JP2006502739A

JP2006502739A - Fully human antibody Fab fragment having human interferon-gamma neutralizing activity

Info

Publication number: JP2006502739A
Application number: JP2004553382A
Authority: JP
Inventors: デシュパンデ，ラジェンドラ・ブイ; ツァイ，メイ−メイ
Original assignee: アムジェンインコーポレイテッド
Priority date: 2002-10-17
Filing date: 2002-10-17
Publication date: 2006-01-26
Also published as: MXPA05003949A; CA2502668C; AU2002347978B2; EP1560595A4; EP1560595A2; AU2002347978A1; CA2502668A1

Abstract

本発明は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）の選択的結合剤を提供する。より具体的には、本発明は、ＩＦＮγに選択的に結合し、そして関節リウマチ、全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症などの自己免疫および炎症性疾患に関連する状態を防止するかまたは治療するのに使用可能な、抗体および抗原結合ドメインを提供する。前記の抗体および抗原結合ドメインをコードする核酸分子、並びに該核酸分子を産生するための発現ベクターおよび宿主細胞もまた、提供する。The present invention provides selective binding agents for interferon-gamma (IFNγ). More specifically, the present invention selectively binds to IFNγ and prevents or treats conditions associated with autoimmune and inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus and multiple sclerosis. Antibodies and antigen binding domains that can be used for Nucleic acid molecules encoding the antibodies and antigen binding domains as well as expression vectors and host cells for producing the nucleic acid molecules are also provided.

Description

発明の詳細な説明Detailed Description of the Invention

発明の分野
本発明は、ヒト・インターフェロン・ガンマ（ｈＩＦＮγ）に結合し、そして該分子と同族（ｃｏｇｎａｔｅ）受容体、ＩＦＮγ−Ｒとの相互作用を阻害し、そして／またはＩＦＮγに誘発される生物学的作用を修飾する、新規完全ヒト抗体Ｆａｂ断片に関する。より具体的には、本発明は、ファージ・ディスプレー・ライブラリーであって、ユニークなＦａｂ断片を含有し、該断片が次いで、全長ヒトＩｇＧ抗体に変換される、前記ファージ・ディスプレー・ライブラリーのｈＩＦＮγ親和性選択を通じて単離される中和Ｆａｂ断片（Ｆａｂ）に関する。ｈＩＦＮγ中和活性、高親和性、およびｉｎｖｉｖｏでの長い半減期という望ましい特質を有する、ｈＩＦＮγに対するこれらの新規完全ヒト抗体を用いて、多様な自己免疫および炎症性疾患を防止するかまたは治療することも可能である。本発明の完全ヒトＦａｂを産生するための核酸分子、ベクターおよび宿主細胞もまた提供する。 FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to organisms that bind to human interferon gamma (hIFNγ) and inhibit the interaction of the molecule with a cognate receptor, IFNγ-R, and / or are induced by IFNγ. The present invention relates to novel fully human antibody Fab fragments that modify the biological effects. More specifically, the present invention relates to a phage display library comprising a unique Fab fragment, which is then converted to a full-length human IgG antibody. It relates to neutralizing Fab fragments (Fab) isolated through hIFNγ affinity selection. Use these novel fully human antibodies against hIFNγ with the desirable attributes of hIFNγ neutralizing activity, high affinity, and long half-life in vivo to prevent or treat a variety of autoimmune and inflammatory diseases It is also possible. Nucleic acid molecules, vectors and host cells for producing fully human Fabs of the invention are also provided.

発明の背景
抗体は、生物薬剤学研究および薬剤発見の試みにおいて、長年、非常に重要な役割を果たしてきた。ヒト疾患の治療のための療法剤としての抗体の有用性は、抗体が：（ａ）ｉｎｖｉｖｏでの半減期が長く；（ｂ）高い親和性および特異性で標的（単数または複数）に結合可能であり；そして（ｃ）免疫エフェクター機能（補体結合および抗体依存性細胞傷害作用など）を仲介する能力を持ちうるため、長年、理想とされてきた。 BACKGROUND OF THE INVENTION Antibodies have played a very important role in biopharmaceutical research and drug discovery attempts for many years. The usefulness of antibodies as therapeutic agents for the treatment of human diseases is that antibodies: (a) have a long in vivo half-life; (b) bind to target (s) with high affinity and specificity And (c) has been ideal for many years because it can have the ability to mediate immune effector functions such as complement binding and antibody-dependent cytotoxicity.

しかし、今までは、非ヒト種から得た抗体に、不都合な免疫原性があり、抗体の長期臨床的有用性が制限されることから、療法抗体の概念を実行することは、大幅に制限されていた。最近の技術的進歩によって、免疫原性がより低く、そして長期の療法潜在能力を持つ、完全ヒト抗体を得る手段を提供することによって、これらの制限を克服する新規の方法が提供されてきている。さらに、コンビナトリアル・ライブラリー法および抗体操作における発展によって、抗体親和性、半減期、および／またはエフェクター機能を修飾する機会が得られるようになってきた。 Until now, however, implementation of the concept of therapeutic antibodies has been severely limited, as antibodies from non-human species have inconvenient immunogenicity and limit the long-term clinical usefulness of antibodies. It had been. Recent technological advances have provided new ways to overcome these limitations by providing a means to obtain fully human antibodies that are less immunogenic and have long-term therapeutic potential. . In addition, advances in combinatorial library methods and antibody manipulation have provided opportunities to modify antibody affinity, half-life, and / or effector function.

高親和性、高特異性であり、そしてｉｎｖｉｖｏでアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を持つ抗体を発見するのに、ファージ・コートタンパク質に融合された抗体断片の繊維状ファージ・ディスプレー・コンビナトリアル・ライブラリー（いわゆる「ファージ・ディスプレー・ライブラリー」）を使用する、こうした技術の１つが有効に用いられてきている。 Filamentous phage display combinatorial library of antibody fragments fused to phage coat proteins to discover antibodies with high affinity, high specificity, and in vivo agonist or antagonist activity ( One such technique using so-called “phage display libraries”) has been used effectively.

ヒト・インターフェロン・ガンマ（ｈＩＦＮγ）は、活性化Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞に産生されるリンホカインである。該分子は、抗増殖活性、抗ウイルス活性および免疫調節活性を示し、そして免疫系の大部分の初代細胞上にあるヘテロ二量体受容体、ｈＩＦＮγ−Ｒに結合し；Ｌａｎｇｅｒら，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ，９：３９３（１９８８）、そして炎症につながる事象カスケードを誘発する。ＩＦＮγの抗ウイルス活性および免疫調節活性は、いくつかの臨床状態に有益な影響を有することが知られる。しかし、ＩＦＮγ活性が有害な影響を有することが知られる、多くの臨床設定がある。例えば、自己免疫疾患は、高レベルの血中ｈＩＦＮγと関連し、そして現在、ＩＦＮγの隔絶が、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および多発性硬化症（ＭＳ）などの自己免疫疾患の症状軽減と関連することを示唆する証拠がある：例えばＳｋｕｒｋｏｖｉｃｈら，Ｉｎｔｅｒｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，１４：２３−３２（１９９８）；Ｇｅｒｅｚら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０９：２９６−３０３（１９９７）を参照されたい。ＩＦＮγ活性はまた、悪液質、敗血症ショックおよびクローン病などの疾患状態にも関連付けられてきている。 Human interferon gamma (hIFNγ) is a lymphokine produced by activated T lymphocytes and natural killer cells. The molecule exhibits antiproliferative activity, antiviral activity and immunomodulatory activity, and binds to a heterodimeric receptor, hIFNγ-R, on most primary cells of the immune system; Langer et al., Immunology Today, 9 : 393 (1988) and triggers an event cascade leading to inflammation. The antiviral and immunomodulatory activity of IFNγ is known to have a beneficial effect on several clinical conditions. However, there are many clinical settings where IFNγ activity is known to have deleterious effects. For example, autoimmune diseases are associated with high levels of blood hIFNγ, and currently IFNγ sequestration is associated with autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis (RA), systemic lupus erythematosus (SLE), and multiple sclerosis (MS). There is evidence to suggest that it is associated with symptom relief in: Kurkuvich et al. Journal of Immunotherapy, 14 : 23-32 (1998); Gerez et al., Clin. Exp. Immunol. 109 : 296-303 (1997). IFNγ activity has also been linked to disease states such as cachexia, septic shock and Crohn's disease.

ｈＩＦＮγのその受容体への相互作用を遮断することは、これに関連する最も上流の段階に介入することに相当するため、ｈＩＦＮγ中和活性を持つ完全ヒト抗体は、魅力的な療法製品候補に相当する。ヒト・インターフェロン−ガンマ（ｈＩＦＮγ）を療法標的として用いる抗体を同定するのに、ファージ・ディスプレー・ライブラリー技術を使用することが、本発明の目的である。 Blocking hIFNγ's interaction with its receptor is equivalent to intervening in the most upstream stages associated with this, and so fully human antibodies with hIFNγ neutralizing activity are attractive therapeutic product candidates. Equivalent to. It is an object of the present invention to use phage display library technology to identify antibodies that use human interferon-gamma (hIFNγ) as a therapeutic target.

発明の概要
本発明は、ヒト・インターフェロン−ガンマ（ｈＩＦＮγ）に結合する、新規完全ヒト抗体Ｆａｂ断片を提供する。１つの態様において、完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、ｈＩＦＮγとその同族受容体、ｈＩＦＮγ−Ｒとの相互作用を、部分的にまたは完全に阻害し、そしてそれによって、ｈＩＦＮγ活性を、部分的にまたは完全に阻害する方式で、ｈＩＦＮγに結合する；すなわち抗体は、ｈＩＦＮγのアンタゴニストである。好ましくは、ｈＩＦＮγは哺乳動物ｈＩＦＮγである。より好ましくは、ｈＩＦＮγは、可溶性型または細胞表面結合型であることも可能なヒトｈＩＦＮγ、あるいはその断片、誘導体および変異体（ｖａｒｉａｎｔ）である。 SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides novel fully human antibody Fab fragments that bind to human interferon-gamma (hIFNγ). In one embodiment, the fully human antibody Fab fragment partially or completely inhibits the interaction between hIFNγ and its cognate receptor, hIFNγ-R, and thereby partially or completely inhibits hIFNγ activity. Binds to hIFNγ in a manner that inhibits; i.e., the antibody is an antagonist of hIFNγ. Preferably, hIFNγ is mammalian hIFNγ. More preferably, hIFNγ is human hIFNγ, which can be soluble or cell surface bound, or fragments, derivatives and variants thereof.

本発明の抗体は、ネズミまたはヒトｈＩＦＮγなどのｈＩＦＮγ、好ましくはヒトｈＩＦＮγ、あるいはその免疫原性断片、誘導体または変異体で、動物を免疫することによって、調製可能である。さらに、ｈＩＦＮγがトランスフェクション細胞で発現されて、そしてその表面に結合するように、ｈＩＦＮγをコードする核酸分子を含有するベクターでトランスフェクションされた細胞を用いて、動物を免疫することも可能である。あるいは、ｈＩＦＮγへの結合に関して、抗体または抗原結合ドメイン配列を含むライブラリーをスクリーニングすることによって、抗体を得ることも可能である。こうしたライブラリーは、組み立てられたファージ粒子表面上に発現されるバクテリオファージ・コートタンパク質へのタンパク質融合体またはペプチド融合体、およびファージ粒子内に含有されるコードＤＮＡ配列として、バクテリオファージ中で、好適に調製される（いわゆる「ファージ・ディスプレー・ライブラリー」）。１つの例において、ファージ・ディスプレー・ライブラリーは、可変軽鎖および重鎖などのヒト抗体をコードするＤＮＡ配列を含有する。 The antibodies of the present invention can be prepared by immunizing animals with hIFNγ, such as murine or human hIFNγ, preferably human hIFNγ, or an immunogenic fragment, derivative or variant thereof. In addition, it is possible to immunize animals with cells transfected with a vector containing a nucleic acid molecule encoding hIFNγ such that hIFNγ is expressed in and binds to the surface of the transfected cells. . Alternatively, antibodies can be obtained by screening a library containing antibodies or antigen binding domain sequences for binding to hIFNγ. Such libraries are suitable in bacteriophages as protein or peptide fusions to bacteriophage coat proteins expressed on the surface of assembled phage particles, and coding DNA sequences contained within the phage particles. (So-called “phage display library”). In one example, a phage display library contains DNA sequences encoding human antibodies such as variable light and heavy chains.

抗体または抗原結合ドメインは、ｈＩＦＮγに結合可能であり、そして部分的にまたは完全にｈＩＦＮγ活性を中和する、天然抗体に類似の四量体糖タンパク質であることも可能であるし、あるいは一本鎖抗体；Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）’断片、二重特異性抗体、異種抗体、あるいはそれらの他の断片、変異体、または誘導体であることも可能である。抗体または抗原結合ドメインを、ハイブリドーマ細胞株（例えばマウス骨髄腫細胞に融合させた脾臓細胞などの、抗体産生細胞）で産生することも可能であるし、あるいは前記抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子でトランスフェクションした異種細胞株で産生することも可能である。 The antibody or antigen-binding domain can be a tetrameric glycoprotein similar to a natural antibody that can bind to hIFNγ and partially or completely neutralize hIFNγ activity, or a single It can also be a chain antibody; an Fv, Fab, Fab ′ or F (ab) ′ fragment, a bispecific antibody, a heterologous antibody, or other fragment, variant, or derivative thereof. The antibody or antigen-binding domain can be produced in a hybridoma cell line (eg, antibody-producing cells such as spleen cells fused to mouse myeloma cells), or a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding domain It is also possible to produce in a heterologous cell line transfected with the molecule.

本発明の抗体または抗原結合ドメインは：
（ａ）図３〜１３（配列番号６５〜配列番号８６）に示すようなＦａｂ重鎖アミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）の配列の保存的アミノ酸置換を含む、重鎖アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の配列に少なくとも約８０％同一である、重鎖アミノ酸配列；あるいは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の断片または誘導体
を含み、ｈＩＦＮγに選択的に結合する。 The antibody or antigen binding domain of the present invention is:
(A) Fab heavy chain amino acid sequence as shown in FIGS. 3 to 13 (SEQ ID NO: 65 to SEQ ID NO: 86);
(B) a heavy chain amino acid sequence comprising a conservative amino acid substitution of the sequence of (a);
(C) a heavy chain amino acid sequence that is at least about 80% identical to the sequence of (a); or (d) comprising a fragment or derivative of (a), (b) or (c) and selectively binding to hIFNγ To do.

別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、上記と同一の図３〜１３に示すようなＦａｂ重鎖アミノ酸配列（配列番号６５〜配列番号８６）および図１４〜２４に示すようなＦａｂ軽鎖アミノ酸配列（配列番号８７〜配列番号１０８）を含む抗体または抗原結合ドメインに認識される、ヒトｈＩＦＮγ上のエピトープを認識する。 In another embodiment, the antibody or antigen-binding domain of the present invention has the same Fab heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 65 to SEQ ID NO: 86) as shown in FIGS. It recognizes an epitope on human hIFNγ that is recognized by an antibody or antigen binding domain comprising the Fab light chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 87-SEQ ID NO: 108).

別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖を含み：
各Ｖ_ｌ鎖が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されるＣＤＲ１（Ｖ_ｌ）、ＣＤＲ２（Ｖ_ｌ）およびＣＤＲ３（Ｖ_ｌ）と称されるＣＤＲアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１（Ｖ_ｌ）が： In another embodiment, the antibody or antigen binding domain of the invention comprises a V _l chain and a V _h chain:
Each V _l chain comprises CDR amino acid sequences designated CDR1 (V _l ), CDR2 (V _l ) and CDR3 (V _l ) separated by a framework amino acid sequence, where CDR1 (V _l ) is:

からなる群より選択され、
ＣＤＲ２（Ｖ_ｌ）が： Selected from the group consisting of
CDR2 (V _l ) is:

からなる群より選択され、
そしてＣＤＲ３（Ｖ_ｌ）が： Selected from the group consisting of
And CDR3 (V _l ) is:

からなる群より選択され、
ＣＤＲ１（Ｖ_ｌ）、ＣＤＲ２（Ｖ_ｌ）およびＣＤＲ３（Ｖ_ｌ）が互いに独立に選択され；そして
各Ｖ_ｈ鎖が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されるＣＤＲ１（Ｖ_ｈ）、ＣＤＲ２（Ｖ_ｈ）およびＣＤＲ３（Ｖ_ｈ）と称されるＣＤＲアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１（Ｖ_ｈ）が： Selected from the group consisting of
CDR1 (V _l ), CDR2 (V _l ) and CDR3 (V _l ) are selected independently of each other; and each V _h chain is separated by a framework amino acid sequence CDR1 (V _h ), CDR2 (V _h ) And CDR3 (V _h ), the CDR amino acid sequence comprising: CDR1 (V _h ):

からなる群より選択され、
ＣＤＲ２（Ｖ_ｈ）が： Selected from the group consisting of
CDR2 (V _h ) is:

からなる群より選択され、
ＣＤＲ３（Ｖ_ｈ）が： Selected from the group consisting of
CDR3 (V _h ) is:

からなる群より選択され；
ＣＤＲ１（Ｖ_ｈ）、ＣＤＲ２（Ｖ_ｈ）およびＣＤＲ３（Ｖ_ｈ）が互いに独立に選択される。 Selected from the group consisting of:
CDR1 (V _h ), CDR2 (V _h ) and CDR3 (V _h ) are selected independently of each other.

別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖を含み：Ｖ_ｌ鎖が、配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＳＨＹＶＱ（配列番号０１）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＫＥＲＰＳ（配列番号１２）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＳＳＮＱＷＶ（配列番号２３）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号３４）を有するＣＤＲ１、配列ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４４）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＲＡＲＮＷＲＳＲＦＤＹ（配列番号５４）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。 In another embodiment, an antibody or antigen-binding domain of the invention comprises a V _l chain and a V _h chain, wherein the V _l chain has CDR1, the sequence EDKERPS (SEQ ID NO: 12) having the sequence TGSSGSIASHYVQ (SEQ ID NO: 01) CDR2, and comprises a CDR3 having a sequence QSYDSSNQWV (SEQ ID NO: 23); and _{V h} chain, CDRl has the sequence GYYWS (SEQ ID NO: 34), CDR2 having the sequence EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 44), and sequence GRARNWRSRFDY (SEQ ID NO: 54) comprising CDR3;
Of CDR1, CDR2 and CDR3 on each _{V l} chain and _{V h} chain are separated by framework amino acid sequences.

別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖を含み：Ｖ_ｌ鎖が、配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号０２）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＮＱＲＰＳ（配列番号１３）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＧＳＡＷＶ（配列番号２４）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、配列ＳＹＡＭＳ（配列番号３５）を有するＣＤＲ１、配列ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４５）を有するＣＤＲ２、および配列ＴＳＷＮＡＧＧＰＩＤＹ（配列番号５５）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。 In another embodiment, the antibody or antigen-binding domain of the invention comprises a V _l chain and a V _h chain, wherein the V _l chain has CDR1, the sequence EDNQRPS (SEQ ID NO: 13), which has the sequence TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 02). CDR2, and CDR3 having the sequence QSYDGSAWV (SEQ ID NO: 24); and the V _h chain is CDR1, having the sequence SYAMS (SEQ ID NO: 35), CDR2 having the sequence AISGSGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 45), and the sequence TSWNAGPDIDY (SEQ ID NO: 55) comprising CDR3;
Of CDR1, CDR2 and CDR3 on each _{V l} chain and _{V h} chain are separated by framework amino acid sequences.

別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖を含み：Ｖ_ｌ鎖が、配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＹＹＶＱ（配列番号０３）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号１４）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＲＮＳＬＶ（配列番号２５）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、配列ＳＹＡＭＳ（配列番号３５）を有するＣＤＲ１、配列ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４５）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＲＶＧＹＳＳＳＬＬＤＹ（配列番号５６）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。 In another embodiment, the antibody or antigen binding domain of the invention comprises a _{V l} chain and _{V h} chain: _{V l} chain comprises CDR1, SEQ EDDQRPS (SEQ ID NO: 14) having a sequence TRSSGSIASYYVQ (SEQ ID NO: 03) CDR2, and CDR3 having the sequence QSYDRNSLV (SEQ ID NO: 25); and the V _h chain is CDR1, having the sequence SYAMS (SEQ ID NO: 35), CDR2 having the sequence AISGSGSTYYADSSVKG (SEQ ID NO: 45), and the sequence DRVGYSSSLLDLY (SEQ ID NO: 56) comprising CDR3;
Of CDR1, CDR2 and CDR3 on each _{V l} chain and _{V h} chain are separated by framework amino acid sequences.

別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖を含み：Ｖ_ｌ鎖が、配列ＲＡＴＱＳＬＬＨＧＮＧＨＮＹＬＤ（配列番号０４）を有するＣＤＲ１、配列ＭＧＳＮＲＡＳ（配列番号１５）を有するＣＤＲ２、および配列ＭＱＡＬＱＬＰＰＴ（配列番号２６）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号３６）を有するＣＤＲ１、配列ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４６）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＫＧＳＲＩＴＩＦＧＶＶＧＳＡＧＦＤＹ（配列番号５７）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。 In another embodiment, an antibody or antigen-binding domain of the invention comprises a V _l chain and a V _h chain: V _l chain has CDR1, sequence MGSNRAS (SEQ ID NO: 15) having the sequence RATQSLLHGNGNYLD (SEQ ID NO: 04) CDR2, and comprises a CDR3 having a sequence MQALQLPPT (SEQ ID NO: 26); and _{V h} chain, CDRl has the sequence GYYWS (SEQ ID NO: 36), CDR2 having the sequence EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 46), and sequence DKGSRITIFGVVGSAGFDY (SEQ ID NO: 57) comprising CDR3;
Of CDR1, CDR2 and CDR3 on each _{V l} chain and _{V h} chain are separated by framework amino acid sequences.

別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖を含み：Ｖ_ｌ鎖が、配列ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＳ（配列番号０５）を有するＣＤＲ１、配列ＫＩＳＮＲＦＳ（配列番号１６）を有するＣＤＲ２、および配列ＭＱＡＴＱＬＰＹＴ（配列番号２７）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、配列ＮＡＲＭＧＶＳ（配列番号３７）を有するＣＤＲ１、配列ＨＩＦＳＮＤＥＥＳＹＳＴＳＬＫＳ（配列番号４７）を有するＣＤＲ２、および配列ＬＬＬＹＥＧＦＤＰ（配列番号５８）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。 In another embodiment, the antibody or antigen binding domain of the invention comprises a _{V l} chain and _{V h} chain: _{V l} chain comprises CDR1, SEQ KISNRFS (SEQ ID NO: 16) having the sequence RSSQSLVHSDGNTYLS (SEQ ID NO: 05) CDR2, and comprises a CDR3 having a sequence MQATQLPYT (SEQ ID NO: 27); and _{V h} chain, CDRl has the sequence NARMGVS (SEQ ID NO: 37), CDR2 having the sequence HIFSNDEESYSTSLKS (SEQ ID NO: 47), and sequence LLLYEGFDP (SEQ ID NO: 58) comprising CDR3;
Of CDR1, CDR2 and CDR3 on each _{V l} chain and _{V h} chain are separated by framework amino acid sequences.

別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖を含み：Ｖ_ｌ鎖が、配列ＳＧＤＶＬＡＲＫＹＡＲ（配列番号０６）を有するＣＤＲ１、配列ＫＤＲＥＲＰＳ（配列番号１７）を有するＣＤＲ２、および配列ＹＳＡＡＤＮＲＧＶ（配列番号２８）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、配列ＳＹＡＭＨ（配列番号３８）を有するＣＤＲ１、配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４８）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＬＶＬＴＭＴＳＲＲＡＡＦＤＩ（配列番号５９）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。 In another embodiment, the antibody or antigen binding domain of the invention comprises a _{V l} chain and _{V h} chain: _{V l} chain comprises CDR1, SEQ KDRERPS (SEQ ID NO: 17) having a sequence SGDVLARKYAR (SEQ ID NO: 06) CDR2, and comprises a CDR3 having a sequence YSAADNRGV (SEQ ID NO: 28); and _{V h} chain, CDRl has the sequence SYAMH (SEQ ID NO: 38), CDR2 having the sequence VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 48), and sequence DLVLTMTSRRAAFDI (SEQ ID NO: 59) comprising CDR3;
Of CDR1, CDR2 and CDR3 on each _{V l} chain and _{V h} chain are separated by framework amino acid sequences.

別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖を含み：Ｖ_ｌ鎖が、配列ＧＧＤＮＬＧＧＫＳＬＨ（配列番号０７）を有するＣＤＲ１、配列ＤＤＳＤＲＰＳ（配列番号１８）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＶＷＤＧＳＳＤＱＲＶ（配列番号２９）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、配列ＳＹＳＭＮ（配列番号３９）を有するＣＤＲ１、配列ＳＩＳＳＧＳＳＹＲＹＤＡＤＳＶＫＧ（配列番号４９）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＱＷＧＴＩＳＧＮＤＹ（配列番号６０）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。 In another embodiment, the antibody or antigen-binding domain of the invention comprises a V ₁ chain and a V _h chain, wherein the V ₁ chain has CDR1, sequence DDSDDRPS (SEQ ID NO: 18) having the sequence GGDNLGGGSLH (SEQ ID NO: 07). CDR2, and comprises a CDR3 having a sequence QVWDGSSDQRV (SEQ ID NO: 29); and _{V h} chain, CDRl has the sequence SYSMN (SEQ ID NO: 39), CDR2 having the sequence SISSGSSYRYDADSVKG (SEQ ID NO: 49), and sequence DQWGTISGNDY (SEQ ID NO: 60) comprising CDR3;
Of CDR1, CDR2 and CDR3 on each _{V l} chain and _{V h} chain are separated by framework amino acid sequences.

別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖を含み：Ｖ_ｌ鎖が、配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＴＮＥＹＮＹＬＤ（配列番号０８）を有するＣＤＲ１、配列ＬＧＳＮＲＡＰ（配列番号１９）を有するＣＤＲ２、および配列ＭＱＡＬＱＴＰＲＴ（配列番号３０）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号４０）を有するＣＤＲ１、配列ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５０）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＷＰＴＹＶＷＧＳＹＲＰＫＧＹＦＤＹ（配列番号６１）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。 In another embodiment, an antibody or antigen-binding domain of the invention comprises a V ₁ chain and a V _h chain, wherein the V ₁ chain has CDR1, the sequence LGSNRAP (SEQ ID NO: 19) having the sequence RSSQSLLHTNENYNYLD (SEQ ID NO: 08). CDR2, and comprises a CDR3 having a sequence MQALQTPRT (SEQ ID NO: 30); and _{V h} chain, CDRl has the sequence GYYWS (SEQ ID NO: 40), CDR2 having the sequence EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 50), and sequence GWPTYVWGSYRPKGYFDY (SEQ ID NO: 61) comprising CDR3;
Of CDR1, CDR2 and CDR3 on each _{V l} chain and _{V h} chain are separated by framework amino acid sequences.

別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖を含み：Ｖ_ｌ鎖が、配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＮＮＹＶＨ（配列番号０９）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号２０）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＮＳＮＳＦＶＶ（配列番号３１）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、配列ＳＧＧＹＳＷＳ（配列番号４１）を有するＣＤＲ１、配列ＹＩＹＨＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５１）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＤＷＧＹＦＤＹ（配列番号６２）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。 In another embodiment, the antibody or antigen binding domain of the invention comprises a _{V l} chain and _{V h} chain: _{V l} chain comprises CDR1, SEQ EDDQRPS (SEQ ID NO: 20) having the sequence TGSSGSIANNYVH (SEQ ID NO: 09) CDR2, and CDR3 having the sequence QSYDNSNSFVV (SEQ ID NO: 31); and the V _h chain is CDR1, having the sequence SGGYSWS (SEQ ID NO: 41), CDR2 having the sequence YIYHSGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO: 51), and the sequence GDWGYFDY (SEQ ID NO: 62) comprising CDR3;
Of CDR1, CDR2 and CDR3 on each _{V l} chain and _{V h} chain are separated by framework amino acid sequences.

別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖を含み：Ｖ_ｌ鎖が、配列ＲＡＳＱＹＶＳＳＮＳＬＡ（配列番号１０）を有するＣＤＲ１、配列ＧＡＳＮＲＡＴ（配列番号２１）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＱＹＧＳＳＰＩＴ（配列番号３２）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、配列ＳＮＹＭＳ（配列番号４２）を有するＣＤＲ１、配列ＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５２）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＡＤＧＧＤＹＧＹ（配列番号６３）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。 In another embodiment, an antibody or antigen-binding domain of the invention comprises a V _l chain and a V _h chain, wherein the V _l chain has CDR1, the sequence GASNRAT (SEQ ID NO: 21) having the sequence RASQYVSSNSLA (SEQ ID NO: 10) CDR2, and comprises a CDR3 having a sequence QQYGSSPIT (SEQ ID NO: 32); and _{V h} chain, CDRl has the sequence SNYMS (SEQ ID NO: 42), CDR2 having the sequence VIYSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 52), and sequence DADGGDYGY (SEQ ID NO: 63) comprising CDR3;
Of CDR1, CDR2 and CDR3 on each _{V l} chain and _{V h} chain are separated by framework amino acid sequences.

別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖を含み：Ｖ_ｌ鎖が、配列ＲＳＳＱＳＬＬＲＳＮＧＹＮＹＬＡ（配列番号１１）を有するＣＤＲ１、配列ＬＡＳＮＲＡＳ（配列番号２２）を有するＣＤＲ２、および配列ＶＨＧＶＨＩＰＹＴ（配列番号３３）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、配列ＳＮＥＡＧＶＧ（配列番号４３）を有するＣＤＲ１、配列ＬＬＹＷＤＤＤＫＲＹＳＰＳＬＲＳ（配列番号５３）を有するＣＤＲ２、および配列ＲＬＶＲＹＧＧＹＳＴＧＧＦＤＶ（配列番号６４）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。 In another embodiment, an antibody or antigen-binding domain of the invention comprises a V _l chain and a V _h chain, wherein the V _l chain has CDR1, sequence LASNRAS (SEQ ID NO: 22) having the sequence RSSQSLLRSNGYNYLA (SEQ ID NO: 11). CDR2, and CDR3 having the sequence VHGVHIPYT (SEQ ID NO: 33); and the V _h chain is CDR1, having the sequence SNEAGVG (SEQ ID NO: 43), CDR having the sequence LLYWDDDRYSPSLRS (SEQ ID NO: 53), and the sequence RLVRYGGYSTGGFDV (SEQ ID NO: 64) comprising CDR3;
Of CDR1, CDR2 and CDR3 on each _{V l} chain and _{V h} chain are separated by framework amino acid sequences.

本発明の抗体および抗原結合ドメインは、軽鎖および重鎖アミノ酸配列をコードするゲノムＤＮＡに存在する生殖系列核酸由来である。抗体は、生殖系列配列再編成突然変異および体細胞突然変異の産物である核酸配列にコードされる。 The antibodies and antigen binding domains of the present invention are derived from germline nucleic acids present in genomic DNA encoding light and heavy chain amino acid sequences. The antibody is encoded by a nucleic acid sequence that is the product of germline sequence rearrangement mutations and somatic mutations.

１つの態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖を含み、Ｖ_ｌ鎖が、図４１におけるようなＶλ６生殖系列遺伝子（配列番号１３０）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、図３３におけるようなＶＨ４生殖系列遺伝子（配列番号１２２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして抗体は、ＩＦＮγポリペプチドに選択的に結合する。 In one embodiment, an antibody or antigen binding domain of the invention comprises a V _l chain and a V _h chain, wherein the V _l chain is a rearranged variant of the Vλ6 germline gene (SEQ ID NO: 130) as in FIG. The V _h chain comprises a rearranged or somatic variant of the VH4 germline gene (SEQ ID NO: 122) as in FIG. 33; and the antibody is selective for the IFNγ polypeptide To join.

別の態様において、Ｖ_ｌ鎖が、図４１におけるようなＶλ６生殖系列遺伝子（配列番号１３０）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、図３４におけるようなＶＨ１生殖系列遺伝子（配列番号１２３）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。 In another embodiment, the V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the Vλ6 germline gene (SEQ ID NO: 130) as in FIG. 41; and the V _h chain is a VH1 germline as in FIG. A rearrangement variant or somatic variant of a lineage gene (SEQ ID NO: 123) is included.

別の態様において、Ｖ_ｌ鎖が、図４２におけるようなＶκ２生殖系列遺伝子（配列番号１３１）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、図３５におけるようなＶＨ２生殖系列遺伝子（配列番号１２４）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。 In another embodiment, the V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the Vκ2 germline gene (SEQ ID NO: 131) as in FIG. 42; and the V _h chain is a VH2 germline as in FIG. A rearrangement variant or somatic variant of a lineage gene (SEQ ID NO: 124) is included.

別の態様において、Ｖ_ｌ鎖が、図４３におけるようなＶκ２生殖系列遺伝子（配列番号１３２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、図３３におけるようなＶＨ４生殖系列遺伝子（配列番号１２２）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。 In another embodiment, the V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the Vκ2 germline gene (SEQ ID NO: 132) as in FIG. 43; and the V _h chain is a VH4 germline as in FIG. A rearrangement variant or somatic variant of a lineage gene (SEQ ID NO: 122) is included.

別の態様において、Ｖ_ｌ鎖が、図４４におけるようなＶλ３生殖系列遺伝子（配列番号１３３）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、図３６におけるようなＶＨ３生殖系列遺伝子（配列番号１２５）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。 In another embodiment, the V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the Vλ3 germline gene (SEQ ID NO: 133) as in FIG. 44; and the V _h chain is a VH3 germline as in FIG. A rearrangement variant or somatic variant of a lineage gene (SEQ ID NO: 125) is included.

別の態様において、Ｖ_ｌ鎖が、図４５におけるようなＶλ３生殖系列遺伝子（配列番号１３４）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、図３７におけるようなＶＨ３生殖系列遺伝子（配列番号１２６）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。 In another embodiment, the V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the Vλ3 germline gene (SEQ ID NO: 134) as in FIG. 45; and the V _h chain is a VH3 germline as in FIG. A rearrangement variant or somatic variant of a lineage gene (SEQ ID NO: 126) is included.

別の態様において、Ｖ_ｌ鎖が、図４６におけるようなＶκ３生殖系列遺伝子（配列番号１３５）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、図３８におけるようなＶＨ３生殖系列遺伝子（配列番号１２７）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。 In another embodiment, the V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the Vκ3 germline gene (SEQ ID NO: 135) as in FIG. 46; and the V _h chain is a VH3 germline as in FIG. A rearrangement variant or somatic variant of a lineage gene (SEQ ID NO: 127) is included.

別の態様において、Ｖ_ｌ鎖が、図４１におけるようなＶλ６生殖系列遺伝子（配列番号１３０）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、図３９におけるようなＶＨ４生殖系列遺伝子（配列番号１２８）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。 In another embodiment, the V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the Vλ6 germline gene (SEQ ID NO: 130) as in FIG. 41; and the V _h chain is a VH4 germline as in FIG. A rearrangement variant or somatic variant of a lineage gene (SEQ ID NO: 128) is included.

別の態様において、Ｖ_ｌ鎖が、図４３におけるようなＶκ２生殖系列遺伝子（配列番号１３２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、図４０におけるようなＶＨ２生殖系列遺伝子（配列番号１２９）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。 In another embodiment, the V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the Vκ2 germline gene (SEQ ID NO: 132) as in FIG. 43; and the V _h chain is a VH2 germline as in FIG. A rearrangement variant or somatic variant of a lineage gene (SEQ ID NO: 129) is included.

本発明の選択的結合剤（抗体または抗原結合ドメイン）は、ＩＦＮγの少なくとも１つの活性、例えばＩＦＮγのＩＦＮγ−Ｒへの結合を、部分的にまたは完全に阻害する。
１つの態様において、ＩＦＮγアンタゴニスト、例えば抗体または抗原ドメインは、狼瘡様疾患、関節炎、または多発性硬化症様症候群を経験しているか、またはこれらを発展させるリスクがある動物に投与される。ＩＦＮγアンタゴニストを用いて、ループス腎炎、関節リウマチ、および／または多発性硬化症を防止し、そして／または治療することも可能である。 The selective binding agents (antibodies or antigen binding domains) of the present invention partially or completely inhibit at least one activity of IFNγ, such as binding of IFNγ to IFNγ-R.
In one embodiment, an IFNγ antagonist, such as an antibody or antigen domain, is administered to an animal experiencing or at risk of developing lupus-like disease, arthritis, or multiple sclerosis-like syndrome. IFNγ antagonists can also be used to prevent and / or treat lupus nephritis, rheumatoid arthritis, and / or multiple sclerosis.

本発明の抗体または抗原結合ドメインおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含む組成物もまた、提供する。 Compositions comprising an antibody or antigen binding domain of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier are also provided.

発明の詳細な説明
本発明は、ヒト・インターフェロン−ガンマ・タンパク質（ｈＩＦＮγ）に選択的に結合する剤（「選択的結合剤」）を提供する。好ましくは、該剤は、ＩＦＮγアンタゴニストまたは阻害剤であり、ＩＦＮγの少なくとも１つの活性、例えばＩＦＮγのその同族受容体への結合を、部分的にまたは完全に阻害する。１つの態様において、完全ヒト抗体断片は、ＩＦＮγのその同族受容体への結合を、部分的にまたは完全に遮断し、そしてＩＦＮγ活性を、部分的にまたは完全に阻害するように、ＩＦＮγに選択的に結合する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides agents that selectively bind to human interferon-gamma protein (hIFNγ) (“selective binding agents”). Preferably, the agent is an IFNγ antagonist or inhibitor that partially or completely inhibits at least one activity of IFNγ, eg, binding of IFNγ to its cognate receptor. In one embodiment, the fully human antibody fragment is selected for IFNγ to partially or completely block binding of IFNγ to its cognate receptor and partially or completely inhibit IFNγ activity. Join.

用語「選択的結合剤」は、ＩＦＮγに優先的に結合する分子を指す。選択的結合剤には、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または小分子量化合物が含まれることも可能である。好ましい態様において、選択的結合剤は抗体であり、例えば可溶性型または結合型で、標識されていることも可能である、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体とともに、限定されるわけではないが、酵素切断、ペプチド合成または組換え技術を含む既知の技術によって提供される、それらの断片、領域または誘導体である。本発明の抗ＩＦＮγ選択的結合剤は、ＩＦＮγの部分に結合することが可能であり、ＩＦＮγのＩＦＮγ−Ｒ受容体への結合を阻害する。 The term “selective binding agent” refers to a molecule that preferentially binds to IFNγ. Selective binding agents can include proteins, peptides, nucleic acids, carbohydrates, lipids, or small molecular weight compounds. In a preferred embodiment, the selective binding agent is an antibody, eg, a soluble or conjugated, labeled antibody, polyclonal antibody, monoclonal antibody (mAb), chimeric antibody, CDR-grafted antibody, anti-antibody to antibody. Along with idiotype (anti-Id) antibodies, fragments, regions or derivatives thereof provided by known techniques including, but not limited to, enzymatic cleavage, peptide synthesis or recombinant techniques. The anti-IFNγ selective binding agent of the present invention can bind to a portion of IFNγ and inhibits binding of IFNγ to the IFNγ-R receptor.

本発明の抗体および抗原結合ドメインは、ＩＦＮγに選択的に結合し、すなわち、これらは他の抗原より高い結合親和性で、優先的にＩＦＮγに結合する。抗体は、ヒトＩＦＮγに選択的に結合するが、ネズミＩＦＮγなどの非ヒトＩＦＮγにもまた検出可能であるように結合することも可能である。あるいは、抗体は、非ヒトＩＦＮγに選択的に結合するが、ヒトＩＦＮγにもまた検出可能であるように結合することも可能である。あるいは、抗体は、もっぱらヒトＩＦＮγに結合し、非ヒトＩＦＮγには検出可能に結合しないことも可能である。 The antibodies and antigen binding domains of the invention selectively bind to IFNγ, ie, they bind preferentially to IFNγ with a higher binding affinity than other antigens. The antibody selectively binds to human IFNγ, but can also be detected so that it can also be detected by non-human IFNγ such as murine IFNγ. Alternatively, the antibody selectively binds to non-human IFNγ, but can also bind to be detectable to human IFNγ. Alternatively, the antibody can bind exclusively to human IFNγ and not detectably bind to non-human IFNγ.

用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、ここで、各モノクローナル抗体は、典型的には、抗原上の単一のエピトープを認識するであろう。用語「モノクローナル」は、抗体を作成するいかなる特定の方法にも限定されない。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら；Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されるようなハイブリドーマ法によって作成することも可能であるし、また例えば本明細書記載の技術を用いて、ファージ・ライブラリーから単離することも可能である。 The term “monoclonal antibody” refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, wherein each monoclonal antibody will typically recognize a single epitope on the antigen. The term “monoclonal” is not limited to any particular method of making an antibody. For example, the monoclonal antibodies of the present invention can be made by hybridoma methods such as those described in Kohler et al .; Nature, 256 : 495 (1975), or using, for example, the techniques described herein. It is also possible to isolate from a phage library.

