JP2006502708A - Method for producing high amounts of correctly folded heterologous proteins in inclusion bodies - Google Patents

Abstract

本発明は、生物活性異種タンパク質の生産のための新しい方法に関する。本方法は、既に封入体内に存在する異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体の蓄積を可能にするように条件を調節することによる生合成の実施を含む。本発明はさらに、特に非変性条件下での、封入体の洗浄及び可溶化を含む。The present invention relates to a new method for the production of bioactive heterologous proteins. The method involves performing biosynthesis by adjusting conditions to allow the accumulation of correctly folded precursors of heterologous proteins already present in the inclusion bodies. The present invention further includes washing and solubilization of inclusion bodies, particularly under non-denaturing conditions.

Description

本発明は、異種タンパク質が発現される生物において形成される封入体から異種タンパク質を生産する新しい方法に関する。本発明の原理は、主として生物活性顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を生産する方法を対象として説明するが、適切な発現生物から発現される広範囲の異種タンパク質に適用することができる。   The present invention relates to a new method for producing a heterologous protein from inclusion bodies formed in an organism in which the heterologous protein is expressed. Although the principles of the present invention will be described primarily with respect to methods of producing bioactive granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), it can be applied to a wide range of heterologous proteins expressed from appropriately expressing organisms.

ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）は、好中球の形成において決定的な役割を有する造血系増殖因子に属する。Ｇ−ＣＳＦは、血液学及び腫瘍学の分野において薬剤中で使用されている。現在、臨床使用のための２つの形態：グリコシル化されており、哺乳類細胞、特にＣＨＯ細胞系において生産されるレノグラスチム（Ｈｏｌｌｏｗａｙ ＣＪ（１９９４）Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３０Ａ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ２−Ｓ６，欧州特許第１６９５６６号）、及びグリコシル化されておらず、大腸菌におけるその発現後に生産されるフィルグラスチム（欧州特許第２３７５４５号）、が市販されている。   Human granulocyte colony stimulating factor (hG-CSF) belongs to a hematopoietic growth factor that has a decisive role in the formation of neutrophils. G-CSF is used in medicine in the field of hematology and oncology. Currently, two forms for clinical use are glycosylated and are produced in mammalian cells, particularly CHO cell lines, Lenograstim (Holloway CJ (1994) Eur J Cancer 30A Suppl 3: S2-S6, European Patent No. 169566 And filgrastim (European Patent No. 237545), which is not glycosylated and is produced after its expression in E. coli.

細菌である大腸菌における異種Ｇ−ＣＳＦの細胞内生産のために、前記タンパク質は封入体（古典的封入体）の形態で蓄積される。大腸菌ペリプラズムへの分泌の実験では、Ｇ−ＣＳＦが古典的封入体の形態で蓄積されるか（Ｌｅｉ Ｓ．Ｐら（１９８７）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １６９：４３７９−４３８３；Ｃｈｕｎｇ ＢＨら（１９９８）Ｊ Ｆｅｒｍｅｎｔ Ｂｉｏｅｎｇ ８５：４４３−４４６）、又はこのようにして生産されるＧ−ＣＳＦの生物活性に関する報告は存在しない（Ｊｅｏｎｇ ＫＪ＆Ｌｅｅ ＳＹ（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２３：３１１−３１８）。   For intracellular production of heterologous G-CSF in the bacterium E. coli, the protein accumulates in the form of inclusion bodies (classical inclusion bodies). In experiments of secretion into the E. coli periplasm, was G-CSF accumulated in the form of classical inclusion bodies (Lei S.P et al. (1987) J Bacteriol 169: 4379-4383; Chung BH et al. (1998) J Ferment Bioeng 85: 443-446), or reports on the biological activity of G-CSF produced in this way (Jeon KJ & Lee SY (2001) Protein Expression and Purification 23: 311-318).

上記より、従来技術において大腸菌からのＧ−ＣＳＦの単離について記述されているほとんどすべての実験では、Ｇ−ＣＳＦが古典的封入体内で認められることは明らかである。   From the above, it is clear that in almost all experiments described in the prior art for the isolation of G-CSF from E. coli, G-CSF is found in classical inclusion bodies.

古典的封入体の形成に関する同様の所見は、Ｇ−ＣＳＦ以外の異種タンパク質の生産方法にもあてはまる。   Similar observations regarding the formation of classical inclusion bodies also apply to methods for producing heterologous proteins other than G-CSF.

酵母において生産される古典的封入体の幾つかの例が記述されているが、Ｇ−ＣＳＦに関する報告はない。   Several examples of classical inclusion bodies produced in yeast have been described, but there are no reports on G-CSF.

天然条件下で水ベースの液体に不溶の封入体（古典的封入体）から正しく折りたたまれた生物活性タンパク質を生産するには、その封入体を細胞から単離し、洗浄して、可溶化し、次にインビトロでの再生を実施しなければならない。インビトロでの再生は、大規模なタンパク質分離の方法においては付加的な工程である。   To produce correctly folded bioactive proteins from inclusion bodies that are insoluble in water-based liquids (classical inclusion bodies) under natural conditions, the inclusion bodies are isolated from the cells, washed, solubilized, In vitro regeneration must then be performed. In vitro regeneration is an additional step in large-scale protein separation methods.

古典的封入体から組換えタンパク質を生産する方法は、細胞の溶解と破壊及びそれに続く遠心分離を含む。大きな割合の古典的封入体を含むペレットを、通常は界面活性剤で洗浄する。Ｇ−ＣＳＦの単離のためには、１％デオキシコール酸塩（Ｚｓｅｂｏ ＫＭら（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １７２：１７５−１８４、欧州特許第２３７５４５号；米国特許第５８４９８８３号）又は０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０を加えた１．０Ｍ ＮａＣｌ溶液（Ｇｅｌｕｎａｉｔｅ Ｌら（２０００）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ９０４：１３１−１４３）による古典的封入体の洗浄が簡便であると報告されている。   Methods for producing recombinant proteins from classical inclusion bodies include cell lysis and disruption followed by centrifugation. Pellets containing a large proportion of classical inclusion bodies are usually washed with a surfactant. For isolation of G-CSF, 1% deoxycholate (Zsebo KM et al. (1986) Immunobiology 172: 175-184, EP 237545; US Pat. No. 5,889,883) or 0.1% Tween 80 Washing of classical inclusion bodies with a 1.0 M NaCl solution (Gelunaite L et al. (2000) J Chromatogr A 904: 131-143) plus

