哺乳動物宿主においてHIV−1 gag抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。
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