用語「抗原結合ドメイン」または「抗原結合領域」は、選択的結合剤（例えば抗体分子）の部分であって、抗原と相互作用し、そして該結合剤に、抗原に対する特異性および親和性を与えるアミノ酸残基を含有する、前記部分を指す。好ましくは、抗原結合領域は、ヒト起源のものであろう。他の態様において、抗原結合領域は、他の動物種、特にウサギ、ラットまたはハムスターなどのげっ歯類に由来することも可能である。 The term “antigen-binding domain” or “antigen-binding region” is a portion of a selective binding agent (eg, an antibody molecule) that interacts with an antigen and provides the binding agent with specificity and affinity for the antigen. Said part containing amino acid residues. Preferably, the antigen binding region will be of human origin. In other embodiments, the antigen binding region can be derived from other animal species, particularly rodents such as rabbits, rats or hamsters.

用語「エピトープ」は、１以上の結合剤の抗原結合領域で、選択的結合剤（例えば抗体）によって認識され、そして結合されることが可能な分子いずれかの部分を指す。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの、分子の化学的に活性である表面集団からなり、そして特定の三次元構造特性とともに特定の電荷特性を有する。「阻害性エピトープおよび／または中和エピトープ」は、選択的結合剤に結合された際、そのエピトープを含有する分子または生物のｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏ、またはｉｎｓｉｔｕでの、より好ましくはｉｎｖｉｖｏでの、ＩＦＮγのその受容体への結合を含めた、生物学的活性の損失を生じるエピトープを意図する。用語「軽鎖」は、抗体に関して用いた場合、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）またはラムダ（λ）と呼ばれる２つの別個の種類を指す。 The term “epitope” refers to any portion of a molecule capable of being recognized and bound by a selective binding agent (eg, an antibody) in the antigen binding region of one or more binding agents. Epitopes usually consist of chemically active surface populations of molecules, such as amino acids or sugar side chains, and have specific charge characteristics along with specific three-dimensional structural characteristics. An “inhibitory epitope and / or neutralizing epitope” is an in vivo, in vitro, or in situ, more preferably in vivo, molecule or organism containing the epitope when bound to a selective binding agent. Of epitopes that result in loss of biological activity, including binding of IFNγ to its receptor. The term “light chain” when used in reference to antibodies refers to two distinct types, called kappa (κ) or lambda (λ), based on the amino acid sequence of the constant domain.

用語「重鎖」は、抗体に関して用いた場合、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる５つの別個の種類を指す。重鎖のこれらの別個の種類は、抗体の５つのクラス、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを生じさせ、これには、ＩｇＧの４つのサブクラス、すなわちＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３およびＩｇＧ_４が含まれる。 The term “heavy chain” when used in reference to antibodies refers to five distinct types called alpha, delta, epsilon, gamma and mu, based on the amino acid sequence of the heavy chain constant domain. These distinct types of heavy chains give rise to five classes of antibodies, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, respectively, which include four subclasses of IgG: IgG ₁ , IgG ₂ , IgG ₃ and include IgG _4.

用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、典型的には、重鎖ではアミノ末端の約１２０〜１３０アミノ酸、そして軽鎖では約１００〜１１０アミノ酸であり、抗体間で配列が大規模に異なり、そして特定の抗原に対する特定の各抗体の結合および特異性において用いられる、軽鎖の部分および重鎖の部分を指す。配列の可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域に集中しており、一方、可変ドメイン中のよりよく保存される領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。軽鎖のＣＤＲおよび重鎖のＣＤＲは、抗原と抗体の相互作用に関与する。 The term “variable region” or “variable domain” is typically about 120-130 amino acids at the amino terminus in the heavy chain and about 100-110 amino acids in the light chain, and the sequences vary widely between antibodies. And the light and heavy chain portions used in the binding and specificity of each particular antibody to a particular antigen. Sequence variability is concentrated in a region called the complementarity determining region (CDR), while the better conserved regions in the variable domain are called framework regions (FR). The light chain and heavy chain CDRs are involved in antigen-antibody interactions.

用語「定常領域」または「定常ドメイン」は、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、Ｆｃ受容体との相互作用など、多様なエフェクター機能を示す、軽鎖のカルボキシ末端部分および重鎖のカルボキシ末端部分を指す。 The term “constant region” or “constant domain” refers to the carboxy-terminal portion and heavy chain of a light chain that are not directly involved in binding of an antibody to an antigen, but exhibit a variety of effector functions, such as interaction with an Fc receptor. Refers to the carboxy terminal portion of the chain.

用語「ヒト・インターフェロン−ガンマ」または「ヒト・インターフェロン−ガンマ・ポリペプチド」は、その開示が本明細書に援用されるＰＣＴ公報ＷＯ８３／０４０５３に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および関連ポリペプチドを指す。関連ポリペプチドには、対立遺伝子変異体；スプライス変異体；断片；誘導体；置換変異体、欠失変異体、および挿入変異体；融合ポリペプチド；並びに種間相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）が含まれる。免疫反応を生じるのに十分なＩＦＮγの可溶性型もまた含まれる。ＩＦＮγは、本明細書に定義するような成熟ポリペプチドであることも可能であり、そして調製した方法に応じて、アミノ末端メチオニン残基を有することもまた持たないことも可能である。 The term “human interferon-gamma” or “human interferon-gamma polypeptide” refers to a polypeptide comprising the amino acid sequence described in PCT Publication WO 83/04053, the disclosure of which is incorporated herein, and related Refers to a polypeptide. Related polypeptides include allelic variants; splice variants; fragments; derivatives; substitution variants, deletion variants, and insertion variants; fusion polypeptides; and interspecies homologs. Also included are soluble forms of IFNγ sufficient to generate an immune response. The IFNγ can be a mature polypeptide as defined herein, and may or may not have an amino terminal methionine residue, depending on the method prepared.

用語「断片」は、ＩＦＮγに関連して、またはＩＦＮγのタンパク質性選択的結合剤に関連して用いた場合、全長アミノ酸配列に満たない配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。こうした断片は、例えばアミノ末端の一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、カルボキシ末端の一部切除、および／またはアミノ酸配列からの残基（単数または複数）の内部欠失から生じることも可能である。断片は、選択的ＲＮＡスプライシング、またはｉｎｖｉｖｏプロテアーゼ活性から生じることも可能である。 The term “fragment” refers to a peptide or polypeptide comprising a sequence that is less than the full-length amino acid sequence when used in connection with IFNγ or in connection with a proteinaceous selective binding agent of IFNγ. Such fragments can result, for example, from truncation at the amino terminus, partial truncation at the carboxy terminus, and / or internal deletion of residue (s) from the amino acid sequence. Fragments can also arise from alternative RNA splicing or in vivo protease activity.

用語「変異体」は、ＩＦＮγに関連して、またはＩＦＮγのタンパク質性選択的結合剤に関連して用いた場合、天然配列または非修飾配列に比較した際に、１以上のアミノ酸配列置換、欠失、および／または付加を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。例えば、ＩＦＮγ変異体は、天然ＩＦＮγのアミノ酸配列に対する１以上の変化から生じることも可能である。やはり例として、ＩＦＮγの選択的結合剤の変異体は、天然のまたはあらかじめ修飾されていない選択的結合剤のアミノ酸配列に対する１以上の変化から生じることも可能である。変異体は、対立遺伝子変異体またはスプライス変異体などの天然存在変異体であることも可能であるし、あるいは人工的に構築することも可能である。ポリペプチド変異体は、前記変異体をコードする、対応する核酸分子から調製することも可能である。 The term “variant” when used in connection with IFNγ or in connection with a proteinaceous selective binding agent of IFNγ, includes one or more amino acid sequence substitutions, deletions when compared to the native or unmodified sequence. Refers to a peptide or polypeptide comprising a loss and / or addition. For example, an IFNγ variant can result from one or more changes to the amino acid sequence of native IFNγ. Also by way of example, a selective binding agent variant of IFNγ can result from one or more changes to the amino acid sequence of a natural or unmodified selective binding agent. Variants can be naturally occurring variants such as allelic variants or splice variants, or can be artificially constructed. Polypeptide variants can also be prepared from the corresponding nucleic acid molecules that encode the variants.

用語「誘導体」は、ＩＦＮγに関連して、またはＩＦＮγのタンパク質性選択的結合剤に関連して用いた場合、化学的に修飾されているポリペプチドまたはペプチド、あるいはその変異体、断片または誘導体を指す。例には、１以上のポリマー、例えば水溶性ポリマー、Ｎ連結、またはＯ連結炭水化物、糖、リン酸、および／または他のこうした分子の共有結合が含まれる。誘導体は、付着する分子の種類または位置いずれかが、天然存在または出発ペプチドまたはポリペプチドと異なる方式で修飾されている。誘導体には、ペプチドまたはポリペプチド上に天然に存在する１以上の化学基の欠失がさらに含まれる。 The term “derivative” refers to a chemically modified polypeptide or peptide, or a variant, fragment or derivative thereof, when used in connection with IFNγ or in connection with a proteinaceous selective binding agent of IFNγ. Point to. Examples include covalent bonding of one or more polymers, such as water soluble polymers, N-linked or O-linked carbohydrates, sugars, phosphates, and / or other such molecules. Derivatives are modified in a manner different from either naturally occurring or starting peptides or polypeptides, either in the type or position of the molecule to which they are attached. Derivatives further include deletion of one or more chemical groups that are naturally present on the peptide or polypeptide.

用語「融合」は、ＩＦＮγに関連して、またはＩＦＮγのタンパク質性選択的結合剤に関連して用いた場合、ペプチドまたはポリペプチド、あるいはその断片、変異体および／または誘導体と、異種ペプチドまたはポリペプチドとの連結を指す。 The term “fusion” when used in connection with IFNγ or in connection with a proteinaceous selective binding agent of IFNγ and a fragment, variant and / or derivative thereof, and a heterologous peptide or poly Refers to linkage with a peptide.

用語「生物学的に活性」は、ＩＦＮγに関連して、またはタンパク質性選択的結合剤に関連して用いた場合、ＩＦＮγまたは選択的結合剤の少なくとも１つの活性特性を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。ＩＦＮγの選択的結合剤は、ＩＦＮγの少なくとも１つの生物学的活性に関して、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、あるいは中和活性または遮断活性を有することも可能である。 The term “biologically active” when used in connection with IFNγ or in connection with a proteinaceous selective binding agent refers to a peptide or polypeptide having at least one active property of IFNγ or a selective binding agent. Point to. A selective binding agent of IFNγ can have agonist activity, antagonist activity, or neutralizing or blocking activity with respect to at least one biological activity of IFNγ.

用語「天然存在」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞等の生物学的材料に関連して用いた場合、天然に見出され、そして人間によって操作されていないものを指す。
用語「単離」は、ＩＦＮγに関連して、またはＩＦＮγのタンパク質性選択的結合剤に関連して用いた場合、天然環境で見出される混入ポリペプチドを少なくとも１つ含まないペプチドまたはポリペプチドを指し、そして好ましくは、療法使用および診断使用に干渉するであろう、いかなる他の混入哺乳動物ポリペプチドも実質的に含まないペプチドまたはポリペプチドを指す。 The term “naturally occurring” when used in connection with biological materials such as nucleic acid molecules, polypeptides, host cells, etc. refers to those found in nature and not manipulated by humans.
The term “isolated” refers to a peptide or polypeptide that, when used in connection with IFNγ or in connection with a proteinaceous selective binding agent of IFNγ, does not contain at least one contaminating polypeptide found in the natural environment. And preferably refers to peptides or polypeptides that are substantially free of any other contaminating mammalian polypeptide that would interfere with therapeutic and diagnostic uses.

用語「成熟」は、ＩＦＮγに関連して、またはＩＦＮγのタンパク質性選択的結合剤に関連して用いた場合、リーダー配列を欠くペプチドまたはポリペプチドを指す。該用語はまた、アミノ末端（リーダー配列を含むまたは含まない）および／またはカルボキシ末端のタンパク質分解的プロセシング、より大きい前駆体からのより小さいポリペプチドの切断、Ｎ連結および／またはＯ連結グリコシル化等のペプチドまたはポリペプチドの他の修飾も含むことも可能である。 The term “mature” refers to a peptide or polypeptide that lacks a leader sequence when used in connection with IFNγ or with a proteinaceous selective binding agent of IFNγ. The term also includes amino-terminal (with or without leader sequence) and / or carboxy-terminal proteolytic processing, cleavage of smaller polypeptides from larger precursors, N-linked and / or O-linked glycosylation, etc. Other modifications of the peptide or polypeptide may also be included.

用語「有効量」および「療法的有効量」は、ＩＦＮγの選択的結合剤に関連して用いた場合、ＩＦＮγの１以上の生物学的活性レベルの観察可能な変化を支持するのに有用であるかまたは必要である、選択的結合剤の量を指す。前記変化は、ＩＦＮγ活性レベルの増加または減少いずれであることも可能である。 The terms “effective amount” and “therapeutically effective amount” when used in connection with a selective binding agent of IFNγ are useful to support observable changes in one or more biological activity levels of IFNγ. Refers to the amount of selective binder that is or is necessary. The change can be either an increase or decrease in the level of IFNγ activity.

用語「保存的アミノ酸置換」は、その位でのアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたはまったく影響しないような、天然アミノ酸残基の非天然残基での置換を指す。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の非極性残基を他の非極性残基いずれかで置換することから生じる。さらに、アラニン・スキャニング突然変異誘発に関して、先に記載されているように、ポリペプチド中の天然残基いずれかをアラニンで置換することもまた可能である；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）。保存的アミノ酸置換の典型的な規則を表Ｉに示す。 The term “conservative amino acid substitution” refers to a substitution of a natural amino acid residue with a non-natural residue that has little or no effect on the polarity or charge of the amino acid residue at that position. For example, a conservative substitution results from substituting a nonpolar residue in a polypeptide with any other nonpolar residue. Furthermore, with respect to alanine scanning mutagenesis, it is also possible to substitute any natural residue in the polypeptide with alanine, as described above; Cunningham et al., Science, 244 : 1081-1108. (1989). Typical rules for conservative amino acid substitutions are shown in Table I.

表ＩTable I
保存的アミノ酸置換Conservative amino acid substitution

保存的アミノ酸置換はまた、典型的には、生物学的系における合成よりも化学的ペプチド合成によって取り込まれる、非天然存在アミノ酸残基も含む。これらには、ペプチド模倣体、およびアミノ酸部分の他の逆転型または反転型が含まれる。 Conservative amino acid substitutions also typically include non-naturally occurring amino acid residues that are incorporated by chemical peptide synthesis rather than by synthesis in biological systems. These include peptidomimetics and other inverted or inverted forms of amino acid moieties.

アミノ酸配列に対する保存的修飾（およびコードするヌクレオチドに対する対応する修飾）は、天然存在ＩＦＮγまたは選択的結合剤と類似の機能特性および化学特性を有するＩＦＮγポリペプチド（およびそのタンパク質性選択的結合剤）を産生可能である。対照的に、（ａ）置換領域における分子主鎖の構造、例えばシートまたはらせんコンホメーション、（ｂ）標的部位での、分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖バルクの維持に対する影響が有意に異なる置換を選択することによって、ＩＦＮγ（およびそのタンパク質性選択的結合剤）の機能特性および／または化学特性の実質的な修飾を達成することも可能である。天然存在残基は、共通の側鎖特性に基づいて、グループに分けることも可能である：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。 Conservative modifications to the amino acid sequence (and corresponding modifications to the encoding nucleotide) result in an IFNγ polypeptide (and its proteinaceous selective binding agent) having functional and chemical properties similar to those of naturally occurring IFNγ or selective binding agents. Can be produced. In contrast, (a) the structure of the molecular backbone in the substitution region, eg sheet or helical conformation, (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the target site, or (c) the effect on the maintenance of the side chain bulk By selecting substitutions that differ significantly, it is also possible to achieve substantial modification of the functional and / or chemical properties of IFNγ (and its proteinaceous selective binders). Naturally occurring residues can also be grouped based on common side chain properties:
1) Hydrophobicity: norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) Neutral hydrophilicity: Cys, Ser, Thr;
3) Acidity: Asp, Glu;
4) Basic: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) Residues affecting chain orientation: Gly, Pro; and 6) Aromatics: Trp, Tyr, Phe.

非保存的置換は、これらの種類の１つのメンバーと別の種類のメンバーとの交換を伴うことも可能である。
２以上の核酸分子および／またはポリペプチドの「同一性または類似性」は、２以上の別個の配列の関連性の測定値を提供する。用語「同一性」は、２つの別個のアミノ酸配列の対応する位で同一であるアミノ酸を指す。用語「類似性」は、２つの別個のアミノ酸配列の対応する位で、同一であるか、または上に定義するような保存的置換であるアミノ酸を指す。 Non-conservative substitutions can also involve the exchange of one member of these types for another type of member.
“Identity or similarity” of two or more nucleic acid molecules and / or polypeptides provides a measure of the relatedness of two or more distinct sequences. The term “identity” refers to amino acids that are identical at corresponding positions in two distinct amino acid sequences. The term “similarity” refers to amino acids that are identical or are conservative substitutions as defined above at corresponding positions in two distinct amino acid sequences.

同一性または類似性の度合いは、限定されるわけではないが、ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．監修，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：ＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．監修，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９９３；ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ，Ｐａｒｔ１，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．監修，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ニュージャージー，１９９４；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９８７；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．監修，Ｍ．ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏら，ＳＩＡＭＪ．ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されるものを含む、既知の方法によって、容易に計算可能である。 The degree of identity or similarity is not limited, but includes Computational Molecular Biology, Lesk, A. et al. M.M. Supervision, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. Supervised, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M.M. And Griffin, H .; G. Supervised, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M .; And Devereux, J. et al. Supervised by M.M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. et al. Applied Math. 48 : 1073 (1988) and can be readily calculated by known methods.

同一性および／または類似性を決定する好ましい方法を設計して、試験する配列間の最大のマッチを得る。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定する典型的なコンピュータプログラム法には、限定されるわけではないが、ＧＡＰ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１２：３８７（１９８４）；遺伝学コンピュータグループ、ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）を含むＧＣＧプログラムパッケージが含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌ，ＡｌｔｓｃｈｕｌらＮＣＢＮＬＭＮＩＨメリーランド州ベセスダ）から公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、同一性を決定することもまた可能である。 A preferred method of determining identity and / or similarity is designed to obtain the greatest match between the sequences tested. The methods for determining identity and similarity are organized into publicly available computer programs. Typical computer program methods for determining identity and similarity between two sequences include, but are not limited to, GAP; Devereux et al., Nucleic Acids Research, 12 : 387 (1984); Genetic Computer Group University of Wisconsin, Madison, Wisconsin; BLASTP, BLASTN and FASTA, Altschul et al. Mol. Biol. , 215 : 403-410 (1990). The BLAST X program is publicly available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and other sources (BLAST Manual, Altschul et al. NCB NLM NIH Bethesda, MD). It is also possible to determine identity using the well-known Smith Waterman algorithm.

ＩＦＮγポリペプチド
本発明の選択的結合剤をスクリーニングし、そして同定するため、ＩＦＮγポリペプチド、並びにその断片、変異体および誘導体を標的分子として用いる。選択的結合剤として抗体を調製することが望ましい場合、ＩＦＮγポリペプチドは、好ましくは免疫原性であり、すなわち、これらは動物に投与された際に、免疫応答を誘発する。あるいは、ｉｎｖｉｔｒｏ技術によって抗体を調製する場合、標的分子として用いられるＩＦＮγポリペプチドは、抗体または抗原結合ドメインと検出可能に結合することが可能である。 IFNγ Polypeptides IFNγ polypeptides , and fragments, variants and derivatives thereof, are used as target molecules to screen and identify selective binding agents of the invention. Where it is desirable to prepare antibodies as selective binding agents, IFNγ polypeptides are preferably immunogenic, ie they elicit an immune response when administered to an animal. Alternatively, when preparing an antibody by in vitro techniques, the IFNγ polypeptide used as the target molecule can detectably bind to the antibody or antigen binding domain.

生物学的方法または化学的方法によって、ＩＦＮγポリペプチドを調製する。組換えＩＦＮγをコードするＤＮＡ配列の発現などの生物学的な方法が当該技術分野に知られる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５１３２（１９８５）、並びにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，イリノイ州ロックフォード（１９８４）に示されるような化学合成法を用いて、本発明のＩＦＮγポリペプチドを調製することもまた可能である。こうしたポリペプチドを、アミノ末端メチオニンを伴い、または伴わずに合成することも可能である。化学的に合成したＩＦＮγポリペプチド、あるいはその断片または変異体を、これらの参考文献に示される方法を用いて酸化して、ジスルフィド架橋を形成することも可能である。化学合成によって調製された本発明のＩＦＮγポリペプチドは、組換えによって産生されたか、または天然供給源から精製された、対応するＩＦＮγポリペプチドに匹敵する生物学的活性を、少なくとも１つ有するであろう。 IFNγ polypeptides are prepared by biological or chemical methods. Biological methods such as expression of DNA sequences encoding recombinant IFNγ are known in the art; see, for example, Sambrook et al., Supra. Merrifield et al., J. MoI. Am. Chem. Soc. 85 : 2149 (1963), Houghten et al., Proc Natl Acad. Sci. USA, 82 : 5132 (1985), and Stewart and Young, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chemical Co. It is also possible to prepare IFNγ polypeptides of the invention using chemical synthesis methods such as those shown in Rockford, Ill. (1984). Such polypeptides can also be synthesized with or without an amino terminal methionine. Chemically synthesized IFNγ polypeptides, or fragments or variants thereof, can be oxidized to form disulfide bridges using the methods shown in these references. An IFNγ polypeptide of the invention prepared by chemical synthesis has at least one biological activity comparable to the corresponding IFNγ polypeptide, produced recombinantly or purified from a natural source. Let ’s go.

ＩＦＮγポリペプチドを、ＩＦＮγポリペプチドが天然に見出される供給源組織および／または体液などの生物学的試料から単離することによって、得ることも可能である。ＩＦＮγポリペプチドの供給源は、起源が、ヒトまたは非ヒトであることも可能である。電気泳動による分離、その後の電気的溶出、多様な種類のクロマトグラフィー（アフィニティー、免疫親和性、分子ふるい、および／またはイオン交換）、および／または高圧液体クロマトグラフィーなどの、当該技術分野に知られる方法を用いて、天然存在ＩＦＮγポリペプチドの単離を達成することも可能である。例えば、組換えで産生したＩＦＮγポリペプチドまたはそのペプチド断片に対して調製した抗体を用いて、精製中のＩＦＮγポリペプチドの存在を監視することも可能である。 An IFNγ polypeptide can also be obtained by isolating it from a biological sample such as a source tissue and / or body fluid in which the IFNγ polypeptide is naturally found. The source of the IFNγ polypeptide can be of human or non-human origin. Known in the art, such as electrophoretic separation, subsequent electroelution, various types of chromatography (affinity, immunoaffinity, molecular sieving, and / or ion exchange), and / or high pressure liquid chromatography The method can also be used to achieve isolation of naturally occurring IFNγ polypeptides. For example, antibodies prepared against recombinantly produced IFNγ polypeptides or peptide fragments thereof can be used to monitor the presence of IFNγ polypeptides during purification.

本発明のポリペプチドには、単離ＩＦＮγポリペプチド、並びに上に定義するような、断片、変異体、融合ポリペプチド、および誘導体を含む、ＩＦＮγポリペプチドに関連するポリペプチドが含まれる。本発明のＩＦＮγ断片は、アミノ末端（リーダー配列を含むまたは含まない）の一部切除、カルボキシ末端の一部切除、および／またはポリペプチド内部の欠失から生じることも可能である。こうしたＩＦＮγポリペプチド断片は、所望によって、アミノ末端メチオニン残基を含むことも可能である。本発明のポリペプチドは、抗体応答を誘発可能である点で、免疫原性であろう。 The polypeptides of the present invention include isolated IFNγ polypeptides, as well as polypeptides related to IFNγ polypeptides, including fragments, variants, fusion polypeptides, and derivatives as defined above. The IFNγ fragments of the present invention can also result from partial excision at the amino terminus (with or without the leader sequence), partial excision at the carboxy terminus, and / or a deletion within the polypeptide. Such IFNγ polypeptide fragments can optionally include an amino terminal methionine residue. The polypeptides of the invention will be immunogenic in that they can elicit an antibody response.

本発明のＩＦＮγポリペプチド変異体には、天然ＩＦＮγアミノ酸配列に比較した際、１以上のアミノ酸置換、付加および／または欠失が含まれる。アミノ酸置換は、上に定義するように保存的であることも可能であるし、または非保存的であることも、あるいはその組み合わせいずれかであることも可能である。変異体は、カルボキシ末端またはアミノ末端いずれかに、アミノ酸残基の付加を有することも可能である（この場合、アミノ末端は、リーダー配列を含んでもよいし、また含まなくてもよい）。 The IFNγ polypeptide variants of the present invention include one or more amino acid substitutions, additions and / or deletions when compared to the native IFNγ amino acid sequence. Amino acid substitutions can be conservative, as defined above, or non-conservative, or a combination thereof. Variants can also have amino acid residue additions at either the carboxy terminus or the amino terminus (in which case the amino terminus may or may not include a leader sequence).

本発明の態様には、ＩＦＮγグリコシル化変異体およびシステイン変異体が含まれる。ＩＦＮγグリコシル化変異体には、天然ＩＦＮγポリペプチドに比較して、グリコシル化部位の数および／または種類が改変されている変異体が含まれる。１つの態様において、ＩＦＮγグリコシル化変異体は、天然ＩＦＮγに比較して、より多くのまたはより少ない数のＮ連結グリコシル化部位を含む。 Aspects of the invention include IFNγ glycosylation variants and cysteine variants. IFNγ glycosylation variants include variants in which the number and / or type of glycosylation sites are altered as compared to a native IFNγ polypeptide. In one embodiment, the IFNγ glycosylation variant comprises a greater or lesser number of N-linked glycosylation sites compared to native IFNγ.

Ｎ連結炭水化物鎖の再編成を含むＩＦＮγグリコシル化変異体であって、１以上のＮ連結グリコシル化部位（典型的には天然存在であるもの）が除去され、そして１以上の新規Ｎ連結部位が生成されている、前記変異体もまた提供する。ＩＦＮγシステイン変異体は、天然ＩＦＮγに比較して、より多い数の、あるいはより少ない数のシステイン残基を含む。１つの態様において、１以上のシステイン残基が欠失されるか、または別のアミノ酸（例えばセリン）で置換される。ＩＦＮγのシステイン変異体は、変性状態から単離された後、ＩＦＮγが生物学的に活性であるコンホメーションに再フォールディングするのを補助することによって、生物学的に活性であるＩＦＮγの回収を改善することも可能である。 An IFNγ glycosylation variant comprising an N-linked carbohydrate chain rearrangement wherein one or more N-linked glycosylation sites (typically those that are naturally occurring) are removed and one or more new N-linked sites are Also provided are the variants that have been produced. IFNγ cysteine variants contain a greater or lesser number of cysteine residues compared to native IFNγ. In one embodiment, one or more cysteine residues are deleted or substituted with another amino acid (eg, serine). Cysteine variants of IFNγ, after being isolated from a denatured state, help recover IFNγ that is biologically active by helping IFNγ refold into a biologically active conformation. It is also possible to improve.

ＩＦＮγポリペプチド変異体の調製は、当該技術分野の技術レベル内である。１つのアプローチにおいて、天然ＩＦＮγに１以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加を導入することも可能であり、ここでＩＦＮγ変異体は、ＩＦＮγの天然構造および／または少なくとも１つの生物学的活性を保持する。１つのアプローチは、比較的低いそして高い同一性および／または類似性の領域を同定するため、多様な異なる種由来のＩＦＮγポリペプチドの配列を比較することである。比較的低い同一性および／または類似性を有するＩＦＮγポリペプチドの領域は、構造および活性に必須である可能性はより低く、そしてしたがって、アミノ酸改変、特に非保存性である改変に、より耐性でありうると認識される。比較的保存される領域であっても、活性を保持しつつ、保存的アミノ酸置換を導入可能であることもまた認識される。 The preparation of IFNγ polypeptide variants is within the level of skill in the art. In one approach, it is also possible to introduce one or more amino acid substitutions, deletions and / or additions into native IFNγ, wherein the IFNγ variant is a natural structure and / or at least one biological activity of IFNγ. Hold. One approach is to compare the sequences of IFNγ polypeptides from a variety of different species to identify regions of relatively low and high identity and / or similarity. Regions of IFNγ polypeptides that have relatively low identity and / or similarity are less likely to be essential for structure and activity and are therefore more resistant to amino acid modifications, particularly those that are non-conservative. It is recognized that it is possible. It is also recognized that conservative amino acid substitutions can be introduced while retaining activity even in regions that are relatively conserved.

別のアプローチにおいて、構造−機能関連性を用いて、類似のポリペプチドにおいて、活性または構造に重要な残基を同定することも可能である。例えば、ＩＦＮγ、および構造−機能解析が利用可能な腫瘍壊死因子ファミリーの他のメンバーの間で保存されるアミノ酸残基を比較し、そしてこうした比較に基づいて、ＩＦＮγ中のどのアミノ酸残基が活性または構造に重要であるかを予測することも可能である。当業者は、こうして予測されたＩＦＮγの重要なアミノ酸残基に関して、化学的に類似のアミノ酸置換を選択することも可能である。 In another approach, structure-function relationships can be used to identify residues important for activity or structure in similar polypeptides. For example, compare amino acid residues conserved between IFNγ and other members of the tumor necrosis factor family for which structure-function analysis is available, and based on such comparison, which amino acid residues in IFNγ are active It is also possible to predict what is important for the structure. One skilled in the art can also select chemically similar amino acid substitutions for the predicted important amino acid residues of IFNγ.

さらに別のアプローチにおいて、ＩＦＮγの二次構造または三次構造（ＩＦＮγ結晶のＸ線回折によって、または構造予測法によって決定されるものいずれか）の解析を行って、ＩＦＮγポリペプチド内の実際の構造または予測される構造に関して、特定のアミノ酸残基の位置を決定することも可能である。この情報を用いて、ＩＦＮγポリペプチドの二次構造および／または三次構造をできるだけ多く保持することを模索する方式で、アミノ酸変化を導入することも可能である。さらに別のアプローチにおいて、アミノ酸置換を導入し、そして本明細書に記載するアッセイを用いて、生物学的活性に関して、改変されたＩＦＮγポリペプチドを試験することによって、特定の位でアミノ酸を改変する影響を実験的に試験することも可能である。 In yet another approach, analysis of the secondary or tertiary structure of IFNγ (either determined by X-ray diffraction of IFNγ crystals or by structure prediction methods) is performed to determine the actual structure or IFNγ polypeptide It is also possible to determine the position of a particular amino acid residue with respect to the predicted structure. This information can be used to introduce amino acid changes in a manner that seeks to retain as much secondary and / or tertiary structure of the IFNγ polypeptide as possible. In yet another approach, amino acid substitutions are introduced and amino acids are modified at specific positions by testing the modified IFNγ polypeptide for biological activity using the assays described herein. It is also possible to test the effect experimentally.

アラニン・スキャニング突然変異誘発などの技術（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、上記）が、このアプローチに特によく適している。ＩＦＮγ中の多様なアミノ酸位で、多くの置換を導入し、そしてファージ・ディスプレー・ライブラリーの一部として、改変されたポリペプチド集団をスクリーニングすることによって、多くの改変された配列を好適に試験することも可能である。このアプローチを用いて、活性に必須のＩＦＮγポリペプチドの領域を容易に決定することも可能である。 Techniques such as alanine scanning mutagenesis (Cunningham et al., Supra) are particularly well suited for this approach. Many modified sequences are suitably tested by introducing many substitutions at various amino acid positions in IFNγ and screening a modified population of polypeptides as part of a phage display library It is also possible to do. Using this approach, it is also possible to easily determine the region of the IFNγ polypeptide that is essential for activity.

上記方法は、天然構造を保持するＩＦＮγ変異体を生成するのに有用である。したがって、各変異体に対して作成された抗体は、ＩＦＮγの天然構造決定基またはエピトープを認識する可能性があり、そしてまた、天然ＩＦＮγに結合する可能性もある。しかし、いくつかの場合、天然ＩＦＮγ構造を保持しないか、あるいは部分的にまたは完全に空白である（ｕｎｆｉｌｌｅｄ）ＩＦＮγ変異体を産生することが望ましい可能性もある。こうしたタンパク質に対して作成された抗体は、ＩＦＮγ上の覆い隠されたエピトープを認識するであろう。 The above method is useful for generating IFNγ variants that retain the native structure. Thus, antibodies generated against each variant may recognize the natural structural determinant or epitope of IFNγ and may also bind to native IFNγ. However, in some cases it may be desirable to produce IFNγ variants that do not retain the native IFNγ structure or that are partially or completely unfilled. Antibodies generated against such proteins will recognize the masked epitope on IFNγ.

本発明はまた、異種ペプチドまたはタンパク質に融合された、ＩＦＮγポリペプチド、並びにその断片、変異体、および誘導体を含む、ＩＦＮγ融合ポリペプチドも提供する。異種ペプチドおよびタンパク質には、限定されるわけではないが：ＩＦＮγ融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通受容体タンパク質またはその部分、例えば細胞外ドメイン、または膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン；膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンドまたはその部分；触媒として活性である酵素またはその部分；オリゴマー化を促進するタンパク質またはペプチド、例えばロイシンジッパードメイン；および安定性を増加させるタンパク質またはペプチド、例えば免疫グロブリン定常領域が含まれる。 The invention also provides IFNγ fusion polypeptides, including IFNγ polypeptides, and fragments, variants, and derivatives thereof, fused to heterologous peptides or proteins. Heterologous peptides and proteins include, but are not limited to: epitopes that allow detection and / or isolation of IFNγ fusion polypeptides; transmembrane receptor proteins or portions thereof, such as extracellular domains, or transmembrane domains And intracellular domains; ligands or portions thereof that bind to transmembrane receptor proteins; catalytically active enzymes or portions thereof; proteins or peptides that promote oligomerization, such as leucine zipper domains; and proteins that increase stability or Peptides such as immunoglobulin constant regions are included.

ＩＦＮγポリペプチドをそれ自体、あるいはその断片、変異体、または誘導体と融合させることも可能である。融合は、ＩＦＮγポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端いずれで行うことも可能であるし、そしてリンカー分子またはアダプター分子を伴わずに直接であることも、あるいはリンカー分子またはアダプター分子を介したものであることも可能である。また、リンカー分子またはアダプター分子を、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼの切断部位を含んで設計して、融合部分の分離を可能にすることも可能である。本発明のさらなる態様において、ＩＦＮγポリペプチド、断片、変異体および／または誘導体をヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合させる。１つの例において、当業者に知られる方法を用いて、ＩＦＮγポリペプチドのＮ末端またはＣ末端いずれかに、ヒトＩｇＧヒンジ、ｃｈ２およびｃｈ３領域を融合させることも可能である。別の例において、ヒンジ領域、並びにｃｈ２およびｃｈ３領域の部分を融合させることも可能である。タンパク質アフィニティーカラムを使用することによって、こうして産生したＩＦＮγ・Ｆｃ融合ポリペプチドを精製することも可能である。さらに、Ｆｃ領域に融合させたペプチドおよびタンパク質は、融合させていない対応物よりも、実質的により長いｉｎｖｉｖｏ半減期を示すことも見出されてきている。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化も可能にする。Ｆｃ領域は、天然存在Ｆｃ領域であることも可能であるし、また療法特質や循環時間などの特定の特質を改善し、凝集を減少させるように改変することなども可能である。 It is also possible to fuse the IFNγ polypeptide itself, or a fragment, variant, or derivative thereof. The fusion can be at either the amino terminus or the carboxy terminus of the IFNγ polypeptide and can be direct without a linker molecule or adapter molecule, or via a linker molecule or adapter molecule. It is also possible. Linker molecules or adapter molecules can also be designed to include DNA restriction endonuclease or protease cleavage sites to allow separation of the fusion moiety. In a further aspect of the invention, the IFNγ polypeptide, fragment, variant and / or derivative is fused to the Fc region of human IgG. In one example, the human IgG hinge, ch2 and ch3 regions can be fused to either the N-terminus or C-terminus of the IFNγ polypeptide using methods known to those skilled in the art. In another example, the hinge region and portions of the ch2 and ch3 regions can be fused. It is also possible to purify the IFNγ · Fc fusion polypeptide thus produced by using a protein affinity column. Furthermore, peptides and proteins fused to the Fc region have also been found to exhibit substantially longer in vivo half-life than their unfused counterparts. Fusion to the Fc region also allows for dimerization / multimerization of the fusion polypeptide. The Fc region can be a naturally occurring Fc region, or it can be modified to improve certain properties such as therapeutic properties and circulation time and reduce aggregation.

ＩＦＮγポリペプチド誘導体は、本発明の範囲内に含まれる。こうした誘導体は、ＩＦＮγポリペプチドがポリマーに連結された、化学的に修飾されたＩＦＮγポリペプチド組成物である。選択されるポリマーは、付着するタンパク質が、生理学的環境などの水性環境において沈殿しないように、典型的には、水溶性である。ポリマーは、いかなる分子量のものであることも可能であるし、そして分枝していてもまたは分枝していなくてもよい。ＩＦＮγポリペプチドポリマーの範囲内に含まれるのは、ポリマー混合物である。好ましくは、最終産物調製物を療法的に使用するため、ポリマーは薬学的に許容しうるものであろう。 IFNγ polypeptide derivatives are included within the scope of the present invention. Such a derivative is a chemically modified IFNγ polypeptide composition in which the IFNγ polypeptide is linked to a polymer. The polymer selected is typically water soluble so that the attached protein does not precipitate in an aqueous environment, such as a physiological environment. The polymer can be of any molecular weight and may be branched or unbranched. Included within the scope of IFNγ polypeptide polymers are polymer blends. Preferably, the polymer will be pharmaceutically acceptable for therapeutic use of the final product preparation.

水溶性ポリマーまたはその混合物は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば約６ｋＤの低分子量デキストランなど）、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール・ホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド・コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えばグリセロール）およびポリビニルアルコールであることも可能である。 The water-soluble polymer or mixture thereof can be, for example, polyethylene glycol (PEG), monomethoxy-polyethylene glycol, dextran (such as low molecular weight dextran of about 6 kD), cellulose, or other carbohydrate-based polymers, poly- (N-vinyl) Pyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymer, polypropylene oxide / ethylene oxide copolymer, polyoxyethylated polyols (eg glycerol) and polyvinyl alcohol can also be used.

好ましい水溶性ポリマーはポリエチレングリコールである。本明細書において、ポリエチレングリコールは、他のタンパク質を誘導体化するのに用いられてきたＰＥＧのいかなる型も、例えばモノ−（Ｃ_１−Ｃ_１０）アルコキシ−、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールも含むよう意図される。本発明にやはり含まれるのは、共有結合ＩＦＮγ多量体を調製するのに使用可能な二官能性ＰＥＧ架橋分子である。 A preferred water soluble polymer is polyethylene glycol. As used herein, polyethylene glycol includes any type of PEG that has been used to derivatize other proteins, such as mono- (C ₁ -C ₁₀ ) alkoxy-, or aryloxy-polyethylene glycol. Intended. Also included in the present invention are bifunctional PEG cross-linking molecules that can be used to prepare covalent IFNγ multimers.

化学的に誘導体化されたＩＦＮγポリペプチドを調製する方法が当該技術分野に知られる。例えば、Ｆｒａｎｃｉｓら，ＦｏｃｕｓｏｎＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ，３：４−１０（１９９２）；ＥＰ０１５４３１６；およびＥＰ０４０１３８４に記載される方法を用いて、ＰＥＧでのＩＦＮγポリペプチドの誘導体化を行うことも可能である。好ましい態様において、ＩＦＮγポリペプチド誘導体は、アミノ末端に単一のＰＥＧ部分を有するであろう；本明細書に援用される米国特許第５，９８５，２６５号を参照されたい。 Methods for preparing chemically derivatized IFNγ polypeptides are known in the art. For example, derivatization of IFNγ polypeptides with PEG using the methods described in Francis et al., Focus on Growth Factors, 3 : 4-10 (1992); EP 0 154 316; and EP 0 401 384 Is also possible. In a preferred embodiment, the IFNγ polypeptide derivative will have a single PEG moiety at the amino terminus; see US Pat. No. 5,985,265, incorporated herein.