組換えタンパク質を入手する場合のさらなる工程は、一般にかなり強い変性剤の使用を必要とする古典的封入体の可溶化である。Ｇ−ＣＳＦの生産に関しては、６Ｍ ＧｄＨＣｌ（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ Ｐら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２５６：２１３−２１８；Ｚｉｎｋ Ｔら（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３１４：４３５−４３９）、ｐＨ７．２での７Ｍ尿素（Ｋｕｇａ Ｔら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １５９：１０３−１１１）又はｐＨ８．０での８Ｍ尿素（Ｙａｍａｓａｋｉ Ｍら（１９９８）Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６２：１５２８−１５３４）、２０ｍＭトリス／ＨＣｌの使用及びＥＤＴＡとＤＴＴの添加が記述されている。Ｋａｎｇ Ｓ−Ｈとその共同研究者達は、約１２の強いアルカリ性ｐＨの２Ｍ尿素に古典的封入体を可溶化することに成功した（Ｋａｎｇ ＳＨら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ １７：６８７−６９２）。同様の方法は、短期間ｐＨを１１．５に上昇させることを伴う１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液での可溶化である（Ｇｅｌｕｎａｉｔｅ Ｌら（２０００）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ９０４：１３１−１４３）。変性濃度の強力な変性剤、例えば５０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．５中５％エタノールを加えた１％ＳＤＳも、同様に可溶化のために有効である（Ｓｏｕｚａ ＬＭら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１−６５）。２％Ｎ−ラウロイルサルコシンがしばしば使用され、（Ｌｕ ＨＳら（１９９２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：８７７０−８７７７；Ｌｕ ＨＳら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ４：４６５−４７２；Ｙｏｕｎｇ ＤＣら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：１２２８−１２３６；欧州特許第２３７５４５号；米国特許第５８４９８８３号）又は１％Ｎ−ラウロイルサルコシンが単独で使用される（Ｚｓｅｂｏ ＫＭら（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １７２：１７５−１８４）。ほとんどの場合、古典的封入体の可溶化は、毒性であり、非自然共生性で、深刻な環境汚染物質である強力な界面活性剤の使用を必要とする。それらの使用はまた、工程終了後の安全な除去のために付加的な費用と時間がかかるので、非経済的である。   An additional step in obtaining recombinant proteins is the solubilization of classical inclusion bodies that generally requires the use of fairly strong denaturing agents. For the production of G-CSF, 6M GdHCl (Wingfield P et al. (1988) Biochem J 256: 213-218; Zink T et al. (1992) FEBS Lett 314: 435-439), 7M urea at pH 7.2 (Kuga T (1989) Biochem Biophys Res Commun 159: 103-111) or 8M urea at pH 8.0 (Yamazaki M et al. (1998) Biosci Biotechnol Biochem 62: 1528-1534), use of 20 mM Tris / HCl and EDTA and DTT. Additions are described. Kang SH and its collaborators succeeded in solubilizing classical inclusion bodies in 2M urea at about 12 strong alkaline pH (Kang SH et al. (1995) Biotechnol Lett 17: 687-692). A similar method is solubilization with 10 mM HEPES buffer with increasing the pH to 11.5 for a short period of time (Gelunaite L et al. (2000) J Chromatogr A 904: 131-143). A denaturing concentration of a strong denaturant such as 1% SDS with 5% ethanol in 50 mM Tris / HCl pH 8.5 is also effective for solubilization (Souza LM et al. (1986) Science 232: 61- 65). 2% N-lauroyl sarcosine is often used (Lu HS et al. (1992) J Biol Chem 267: 8770-8777; Lu HS et al. (1993) Protein Expr Purif 4: 465-472; Young DC et al. (1997) Protein Science. 6: 1228-1236; EP 237545; US Pat. No. 5,849,883) or 1% N-lauroyl sarcosine is used alone (Zsebo KM et al. (1986) Immunobiology 172: 175-184). In most cases, solubilization of classical inclusion bodies requires the use of powerful surfactants that are toxic, non-symbiotic, and a serious environmental pollutant. Their use is also uneconomical because of the additional cost and time for safe removal after completion of the process.

例えばＣ４ ＲＰ ＨＰＬＣでの最初のクロマトグラフィー工程における（Ｓｏｕｚａ ＬＭら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１−６５；Ｚｓｅｂｏ ＫＭら（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １７２：１７５−１８４；欧州特許第２３７５４５号）又はゲルろ過を使用することによる（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ Ｐら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２５６：２１３−２１８；米国特許第４９９９２９１号）、変性条件下でのタンパク質の分離の幾つかの例が記述されているが、大部分の例においては、予備的なインビトロ再生後にクロマトグラフィー分離を実施する。   For example, in the first chromatographic step on C4 RP HPLC (Souza LM et al. (1986) Science 232: 61-65; Zsebo KM et al. (1986) Immunobiology 172: 175-184; EP 237545) or using gel filtration (Wingfield P et al. (1988) Biochem J 256: 213-218; U.S. Pat. No. 4,999,291), several examples of protein separation under denaturing conditions have been described, but in most examples Performs chromatographic separation after preliminary in vitro regeneration.

強力な変性剤中での古典的封入体の可溶化に続いて、インビトロでのタンパク質の再生を実施する。再びＧ−ＣＳＦを例にとると、そのインビトロ再生は、より低い（非変性）濃度の変性剤を含む緩衝液に対する透析によって（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ Ｐら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２５６：２１３−２１８）、変性剤を含まない緩衝液に対する透析によって（Ｋｕｇａ Ｔら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １５９：１０３−１１１）、０．８Ｍアルギニンを加えた緩衝液中で（Ｚｉｎｋ Ｔら（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３１４：４３５−４３９）、又はゲルろ過によって（米国特許第４９９９２９１号；Ｄ．Ｃ．Ｙｏｕｎｇら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：１２２８−１２３６）達成される。変性濃度のＮ−ラウロイルサルコシン中で可溶化した後、室温で長期間攪拌しながら低濃度のＣｕＳＯ_４を添加し、その後強塩基性イオン交換体を使用した界面活性剤の除去によって酸化的折りたたみが達成される（米国特許第５８４９８８３号）。極端なアルカリ性条件下で可溶化を実施する場合、より低いｐＨを回復することによってタンパク質は自然に再生される（Ｋａｎｇ ＳＨら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ １７：６８７−６９２）。インビトロ再生のために記述されている方法はすべて、複雑であり、時間がかかる。大規模な希釈は大容量の装置を必要とし、従ってより高い初期投資（より大きな場所、より大きな装置等）が必要であり、また生産のためにより高い操作費用（電力、水、緩衝剤等）がかかる。 Following solubilization of classical inclusion bodies in strong denaturing agents, in vitro protein regeneration is performed. Taking G-CSF again as an example, its in vitro regeneration is achieved by dialysis against a buffer containing a lower (non-denaturing) concentration of denaturant (Wingfield P et al. (1988) Biochem J 256: 213-218). (Kuga T et al. (1989) Biochem Biophys Res Commun 159: 103-111) in buffer containing 0.8 M arginine (Zink T et al. (1992) FEBS Lett 314: 435- 439), or by gel filtration (US Pat. No. 4,999,291; DC Young et al. (1997) Protein Science 6: 1228-1236). After solubilization in denaturing concentrations of N-lauroyl sarcosine, low concentrations of CuSO ₄ are added with long-term stirring at room temperature, followed by oxidative folding by removal of the surfactant using a strongly basic ion exchanger. Achieved (US Pat. No. 5,849,883). When solubilization is performed under extreme alkaline conditions, the protein is naturally regenerated by restoring a lower pH (Kang SH et al. (1995) Biotechnol Lett 17: 687-692). All the methods described for in vitro regeneration are complex and time consuming. Large scale dilution requires large capacity equipment and therefore requires higher initial investment (larger space, larger equipment, etc.) and higher operating costs for production (power, water, buffer, etc.) It takes.

オリゴペプチド親水性タグ及びＩｇＡプロテアーゼについての制限部位がＮ末端に付加されている融合タンパク質では、改善されたインビトロ再生が実現される（欧州特許第０５００１０８号）。   Improved in vitro regeneration is achieved with fusion proteins in which a restriction site for the oligopeptide hydrophilic tag and IgA protease is added at the N-terminus (European Patent No. 0500108).

文献において細胞質内の可溶性タンパク質の割合の上昇が報告されている（Ｗｅｉｃｋｅｒｔ ＭＪら（１９９７）、Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６３：４３１３−４３２０；Ｂｈａｎｄａｒｉ Ｐ＆Ｇｏｗｒｉｓｈａｎｋａｒ Ｊ（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７９：４４０３−４４０６；Ｚｈａｎｇ Ｙら（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，１２：１５９−１６５；Ｔｈｏｍａｓ ＪＧとＢａｎｅｙｘ Ｆ（１９９６）Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１：１１１４１−１１１４７；Ｋａｐｕｓｔ ＲＢとＷａｕｇｈ ＤＳ（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，８：１６６８−１６７４；Ｄａｖｉｓ ＧＤら（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ ６５：３８２−３８８）が、封入体内での蓄積に代わる細胞質内での可溶性Ｇ−ＣＳＦの生産に関する報告はない。   An increase in the proportion of soluble protein in the cytoplasm has been reported in the literature (Weickert MJ et al. (1997), Appl and Environmental Microbiology, 63: 4313-4320; Bandari P & Gowishankar J (1997) J. Bacteriol-4, 179: 4. Zhang Y et al. (1998) Protein Expr Purif, 12: 159-165; Thomas JG and Banneyx F (1996) J of Biological Chemistry, 271: 11141-11147; -1674; Davis GD et al. (1999) Bio ech and Bioeng 65: 382-388) found no report on the production of soluble G-CSF in the cytoplasm alternative to accumulation in inclusion bodies.

本発明者らの知る限り、特許及び学術文献において、既に封入体内にある正しく折りたたまれた異種タンパク質の割合の上昇に関する報告はこれまでのところ存在しない。   To the best of our knowledge, there have been no reports so far in the patent and academic literature regarding the increased proportion of correctly folded heterologous proteins already in inclusion bodies.

Ｇ−ＣＳＦの場合は、インビトロでの再生が第一条件として、それ故生物活性タンパク質の生産のための唯一の可能な方法として報告されている（Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ（１９９６）ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｃｌｅｌａｎｄ ＪＬとＣｒａｉｋ ＣＳ編集）ｐｐ．２８３−２９８，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。   In the case of G-CSF, in vitro regeneration has been reported as the first condition and therefore as the only possible method for the production of bioactive proteins (Rudolph R (1996) in Protein Engineering: Principles and Practices). (Edited by Cleland JL and Craik CS) pp. 283-298, Wiley-Liss, Inc., New York).

異種タンパク質が発現される生物において形成される非古典的封入体から異種タンパク質を得ることを含む、異種タンパク質の生産のための改善された方法を提供することが本発明の目的である。   It is an object of the present invention to provide an improved method for the production of a heterologous protein comprising obtaining the heterologous protein from non-classical inclusion bodies formed in an organism in which the heterologous protein is expressed.

その目的は、請求項１、２、２７及び３３に規定する選択的方法のいずれかによって解決される。本発明に従った方法の好ましく且つ有益なさらなる開発を従属する請求項の中で述べる。本発明はまた、請求項３６に記載の使用を提供する。   The object is solved by any of the selective methods defined in claims 1, 2, 27 and 33. Further preferred and advantageous further developments of the method according to the invention are stated in the dependent claims. The present invention also provides the use according to claim 36.

本発明の概念は、細菌及び酵母のような微生物などの適切な宿主細胞系において発現させうる多様な異種タンパク質に適用することができる。本発明は特にＧ−ＣＳＦの生産に関して開発された。本発明の概念は、中でも特に、比較的疎水性のタンパク質から形成される封入体の形成を含むので、本発明は、他の異種タンパク質の生産、特にあまり多すぎるジスルフィド結合は持たないタンパク質の生産にも容易に適用できる。本発明は、それ故、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＨＳＡ、デオキシリボヌクレアーゼ、ＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターフェロン及びインターロイキンから成る群の異種タンパク質の生産に特に適する。   The concepts of the present invention can be applied to a variety of heterologous proteins that can be expressed in suitable host cell systems such as bacteria and microorganisms such as yeast. The invention has been developed specifically for the production of G-CSF. Since the concept of the present invention includes, among other things, the formation of inclusion bodies formed from relatively hydrophobic proteins, the present invention produces other heterologous proteins, particularly proteins that do not have too many disulfide bonds. It can be easily applied to. The present invention is therefore particularly suitable for the production of heterologous proteins of the group consisting of G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EGF, HSA, deoxyribonuclease, FGF, TNF-α, TNF-β, interferon and interleukins. Suitable.

本発明に従った方法の基礎として、驚くべきことに、Ｇ−ＣＳＦが、古典的封入体よりも高い量の正しく折りたたまれた前駆体を有する封入体において正しく折りたたまれた前駆体の形態で蓄積されうることが認められた。あるいは、Ｇ−ＣＳＦの生合成の調節は、直接封入体において、非変性条件下で又は変性／再生工程なしで、生物活性Ｇ−ＣＳＦを生成できる実質的な割合の異種タンパク質の前駆体を生産可能にする。また前述したような他の異種タンパク質の場合にも、やはり本発明に従った方法において封入体中のそのような他の異種タンパク質の蓄積が可能であると期待される。   As a basis for the method according to the present invention, surprisingly, G-CSF accumulates in the form of correctly folded precursors in inclusion bodies with higher amounts of correctly folded precursors than classical inclusion bodies. It was recognized that it could be done. Alternatively, modulation of G-CSF biosynthesis produces a substantial proportion of heterologous protein precursors that can produce bioactive G-CSF, either directly in inclusion bodies, under non-denaturing conditions or without denaturation / regeneration steps. enable. Also in the case of other heterologous proteins as described above, it is expected that accumulation of such other heterologous proteins in inclusion bodies is also possible in the method according to the present invention.

本発明の１つの特定局面では、既に、生合成、すなわち発酵及びタンパク質発現工程の間の条件又はパラメータは、異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体の形成を制御し、好都合に促進又は増強するように調整される。生合成を実施する方法を考慮に入れた工程は、既に封入体内にあるＧ−ＣＳＦ、すなわち異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体の蓄積を可能にすると想定される。前記工程のそのような実施方法、すなわち封入体内で異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体を形成し、増加させるという見地から生合成を調節し、有益に制御することは、培養温度、培地の組成、誘導様式、発酵の実施原理、ストレスを生じさせることができる物質の添加、及び補助タンパク質の同時発現を含む群より選択される１つ以上の条件を含む。生合成の制御は、従来の生合成条件と比較したとき、より低い温度、発酵培地及び発酵のタイプの選択、誘導物質及び誘導様式の選択、及びストレスの誘発などの調整及び／又は変更を含む。   In one particular aspect of the invention, already the conditions or parameters during the biosynthesis, ie fermentation and protein expression steps, control the formation of correctly folded precursors of the heterologous protein, so as to facilitate or enhance it. Adjusted to It is envisioned that the process taking into account the method of performing biosynthesis allows the accumulation of G-CSF already in the inclusion body, ie a correctly folded precursor of the heterologous protein. Such a method of performing the above steps, ie, regulating and beneficially controlling biosynthesis from the perspective of forming and increasing correctly folded precursors of heterologous proteins within the inclusion body is the culture temperature, medium composition One or more conditions selected from the group comprising: induction mode, fermentation principle, addition of substances capable of causing stress, and co-expression of auxiliary proteins. Control of biosynthesis includes adjustments and / or changes such as lower temperatures, selection of fermentation media and type of fermentation, selection of inducers and modes of induction, and induction of stress when compared to conventional biosynthetic conditions. .

本発明のもう１つの特定局面では、封入体内に認められる異種タンパク質の前駆体を、封入体からの異種タンパク質の単離及び精製の工程中、前記異種タンパク質にとっての非変性条件下に保持する。本発明の生物活性異種タンパク質の生産のための方法の特に好ましい実施態様は、従って、好ましくは洗浄工程に続く、非変性条件、好ましくは天然条件下での封入体の可溶化をさらに含み、変性剤を使用する必要なしに又は変性／再生工程を適用する必要なしに、生物活性タンパク質の直接の単離を可能にする。本発明は異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体の実質的な割合を有する封入体（非古典的封入体）の生産を可能にするので、本発明のこの特定局面は、変性／再生工程を必要としない、前記タンパク質の生産の非常に効率的な方法を提供する。   In another particular aspect of the invention, the precursor of the heterologous protein found in the inclusion body is maintained under non-denaturing conditions for the heterologous protein during the process of isolation and purification of the heterologous protein from the inclusion body. A particularly preferred embodiment of the method for the production of the biologically active heterologous protein of the invention thus further comprises solubilization of inclusion bodies under non-denaturing conditions, preferably natural conditions, preferably following a washing step, Allows the direct isolation of bioactive proteins without the need to use agents or the need to apply denaturation / regeneration steps. This particular aspect of the present invention requires a denaturation / regeneration step because the present invention allows the production of inclusion bodies (non-classical inclusion bodies) that have a substantial proportion of correctly folded precursors of heterologous proteins. A very efficient method for the production of said protein.

本発明を、本発明の基本的概念と好ましい実施態様の両方に関して以下でさらに詳細に説明する。本発明は、しかしながら、特定して述べる実施態様に限定されず、当業者は添付の特許請求の範囲内で多様性及び改変が存在することを了解するである。   The invention is described in more detail below with respect to both the basic concept of the invention and preferred embodiments. The present invention, however, is not limited to the specifically described embodiments, and those skilled in the art will appreciate that there are variations and modifications within the scope of the appended claims.

驚くべきことに、異種タンパク質を発現する生物の培養又は発酵に影響することにより、特に前記生物によって行われる生合成に影響することにより、生物活性Ｇ−ＣＳＦの生産、及びそれに対応して他の異種タンパク質の生産を、Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体が封入体内に蓄積されるように実施することができることが見出された。このようにして非古典的封入体を形成することができる。   Surprisingly, by affecting the culture or fermentation of an organism expressing a heterologous protein, in particular by affecting the biosynthesis performed by said organism, the production of bioactive G-CSF, and correspondingly other It has been found that the production of heterologous proteins can be carried out so that correctly folded precursors of G-CSF accumulate in the inclusion bodies. In this way, non-classical inclusion bodies can be formed.