本明細書に開示するＩＦＮγポリペプチド誘導体は、非修飾ポリペプチドに比較して、ＩＦＮγの少なくとも１つの生物学的活性の増進または減少を示すことも可能であるし、あるいは増加したまたは減少した半減期または安定性を示すことも可能である。 The IFNγ polypeptide derivatives disclosed herein can exhibit an increase or decrease in at least one biological activity of IFNγ, as well as an increased or decreased half as compared to an unmodified polypeptide. It is also possible to show phase or stability.

ＩＦＮγ選択的結合剤
ＩＦＮγポリペプチド、およびその断片、変異体および誘導体を用いて、ＩＦＮγの選択的結合剤を同定することも可能である。上に定義するように、ＩＦＮγの選択的結合剤は、タンパク質性結合剤および非タンパク質性結合剤を両方含み、そして本発明の１つの好ましい態様において、選択的結合剤はタンパク質性である。さらに別の好ましい態様において、選択的結合剤は、ＩＦＮγ、好ましくはヒトＩＦＮγに結合する抗体またはその断片である。本発明の抗体は、ＩＦＮγの少なくとも１つの生物学的活性のレベルを増進するアゴニスト抗体；またはＩＦＮγの少なくとも１つの生物学的活性のレベルを減少させるアンタゴニスト抗体であることも可能である。ＩＦＮγのアンタゴニスト抗体を、ＩＦＮγの阻害性抗体または中和抗体と呼ぶこともまた可能である。こうした抗体は本発明の好ましい態様であるが、ＩＦＮγ活性のアゴニストまたはアンタゴニストである他のタンパク質性選択的結合剤もまた、本発明に含まれることが理解される。 IFNγ selective binding agents IFNγ polypeptides, and fragments, variants and derivatives thereof can also be used to identify selective binding agents for IFNγ. As defined above, selective binding agents for IFNγ include both proteinaceous and non-proteinaceous binding agents, and in one preferred embodiment of the invention, the selective binding agent is proteinaceous. In yet another preferred embodiment, the selective binding agent is an antibody or fragment thereof that binds to IFNγ, preferably human IFNγ. The antibodies of the invention can also be agonistic antibodies that increase the level of at least one biological activity of IFNγ; or antagonist antibodies that decrease the level of at least one biological activity of IFNγ. It is also possible to refer to an antagonist antibody of IFNγ as an inhibitory antibody or neutralizing antibody of IFNγ. While such antibodies are a preferred embodiment of the present invention, it is understood that other proteinaceous selective binding agents that are agonists or antagonists of IFNγ activity are also included in the present invention.

以下の実施例に記載するように、ＩＦＮγの少なくとも１つの活性を阻害する抗ＩＦＮγ抗体および抗原結合ドメインが同定されてきている。本発明の態様には、図３〜１３のいずれかに示すような重鎖Ｆａｂ配列を含み、そしてカッパ軽鎖配列またはラムダ軽鎖配列をさらに含む抗体が含まれる。軽鎖Ｆａｂ配列は、図１４〜２４に示すとおりであってもよい。例えば、「ＢＳ−Ａ」抗体は、それぞれ、図１４および図３の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「ＢＳ−Ｂ」抗体は、それぞれ、図１５および図４の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「ＲＤ−Ｂ１」抗体は、それぞれ、図１６および図５の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「ＲＤ−Ａ２」抗体は、それぞれ、図１７および図６の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「５８Ｃ」抗体は、それぞれ、図１８および図７の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「ＧＰ−Ａ」抗体は、それぞれ、図１９および図８の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「５７Ｄ」抗体は、それぞれ、図２０および図９の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「５７Ｅ」抗体は、それぞれ、図２１および図１０の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「ＩＦＮ−Ａ」抗体は、それぞれ、図２２および図１１の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「６７Ｃ」抗体は、それぞれ、図２３および図１２の軽鎖配列および重鎖配列を有し；そして「５９−Ａ２」抗体は、それぞれ、図２４および図１３の軽鎖配列および重鎖配列を有する。本発明の抗体は、アイソタイプ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＤいずれか由来のヒトＦｃ領域をさらに含む。好ましくは、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来である。 As described in the Examples below, anti-IFNγ antibodies and antigen binding domains that inhibit at least one activity of IFNγ have been identified. Embodiments of the invention include antibodies comprising a heavy chain Fab sequence as shown in any of FIGS. 3-13 and further comprising a kappa light chain sequence or a lambda light chain sequence. The light chain Fab sequence may be as shown in FIGS. For example, the “BS-A” antibody has the light and heavy chain sequences of FIGS. 14 and 3, respectively; the “BS-B” antibody has the light and heavy chain sequences of FIGS. 15 and 4, respectively. The “RD-B1” antibody has the light and heavy chain sequences of FIGS. 16 and 5, respectively; the “RD-A2” antibody has the light chain sequence of FIGS. 17 and 6, respectively. The “58C” antibody has the light and heavy chain sequences of FIGS. 18 and 7, respectively; the “GP-A” antibody has FIGS. 19 and 8, respectively. The “57D” antibody has the light chain and heavy chain sequences of FIGS. 20 and 9, respectively; the “57E” antibody has FIGS. 21 and 10, respectively. The “IFN-A” antibodies have the following light chain and heavy chain sequences: The “67C” antibody has the light and heavy chain sequences of FIGS. 23 and 12, respectively; and the “59-A2” antibody has the light and heavy chain sequences of 2 and 11; Each has the light and heavy chain sequences of FIGS. 24 and 13, respectively. The antibodies of the present invention further comprise a human Fc region derived from any of the isotypes, IgG, IgM, IgA, IgE, or IgD. Preferably, the Fc region is derived from human IgG, such as IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4.

本発明はまた、本明細書に開示するＦａｂ配列の断片、変異体、または誘導体を含む抗体または抗原結合ドメインも提供する。断片には、軽鎖または重鎖のＦａｂ配列いずれかの可変ドメインが含まれ、これらは、典型的には軽鎖または重鎖の定常ドメインに連結されている。変異体には、図１４〜２４のいずれか１つのＦａｂ配列に、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一または類似である軽鎖Ｆａｂ配列、または対応する可変ドメインを含む抗体、あるいは図３〜１３のいずれか１つのＦａｂ配列に、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一または類似である重鎖Ｆａｂ配列、または対応する可変ドメインを含む抗体が含まれる。抗体は、典型的には、重鎖および軽鎖の定常領域と会合して、全長抗体を形成することも可能である。 The invention also provides antibodies or antigen binding domains comprising fragments, variants, or derivatives of the Fab sequences disclosed herein. Fragments include variable domains of either light or heavy chain Fab sequences, which are typically linked to the light or heavy chain constant domain. A variant includes a light chain Fab sequence that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% identical or similar to a Fab sequence of any one of FIGS. A heavy chain Fab sequence that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% identical or similar to an antibody comprising a variable domain, or any one of the Fab sequences of FIGS. Antibodies containing the corresponding variable domain are included. Antibodies can typically associate with the heavy and light chain constant regions to form full-length antibodies.

本発明の抗体および抗原結合ドメイン、並びにその断片、変異体および誘導体は、ＩＦＮγポリペプチド、好ましくはヒトＩＦＮγポリペプチドに選択的に結合する能力を保持するであろう。１つの態様において、抗体は、約１ｎＭ以下、あるいは０．１ｎＭ以下、あるいは１０ｐＭ以下、あるいは１０ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）でＩＦＮγポリペプチドに結合するであろう。 The antibodies and antigen binding domains of the invention, and fragments, variants and derivatives thereof, will retain the ability to selectively bind to an IFNγ polypeptide, preferably a human IFNγ polypeptide. In one embodiment, the antibody will bind to the IFNγ polypeptide with a dissociation constant (KD) of about 1 nM or less, alternatively 0.1 nM or less, alternatively 10 pM or less, alternatively less than 10 pM.

本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、単一特異性ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、一本鎖抗体および／または二重特異性抗体が含まれる。抗体断片には、ＩＦＮγポリペプチド上のエピトープに結合する抗ＩＦＮγ抗体の部分が含まれる。こうした断片の例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、およびｓＦｖ断片が含まれる。抗体は、全長抗体の酵素切断によって、または組換えＤＮＡ技術によって、例えば抗体可変領域をコードする核酸配列を含有する組換えプラスミドの発現などによって、生成可能である。 Antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monospecific polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, fully human antibodies, single chain antibodies and / or bispecific antibodies. . Antibody fragments include those portions of the anti-IFNγ antibody that bind to an epitope on the IFNγ polypeptide. Examples of such fragments include Fab, F (ab '), F (ab)', Fv, and sFv fragments. Antibodies can be generated by enzymatic cleavage of full length antibodies or by recombinant DNA techniques, such as by expression of recombinant plasmids containing nucleic acid sequences encoding antibody variable regions.

ポリクローナル抗体は、抗原で免疫した動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。抗原は、抗体に結合されることが可能であり、さらに、動物が、その抗原のエピトープに結合可能な抗体を産生するよう誘導可能である、分子または分子の部分である。抗原は、１以上のエピトープを有することも可能である。上述の特異的反応は、抗原が、非常に選択的な方式で、対応する抗体と反応し、そして他の抗原に誘発されうる多数の他の抗体とは反応しないであろうことを示すよう意味する。 Polyclonal antibodies are a heterogeneous population of antibody molecules derived from the sera of animals immunized with an antigen. An antigen is a molecule or a portion of a molecule that can be conjugated to an antibody and that is further inducible to produce an antibody in which an animal can bind to an epitope of that antigen. An antigen can also have one or more epitopes. The specific reaction described above is meant to indicate that the antigen will react in a very selective manner with the corresponding antibody and not with many other antibodies that can be elicited by other antigens. To do.

ＩＦＮγポリペプチドに対して向けられるポリクローナル抗体は、一般的に、ＩＦＮγおよびアジュバントの多数回の皮下注射または腹腔内注射によって、動物（例えばウサギまたはマウス）において作成される。本発明にしたがって、ＩＦＮγポリペプチド、あるいはその変異体、断片、または誘導体を、免疫しようとする種において免疫原性であるキャリアータンパク質、例えばキーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ）・ヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシ・チログロブリン、またはダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）・トリプシン阻害剤にコンジュゲート化することが有用である可能性もある。また、ミョウバンなどの凝集剤を用いて、免疫応答を増進する。免疫後、動物から出血させ、そして抗ＩＦＮγ抗体力価に関して、血清をアッセイする。 Polyclonal antibodies directed against IFNγ polypeptides are generally made in animals (eg, rabbits or mice) by multiple subcutaneous or intraperitoneal injections of IFNγ and an adjuvant. In accordance with the present invention, an IFNγ polypeptide, or a variant, fragment, or derivative thereof, is a carrier protein that is immunogenic in the species to be immunized, such as keyhole limpet hemocyanin, serum, albumin, It may be useful to conjugate to bovine thyroglobulin or soybean trypsin inhibitor. In addition, an agglutinating agent such as alum is used to enhance the immune response. Following immunization, the animals are bled and the serum is assayed for anti-IFNγ antibody titers.

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、抗原に特異的な抗体の実質的に均質な集団を含有し、この集団は、実質的に類似のエピトープ結合部位を含有する。こうした抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのサブクラスいずれかを含む、免疫グロブリンクラスいずれのものであることも可能である。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｓｉｔｕまたはｉｎｖｉｖｏで培養することも可能である。ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｓｉｔｕでの高力価の産生が好ましい産生法である。ＩＦＮγに対して向けられるモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する方法いずれかを用いて産生される。モノクローナル抗体を調製するのに適した方法の例には、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）のハイブリドーマ法、並びにヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク，１９８７）；並びにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）が含まれ；これら参考文献の内容は、本明細書に完全に援用される。 Monoclonal antibodies (mAbs) contain a substantially homogeneous population of antibodies specific for the antigen, which population contains substantially similar epitope binding sites. Such antibodies can be of any immunoglobulin class, including IgG, IgM, IgE, IgA, IgD and any subclass thereof. The hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention can be cultured in vitro, in situ, or in vivo. High titer production in vivo or in situ is the preferred production method. Monoclonal antibodies directed against IFNγ are produced using any method that provides for the production of antibody molecules by continuous cell lines in culture. Examples of suitable methods for preparing monoclonal antibodies include the hybridoma method of Kohler et al., Nature, 256 : 495-497 (1975), and the human B cell hybridoma method, Kozbor, J. et al. Immunol,. 133 : 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); the contents of these references are fully incorporated herein by reference. Incorporated.

好ましい抗ＩＦＮγ選択的結合剤には、ヒトＩＦＮγのその同族受容体、ｈＩＦＮγ−Ｒへの結合を、部分的にまたは完全に阻害するであろうモノクローナル抗体、あるいは実質的に同一の特異的結合特性を有する抗体とともに、その断片および領域が含まれる。競合的阻害によって、モノクローナル抗体特異性および親和性を決定するのに好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８８）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら監修，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃ．ａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク，（１９９２，１９９３）；およびＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：５８９−６０１（１９８３）に見出されることも可能である。これらの参考文献は、本明細書に援用される。本発明にやはり提供するのは、ＩＦＮγポリペプチドと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。 Preferred anti-IFNγ selective binding agents include monoclonal antibodies that will partially or completely inhibit the binding of human IFNγ to its cognate receptor, hIFNγ-R, or substantially the same specific binding properties. As well as fragments and regions thereof. A preferred method for determining monoclonal antibody specificity and affinity by competitive inhibition is the method described by Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988); Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, New York, (1992, 1993); and Muller, Meth. Enzymol. , 92 : 589-601 (1983). These references are hereby incorporated by reference. Also provided by the present invention is a hybridoma cell line that produces a monoclonal antibody that reacts with an IFNγ polypeptide.

キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えばネズミ・モノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものがある。キメラ抗体は、主に、適用中の免疫原性を減少させ、そして産生中の収率を増加させるように用いられ、例えば、ネズミ・モノクローナル抗体が、ハイブリドーマからはより高い収率で得られるが、ヒトにおいてより免疫原性である場合、ヒト／ネズミ・キメラモノクローナル抗体を用いる。 A chimeric antibody is a molecule in which different portions are derived from different animal species, such as those having a variable region derived from a murine monoclonal antibody and a human immunoglobulin constant region. Chimeric antibodies are mainly used to reduce the immunogenicity during application and increase the yield during production, for example, although murine monoclonal antibodies are obtained in higher yields from hybridomas. If more immunogenic in humans, human / murine chimeric monoclonal antibodies are used.

キメラ抗体およびその産生法が当該技術分野に知られる。Ｃａｂｉｌｌｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３２７３−３２７７（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６４３−６４６（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：２６８−２７０（１９８５）；Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：３４３９−３４４３（１９８７）；並びにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）。これらの参考文献は、本明細書に援用される。 Chimeric antibodies and methods for their production are known in the art. Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature, 312 : 643-646 (1984); Neuberger et al., Nature, 314 : 268-270 (1985); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 : 3439-3443 (1987); and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). These references are hereby incorporated by reference.

例えば、本発明のキメラモノクローナル抗体を療法剤として用いることも可能である。こうしたキメラ抗体では、望ましい生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種に由来するか、または１つの特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同であり、一方、鎖（単数または複数）の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体とともにこうした抗体の断片の対応する配列と同一であるかまたは相同である；例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５（１９８５）を参照されたい。 For example, the chimeric monoclonal antibody of the present invention can be used as a therapeutic agent. In such chimeric antibodies, as long as the desired biological activity is exhibited, the heavy and / or light chain portion is derived from a particular species or with the corresponding sequence of an antibody belonging to one particular antibody class or subclass. Identical or homologous, while the remainder of the chain (s) is identical to the corresponding sequence of a fragment of such an antibody together with an antibody from another species or belonging to another antibody class or subclass Or homologous; see, eg, US Pat. No. 4,816,567 and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81 : 6851-6855 (1985).

本明細書において、用語「キメラ抗体」には、一価、二価または多価免疫グロブリンが含まれる。一価キメラ抗体は、キメラＬ鎖とのジスルフィド架橋を通じて会合するキメラＨ鎖によって形成される二量体（ＨＬ）である。二価キメラ抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋を通じて会合する２つのＨＬ二量体によって形成される四量体（Ｈ_２Ｌ_２）である。多価キメラ抗体もまた、例えば凝集するＣ_Ｈ領域（例えばＩｇＭＨ鎖、またはμ鎖由来のもの）を使用することによって産生可能である。 As used herein, the term “chimeric antibody” includes monovalent, divalent or multivalent immunoglobulins. Monovalent chimeric antibodies are dimers (HL) formed by chimeric H chains that associate through disulfide bridges with chimeric L chains. A divalent chimeric antibody is a tetramer (H ₂ L ₂ ) formed by two HL dimers that associate through at least one disulfide bridge. Polyvalent chimeric antibody can also be produced by using a C _H region that example aggregate (e.g. IgM H chain or μ chain-derived ones,).

本発明のネズミ抗体およびキメラ抗体、断片および領域は、個々の重鎖（Ｈ）および／または軽鎖（Ｌ）免疫グロブリン鎖を含むことも可能である。キメラＨ鎖は、ＩＦＮγに特異的な非ヒト抗体のＨ鎖由来の抗原結合領域を含み、これがヒトＨ鎖Ｃ領域（Ｃ_Ｈ）の少なくとも部分、例えばＣＨ_１またはＣＨ_２に連結される。 The murine and chimeric antibodies, fragments and regions of the present invention can also comprise individual heavy (H) and / or light (L) immunoglobulin chains. The chimeric heavy chain comprises an antigen-binding region derived from the heavy chain of a non-human antibody specific for IFNγ, which is linked to at least a portion of the human heavy chain C region (C _H ), eg, CH ₁ or CH ₂ .

本発明記載のキメラＬ鎖は、ヒトＬ鎖Ｃ領域（Ｃ_Ｌ）の少なくとも部分に連結された、ＩＦＮγに特異的な非ヒト抗体のＬ鎖由来の抗原結合領域を含む。
既知の方法工程にしたがって、個々のポリペプチド鎖を適切に会合させることによって、選択的結合剤、例えば同一のまたは異なる可変領域結合特異性を持つキメラＨ鎖およびＬ鎖を有する抗体、断片、または誘導体もまた調製可能である；例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら監修ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク（１９９３）およびＨａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を参照されたい。これらの参考文献の内容は、本明細書に完全に援用される。このアプローチを用いて、キメラＨ鎖（またはその誘導体）を発現する宿主を、キメラＬ鎖（またはその誘導体）を発現する宿主と別個に培養し、そして免疫グロブリン鎖を別個に回収して、そして次いで会合させる。あるいは、宿主を同時培養して、そして鎖を培地中で自発的に会合可能にし、その後、組み立てられた免疫グロブリン、断片または誘導体を回収することも可能である。 The chimeric L chain according to the present invention comprises an antigen-binding region derived from the L chain of a non-human antibody specific for IFNγ linked to at least part of the human L chain C region (C _L ).
By appropriately associating individual polypeptide chains according to known method steps, selective binding agents, eg, antibodies, fragments having chimeric heavy and light chains with the same or different variable region binding specificities, or Derivatives can also be prepared; for example, Current Protocols in Molecular Biology, Supervised by Ausubel et al., Wiley Interscience, New York (1993) and Harlow et al. Please refer to. The contents of these references are fully incorporated herein. Using this approach, the host expressing the chimeric heavy chain (or derivative thereof) is cultured separately from the host expressing the chimeric light chain (or derivative thereof), and the immunoglobulin chain is recovered separately, and Then meet. Alternatively, the host can be co-cultured and the chains can spontaneously associate in the medium, after which the assembled immunoglobulin, fragment or derivative is recovered.

例として、本発明の選択的結合剤（例えばキメラ抗体）の抗原結合領域は、好ましくは、ヒトＩＦＮγに特異的な非ヒト抗体由来である。こうした非ヒト抗体をコードするＤＮＡの好ましい供給源には、抗体を産生する細胞株、例えば一般的にハイブリドーマとして知られるハイブリッド細胞株が含まれる。 By way of example, the antigen binding region of a selective binding agent (eg, a chimeric antibody) of the present invention is preferably derived from a non-human antibody specific for human IFNγ. Preferred sources of DNA encoding such non-human antibodies include cell lines that produce antibodies, such as hybrid cell lines commonly known as hybridomas.

本発明はまた、抗ＩＦＮγ抗体の断片、変異体および誘導体も提供し、ここで用語「断片」、「変異体」、「誘導体」および「融合体」は、本明細書に定義される。本発明は、非修飾抗ＩＦＮγ抗体に機能的に類似である、すなわち非修飾抗体の活性を少なくとも１つ保持する、抗ＩＦＮγ抗体の断片、変異体、誘導体、および融合体を含む。上述の修飾に加えて、植物毒素および細菌毒素などの細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子配列の付加も含まれる。抗ＩＦＮγ抗体の断片、変異体、誘導体および融合体を、本発明の宿主のいずれから産生することも可能である。 The invention also provides fragments, variants and derivatives of anti-IFNγ antibodies, wherein the terms “fragment”, “variant”, “derivative” and “fusion” are defined herein. The invention includes fragments, variants, derivatives, and fusions of anti-IFNγ antibodies that are functionally similar to unmodified anti-IFNγ antibodies, ie, retain at least one activity of the unmodified antibody. In addition to the modifications described above, the addition of genetic sequences encoding cytotoxic proteins such as plant and bacterial toxins is also included. Fragments, variants, derivatives and fusions of anti-IFNγ antibodies can be produced from any of the hosts of the present invention.

適切な断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ＦｖおよびｓｃＦｖが含まれる。これらの断片は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体のＦｃ断片を欠き、循環からより迅速に一掃され、そして損なわれていない抗体よりも非特異性組織結合がより少なくなりうる；Ｗａｈｌら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２４：３１６−３２５（１９８３）。これらの断片は、当該技術分野に周知の方法を用いて、例えばパパイン（Ｆａｂ断片を産生する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２断片を産生する）などの酵素でのタンパク質分解切断によって、損なわれていない抗体から産生される。これらの抗原結合領域および／または本発明のモノクローナル抗体に認識されるエピトープを同定すると、本出願の態様と同等である、類似の結合特性および療法的有用性または診断有用性を持つさらなるモノクローナル抗体を生成するのに必要な情報が提供される。 Suitable fragments include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) ₂ , Fv and scFv. These fragments lack the intact Fc fragment of the intact antibody, are cleared more rapidly from the circulation, and may have less non-specific tissue binding than the intact antibody; Wahl et al., J . Nucl. Med. 24 : 316-325 (1983). These fragments are damaged by proteolytic cleavage with enzymes such as papain (producing Fab fragments) or pepsin (producing F (ab ′) ₂ fragments) using methods well known in the art. Produced from non-antibody. Identification of these antigen-binding regions and / or epitopes recognized by the monoclonal antibodies of the present invention will yield additional monoclonal antibodies with similar binding properties and therapeutic or diagnostic utility that are equivalent to embodiments of the present application. Information necessary to generate is provided.

選択的結合剤の変異体もまた提供する。１つの態様において、抗体および抗原結合ドメインの変異体は、軽鎖および／または重鎖アミノ酸配列中に変化を含み、これらの変化は天然存在であるか、または組換えＤＮＡ技術を用いた天然配列のｉｎｖｉｔｒｏ操作によって導入されている。天然存在変異体には、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）抗原に対する抗体応答の生成中、対応する生殖系列ヌクレオチド配列において、ｉｎｖｉｖｏで生成される「体細胞」変異体が含まれる。配列において、本発明の典型的なＦａｂを生成する、生殖系列可変軽鎖および重鎖配列中の体細胞突然変異にコードされる変異体は、Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」に関しては図３３および図４１に、Ｆａｂ「ＢＳ−Ｂ」に関しては図３４および図４１に、Ｆａｂ「ＲＤ−Ｂ１」に関しては図３５および図４２に、Ｆａｂ「ＲＤ−Ｂ１」に関しては図３５および図４２に、Ｆａｂ「ＲＤ−Ａ２」に関しては図３３および図４３に、Ｆａｂ「５８Ｃ」に関しては図３６および図４４に、Ｆａｂ「ＧＰ−Ａ」に関しては図３７および図４５に、Ｆａｂ「５７Ｄ」に関しては図３８および図４６に、Ｆａｂ「５７Ｅ」に関しては図３９および図４１に、Ｆａｂ「ＩＦＮ−Ａ」に関しては図３３および図４３に、Ｆａｂ「６７Ｃ」に関しては図４０および図４３に、そしてＦａｂ「５９−Ａ２」に関しては図３４および図４１に示される。 Variants of selective binding agents are also provided. In one embodiment, antibody and antigen binding domain variants comprise changes in the light and / or heavy chain amino acid sequences, which are naturally occurring or native sequences using recombinant DNA technology. It is introduced by in vitro operation. Naturally occurring variants include “somatic” variants that are generated in vivo at the corresponding germline nucleotide sequence during the generation of an antibody response to a foreign antigen. The variants encoded in the somatic mutations in the germline variable light and heavy chain sequences that produce a typical Fab of the invention in sequence are shown in FIGS. 33 and 41 for Fab “BS-A”. 34 and 41 for the Fab “BS-B”, FIGS. 35 and 42 for the Fab “RD-B1”, and FIGS. 35 and 42 for the Fab “RD-B1”. -A2 "in FIGS. 33 and 43, Fab" 58C "in FIGS. 36 and 44, Fab" GP-A "in FIGS. 37 and 45, and Fab" 57D "in FIGS. 46, FIG. 39 and FIG. 41 for Fab “57E”, FIG. 33 and FIG. 43 for Fab “IFN-A”, and FIG. 40 and FIG. 43 for Fab “67C”. And with respect Fab "59-A2" shown in FIGS. 34 and 41.

抗ＩＦＮγ抗体および抗原結合ドメインの変異体はまた、当該技術分野に知られる突然変異誘発技術によっても調製可能である。１つの例において、抗体コード領域全体で、無作為にアミノ酸変化を導入することも可能であり、そして望ましい活性、例えばＩＦＮγに対する結合親和性に関して、生じた変異体をスクリーニングすることも可能である。あるいは、ＩＦＮγ抗体の選択される領域に、例えば軽鎖および／または重鎖ＣＤＲ、およびフレームワーク領域に、アミノ酸変化を導入することも可能であり、そしてＩＦＮγへの結合または他の何らかの活性に関して、生じた抗体をスクリーニングすることも可能である。アミノ酸変化は、単一アミノ酸相違から、既定のＣＤＲ、例えばＣＤＲ３内のアミノ酸のありうるすべての順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）の範囲で、ＣＤＲ中に１以上のアミノ酸置換を含む。別の方法において、ＣＤＲ内の少なくとも１つの残基をアラニンで置換することによって、ＣＤＲ内の各残基のＩＦＮγ結合への寄与を評価することも可能である；Ｌｅｗｉｓら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１０６５−１０７２（１９９５）。次いで、より最適な配列を決定するため、ＩＦＮγへの結合に最適でない残基を変化させることも可能である。アミノ酸を挿入して、ＣＤＲ、例えばＣＤＲ３のサイズを増加させることによって生成される変異体もまた、含まれる。例えば、大部分の軽鎖ＣＤＲ３配列は、長さ９アミノ酸である。９残基より短い、抗体中の軽鎖ＣＤＲ３配列は、適切なアミノ酸を挿入して、ＣＤＲの長さを増加させることによって、ＩＦＮγへの結合に関して最適化されることも可能である。 Anti-IFNγ antibodies and antigen binding domain variants can also be prepared by mutagenesis techniques known in the art. In one example, amino acid changes can be introduced randomly throughout the antibody coding region, and the resulting mutants can be screened for a desired activity, eg, binding affinity for IFNγ. Alternatively, amino acid changes can be introduced into selected regions of the IFNγ antibody, eg, light and / or heavy chain CDRs, and framework regions, and for binding to IFNγ or some other activity, It is also possible to screen the resulting antibodies. Amino acid changes include one or more amino acid substitutions in a CDR, ranging from a single amino acid difference to all possible permutations of amino acids within a given CDR, eg, CDR3. In another method, it is possible to assess the contribution of each residue in the CDR to IFNγ binding by substituting at least one residue in the CDR with alanine; Lewis et al., Mol. Immunol. 32 : 1065-1072 (1995). It is also possible to change residues that are not optimal for binding to IFNγ in order to determine a more optimal sequence. Also included are variants generated by inserting amino acids to increase the size of a CDR, eg, CDR3. For example, most light chain CDR3 sequences are 9 amino acids in length. Light chain CDR3 sequences in antibodies that are shorter than 9 residues can also be optimized for binding to IFNγ by inserting appropriate amino acids to increase the length of the CDRs.

１つの態様において、抗体または抗原結合ドメイン変異体は、１以上の重鎖または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３に、そして所望によって１以上の重鎖または軽鎖フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２またはＦＲ３に、１以上のアミノ酸変化を含む。アミノ酸変化は、アミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入を含む。典型的な変異体には、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号３４）；ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４４）；またはＧＲＡＲＮＷＲＳＲＦＤＹ（配列番号５４）に１以上のアミノ酸変化を持つ「ＢＳ−Ａ」重鎖可変領域変異体、あるいは配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＳＨＹＶＱ（配列番号０１）；ＥＤＫＥＲＰＳ（配列番号１２）；またはＱＳＹＤＳＳＮＱＷＶ（配列番号２３）に１以上のアミノ酸変化を持つ「ＢＳ−Ａ」軽鎖可変領域変異体が含まれる。前述の「ＢＳ−Ａ」重鎖および軽鎖可変領域変異体は、フレームワーク領域に１以上のアミノ酸変化をさらに含むことも可能である。 In one embodiment, the antibody or antigen binding domain variant is in one or more heavy or light chain CDR1, CDR2 or CDR3, and optionally in one or more heavy or light chain framework regions FR1, FR2 or FR3, Contains one or more amino acid changes. Amino acid changes include amino acid residue substitutions, deletions and / or insertions. Exemplary variants include “BS-A” heavy chain variable region variants with one or more amino acid changes in the sequence GYYWS (SEQ ID NO: 34); EINHSSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 44); or GRARNWRSRFDY (SEQ ID NO: 54); Alternatively, a “BS-A” light chain variable region variant having one or more amino acid changes in the sequence TGSSGSIASHYVQ (SEQ ID NO: 01); EDKERPS (SEQ ID NO: 12); or QSYDSSNQWV (SEQ ID NO: 23) is included. The aforementioned “BS-A” heavy and light chain variable region variants may further comprise one or more amino acid changes in the framework regions.

１つの例において、１以上のアミノ酸変化を導入して、体細胞突然変異フレームワーク残基を、その位の生殖系列残基で置換することも可能である。前述のアミノ酸変化が置換である場合、変化は保存的置換でもまた非保存的置換でもよい。変異体を、軽鎖または重鎖いずれかの「鎖シャフリング」によって調製することもまた可能である；ＭａｒｋｓらＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２）。典型的には、単一の軽鎖（または重鎖）を、重鎖（または軽鎖）のレパートリーを有するライブラリーと組み合わせて、そして生じた集団を、ＩＦＮγへの結合などの望ましい活性に関してスクリーニングする。この技術は、重鎖および軽鎖両方のレパートリーを含むライブラリーで可能であるよりも、単一の軽鎖（または重鎖）と組み合わされた異なる重鎖（または軽鎖）のより多数の試料をスクリーニングすることを可能にする。 In one example, one or more amino acid changes can be introduced to replace a somatic mutation framework residue with a germline residue in its place. Where the aforementioned amino acid changes are substitutions, the changes may be conservative or non-conservative substitutions. Variants can also be prepared by “chain shuffling” of either light or heavy chains; Marks et al. Biotechnology, 10 : 779-783 (1992). Typically, a single light chain (or heavy chain) is combined with a library having a repertoire of heavy chains (or light chains) and the resulting population is screened for a desired activity such as binding to IFNγ. To do. This technique allows more samples of different heavy chains (or light chains) combined with a single light chain (or heavy chain) than is possible with libraries containing both heavy and light chain repertoires. Makes it possible to screen.

本発明の選択的結合剤は、二重特異性であることも可能である。本発明の二重特異性選択的結合剤は、いくつかの立体配置のものであることも可能である。例えば、二重特異性抗体は、一本鎖抗体（または抗体断片）に似ているが、２つの異なる抗原結合部位（可変領域）を有する。二重特異性抗体は、化学的技術によって；例えば、Ｋｒａｎｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：５８０７（１９８１）を参照されたい；「ポリドーマ（ｐｏｌｙｄｏｍａ）」技術によって；米国特許第４，４７４，８９３号；または組換えＤＮＡ技術によって、産生可能である。 The selective binding agents of the present invention can also be bispecific. The bispecific selective binding agents of the present invention can be of several configurations. For example, bispecific antibodies resemble single chain antibodies (or antibody fragments) but have two different antigen binding sites (variable regions). Bispecific antibodies can be obtained by chemical techniques; see, eg, Kranz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 : 5807 (1981); can be produced by “polydoma” technology; US Pat. No. 4,474,893; or by recombinant DNA technology.

本発明の選択的結合剤はまた、異種抗体であることも可能である。異種抗体は、ともに連結された、各々異なる特異性を有する、２以上の抗体、または抗体結合断片（Ｆａｂ）である。 The selective binding agent of the present invention can also be a heterologous antibody. A heterologous antibody is two or more antibodies, or antibody-binding fragments (Fabs), each having different specificities linked together.

本発明はまた、「ヒト化」抗体にも関する。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野に周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からヒト抗体に導入された１以上のアミノ酸残基を有する。一般的に、非ヒト残基は、ＣＤＲに存在するであろう。ヒト化は、当該技術分野に知られる方法にしたがって、げっ歯類相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の対応する領域に対して置換することによって、実行可能である；Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）。 The invention also relates to “humanized” antibodies. Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. Generally, a humanized antibody has one or more amino acid residues introduced into it from a source that is non-human. In general, non-human residues will be present in a CDR. Humanization can be performed by replacing rodent complementarity determining regions (CDRs) with corresponding regions of human antibodies according to methods known in the art; Jones et al., Nature 321 : 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332 : 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239 : 1534-1536 (1988).

キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、およびヒト化抗体を含む、本発明の選択的結合剤は、当該技術分野に知られる組換え法によっても産生可能である。抗体をコードする核酸を宿主細胞に導入し、そして本明細書に記載し、そして当該技術分野に知られる、材料および方法を用いて発現させる。好ましい態様において、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞において、抗体を産生する。宿主細胞にトランスフェクションした組換えＤＮＡの発現によって、または上述のようなハイブリドーマ細胞における発現によって、完全ヒト抗体を産生することも可能である。 Selective binding agents of the present invention, including chimeric antibodies, CDR-grafted antibodies, and humanized antibodies, can also be produced by recombinant methods known in the art. Nucleic acid encoding the antibody is introduced into a host cell and expressed using materials and methods described herein and known in the art. In a preferred embodiment, the antibody is produced in a mammalian host cell such as a CHO cell. It is also possible to produce fully human antibodies by expression of recombinant DNA transfected into host cells or by expression in hybridoma cells as described above.

モノクローナル抗体の生成を回避して、抗体分子の抗原結合領域の組換えＤＮＡ型を生成する技術が本発明の実施内に含まれる。これを行うため、免疫動物から採取した免疫系細胞から、抗体特異的メッセンジャーＲＮＡ分子を抽出し、そして相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写する。次いで、ｃＤＮＡを細菌発現系にクローニングする。本発明を実施するのに適した技術の一例は、発現されたＦａｂタンパク質を細胞膜周辺腔（細菌細胞膜および細胞壁の間）に移動させるか、または分泌させる、リーダー配列を有する、繊維状バクテリオファージＭ１３由来ファージミド・ベクター系を用いる。抗原に結合するものに関して、非常に多数の機能するＦａｂ断片を迅速に生成し、そしてスクリーニングすることも可能である。こうしたＩＦＮγ選択的結合剤（ＩＦＮγポリペプチドに対して特異性を持つＦａｂ断片）は、本明細書に定義され、議論され、そして請求される際、用語「抗体」に明確に含まれる。 Techniques that avoid the production of monoclonal antibodies and generate recombinant DNA forms of the antigen binding region of the antibody molecule are included within the practice of the invention. To do this, antibody-specific messenger RNA molecules are extracted from immune system cells taken from the immunized animal and transcribed into complementary DNA (cDNA). The cDNA is then cloned into a bacterial expression system. One example of a technique suitable for practicing the present invention is the filamentous bacteriophage M13 with a leader sequence that moves or secretes the expressed Fab protein into the periplasmic space (between the bacterial cell membrane and the cell wall). A derived phagemid vector system is used. A large number of functional Fab fragments can be rapidly generated and screened for those that bind to the antigen. Such IFNγ selective binding agents (Fab fragments with specificity for IFNγ polypeptides) are specifically included in the term “antibody” as defined, discussed and claimed herein.

やはり本発明の範囲内にあるのは、適切な抗原特異性を持つマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性、例えばヒト補体を活性化し、そしてＡＤＣＣを仲介する能力を持つヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングすることによって、キメラ抗体を産生するために開発された技術である；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４（１９８４）。１つの例は、Ｆｃ領域の、異なるアイソタイプのＦｃ領域との交換である。この技術によって産生される抗体などの選択的結合剤は、本発明の範囲内である。 Also within the scope of the present invention is a gene from a mouse antibody molecule with the appropriate antigen specificity, the human having the ability to activate the appropriate biological activity, eg human complement, and mediate ADCC A technique developed to produce chimeric antibodies by splicing together with genes from antibody molecules; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 81 : 6851 (1984); Neuberger et al., Nature, 312 : 604 (1984). One example is the exchange of an Fc region with an Fc region of a different isotype. Selective binding agents such as antibodies produced by this technique are within the scope of the present invention.

本発明の好ましい態様において、抗ＩＦＮγ抗体は、完全ヒト抗体である。したがって、ＩＦＮγポリペプチドに結合し、そしてヒト生殖系列免疫グロブリン核酸配列、並びにその断片、合成変異体、誘導体および融合体の天然存在体細胞変異体である核酸配列にコードされる抗体が本発明に含まれる。こうした抗体は、当該技術分野に知られる方法いずれによって産生してもよい。典型的な方法には、内因性免疫グロブリン産生を伴わずに、ヒト抗体レパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を、ＩＦＮγ抗原（免疫応答を誘発することが可能であり、そして所望によってキャリアーにコンジュゲート化されているＩＦＮγポリペプチドいずれか）で免疫することが含まれる；例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，ＹｅａｒｉｎＩｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照されたい。 In a preferred embodiment of the invention, the anti-IFNγ antibody is a fully human antibody. Accordingly, antibodies that bind to IFNγ polypeptides and encoded by human germline immunoglobulin nucleic acid sequences and nucleic acid sequences that are naturally occurring somatic cell variants of fragments, synthetic variants, derivatives and fusions thereof are provided herein. included. Such antibodies may be produced by any method known in the art. A typical method is to transform a transgenic animal (eg, a mouse) capable of producing a human antibody repertoire without endogenous immunoglobulin production into an IFNγ antigen (to induce an immune response; And optionally immunizing with any of the IFNγ polypeptides conjugated to a carrier); see, eg, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 90 : 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362 : 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol. , 7:33 see (1993).

あるいは、ファージ・ディスプレー抗体ライブラリーのｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングを通じて、ヒト抗体を生成することも可能である；例えば、本明細書に援用される、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１)を参照されたい。多様な抗体含有ファージ・ディスプレー・ライブラリーが記載されており、そして当業者によって容易に調製可能である。ライブラリーは、適切な標的に対してスクリーニング可能な、多様なヒト抗体配列、例えばヒトＦａｂ、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ断片を含有することも可能である。実施例２は、ＩＦＮγに選択的に結合する分子を同定するための、ＩＦＮγに対するＦａｂファージ・ライブラリーのスクリーニングを記載する。ファージ・ディスプレー・ライブラリーが、ＩＦＮγの選択的結合剤を同定するためにスクリーニングすることが可能な抗体以外のペプチドまたはタンパク質を含んでもよいことが認識されるであろう。 Alternatively, human antibodies can be generated through in vitro screening of phage display antibody libraries; see, eg, Hoogenboom et al., J. Chem. Mol. Biol. , 227 : 381 (1991); Marks et al., J. MoI. Mol. Biol. 222 : 581 (1991). A variety of antibody-containing phage display libraries have been described and can be readily prepared by one skilled in the art. The library can also contain a variety of human antibody sequences, such as human Fab, Fv, and scFv fragments, that can be screened against an appropriate target. Example 2 describes the screening of a Fab phage library against IFNγ to identify molecules that selectively bind to IFNγ. It will be appreciated that the phage display library may include peptides or proteins other than antibodies that can be screened to identify selective binding agents for IFNγ.

抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、一般的に抗体の抗原結合部位と会合するユニークな決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄを調製しようとするモノクローナル抗体で、該モノクローナル抗体の供給源と同一種および同一遺伝子型（例えばマウス系統）の動物を免疫することによって、調製可能である。免疫された動物は、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することによって、免疫抗体のイディオタイプ決定基を認識し、そして応答するであろう；例えば本明細書に完全に援用される米国特許第４，６９９，８８０号を参照されたい。抗Ｉｄ抗体はまた、さらに別の動物において免疫応答を誘導し、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生する、「免疫原」としても使用可能である。抗−抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した元来のモノクローナル抗体と、エピトープが同一であることも可能である。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることによって、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。 Anti-idiotype (anti-Id) antibodies are antibodies that recognize unique determinants that are typically associated with the antigen binding site of the antibody. An Id antibody can be prepared by immunizing an animal of the same species and the same genotype (for example, mouse strain) as the monoclonal antibody source with a monoclonal antibody to be prepared for anti-Id. The immunized animal will recognize and respond to the idiotypic determinants of the immune antibody by producing antibodies against these idiotypic determinants (anti-Id antibodies); See incorporated US Pat. No. 4,699,880. Anti-Id antibodies can also be used as “immunogens” that induce an immune response in yet another animal and produce so-called anti-anti-Id antibodies. Anti-anti-Id can have the same epitope as the original monoclonal antibody that induced anti-Id. Thus, by using antibodies against the idiotypic determinants of the mAb, it is possible to identify other clones that express antibodies of the same specificity.

ＩＦＮγの選択的結合剤の産生
調製しようとするＩＦＮγの選択的結合剤が、タンパク質性選択的結合剤、例えば抗体または抗原結合ドメインである場合、前記剤を産生するため、多様な生物学的方法または化学的方法が利用可能である。 Production of a selective binding agent of IFNγ When the selective binding agent of IFNγ to be prepared is a proteinaceous selective binding agent, such as an antibody or an antigen-binding domain, various biological methods are used to produce the agent. Or chemical methods are available.

療法使用のために十分な量の選択的結合剤を産生するには、生物学的方法が好ましい。本発明の抗体および抗原結合ドメインの産生には、標準的組換えＤＮＡ技術が特に有用である。発現産物の回収のための典型的な発現ベクター、宿主細胞および方法を以下に記載する。 Biological methods are preferred to produce a sufficient amount of the selective binding agent for therapeutic use. Standard recombinant DNA techniques are particularly useful for the production of antibodies and antigen binding domains of the invention. Exemplary expression vectors, host cells and methods for recovery of expression products are described below.

標準的連結技術を用いて、ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子を適切な発現ベクターに挿入する。ベクターは、典型的には、使用する特定の宿主細胞で機能するように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が起こりうるように、宿主細胞機構と適合する）。抗ＩＦＮγ抗体をコードする核酸分子を、原核宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞（バキュロウイルス系）および／または真核宿主細胞で増幅／発現することも可能である。宿主細胞の選択は、部分的に、抗ＩＦＮγ抗体を翻訳後に（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ）修飾（例えばグリコシル化および／またはリン酸化）しようとしているかどうかに応じるであろう。修飾するのであれば、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの概説に関しては、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．Ｖ．１８５，Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ監修ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）を参照されたい。 Using standard ligation techniques, a nucleic acid molecule encoding an IFNγ antibody or antigen binding domain is inserted into an appropriate expression vector. The vector is typically selected to function in the particular host cell used (ie, the vector is compatible with the host cell machinery so that gene amplification and / or gene expression can occur). . Nucleic acid molecules encoding anti-IFNγ antibodies can also be amplified / expressed in prokaryotic host cells, yeast host cells, insect host cells (baculovirus systems) and / or eukaryotic host cells. The choice of host cell will depend, in part, on whether the anti-IFNγ antibody is going to be post-translationally modified (eg, glycosylation and / or phosphorylation). If modified, yeast host cells, insect host cells, or mammalian host cells are preferred. For a review of expression vectors, see Meth. Enz. V. 185, D.E. V. Supervised by Goeddel Academic Press Inc. , San Diego, California (1990).

典型的には、いかなる宿主細胞で用いられる発現ベクターも、以下の構成要素の１以上を含有するであろう：プロモーター、１以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプターのスプライス部位を含有する完全イントロン配列、分泌のためのリーダー配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現しようとするポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能マーカー要素。これらの配列は各々、以下により詳細に論じられる。 Typically, an expression vector used in any host cell will contain one or more of the following components: a promoter, one or more enhancer sequences, an origin of replication, a transcription termination sequence, donor and acceptor splice sites. A complete intron sequence containing, a leader sequence for secretion, a ribosome binding site, a polyadenylation sequence, a polylinker region for inserting a nucleic acid encoding a polypeptide to be expressed, and a selectable marker element. Each of these sequences is discussed in more detail below.

ベクター構成要素は、相同配列（すなわち宿主細胞と同一種および／または同一系統由来）、異種配列（すなわち宿主細胞種以外の種または系統由来）、ハイブリッド（すなわち１より多い供給源由来の異なる配列の組み合わせ）、合成配列、または通常、免疫グロブリン発現を制御するように機能する天然配列であることも可能である。こうしたものとして、ベクター構成要素の供給源は、宿主細胞機構において機能し、そして該機構によって活性化可能である限り、いかなる原核生物または真核生物、いかなる脊椎動物または無脊椎動物、またはいかなる植物であることも可能である。 Vector components can be homologous sequences (ie, from the same species and / or strain as the host cell), heterologous sequences (ie, from species or strains other than the host cell species), hybrid (ie, of different sequences from more than one source). Combinations), synthetic sequences, or natural sequences that usually function to control immunoglobulin expression. As such, the source of the vector component can be in any prokaryotic or eukaryotic organism, any vertebrate or invertebrate animal, or any plant as long as it functions in and can be activated by the host cell machinery. It is also possible.

複製起点は、発現に用いられる宿主細胞の種類に基づいて選択される。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（製品番号３０３−３ｓ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）由来の複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適しており、一方、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）またはパピローマウイルス（ＨＰＶまたはＢＰＶなど）由来の多様な起点は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点構成要素は哺乳動物発現ベクターには必要ない（例えば、ＳＶ４０起点がしばしば用いられるが、これはただ初期プロモーターを含有するからである）。 The origin of replication is selected based on the type of host cell used for expression. For example, the origin of replication from plasmid pBR322 (Product No. 303-3s, New England Biolabs, Beverly, Mass.) Is suitable for most gram-negative bacteria, while SV40, polyoma, adenovirus, vesicular stomatitis virus ( Various origins from VSV) or papillomaviruses (such as HPV or BPV) are useful for cloning vectors in mammalian cells. In general, an origin of replication component is not needed for mammalian expression vectors (eg, the SV40 origin is often used because it contains only the early promoter).

転写終結配列は、典型的にはポリペプチドコード領域の３’端に位置し、そして転写を終結させるように働く。通常、原核細胞中の転写終結配列には、Ｇ−Ｃリッチ断片に続いてポリＴ配列がある。配列を、ライブラリーから容易にクローニングするか、またはベクターの一部として商業的に購入してもよいが、上述のものなどの核酸合成法を用いて、容易に合成することも可能である。 A transcription termination sequence is typically located at the 3 'end of the polypeptide coding region and serves to terminate transcription. Usually, transcription termination sequences in prokaryotic cells include a poly-T sequence following a GC rich fragment. The sequences can be easily cloned from a library or purchased commercially as part of a vector, but can also be readily synthesized using nucleic acid synthesis methods such as those described above.

選択可能マーカー遺伝子要素は、選択培地中で増殖する宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば原核宿主細胞ではアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を与えるタンパク質、（ｂ）細胞の栄養要求不全を補足するタンパク質；または（ｃ）複合培地から入手可能でない非常に重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。原核宿主細胞および真核宿主細胞において、ネオマイシン耐性遺伝子もまた使用可能である。 The selectable marker gene element encodes a protein necessary for the survival and growth of host cells growing in the selective medium. Typical selectable marker genes are (a) proteins that confer resistance to antibiotics or other toxins, such as ampicillin, tetracycline, or kanamycin in prokaryotic host cells; (b) proteins that complement cellular auxotrophy; or (c ) Encodes a protein that supplies very important nutrients that are not available from complex media. Preferred selectable markers are the kanamycin resistance gene, the ampicillin resistance gene, and the tetracycline resistance gene. Neomycin resistance genes can also be used in prokaryotic and eukaryotic host cells.

他の選択遺伝子を用いて、発現しようとする遺伝子を増幅することも可能である。増幅は、増殖に決定的に重要なタンパク質の産生に対する要求がより高い遺伝子が、組換え細胞の代々の世代の染色体内で、タンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に適した選択可能マーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが含まれる。哺乳動物細胞形質転換体を、ベクターに存在するマーカーのため、形質転換体のみがユニークに適応して生存する選択圧下に置く。培地中の選択剤の濃度を連続的に変化させて、それによって選択遺伝子および抗ＩＦＮγ抗体をコードするＤＮＡ両方の増幅が導かれる条件下で、形質転換細胞を培養することによって、選択圧を課す。その結果、増幅されたＤＮＡから、増加した量の抗体が合成される。 It is also possible to amplify the gene to be expressed using other selection genes. Amplification is a process in which genes that are more demanding for the production of proteins critical to growth are repeated in tandem within the chromosomes of successive generations of recombinant cells. Examples of selectable markers suitable for mammalian cells include dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidine kinase. Mammalian cell transformants are placed under selective pressure so that only the transformants uniquely adapt and survive because of the markers present in the vector. Selective pressure is imposed by culturing transformed cells under conditions that continuously change the concentration of the selective agent in the medium, thereby leading to amplification of both the selection gene and the DNA encoding the anti-IFNγ antibody. . As a result, an increased amount of antibody is synthesized from the amplified DNA.

リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてシャイン・ダルガノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。これら要素は、典型的には、発現しようとするポリペプチドのプロモーターの３’で、そしてコード配列の５’に位置する。シャイン・ダルガノ配列は多様であるが、典型的にはポリプリンである（すなわち高いＡ−Ｇ含量を有する）。多くのシャイン・ダルガノ配列が同定されてきており、各々、上述の方法を用いて、容易に合成可能であり、そして原核ベクターで使用可能である。 The ribosome binding site is usually required for translation initiation of mRNA and is characterized by a Shine-Dalgarno sequence (prokaryotes) or a Kozak sequence (eukaryotes). These elements are typically located 3 'to the promoter of the polypeptide to be expressed and 5' to the coding sequence. The Shine-Dalgarno sequence varies but is typically a polypurine (ie, has a high AG content). Many Shine-Dalgarno sequences have been identified, each easily synthesized using the methods described above, and usable in prokaryotic vectors.

リーダー配列またはシグナル配列は、ポリペプチドの分泌を指示するのに用いられる。シグナル配列はポリペプチドコード領域内にまたはその５’端に直接配置されることも可能である。多くのシグナル配列が同定されてきており、そして発現に用いる宿主細胞に基づいて選択可能である。本発明において、シグナル配列は、抗ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸配列に相同である（天然存在である）か、またはこれら配列に対して異種であることも可能である。選択される異種シグナル配列は、シグナルペプチダーゼにより、宿主細胞によって、認識され、そしてプロセシングされる、すなわち切断されるものであるべきである。天然免疫グロブリンシグナル配列を認識せず、そしてプロセシングしない原核宿主細胞では、シグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性内毒素ＩＩのリーダーの群から選択される原核シグナル配列によって置換する。酵母分泌のため、天然免疫グロブリンシグナル配列を、酵母インベルターゼ、アルファ因子、または酸ホスファターゼのリーダーによって置換することも可能である。哺乳動物細胞発現では、天然シグナル配列で十分だが、他の哺乳動物シグナル配列が適切である可能性もある。 A leader or signal sequence is used to direct secretion of the polypeptide. The signal sequence can also be located directly within the polypeptide coding region or at its 5 'end. Many signal sequences have been identified and can be selected based on the host cell used for expression. In the present invention, the signal sequence can be homologous (naturally occurring) to a nucleic acid sequence encoding an anti-IFNγ antibody or antigen binding domain, or can be heterologous to these sequences. The heterologous signal sequence selected should be one that is recognized and processed, ie cleaved, by the host cell by the signal peptidase. In prokaryotic host cells that do not recognize and process the native immunoglobulin signal sequence, the signal sequence is replaced by a prokaryotic signal sequence selected, for example, from the group of leaders of alkaline phosphatase, penicillinase, or thermostable endotoxin II. Because of yeast secretion, the native immunoglobulin signal sequence can be replaced by a yeast invertase, alpha factor, or acid phosphatase leader. For mammalian cell expression, the natural signal sequence is sufficient, but other mammalian signal sequences may be appropriate.

大部分の場合、宿主細胞から抗ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインが分泌される結果、抗体からシグナルペプチドが除去されるであろう。したがって、成熟抗体は、いかなるリーダー配列またはシグナル配列も欠くであろう。 In most cases, secretion of the anti-IFNγ antibody or antigen binding domain from the host cell will result in removal of the signal peptide from the antibody. Thus, a mature antibody will lack any leader or signal sequence.

真核宿主細胞発現系におけるグリコシル化が望ましいなどのいくつかの場合、グリコシル化または収率を改善するため、多様なプレ配列を操作することも可能である。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変することも可能であるし、またはグリコシル化に影響を及ぼすことも可能なプロ配列を付加することも可能である。最終タンパク質産物は、−１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に比較して）に、完全には除去されなかった可能性もある、発現によって生じる１以上のさらなるアミノ酸を有することも可能である。例えば、最終タンパク質産物は、Ｎ末端に付着して、ペプチダーゼ切断部位に見られる１つまたは２つのアミノ酸を有することも可能である。あるいは、いくつかの酵素切断部位を用いることによって、望ましいＩＦＮγポリペプチドのわずかに一部切除された型を生じることも可能であり、これは酵素が成熟ポリペプチド内のこうした領域を切断する場合である。 In some cases, such as where glycosylation in a eukaryotic host cell expression system is desired, a variety of pre-sequences can be engineered to improve glycosylation or yield. For example, the peptidase cleavage site of a particular signal peptide can be altered, or a prosequence can be added that can affect glycosylation. The final protein product can also have one or more additional amino acids resulting from expression that may not have been completely removed in position −1 (compared to the first amino acid of the mature protein). For example, the final protein product can have one or two amino acids attached to the N-terminus and found at the peptidase cleavage site. Alternatively, several enzymatic cleavage sites can be used to produce a slightly truncated form of the desired IFNγ polypeptide, when the enzyme cleaves such a region within the mature polypeptide. is there.

本発明の発現ベクターは、典型的には、宿主生物に認識され、そして抗ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子に機能可能であるように連結されているプロモーターを含有するであろう。発現に用いる宿主細胞および望ましいタンパク質収率に応じて、天然プロモーターまたは異種プロモーターを使用することも可能である。 An expression vector of the invention will typically contain a promoter that is recognized by the host organism and is operably linked to a nucleic acid molecule encoding an anti-IFNγ antibody or antigen binding domain. Depending on the host cell used for expression and the desired protein yield, native or heterologous promoters may be used.

原核宿主で用いるのに適したプロモーターには、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。他の既知の細菌プロモーターもまた、適している。これらの配列は公表されており、それによって、当業者が、必要に応じて、必要な制限部位いずれかを供給するリンカーまたはアダプターを用いて、これらプロモーターを望ましいＤＮＡ配列（単数または複数）に連結することが可能になる。 Suitable promoters for use in prokaryotic hosts include hybrid promoters such as the beta-lactamase and lactose promoter system; the alkaline phosphatase, tryptophan (trp) promoter system; and the tac promoter. Other known bacterial promoters are also suitable. These sequences have been published so that one skilled in the art can link these promoters to the desired DNA sequence (s) using linkers or adapters that supply any of the necessary restriction sites, as needed. It becomes possible to do.

酵母宿主で用いるのに適したプロモーターもまた、当該技術分野に周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに、好適に用いられる。哺乳動物宿主細胞で用いるのに適したプロモーターが周知であり、そしてポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ・パピローマウイルス、鳥・肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサル・ウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが含まれる。他の適切な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば熱ショックプロモーターおよびアクチン・プロモーターが含まれる。 Suitable promoters for use with yeast hosts are also well known in the art. Yeast enhancers are preferably used together with yeast promoters. Suitable promoters for use in mammalian host cells are well known and include polyoma virus, fowlpox virus, adenovirus (such as adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus , Hepatitis B virus, and most preferably derived from the genome of a virus such as simian virus 40 (SV40). Other suitable mammalian promoters include heterologous mammalian promoters such as heat shock promoters and actin promoters.

本発明の選択的結合剤を発現するのに使用可能なさらなるプロモーターには、限定されるわけではないが：ＳＶ４０初期プロモーター領域；ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：３０４−３１０（１９８１）、ＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列（ｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ）に含有されるプロモーター；Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ，２２：７８７−７９７（１９８０）、ヘルペス・チミジンキナーゼ・プロモーター；Ｗａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８：１４４−１４４５（１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２９６：３９−４２（１９８２）、ベータ−ラクタマーゼ・プロモーターなどの原核生物発現ベクター；Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３７３１（１９７８）、またはｔａｃプロモーター；ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５（１９８３）が含まれる。 Additional promoters that can be used to express the selective binding agents of the present invention include, but are not limited to: SV40 early promoter region; Bernist and Chamber, Nature, 290 : 304-310 (1981), CMV promoter. , A promoter contained in the 3 ′ terminal repeat of Rous sarcoma virus; Yamamoto et al., Cell, 22 : 787-797 (1980), herpes thymidine kinase promoter; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 78 : 144-1445 (1981), regulatory sequences of the metallothionein gene; Brinster et al., Nature, 296 : 39-42 (1982), prokaryotic expression vectors such as the beta-lactamase promoter; Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 75 : 3727-3731 (1978), or tac promoter; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80 : 21-25 (1983).

やはり重要なのは、組織特異性を有し、そしてトランスジェニック動物において利用されてきている、以下の動物転写調節領域である：膵臓腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子調節領域；Ｓｗｉｆｔら，Ｃｅｌｌ，３８：６３９−６４６（１９８４）；Ｏｒｎｉｔｚら，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，７：４２５−５１５（１９８７）、膵臓ベータ細胞で活性であるインスリン遺伝子調節領域；Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：１１５−１２２（１９８５）、リンパ球で活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域；Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，Ｃｅｌｌ，３８：６４７−６５８（１９８４）；Ａｄａｍｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３１８：５３３−５３８（１９８５）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−１４４４（１９８７）、精巣細胞、***細胞、リンパ球およびマスト細胞で活性であるマウス乳腺腫瘍ウイルス調節領域；Ｌｅｄｅｒら，Ｃｅｌｌ，４５：４８５−４９５（１９８６）、肝臓で活性であるアルブミン遺伝子調節領域；Ｐｉｎｋｅｒｔら，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌ．，１：２６８−２７６（１９８７）、肝臓で活性であるアルファ・フェトプロテイン遺伝子調節領域；Ｋｒｕｍｌａｕｆら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−１６４８（１９８５）；Ｈａｍｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：５３−５８（１９８７）、肝臓で活性であるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子調節領域；Ｋｅｌｓｅｙら，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌ．，１：１６１−１７１（１９８７）；骨髄細胞で活性であるベータ−グロビン遺伝子調節領域；Ｍｏｇｒａｍら，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３３８−３４０（１９８５）；Ｋｏｌｌｉａｓら，Ｃｅｌｌ，４６：８９−９４（１９８６）、脳のオリゴデンドロサイトで活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域；Ｒｅａｄｈｅａｄら，Ｃｅｌｌ，４８：７０３−７１２（１９８７）、骨格筋で活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域；Ｓａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：２８３−２８６（１９８５）、および視床下部で活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域；Ｍａｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：１３７２−１３７８（１９８６）。 Also important are the following animal transcriptional regulatory regions that have tissue specificity and have been utilized in transgenic animals: the elastase I gene regulatory region active in pancreatic acinar cells; Swift et al., Cell, 38 : 639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 : 399-409 (1986); MacDonald, Hepatology, 7 : 425-515 (1987), insulin gene regulatory region active in pancreatic beta cells; Hanahan, Nature, 315 : 115-122 (1985), on lymphocytes Active immunoglobulin gene regulatory regions; Grosschedl et al., Cell, 38 : 647-658 (1984); Adames et al., Nature, 318 : 533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell. Biol. , 7 : 1436-1444 (1987), mouse mammary tumor virus regulatory region active in testis cells, breast cells, lymphocytes and mast cells; Leder et al., Cell, 45 : 485-495 (1986), active in liver Certain albumin gene regulatory regions; Pinkert et al., Genes and Devel. , 1 : 268-276 (1987), the alpha-fetoprotein gene regulatory region active in the liver; Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. , 5 : 1639-1648 (1985); Hammer et al., Science, 235 : 53-58 (1987), alpha 1-antitrypsin gene regulatory region active in the liver; Kelsey et al., Genes and Devel. 1, 161-171 (1987); beta-globin gene regulatory region active in bone marrow cells; Mogram et al., Nature, 315 : 338-340 (1985); Kollias et al., Cell, 46 : 89-94 (1986). , Myelin basic protein gene regulatory region active in brain oligodendrocytes; Readhead et al., Cell, 48 : 703-712 (1987), Myosin light chain-2 gene regulatory region active in skeletal muscle; Sani, Nature , 314 : 283-286 (1985), and the gonadotropin releasing hormone gene regulatory region that is active in the hypothalamus; Mason et al., Science, 234 : 1372-1378 (1986).

エンハンサー配列をベクターに挿入して、真核宿主細胞において転写を増加させることも可能である。哺乳動物遺伝子で利用可能ないくつかのエンハンサー配列が知られる（例えばグロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェト−プロテインおよびインスリン）。しかし、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーター・エンハンサー、ポリオーマ・エンハンサー、およびアデノウイルス・エンハンサーは、真核プロモーター活性化のための典型的な増進要素である。エンハンサーは、ポリペプチドコード領域の５’または３’の位で、ベクターにスプライシングすることも可能であるが、典型的には、プロモーターの５’の部位に位置する。 Enhancer sequences can be inserted into the vector to increase transcription in eukaryotic host cells. Several enhancer sequences that are available in mammalian genes are known (eg globin, elastase, albumin, alpha-feto-protein and insulin). Typically, however, virus-derived enhancers will be used. The SV40 enhancer, cytomegalovirus early promoter enhancer, polyoma enhancer, and adenovirus enhancer are typical enhancement elements for eukaryotic promoter activation. Enhancers can be spliced into the vector at the 5 'or 3' position of the polypeptide coding region, but are typically located at the 5 'site of the promoter.

本発明を実施するための好ましいベクターは、細菌細胞、昆虫細胞、および哺乳動物宿主細胞と適合するものである。こうしたベクターには、とりわけ、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州サンディエゴ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラホヤ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）、ｐＧＥＸ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）、ｐＤＳＲ−アルファ（ＰＣＲ公報第ＷＯ９０／１４３６３）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）が含まれる。 Preferred vectors for practicing the present invention are those that are compatible with bacterial cells, insect cells, and mammalian host cells. Such vectors include, among others, pCRII, pCR3, and pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla, CA), pET15 (Novagen, Madison, Wis.), PGEX (Pharmacia Biotech, NJ) Piscataway), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), PETL (BlueBacII; Invitrogen, Carlsbad, Calif.), PDSR-alpha (PCR Publication No. WO90 / 14363) and pFastBacDual (Gibco / BRL, Grand Island, NY) included.

さらなる可能なベクターには、限定されるわけではないが、コスミド、プラスミドまたは修飾ウイルスが含まれるが、ベクター系は、選択した宿主細胞に適合しなければならない。こうしたベクターには、限定されるわけではないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（ＣｏｌＥ１に基づく高コピー数ファージミド、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．、カリフォルニア州ラホヤ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えばＴＯＰＯ^ＴＭＴＡクローニング（登録商標）キット、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）、および哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはウイルスベクター、例えばバキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）が含まれる。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、または他の既知の技術を介して、宿主細胞に導入可能である。 Further possible vectors include, but are not limited to, cosmids, plasmids or modified viruses, but the vector system must be compatible with the selected host cell. Such vectors include, but are not limited to, Bluescript® plasmid derivatives (ColE1-based high copy number phagemids, Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla, Calif.), Designed for cloning Taq amplified PCR products. PCR cloning plasmids (eg TOPO ^™ TA Cloning® kit, PCR2.1® plasmid derivatives, Invitrogen, Carlsbad, CA), and mammalian, yeast or viral vectors, eg baculovirus expression System (pBacPAK plasmid derivative, Clontech, Palo Alto, Calif.). Recombinant molecules can be introduced into host cells via transformation, transfection, infection, electroporation, or other known techniques.

本発明の宿主細胞は、原核宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または真核宿主細胞（例えば酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であることも可能である。宿主細胞は、適切な条件下で培養すると、本発明の抗体または抗原結合ドメインを発現し、これを続いて培地から収集する（宿主細胞がこれらを培地に分泌する場合）か、またはこれらを産生する宿主細胞から直接収集する（これらが分泌されない場合）ことも可能である。適切な宿主細胞の選択は、望ましい発現レベル、活性に望ましいかまたは必要なポリペプチド修飾、例えばグリコシル化またはリン酸化、および生物学的活性分子にフォールディングするのが容易であることなどの多様な要因に応じるであろう。 The host cells of the invention can also be prokaryotic host cells (eg, E. coli) or eukaryotic host cells (eg, yeast cells, insect cells, or vertebrate cells). When host cells are cultured under appropriate conditions, they express the antibodies or antigen binding domains of the invention and subsequently collect them from the medium (if the host cells secrete them into the medium) or produce them. It is also possible to collect directly from the host cells (if they are not secreted). The selection of the appropriate host cell will depend on a variety of factors such as the desired level of expression, polypeptide modifications desirable or necessary for activity, such as glycosylation or phosphorylation, and ease of folding into biologically active molecules. Will respond.

いくつかの適切な宿主細胞が当該技術分野に知られ、そして多くがアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサスから入手可能である。例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＣＨＯＤＨＦＲ細胞；Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：４２１６−４２２０（１９８０）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞または２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、あるいは３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）などの哺乳動物細胞が含まれる。形質転換、培養、増幅、スクリーニング、並びに産物産生および産物精製に適した哺乳動物宿主細胞および方法の選択は当該技術分野に知られる。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）およびＣＯＳ−７細胞株（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６５１）、およびＣＶ−１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）である。さらなる典型的な哺乳動物宿主細胞には、霊長類細胞株およびげっ歯類細胞株が含まれ、形質転換細胞株が含まれる。正常な二倍体細胞、初代組織のｉｎｖｉｔｒｏ培養から得られる細胞株とともに、初代外植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子の遺伝子型が不完全であることも可能であるし、また優性に作用する選択遺伝子を含有することも可能である。他の適切な哺乳動物細胞株には、限定されるわけではないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓマウス、Ｂａｌｂ−ｃマウスまたはＮＩＨマウス由来の３Ｔ３細胞株、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞株が含まれ、これらはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州マナサス）から入手可能である。これら細胞株は各々、タンパク質発現の技術分野の当業者に知られ、そして入手可能である。 A number of suitable host cells are known in the art, and many are available from the American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. Examples include Chinese hamster ovary cells (CHO) (ATCC number CCL61), CHO DHFR cells; Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 4216-4220 (1980), mammalian cells such as human embryonic kidney (HEK) 293 cells or 293T cells (ATCC number CRL 1573), or 3T3 cells (ATCC number CCL92). The selection of mammalian host cells and methods suitable for transformation, culture, amplification, screening, and product production and product purification are known in the art. Other suitable mammalian cell lines are the monkey COS-1 (ATCC number CRL1650) and COS-7 cell lines (ATCC No. CRL1651), and the CV-1 cell line (ATCC number CCL70). Further exemplary mammalian host cells include primate cell lines and rodent cell lines, including transformed cell lines. Primary explants are also suitable, along with normal diploid cells, cell lines obtained from in vitro culture of primary tissues. Candidate cells can be incomplete in the genotype of the selection gene, or can contain a selection gene that acts dominantly. Other suitable mammalian cell lines include, but are not limited to, 3T3 cells from mouse neuroblastoma N2A cells, HeLa cells, mouse L-929 cells, Swiss mice, Balb-c mice or NIH mice. Strains, BHK or HaK hamster cell lines, which are available from the American Type Culture Collection (Manassas, VA). Each of these cell lines is known and available to those skilled in the art of protein expression.

本発明に適した宿主細胞として、同様に有用であるのは、細菌細胞である。例えば、大腸菌の多様な株（例えばＨＢ１０１（ＡＴＣＣ番号３３６９４）、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８））は、バイオテクノロジーの分野で、宿主細胞として周知である。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、他のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種等の多様な株もまた、この方法で使用可能である。 Also useful as host cells suitable for the present invention are bacterial cells. For example, various strains of E. coli (eg, HB101 (ATCC number 33694), DH5α, DH10, and MC1061 (ATCC number 53338)) are well known as host cells in the field of biotechnology. Various strains such as B. subtilis, Pseudomonas species, other Bacillus species, and Streptomyces species can also be used in this method.

当業者に知られる酵母細胞の多くの株もまた、本発明のポリペプチドを発現するための宿主細胞として、入手可能である。好ましい酵母細胞には、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓａｅ）が含まれる。 Many strains of yeast cells known to those skilled in the art are also available as host cells for expressing the polypeptides of the invention. Preferred yeast cells include, for example, Saccharomyces cerevisiae.

さらに、望ましい場合、本発明の方法には、昆虫細胞系が利用可能である。こうした系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−８１７（１９９３）、Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４：５６４−５７２（１９９３）およびＬｕｃｋｌｏｗら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−４５７９（１９９３）に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）である。 In addition, insect cell lines are available for the methods of the invention, if desired. Such systems are described, for example, by Kitts et al., Biotechniques, 14 : 810-817 (1993), Luclow, Curr. Opin. Biotechnol. 4, 564-572 (1993) and Luclow et al., J. MoI. Virol. 67 : 4566-4579 (1993). Preferred insect cells are Sf-9 and Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

抗ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子の、選択した宿主細胞への形質転換またはトランスフェクションは、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法またはＤＥＡＥデキストラン法などの方法を含む、周知の方法によって達成可能である。選択される方法は、部分的に、用いる宿主細胞の種類と相関関係にあるであろう。これらの方法および他の適切な方法が当業者に周知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記に示される。 Transformation or transfection of a nucleic acid molecule encoding an anti-IFNγ antibody or antigen binding domain into a selected host cell can be accomplished by methods such as the calcium chloride method, electroporation method, microinjection method, lipofection method or DEAE dextran method. This can be achieved by well-known methods. The method chosen will depend, in part, on the type of host cell used. These and other suitable methods are well known to those skilled in the art and are shown, for example, in Sambrook et al., Supra.

トランスジェニック動物を使用して、グリコシル化選択的結合剤、例えば抗体および抗原結合ドメインを発現することも可能である。例えば、ミルクを産生するトランスジェニック動物（例えばウシまたはヤギ）を用いて、そして動物のミルク中にグリコシル化された結合剤を得ることも可能である。あるいは、植物を用いて、グリコシル化された選択的結合剤を産生することも可能である。 Transgenic animals can also be used to express glycosylation selective binding agents such as antibodies and antigen binding domains. For example, it is also possible to obtain a glycosylated binding agent using a milk-producing transgenic animal (eg cow or goat) and in the animal's milk. Alternatively, plants can be used to produce glycosylated selective binding agents.

当業者に周知の標準的培地を用いて、ＩＦＮγの選択的結合剤をコードする発現ベクターを含む（すなわち形質転換されたかまたはトランスフェクションされた）宿主細胞を培養してもよい。培地は、通常、細胞の増殖および生存に必要なすべての栄養素を含有するであろう。大腸菌細胞を培養するのに適した培地は、例えば、ルリア・ブロス（ＬＢ）および／またはテリフィック・ブロス（ＴＢ）である。真核細胞を培養するのに適した培地は、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭであり、これらすべてには、培養中の特定の細胞株に必要とされるような血清および／または増殖因子を補うことも可能である。昆虫培養に適した培地は、必要に応じて、イーストレート、ラクトアルブミン加水分解物、および／またはウシ胎児血清を補ったグレース培地である。 Standard media well known to those skilled in the art may be used to culture host cells containing (ie, transformed or transfected) expression vectors encoding a selective binding agent for IFNγ. The medium will usually contain all the nutrients necessary for cell growth and survival. A suitable medium for culturing E. coli cells is, for example, Luria Broth (LB) and / or Terrific Broth (TB). Suitable media for culturing eukaryotic cells are RPMI 1640, MEM, DMEM, all of which may be supplemented with serum and / or growth factors as required for the particular cell line being cultured. Is possible. A suitable medium for insect culture is Grace's medium supplemented with yeastrate, lactalbumin hydrolyzate, and / or fetal bovine serum, as appropriate.

典型的には、トランスフェクション細胞および形質転換細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、培地の補充剤として添加される。使用すべき化合物は、宿主細胞を形質転換するプラスミド上に存在する選択可能マーカー要素によって、決定されるであろう。例えば、選択可能マーカー要素が、カナマイシン耐性である場合、培地に添加される化合物はカナマイシンであろう。選択的増殖のための他の化合物には、アンピシリン、テトラサイクリンおよびネオマイシンが含まれる。 Typically, antibiotics or other compounds useful for selective growth of transfected and transformed cells are added as media supplements. The compound to be used will be determined by the selectable marker element present on the plasmid that transforms the host cell. For example, if the selectable marker element is kanamycin resistant, the compound added to the medium will be kanamycin. Other compounds for selective growth include ampicillin, tetracycline and neomycin.

当該技術分野に知られる標準法を用いて、宿主細胞に産生される抗ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインの量を評価することも可能である。こうした方法には、限定なしに、ウェスタンブロット解析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降、および／または活性アッセイが含まれる。 It is also possible to assess the amount of anti-IFNγ antibody or antigen binding domain produced in the host cell using standard methods known in the art. Such methods include, without limitation, Western blot analysis, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, non-denaturing gel electrophoresis, HPLC separation, immunoprecipitation, and / or activity assays.

細胞培地に分泌されている抗ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインの精製は、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、分取用ゲル電気泳動または等電点電気泳動、クロマトフォーカシング、および高圧液体クロマトグラフィーを含む、多様な技術を用いて、達成可能である。例えば、Ｆｃ領域に選択的に結合するプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、Ｆｃ領域を含む抗体を好適に精製することも可能である。カルボキシル末端またはアミノ末端いずれかの、ヘキサヒスチジン、あるいはＦＬＡＧ（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋＣｏ．、コネチカット州ニューヘブン）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの他の小ペプチドなどのアフィニティータグを用いて、抗体または抗原結合ドメインの修飾型を調製し、そして一工程アフィニティーカラムによって精製することも可能である。例えば、ポリヒスチジンは、高い親和性および特異性でニッケルに結合し、したがってニッケルのアフィニティーカラム（例えばＱｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）を、ポリヒスチジンでタグ化した選択的結合剤の精製に用いることも可能である；例えばＡｕｓｕｂｅｌら監修，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，セクション１０．１１．８，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９３）を参照されたい。いくつかの例では、１より多い精製工程が必要である可能性もある。 Purification of the anti-IFNγ antibody or antigen-binding domain secreted in the cell culture medium can be performed by affinity chromatography, immunoaffinity chromatography or ion exchange chromatography, molecular sieve chromatography, preparative gel electrophoresis or isoelectric focusing. Achievable using a variety of techniques, including chromatofocusing, and high pressure liquid chromatography. For example, an antibody containing an Fc region can be suitably purified by affinity chromatography using protein A that selectively binds to the Fc region. Using affinity tags such as hexahistidine, or FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.) Or other small peptides such as myc (Invitrogen), either carboxyl- or amino-terminal, It is also possible to prepare a modified form and purify by a one-step affinity column. For example, polyhistidine binds to nickel with high affinity and specificity, so a nickel affinity column (eg, Qiagen® nickel column) should be used to purify selective binding agents tagged with polyhistidine. See, eg, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993). In some instances, more than one purification step may be required.

原核宿主細胞で発現される本発明の選択的結合剤は、細胞膜周辺腔または細胞質いずれかで、可溶性型で、あるいは細胞内封入体の一部として、不溶性型で、存在することも可能である。選択的結合剤は、当業者に知られる標準的技術いずれかを用いて、宿主細胞から抽出することも可能である。例えば、フレンチプレス、ホモジナイズ、および／または超音波処理の後、遠心分離することによって、宿主細胞を溶解して、周辺質／細胞質の内容物を放出させることも可能である。 The selective binding agents of the invention expressed in prokaryotic host cells can exist in soluble form, either in the periplasmic space or in the cytoplasm, or in insoluble form as part of intracellular inclusions. . The selective binding agent can also be extracted from the host cell using any standard technique known to those skilled in the art. For example, the host cells can be lysed to release periplasmic / cytoplasmic contents by centrifugation after French press, homogenization, and / or sonication.

当該技術分野に知られる方法を用いて、細胞質に存在するか、または細胞膜周辺腔から放出されるか、いずれかの抗ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインの可溶性型をさらに精製することも可能であり、例えば浸透圧ショック技術によって、細菌細胞膜周辺腔からＦａｂ断片を放出させる。抗体または抗原結合ドメインが、封入体を形成した場合、これらはしばしば、内部細胞膜および／または外部細胞膜に結合することも可能であり、そしてしたがって、遠心分離後、主にペレット成分中に見られるであろう。次いで、ペレット成分を、アルカリｐＨではジチオスレイトールなどの還元剤の存在下で、または酸ｐＨではＴｒｉｓカルボキシエチルホスフィンなどの還元剤の存在下で、極端なｐＨで処理するか、あるいは界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体などのカオトロピック剤で処理して、封入体を放出させ、粉々にし、そして可溶化することも可能である。次いで、ゲル電気泳動、免疫沈降等を用いて、可溶性選択的結合剤を解析することも可能である。可溶化抗体または抗原結合ドメインを単離することが望ましい場合、以下に示す方法およびＭａｒｓｔｏｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−２７５（１９９０）に示される方法などの標準法を用いて、単離を達成することも可能である。 Using methods known in the art, it is also possible to further purify soluble forms of either anti-IFNγ antibodies or antigen binding domains that are present in the cytoplasm or released from the periplasmic space, For example, Fab fragments are released from the bacterial cell periplasmic space by osmotic shock techniques. When antibodies or antigen binding domains form inclusion bodies, they are often also able to bind to the inner and / or outer cell membrane and are therefore found primarily in the pellet component after centrifugation. I will. The pellet component is then treated at an extreme pH in the presence of a reducing agent such as dithiothreitol at alkaline pH or in the presence of a reducing agent such as Tris carboxyethylphosphine at acid pH, or a surfactant. Can be treated with a chaotropic agent such as guanidine, guanidine derivatives, urea, or urea derivatives to release, break up and solubilize inclusion bodies. The soluble selective binding agent can then be analyzed using gel electrophoresis, immunoprecipitation or the like. Where it is desirable to isolate a solubilized antibody or antigen binding domain, the method described below and Marston et al., Meth. Enz. , 182 : 264-275 (1990), and isolation can be achieved using standard methods.

いくつかの場合、抗体または抗原結合ドメインは、単離の際には、生物学的に活性でなくてもよい。ポリペプチドを三次構造に「再フォールディング」するか、または変換して、そしてジスルフィド連結を生成するための、多様な方法を用いて、生物学的活性を回復することも可能である。こうした方法には、可溶化ポリペプチドを、通常７を超えるｐＨに、そして特定の濃度のカオトロープの存在下で、曝露することが含まれる。カオトロープの選択は、封入体可溶化に用いる選択と非常に類似であるが、通常、カオトロープは、より低い濃度で用いられ、そして可溶化に用いるカオトロープと必ずしも同一ではない。大部分の場合、再フォールディング／酸化溶液はまた、還元剤を含有するか、または還元剤に加えて特定の比で酸化型を含有して、特定の酸化還元電位を生じ、ジスルフィド・シャフリングを可能にして、タンパク質のシステイン架橋（単数または複数）の形成を生じる。通常用いられるレドックス対には、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が含まれる。多くの場合、共溶媒（ｃｏｓｏｌｖｅｎｔ）を用いることも可能であるし、また再フォールディングの効率を増加させるのに共溶媒が必要とされる可能性もあり、そしてこの目的に用いられる、より一般的な試薬には、グリセロール、多様な分子量のポリエチレングリコール、アルギニン等が含まれる。 In some cases, the antibody or antigen binding domain may not be biologically active upon isolation. A variety of methods for “refolding” or converting a polypeptide to tertiary structure and generating disulfide linkages can be used to restore biological activity. Such methods include exposing the solubilized polypeptide to a pH usually above 7 and in the presence of a specific concentration of chaotrope. The choice of chaotrope is very similar to the choice used for inclusion body solubilization, but usually the chaotrope is used at a lower concentration and is not necessarily identical to the chaotrope used for solubilization. In most cases, the refolding / oxidation solution also contains a reducing agent, or contains the oxidized form at a specific ratio in addition to the reducing agent, resulting in a specific redox potential and disulfide shuffling. Allowing the formation of cysteine bridge (s) of the protein. Commonly used redox pairs include cysteine / cystamine, glutathione (GSH) / dithiobis GSH, cupric chloride, dithiothreitol (DTT) / dithian DTT, and 2-mercaptoethanol (bME) / dithio-b (ME). Is included. In many cases, a cosolvent can be used, and a cosolvent may be required to increase the efficiency of refolding, and the more common used for this purpose. Such reagents include glycerol, polyethylene glycols of various molecular weights, arginine and the like.