特許及び学術文献に述べられている封入体は、不正確に折りたたまれた又は部分的に正しく折りたたまれたタンパク質の不溶性の緻密な凝集物（古典的封入体）を提供するが、本発明ではＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体が封入体内に蓄積され、非古典的封入体を形成しうることが実現された。以下で述べる、生合成に有益な影響を及ぼす２つ以上の条件、好ましくは多数の条件の組合せを遵守することにより、封入体内に認められるＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の量が著明に上昇する。Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体を含む封入体（非古典的封入体）は、当技術分野で認められる封入体（古典的封入体）よりも可溶性である。より高い溶解度は、より容易でより時間のかからない封入体からのＧ−ＣＳＦの生産を可能にする。それ故、その大規模生産においては収率が高く、有用で、実用的且つ経済的である。   The inclusion bodies described in the patent and academic literature provide insoluble dense aggregates (classical inclusion bodies) of proteins that are incorrectly folded or partially correctly folded. -It has been realized that correctly folded precursors of CSF can accumulate in the inclusion bodies and form non-classical inclusion bodies. By adhering to two or more conditions, preferably multiple combinations of conditions that have a beneficial effect on biosynthesis, described below, the amount of correctly folded precursor of G-CSF found in the inclusion body is significantly increased. It rises clearly. Inclusion bodies containing correctly folded precursors of G-CSF (non-classical inclusion bodies) are more soluble than inclusion bodies recognized in the art (classical inclusion bodies). Higher solubility allows easier and less time-consuming production of G-CSF from inclusion bodies. Therefore, in its large-scale production, the yield is high, useful, practical and economical.

ここで使用する古典的封入体という用語は、従来技術において記述されている、主として誤って折りたたまれたタンパク質を含む不溶性又はわずかに可溶性の（非変性水溶液などの非変性条件下での媒質中）封入体を指す。   As used herein, the term classical inclusion body is insoluble or slightly soluble (in a medium under non-denaturing conditions such as a non-denaturing aqueous solution) as described in the prior art, mainly including misfolded proteins. Refers to inclusion body.

ここで使用する非古典的封入体という用語は、古典的封入体よりも可溶性であり（非変性水溶液などの非変性条件下での媒質中）、ある程度の量の異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体を含む封入体を指す。   As used herein, the term non-classical inclusion bodies is more soluble than classical inclusion bodies (in a medium under non-denaturing conditions such as non-denaturing aqueous solutions) and is a correctly folded precursor of some amount of heterologous protein. An inclusion body containing a body.

ここで使用する異種タンパク質（Ｇ−ＣＳＦなど）の「正しく折りたたまれた前駆体」という用語は、ジスルフィド結合がまだ形成されていないか又は完全には形成されていない、正しいコンフォメーションを有する（天然コンフォメーションが存在するか又は固有に生成されうる）タンパク質（例えばＧ−ＣＳＦ）を指す。あるいは、「正しく折りたたまれた前駆体」という用語は、封入体内に存在し、その形態が変性剤又は強力なアルカリ溶液なしでも直接可溶化されて、生物活性タンパク質を提供することができる異種タンパク質の形態とすることができる。これは、例示的な異種タンパク質Ｇ−ＣＳＦを説明する実施例において明らかにされる。   As used herein, the term “correctly folded precursor” of a heterologous protein (such as G-CSF) has the correct conformation in which disulfide bonds have not yet been formed or have not been fully formed (natural Refers to a protein (e.g., G-CSF) in which a conformation may exist or may be inherently produced. Alternatively, the term “correctly folded precursor” refers to a heterologous protein that is present in the inclusion body and whose form can be directly solubilized without a denaturant or strong alkaline solution to provide a bioactive protein. It can be in the form. This is demonstrated in the examples describing the exemplary heterologous protein G-CSF.

本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体は、非古典的封入体内に存在する不溶性凝集物の中に幾分か捕獲されており、それ故これらの凝集物からの単離だけが必要であると考える。その単離は封入体の可溶化によって実施され、好ましくは可溶化に先立って洗浄工程を実施する。そのような単離のためには穏やかな可溶化剤だけを使用すべきであり、古典的封入体の可溶化のために慣例的に使用される強力な変性剤は回避することができる。可溶化に先立つ洗浄工程は、好ましくは正しく折りたたまれた前駆体が洗浄液によって溶解しない条件下で実施すべきである。Ｇ−ＣＳＦ前駆体の単離の工程は、自然酸化を可能にし（例えば空気中の酸素の存在によって）、分子内ジスルフィド架橋の自然形成を許容すると推定される。所望する場合は、洗浄及び／又は可溶化の間に、ＣｕＳＯ_４又は他の金属塩などの小量の触媒で適切に処理することによってジスルフィド結合の形成を促進することができる。それによって生物活性Ｇ−ＣＳＦを入手し、直接単離して、適切な精製手法によって精製することができる。 We have found that some correctly folded precursors of G-CSF are trapped in insoluble aggregates present in non-classical inclusion bodies and are therefore isolated from these aggregates. Only think that is necessary. The isolation is performed by solubilization of the inclusion bodies, preferably a washing step is performed prior to solubilization. Only mild solubilizers should be used for such isolation, and powerful denaturants conventionally used for solubilization of classical inclusion bodies can be avoided. The washing step prior to solubilization should preferably be carried out under conditions in which the correctly folded precursor is not dissolved by the washing solution. The process of isolation of the G-CSF precursor is presumed to allow spontaneous oxidation (eg by the presence of oxygen in the air) and to allow the spontaneous formation of intramolecular disulfide bridges. If desired, disulfide bond formation can be facilitated by appropriate treatment with small amounts of catalyst such as CuSO ₄ or other metal salts during washing and / or solubilization. Thereby, bioactive G-CSF can be obtained, directly isolated and purified by a suitable purification technique.

発現後に、古典的封入体内に認められる異種タンパク質の生産の他の既知の手法と比較して、本発明の手順は経済的見地からより優れる。強力な界面活性剤で洗浄する代りに水又は緩衝液による洗浄しか必要とせず、また可溶化は、穏やかな条件下で、強力な変性剤、強アルカリ溶液又は高濃度の界面活性剤の存在なしで実施する。さらに、通常はリフォールディングのために必要なインビトロでの再生手順を必要としない。   Compared to other known techniques for producing heterologous proteins found in classical inclusion bodies after expression, the procedure of the present invention is better from an economic point of view. Instead of washing with a strong surfactant, only washing with water or buffer is required, and solubilization is under mild conditions and without the presence of strong denaturing agents, strong alkaline solutions or high concentrations of surfactant. To implement. Furthermore, it does not require the in vitro regeneration procedure normally required for refolding.

既に封入体内に存在する異種タンパク質（特にＧ−ＣＳＦ）の正しく折りたたまれた前駆体の形成と蓄積が特に有効であり、生物活性タンパク質（例えばＧ−ＣＳＦ）が封入体から直接入手できる、本発明の特に好ましい実施態様では、生物活性タンパク質（例えばＧ−ＣＳＦ）の生産のための方法は、
・培養温度、
・誘導様式、
・発酵のタイプ、
・培地の選択、
・ストレスを生じさせることができる物質の添加、及び
・補助タンパク質の同時発現
から成る群より選択される幾つかのパラメータ又は条件の１つ又は組合せによって生合成を実施する方法を調節することを含む。 The formation and accumulation of correctly folded precursors of heterologous proteins (especially G-CSF) already present in the inclusion bodies is particularly effective and the bioactive protein (eg G-CSF) can be obtained directly from the inclusion bodies In a particularly preferred embodiment of the method for producing a bioactive protein (eg G-CSF),
・ Culture temperature,
・ Guidance style,
The type of fermentation,
・ Selection of medium
Adding a substance capable of causing stress, and adjusting the method of performing biosynthesis by one or a combination of several parameters or conditions selected from the group consisting of co-expression of auxiliary proteins .

これらのパラメータの調節は、非古典的封入体が形成されるように実施することができる。   Adjustment of these parameters can be performed such that non-classical inclusion bodies are formed.

本発明の生物活性異種タンパク質（Ｇ−ＣＳＦなど）の生産のための方法は、好ましくは封入体の洗浄及び／又は可溶化をさらに含み、変性剤の使用又はインビトロでの再生工程を伴わない生物活性異種タンパク質（Ｇ−ＣＳＦなど）の単離を可能にする。それ故、前記異種タンパク質の生産のための工程及び異種タンパク質のその後の単離及び／又は精製は、工程の間ずっと天然条件下で好都合に実施することができ、これは収率のために有益であって、経済的で環境に優しい方法を提供する。   The method for the production of a bioactive heterologous protein (such as G-CSF) of the present invention preferably further comprises washing and / or solubilization of inclusion bodies, without the use of denaturing agents or in vitro regeneration steps. Allows isolation of active heterologous proteins (such as G-CSF). Therefore, the process for the production of said heterologous protein and the subsequent isolation and / or purification of the heterologous protein can be conveniently carried out under natural conditions throughout the process, which is beneficial for the yield. And provide an economical and environmentally friendly way.

本発明の方法の１つの特徴は、生合成を実施する方法が、正しく折りたたまれたタンパク質分子（特にＧ−ＣＳＦの分子、中でもＧ−ＣＳＦの前駆体）の割合が上昇するように、封入体の組成の調節を可能にするパラメータ又は条件の少なくとも１つを調整することを含む。異種タンパク質の高い蓄積は、その異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体の高い比率を自動的に意味するわけではない。本発明の生物活性異種タンパク質の生産のための方法はまた、異種タンパク質の蓄積とその異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体の割合の間で最適の比率を見出すことを可能にする（特に異種タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合）。   One feature of the method of the present invention is that the method of performing biosynthesis increases the proportion of correctly folded protein molecules (especially G-CSF molecules, especially G-CSF precursors). Adjusting at least one of the parameters or conditions that allow adjustment of the composition. High accumulation of a heterologous protein does not automatically mean a high ratio of correctly folded precursors of that heterologous protein. The method for the production of a bioactive heterologous protein of the invention also makes it possible to find an optimal ratio between the accumulation of the heterologous protein and the proportion of correctly folded precursors of that heterologous protein (especially the heterologous protein Is G-CSF).

生物活性Ｇ−ＣＳＦの高い収率の大規模生産がそれによって達成され、他の異種タンパク質についても同様に期待される。   High yield large-scale production of biologically active G-CSF is thereby achieved and is expected for other heterologous proteins as well.

ここで使用する「生物活性Ｇ−ＣＳＦ」という用語は、造血前駆細胞の分化と増殖及び造血系の成熟細胞の活性化を促進することができるＧ−ＣＳＦを指す。本発明の方法により、有益には少なくとも１×１０^７ＩＵ／ｍｇの範囲、より好ましくは４×１０^７ＩＵ／ｍｇ以上の範囲にあるＧ−ＣＳＦの比活性を得ることが可能になる。その後に適切な精製工程を適用するとき、前記比活性を少なくとも７−８×１０^７ＩＵ／ｍｇの範囲、最も好ましくは少なくとも１×１０^８ＩＵ／ｍｇの範囲に上昇させることができる。前記比活性は、実施例１２で述べるように細胞増殖の刺激に基づく方法によって測定される。 As used herein, the term “bioactive G-CSF” refers to G-CSF that can promote the differentiation and proliferation of hematopoietic progenitor cells and the activation of mature cells of the hematopoietic system. The method of the present invention advantageously makes it possible to obtain a specific activity of G-CSF in the range of at least 1 × 10 ⁷ IU / mg, more preferably in the range of 4 × 10 ⁷ IU / mg or more. When a suitable purification step is subsequently applied, the specific activity can be increased to at least 7-8 × 10 ⁷ IU / mg, most preferably at least 1 × 10 ⁸ IU / mg. The specific activity is measured by a method based on stimulation of cell proliferation as described in Example 12.

ここで使用する「異種タンパク質」という用語は、発現を実施する生物にとって外来性であるタンパク質を指す。   As used herein, the term “heterologous protein” refers to a protein that is foreign to the organism performing the expression.

ここで使用する「再生」という用語は、変性タンパク質が、それらのタンパク質がそれらの天然コンフォメーションにおいて有するコンフォメーションへと転換することを指す。   The term “regeneration” as used herein refers to the transformation of denatured proteins into the conformation that they have in their natural conformation.

ここで使用する「インビトロでの再生」という用語は、生物の体外で実施される再生を指す。   As used herein, the term “in vitro regeneration” refers to regeneration performed outside the body of an organism.

ここで使用する「変性」という用語は、タンパク質の天然コンフォメーション（三次元構造）は変化するが、前記タンパク質の一次構造（アミノ酸鎖、ペプチド結合）は不変のままである過程を指す。   As used herein, the term “denaturation” refers to a process in which the native conformation (three-dimensional structure) of a protein changes, but the primary structure (amino acid chain, peptide bond) of the protein remains unchanged.

ここで使用する「変性剤」という用語は、（通常は溶液中で）その存在下ではタンパク質の天然コンフォメーションが保存されない物質を指す。変性剤の存在下ではタンパク質の生物活性が変化し、保存されない。   As used herein, the term “denaturing agent” refers to a substance that, in its presence (usually in solution), does not preserve the native conformation of the protein. In the presence of denaturing agents, the biological activity of the protein changes and is not preserved.

ここで使用する「凝集物」という用語は、主として疎水性結合によってならびに他の結合によって（例えばジスルフィド結合など）相互に連結された分子のクラスターを指す。これらの分子は生物学的に活性ではない。   As used herein, the term “aggregate” refers to a cluster of molecules interconnected primarily by hydrophobic bonds as well as by other bonds (eg, disulfide bonds, etc.). These molecules are not biologically active.

ここで使用する「非変性条件」という用語は、所望タンパク質の変性が起こらない条件を指す。この条件は、例えば、変性剤が存在しないか又は変性濃度未満で存在する条件を指す。   As used herein, the term “non-denaturing conditions” refers to conditions under which denaturation of the desired protein does not occur. This condition refers, for example, to the condition where no modifier is present or is present below the denaturing concentration.

ここで使用する「天然条件」という用語は、タンパク質分子がその天然コンフォメーションと生物活性を保存することができる条件を指す。   As used herein, the term “natural conditions” refers to conditions under which a protein molecule can preserve its natural conformation and biological activity.

ここで使用する「生合成」という用語は、微生物を使用することによる異種タンパク質の生産を指す。   The term “biosynthesis” as used herein refers to the production of heterologous proteins by using microorganisms.

ここで使用する「培養」という用語は、微生物が、その微生物の増殖のために必要な基質の提供ソースと共に液中にあるか（ｓｕｂｍｅｒｓｅｄ）又は固体支持体上に存在する、制御された条件下での微生物の増殖を指す。   As used herein, the term “culture” refers to controlled conditions in which a microorganism is either submerged or present on a solid support with a source of substrate necessary for growth of the microorganism. Refers to the growth of microorganisms in

ここで使用する「発酵」という用語は、バイオリアクター（発酵槽）又は振とうフラスコにおける液中条件下での微生物の培養を指す。   The term “fermentation” as used herein refers to the cultivation of microorganisms under submerged conditions in a bioreactor (fermentor) or shake flask.

ここで使用する「異種タンパク質の蓄積」及び「Ｇ−ＣＳＦの蓄積」という用語は、総タンパク質に関して、異種タンパク質又はＧ−ＣＳＦについての遺伝子の異種発現を使用することによってそれぞれ得られる異種タンパク質及びＧ−ＣＳＦの割合を指す。所望する場合は、本発明に従って、発現系において生産される所望の正しく折りたたまれた異種タンパク質を、発現系において使用する宿主細胞の総タンパク質量に対して少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、特に少なくとも約３０％及びそれ以上の割合に蓄積することが可能である。ここで使用する「異種発現」という用語は、発現を実施する生物にとって外来性である遺伝子の発現を指す。   As used herein, the terms “heterologous protein accumulation” and “G-CSF accumulation” refer to the heterologous protein and G obtained by using heterologous expression of the gene for the heterologous protein or G-CSF, respectively, with respect to the total protein. -Refers to the percentage of CSF. If desired, in accordance with the present invention, the desired correctly folded heterologous protein produced in the expression system is at least about 20%, more preferably at least about 25, based on the total amount of host cell protein used in the expression system. %, In particular at least about 30% and higher. The term “heterologous expression” as used herein refers to the expression of a gene that is foreign to the organism performing the expression.

ここで使用する「異種タンパク質（Ｇ−ＣＳＦなど）の正しく折りたたまれた前駆体の割合」という用語は、正しく、部分的に正しく、不正確に折りたたまれた形態を含む、異種タンパク質形態（例えばＧ−ＣＳＦタンパク質）の総量に対する、異種タンパク質（例えばＧ−ＣＳＦ）の正しく折りたたまれた前駆体の割合を指す。   As used herein, the term “percentage of correctly folded precursors of a heterologous protein (such as G-CSF)” refers to a heterologous protein form (eg, G), including correctly, partially correctly, and incorrectly folded forms. -Refers to the ratio of correctly folded precursor of a heterologous protein (eg G-CSF) to the total amount of (CSF protein).