本発明の抗体および抗原結合ドメインはまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５１３２（１９８５）、並びにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，イリノイ州ロックフォード（１９８４）に示されるものなどの当該技術分野に知られる技術を用いた化学合成法（例えば固相ペプチド合成）によっても調製可能である。こうしたポリペプチドを、アミノ末端にメチオニンを含み、または含まずに合成することも可能である。これらの参考文献に示される方法を用いて、化学的に合成された抗体および抗原結合ドメインを酸化して、ジスルフィド架橋を形成することも可能である。こうして調製された抗体は、天然のまたは組換えによって産生された抗ｏｐｇｂｐ抗体または抗原結合ドメインと関連する生物学的活性を少なくとも１つ保持するであろう。 The antibodies and antigen binding domains of the present invention are also described in Merrifield et al. Am. Chem. Soc. 85 : 2149 (1963); Houghten et al., Proc Natl Acad. Sci. USA, 82 : 5132 (1985), and Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co. , Rockford, Illinois (1984), and can also be prepared by chemical synthesis methods using techniques known in the art, such as those shown in the art (eg, solid phase peptide synthesis). Such polypeptides can also be synthesized with or without methionine at the amino terminus. The methods shown in these references can be used to oxidize chemically synthesized antibodies and antigen binding domains to form disulfide bridges. The antibody thus prepared will retain at least one biological activity associated with a natural or recombinantly produced anti-opgbp antibody or antigen binding domain.

ＩＦＮγの選択的結合剤に関するアッセイ
ＩＦＮγの少なくとも１つの生物学的活性を部分的にまたは完全に阻害する選択的結合剤を同定するためのスクリーニング法を本発明に提供する。ＩＦＮγの生物学的活性の阻害には、限定されるわけではないが、ＩＦＮγのその同族受容体、ＩＦＮγ−Ｒへの結合の阻害、ｉｎｖｉｔｒｏでのＡ５４９に対するＩＦＮγの抗増殖活性の阻害、並びにｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでのＩＦＮγによる単球の活性化の阻害が含まれる。本発明の選択的結合剤には、抗ＩＦＮγ抗体、並びにその断片、変異体、誘導体および融合体、ペプチド、ペプチド模倣体化合物または有機模倣体（ｏｒｇａｎｏ−ｍｉｍｅｔｉｃ）化合物が含まれる。ＩＦＮγの生物学的活性を部分的にまたは完全に阻害可能な選択的結合剤を同定するためのスクリーニング法には、ｉｎｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎｖｉｖｏアッセイが含まれることも可能である。ｉｎｖｉｔｒｏアッセイには、ＩＦＮγのＩＦＮγ−Ｒへの結合を検出するものが含まれ、そしてこうしたアッセイを用いて、ＩＦＮγのＩＦＮγ−Ｒへの結合の速度または度合いを増加させるかまたは減少させる能力に関して、ＩＦＮγの選択的結合剤をスクリーニングすることも可能である。１つの種類のアッセイでは、ＩＦＮγポリペプチド、好ましくは細胞外ドメインなどのＩＦＮγの可溶性型を固体支持体（例えばアガロースまたはアクリルビーズ）に固定し、そしてＩＦＮγ−Ｒポリペプチドを、ＩＦＮγの選択的結合剤の存在下または非存在下いずれかで添加する。選択的結合剤の存在下または非存在下でＩＦＮγおよびＩＦＮγ−Ｒの結合の度合いを測定する。例えば放射標識、蛍光標識または酵素反応によって、結合を検出することも可能である。 Assays for selective binding agents of IFNγ Provided herein are screening methods for identifying selective binding agents that partially or fully inhibit at least one biological activity of IFNγ. Inhibition of biological activity of IFNγ includes, but is not limited to, inhibition of binding of IFNγ to its cognate receptor, IFNγ-R, inhibition of IFNγ's antiproliferative activity against A549 in vitro, and Inhibition of monocyte activation by IFNγ in vitro and in vivo is included. Selective binding agents of the present invention include anti-IFNγ antibodies, and fragments, variants, derivatives and fusions, peptides, peptidomimetic compounds or organic-mimic compounds thereof. Screening methods for identifying selective binding agents capable of partially or completely inhibiting the biological activity of IFNγ can include in vitro or in vivo assays. In vitro assays include those that detect binding of IFNγ to IFNγ-R, and using such assays, the ability to increase or decrease the rate or degree of binding of IFNγ to IFNγ-R. It is also possible to screen for selective binders of IFNγ. In one type of assay, a soluble form of IFNγ, preferably an extracellular domain, such as an extracellular domain, is immobilized on a solid support (eg, agarose or acrylic beads) and the IFNγ-R polypeptide is selectively bound to IFNγ. Add in the presence or absence of agent. The degree of binding of IFNγ and IFNγ-R is measured in the presence or absence of a selective binding agent. It is also possible to detect binding, for example by radiolabeling, fluorescent labeling or enzymatic reaction.

あるいは、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）などの表面プラズモン共鳴検出装置系を用いて、結合反応を行うことも可能である。結合反応は、製造者のプロトコルにしたがって、実行可能である。 Alternatively, the binding reaction can be performed using a surface plasmon resonance detector system such as a BIAcore assay system (Pharmacia, Piscataway, NJ). The binding reaction can be performed according to the manufacturer's protocol.

上述のものなどのｉｎｖｉｔｒｏアッセイを好適に用いて、ＩＦＮγのＩＦＮγ−Ｒへの結合に対する影響に関して、迅速に多数の選択的結合剤をスクリーニングすることも可能である。アッセイを自動化して、ファージ・ディスプレー・ライブラリー、合成ペプチドライブラリーおよび化学合成ライブラリーで生成される化合物をスクリーニングすることも可能である。 A number of selective binding agents can also be rapidly screened for the effect of IFNγ on binding to IFNγ-R, preferably using in vitro assays such as those described above. It is also possible to automate the assay to screen compounds generated in phage display libraries, synthetic peptide libraries and chemical synthesis libraries.

ＩＦＮγのＩＦＮγ−Ｒへの結合を増加させるかまたは減少させる選択的結合剤を、どちらかのポリペプチドを発現する細胞および細胞株を用いて、細胞培養中でスクリーニングすることもまた可能である。細胞および細胞株は、いかなる哺乳動物から得ることも可能であるが、好ましくは、ヒトまたは他の霊長類、イヌまたはげっ歯類供給源由来であろう。例えば、選択的結合剤の存在下または非存在下で、表面にＩＦＮγ−Ｒを発現している細胞に対するＩＦＮγの結合を評価して、そして例えばＩＦＮγに対するビオチン化抗体を用いたフローサイトメトリーによって、結合の度合いを測定することも可能である。 It is also possible to screen in cell culture for selective binding agents that increase or decrease the binding of IFNγ to IFNγ-R using cells and cell lines that express either polypeptide. Cells and cell lines can be obtained from any mammal, but preferably will be from a human or other primate, dog or rodent source. For example, assessing the binding of IFNγ to cells expressing IFNγ-R on the surface in the presence or absence of a selective binding agent and, eg, by flow cytometry using a biotinylated antibody to IFNγ It is also possible to measure the degree of binding.

ｉｎｖｉｔｒｏ活性アッセイを用いて、ＩＦＮγ活性を阻害する選択的結合剤を同定することもまた可能である。アッセイの例には、Ａ５４９細胞増殖アッセイおよびＴＨＰ−１ＨＬＡ−ＤＲ発現アッセイが含まれる。 It is also possible to identify selective binding agents that inhibit IFNγ activity using in vitro activity assays. Examples of assays include the A549 cell proliferation assay and the THP-1 HLA-DR expression assay.

選択的結合剤が、ＮＺＢｘＮＺＷＦ１マウスモデルにおいて、タンパク尿の発生を遅延させ、そして生存時間を増加させることが可能であるかどうかを決定するため、ｉｎｖｉｖｏアッセイもまた利用可能である。 In vivo assays are also available to determine whether selective binding agents can delay the development of proteinuria and increase survival time in the NZBxNZW F1 mouse model.

診断適用のため、特定の態様において、ＩＦＮγの選択的結合剤、例えば抗体およびその抗原結合ドメインを、典型的には、検出可能部分で標識する。検出可能部分は、直接または間接的に、検出可能シグナルを産生可能なものいずれであってもよい。例えば、検出可能部分は、放射性同位体、例えば^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、または^１２５Ｉ、蛍光化合物または化学発光化合物、例えばフルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリン；あるいは酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼであってもよい；Ｂａｙｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８４：１３８−１６３（１９９０）。 For diagnostic applications, in certain embodiments, selective binding agents for IFNγ, such as antibodies and antigen binding domains thereof, are typically labeled with a detectable moiety. The detectable moiety may be any capable of producing a detectable signal, either directly or indirectly. For example, the detectable moiety can be a radioisotope, such as ³ H, ¹⁴ C, ³² P, ³⁵ S, or ¹²⁵ I, a fluorescent or chemiluminescent compound such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine, or luciferin; or an enzyme such as It may be alkaline phosphatase, β-galactosidase or horseradish peroxidase; Bayer et al., Meth. Enz. , 184 : 138-163 (1990).

本発明の選択的結合剤は、いかなる既知のアッセイ法で使用することも可能であり、こうした方法には、例えばＩＦＮγポリペプチドを検出し、そして定量化するための、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および免疫沈降アッセイがある（Ｓｏｌａ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９８７））。抗体は、使用中のアッセイ法に適した親和性で、ＩＦＮγポリペプチドに結合するであろう。 The selective binding agents of the invention can be used in any known assay method, including, for example, radioimmunoassays, competitive binding assays, to detect and quantify IFNγ polypeptides. , Direct and indirect sandwich assays (ELISA), and immunoprecipitation assays (Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Technologies, pp. 147-158 (CRC Press, 1987)). The antibody will bind to the IFNγ polypeptide with an affinity suitable for the assay in use.

本発明の選択的結合剤はまた、ｉｎｖｉｖｏ画像化にも有用であり、ここで、例えば検出可能部分で標識した選択的結合剤を、動物の好ましくは血流中に投与し、そして宿主中の標識抗体の存在および位置をアッセイする。剤を、核磁気共鳴によってであれ、放射線によってであれ、または当該技術分野に知られる他の手段によってであれ、動物中で検出可能ないずれの部分で標識することも可能である。 The selective binding agents of the present invention are also useful for in vivo imaging, wherein, for example, a selective binding agent labeled with a detectable moiety is administered into an animal, preferably in the bloodstream, and in a host. The presence and location of labeled antibodies are assayed. The agent can be labeled with any moiety detectable in an animal, whether by nuclear magnetic resonance, by radiation, or by other means known in the art.

本発明はまた、抗体または抗原結合ドメインなどのＩＦＮγの選択的結合剤、および生物学的試料中のＩＦＮγレベルを検出するのに有用な他の試薬を含むキットにも関する。こうした試薬には、二次活性、検出可能標識、ブロッキング血清、陽性対照試料および陰性対照試料、および検出試薬が含まれることも可能である。 The invention also relates to kits comprising a selective binding agent of IFNγ, such as an antibody or antigen binding domain, and other reagents useful for detecting IFNγ levels in a biological sample. Such reagents can include secondary activity, detectable label, blocking serum, positive and negative control samples, and detection reagents.

ＩＦＮγ選択的結合剤の療法使用
本発明の選択的結合剤は、療法剤として使用可能である。療法選択的結合剤は、ＩＦＮγアゴニストまたはアンタゴニストであることも可能であり、そして１つの態様において、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏでＩＦＮγポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを阻害する抗ＩＦＮγアンタゴニスト抗体である。例えば、ＩＦＮγのアンタゴニストは、ＩＦＮγのＩＦＮγ−Ｒへの結合を阻害するであろう。あるいは、ＩＦＮγアンタゴニストは、実施例１に記載するものなどのＡ５４９細胞増殖アッセイにおいて、測定可能なＮＤ５０（５０％増殖を生じる濃度）によって示されるようなｉｎｖｉｔｒｏでのヒト肺癌の増殖を刺激するであろう。 Therapeutic use of IFNγ selective binding agents The selective binding agents of the present invention can be used as therapeutic agents. The therapy selective binding agent can also be an IFNγ agonist or antagonist, and in one embodiment, an anti-IFNγ antagonist antibody that inhibits at least one of the biological activities of an IFNγ polypeptide in vitro or in vivo. It is. For example, an antagonist of IFNγ will inhibit the binding of IFNγ to IFNγ-R. Alternatively, IFNγ antagonists stimulate human lung cancer growth in vitro as indicated by a measurable ND50 (concentration producing 50% proliferation) in an A549 cell proliferation assay such as that described in Example 1. I will.

ＩＦＮγアンタゴニスト、例えば抗ＩＦＮγアンタゴニスト抗体および抗原結合ドメインを用いて、限定されるわけではないが、以下の：急性膵炎；ＡＬＳ；アルツハイマー病；ＡＩＤＳ誘導悪疫質を含む悪疫質／摂食障害；喘息および他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；慢性疲労症候群；クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）関連下痢を含むクロストリジウム属関連疾病；うっ血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全（例えば敗血症に関連するもの）、および冠状動脈バイパス移植を含む冠状動脈状態および徴候；癌、例えば多発性骨髄腫、並びに骨髄性白血病（例えばＡＭＬおよびＣＭＬ）および他の白血病とともに腫瘍転位；発熱；糸球体腎炎；移植片対宿主病／移植拒絶；出血性ショック；例えば角膜移植に関与することもありうるような、炎症性眼疾患；脳虚血（例えば、各々神経変性につながりうる、外傷、癲癇、出血または脳卒中などの結果の脳傷害）を含む虚血；学習障害；多発性硬化症；筋障害（例えば筋タンパク質代謝、特に敗血症におけるもの）；神経毒性（例えばＨＩＶに誘導されるようなもの）；骨粗鬆症；癌関連疼痛を含む疼痛；パーキンソン病；歯周病；神経毒性；早期陣痛；乾癬；再灌流傷害；敗血症ショック；放射療法の副作用；顎関節疾患；睡眠障害；ブドウ膜炎；または挫傷（ｓｔｒａｉｎ）、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形手術、感染もしくは他の疾患過程から生じる炎症状態；若年発症１型糖尿病およびインスリン耐性糖尿病（例えば肥満に関連するようなもの）を含む糖尿病；子宮内膜症、子宮内膜炎、および関連状態；線維筋痛症または痛覚脱失症；痛覚過敏；クローン病を含む炎症性腸疾患；肺疾患（例えば成人呼吸困難症候群、および肺線維症）；神経炎症性疾患；眼変性およびブドウ膜炎を含む、眼疾患および状態；毛孔性紅色粃糠疹（ＰＲＰ）；前立腺炎（細菌性または非細菌性）および関連状態；乾癬および関連状態；肺線維症；再灌流傷害；骨関節炎、関節リウマチ、若年性（リウマチ様）関節炎、血清陰性多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群および反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、腸疾患に基づく関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、脈管炎（例えば川崎病）、脳脈管炎、ライム病、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）誘導（「敗血症」）関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎およびリウマチ性多発性筋痛および巨細胞性動脈炎を含む、関節の炎症状態およびリウマチ疾患；敗血症ショック；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）腎炎；放射療法による副作用；顎関節疾患；甲状腺炎；組織移植、または挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、および整形手術から生じる炎症状態を含む、自己免疫疾患および炎症状態を防止するかまたは治療することも可能である。 IFNγ antagonists, such as anti-IFNγ antagonist antibodies and antigen binding domains, include but are not limited to the following: acute pancreatitis; ALS; Alzheimer's disease; Other pulmonary diseases; atherosclerosis; chronic fatigue syndrome; Clostridium-related diseases including Clostridium-related diarrhea; congestive heart failure, coronary restenosis, myocardial infarction, myocardial dysfunction (eg, associated with sepsis) ), And coronary artery status and signs including coronary artery bypass grafts; tumor metastasis with cancer, eg multiple myeloma, and myeloid leukemia (eg AML and CML) and other leukemias; fever; glomerulonephritis; Anti-host disease / transplant rejection; hemorrhagic shock; eg corneal translocation Inflammatory eye diseases that may be involved in transplantation; ischemia including cerebral ischemia (eg, brain injury resulting in trauma, hemorrhoids, bleeding or stroke, each of which can lead to neurodegeneration); learning disorders Multiple sclerosis; myopathy (eg, in muscle protein metabolism, especially in sepsis); neurotoxicity (eg, as induced by HIV); osteoporosis; pain including cancer-related pain; Parkinson's disease; periodontal disease; Neurotoxicity; early labor; psoriasis; reperfusion injury; septic shock; side effects of radiation therapy; temporomandibular disorders; sleep disorders; uveitis; or strain, sprains, cartilage damage, trauma, plastic surgery, infection or others Inflammatory conditions resulting from various disease processes; diabetes, including juvenile-onset type 1 diabetes and insulin-resistant diabetes (such as those associated with obesity); endometriosis, endometritis, Fibromyalgia or analgesia; hyperalgesia; inflammatory bowel disease including Crohn's disease; lung disease (eg adult dyspnea syndrome and pulmonary fibrosis); neuroinflammatory disease; ocular degeneration and grapes Eye diseases and conditions, including membranitis; pore erythema (PRP); prostatitis (bacterial or non-bacterial) and related conditions; psoriasis and related conditions; pulmonary fibrosis; reperfusion injury; Rheumatoid arthritis, juvenile (rheumatic) arthritis, seronegative polyarthritis, ankylosing spondylitis, Reiter syndrome and reactive arthritis, Still's disease, psoriatic arthritis, arthritis based on intestinal disease, polymyositis, dermatomyositis, strong Dermatosis, systemic sclerosis, vasculitis (eg Kawasaki disease), cerebral vasculitis, Lyme disease, staphylococcal induction ("sepsis") arthritis, Sjogren's syndrome, rheu Inflammatory state of the joints and rheumatic diseases, including chief fever, polychondritis and rheumatic polymyalgia and giant cell arteritis; septic shock; systemic lupus erythematosus (SLE) nephritis; side effects from radiation therapy; temporomandibular joint disease Thyroiditis; it is also possible to prevent or treat autoimmune diseases and conditions, including inflammatory conditions resulting from tissue transplantation or contusions, sprains, cartilage damage, trauma, and plastic surgery.

より具体的には、ＩＦＮγアンタゴニスト、例えば抗ＩＦＮγアンタゴニスト抗体および抗原結合ドメインを用いて、関節炎（特に関節リウマチ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、多発性硬化症および糖尿病を防止するかまたは治療することも可能である。 More specifically, using IFNγ antagonists, such as anti-IFNγ antagonist antibodies and antigen binding domains, arthritis (especially rheumatoid arthritis), systemic lupus erythematosus (SLE), graft-versus-host disease (GvHD), multiple sclerosis and It is also possible to prevent or treat diabetes.

アンタゴニスト抗体および抗原結合ドメインを含む、本発明のＩＦＮγアンタゴニストを、単独で、または抗ＩＦＮγアンタゴニスト抗体および抗原結合ドメインなどの他の療法剤ＩＦＮγアンタゴニストと組み合わせて投与して、これらを用いて、多様な炎症状態、自己免疫状態、および骨損失につながる他の状態を防止するかまたは治療することも可能である。状態および望ましい治療レベルに応じて、２、３、またはそれより多い剤を投与することも可能である。同一処方に含むか、または治療キットに含むことによって、これらの剤をともに提供することも可能であり、あるいは別個に提供することも可能である。遺伝子治療によって投与する際、タンパク質剤をコードする遺伝子を、所望によって同一プロモーター領域の制御下で同一ベクターに含めてもよいし、または別個のベクターに含めてもよい。前述の種類の特に好ましい分子は以下のとおりである。
・ＩＬ−１阻害剤：ＩＬ−１ｒａタンパク質および可溶性ＩＬ−１受容体。最も好ましいＩＬ−１阻害剤はアナキンラである。
・ＴＮＦ−α阻害剤：可溶性腫瘍壊死因子Ｉ型受容体（ｓＴＮＦ−ＲＩ；−ＲＩはまた、ｐ５５受容体とも呼ばれる）；可溶性腫瘍壊死因子ＩＩ型受容体（ｐ７５受容体とも呼ばれる）；およびＴＮＦ受容体に結合するモノクローナル抗体。最も好ましいのは、ＷＯ９８／２４４６３に記載されるようなｓＴＮＦ−ＲＩ、エタネルセプト（エンブレル（登録商標））、およびアバカイン（登録商標）である。典型的なＴＮＦ−α阻害剤は、ＥＰ４２２３３９、ＥＰ３０８３７８、ＥＰ３９３４３８、ＥＰ３９８３２７、およびＥＰ４１８０１４に記載される。
・セリンプロテアーゼ阻害剤：ＳＬＰＩ、ＡＬＰ、ＭＰＩ、ＨＵＳＩ−Ｉ、ＢＭＩ、およびＣＵＳＩ。ＳＬＰＩがＬＰＳ反応を阻害することが示されたように、これらの阻害剤を、典型的なＬＰＳ調節因子として見ることもまた可能である。Ｊｉｎら（１９９７），Ｃｅｌｌ８８（３）：４１７−２６（本明細書に援用される）。 An IFNγ antagonist of the invention comprising an antagonist antibody and an antigen binding domain can be administered alone or in combination with other therapeutic agents such as an anti-IFNγ antagonist antibody and an antigen binding domain, and used with a variety of It is also possible to prevent or treat inflammatory conditions, autoimmune conditions, and other conditions that lead to bone loss. Depending on the condition and the desired level of treatment, it is possible to administer 2, 3 or more agents. These agents can be provided together or included separately by inclusion in the same formulation or in a treatment kit. When administered by gene therapy, the gene encoding the protein agent may be included in the same vector, optionally under the control of the same promoter region, or may be included in a separate vector. Particularly preferred molecules of the aforementioned kind are:
IL-1 inhibitor: IL-1ra protein and soluble IL-1 receptor. The most preferred IL-1 inhibitor is anakinra.
TNF-α inhibitors: soluble tumor necrosis factor type I receptor (sTNF-RI; -RI is also referred to as p55 receptor); soluble tumor necrosis factor type II receptor (also referred to as p75 receptor); and TNF A monoclonal antibody that binds to the receptor. Most preferred are sTNF-RI, etanercept (Embrel®), and Abacaine® as described in WO 98/24463. Exemplary TNF-α inhibitors are described in EP 422 339, EP 308 378, EP 393 438, EP 398 327, and EP 418 014.
Serine protease inhibitors: SLPI, ALP, MPI, HOSI-I, BMI, and CUSI. These inhibitors can also be viewed as typical LPS modulators, as SLPI has been shown to inhibit LPS responses. Jin et al. (1997), Cell 88 (3): 417-26 (incorporated herein).

薬剤組成物
ＩＦＮγ選択的結合剤の薬剤組成物は、本発明の範囲内にある。こうした組成物は、療法的または予防的に有効な量のＩＦＮγ選択的結合剤、例えば抗体、あるいはその断片、変異体、誘導体または融合体を、薬学的に許容しうる剤と混合して含む。好ましい態様において、薬剤組成物は、ＩＦＮγの少なくとも１つの生物学的活性を部分的にまたは完全に阻害する抗ＩＦＮγアンタゴニスト抗体を、薬学的に許容しうる剤と混合して含む。典型的には、抗体は、動物への投与のため、十分に精製されているであろう。 Pharmaceutical Compositions Pharmaceutical compositions of IFNγ selective binding agents are within the scope of the invention. Such compositions comprise a therapeutically or prophylactically effective amount of an IFNγ selective binding agent, such as an antibody, or a fragment, variant, derivative or fusion thereof, in admixture with a pharmaceutically acceptable agent. In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition comprises an anti-IFNγ antagonist antibody that partially or completely inhibits at least one biological activity of IFNγ in admixture with a pharmaceutically acceptable agent. Typically, the antibody will be sufficiently purified for administration to animals.

本発明の組成物に使用するための薬学的に許容しうる剤には、当該技術分野に周知であるような、キャリアー、賦形剤、希釈剤、酸化防止剤、保存剤、着色剤、フレーバー剤および希釈剤、乳化剤、懸濁剤、溶媒、増量剤（ｆｉｌｌｅｒ）、充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇａｇｅｎｔ）、緩衝剤、搬送ビヒクル、等張化剤、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝化剤、抗菌剤および界面活性剤が含まれる。 Pharmaceutically acceptable agents for use in the compositions of the present invention include carriers, excipients, diluents, antioxidants, preservatives, colorants, flavors as are well known in the art. And diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents, buffers, carrier vehicles, isotonic agents, cosolvents, wetting agents, complexing agents, buffering agents , Antibacterial agents and surfactants.

中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水が、典型的な適切なキャリアーである。組成物にやはり含まれるのは、アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノースまたはデキストリン類を含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴｗｅｅｎ、プルロニック類またはポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤である。やはり例として、適切な等張化増進剤には、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトール、ソルビトール等が含まれる。適切な保存剤には、限定されるわけではないが、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェネチル・アルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸等が含まれる。過酸化水素もまた、保存剤として使用可能である。 Neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin are typical suitable carriers. Also included in the composition are antioxidants such as ascorbic acid; low molecular weight polypeptides; proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulin; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; glycine, glutamine, asparagine, arginine or Amino acids such as lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugar alcohols such as mannitol or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; and / or Tween , Nonionic surfactants such as pluronics or polyethylene glycols. Again by way of example, suitable tonicity enhancing agents include alkali metal halides (preferably sodium chloride or potassium chloride), mannitol, sorbitol, and the like. Suitable preservatives include, but are not limited to, benzalkonium chloride, thimerosal, phenethyl alcohol, methyl paraben, propyl paraben, chlorhexidine, sorbic acid, and the like. Hydrogen peroxide can also be used as a preservative.

適切な共溶媒は、例えばグリセリン、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールである。適切な錯化剤は、例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシ−プロピル−ベータ−シクロデキストリンである。適切な界面活性剤または湿潤剤には、ソルビタンエステル類、ポリソルベート８０などのポリソルベート類、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）等が含まれる。緩衝剤は、酢酸、ホウ酸、クエン酸、リン酸、炭酸水素、またはＴｒｉｓ−ＨＣｌなどの慣用的緩衝剤であることも可能である。酢酸緩衝液はｐＨ４．０〜５．５程度であることも可能であり、そしてＴｒｉｓ緩衝液はｐＨ７．０〜８．５程度であることも可能である。さらなる薬学的剤が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ監修，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、１９９０に示されており、該文献の相当する部分は、本明細書に援用される。 Suitable cosolvents are, for example, glycerin, propylene glycol, and polyethylene glycol. Suitable complexing agents are, for example, caffeine, polyvinylpyrrolidone, beta-cyclodextrin or hydroxy-propyl-beta-cyclodextrin. Suitable surfactants or wetting agents include sorbitan esters, polysorbates such as polysorbate 80, tromethamine, lecithin, cholesterol, tyloxapol and the like. The buffer may be a conventional buffer such as acetic acid, boric acid, citric acid, phosphoric acid, bicarbonate, or Tris-HCl. The acetate buffer can be about pH 4.0-5.5, and the Tris buffer can be about pH 7.0-8.5. Additional pharmaceutical agents are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.M. R. Supervised by Gennaro, Mack Publishing, 1990, the corresponding portions of which are incorporated herein by reference.

組成物は、液体型であっても、あるいは凍結乾燥型またはフリーズドライ型であってもよい。凍結乾燥型には、スクロースなどの賦形剤が含まれうる。本発明の組成物は、非経口投与に適している。好ましい態様において、組成物は、当業者に利用可能ないずれかの経路によって、例えば皮下経路、静脈内経路、筋内経路、腹腔内経路、大脳内（実質内）経路、脳室内経路、筋内経路、眼内経路、動脈内経路、または病変内経路によって、動物に注射するかまたは注入するのに適している。非経口処方は、典型的には、無菌、病原体不含の等張化水性溶液であり、所望によって薬学的に許容しうる保存剤を含有するであろう。 The composition may be liquid, lyophilized or freeze-dried. The lyophilized form may contain excipients such as sucrose. The composition of the present invention is suitable for parenteral administration. In a preferred embodiment, the composition is by any route available to those skilled in the art, for example, subcutaneous route, intravenous route, intramuscular route, intraperitoneal route, intracerebral (intraparenchymal) route, intraventricular route, intramuscular route. Suitable for injection or infusion into animals by route, intraocular route, intraarterial route, or intralesional route. Parenteral formulations are typically sterile, pathogen-free isotonic aqueous solutions that optionally contain a pharmaceutically acceptable preservative.

最適な薬剤処方は、意図される投与経路、搬送形式および望ましい投薬量に応じて、当業者が容易に決定可能である。
他の処方もまた本発明に意図される。薬剤組成物はまた、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子性調製物、またはリポソームへのＩＦＮγ選択的結合剤（抗体など）の導入も含むことも可能である。ヒアルロン酸もまた使用可能であり、そしてこの酸は、循環中にある期間の持続を促進する効果も有しうる。薬剤組成物は、ＩＦＮγ選択的結合剤（例えば抗体）と、注射可能微小球体、生体侵食性粒子またはビーズ、あるいはリポソームとの処方もまた含み、こうした処方は、選択的結合剤の制御放出または徐放を提供し、こうした処方を、次いで、蓄積注射として搬送してもよい。他の適切な搬送手段には、移植可能搬送装置が含まれる。 The optimal pharmaceutical formulation can be readily determined by one skilled in the art depending on the intended route of administration, delivery format and desired dosage.
Other formulations are also contemplated by the present invention. The pharmaceutical composition can also include particulate preparations of polymeric compounds such as polylactic acid, polyglycolic acid, or the introduction of IFNγ selective binding agents (such as antibodies) into liposomes. Hyaluronic acid can also be used, and this acid can also have the effect of promoting the duration of a period in the circulation. The pharmaceutical composition also includes a formulation of an IFNγ selective binding agent (eg, an antibody) and injectable microspheres, bioerodible particles or beads, or liposomes, which formulation provides controlled release or slow release of the selective binding agent. Such a formulation may then be delivered as a cumulative injection. Other suitable transport means include implantable transport devices.

ＩＦＮγ選択的結合剤（抗体など）を含む薬剤組成物は、吸入用の乾燥粉末としても処方可能である。こうした吸入溶液はまた、エアロゾル搬送用の液化噴霧剤中にも処方可能である。さらに別の処方において、溶液を噴霧することも可能である。ＩＦＮγ選択的結合剤を含有する特定の処方を経口投与してもよいこともまた意図される。この方式で投与される処方を、錠剤およびカプセルなどの固形投薬型の配合に習慣的に用いられるキャリアーを伴い、または伴わずに、処方することも可能である。例えば、生物学的利用能が最大となりそして前全身分解が最小となる胃腸管で、処方の活性部分が放出されるように、カプセルを設計することも可能である。選択的結合剤の吸収を促進する、さらなる剤を含むことも可能である。希釈剤、フレーバー剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた、使用可能である。 A pharmaceutical composition comprising an IFNγ selective binding agent (such as an antibody) can also be formulated as a dry powder for inhalation. Such inhalation solutions can also be formulated in liquefied propellants for aerosol delivery. In yet another formulation, the solution can be sprayed. It is also contemplated that certain formulations containing an IFNγ selective binding agent may be administered orally. Formulations administered in this manner can be formulated with or without carriers customarily used in formulating solid dosage forms such as tablets and capsules. For example, capsules can be designed such that the active portion of the formulation is released in the gastrointestinal tract with maximum bioavailability and minimum pre-systemic degradation. It is also possible to include additional agents that facilitate absorption of the selective binder. Diluents, flavors, low melting point waxes, vegetable oils, lubricants, suspending agents, tablet disintegrating agents, and binders can also be used.

別の調製は、有効量のＩＦＮγ選択的結合剤を、錠剤の製造に適した非毒性賦形剤と混合して含むことも可能である。錠剤を滅菌水、または別の適切なビヒクルに溶解することによって、単位用量型の溶液を調製することも可能である。適切な賦形剤には、限定されるわけではないが、不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム；あるいは結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、またはアラビアゴム（ａｃａｃｉａ）；あるいは滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクが含まれる。 Another preparation may include an effective amount of an IFNγ selective binder mixed with non-toxic excipients suitable for tablet manufacture. Unit dose solutions can also be prepared by dissolving the tablets in sterile water or another suitable vehicle. Suitable excipients include, but are not limited to, inert diluents such as calcium carbonate, sodium carbonate or sodium bicarbonate, lactose, or calcium phosphate; or binders such as starch, gelatin, or gum arabic ( or a lubricant, such as magnesium stearate, stearic acid, or talc.

さらなる処方が当業者には明らかであり、こうした処方には、ＩＦＮγ選択的結合剤を、１以上の他の療法剤と組み合わせて含む処方が含まれる。多様な他の徐放または制御搬送手段、例えばリポソームキャリアー、生体侵食性微小粒子または多孔ビーズおよび蓄積注射を処方するための技術もまた、当業者に知られる。例えば、その開示が本明細書に援用される、Ｓｕｐｅｒｓａｘｏら、薬剤組成物搬送用の制御放出多孔ポリマー微小粒子の説明（ＷＯ９３／１５７２２（ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９）を参照されたい）を参照されたい。 Additional formulations will be apparent to those skilled in the art, and such formulations include formulations comprising an IFNγ selective binding agent in combination with one or more other therapeutic agents. Techniques for formulating a variety of other sustained or controlled delivery means such as liposome carriers, bioerodible microparticles or porous beads and accumulating injections are also known to those skilled in the art. See, for example, Supersaxo et al., Description of controlled release porous polymer microparticles for drug composition delivery (see WO 93/15722 (PCT / US93 / 00829)), the disclosure of which is incorporated herein. I want.

投与方式に関わらず、体重、体表面積または臓器サイズにしたがって、特定の用量を計算することも可能である。上述の処方各々を伴う治療の適切な投薬量を決定するのに必要な計算のさらなる微調整は、当業者によって日常的に行われ、そして当業者が日常的に行う仕事の範囲内である。適切な用量−反応データの使用を通じて、適切な投薬量を確認することも可能である。 Regardless of the mode of administration, it is possible to calculate a specific dose according to body weight, body surface area or organ size. Further fine-tuning of the calculations necessary to determine the appropriate dosage for treatment with each of the above-mentioned prescriptions is routinely performed by those skilled in the art and within the scope of work routinely performed by those skilled in the art. Appropriate dosages can be ascertained through the use of appropriate dose-response data.

さらに、肺投与によって、本発明の薬剤組成物を投与することも可能であり、例えば化学的に修飾されたタンパク質の肺搬送を開示し、本明細書に援用される、ＰＣＴＷＯ９４／２００６９を参照されたい。肺搬送のため、粒子サイズは、遠位肺への搬送に適したものでなければならない。例えば、粒子サイズは１μｍ〜５μｍであることも可能であるが、例えば各粒子がかなり多孔性であれば、より大きい粒子も使用可能である。 Furthermore, it is also possible to administer the pharmaceutical composition of the invention by pulmonary administration, see for example PCT WO94 / 20069, which discloses pulmonary delivery of chemically modified proteins and is incorporated herein. I want to be. For pulmonary delivery, the particle size must be suitable for delivery to the distal lung. For example, the particle size can be 1 μm to 5 μm, but larger particles can be used, for example, if each particle is fairly porous.

あるいはまたはさらに、ＩＦＮγ選択的結合剤が吸収されているか、または被包されている、膜、スポンジ、または他の適切な材料を、罹患領域に移植することを介して、組成物を局所投与することも可能である。移植装置を用いる場合、適切な組織または臓器いずれかに装置を移植し、そしてＩＦＮγ選択的結合剤の搬送は、多量（ｂｏｌｕｓ）投与を介して、または連続投与を介して、または連続注入を用い、カテーテルを介して、装置から直接なされることも可能である。 Alternatively or additionally, the composition is administered topically via implantation of a membrane, sponge, or other suitable material in which the IFNγ selective binding agent is absorbed or encapsulated into the affected area. It is also possible. When using an implantation device, the device is implanted into any appropriate tissue or organ and delivery of the IFNγ selective binding agent is via bolus administration, or via continuous administration, or using continuous infusion. It can also be done directly from the device via a catheter.

本発明の薬剤組成物は、徐放処方または徐放調製物中でもまた投与可能である。徐放調製物の適切な例には、成形物品の形の半透性ポリマーマトリックス、例えばフィルム、または微小カプセルが含まれる。徐放マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（例えば米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ・エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。徐放組成物にはまた、当該技術分野に知られるいくつかの方法のいずれかによって調製可能なリポソームが含まれることも可能である。例えばＥｐｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；およびＥＰ１４３，９４９を参照されたい。 The pharmaceutical compositions of the present invention can also be administered in sustained release formulations or sustained release preparations. Suitable examples of sustained release preparations include semipermeable polymer matrices in the form of shaped articles such as films or microcapsules. Sustained release matrices include polyesters, hydrogels, polylactic acids (eg, US Pat. No. 3,773,919, EP 58,481), copolymers of L-glutamic acid and gamma ethyl-L-glutamate (Sidman et al., Biopolymers, 22 : 547-556 (1983)), poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) and Langer, Chem. Tech., 12:98. -105 (1982)), ethylene vinyl acetate, or poly-D (-)-3-hydroxybutyric acid. Sustained release compositions can also include liposomes that can be prepared by any of several methods known in the art. See, eg, Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); EP 36,676; EP 88,046; and EP 143,949.

いくつかの例では、ＩＦＮγ選択的結合剤組成物を含む薬剤組成物を、ｅｘｖｉｖｏ方式で使用することが望ましい可能性もある。この場合、患者から取り除いた細胞、組織または臓器を、ＩＦＮγ選択的結合剤を含む薬剤組成物に曝露し、その後、続いて、細胞、組織および／または臓器を患者に移植しなおす。 In some instances, it may be desirable to use a pharmaceutical composition comprising an IFNγ selective binding agent composition in an ex vivo manner. In this case, the cells, tissues or organs removed from the patient are exposed to a pharmaceutical composition comprising an IFNγ selective binding agent, and then the cells, tissues and / or organs are subsequently reimplanted into the patient.

他の場合では、本明細書に記載するものなどの方法を用いて、遺伝子操作した特定の細胞を患者に移植して、ポリペプチド、選択的結合剤、断片、変異体、または誘導体を発現させ分泌させることによって、ＩＦＮγ選択的結合剤を含む組成物を搬送することも可能である。こうした細胞は、動物細胞またはヒト細胞であってもよく、そして患者自身の組織あるいはヒトまたは非ヒトいずれかの別の供給源由来であってもよい。所望によって、細胞を不死化してもよい。しかし、免疫応答の可能性を減少させるため、細胞を被包して、周囲組織への浸潤を回避することが好ましい。被包材料は、典型的には、タンパク質産物（単数または複数）の放出を許すが、患者の免疫系による、または周囲組織由来の他の有害因子による分解を防止する、生体適合性の半透性ポリマー被包体（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）または膜である。 In other cases, using methods such as those described herein, certain genetically engineered cells are transplanted into a patient to express a polypeptide, selective binding agent, fragment, variant, or derivative. It is also possible to deliver a composition comprising an IFNγ selective binding agent by secretion. Such cells may be animal cells or human cells and may be from the patient's own tissue or another source, either human or non-human. If desired, the cells may be immortalized. However, to reduce the possibility of an immune response, it is preferable to encapsulate the cells to avoid infiltration of surrounding tissues. The encapsulating material typically allows the release of the protein product (s), but prevents biodegradation by the patient's immune system or other detrimental factors from surrounding tissues. An encapsulating polymer or membrane.

細胞の膜被包に用いられる方法は当業者に周知であり、そして被包細胞の調製および該細胞の患者への移植は、過度の実験を伴わずに達成可能である。例えば米国特許第４，８９２，５３８号、第５，０１１，４７２号、および第５，１０６，６２７号を参照されたい。生存細胞を被包する系がＰＣＴＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に記載される。他の多様な徐放または制御搬送手段、例えばリポソームキャリアー、生体侵食性粒子またはビーズを処方するための技術もまた、当該技術分野に知られ、そして記載されている。細胞を被包し、また被包せずに、患者の適切な体組織または臓器に移植してもよい。 The methods used for membrane encapsulation of cells are well known to those skilled in the art, and preparation of encapsulated cells and transplantation of the cells into a patient can be accomplished without undue experimentation. See, for example, U.S. Pat. Nos. 4,892,538, 5,011,472, and 5,106,627. A system for encapsulating viable cells is described in PCT WO 91/10425 (Aebischer et al.). Techniques for formulating various other sustained or controlled delivery means such as liposome carriers, bioerodible particles or beads are also known and described in the art. The cells may be encapsulated or unencapsulated and transplanted to the appropriate body tissue or organ of the patient.

ＩＦＮγ選択的結合剤（例えば抗ＩＦＮγ抗体、あるいはその断片、変異体、誘導体、および融合体）を含む薬剤組成物の療法的または予防的に有効な量は、例えば該組成物を用いる徴候などの療法目的、投与経路、および被験者の状態に応じるであろう。本発明のＩＦＮγアンタゴニスト抗体または抗原結合ドメインは、自己免疫および／または炎症状態を防止し、そして／または治療するため、療法的または予防的に有効な量で投与される。 A therapeutically or prophylactically effective amount of a pharmaceutical composition comprising an IFNγ selective binding agent (eg, an anti-IFNγ antibody, or fragment, variant, derivative, and fusion thereof) can be, for example, indications using the composition, etc. It will depend on the therapeutic purpose, the route of administration, and the condition of the subject. The IFNγ antagonist antibody or antigen binding domain of the invention is administered in a therapeutically or prophylactically effective amount to prevent and / or treat autoimmune and / or inflammatory conditions.

以下の実施例は、本発明をさらに十分に例示するために提供され、そして本発明の範囲を限定するとは解釈されない。 The following examples are provided to more fully illustrate the invention and are not to be construed as limiting the scope of the invention.

（実施例１）
試薬およびアッセイ
これらの研究に用いるスクリーニング標的を：１）ＥＰ０４２３８４５またはＰＣＴ公報ＷＯ８３／０４０５３に記載されるような、ｈＩＦＮγをコードするｃＤＮＡの大腸菌における発現；または２）以下のような、ｈＩＦＮγをコードするｃＤＮＡのＣＨＯ宿主細胞における発現から調製した：ＰＣＲ（標準的条件）を用いて、テンプレートとしてヒト脾臓ＭａｒａｔｈｏｎＲｅａｄｙｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用い、ヒトＩＮＦγをコードする全長配列を増幅した。発現プラスミドに配列をサブクローニングし、そしてＤＨ１０Ｂ細胞（ＧｉｂｃｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）をＤＮＡで形質転換し、ＤＮＡを調製し、そしてリン酸カルシウム法（ＳｐｅｃｉａｌｉｔｙＭｅｄｉａ，Ｉｎｃ．）によって、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。高発現細胞株クローンを用いて、血清不含馴化培地を生成した。 Example 1
Reagents and assays Screening targets used in these studies are: 1) expression of cDNA encoding hIFNγ in E. coli, as described in EP 0423845 or PCT publication WO 83/04053; or 2) hIFNγ as follows: Prepared from the expression of the encoding cDNA in CHO host cells: PCR (standard conditions) was used to amplify the full-length sequence encoding human INFγ using human spleen Marathon Ready cDNA (Clonetech) as a template. Sequences were subcloned into expression plasmids and DH10B cells (Gibco Life Sciences) were transformed with DNA, DNA was prepared and transfected into CHO cells by the calcium phosphate method (Speciality Media, Inc.). High expression cell line clones were used to generate serum free conditioned media.

ｈＩＮＦγを含有するＣＨＯ細胞馴化培地を濃縮し、透析し、そして次いで、いくつかのクロマトグラフィー工程を通じて精製した。最初の工程は、非グリコシル化ｈＩＦＮγ型に対して高グリコシル化型を分離する、標準的ＮａＣｌ勾配を用いたＱ−ＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィーであった。コムギ（ｗｈｅａｔ）胚芽凝集素クロマトグラフィー（ＥＹＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を通して、Ｑ−ＨＰプールをさらに精製した。精製物質は、クーマシー−ブルーおよび銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ両方によって判断すると、９５％より純粋であった。物質は、ゲル凝固法（カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ）アメーバ様細胞溶解物）によってアッセイした際、内毒素が低レベルであった。Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓのヤギ（ｇｏａｔ）抗ｈＩＦＮγ中和抗体（カタログ番号ＡＦ−２８５−ＮＡ、ロット番号ＺＷ０１９０１１）を用いて、ウェスタンブロットによって、ｈＩＮＦγの同一性を確認した。吸光係数法（０．６６）を用いて、最終タンパク質濃度を決定した。物質２ロットをそれぞれ生成した。収率は４０ｍｇ／ｌであった。最終物質をＰＢＳ中に配合した。 CHO cell conditioned medium containing hINFγ was concentrated, dialyzed and then purified through several chromatographic steps. The first step was Q-HP (Pharmacia) chromatography using a standard NaCl gradient to separate the highly glycosylated form from the unglycosylated hIFNγ form. The Q-HP pool was further purified through wheat germ agglutinin chromatography (EY Laboratories). The purified material was more than 95% pure as judged by both Coomassie-Blue and silver stained SDS-PAGE. The material had low levels of endotoxin when assayed by the gel coagulation method (Limulus amoeba-like cell lysate). The identity of hINFγ was confirmed by Western blot using a R & D Systems goat anti-hIFNγ neutralizing antibody (catalog number AF-285-NA, lot number ZW019011). The final protein concentration was determined using the extinction coefficient method (0.66). Two lots of material were generated respectively. The yield was 40 mg / l. The final material was formulated in PBS.

ＣＨＯ細胞におけるヒトＩＦＮγＲ１−Ｆｃタンパク質の発現
これらの研究において、標的からファージ抗体を溶出するのに用いたヒトＩＦＮγＲ１−Ｆｃタンパク質を以下のように調製した：ＰＣＲ（標準的条件）を用いて、テンプレートとしてヒトリンパ球ＭａｒａｔｈｏｎＲｅａｄｙｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈより購入）を用い、ヒトＩＦＮγＲ１をコードする全長配列を増幅した。ＰＣＲ（標準的条件）を用いて、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分をコードする配列を増幅した。重複ＰＣＲを用いて、ＩＦＮγＲ１−Ｆｃ融合構築物をコードする配列（ＩＦＮγＲ１のアミノ酸１〜Ｓｅｒ^２４６）を生成して、そして発現プラスミドに該配列をサブクローニングした。ＤＨ１０Ｂ細胞（ＧｉｂｃｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）をＤＮＡで形質転換し、ＤＮＡを調製し、そしてリン酸カルシウム法（ＳｐｅｃｉａｌｉｔｙＭｅｄｉａ，Ｉｎｃ．）によって、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。高発現細胞株クローンを用いて、血清不含馴化培地を生成した。 Expression of human IFNγR1-Fc protein in CHO cells In these studies, the human IFNγR1-Fc protein used to elute phage antibodies from the target was prepared as follows: PCR (standard conditions) was used to template The human lymphocyte Marathon Ready cDNA (purchased from Clonetech) was used to amplify the full-length sequence encoding human IFNγR1. PCR (standard conditions) was used to amplify the sequence encoding the Fc portion of human IgG1. Overlapping PCR was used to generate a sequence encoding the IFNγR1-Fc fusion construct (amino acids 1 to Ser ^{246 of} IFNγR1) and subcloned into an expression plasmid. DH10B cells (Gibco Life Sciences) were transformed with DNA, DNA was prepared, and transfected into CHO cells by the calcium phosphate method (Speciality Media, Inc.). High expression cell line clones were used to generate serum free conditioned media.

標準的プロテインＧＦａｓｔ−Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通して、ｈＩＮＦγＲ１−Ｆｃを含有するＣＨＯ細胞馴化培地を濃縮し、そして精製した。吸光係数として１．４４を用いて、Ａ_２８０によって最終濃度を決定した。Ｎ末端配列決定解析を通じて、精製試料の同一性を確認した。この物質をＰＢＳ中に配合した。 The CHO cell conditioned medium containing hINFγR1-Fc was concentrated and purified through a standard protein G Fast-Flow column (Pharmacia). Using 1.44 as the extinction coefficient _was determined at a final concentration by _{A 280.} The identity of the purified sample was confirmed through N-terminal sequencing analysis. This material was formulated in PBS.

抗体
モノクローナル抗ｈＩＦＮγ抗体、クローン２５７８．１１１をＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓから購入した（カタログ番号ＭＡＢ２８５、ロット番号ＫＷ０７）。モノクローナル抗ｈＩＦＮγ抗体、クローンＭＭＨＧ−１をＢｉｏｓｏｕｒｃｅから購入した（カタログ番号ＡＨＣ４８３４、ロット番号１０８０３−０１５）。組換えヒトＩＦＮγ受容体１（ｒｈＩＦＮγ Ｒ１）をＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓから購入した（カタログ番号６７３−ＩＲ）。ｒｈＩＦＮγ Ｒ１の計算上の分子量は２５，０００ダルトンである。グリコシル化の結果、組換えタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、４０〜５０ｋＤａタンパク質として移動する。 An antibody monoclonal anti-hIFNγ antibody, clone 2578.111, was purchased from R & D Systems (catalog number MAB285, lot number KW07). A monoclonal anti-hIFNγ antibody, clone MMHG-1, was purchased from Biosource (catalog number AHC4834, lot number 10803-015). Recombinant human IFNγ receptor 1 (rhIFNγ R1) was purchased from R & D Systems (catalog number 673-IR). The calculated molecular weight of rhIFNγ R1 is 25,000 daltons. As a result of glycosylation, the recombinant protein migrates as a 40-50 kDa protein on SDS-PAGE.

Ａ５４９細胞増殖アッセイ
ＩＦＮγの抗体中和を評価するために用いたＡ５４９細胞増殖アッセイは、９６ウェルアッセイであり、そして一般的に以下のように記載される：第１日、１）アッセイ培地（Ｆ１２Ｋ、５％ＦＢＳ、１ｘＰｅｎ／ＳｔｒｅｐＬ−グルタミン）中の最高濃度からＡｂを１：２で連続希釈する。アッセイにおいて望ましい濃度の４倍で、全部で１０回の希釈を行う。２つ組のため、各希釈物は少なくとも最終２００μｌが必要である；２）用量反応曲線中の有効用量の９０％に基づいて、スパイク用にＩＦＮγを適切な濃度に希釈する。アッセイにおいて望ましい濃度の４倍で、ＩＦＮγスパイクを作成する；３）Ｔｉｔｅｒｔｅｋ試験管中で、各４ｘＡｂ希釈物１５０μｌを、４ｘＩＮＦγスパイク１５０μｌと合わせる。ピペッティングによって混合する。ふたをして、室温で１時間インキュベーションする。（注：ＡｂおよびＩＦＮγの濃度は、ここで、アッセイ濃度の２倍である）；４）（所望による）ＡｂおよびＩＦＮγをインキュベーションしている間、力価決定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）曲線用にＩＦＮγを希釈する。４０００ｎｇ／ｍｌから始めて、１：３希釈を１２回行う。アッセイにおいて、３つ組には３００μｌが必要であるため、希釈終了時に必要な体積は少なくとも４００μｌであるはずである。必要となるまで、４℃で保存する；５）インキュベーションが完了する前に、５ｍｌトリプシン中で、Ａ５４９細胞をトリプシン処理する。フラスコに２０ｍｌのアッセイ培地を添加し、そして５０ｍｌコニカルに移して、そしてＩＥＣ中、室温で１／２〜３／４の速度で遠心分離する；６）細胞を吸引する。７．５ｍｌのアッセイ培地に再懸濁する。トリパンブルー中、１：１で計数する；７）アッセイ培地中、細胞を２．５ｘ１０^４細胞／ｍｌに希釈する。各試料について、２．５ｘ１０^３細胞／ウェルを、９６ウェルＦａｌｃｏｎに０．１ｍｌで植え付ける；８）１時間後、２つ組の２つのウェル各々に、１００μｌＡｂ／ＩＦＮγ混合物を添加する；そして９）３７℃、５％ＣＯ_２および高湿度で５日間インキュベーションする。第５日：１）ウェルあたり２０μｌのＡｌａｍａｒＢｌｕｅを添加する。３７℃、５％ＣＯ_２および高湿度で３〜４時間インキュベーションする；２）ＦＬ５００蛍光プレート読取装置のスイッチを入れる。プレートからふたを取り除き、そしてふたなしで１０分間振盪する；そして３）ＦＬ５００を読み取る。設定：中程度に３秒間振盪、励起５３０／２５、発光５９０／３５、感度３４。 A549 Cell Proliferation Assay The A549 cell proliferation assay used to assess antibody neutralization of IFNγ is a 96-well assay and is generally described as follows: Day 1, 1) Assay medium (F12K Serially dilute Ab 1: 2 from highest concentration in 5% FBS, 1 × Pen / Strep L-glutamine). A total of 10 dilutions are performed at 4 times the desired concentration in the assay. For dilutions, each dilution requires at least a final 200 μl; 2) Dilute IFNγ to the appropriate concentration for the spike based on 90% of the effective dose in the dose response curve. Create an IFNγ spike at 4 times the desired concentration in the assay; 3) Combine 150 μl of each 4 × Ab dilution with 150 μl of 4 × INFγ spike in a Titertek tube. Mix by pipetting. Cover and incubate at room temperature for 1 hour. (Note: Ab and IFNγ concentrations are now twice the assay concentration); 4) Dilute IFNγ for titration curves during incubation of Ab and IFNγ (optional) To do. Starting with 4000 ng / ml, do 1: 3 dilutions 12 times. Since 300 μl is required for the triplicate in the assay, the volume required at the end of dilution should be at least 400 μl. Store at 4 ° C. until needed; 5) Trypsinize A549 cells in 5 ml trypsin before incubation is complete. Add 20 ml assay medium to the flask and transfer to a 50 ml conical and centrifuge in IEC at 1/2 to 3/4 speed at room temperature; 6) Aspirate cells. Resuspend in 7.5 ml assay medium. Count in 1: 1 in trypan blue; 7) Dilute cells in assay medium to 2.5 × 10 ⁴ cells / ml. For each sample, 2.5 × 10 ³ cells / well are seeded in 0.1 ml in a 96-well Falcon; 8) After 1 hour, 100 μl Ab / IFNγ mixture is added to each of two duplicate wells; and 9 ) Incubate for 5 days at 37 ° C., 5% CO ₂ and high humidity. Day 5: 1) Add 20 μl Alamar Blue per well. Incubate at 37 ° C., 5% CO ₂ and high humidity for 3-4 hours; 2) Turn on the FL500 fluorescent plate reader. Remove lid from plate and shake for 10 minutes without lid; and 3) Read FL500. Settings: medium shaking for 3 seconds, excitation 530/25, emission 590/35, sensitivity 34.

（実施例２）
ヒトＦａｂライブラリーのスクリーニング
スクリーニング法
ヒトＦａｂライブラリーを構築し、そしてスクリーニングする、一般的な方法は、ｄｅＨａａｒｄら（ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ，３１：５−３１（１９９８）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１８２１８−１８２３０（１９９９））に記載された。以下の方法によって、ｈＩＦＮγに結合するＦａｂ断片をスクリーニングした。 (Example 2)
Screening of human Fab library
Screening Methods General methods for constructing and screening human Fab libraries are described by de Haard et al. (Advanced Drug Delivery Reviews, 31 : 5-31 (1998); J. Biol. Chem., 274 : 18218-18230 (1999)). Fab fragments that bind to hIFNγ were screened by the following method.

Ｎｕｎｃイムノチューブを、０．１Ｍ炭酸Ｎａ、ｐＨ９．６中、０．３９μｇ／ｍｌのｈＩＦＮγ ４ｍｌで、Ｎｕｔａｔｏｒ上、室温で２時間コーティングした。ＴａｒｇｅｔＱｕｅｓｔ、ＮＶ（オランダ・アムステルダム）凍結ファージライブラリーストック（試験管あたり７５０μｌ中、４ｘ１０^１２ｐｆｕ）のアリコットを融解後、１／５体積（１５０μｌ）のＰＥＧ溶液（２０％ポリエチレングリコール８０００、２．５ＭＮａＣｌ、オートクレーブ）を添加し、そして試験管を氷上に１時間放置してファージを沈殿させることによって、グリセロール（１５％）を取り除いた。沈殿したファージ粒子を４０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心してペレットとし、次いで５００μｌＰＢＳ、ｐＨ７．４に再懸濁した。ＩＦＮγでコーティングしたイムノチューブを４ｍｌＰＢＳで３回洗浄し、そしてＮｕｔａｔｏｒ上、４ｍｌの２％ＭＰＢＳを用いて、室温で１時間ブロッキングした。同時に、５００μｌの４％ＭＰＢＳをファージ懸濁物に添加し、そして室温で３０分間〜１時間インキュベーションして、ファージ粒子のプレ・ブロッキングを可能にした。ブロッキングしたイムノチューブをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、そしてＰＢＳで２回洗浄した。プレ・ブロッキングしたファージ混合物を、３ｍｌの２％ＭＰＢＳを含有する、洗浄したイムノチューブに添加した。回転装置上で３０分間インキュベーションし、その後、室温で１．５時間、静置インキュベーションした後、ファージ混合物を廃棄した。試験管をまずＰＢＳＴで２０回、次いでＰＢＳで２０回洗浄した。回転装置上、０．４％ＭＰＢＳ、ｐＨ７．４中、１μＭの特異的溶出試薬（それぞれｈＩＦＮγ、ＧＰＮＡ、ＲＤＭＡ、ＢＳＭＡ、またはｒｈＩＦＮγ Ｒ１）１ｍｌとインキュベーションすることによって、結合したファージ粒子を溶出した。溶出したファージ粒子を無菌５０ｍｌコニカル・ポリプロピレン試験管に移し、そして氷上で保存した。各ファージ溶出物、約２０μｌを、力価決定のため、取り置いた。増幅のため、残った溶出ファージ粒子を、５ｍｌのＴＧ１培養物（ＯＤ_５９０約０．５）および４ｍｌの２ｘＹＴを含有する５０ｍｌコニカル試験管に添加した。ＩＦＮ感染（ＩＦＮｅｃｔｉｏｎ）混合物を振盪せずに３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで、３５００ｒｐｍで２０分間回転させた。細胞ペレットを１５００μｌの２ｘＹＴ−ＡＧブロスに懸濁し、そして５つのＳＯＢＣＧプレート上、３００μｌ／プレートで蒔いた。プレートを３０℃で一晩インキュベーションした。２０時間インキュベーションした後、プレートから細胞スクレーパーで細胞を回収し、これにプレートあたり４ｍｌの２ｘＹＴ−ＡＧを添加した。この工程を３回反復した。回収細胞のごく一部をファージ救出に用いた（以下を参照されたい）。残った細胞懸濁物を３５００ｒｐｍで２０分間回転させた。細胞ペレットをペレットサイズの１／２体積の５０％グリセロールに再懸濁して、グリセロールストックを作成し、そして−８０℃で保存した。 Nunc immunotubes were coated with 4 ml of 0.39 μg / ml hIFNγ in 0.1 M Na carbonate pH 9.6 for 2 hours at room temperature on a Nutorator. Target Quest, NV (Amsterdam, The Netherlands) frozen phage library stock (4 × 10 ¹² pfu in 750 μl per tube) after thawing an aliquot, 1/5 volume (150 μl) of PEG solution (20% polyethylene glycol 8000, 2. Glycerol (15%) was removed by adding 5M NaCl, autoclave) and allowing the tubes to stand on ice for 1 hour to precipitate the phage. The precipitated phage particles were centrifuged at 4000 rpm, 4 ° C. for 15 minutes to give a pellet and then resuspended in 500 μl PBS, pH 7.4. Immunotubes coated with IFNγ were washed 3 times with 4 ml PBS and blocked for 1 hour at room temperature with 4 ml 2% MPBS on a Nutoror. At the same time, 500 μl of 4% MPBS was added to the phage suspension and incubated for 30 minutes to 1 hour at room temperature to allow pre-blocking of the phage particles. Blocked immunotubes were washed twice with PBST (0.1% Tween 20 in PBS) and twice with PBS. The pre-blocked phage mixture was added to a washed immunotube containing 3 ml of 2% MPBS. After a 30 minute incubation on a rotator, followed by a 1.5 hour static incubation at room temperature, the phage mixture was discarded. The test tube was first washed 20 times with PBST and then 20 times with PBS. Bound phage particles were eluted by incubation with 1 ml of 1 μM specific elution reagent (hIFNγ, GPNA, RDMA, BSMA, or rhIFNγ R1 respectively) in 0.4% MPBS, pH 7.4 on a rotator. The eluted phage particles were transferred to a sterile 50 ml conical polypropylene tube and stored on ice. Approximately 20 μl of each phage eluate was saved for titer determination. For amplification, the remaining eluted phage particles were added to a 50 ml conical tube containing 5 ml of TG1 culture (OD ₅₉₀ approximately 0.5) and 4 ml of 2xYT. The IFN infection mixture was incubated for 30 minutes at 37 ° C. without shaking and then spun at 3500 rpm for 20 minutes. The cell pellet was suspended in 1500 μl of 2 × YT-AG broth and plated on 5 SOBCG plates at 300 μl / plate. Plates were incubated overnight at 30 ° C. After incubation for 20 hours, the cells were recovered from the plate with a cell scraper, and 4 ml of 2xYT-AG was added to the plate. This process was repeated three times. A small portion of the recovered cells was used for phage rescue (see below). The remaining cell suspension was spun at 3500 rpm for 20 minutes. The cell pellet was resuspended in 1/2 volume of pellet size 50% glycerol to make a glycerol stock and stored at −80 ° C.

増幅細胞懸濁物からのファージ救出を以下のように行った。蒔いて増幅させた約０．５ｍｌの回収細胞懸濁物を用いて、約０．３のＯＤ_５９０になるように５０ｍｌの２ｘＹＴ−ＡＧに接種した。振盪装置上、ＯＤ_５９０が０．５になるまで培養物を３７℃でインキュベーションした。Ｍ．Ｏ．Ｉ．２０のＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ、カタログ番号１８３１１−０１９、１．１ｘ１０^１１ｐｆｕ／ｍｌ）１ｍｌで、１０ｍｌの培養物をＩＦＮ感染させて、そして３７℃で３０分間、インキュベーター中でインキュベーションした。ＩＦＮ感染した細胞を４０００ｒｐｍで２０分間回転させて落とした。細胞ペレットを５０ｍｌの２ｘＹＴ−ＡＫに再懸濁し、２５０ｍｌフラスコに移して、そして２７０ｒｐｍで２０時間、振盪しながら３０℃でインキュベーションした。一晩培養物を４０００ｒｐｍで２０分間回転させて、細胞破片を取り除いた。上清を再び遠心分離して、細胞破片が除去されることを確実にした。ＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ８０００、２．５ＭＮａＣｌ）約１／５体積を上清に添加して、ファージ粒子を沈殿させた。混合物を氷上で少なくとも１時間インキュベーションし、次いで４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、沈殿したファージ粒子を収集した。ファージペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、そして微量遠心分離試験管に移した。ファージ懸濁物を氷上で１時間放置して、ファージ粒子の完全な懸濁を可能にし、次いで、１４，０００ｒｐｍで２分間回転させて、残った細胞破片を取り除いた。ファージ沈殿工程を反復した。最終ファージペレットを１．１ｍｌのＰＢＳに懸濁し、そして延長した期間、氷上に放置して、ファージ粒子の完全な懸濁を確実にした。ファージ懸濁物を１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、残った細胞破片を取り除いた。５００μｌの救出したファージ懸濁物を用いて、２５０μｌの５０％グリセロールを添加することによって、グリセロールストックを作成した。１００μｌの救出ファージ懸濁物をファージプールＥＬＩＳＡ（以下を参照されたい）用に取り置いた。残った５００μｌの救出ファージを次の周期のパニングに用いた。 Phage rescue from the amplified cell suspension was performed as follows. Approximately 0.5 ml of the recovered cell suspension, which was seeded and amplified, was used to inoculate 50 ml of 2 × YT-AG to an OD ₅₉₀ of approximately 0.3. The culture was incubated at 37 ° C. on a shaker until OD ₅₉₀ was 0.5. M.M. O. I. Ten ml of 20 M13KO7 helper phage (GIBCO BRL, catalog number 183111-19, 1.1 × 10 ¹¹ pfu / ml) was infected with 10 ml of the culture and incubated at 37 ° C. for 30 minutes in an incubator. IFN infected cells were spun down at 4000 rpm for 20 minutes. The cell pellet was resuspended in 50 ml 2 × YT-AK, transferred to a 250 ml flask and incubated at 30 ° C. with shaking at 270 rpm for 20 hours. The overnight culture was spun at 4000 rpm for 20 minutes to remove cell debris. The supernatant was centrifuged again to ensure that cell debris was removed. About 1/5 volume of PEG solution (20% PEG 8000, 2.5 M NaCl) was added to the supernatant to precipitate the phage particles. The mixture was incubated on ice for at least 1 hour and then centrifuged at 4000 rpm for 20 minutes to collect the precipitated phage particles. The phage pellet was resuspended in 1 ml PBS and transferred to a microcentrifuge tube. The phage suspension was left on ice for 1 hour to allow complete suspension of the phage particles and then spun at 14,000 rpm for 2 minutes to remove residual cell debris. The phage precipitation process was repeated. The final phage pellet was suspended in 1.1 ml PBS and left on ice for an extended period to ensure complete suspension of phage particles. The phage suspension was centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes to remove remaining cell debris. A glycerol stock was made by adding 250 μl of 50% glycerol using 500 μl of rescued phage suspension. 100 μl of rescued phage suspension was saved for phage pool ELISA (see below). The remaining 500 μl of rescued phage was used for the next cycle of panning.

ファージプールＥＬＩＳＡ
ファージプールＥＬＩＳＡを以下のように行った：大腸菌で発現したｈＩＦＮγを、ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｂＩｍｍｕｎｏプレートにおいて、０．１Ｍ炭酸Ｎａ、ｐＨ９．６中、０．３９μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルで、穏やかに振動させながら、室温で２時間プレーティングした。コーティングしたプレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、振動装置上、室温で１時間、２％ＭＰＢＳ３００μｌ／ウェルを用いてブロッキングした。陰性対照として、抗原でコーティングされていない別のＮｕｎｃＩｍｍｕｎｏプレートもまた、２％ＭＰＢＳでブロッキングした。その間に、１２０μｌの救出された各ファージプールを、９６ウェルＣｏｓｔａｒ３７９０プレート中、１２０μｌの０．８％ＭＴＢＳでプレ・ブロッキングし、そして使用準備が整うまで、室温で放置した。ブロッキングしたプレートをどちらも、０．１％ＴＢＳＴ（ＴＢＳ：１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ；Ｔｗｅｅｎ−２００．１％）で５回洗浄した。プレ・ブロッキングしたファージ希釈物を、抗原でコーティングしたプレートおよび陰性対照プレート両方に分配し（１００μｌ／ウェル）、そして振動装置上、室温で１時間インキュベーションした。記載するようにプレートを洗浄した後、０．４％ＭＴＢＳ中、１：１０００倍希釈したＨＲＰ／抗Ｍ１３モノクローナル・コンジュゲート（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２７−９４２１−０１）１００μｌ／ウェルを分配し、そして振動装置上、室温で１時間インキュベーションした。記載するようにプレートを洗浄した。基質、１−Ｓｔｅｐ^ＴＭＡＢＴＳ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３７６１５）１００μｌ／ウェルを添加した後、プレートを１時間インキュベーションした。シグナル検出のため、ＯＤ_４０５を測定した。さらなる解析のため、個々のクローンの供給源として、ＥＬＩＳＡ陽性ファージプールを用いた。 Phage pool ELISA
Phage pool ELISA was performed as follows: hIFNγ expressed in E. coli was gently rocked in Nunc MaxiSorb Immunoplate at 0.39 μg / ml, 100 μl / well in 0.1 M Na carbonate, pH 9.6. The plate was then plated for 2 hours at room temperature. The coated plate was washed 3 times with PBS and then blocked with 300 μl / well of 2% MPBS for 1 hour at room temperature on a shaker. As a negative control, another Nunc Immuno plate that was not coated with antigen was also blocked with 2% MPBS. Meanwhile, 120 μl of each rescued phage pool was pre-blocked with 120 μl 0.8% MTBS in 96-well Costar 3790 plates and left at room temperature until ready to use. Both blocked plates were washed 5 times with 0.1% TBST (TBS: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl; Tween-20 0.1%). Pre-blocked phage dilutions were dispensed into both antigen-coated and negative control plates (100 μl / well) and incubated for 1 hour at room temperature on a shaker. After washing the plates as described, 100 μl / well of HRP / anti-M13 monoclonal conjugate (Amersham Pharmacia Biotech, catalog number 27-9421-01) diluted 1: 1000 in 0.4% MTBS was dispensed. And incubated for 1 hour at room temperature on a vibratory apparatus. Plates were washed as described. After adding 100 μl / well of substrate, 1-Step ^™ ABTS (Pierce, catalog number 37615), the plates were incubated for 1 hour. OD ₄₀₅ was measured for signal detection. For further analysis, an ELISA positive phage pool was used as the source of individual clones.

（実施例３）
ＩＦＮγに結合するＦａｂファージクローンの同定
ＤＮＡフィンガープリンティング
ＥＬＩＳＡ陽性ファージプール由来の重鎖および軽鎖両方を含有する全長クローンを同定するため、９６ウェルＴｈｅｒｍｏｗｅｌｌプレート中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。典型的には、各ウェルは、２５μｌのＰＣＲ反応混合物（２．５μｌ１０ｘＰＣＲ緩衝液、２１．６２５μｌの水、２５ｍＭの０．２５μｌｄＮＴＰ類、１０ｐｍｏｌ／μｌの０．２５μｌプライマー８７０−０２（以下を参照されたい）、１０ｐｍｏｌ／μｌの０．２５μｌプライマー２１８２−８３（以下を参照されたい）、５単位／μｌの０．１２５μｌＴａｑポリメラーゼ）を含有する。 (Example 3)
Identification of Fab phage clones that bind to IFNγ
To identify full-length clones containing both heavy and light chains from a DNA fingerprinting ELISA positive phage pool, polymerase chain reaction (PCR) was performed in 96-well Thermowell plates. Typically, each well contains 25 μl PCR reaction mixture (2.5 μl 10 × PCR buffer, 21.625 μl water, 25 mM 0.25 μl dNTPs, 10 pmol / μl 0.25 μl primer 870-02 (below (See)) 10 pmol / μl of 0.25 μl primer 2182-83 (see below, 5 units / μl 0.125 μl Taq polymerase).

個々のコロニーを摘み取り、そしてまずＰＣＲプレート中のウェルに再懸濁し、次いで３００μｌ／ウェルの２ｘＹＴ−ＡＧブロス（２ｘＹＴブロス：１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含有する、水１ｌあたり、１０ｇ酵母エキス、１６ｇバクト−トリプトン、５ｇＮａＣｌ）を満たした９６ウェル深底ウェルブロックの対応するウェルに再懸濁する。ＰＣＲ反応条件は、９４℃５分間の変性周期１回、４０周期の９４℃４５秒間、５５℃４５秒間、７２℃１．５分間、その後、７２℃１０分間の伸長周期１回であった。ＰＣＲ反応が完了した後、３μｌ／ウェルのＰＣＲ反応混合物を、０．５μｌ／ｍｌのエチジウムブロミドを含有する、余分に長い４ｘ（２４＋２）の１％ＴＡＥゲル（ＥｍｂｉＴｅｃ、カタログ番号ＧＥ−３８２０）上で、１２０ボルトで１時間泳動した。１ｋｂｐｌｕｓＤＮＡラダー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、カタログ番号１０７８７−０１８）に比較することによって、１．６ｋｂより大きい挿入物を持つクローンを全長クローンと同定した。 Individual colonies are picked and resuspended first in wells in a PCR plate and then 10 g yeast extract per liter of water containing 300 μl / well 2 × YT-AG broth (2 × YT broth: 100 μg / ml ampicillin and 2% glucose). Resuspend in the corresponding wells of a 96 well deep well block filled with 16 g bacto-tryptone, 5 g NaCl). PCR reaction conditions were one denaturation cycle of 94 ° C. for 5 minutes, 40 cycles of 94 ° C. for 45 seconds, 55 ° C. for 45 seconds, 72 ° C. for 1.5 minutes, and then one extension cycle of 72 ° C. for 10 minutes. After the PCR reaction was completed, 3 μl / well PCR reaction mixture was added to an extra long 4 × (24 + 2) 1% TAE gel containing 0.5 μl / ml ethidium bromide (Embi Tec, catalog number GE-3820). Above, run at 120 volts for 1 hour. By comparing to a 1 kb plus DNA ladder (Gibco BRL, catalog number 10787-018), clones with inserts greater than 1.6 kb were identified as full-length clones.

ユニークな全長クローンの同定を以下のように行った：同定された全長クローンのＰＣＲ増幅した挿入物に対して、ＢｓｔＮＩ消化を行った。９６ウェルＴｈｅｒｍｏｗｅｌｌプレート中の試料あたり１６μｌのＰＣＲ反応混合物に、３μｌ１０ｘ緩衝液２（ＮＥＢＬ）、１０ｍｇ／ｍｌの０．３μｌＢＳＡ、１０μｌの水および０．７μｌのＢｓｔＮＩ（ＮＥＢＬ）を含有する１４μｌのＢｓｔＮＩ消化マスター溶液を添加した。プレートを６０℃で３時間インキュベーションした。消化した試料の各々１３μｌを、０．５μｌ／ｍｌのエチジウムブロミドを含有する、余分に長い２ｘ（２４＋２）の４％ＴＡＥゲル（ＥｍｂｉＴｅｃ、カタログ番号ＧＥ−３８１７）上で、１００ボルトで３時間泳動した。ＢｓｔＮＩ断片パターンの相違に基づいて、ユニークなクローンを同定した。 Identification of unique full-length clones was performed as follows: BstNI digestion was performed on PCR-amplified inserts of the identified full-length clones. 16 μl of PCR reaction mixture per sample in a 96 well Thermowell plate was added 14 μl of 3 μl 10 × Buffer 2 (NEBL), 10 mg / ml 0.3 μl BSA, 10 μl water and 0.7 μl BstNI (NEBL). BstNI digestion master solution was added. The plate was incubated at 60 ° C. for 3 hours. 13 μl of each digested sample is placed on an extra long 2 × (24 + 2) 4% TAE gel (Embi Tec, catalog number GE-3817) containing 0.5 μl / ml ethidium bromide for 3 hours at 100 volts. Electrophoresed. Based on the difference in BstNI fragment patterns, unique clones were identified.

クローンファージＥＬＩＳＡ
同定されたユニークな全長クローンのＦａｂファージを９６ウェル形式で救出した。９６ウェルの２ｍｌ深底ウェルブロックにおいて、４８０μｌ／ウェル２ｘＹＴＡＧブロスに、選択したユニークな全長クローンの一晩培養物２０μｌを接種し、次いで、３００ｒｐｍ、３７℃で３時間インキュベーションした。細胞をＩＦＮ感染させるため、各ウェルに、１００μｌの１：１０希釈したＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ希釈物を添加した。ブロックを振盪せずに３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで、１５０ｒｐｍでさらに３０分間、穏やかに振盪した。ブロックを３６００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、ＩＦＮ感染させた細胞をペレットにした。各ウェルの細胞ペレットを４８０μｌの２ｘＹＴＡＫ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび４０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する２ｘＹＴブロス）に懸濁し、次いで約２０時間に渡って、３０℃で一晩インキュベーションした。３６００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって、細胞破片を分離した。救出したファージ上清を注意深く別の無菌９６ウェルブロックに移した。救出したファージを用いて、実施例２のファージプールＥＬＩＳＡに記載したのと正確に同じように、クローンファージＥＬＩＳＡを行った。０．２以上の純ＯＤ_４０５を生じるクローンをＩＦＮγ結合候補と見なした。 Clone phage ELISA
The identified unique full-length clone of Fab phage was rescued in a 96-well format. In a 96-well 2 ml deep well block, 480 μl / well 2 × YTAG broth was inoculated with 20 μl of an overnight culture of the selected unique full-length clone and then incubated at 300 rpm, 37 ° C. for 3 hours. To infect cells, 100 μl of 1:10 diluted M13KO7 helper phage dilution was added to each well. The block was incubated for 30 minutes at 37 ° C. without shaking, and then gently shaken for an additional 30 minutes at 150 rpm. The block was centrifuged at 3600 rpm for 20 minutes to pellet the IFN infected cells. The cell pellet in each well was suspended in 480 μl of 2 × YTAK (2 × YT broth containing 100 μg / ml ampicillin and 40 μg / ml kanamycin) and then incubated overnight at 30 ° C. for about 20 hours. Cell debris was separated by centrifuging at 3600 rpm for 20 minutes. The rescued phage supernatant was carefully transferred to another sterile 96 well block. Cloned phage ELISA was performed using the rescued phage exactly as described in the phage pool ELISA of Example 2. Clones that produced a pure OD _{405 of} 0.2 or greater were considered IFNγ binding candidates.

大規模ファージ救出ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡにおいて、ＦａｂファージがＩＦＮγに濃度依存的に結合することを立証することによって、同定したユニークなＦａｂファージクローンが特異的にＩＦＮγに結合することを確認した。大規模救出によってＦａｂファージを得た。 Large-scale phage rescue ELISA
In the ELISA, it was confirmed that the identified unique Fab phage clone specifically binds to IFNγ by demonstrating that Fab phage binds to IFNγ in a concentration-dependent manner. Fab phages were obtained by large-scale rescue.

個々のクローンの大規模救出を、以下のように行った：同定したユニークなＩＦＮγ結合クローンのＦａｂファージを大規模に救出した。２５０ｍｌの無菌フラスコ中で、５０ｍｌの２ｘＹＴ−ＡＧブロスに、選択したＩＦＮγ結合クローンの一晩培養物２００μｌを接種し、そして培養物のＯＤ５９０が０．５に達するまで、３７℃、２７００ｒｐｍでインキュベーションした。５ｍｌのＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ、カタログ番号１８３１１−０１９、１．１ｘ１０^１１ｐｆｕ／ｍｌ）をＭ．Ｏ．Ｉ．２０で添加して、細胞を感染させた。細胞／ヘルパーファージ混合物を振盪せずに３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、感染細胞をペレットにした。細胞ペレットを５０ｍｌの２ｘＹＴＡＫブロス（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび４０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する２ｘＹＴブロス）に懸濁し、次いで２７０ｒｐｍで振盪しながら、約２０時間に渡って、３０℃で一晩インキュベーションした。一晩培養物を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって、細胞破片を取り除いた。上清を再び遠心分離して、細胞破片が除去されていることを確実にした。上清に、１０ｍｌ（１／５体積）のＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ８０００、２．５ＭＮａＣｌ）を添加して、ファージ粒子を沈殿させた。混合物を氷上で少なくとも１時間インキュベーションし、そして４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、沈殿したファージ粒子を収集した。ファージペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁して、そして微量遠心分離試験管に移した。ファージ懸濁物を氷上で１時間放置して、ファージ粒子の完全な懸濁を可能にし、次いで、１４，０００ｒｐｍで２分間回転させて、残った細胞破片を取り除いた。ファージ沈殿工程を反復した。最終ファージペレットを１ｍｌのＰＢＳに懸濁し、そして延長した期間、氷上に放置して、ファージ粒子の完全な懸濁を確実にした。ファージ懸濁物を１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、残った細胞破片を取り除いた。最終ファージ懸濁物を４℃で保存した。実施例２のファージプールＥＬＩＳＡに記載するように、ファージＥＬＩＳＡを行った。典型的には１ｘ１０^９ｐｆｕ／ウェル〜１ｘ１０^１１ｐｆｕ／ウェルの、少なくとも６つの異なる濃度の大規模救出ファージを、対応するウェルに添加した。 Large-scale rescue of individual clones was performed as follows: Fab phages of identified unique IFNγ binding clones were rescued on a large scale. In a 250 ml sterile flask, 50 ml of 2 × YT-AG broth was inoculated with 200 μl of an overnight culture of selected IFNγ binding clones and incubated at 37 ° C., 2700 rpm, until the culture reached an OD590 of 0.5. . 5 ml of M13KO7 helper phage (GIBCO BRL, catalog number 18311-019, 1.1 × 10 ¹¹ pfu / ml) O. I. 20 was added to infect the cells. The cell / helper phage mixture was incubated for 30 minutes at 37 ° C. without shaking, then centrifuged at 4000 rpm for 20 minutes to pellet infected cells. The cell pellet was suspended in 50 ml of 2 × YTAK broth (2 × YT broth containing 100 μg / ml ampicillin and 40 μg / ml kanamycin) and then incubated overnight at 30 ° C. for about 20 hours with shaking at 270 rpm. Cell debris was removed by centrifuging the overnight culture at 4000 rpm for 20 minutes. The supernatant was centrifuged again to ensure that cell debris was removed. To the supernatant, 10 ml (1/5 volume) of PEG solution (20% PEG8000, 2.5 M NaCl) was added to precipitate phage particles. The mixture was incubated on ice for at least 1 hour and centrifuged at 4000 rpm for 20 minutes to collect the precipitated phage particles. The phage pellet was resuspended in 1 ml PBS and transferred to a microcentrifuge tube. The phage suspension was left on ice for 1 hour to allow complete suspension of the phage particles and then spun at 14,000 rpm for 2 minutes to remove residual cell debris. The phage precipitation process was repeated. The final phage pellet was suspended in 1 ml PBS and left on ice for an extended period to ensure complete suspension of phage particles. The phage suspension was centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes to remove remaining cell debris. The final phage suspension was stored at 4 ° C. A phage ELISA was performed as described in the phage pool ELISA of Example 2. At least six different concentrations of large-scale rescue phage, typically 1 × 10 ⁹ pfu / well to 1 × 10 ¹¹ pfu / well, were added to the corresponding wells.