ここで使用する「生物活性異種タンパク質（Ｇ−ＣＳＦなど）の割合」という用語は、（非古典的）封入体の洗浄と可溶化後の異種タンパク質（例えばＧ−ＣＳＦ）の正しく折りたたまれた前駆体の割合を指す。本発明の方法の間、特に洗浄及び／又は可溶化の間及びその後、異種タンパク質（例えばＧ−ＣＳＦ）の正しく折りたたまれた前駆体は、自然酸化、及びそれ故ジスルフィド結合の自然形成によって生物学的に活性にすることができる。   As used herein, the term “ratio of biologically active heterologous protein (such as G-CSF)” refers to a correctly folded precursor of a heterologous protein (eg, G-CSF) after washing and solubilization of (non-classical) inclusion bodies. Refers to the proportion of the body. During the method of the invention, in particular during washing and / or solubilization and thereafter, correctly folded precursors of heterologous proteins (eg G-CSF) are biologically oxidized by spontaneous oxidation and hence spontaneous formation of disulfide bonds. Can be activated.

本発明のＧ−ＣＳＦなどの生物活性異種タンパク質の生産のための方法は、ヒト及び獣医学における臨床使用に適したＧ−ＣＳＦなどの異種タンパク質の製造を可能にする。   The method for the production of biologically active heterologous proteins such as G-CSF of the present invention allows the production of heterologous proteins such as G-CSF suitable for clinical use in human and veterinary medicine.

前記方法は、ヒトＧ−ＣＳＦ及び他の哺乳類Ｇ−ＣＳＦの製造のため、ならびにメチオニルＧ−ＣＳＦ（Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ）、酵素的及び化学的に修飾された（例えばペグ化、スクシニル化など）Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ類似体及びＧ−ＣＳＦを含む融合タンパク質などのＧ−ＣＳＦ誘導体の製造のために使用できる。   Said method is for the production of human G-CSF and other mammalian G-CSF, as well as methionyl G-CSF (Met-G-CSF), enzymatically and chemically modified (eg pegylation, succinylation etc.) ) Can be used for the production of G-CSF derivatives such as G-CSF, G-CSF analogs and fusion proteins comprising G-CSF.

本発明の上記説明は特に生物活性Ｇ−ＣＳＦの生産を対象とするが、本発明の方法はまた、非古典的封入体の形態で蓄積される他の生物活性な異種タンパク質の生産のためにも使用できる。これらのタンパク質は、ＩＦＮ−β１ｂ、ＩＦＮ−β２ｂ、ＩＦＮ−γ１ｂなどのインターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＬ−２及びＩＬ−４などのインターロイキン（ＩＬ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及び腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）を含む群から選択され、及びさらに、（少なくとも一部、好ましくは実質的な割合が）自発的に正しい三次元構造に折りたたまれうる、あまり多すぎるジスルフィド結合は持たない融合タンパク質を含む、他のタンパク質を包含する。   Although the above description of the present invention is specifically directed to the production of bioactive G-CSF, the method of the present invention is also useful for the production of other bioactive heterologous proteins that accumulate in the form of non-classical inclusion bodies. Can also be used. These proteins include interferons (IFN) such as IFN-β1b, IFN-β2b, IFN-γ1b, interleukins (IL) such as IL-2 and IL-4, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), Macrophage colony stimulating factor (M-CSF), epidermal growth factor (EGF), human serum albumin (HSA), deoxyribonuclease (DNAse), fibroblast growth factor (FGF), tumor necrosis factor α (TNFα) and tumor necrosis factor a fusion protein that is selected from the group comprising β (TNFβ) and that does not have too many disulfide bonds that can be spontaneously folded into a correct three-dimensional structure (at least in part, preferably a substantial proportion) Including other proteins including.

本発明のＧ−ＣＳＦなどの生物活性異種タンパク質の生産のための方法は、発現のための宿主として使用される生物に関わりなく非古典的封入体の形成の場合に使用できる。適切な宿主生物として、主として細菌及び酵母を含む群から選択されるものが使用できる。細菌系では大腸菌及びストレプトミセス属、酵母系ではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの従来の酵母菌株及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓその他のような非従来型酵母菌株が使用できる。   The method for production of biologically active heterologous proteins such as G-CSF of the present invention can be used in the case of the formation of non-classical inclusion bodies regardless of the organism used as the host for expression. As suitable host organisms, those selected from the group comprising mainly bacteria and yeasts can be used. Conventional yeast strains such as Saccharomyces cerevisiae and non-conventional yeast strains such as Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida utilis and the like can be used in bacterial systems, and in yeast systems, conventional yeast strains such as Saccharomyces cerevisiae.

本発明のＧ−ＣＳＦなどの異種タンパク質の生合成を実施する方法は、培養温度、培地の組成物、誘導様式、発酵の実施原理又はタイプ、ストレスを生じさせる物質の添加、及び補助タンパク質の同時発現の群から選択される条件又はパラメータを調節することを含む。前記パラメータの個々のパラメータを最適化することにより、Ｇ−ＣＳＦに関して認められるように、異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体の割合を実質的に上昇させることが可能であり、前記パラメータの組合せはさらより高い割合を可能にする。生合成によってＧ−ＣＳＦを生産する好ましい実施態様に言及して、前記条件又はパラメータを以下でより詳細に説明する。   Methods for carrying out biosynthesis of heterologous proteins such as G-CSF of the present invention include the following: culture temperature, medium composition, induction mode, principle or type of fermentation, addition of stress-inducing substance, and auxiliary protein simultaneously. Adjusting a condition or parameter selected from the group of expression. By optimizing individual parameters of the parameters, it is possible to substantially increase the proportion of correctly folded precursors of the heterologous protein, as observed for G-CSF, the combination of the parameters being Allow even higher rates. The conditions or parameters are described in more detail below with reference to a preferred embodiment for producing G-CSF by biosynthesis.

（培養温度）
驚くべきことに、培養温度を低下させると、既に非古典的封入体内に存在するＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の蓄積を可能にすることが認められた。例えば大腸菌細胞の通常の最適培養温度は３７℃である。本発明では、既に非古典的封入体内に存在するＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の蓄積のための好ましい温度は、３７℃より有意に低いこと、すなわち約２０℃から約３０℃であることを認めた。最も好ましい温度は約２５℃である。 (Culture temperature)
Surprisingly, it has been observed that lowering the culture temperature allows the accumulation of correctly folded precursors of G-CSF already present in non-classical inclusion bodies. For example, the usual optimum culture temperature for E. coli cells is 37 ° C. In the present invention, the preferred temperature for accumulation of the correctly folded precursor of G-CSF already present in the non-classical inclusion body is significantly lower than 37 ° C., ie from about 20 ° C. to about 30 ° C. Admitted. The most preferred temperature is about 25 ° C.

（誘導様式）
驚くべきことに、封入体（非古典的）内のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合はまた、誘導様式にも依存することが認められた。誘導は、好ましくはＩＰＴＧ、ラクトース及びＮａＣｌから成る群より選択される誘導物質の添加によって実施できる。特に好ましい誘導はＩＰＴＧによるものである。非古典的封入体内のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合はまた、誘導物質の濃度にも依存する。ＩＰＴＧを添加するとき、その選択濃度は、好ましくは約０．１ｍＭから約１ｍＭの範囲内である。より好ましい濃度は約０．３から０．６ｍＭ、特に約０．４ｍＭである。ＮａＣｌを使用するときは、その選択濃度は、好ましくは約０．３Ｍから１．３Ｍの範囲内である。より好ましい濃度は約１．０から１．３ｍＭ、特に約１．２Ｍである。ラクトースを使用するときは、その選択濃度は、好ましくは約１から約１０ｇ／ｌの範囲内であり、最も好ましい濃度は約２から約４ｇ／ｌである。封入体内のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合はまた、誘導様式（培養時間）にも依存する。発酵の開始時に（前培養工程を実施するときは：その前培養工程の直後に）誘導物質を添加することができ、これはＩＰＴＧ、ＮａＣｌ又はラクトースの場合に好ましい。ＩＰＴＧ及びＮａＣｌは発酵のより後の段階で、適切には約６．０のＯＤ_{６００ｎｍ}で（ＯＤは細菌数の尺度である）添加することもできる。 (Guidance style)
Surprisingly, the proportion of correctly folded precursors of G-CSF within inclusion bodies (non-classical) was also found to depend on the mode of induction. Induction can be performed by the addition of an inducer, preferably selected from the group consisting of IPTG, lactose and NaCl. A particularly preferred induction is by IPTG. The proportion of correctly folded precursors of G-CSF within the non-classical inclusions also depends on the concentration of inducer. When IPTG is added, the selected concentration is preferably in the range of about 0.1 mM to about 1 mM. A more preferred concentration is about 0.3 to 0.6 mM, especially about 0.4 mM. When using NaCl, the selected concentration is preferably in the range of about 0.3M to 1.3M. A more preferred concentration is about 1.0 to 1.3 mM, especially about 1.2M. When lactose is used, the selected concentration is preferably in the range of about 1 to about 10 g / l, with the most preferred concentration being about 2 to about 4 g / l. The proportion of correctly folded precursor of G-CSF within the inclusion body also depends on the mode of induction (culture time). An inducer can be added at the start of the fermentation (when performing the pre-culture step: immediately after the pre-culture step), which is preferred in the case of IPTG, NaCl or lactose. IPTG and NaCl can also be added at a later stage in the fermentation, suitably at an OD _{600 nm} of about 6.0 (OD is a measure of the number of bacteria).

（発酵を実施する原理又はタイプ）
驚くべきことに、非古典的封入体内のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合はまた、発酵を実施するタイプにも依存することが認められた。これは、バイオリアクターでの発酵及び振とうフラスコにおいて発酵を実施することを含む群から選択される。バッチ方式で発酵を行うこと及びフェドバッチ方式で発酵を行うことを含む、バイオリアクターの発酵の実施が好ましい。発酵を実施することの好ましい原理又はタイプは、封入体の高い可溶化と共にバイオマスの高い生産性が得られるバッチ方式である。 (Principle or type of fermentation)
Surprisingly, it has been observed that the proportion of correctly folded precursors of G-CSF in non-classical inclusion bodies also depends on the type of fermentation being performed. This is selected from the group comprising fermentation in a bioreactor and performing fermentation in a shake flask. Implementation of bioreactor fermentation is preferred, including performing fermentation in batch mode and performing fermentation in fed-batch mode. The preferred principle or type of carrying out the fermentation is a batch system that provides high biomass productivity with high solubilization of inclusion bodies.

（補助タンパク質の同時発現又はストレスを生じさせる物質の添加）
さらに、封入体内のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合はまた、ストレスを引き起こすことができる物質の添加にも依存することが認められた。これらの添加物はストレスタンパク質の同時発現の引き金となり、好ましくはエタノール及びプロパノールを含む群から選択され、これらの物質は１％から５％（ｖ／ｖ）の範囲内の様々な濃度で使用することができる。約３％（ｖ／ｖ）の濃度でのエタノール及びプロパノールの使用が最も好ましい。 (Addition of substances that cause co-expression of auxiliary proteins or stress)
Furthermore, the proportion of correctly folded precursors of G-CSF in the inclusion bodies was also found to depend on the addition of substances that can cause stress. These additives trigger the co-expression of stress proteins, preferably selected from the group comprising ethanol and propanol, and these substances are used at various concentrations in the range of 1% to 5% (v / v) be able to. Most preferred is the use of ethanol and propanol at a concentration of about 3% (v / v).

（培地の組成）
さらに、驚くべきことに、非古典的封入体内のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合はまた、培地の組成にも依存することが認められた。好ましい培地は、抗生物質、例えば１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補足したＧＹＳＴ（２０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌグルコース、極微量の金属）、抗生物質、例えば１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補足したＧＹＳＰ（２０ｇ／ｌファイトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌグルコース、極微量の金属）、及び抗生物質、例えば１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補足したＬＹＳＰ（２０ｇ／ｌファイトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／ｌグリセロール、２ｇ／ｌ又は４ｇ／ｌラクトース、極微量の金属）、抗生物質、例えば１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補足したＬＹＳＴ（２０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／ｌグリセロール、２ｇ／ｌ又は４ｇ／ｌラクトース、極微量の金属）、抗生物質、例えば１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢＯＮ（１０ｇ／ｌファイトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物）、抗生物質、例えば１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補足したＧＹＳＰＯＮ（２０ｇ／ｌファイトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌグルコース、極微量の金属）を含む群から選択される（極微量の金属：ＦｅＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ：４０ｍｇ／ｌ、ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ：４０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ_４×ｎＨ_２Ｏ：１０ｍｇ／ｌ、ＡｌＣｌ_３×６Ｈ_２Ｏ：１０ｍｇ／ｌ、ＣｏＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ：４ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ：２ｍｇ／ｌ、ＮａＭｏＯ_４×２Ｈ_２Ｏ：２ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏ：１ｍｇ／ｌ、Ｈ_３ＢＯ_３：０．５ｍｇ／ｌ））。好ましくは１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＴ及びＧＹＳＰ培地を使用する。 (Composition of medium)
Furthermore, it was surprisingly found that the proportion of correctly folded precursors of G-CSF in non-classical inclusion bodies also depends on the composition of the medium. Preferred media are antibiotics such as GYST supplemented with 100 mg / l ampicillin (20 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract, 10 g / l NaCl, 10 g / l glucose, trace metals), antibiotics such as 100 mg GYSP supplemented with / l ampicillin (20 g / l Phyton, 5 g / l yeast extract, 10 g / l NaCl, 10 g / l glucose, trace metals) and LYSP supplemented with antibiotics such as 100 mg / l ampicillin ( LYST supplemented with 20 g / l phyton, 5 g / l yeast extract, 10 g / l NaCl, 6 g / l glycerol, 2 g / l or 4 g / l lactose, trace metals), antibiotics, eg 100 mg / l ampicillin 20 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract, 10 g / l NaCl, 6 g / l glycerol, 2 g / l or 4 g / l lactose, trace metals), antibiotics such as LBON supplemented with 100 mg / ml ampicillin (10 g / l phyton, 5 g / l yeast extract), antibiotics such as Selected from the group containing GYSPON (20 g / l Phyton, 5 g / l yeast extract, 10 g / l glucose, trace metal) supplemented with 100 mg / l ampicillin (trace metal: FeSO ₄ × 7H ₂ O : 40 mg / l, CaCl ₂ × 2H ₂ O: 40 mg / l, MnSO ₄ × nH ₂ O: 10 mg / l, AlCl ₃ × 6H ₂ O: 10 mg / l, CoCl ₂ × 6H ₂ O: 4 mg / l, ZnSO _{4 × 7H 2 O: 2mg /} l, NaMoO 4 × 2H 2 O: 2mg / l, CuSO 4 × 5H 2 O: 1mg / l, H 3 BO : 0.5mg / l)). Preferably, GYST and GYSP media supplemented with 100 mg / ml ampicillin are used.

（封入体の洗浄）
封入体内の生物活性タンパク質のより高い割合は、封入体のより高い溶解度を導く。封入体を界面活性剤で洗浄した場合、Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の高い割合が洗浄液と共に洗い流される。それ故、洗浄は、好ましくは水及び非常に低い濃度（１ｍＭから１０ｍＭ）の様々な緩衝液、例えばトリス／ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液から成る群より選択される洗浄液で実施する。水による洗浄が最も好ましい。洗浄液は、好ましくは低い温度、適切には４℃付近に調節する。洗浄は１回又は複数回実施することができる。 (Cleaning of inclusion bodies)
A higher proportion of bioactive protein within the inclusion body leads to a higher solubility of the inclusion body. When the inclusion bodies are washed with a surfactant, a high percentage of the correctly folded precursor of G-CSF is washed away with the washing solution. Therefore, the wash is preferably selected from the group consisting of water and various buffers at very low concentrations (1 mM to 10 mM), such as Tris / HCl buffer, phosphate buffer, acetate buffer, citrate buffer. The cleaning solution is used. Washing with water is most preferred. The cleaning solution is preferably adjusted to a low temperature, suitably around 4 ° C. Washing can be performed once or multiple times.