総数１１のＦａｂクローンを同定した。大腸菌ｈＩＦＮ−γ溶出を用いて、ファージプールからＦａｂクローン「ＩＦＮ−Ａ」、「５７Ｅ」、および「５７Ｄ」を同定した。ＧＰＮＡ溶出を用いて、ファージプールからＦａｂクローン「ＧＰ−Ａ」および「５８Ｃ」を同定した。ＲＤＭＡ溶出を用いて、ファージプールからＦａｂクローン「ＲＤ−Ａ２」、「ＲＤ−Ｂ」および「５９−Ａ２」を同定した。ＢＳＭＡ溶出を用いて、ファージプールからＦａｂクローン「ＢＳ−Ａ」および「ＢＳ−Ｂ」を同定した。ｈＩＦＮ−γ Ｒ１溶出を用いて、ファージプールからＦａｂクローン「６７Ｃ」を同定した。大規模救出ファージ調製物に対して、９つのユニークなクローンの濃度依存的クローンファージＥＬＩＳＡを行って、そしてこれを図１および図２に例示した。これらのＦａｂファージは、ＥＬＩＳＡプロフィールに基づいて、３つのグループに分けることも可能である。グループＡには、Ｆａｂクローン「ＧＰ−Ａ」および「ＢＳ−Ｂ」が含まれる。これらの２つのＦａｂファージは強い結合剤であり、ＥＬＩＳＡシグナルは５Ｅ９ｐｆｕ／ウェルで飽和に到達する。グループＢには、Ｆａｂクローン「ＢＳ−Ａ」、「ＲＤ−Ａ２」、「ＩＮＦ−Ａ」および「５７Ｅ」が含まれる。これらは強い結合剤から穏やかな結合剤であり、優れた濃度依存性結合曲線を示す。グループＣには、Ｆａｂクローン「５７Ｄ」、「５８Ｃ」、「ＲＤ−Ｂ」および「６７Ｃ」が含まれる。これらは弱いが特異的であり、そして濃度依存性のＩＦＮγ結合剤である。 A total of 11 Fab clones were identified. Fab clones “IFN-A”, “57E”, and “57D” were identified from the phage pool using E. coli hIFN-γ elution. Fab clones “GP-A” and “58C” were identified from the phage pool using GPNA elution. Fab clones “RD-A2”, “RD-B” and “59-A2” were identified from the phage pool using RDMA elution. Fab clones “BS-A” and “BS-B” were identified from the phage pool using BSMA elution. Fab clone “67C” was identified from the phage pool using hIFN-γ R1 elution. Nine unique clonal concentration-dependent clonal phage ELISAs were performed on large rescue phage preparations and are illustrated in FIGS. These Fab phages can also be divided into three groups based on the ELISA profile. Group A includes Fab clones “GP-A” and “BS-B”. These two Fab phages are strong binders and the ELISA signal reaches saturation at 5E9 pfu / well. Group B includes Fab clones “BS-A”, “RD-A2”, “INF-A” and “57E”. These are strong to mild binders and show excellent concentration-dependent binding curves. Group C includes Fab clones “57D”, “58C”, “RD-B” and “67C”. These are weak but specific and concentration dependent IFNγ binders.

Ｆａｂクローンの配列解析
ユニークなＩＦＮγ結合Ｆａｂファージクローンの確認を以下のように行った：ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ^ＴＭプラスミド・ミディ・キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１２２４５）を用いて、ユニークなＦａｂＢｓｔＮＩ消化パターン各々の代表のプラスミドＤＮＡを調製し、そして配列決定に送った。ＦａｂＢｓｔＮＩパターンすべての配列がユニークであることが確認され、そして個々の重鎖配列および軽鎖配列が明らかになった（図３〜２４を参照されたい）。 Sequence analysis of Fab clones Unique IFNγ binding Fab phage clones were confirmed as follows: A QIAfilter ^™ plasmid midi kit (Qiagen, Cat # 12245) was used to represent each of the unique Fab BstNI digestion patterns. Plasmid DNA was prepared and sent for sequencing. The sequences of all Fab BstNI patterns were confirmed to be unique and individual heavy and light chain sequences were revealed (see FIGS. 3-24).

Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「ＲＤ−Ｂ１」、「ＲＤ−Ａ２」、「５８Ｃ」、「ＧＰ−Ａ」、「５７Ｄ」、「５７Ｅ」、「ＩＦＮ−Ａ」、「６７Ｃ」および「５９−Ａ２」の重鎖のＤＮＡおよび予測されるアミノ酸配列（それぞれ配列番号６５〜８６）を、それぞれ図３〜１３に示した。Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「ＲＤ−Ｂ１」、「ＲＤ−Ａ２」、「５８Ｃ」、「ＧＰ−Ａ」、「５７Ｄ」、「５７Ｅ」、「ＩＦＮ−Ａ」、「６７Ｃ」および「５９−Ａ２」の軽鎖のＤＮＡおよび予測されるアミノ酸配列（それぞれ配列番号８７〜１０８）を、それぞれ図１４〜２４に示した。図３１に示すように、１１のＦａｂすべての重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を比較した。ＧＣＧの「ＢｅｓｔＦｉｔ」プログラムを用いて、Ｆａｂ各対間の同一性および類似性のパーセンテージを得た。重鎖中の最も密接なマッチは、「ＢＳ−Ａ」、「ＲＤ−Ａ２」および「ＩＦＮ−Ａ」中である。「ＢＳ−Ａ」および「ＲＤ−Ａ２」の重鎖配列は、同一のフレームワークおよびＣＤＲ１およびＣＤＲ２を有する。これらはＣＤＲ３のみが異なり、そして９２．６％の同一性および９３．４％の類似性を有する。最初のアミノ酸を例外として、「ＢＳ−Ａ」および「ＩＦＮ−Ａ」の重鎖配列は、同一のフレームワークおよびＣＤＲ１およびＣＤＲ２を有し、そして異なるＣＤＲ３を有する。これらは９３．５％の同一性および９５．１％の類似性を共有する。同じことが「ＩＦＮ−Ａ」および「ＲＤ−Ａ２」の重鎖配列にも当てはまり、これらは９０．５％の同一性および９２．１％の類似性を持つ。Ｆａｂ「５７Ｅ」の重鎖のアミノ酸配列は、「ＢＳ−Ａ」の重鎖配列に８８．１％の同一性および８９．０％の類似性を示し、「ＲＤ−Ａ２」の重鎖配列に８８．８％の同一性および９０．０％の類似性を示し、そしてＩＦＮ−Ａの重鎖配列に８９．０％の同一性および９０．７％の類似性を示す。Ｆａｂ「ＢＳ−Ｂ」の重鎖のアミノ酸配列は、「５７Ｄ」の重鎖配列に８８．６％の同一性および９０．４％の類似性を示し、「ＧＰ−Ａ」の重鎖配列に８１．７％の同一性および８３．３％の類似性を示し、そして５８Ｃの重鎖配列に８３．９％の同一性および８４．７％の類似性を示す。軽鎖中の最も密接なマッチは、「５９−Ａ２」および「ＢＳ−Ａ」間の９０．８％の同一性および９１．７％の類似性、「ＢＳ−Ａ」および「ＢＳ−Ｂ」間の８９．０％の同一性および９０．９％の類似性、「５７Ｅ」および「ＢＳ−Ａ」間の８８．２％の同一性および９０．９％の類似性、「５７Ｅ」および「ＢＳ−Ｂ」間の８９．７％の同一性および９１．５％の類似性、そして「５９−Ａ２」および「ＢＳ−Ｂ」間の８８．２％の同一性および８８．２％の類似性である。Ｆａｂの３対、「５９−Ａ２」／「ＢＳ−Ｂ」、「５７Ｅ」／「ＢＳ−Ａ」および「ＩＦＮ−Ａ」／「ＲＤ−Ａ２」のみが、重鎖および軽鎖両方で密接にマッチしている。 Fab “BS-A”, “BS-B”, “RD-B1”, “RD-A2”, “58C”, “GP-A”, “57D”, “57E”, “IFN-A”, “ 67C "and" 59-A2 "heavy chain DNA and predicted amino acid sequences (SEQ ID NOs: 65-86, respectively) are shown in FIGS. Fab “BS-A”, “BS-B”, “RD-B1”, “RD-A2”, “58C”, “GP-A”, “57D”, “57E”, “IFN-A”, “ The light chain DNA of "67C" and "59-A2" and the predicted amino acid sequence (SEQ ID NOs: 87 to 108, respectively) are shown in FIGS. 14 to 24, respectively. As shown in FIG. 31, the amino acid sequences of all 11 Fab heavy and light chains were compared. GCG's “BestFit” program was used to obtain percentages of identity and similarity between each pair of Fabs. The closest matches in the heavy chain are in “BS-A”, “RD-A2” and “IFN-A”. The heavy chain sequences of “BS-A” and “RD-A2” have the same framework and CDR1 and CDR2. They differ only in CDR3 and have 92.6% identity and 93.4% similarity. With the exception of the first amino acid, the heavy chain sequences of “BS-A” and “IFN-A” have the same framework and CDR1 and CDR2 and have different CDR3. They share 93.5% identity and 95.1% similarity. The same applies to the heavy chain sequences of “IFN-A” and “RD-A2”, which have 90.5% identity and 92.1% similarity. The amino acid sequence of the heavy chain of Fab “57E” shows 88.1% identity and 89.0% similarity to the heavy chain sequence of “BS-A” and the heavy chain sequence of “RD-A2”. It shows 88.8% identity and 90.0% similarity and shows 89.0% identity and 90.7% similarity to the heavy chain sequence of IFN-A. The amino acid sequence of the heavy chain of Fab “BS-B” shows 88.6% identity and 90.4% similarity to the heavy chain sequence of “57D” and the heavy chain sequence of “GP-A”. It shows 81.7% identity and 83.3% similarity, and shows 83.9% identity and 84.7% similarity to the 58C heavy chain sequence. The closest matches in the light chain are 90.8% identity and 91.7% similarity between “59-A2” and “BS-A”, “BS-A” and “BS-B”. 89.0% identity and 90.9% similarity between, 88.2% identity and 90.9% similarity between “57E” and “BS-A”, “57E” and “ 89.7% identity and 91.5% similarity between “BS-B” and 88.2% identity and 88.2% similarity between “59-A2” and “BS-B” It is sex. Only 3 pairs of Fabs, “59-A2” / “BS-B”, “57E” / “BS-A” and “IFN-A” / “RD-A2”, are closely in both heavy and light chain It matches.

相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列の比較を図２５に示す。１１の抗ＩＦＮγ Ｆａｂの重鎖ＣＤＲ３は、類似性をほとんど共有しない。図３２に示すように、重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲのいずれの類似性にしたがって、Ｆａｂをグループ分けすることも可能である。クローン「ＢＳ−Ａ」、「ＩＦＮ−Ａ」および「ＲＤ−Ａ２」は、同一の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２を有する。しかし、最後の３つの残基が同一である（ＦＤＹ）ことを除いて、これらの重鎖ＣＤＲ３は、非常に異なる。興味深いことに、ＩＦＮ−ＡおよびＲＤ−Ａ２はまた、緊密にマッチする軽鎖ＣＤＲ１（１１／１６の同一残基）、ＣＤＲ２（５／７の同一残基）、およびＣＤＲ３（８／９の同一残基）も共有する。クローン「ＢＳ−Ｂ」、「５９−Ａ２」、「ＧＰ−Ａ」、および「５７Ｄ」は、類似の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２を有する。クローン「ＢＳ−Ｂ」および「５９−Ａ２」は、同一の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２を有するが、非常に異なる重鎖ＣＤＲ３を有する。クローン「５９−Ａ２」、「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」および「５７Ｅ」の３つの軽鎖ＣＤＲはすべて、非常に類似である。 A comparison of the amino acid sequences of complementarity determining regions (CDRs) is shown in FIG. Eleven anti-IFNγ Fab heavy chain CDR3s share little similarity. As shown in FIG. 32, Fabs can be grouped according to the similarity of either heavy chain or light chain CDRs. Clones "BS-A", "IFN-A" and "RD-A2" have the same heavy chain CDR1 and CDR2. However, these heavy chain CDR3s are very different, except that the last three residues are identical (FDY). Interestingly, IFN-A and RD-A2 are also closely matched light chain CDR1 (11/16 identical residues), CDR2 (5/7 identical residues), and CDR3 (8/9 identical) Share residues). Clones "BS-B", "59-A2", "GP-A", and "57D" have similar heavy chain CDR1 and CDR2. Clones "BS-B" and "59-A2" have the same heavy chain CDR1 and CDR2, but have very different heavy chain CDR3. All three light chain CDRs of clones “59-A2”, “BS-A”, “BS-B” and “57E” are very similar.

（実施例４）
可溶性Ｆａｂの発現および精製
大腸菌株ＨＢ２１５１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、ユニークな結合剤のプラスミドＤＮＡで形質転換した。形質転換ＨＢ２１５１の一晩培養物を２ｘＹＴ−ＡＧブロス中、３０℃で増殖させた。１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１％グルコースを含有する７５０ｍｌの２ｘＹＴに、一晩培養物７．５ｍｌを接種し、そして３７℃で約２時間、振盪しながら（２７０ｒｐｍ）インキュベーションした。ＯＤ_５９０が０．８〜１．０に到達したら、誘導のため、ＩＰＴＧを１ｍＭ添加した。培養物を振盪しながら３０℃で４時間増殖させ続けた。培養物を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、そして上清を廃棄した。浸透圧ショックアプローチを用いて、Ｆａｂの周辺腔放出を達成した。８ｍｌの氷冷ＴＥＳ（０．２ＭＴｒｉｓ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、１７．１％スクロース、ｐＨ８．０）に細胞を懸濁し、そしてときどき穏やかに振盪しながら氷上で５〜１０分間インキュベーションした。空の試験管を８．８ｍｌのＴＥＳ／Ｈ_２Ｏ（１：３）でリンスし、これを細胞懸濁物にプールした。 Example 4
Soluble Fab Expression and Purification E. coli strain HB2151 (Pharmacia) was transformed with a unique binder plasmid DNA. An overnight culture of transformed HB2151 was grown at 30 ° C. in 2 × YT-AG broth. 750 ml of 2 × YT containing 100 μg / ml ampicillin and 0.1% glucose was inoculated with 7.5 ml of overnight culture and incubated at 37 ° C. for about 2 hours with shaking (270 rpm). When OD ₅₉₀ reached 0.8-1.0, 1 mM IPTG was added for induction. The culture was continued to grow for 4 hours at 30 ° C. with shaking. The culture was centrifuged at 4000 rpm for 20 minutes and the supernatant was discarded. An osmotic shock approach was used to achieve peripheral cavity release of the Fab. Cells were suspended in 8 ml ice cold TES (0.2 M Tris, 0.5 mM EDTA, 17.1% sucrose, pH 8.0) and incubated on ice for 5-10 minutes with occasional gentle shaking. Empty tubes were rinsed with 8.8 ml TES / H ₂ O (1: 3) and pooled into the cell suspension.

細胞懸濁物を氷上でさらに２０分間インキュベーションし、そして４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を注意深く別の試験管に移し、そして８０００ｒｐｍで２０分間、再度遠心分離した。生じた上清は、ＴＥＳ放出周辺腔分画であった。細胞ペレットを１０ｍｌＴＥＳ／１５ｍＭＭｇＳＯ_４に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベーションし、次いで上述のように２回遠心分離した。最後の上清は、Ｍｇ放出周辺腔分画であり、そしてＴＥＳ放出周辺腔分画にともにプールした。 The cell suspension was further incubated on ice for 20 minutes and centrifuged at 4,000 rpm for 15 minutes. The supernatant was carefully transferred to another tube and centrifuged again at 8000 rpm for 20 minutes. The resulting supernatant was a TES release peripheral cavity fraction. The cell pellet was resuspended in 10 ml TES / 15 mM MgSO ₄ , incubated for 15 minutes on ice and then centrifuged twice as described above. The final supernatant was the Mg release periplasmic fraction and was pooled together in the TES release periplasmic fraction.

周辺腔分画に、最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようにキャリアーおよび安定化剤としてＢＳＡを添加した。プロテアーゼ阻害剤を加えた、２ｌの超音波処理緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．５）に対して、１回交換しつつ、周辺腔分画を透析した。１／１０体積のあらかじめ平衡化したＴＡＬＯＮ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に周辺腔分画を添加し、そして穏やかに振動させながら４℃で１時間インキュベーションした。樹脂混合物を１３００ｒｐｍで３分間遠心分離し、そして上清をできるだけ多く取り除いた。樹脂を１０体積の超音波処理緩衝液で洗浄し、次いで１３００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を廃棄した。洗浄した樹脂を１ベッド体積の超音波処理緩衝液に懸濁し、そしてカラムに充填し、これを３ベッド体積の超音波処理緩衝液で洗浄した。２ベッド体積の２００ｍＭイミダゾールを用いて、Ｆａｂを溶出させた。精製したＦａｂをＰＢＳ、ｐＨ７．４に透析した。 BSA as a carrier and stabilizer was added to the peripheral cavity fraction to a final concentration of 1 mg / ml. The periplasmic fraction was dialyzed with one change against 2 l of sonication buffer (20 mM Tris-HCl / 0.1 M NaCl, pH 8.5) with protease inhibitors. Peripheral compartment fractions were added to 1/10 volume of pre-equilibrated TALON resin (Clontech) and incubated for 1 hour at 4 ° C. with gentle shaking. The resin mixture was centrifuged at 1300 rpm for 3 minutes and as much supernatant as possible was removed. The resin was washed with 10 volumes of sonication buffer and then centrifuged at 1300 rpm for 3 minutes. The supernatant was discarded. The washed resin was suspended in 1 bed volume of sonication buffer and packed into a column which was washed with 3 bed volumes of sonication buffer. Fab was eluted using 2 bed volumes of 200 mM imidazole. The purified Fab was dialyzed against PBS, pH 7.4.

（実施例５）
全長ヒトＩＦＮγ抗体のクローニングおよび発現
以下の方法によって、ＦＡｂクローンを全長抗体に変換した。 (Example 5)
Cloning and expression of full-length human IFNγ antibody The FAb clone was converted to a full-length antibody by the following method.

ｐＤＳＲα１９：ｈＩｇＧ１ＣＨの構築
プラスミドｐＤＳＲα１９：抗ヒトＯＰＧＬＩｇＧ１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｍＢＩで消化して、抗ヒトＯＰＧＬ可変領域のコード領域を除去した。１．０ｋｂｐヒトＩｇＧ１定常領域ドメイン（Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメイン）を含有する直鎖プラスミドｐＤＳＲα１９：ｈＩｇＧ１ＣＨをゲル単離し、そしてＦＡｂ由来抗ＩＦＮ−ガンマ可変領域を受け入れさせるのに用いた。 Construction of pDSRα19: hIgG1 CH Plasmid pDSRα19: anti-human OPGL IgG1 was digested with HindIII and BsmBI to remove the coding region of the anti-human OPGL variable region. Gel-isolate linear plasmid pDSRα19: hIgG1 CH containing 1.0 kbp human IgG1 constant region domain (C _H 1, hinge, C _H 2 and C _H 3 domains) and accept FAb-derived anti-IFN-gamma variable region Used to make.

ｐＤＳＲα１９：抗ＩＦＮガンマＢＳ−Ａ重鎖の構築
抗ＩＦＮ−ガンマＦＡｂ重鎖ｃＤＮＡをｐＤＳＲα１９：ｈＩｇＧ１ＣＨにクローニングして、ＦＡｂを全長ＩｇＧに変換した。「ＢＳ−Ａ」重鎖をコードするプラスミドの構築を本明細書に記載する。類似の方法を用いて、他のＦＡｂ重鎖をクローニングした。シグナル配列を持つＦＡｂを生成するため、３工程ＰＣＲを行った。まず、ＦＡｂｃＤＮＡテンプレートとともにプライマー２４８５−５１（以下に示す）および２４６５−６８（以下に示す）を用いた。条件は：Ｐｆｕポリメラーゼ、並びに適切な緩衝液およびヌクレオチドを用いて、９４℃１分間、（９４℃２０秒間、４８℃３０秒間、７４℃３０秒間）を４周期、（９４℃２０秒間、６６℃３０秒間、７４℃３０秒間）を２５周期、および７４℃５分間であった。次いで、プライマー２１４８−９８（以下に示す）および２４６５−６８（以下に示す）を用いてＰＣＲ産物を増幅し、その後、プライマー２４８９−３６（以下に示す）および２４６５−６８（以下に示す）を用いて増幅した。最終ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎで精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｍＢＩで切断し、そしてＱｉａｇｅｎで精製した。５’コザック（翻訳開始）部位および哺乳動物発現のための以下のシグナル配列： Construction of pDSRα19: anti-IFN gamma BS-A heavy chain Anti-IFN-gamma FAb heavy chain cDNA was cloned into pDSRα19: hIgG1 CH to convert FAb to full-length IgG. The construction of a plasmid encoding the “BS-A” heavy chain is described herein. Similar methods were used to clone other FAb heavy chains. Three-step PCR was performed to generate FAb with a signal sequence. First, primers 2485-51 (shown below) and 2465-68 (shown below) were used together with the FAb cDNA template. The conditions are: 94 ° C. for 1 minute (94 ° C. for 20 seconds, 48 ° C. for 30 seconds, 74 ° C. for 30 seconds), 4 cycles (94 ° C. for 20 seconds, 66 ° C.) using Pfu polymerase and appropriate buffers and nucleotides. 30 seconds at 74 ° C for 30 seconds) and 25 cycles at 74 ° C for 5 minutes. The PCR product was then amplified using primers 2148-98 (shown below) and 2465-68 (shown below), followed by primers 2489-36 (shown below) and 2465-68 (shown below). Amplified. The final PCR product was purified with Qiagen, cut with HindIII and BsmBI, and purified with Qiagen. 5 'Kozak (translation start) site and the following signal sequences for mammalian expression:

とともにＦＡｂを含有するこの断片を、ｐＤＳＲα１９：ｈＩｇＧ１ＣＨに連結した。 This fragment, together with the FAb, was ligated into pDSRα19: hIgG1 CH.

ｐＤＳＲα１９：抗ＩＦＮガンマＢＳ−Ａ重鎖の構築
ＦＡｂ軽鎖ｃＤＮＡをｐＤＳＲα１９にクローニングして、ＦＡｂを全長抗体に変換した。「ＢＳ−Ａ」軽鎖をコードするプラスミドの構築を本明細書に記載する。類似の方法を用いて、他のＦＡｂをクローニングした。シグナル配列を持つＦＡｂ「ＢＳ−Ａ」を生成するため、３工程ＰＣＲを行った。まず、ＦＡｂｃＤＮＡテンプレートとともにプライマー２５２５−４３（以下に示す）および２５７８−２７（以下に示す）を用いた。ＰＣＲ条件は：ｐｆｕポリメラーゼ、並びに適切な緩衝液およびヌクレオチドを用いて、９４℃１分間、（９４℃２０秒間、４８℃３０秒間、７４℃３０秒間）を４周期、（９４℃２０秒間、６６℃３０秒間、７４℃３０秒間）を２５周期、および７４℃５分間であった。次いで、ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして次いで、プライマー２１４８−９８（以下に示す）および２５７８−２７（以下に示す）で増幅した。次に、再び、ＦＡｂｃＤＮＡテンプレートとともに、プライマー２５７８−２６（以下に示す）および２４６９−６７（以下に示す）を用いた。ＰＣＲ条件は：Ｐｆｕポリメラーゼ、並びに適切な緩衝液およびヌクレオチドを用いて、９４℃１分間、（９４℃２０秒間、４８℃３０秒間、７４℃３０秒間）を４周期、（９４℃２０秒間、６６℃３０秒間、７４℃３０秒間）を２５周期、および７４℃５分間であった。ＰＣＲ産物をゲル単離し、そして同じ条件を用いて再増幅した。最後にゲル単離したＰＣＲ産物をプライマー２４８９−３６（以下に示す）および２４６９−６７（以下に示す）と混合し、そして増幅した。最終ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎで精製し、ＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断し、そしてＱｉａｇｅｎで精製した。５’コザック（翻訳開始）部位および哺乳動物発現のための以下のシグナル配列： pDSRα19: Construction of anti-IFN gamma BS-A heavy chain The FAb light chain cDNA was cloned into pDSRα19 to convert the FAb into a full-length antibody. The construction of a plasmid encoding the “BS-A” light chain is described herein. Other FAbs were cloned using a similar method. Three-step PCR was performed to generate FAb “BS-A” with a signal sequence. First, primers 2525-43 (shown below) and 2578-27 (shown below) were used together with the FAb cDNA template. PCR conditions are: 94 ° C. for 1 minute (94 ° C. for 20 seconds, 48 ° C. for 30 seconds, 74 ° C. for 30 seconds), 4 cycles (94 ° C. for 20 seconds, 66 ° C.) using pfu polymerase and appropriate buffers and nucleotides. 30 seconds at 74 ° C. and 30 seconds at 74 ° C.) for 25 cycles, and 74 ° C. for 5 minutes. The PCR product was then gel purified and then amplified with primers 2148-98 (shown below) and 2578-27 (shown below). Next, primers 2578-26 (shown below) and 2469-67 (shown below) were again used together with the FAb cDNA template. PCR conditions are: 94 ° C. for 1 minute (94 ° C. for 20 seconds, 48 ° C. for 30 seconds, 74 ° C. for 30 seconds), 4 cycles (94 ° C. for 20 seconds, 66 ° C.) using Pfu polymerase and appropriate buffers and nucleotides. 30 seconds at 74 ° C. and 30 seconds at 74 ° C.) for 25 cycles, and 74 ° C. for 5 minutes. The PCR product was gel isolated and reamplified using the same conditions. Finally, the gel isolated PCR product was mixed with primers 2489-36 (shown below) and 2469-67 (shown below) and amplified. The final PCR product was purified with Qiagen, cut with XbaI and SalI, and purified with Qiagen. 5 'Kozak (translation start) site and the following signal sequences for mammalian expression:

とともにＦＡｂを含有するこの断片を、ｐＤＳＲα１９に連結した。 This fragment, together with the FAb, was ligated to pDSRα19.

抗体調製
重鎖および軽鎖全長抗体をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、そして重鎖および軽鎖の発現、並びに細胞培地への分泌を可能にする条件下で培養した。０．４５μｍの酢酸セルロース・フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ、マサチューセッツ州アクトン）を通して馴化培地をろ過し、そして塩化カルシウム不含で、そして塩化マグネシウム不含である、ＰＢＳ−ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＧｉｂｃｏＢＲＬＰｒｏｄｕｃｔｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）で平衡化しておいたプロテインＧセファロース（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）カラムに適用した。試料を適用した後、２８０ｎｍの吸光度がベースラインに達するまで、カラムをＰＢＳで洗浄した。１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５を用いて、タンパク質の溶出を達成した。分画を収集し、そして１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．２を添加することによって、直ちに中和した。クーマシー染色によってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを視覚化することによって抗体を検出した。 Antibody preparation Expression vectors containing cDNA encoding heavy and light chain full-length antibodies were transfected into CHO cells and cultured under conditions that allowed expression of the heavy and light chains and secretion into the cell culture medium . Filter the conditioned medium through a 0.45 μm cellulose acetate filter (Corning, Acton, Mass.) And PBS-Dulbecco's phosphate buffered saline (Gibco BRL) free of calcium chloride and free of magnesium chloride. Applied to a Protein G Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) column that had been equilibrated with Products, Grand Island, NY. After applying the sample, the column was washed with PBS until the absorbance at 280 nm reached baseline. Protein elution was achieved using 100 mM glycine, pH 2.5. Fractions were collected and immediately neutralized by adding 1M Tris-HCl, pH 9.2. Antibodies were detected by visualizing SDS-polyacrylamide gels by Coomassie staining.

抗体を含有する分画をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０（Ａｍｉｃｏｎ）または体積がより多い場合は、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０（Ａｍｉｃｏｎ）いずれかを用いて、濃縮し、そしてＰＢＳ中に透析ろ過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）した。 Fractions containing antibody were pooled, concentrated using either Centricon 10 (Amicon) or, if larger in volume, Centriprep 10 (Amicon), and diafiltered in PBS.

単離抗体を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上のゲルろ過によって性質決定し、そして該抗体は、単量体ＩｇＧとして移動することが示された。 Isolated antibody was characterized by gel filtration on Superose 6 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) and shown to migrate as monomeric IgG.

（実施例６）
ＦａｂおよびＩｇＧの親和性測定
表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって、結合定数（Ｋｄ）、結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）を決定した。Ｆａｂおよび抗体のＢＩＡｃｏｒｅ解析を以下のように行った：ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥＩｎｃ．）を室温で用いて、実験を行った。ＣＨＯが発現したｈＩＦＮγをＣＭ５チップに固定した。多様な濃度のＦａｂまたはＦａｂＩｇＧをｈｕ−ＩＦＮγ表面に注入した。ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ３．１ソフトウェア（ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を用いてデータを解析した。結果を図３０に示す。 (Example 6)
Binding constants (Kd), association rate constants (ka) and dissociation rate constants (kd) were determined by surface plasmon resonance technology (BIAcore, Pharmacia, Piscataway, NJ) for affinity measurements of Fab and IgG . BIAcore analysis of Fab and antibodies was performed as follows: Experiments were performed using BIACORE 2000 (BIACORE Inc.) at room temperature. HIFNγ expressing CHO was immobilized on a CM5 chip. Various concentrations of Fab or Fab IgG were injected onto the hu-IFNγ surface. Data was analyzed using BIAEVALUTION 3.1 software (BIACORE, Inc.). The results are shown in FIG.

（実施例７）
ＦａｂおよびＩｇＧの活性測定
ＢＩＡｃｏｒｅ中和アッセイ
ＩｇＧに変換されたＦａｂの中和活性をＢＩＡｃｏｒｅ上で試験した（実施例６を参照されたい）。結果を図２９に示す。ＢＳ−ＢＩｇＧに関して、９ｎＭのＩＣ５０で、ＩＦＮγ−Ｒ１へのｈｕＩＦＮγ結合の濃度依存性阻害が観察された。 (Example 7)
Measurement of Fab and IgG activity
BIAcore neutralization assay The neutralizing activity of Fab converted to IgG was tested on BIAcore (see Example 6). The results are shown in FIG. For BS-B IgG, a concentration-dependent inhibition of hu IFNγ binding to IFNγ-R1 was observed with an IC50 of 9 nM.

Ａ５４９細胞増殖アッセイ
Ａ５４９増殖アッセイ（実施例１に記載）において、ＦａｂおよびＩｇＧの中和活性測定を以下のように行った：Ａ５４９細胞を、標的化されたＦａｂまたはＩｇＧ（多様な濃度）およびＣＨＯに発現されたｈＩＦＮγ（２ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌ）の混合物で処理した。Ｆａｂ濃度は、０．３〜１５０μｇ／ｍｌの範囲であった。ＩｇＧ濃度は０．１〜１００μｇ／ｍｌの範囲であった。陽性対照Ａｂ（ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＢ２７）濃度は、０．０１〜５μｇ／ｍｌの範囲であった。処理５日後、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅで細胞を染色し、そして染色４時間後、ＦＬ５００プレート読取装置上で解析した。ＢＳ−ＡＦａｂ、ＢＳ−ＢＦａｂおよびＧＰ−ＡＦａｂに関しては図２６に、そしてＢＳ−ＡＩｇＧおよびＢＳ−ＢＩｇＧに関しては図２７に結果を示す。図２６のＢＳ−ＡＦａｂおよびＢＳ−ＢＦａｂ、並びに図２７のＢＳ−ＡＩｇＧおよびＢＳ−ＢＩｇＧは、増殖活性として測定した際、高濃度で、陽性対照よりも約２桁高い中和活性を有することが示された。 A549 Cell Proliferation Assay In the A549 proliferation assay (described in Example 1), Fab and IgG neutralization activity measurements were performed as follows: A549 cells were treated with targeted Fab or IgG (various concentrations) and CHO. Were treated with a mixture of hIFNγ expressed at 2 ng / ml or 5 ng / ml. The Fab concentration ranged from 0.3 to 150 μg / ml. IgG concentrations ranged from 0.1 to 100 μg / ml. Positive control Ab (Pharmingen B27) concentrations ranged from 0.01 to 5 μg / ml. Five days after treatment, cells were stained with Alamar Blue and analyzed on a FL500 plate reader 4 hours after staining. The results are shown in FIG. 26 for BS-A Fab, BS-B Fab and GP-A Fab, and in FIG. 27 for BS-A IgG and BS-B IgG. The BS-A Fab and BS-B Fab of FIG. 26, and the BS-A IgG and BS-B IgG of FIG. 27, when measured as proliferative activity, were at high concentrations and about two orders of magnitude higher than the positive control. It was shown to have

本発明は、好ましい態様に関して記載されてきているが、当業者には多様な変型および修飾が思い浮かぶであろうことが理解された。したがって、付随する請求項が、請求された際に本発明の範囲内に属するであろう、こうした同等の変型をすべて含むと意図された。 Although the present invention has been described with reference to preferred embodiments, it is understood that various variations and modifications will occur to those skilled in the art. Accordingly, the appended claims are intended to cover all such equivalent variations that would fall within the scope of the invention as claimed.

図１は、主なファージＦａｂクローンのｈＩＦＮγに対する反応性に関するＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。２％ＭＰＢＳであらかじめブロッキングしたファージ懸濁物を、ウェルあたり最大１００μｌ用いて、ファージ希釈を行い、ＥＬＩＳＡにおいて典型的な１０^９〜１０^１１ファージ／ウェルの範囲とした。実施例３に記載するように、ＥＬＩＳＡ用のファージストックを調製した。値は、単一点測定によるものであり、そしてシグナル検出のため、ＯＤ_４０５を測定した。FIG. 1 is a graph showing the results of ELISA relating to the reactivity of main phage Fab clones to hIFNγ. Phage suspension pre-blocked with 2% MPBS was used with a maximum of 100 μl per well to make phage dilutions that ranged from 10 ⁹ to 10 ¹¹ phage / well typical in ELISA. As described in Example 3, a phage stock for ELISA was prepared. Values are from a single point measurement and OD ₄₀₅ was measured for signal detection. 図２は、主なＦａｂ「ＧＰ−Ａ」および「ＢＳ−Ｂ」クローンのｈＩＦＮγに対する反応性に関する、用量依存性クローンファージＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。２％ＭＰＢＳであらかじめブロッキングしたファージ懸濁物を、ウェルあたり最大１００μｌ用いて、ファージ希釈を行い、ＥＬＩＳＡにおいて典型的な１０^９〜１０^１１ファージ／ウェルの範囲とした。実施例３に記載するように、ＥＬＩＳＡ用のファージストックを調製した。値は、単一点測定によるものであり、そしてシグナル検出のため、ＯＤ_４０５を測定した。FIG. 2 is a graph showing the results of a dose-dependent clonal phage ELISA on the reactivity of the main Fab “GP-A” and “BS-B” clones to hIFNγ. Phage suspension pre-blocked with 2% MPBS was used with a maximum of 100 μl per well to make phage dilutions that ranged from 10 ⁹ to 10 ¹¹ phage / well typical in ELISA. As described in Example 3, a phage stock for ELISA was prepared. Values are from a single point measurement and OD ₄₀₅ was measured for signal detection. 図３は、Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 3 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “BS-A” heavy chain. 図４は、Ｆａｂ「ＢＳ−Ｂ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 4 shows the nucleotide and amino acid sequence of Fab “BS-B” heavy chain. 図５は、Ｆａｂ「ＲＤ−Ｂ１」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 5 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “RD-B1” heavy chain. 図６は、Ｆａｂ「ＲＤ−Ａ２」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 6 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “RD-A2” heavy chain. 図７は、Ｆａｂ「５８Ｃ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 7 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “58C” heavy chain. 図８は、Ｆａｂ「ＧＰ−Ａ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 8 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “GP-A” heavy chain. 図９は、Ｆａｂ「５７Ｄ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 9 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “57D” heavy chain. 図１０は、Ｆａｂ「５７Ｅ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 10 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “57E” heavy chain. 図１１は、Ｆａｂ「ＩＦＮ−Ａ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 11 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “IFN-A” heavy chain. 図１２は、Ｆａｂ「６７Ｃ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 12 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “67C” heavy chain. 図１３は、Ｆａｂ「５９−Ａ２」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 13 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “59-A2” heavy chain. 図１４は、Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 14 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “BS-A” light chain. 図１５は、Ｆａｂ「ＢＳ−Ｂ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 15 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “BS-B” light chain. 図１６は、Ｆａｂ「ＲＤ−Ｂ１」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 16 shows the nucleotide and amino acid sequence of Fab “RD-B1” light chain. 図１７は、Ｆａｂ「ＲＤ−Ａ２」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 17 shows the nucleotide and amino acid sequence of Fab “RD-A2” light chain. 図１８は、Ｆａｂ「５８Ｃ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 18 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “58C” light chain. 図１９は、Ｆａｂ「ＧＰ−Ａ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 19 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “GP-A” light chain. 図２０は、Ｆａｂ「５７Ｄ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 20 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “57D” light chain. 図２１は、Ｆａｂ「５７Ｅ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 21 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “57E” light chain. 図２２は、Ｆａｂ「ＩＦＮ−Ａ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 22 shows the nucleotide and amino acid sequence of Fab “IFN-A” light chain. 図２３は、Ｆａｂ「６７Ｃ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 23 shows the nucleotide and amino acid sequences of Fab “67C” light chain. 図２４は、Ｆａｂ「５９−Ａ２」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 24 shows the nucleotide and amino acid sequence of Fab “59-A2” light chain. 図２５は、Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「ＲＤ−Ａ２」、「ＲＤ−Ｂ１」、「ＩＦＮ−Ａ」、「５７Ｅ」、「５７Ｄ」、「ＧＰ−Ａ」、「５８−Ｃ」、「６７Ｃ」および「５９−Ａ２」の重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列の比較を示す。FIG. 25 shows Fab “BS-A”, “BS-B”, “RD-A2”, “RD-B1”, “IFN-A”, “57E”, “57D”, “GP-A”, “ A comparison of the amino acid sequences of the heavy and light chain complementarity determining regions (CDRs) of “58-C”, “67C” and “59-A2” is shown. 図２６は、Ａ５４９細胞アッセイで測定した際のＦａｂ「ＢＳ−Ａ」および「ＢＳ−Ｂ」の中和活性を示すグラフである。実施例４に記載するようにＦａｂを精製し、そして０．３〜１５０μｇ／ｍｌのＦａｂ濃度範囲で添加した。ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＢ２７Ａｂ（０．０１〜５μｇ／ｍｌの濃度範囲）を陽性対照として用いた。処理５日後、細胞をＡｌａｍａｒＢｌｕｅで染色し、そしてＦＬ５００プレート読取装置上で、染色４時間後に解析した。FIG. 26 is a graph showing the neutralizing activity of Fab “BS-A” and “BS-B” as measured in the A549 cell assay. Fabs were purified as described in Example 4 and added at a Fab concentration range of 0.3-150 μg / ml. Pharmingen B27 Ab (0.01-5 μg / ml concentration range) was used as a positive control. Five days after treatment, cells were stained with Alamar Blue and analyzed 4 hours after staining on a FL500 plate reader. 図２７は、Ａ５４９細胞アッセイで測定した際の「ＢＳ−Ａ」ＩｇＧおよび「ＢＳ−Ｂ」ＩｇＧの中和活性を示すグラフである。実施例４に記載するようにＩｇＧを精製し、そして０．１〜１００μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度範囲で添加した。ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＢ２７Ａｂ（０．０１〜５μｇ／ｍｌの濃度範囲）を陽性対照として用いた。ｈＩＦＮγと反応しない無関係なＡｂ、ＡＴ−ＩｇＧ（０．０１〜５μｇ／ｍｌの濃度範囲）を陰性対照として用いた。処理５日後、細胞をＡｌａｍａｒＢｌｕｅで染色し、そしてＦＬ５００プレート読取装置上で、染色４時間後に解析した。FIG. 27 is a graph showing the neutralizing activity of “BS-A” IgG and “BS-B” IgG as measured by the A549 cell assay. IgG was purified as described in Example 4 and added at an IgG concentration range of 0.1-100 μg / ml. Pharmingen B27 Ab (0.01-5 μg / ml concentration range) was used as a positive control. An irrelevant Ab, AT-IgG (0.01-5 μg / ml concentration range) that does not react with hIFNγ was used as a negative control. Five days after treatment, cells were stained with Alamar Blue and analyzed 4 hours after staining on a FL500 plate reader. 図２８は、ＢｉａＣｏｒｅによって、そしてＡ５４９細胞アッセイにおいて測定した際の、「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「ＲＤ−Ａ２」、「ＲＤ−Ｂ」、「ＩＦＮ−Ａ」、「５７Ｅ」、「５７Ｄ」、「ＧＰ−Ａ」、「５８Ｃ」および「６７Ｃ」ＩｇＧの親和性および中和活性の比較を提供する表である。ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮを用いて、ＢＩＡＣＯＲＥデータを解析した。FIG. 28 shows “BS-A”, “BS-B”, “RD-A2”, “RD-B”, “IFN-A”, “57E” as measured by BiaCore and in the A549 cell assay. , “57D”, “GP-A”, “58C” and “67C” IgG, a table providing a comparison of affinity and neutralizing activity. BIACORE data was analyzed using BIAEVALUATION. 図２９は、ＢＩＡＣｏｒｅで測定した際の「ＢＳ−Ａ」ＩｇＧおよび「ＢＳ−Ｂ」ＩｇＧの中和活性を示すグラフである。相対結合反応（％）を、試料濃度（ｎＭ）に対してプロットしている。FIG. 29 is a graph showing the neutralizing activity of “BS-A” IgG and “BS-B” IgG as measured by BIACore. Relative binding reaction (%) is plotted against sample concentration (nM). 図３０は、ＢＩＡＣｏｒｅによって測定した際の、抗ＩＦＮγ Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「ＩＦＮ−Ａ」および「ＧＰ−Ａ」、並びに対応するＩｇＧの親和性の比較を提供する表である。FIG. 30 provides a comparison of the affinity of anti-IFNγ Fabs “BS-A”, “BS-B”, “IFN-A” and “GP-A” and the corresponding IgG as measured by BIACore. It is a table. 図３１は、図３〜２４に示すＦａｂアミノ酸配列の比較を示す。重鎖および軽鎖Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「ＲＤ−Ａ２」、「ＲＤ−Ｂ１」、「ＩＦＮ−Ａ」、「５７Ｅ」、「５７Ｄ」、「ＧＰ−Ａ」、「５８−Ｃ」、「６７Ｃ」および「５９−Ａ２」の予測されるアミノ酸配列を、同一性および類似性に関して比較した。ＧＣＧの「ＢｅｓｔＦｉｔ」プログラムを用いて、Ｆａｂの各対間の同一性および類似性パーセントを得た。FIG. 31 shows a comparison of the Fab amino acid sequences shown in FIGS. Heavy and light chain Fabs “BS-A”, “BS-B”, “RD-A2”, “RD-B1”, “IFN-A”, “57E”, “57D”, “GP-A”, The predicted amino acid sequences of “58-C”, “67C” and “59-A2” were compared for identity and similarity. GCG's “BestFit” program was used to obtain percent identity and similarity between each pair of Fabs. 図３２は、重鎖および軽鎖「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「ＲＤ−Ａ２」、「ＲＤ−Ｂ１」、「ＩＦＮ−Ａ」、「５７Ｅ」、「５７Ｄ」、「ＧＰ−Ａ」、「５８−Ｃ」、「６７Ｃ」および「５９−Ａ２」Ｆａｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）の並列を示す。FIG. 32 shows heavy and light chains “BS-A”, “BS-B”, “RD-A2”, “RD-B1”, “IFN-A”, “57E”, “57D”, “GP- A, “58-C”, “67C” and “59-A2” Fab complementarity determining regions (CDRs) are shown side by side. 図３３は、予測されるＦａｂ「ＢＳ−Ａ」、「ＲＤ−Ａ２」および「ＩＦＮ−Ａ」重鎖アミノ酸配列（それぞれ、図３、６および１１の両端を含む残基１〜１２０、１〜１２７および１〜１２６）と、ＶＨ４ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列４−３４、Ｄ領域配列１−１、３−３または３−１６、およびＪ領域配列ＪＨ４を含む。ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３は、３つのフレームワーク領域を指定し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、３つの相補性決定領域を指定し、そしてＨ１、Ｈ２およびＨ３は、フレームワーク領域およびＣＤＲの間の対応する接合部配列を指定する。「ＢＳ−Ａ」、「ＲＤ−Ａ２」、「ＩＦＮ−Ａ」および生殖系列Ｖ、Ｄ、またはＪ配列の間の相違を太字で示す。図３３〜４６の生殖系列アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，米国保健社会福祉省，第４版（１９９１）に記載されるとおりである。FIG. 33 shows the predicted Fab “BS-A”, “RD-A2” and “IFN-A” heavy chain amino acid sequences (residues 1-120, 1 and 2 containing both ends of FIGS. 3, 6 and 11, respectively). 127 and 1-126) and a comparison of germline sequences from the VH4 family. Germline sequences include V region sequence 4-34, D region sequence 1-1, 3-3 or 3-16, and J region sequence JH4. FR1, FR2 and FR3 specify three framework regions, CDR1, CDR2 and CDR3 specify three complementarity determining regions, and H1, H2 and H3 correspond between framework regions and CDRs Specifies the joint arrangement to be performed. Differences between “BS-A”, “RD-A2”, “IFN-A” and germline V, D, or J sequences are shown in bold. The numbering of germline amino acid residues in FIGS. 33-46 is as described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, 4th edition (1991). 図３４は、予測されるＦａｂ「ＢＳ−Ｂ」、および「５９−Ａ２」重鎖アミノ酸配列（それぞれ、図４および１３の両端を含む残基１〜１２１および１〜１２０）と、ＶＨ１ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列１−１８、Ｄ領域配列６−１３、１−１または１−７、およびＪ領域配列ＪＨ４を含む。FIG. 34 shows the predicted Fab “BS-B” and “59-A2” heavy chain amino acid sequences (residues 1-121 and 1-120 including both ends of FIGS. 4 and 13, respectively) and the VH1 family. A comparison of germline sequences is shown. Germline sequences include V region sequence 1-18, D region sequence 6-13, 1-1 or 1-7, and J region sequence JH4. 図３５は、予測されるＦａｂ「ＲＤ−Ｂ１」重鎖アミノ酸配列（図５の両端を含む残基１〜１１９）と、ＶＨ２ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列２−２６、Ｄ領域配列３−２２、およびＪ領域配列ＪＨ５を含む。FIG. 35 shows a comparison of the predicted Fab “RD-B1” heavy chain amino acid sequence (residues 1-119 including both ends of FIG. 5) and the germline sequence from the VH2 family. Germline sequences include V region sequence 2-26, D region sequence 3-22, and J region sequence JH5. 図３６は、予測されるＦａｂ「５８Ｃ」重鎖アミノ酸配列（図７の両端を含む残基１〜１１９）と、ＶＨ３ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列３−２１、未知のＤ領域配列、およびＪ領域配列ＪＨ４を含む。FIG. 36 shows a comparison of the predicted Fab “58C” heavy chain amino acid sequence (residues 1-119 including both ends of FIG. 7) and germline sequences from the VH3 family. Germline sequences include V region sequence 3-21, unknown D region sequence, and J region sequence JH4. 図３７は、予測されるＦａｂ「ＧＰ−Ａ」重鎖アミノ酸配列（図８の両端を含む残基１〜１２４）と、ＶＨ３ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列３−３０．３、Ｄ領域配列３−１０、およびＪ領域配列ＪＨ３を含む。FIG. 37 shows a comparison of the predicted Fab “GP-A” heavy chain amino acid sequence (residues 1-124 including both ends of FIG. 8) with germline sequences from the VH3 family. Germline sequences include V region sequence 3-30.3, D region sequence 3-10, and J region sequence JH3. 図３８は、予測されるＦａｂ「５７Ｄ」重鎖アミノ酸配列（図９の両端を含む残基１〜１１７）と、ＶＨ３ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列３−５３、Ｄ領域配列３−１６、および未知のＪ領域配列を含む。FIG. 38 shows a comparison of the predicted Fab “57D” heavy chain amino acid sequence (residues 1-117 including both ends of FIG. 9) and germline sequences from the VH3 family. Germline sequences include V region sequence 3-53, D region sequence 3-16, and unknown J region sequences. 図３９は、予測されるＦａｂ「５７Ｅ」重鎖アミノ酸配列（図１０の両端を含む残基１〜１１８）と、ＶＨ４ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列４−６１、Ｄ領域配列７−２７、およびＪ領域配列ＪＨ４を含む。FIG. 39 shows a comparison of the predicted Fab “57E” heavy chain amino acid sequence (residues 1-118 including both ends of FIG. 10) with the germline sequence from the VH4 family. Germline sequences include V region sequence 4-61, D region sequence 7-27, and J region sequence JH4. 図４０は、予測されるＦａｂ「６７Ｃ」重鎖アミノ酸配列（図１２の両端を含む残基１〜１１９）と、ＶＨ２ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列２−０５、Ｄ領域配列５−１８、およびＪ領域配列ＪＨ６を含む。FIG. 40 shows a comparison of the predicted Fab “67C” heavy chain amino acid sequence (residues 1-119 including both ends of FIG. 12) and germline sequences from the VH2 family. Germline sequences include V region sequence 2-05, D region sequence 5-18, and J region sequence JH6. 図４１は、予測されるＦａｂ「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「５７Ｅ」および「５９−Ａ２」軽鎖アミノ酸配列（それぞれ、図１４、１５、２１および２４の両端を含む残基１〜１１１、１〜１１０、１〜１１２および１〜１１０）と、Ｖλ６ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列６ａおよび未知のＪ領域配列あるいはＪＬ２またはＪＬ３を含む。FIG. 41 shows the predicted Fab “BS-A”, “BS-B”, “57E” and “59-A2” light chain amino acid sequences (residues including both ends of FIGS. 14, 15, 21 and 24, respectively). 1-111, 1-110, 1-112 and 1-110) and germline sequences from the Vλ6 family. Germline sequences include the V region sequence 6a and the unknown J region sequence or JL2 or JL3. 図４２は、予測されるＦａｂ「ＲＤ−Ｂ１」軽鎖アミノ酸配列（図１６の両端を含む残基１〜１１２）と、Ｖκ２ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列Ａ２３およびＪ領域配列ＪＫ２を含む。FIG. 42 shows a comparison of the predicted Fab “RD-B1” light chain amino acid sequence (residues 1-112 including both ends of FIG. 16) with the germline sequence from the Vκ2 family. Germline sequences include V region sequence A23 and J region sequence JK2. 図４３は、予測されるＦａｂ「ＲＤ−Ａ２」、「ＩＦＮ−Ａ」および「６７Ｃ」軽鎖アミノ酸配列（それぞれ、図１７、２２および２３の両端を含む残基１〜１１２、１〜１１０、１〜１１２および１〜１１０）と、Ｖκ２ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列Ａ１９、並びにそれぞれＪ領域配列ＪＫ３、ＪＫ２およびＪＫ２を含む。FIG. 43 shows the predicted Fab “RD-A2”, “IFN-A” and “67C” light chain amino acid sequences (residues 1-112, 1-110, including both ends of FIGS. 17, 22, and 23, respectively). 1-112 and 1-110) and a comparison of germline sequences from the Vκ2 family. Germline sequences include V region sequence A19 and J region sequences JK3, JK2 and JK2, respectively. 図４４は、予測されるＦａｂ「５８Ｃ」軽鎖アミノ酸配列（図１８の両端を含む残基１〜１０８）と、Ｖλ３ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列３ｈおよび未知のＪ領域配列を含む。FIG. 44 shows a comparison of the predicted Fab “58C” light chain amino acid sequence (residues 1-108 including both ends of FIG. 18) with the germline sequence from the Vλ3 family. The germline sequence includes the V region sequence 3h and the unknown J region sequence. 図４５は、予測されるＦａｂ「ＧＰ−Ａ」軽鎖アミノ酸配列（図１９の両端を含む残基１〜１０６）と、Ｖλ３ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列２−１９およびＪ領域配列ＪＬ２またはＪＬ３を含む。FIG. 45 shows a comparison of the predicted Fab “GP-A” light chain amino acid sequence (residues 1-106 including both ends of FIG. 19) and the germline sequence from the Vλ3 family. Germline sequences include V region sequence 2-19 and J region sequence JL2 or JL3. 図４６は、予測されるＦａｂ「５７Ｄ」軽鎖アミノ酸配列（図２０の両端を含む残基１〜１０８）と、Ｖκ３ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列Ａ２７およびＪ領域配列ＪＫ５を含む。FIG. 46 shows a comparison of the predicted Fab “57D” light chain amino acid sequence (residues 1-108 including both ends of FIG. 20) with the germline sequence from the Vκ3 family. Germline sequences include V region sequence A27 and J region sequence JK5. 図４７は、Ｆａｂクラスの比較を示す。多配列比較解析用のＧＣＧ（遺伝学コンピュータグループ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）ＰｉｌｅＵｐプログラムを用いて、Ｆａｂクラス比較を行った。記号（^＊＊）は、既知の生殖系列配列には関連していたが、最も密接なマッチング多様性（Ｄ）領域または連結領域（Ｊ）が決定不能であったことを示す。記号（^＊）は、同定された連結領域に比較して、１、２または３残基の変異が起きたことを示す。FIG. 47 shows the Fab class comparison. Fab class comparisons were performed using the GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) PileUp program for multiple sequence comparison analysis. The symbol ( ^** ) indicates that the closest matching diversity (D) region or junction region (J) was undecidable, although related to known germline sequences. The symbol ( ^* ) indicates that 1, 2, or 3 residue mutations have occurred compared to the identified linking region.

【配列表】

[Sequence Listing]

Claims

インターフェロン−ガンマ・タンパク質に結合し、そしてアンタゴニスト抗体である、抗体または抗原結合ドメイン、あるいはその断片、変異体（ｖａｒｉａｎｔ）または誘導体。 An antibody or antigen binding domain, or a fragment, variant or derivative thereof, that binds to an interferon-gamma protein and is an antagonist antibody.

インターフェロン−ガンマ・タンパク質が哺乳動物インターフェロン−ガンマ・タンパク質である、請求項１の抗体。 2. The antibody of claim 1, wherein the interferon-gamma protein is a mammalian interferon-gamma protein.

インターフェロン−ガンマ・タンパク質がヒト・インターフェロン−ガンマ・タンパク質またはその免疫原性断片である、請求項２の抗体。 The antibody of claim 2, wherein the interferon-gamma protein is human interferon-gamma protein or an immunogenic fragment thereof.

免疫原性断片が、ヒト・インターフェロン−ガンマ・タンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部を含む、請求項３の抗体。 4. The antibody of claim 3, wherein the immunogenic fragment comprises at least a portion of the extracellular domain of human interferon-gamma protein.

インターフェロン−ガンマ・タンパク質のインターフェロン−ガンマ受容体への結合を阻害する、請求項１の抗体。 2. The antibody of claim 1, which inhibits binding of interferon-gamma protein to an interferon-gamma receptor.

炎症を阻害する、請求項１の抗体。 2. The antibody of claim 1 that inhibits inflammation.

阻害する、請求項１の抗体。 2. The antibody of claim 1, which inhibits.

Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２からなる群より選択される、請求項１の抗体。 _2. The antibody of claim 1 selected from the group consisting of Fv, scFv, Fab, Fab ′ and F (ab ′) ₂ .

ヒト抗体である、請求項１の抗体。 The antibody of claim 1 which is a human antibody.

抗体または抗原結合ドメインであって：
（ａ）図３（配列番号６６）、図４（配列番号６８）、図５（配列番号７０）、図６（配列番号７２）、図７（配列番号７４）、図８（配列番号７６）、図９（配列番号７８）、図１０（配列番号８０）、図１１（配列番号８２）、図１２（配列番号８４）または図１３（配列番号８６）に示すようなＦａｂ重鎖アミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）の配列の保存的アミノ酸置換を含む、重鎖アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の配列に少なくとも約８０％同一である、重鎖アミノ酸配列；あるいは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の断片または誘導体
を含み、ＩＦＮγに選択的に結合する、前記抗体または抗原結合ドメイン。 An antibody or antigen binding domain comprising:
(A) FIG. 3 (SEQ ID NO: 66), FIG. 4 (SEQ ID NO: 68), FIG. 5 (SEQ ID NO: 70), FIG. 6 (SEQ ID NO: 72), FIG. 7 (SEQ ID NO: 74), FIG. A Fab heavy chain amino acid sequence as shown in FIG. 9 (SEQ ID NO: 78), FIG. 10 (SEQ ID NO: 80), FIG. 11 (SEQ ID NO: 82), FIG. 12 (SEQ ID NO: 84) or FIG. 13 (SEQ ID NO: 86);
(B) a heavy chain amino acid sequence comprising a conservative amino acid substitution of the sequence of (a);
(C) a heavy chain amino acid sequence that is at least about 80% identical to the sequence of (a); or (d) comprising a fragment or derivative of (a), (b) or (c) and selectively binding to IFNγ Said antibody or antigen binding domain.

カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖をさらに含む、請求項１０の抗体。 11. The antibody of claim 10, further comprising a kappa light chain or a lambda light chain.

ヒトＦｃ領域をさらに含む、請求項１０の抗体。 11. The antibody of claim 10, further comprising a human Fc region.

図３（配列番号６６）、図４（配列番号６８）、図５（配列番号７０）、図６（配列番号７２）、図７（配列番号７４）、図８（配列番号７６）、図９（配列番号７８）、図１０（配列番号８０）、図１１（配列番号８２）、図１２（配列番号８４）または図１３（配列番号８６）に示すようなＦａｂ重鎖アミノ酸配列、および図１４（配列番号８８）、図１５（配列番号９０）、図１６（配列番号９２）、図１７（配列番号９４）、図１８（配列番号９６）、図１９（配列番号９８）、図２０（配列番号１００）、図２１（配列番号１０２）、図２２（配列番号１０４）、図２３（配列番号１０６）または図２４（配列番号１０８）に示すようなＦａｂ軽鎖アミノ酸配列を含む抗体または抗原結合ドメインに認識される、ヒトＩＦＮγ上のエピトープを認識する、抗体または抗原結合ドメイン。 3 (SEQ ID NO: 66), FIG. 4 (SEQ ID NO: 68), FIG. 5 (SEQ ID NO: 70), FIG. 6 (SEQ ID NO: 72), FIG. 7 (SEQ ID NO: 74), FIG. (SEQ ID NO: 78), Fab heavy chain amino acid sequence as shown in FIG. 10 (SEQ ID NO: 80), FIG. 11 (SEQ ID NO: 82), FIG. 12 (SEQ ID NO: 84) or FIG. 13 (SEQ ID NO: 86), and FIG. (SEQ ID NO: 88), FIG. 15 (SEQ ID NO: 90), FIG. 16 (SEQ ID NO: 92), FIG. 17 (SEQ ID NO: 94), FIG. 18 (SEQ ID NO: 96), FIG. 19 (SEQ ID NO: 98), FIG. No. 100), FIG. 21 (SEQ ID NO: 102), FIG. 22 (SEQ ID NO: 104), FIG. 23 (SEQ ID NO: 106) or FIG. 24 (SEQ ID NO: 108). On human IFNγ recognized by the domain It recognizes Pitopu, antibody or antigen binding domain.

可変軽鎖（Ｖ_ｌ鎖）および可変重鎖（Ｖ_ｈ鎖）を含む抗体または抗原結合ドメインであって：
各Ｖ_ｌ鎖が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されるＣＤＲ１（Ｖ_ｌ）、ＣＤＲ２（Ｖ_ｌ）およびＣＤＲ３（Ｖ_ｌ）と称されるＣＤＲアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１（Ｖ_ｌ）が：

からなる群より選択され、
ＣＤＲ２（Ｖ_ｌ）が：

からなる群より選択され、
そしてＣＤＲ３（Ｖ_ｌ）が：

からなる群より選択され、
ＣＤＲ１（Ｖ_ｌ）、ＣＤＲ２（Ｖ_ｌ）およびＣＤＲ３（Ｖ_ｌ）が互いに独立に選択され；そして
各Ｖ_ｈ鎖が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されるＣＤＲ１（Ｖ_ｈ）、ＣＤＲ２（Ｖ_ｈ）およびＣＤＲ３（Ｖ_ｈ）と称されるＣＤＲアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１（Ｖ_ｈ）が：

からなる群より選択され、
ＣＤＲ２（Ｖ_ｈ）が：

からなる群より選択され、
ＣＤＲ３（Ｖ_ｈ）が：

からなる群より選択され；
ＣＤＲ１（Ｖ_ｈ）、ＣＤＲ２（Ｖ_ｈ）およびＣＤＲ３（Ｖ_ｈ）が互いに独立に選択される、
前記抗体または抗原結合ドメイン。 An antibody or antigen binding domain comprising a variable light chain (V _l chain) and a variable heavy chain (V _h chain) comprising:
Each V _l chain comprises CDR amino acid sequences designated CDR1 (V _l ), CDR2 (V _l ) and CDR3 (V _l ) separated by a framework amino acid sequence, where CDR1 (V _l ) is:

Selected from the group consisting of
CDR2 (V _l ) is:

Selected from the group consisting of
And CDR3 (V _l ) is:

Selected from the group consisting of
CDR1 (V _l ), CDR2 (V _l ) and CDR3 (V _l ) are selected independently of each other; and each V _h chain is separated by a framework amino acid sequence CDR1 (V _h ), CDR2 (V _h ) And CDR3 (V _h ), the CDR amino acid sequence comprising: CDR1 (V _h ):

Selected from the group consisting of
CDR2 (V _h ) is:

Selected from the group consisting of
CDR3 (V _h ) is:

Selected from the group consisting of:
CDR1 (V _h ), CDR2 (V _h ) and CDR3 (V _h ) are selected independently of each other,
Said antibody or antigen binding domain.

可変軽鎖（Ｖ_ｌ鎖）および可変重鎖（Ｖ_ｈ鎖）を含む、請求項１４の抗体であって：
Ｖ_ｌ鎖が、配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＳＨＹＶＱ（配列番号０１）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＫＥＲＰＳ（配列番号１２）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＳＳＮＱＷＶ（配列番号２３）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号３４）を有するＣＤＲ１、配列ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４４）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＲＡＲＮＷＲＳＲＦＤＹ（配列番号５４）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖ_ｌ鎖が、配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＳＨＹＶＱ（配列番号０１）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＫＥＲＰＳ（配列番号１２）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＳＳＮＱＷＶ（配列番号２３）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号３４）を有するＣＤＲ１、配列ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４４）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＲＡＲＮＷＲＳＲＦＤＹ（配列番号５４）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖ_ｌ鎖が、配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号０２）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＮＱＲＰＳ（配列番号１３）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＧＳＡＷＶ（配列番号２４）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、配列ＳＹＡＭＳ（配列番号３５）を有するＣＤＲ１、配列ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４５）を有するＣＤＲ２、および配列ＴＳＷＮＡＧＧＰＩＤＹ（配列番号５５）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖ_ｌ鎖が、配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＹＹＶＱ（配列番号０３）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号１４）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＲＮＳＬＶ（配列番号２５）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、配列ＳＹＡＭＳ（配列番号３５）を有するＣＤＲ１、配列ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４５）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＲＶＧＹＳＳＳＬＬＤＹ（配列番号５６）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖ_ｌ鎖が、配列ＲＡＴＱＳＬＬＨＧＮＧＨＮＹＬＤ（配列番号０４）を有するＣＤＲ１、配列ＭＧＳＮＲＡＳ（配列番号１５）を有するＣＤＲ２、および配列ＭＱＡＬＱＬＰＰＴ（配列番号２６）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号３６）を有するＣＤＲ１、配列ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４６）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＫＧＳＲＩＴＩＦＧＶＶＧＳＡＧＦＤＹ（配列番号５７）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖ_ｌ鎖が、配列ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＳ（配列番号０５）を有するＣＤＲ１、配列ＫＩＳＮＲＦＳ（配列番号１６）を有するＣＤＲ２、および配列ＭＱＡＴＱＬＰＹＴ（配列番号２７）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、配列ＮＡＲＭＧＶＳ（配列番号３７）を有するＣＤＲ１、配列ＨＩＦＳＮＤＥＥＳＹＳＴＳＬＫＳ（配列番号４７）を有するＣＤＲ２、および配列ＬＬＬＹＥＧＦＤＰ（配列番号５８）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖ_ｌ鎖が、配列ＳＧＤＶＬＡＲＫＹＡＲ（配列番号０６）を有するＣＤＲ１、配列ＫＤＲＥＲＰＳ（配列番号１７）を有するＣＤＲ２、および配列ＹＳＡＡＤＮＲＧＶ（配列番号２８）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、配列ＳＹＡＭＨ（配列番号３８）を有するＣＤＲ１、配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４８）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＬＶＬＴＭＴＳＲＲＡＡＦＤＩ（配列番号５９）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖ_ｌ鎖が、配列ＧＧＤＮＬＧＧＫＳＬＨ（配列番号０７）を有するＣＤＲ１、配列ＤＤＳＤＲＰＳ（配列番号１８）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＶＷＤＧＳＳＤＱＲＶ（配列番号２９）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、配列ＳＹＳＭＮ（配列番号３９）を有するＣＤＲ１、配列ＳＩＳＳＧＳＳＹＲＹＤＡＤＳＶＫＧ（配列番号４９）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＱＷＧＴＩＳＧＮＤＹ（配列番号６０）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖ_ｌ鎖が、配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＴＮＥＹＮＹＬＤ（配列番号０８）を有するＣＤＲ１、配列ＬＧＳＮＲＡＰ（配列番号１９）を有するＣＤＲ２、および配列ＭＱＡＬＱＴＰＲＴ（配列番号３０）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号４０）を有するＣＤＲ１、配列ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５０）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＷＰＴＹＶＷＧＳＹＲＰＫＧＹＦＤＹ（配列番号６１）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖ_ｌ鎖が、配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＮＮＹＶＨ（配列番号０９）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号２０）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＮＳＮＳＦＶＶ（配列番号３１）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、配列ＳＧＧＹＳＷＳ（配列番号４１）を有するＣＤＲ１、配列ＹＩＹＨＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５１）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＤＷＧＹＦＤＹ（配列番号６２）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖ_ｌ鎖が、配列ＲＡＳＱＹＶＳＳＮＳＬＡ（配列番号１０）を有するＣＤＲ１、配列ＧＡＳＮＲＡＴ（配列番号２１）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＱＹＧＳＳＰＩＴ（配列番号３２）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、配列ＳＮＹＭＳ（配列番号４２）を有するＣＤＲ１、配列ＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５２）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＡＤＧＧＤＹＧＹ（配列番号６３）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖ_ｌ鎖が、配列ＲＳＳＱＳＬＬＲＳＮＧＹＮＹＬＡ（配列番号１１）を有するＣＤＲ１、配列ＬＡＳＮＲＡＳ（配列番号２２）を有するＣＤＲ２、および配列ＶＨＧＶＨＩＰＹＴ（配列番号３３）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶ_ｈ鎖が、配列ＳＮＥＡＧＶＧ（配列番号４３）を有するＣＤＲ１、配列ＬＬＹＷＤＤＤＫＲＹＳＰＳＬＲＳ（配列番号５３）を有するＣＤＲ２、および配列ＲＬＶＲＹＧＧＹＳＴＧＧＦＤＶ（配列番号６４）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖ_ｌ鎖およびＶ_ｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている、前記抗体。 15. The antibody of claim 14, comprising a variable light chain ( _Vl chain) and a variable heavy chain ( _Vh chain):
The V _l chain comprises CDR1 having the sequence TGSSGSIASHYVQ (SEQ ID NO: 01), CDR2 having the sequence EDKERPS (SEQ ID NO: 12), and CDR3 having the sequence QSYDSSNQWV (SEQ ID NO: 23); and the V _h chain comprises the sequence GYYWS ( or a CDR3 having CDR1, CDR2 having the sequence EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 44), and sequence GRARNWRSRFDY (SEQ ID NO: 54) having the SEQ ID NO: 34); or V _l chain, CDRl having the sequence TGSSGSIASHYVQ (SEQ ID NO: 01) includes a CDR3 having a CDR2 having the sequence EDKERPS (SEQ ID NO: 12), and sequence QSYDSSNQWV (SEQ ID NO: 23); and _{V h} chain comprises a sequence GYYWS (SEQ ID NO: 34) DR1, or a CDR3 having a CDR2 having the sequence EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 44), and sequence GRARNWRSRFDY (SEQ ID NO: 54); or V _l chain, CDRl has the sequence TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 02), sequence EDNQRPS (SEQ ID NO: includes a CDR3 having a CDR2, and SEQ QSYDGSAWV (SEQ ID NO: 24) having a 13); and _{V h} chain, CDRl has the sequence SYAMS (SEQ ID NO: 35), CDR2 having the sequence AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 45), and the sequence or a CDR3 having TSWNAGGPIDY (SEQ ID NO: 55); or V _l chain, CDRl has the sequence TRSSGSIASYYVQ (SEQ ID NO: 03), SEQ EDDQRPS Includes a CDR3 having a CDR2, and SEQ QSYDRNSLV (SEQ ID NO: 25) having the SEQ ID NO: 14); and _{V h} chain, CDRl has the sequence SYAMS (SEQ ID NO: 35), CDR2 having the sequence AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 45), and either a CDR3 having a sequence DRVGYSSSLLDY (SEQ ID NO: 56); or V _l chain, CDRl has the sequence RATQSLLHGNGHNYLD (SEQ ID NO: 04), CDR2 having the sequence MGSNRAS (SEQ ID NO: 15), and sequence MQALQLPPT (SEQ ID NO: 26 ) a CDR3 having; and _{V h} chain, CDRl has the sequence GYYWS (SEQ ID NO: 36), CDR2 having the sequence EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 46), and the sequence Or a CDR3 having KGSRITIFGVVGSAGFDY (SEQ ID NO: 57); or V _l chain, CDRl has the sequence RSSQSLVHSDGNTYLS (SEQ ID NO: 05), CDR2 having the sequence KISNRFS (SEQ ID NO: 16), and sequence MQATQLPYT (SEQ ID NO: 27) And the V _h chain comprises a CDR1 having the sequence NARMMGVS (SEQ ID NO: 37), a CDR2 having the sequence HIFSNDESYSTSLKS (SEQ ID NO: 47), and a CDR3 having the sequence LLLYEGDP (SEQ ID NO: 58); or V _l chain, sequence SGDVLARKYAR (SEQ ID NO: 06) CDRl having, CDR2 having the sequence KDRERPS (SEQ ID NO: 17), and sequence YSAADNRGV (SEQ ID NO: 28 And the V _h chain comprises a CDR1 having the sequence SYAMH (SEQ ID NO: 38), a CDR2 having the sequence VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 48), and a CDR3 having the sequence DLVLTMTSSRRAAFDI (SEQ ID NO: 59); Or the V _l chain comprises CDR1 having the sequence GGDNLGGKSLH (SEQ ID NO: 07), CDR2 having the sequence DDDSDRPS (SEQ ID NO: 18), and CDR3 having the sequence QVWDGSSDQRV (SEQ ID NO: 29); and the V _h chain comprises the sequence SYSMN (SEQ ID NO: 39) CDRl having, CDR2 having the sequence SISSGSSYRYDADSVKG (SEQ ID NO: 49), and either a CDR3 having a sequence DQWGTISGNDY (SEQ ID NO: 60); or V Chains, CDRl has the sequence RSSQSLLHTNEYNYLD (SEQ ID NO: 08), includes a CDR3 having a sequence CDR2 having the LGSNRAP (SEQ ID NO: 19), and sequence MQALQTPRT (SEQ ID NO: 30); and _{V h} chain comprises the sequence GYYWS (SEQ ID NO: CDR1 having 40), or a CDR3 having a sequence EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 50) CDR2 having, and sequence GWPTYVWGSYRPKGYFDY (SEQ ID NO: 61); or V _l chain, CDR1 having the sequence TGSSGSIANNYVH (SEQ ID NO: 09), SEQ CDR2 having the EDDQRPS (SEQ ID NO: 20), and comprises a CDR3 having a sequence QSYDNSNSFVV (SEQ ID NO: 31); and _{V h} chain, sequence SGGYSWS (SEQ CDR1 having issue 41), CDR2 having the sequence YIYHSGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO: 51), and either a CDR3 having a sequence GDWGYFDY (SEQ ID NO: 62); or V _l chain, CDR1 having the sequence RASQYVSSNSLA (SEQ ID NO: 10), CDR2 having the sequence GASNRAT (SEQ ID NO: 21), and comprises a CDR3 having a sequence QQYGSSPIT (SEQ ID NO: 32); and _{V h} chain, CDRl has the sequence SNYMS (SEQ ID NO: 42), SEQ VIYSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 52) or a CDR3 having a CDR2, and SEQ DADGGDYGY (SEQ ID NO: 63) having; or V _l chain, CDRl has the sequence RSSQSLLRSNGYNYLA (SEQ ID NO: 11), SEQ LAS CDR2 having the NRAS (SEQ ID NO: 22), and comprises a CDR3 having a sequence VHGVHIPYT (SEQ ID NO: 33); and _{V h} chain, CDRl has the sequence SNEAGVG (SEQ ID NO: 43), has the sequence LLYWDDDKRYSPSLRS (SEQ ID NO: 53) CDR2 and CDR3 having the sequence RLVRYGGYSTGGFDV (SEQ ID NO: 64);
Of CDR1, CDR2 and CDR3 on each _{V l} chain and _{V h} chain are separated by framework amino acid sequences, said antibody.

ヒトＦｃ領域をさらに含む、請求項１４または１５の抗体。 16. The antibody of claim 14 or 15, further comprising a human Fc region.

可変軽鎖（Ｖ_ｌ鎖）および可変重鎖（Ｖ_ｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖ_ｌ鎖が、図４１の生殖系列配列（配列番号１３０）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、図３３の生殖系列配列（配列番号１２２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。 An antibody comprising a variable light chain (V _l chain) and a variable heavy chain (V _h chain):
The V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the germline sequence (SEQ ID NO: 130) of FIG. 41; and the V _h chain is a rearranged mutation of the germline sequence (SEQ ID NO: 122) of FIG. Said antibody comprising a somatic or somatic variant; and selectively binding to an interferon-gamma protein.

可変軽鎖（Ｖ_ｌ鎖）および可変重鎖（Ｖ_ｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖ_ｌ鎖が、図４１の生殖系列配列（配列番号１３０）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、図３４の生殖系列配列（配列番号１２３）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。 An antibody comprising a variable light chain (V _l chain) and a variable heavy chain (V _h chain):
The V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the germline sequence (SEQ ID NO: 130) of FIG. 41; and the V _h chain is a rearranged mutation of the germline sequence (SEQ ID NO: 123) of FIG. Said antibody comprising a somatic or somatic variant; and selectively binding to an interferon-gamma protein.

可変軽鎖（Ｖ_ｌ鎖）および可変重鎖（Ｖ_ｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖ_ｌ鎖が、図４２の生殖系列配列（配列番号１３１）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、図３５の生殖系列配列（配列番号１２４）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。 An antibody comprising a variable light chain (V _l chain) and a variable heavy chain (V _h chain):
The V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the germline sequence (SEQ ID NO: 131) of FIG. 42; and the V _h chain is a rearranged mutation of the germline sequence (SEQ ID NO: 124) of FIG. Said antibody comprising a somatic or somatic variant; and selectively binding to an interferon-gamma protein.

可変軽鎖（Ｖ_ｌ鎖）および可変重鎖（Ｖ_ｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖ_ｌ鎖が、図４３の生殖系列配列（配列番号１３２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、図３３の生殖系列配列（配列番号１２２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。 An antibody comprising a variable light chain (V _l chain) and a variable heavy chain (V _h chain):
The V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the germline sequence (SEQ ID NO: 132) of FIG. 43; and the V _h chain is a rearranged mutation of the germline sequence (SEQ ID NO: 122) of FIG. Said antibody comprising a somatic or somatic variant; and selectively binding to an interferon-gamma protein.

可変軽鎖（Ｖ_ｌ鎖）および可変重鎖（Ｖ_ｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖ_ｌ鎖が、図４４の生殖系列配列（配列番号１３３）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、図３６の生殖系列配列（配列番号１２５）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。 An antibody comprising a variable light chain (V _l chain) and a variable heavy chain (V _h chain):
The V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the germline sequence (SEQ ID NO: 133) of FIG. 44; and the V _h chain is a rearranged mutation of the germline sequence (SEQ ID NO: 125) of FIG. Said antibody comprising a somatic or somatic variant; and selectively binding to an interferon-gamma protein.

可変軽鎖（Ｖ_ｌ鎖）および可変重鎖（Ｖ_ｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖ_ｌ鎖が、図４５の生殖系列配列（配列番号１３４）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、図３７の生殖系列配列（配列番号１２６）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。 An antibody comprising a variable light chain (V _l chain) and a variable heavy chain (V _h chain):
The V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the germline sequence (SEQ ID NO: 134) of FIG. 45; and the V _h chain is a rearranged mutation of the germline sequence (SEQ ID NO: 126) of FIG. Said antibody comprising a somatic or somatic variant; and selectively binding to an interferon-gamma protein.

可変軽鎖（Ｖ_ｌ鎖）および可変重鎖（Ｖ_ｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖ_ｌ鎖が、図４６の生殖系列配列（配列番号１３５）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、図３８の生殖系列配列（配列番号１２７）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。 An antibody comprising a variable light chain (V _l chain) and a variable heavy chain (V _h chain):
The V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the germline sequence (SEQ ID NO: 135) of FIG. 46; and the V _h chain is a rearranged mutation of the germline sequence (SEQ ID NO: 127) of FIG. Said antibody comprising a somatic or somatic variant; and selectively binding to an interferon-gamma protein.

可変軽鎖（Ｖ_ｌ鎖）および可変重鎖（Ｖ_ｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖ_ｌ鎖が、図４１の生殖系列配列（配列番号１３０）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、図３９の生殖系列配列（配列番号１２８）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。 An antibody comprising a variable light chain (V _l chain) and a variable heavy chain (V _h chain):
The V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the germline sequence (SEQ ID NO: 130) of FIG. 41; and the V _h chain is a rearranged mutation of the germline sequence (SEQ ID NO: 128) of FIG. Said antibody comprising a somatic or somatic variant; and selectively binding to an interferon-gamma protein.

可変軽鎖（Ｖ_ｌ鎖）および可変重鎖（Ｖ_ｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖ_ｌ鎖が、図４３の生殖系列配列（配列番号１３２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖ_ｈ鎖が、図４０の生殖系列配列（配列番号１２９）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。 An antibody comprising a variable light chain (V _l chain) and a variable heavy chain (V _h chain):
The V _l chain comprises a rearranged or somatic variant of the germline sequence (SEQ ID NO: 132) of FIG. 43; and the V _h chain is a rearranged mutation of the germline sequence (SEQ ID NO: 129) of FIG. Said antibody comprising a somatic or somatic variant; and selectively binding to an interferon-gamma protein.

モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、一本鎖抗体、または異種抗体である、請求項１の抗体。 2. The antibody of claim 1, which is a monoclonal antibody, a humanized antibody, a bispecific antibody, a single chain antibody, or a heterologous antibody.

請求項１、１０、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７のいずれかの抗体をコードする、単離核酸分子。 28. An isolated nucleic acid molecule encoding the antibody of any of claims 1, 10, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 or 27.

請求項２８の核酸分子を含む発現ベクター。 An expression vector comprising the nucleic acid molecule of claim 28.

請求項２９の発現ベクターを含む宿主細胞。 30. A host cell comprising the expression vector of claim 29.

ＣＨＯ細胞である、請求項３０の宿主細胞。 32. The host cell of claim 30, which is a CHO cell.

核酸分子の発現を可能にする条件下で、請求項３１の宿主細胞を培養することを含む、抗体産生法。 32. A method for producing an antibody comprising culturing the host cell of claim 31 under conditions that allow expression of the nucleic acid molecule.

ＩｇＧアイソタイプがＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤから選択される、請求項１、１０、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７の抗体。 27. The IgG isotype is selected from IgG, IgM, IgA, IgE and IgD, claim 1, 10, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 or 27 Antibodies.

アイソタイプがＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３またはＩｇＧ_４である、請求項３３の抗体。 Isotype is _IgG _1, IgG 2, IgG ₃ or IgG _4, the antibody of claim 33.

請求項１、１０、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７のいずれかの抗体または抗原結合ドメイン、あるいはその断片、変異体または誘導体、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む組成物。 The antibody or antigen-binding domain of any one of claims 1, 10, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 or 27, or a fragment, variant or A composition comprising a derivative and a pharmaceutically acceptable carrier.

請求項３５の組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、自己免疫疾患を防止するかまたは治療する方法。 36. A method of preventing or treating an autoimmune disease comprising administering to a mammal an effective amount of the composition of claim 35.

請求項３５の組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、炎症状態を防止するかまたは治療する方法。 36. A method for preventing or treating an inflammatory condition comprising administering to a mammal an effective amount of the composition of claim 35.