（封入体の可溶化）
封入体内の異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体のより高い溶解度の故に生じる非古典的封入体のより高い溶解度は、可溶化が、強力な変性剤、強アルカリ溶液又は変性濃度の界面活性剤を添加せずに、穏やかな条件下で好都合に実施できることを示す。封入体の可溶化のために、使用する溶媒は、非変性濃度（１−２Ｍ、好ましくは１０以下のｐＨ、より好ましくは約８．０のｐＨの緩衝液中）の尿素、非変性濃度（０．０５−０．２５％（ｍ／ｖ））のＮ−ラウロイルサルコシン、低濃度の両性界面活性剤、種々の非界面活性スルホベタイン（ＮＤＳＢ）、ベタイン、サルコシン、カルバモイルサルコシン、タウリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びより高い濃度の緩衝液（好ましくは１０以下、より好ましくは約８．０に維持されるｐＨの）、例えばＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ及びＭＥＳから成る群より選択することができる。好ましくはＮ−ラウロイルサルコシン、ＮＤＳＢ及びＤＭＳＯを使用する。最も好ましくは０．１％から０．２５％（ｍ／ｖ）の濃度範囲のＮ−ラウロイルサルコシンを使用する。 (Solubilization of inclusion bodies)
The higher solubility of non-classical inclusion bodies, which arises due to the higher solubility of correctly folded precursors of heterologous proteins within inclusion bodies, solubilization can be a strong denaturant, a strong alkaline solution or a denaturing concentration of surfactant. It shows that it can be conveniently carried out under mild conditions without addition. For inclusion body solubilization, the solvent used is a non-denaturing concentration (1-2 M, preferably in a buffer of pH 10 or less, more preferably in a pH of about 8.0), non-denaturing concentration ( 0.05-0.25% (m / v)) N-lauroyl sarcosine, low concentration of amphoteric surfactant, various non-surfactant sulfobetaines (NDSB), betaine, sarcosine, carbamoyl sarcosine, taurine, dimethyl sulfoxide (DMSO), and a higher concentration buffer (preferably at a pH maintained below 10 and more preferably about 8.0), for example selected from the group consisting of HEPES, HEPPS, MES, ACES and MES it can. Preferably N-lauroyl sarcosine, NDSB and DMSO are used. Most preferably, N-lauroyl sarcosine in the concentration range of 0.1% to 0.25% (m / v) is used.

約２０から３０℃、特に約２５℃の培養温度；バッチ方式での発酵の実施；各々抗生物質、例えば１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＴ又はＧＹＳＰ培地；発酵の開始時に、場合により前培養工程を実施する場合はその前培養工程の後に、約０．３−０．６ｍＭ、好ましくは約０．４ｍＭの濃度でＩＰＴＧを添加することによる誘導様式；場合により水による洗浄及び約０．１から０．２５％、好ましくは約０．２％の濃度のＮ−ラウロイルサルコシン中での封入体の可溶化が、Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合（及びその結果として生物活性Ｇ−ＣＳＦの割合）及びＧ−ＣＳＦの蓄積が特に高い最適化パラメータである。これらのパラメータにより、生じるタンパク質の組成物は、このようにして得られたＧ−ＣＳＦを、抽出、慣用的又は流動床クロマトグラフィー工程、例えばイオン交換、疎水性相互作用、サイズ排除又はアフィニティーなどのさらなる単離手順において、好ましくは固定化金属アフィニティークロマトグラフィー−ＩＭＡＣ用の充填溶液として、直接使用することを可能にする。この方法は、高い収率でＧ−ＣＳＦの大規模生産において使用できる。   Culture temperature of about 20 to 30 ° C., in particular about 25 ° C .; performing the fermentation in a batch mode; GYST or GYSP medium supplemented with antibiotics, eg 100 mg / ml ampicillin each; Induction mode by adding IPTG at a concentration of about 0.3-0.6 mM, preferably about 0.4 mM, if any after the pre-culture step; optionally washing with water and about 0.1 to 0 Inclusion body solubilization in N-lauroyl sarcosine at a concentration of .25%, preferably about 0.2%, results in a proportion of correctly folded precursors of G-CSF (and consequently bioactive G-CSF). Ratio) and G-CSF accumulation are particularly high optimization parameters. Due to these parameters, the resulting protein composition allows the G-CSF thus obtained to be extracted, conventional or fluid bed chromatography steps such as ion exchange, hydrophobic interactions, size exclusion or affinity, etc. In a further isolation procedure, it is possible to use it directly, preferably as a packing solution for immobilized metal affinity chromatography-IMAC. This method can be used in large-scale production of G-CSF with high yield.

上述したように、生物活性異種タンパク質の形成は、変性及び／又は再生のための処理を必要とせず、所望の異種タンパク質の単離及び精製を含む全工程を非変性条件、好ましくは天然条件下で実施する、本発明の方法の好ましい実施態様によって達成することができる。所望の異種タンパク質の単離及び／又は精製のための適切な手法は当業者に既知であり、例えば、周知の原理のいずれか、例えばイオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー又はサイズ排除のいずれかを用いた古典的又は流動床クロマトグラフィー、ならびに適切なマトリックス又は溶液を用いた連続的バッチ方式抽出が使用できる。好ましい手法は固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）であり、これは、高い収率及び天然条件下で純粋な生物活性タンパク質の極めて効率的な製造を可能にする。   As mentioned above, the formation of biologically active heterologous protein does not require treatment for denaturation and / or regeneration, and the entire process including isolation and purification of the desired heterologous protein is performed under non-denaturing conditions, preferably under natural conditions. Can be achieved by a preferred embodiment of the process of the invention carried out in Appropriate techniques for isolation and / or purification of the desired heterologous protein are known to those skilled in the art and include, for example, any of the well-known principles, such as either ion exchange, hydrophobic interaction, affinity or size exclusion. Classical or fluidized bed chromatography using as well as continuous batch extraction using an appropriate matrix or solution. A preferred approach is immobilized metal affinity chromatography (IMAC), which allows for highly efficient production of pure bioactive proteins under high yield and natural conditions.

（実施例１）
封入体内のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合及び封入体の可溶化後の総タンパク質の濃度への培養温度の影響
Ｇ−ＣＳＦについてのヒト遺伝子を、大腸菌（Ｆｏｐｔ５）における高発現のために改変した。プラスミドｐＥＴ３ａを含む発現系、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）では、すべての細胞タンパク質の５０％以上を占めるＧ−ＣＳＦの蓄積レベルが達成される。−７０℃の菌株バンクからの大腸菌培養物ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補足したＬＢＧ培地（１０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２．５ｇ／ｌグルコース）に１：１００の比率で接種し、その培養物を振とう装置において２５℃、１６０ｒｐｍで１０時間培養した。この培養物２から４ｍｌを、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＴ培地４０ｍｌに接種し、そこに、最終濃度０．４ｍＭとなるＩＰＴＧ誘導物質を発酵の開始時に添加した（培養物の初期ＯＤ_{λ６００ｎｍ}は０．３８５であった）。次にその培養物を振とう装置（振とうフラスコ）で、３つの異なる温度にて１６０ｒｐｍで指数的増殖期まで培養した：
２５℃：２２時間、培養物の最終ＯＤ_{λ６００ｎｍ}は１５．２±０．５であった；
３７℃：１５時間、培養物の最終ＯＤ_{λ６００ｎｍ}は１２．２±０．４であった；
４２℃：１５時間、培養物の最終ＯＤ_{λ６００ｎｍ}は６．７５±０．２であった。 Example 1
Effect of culture temperature on the percentage of correctly folded precursor of G-CSF in inclusion bodies and the concentration of total protein after solubilization of inclusion bodies The human gene for G-CSF is highly expressed in E. coli (Fopt5). Modified for. In the expression system containing plasmid pET3a, E. coli BL21 (DE3), G-CSF accumulation levels accounting for 50% or more of all cellular proteins are achieved. E. coli culture BL21 (DE3) pET3a / P-Fopt5 from a strain bank at −70 ° C. was added to LBG medium supplemented with 100 mg / l ampicillin (10 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract, 10 g / l NaCl, 2 0.5 g / l glucose) at a ratio of 1: 100, and the culture was cultured in a shaking apparatus at 25 ° C. and 160 rpm for 10 hours. 4 to 4 ml of this culture was inoculated into 40 ml of GYST medium supplemented with 100 mg / ml ampicillin, and an IPTG inducer with a final concentration of 0.4 mM was added at the start of fermentation (the initial OD _{λ600 nm of the} culture was 0.385). The culture was then cultured in a shaker (shaking flask) at three different temperatures at 160 rpm to the exponential growth phase:
25 ° C .: 22 hours, the final OD _{λ 600 nm of the} culture was 15.2 ± 0.5;
37 ° C .: 15 hours, final OD _{λ 600 nm of the} culture was 12.2 ± 0.4;
42 ° C .: 15 hours, the final OD _{λ 600 nm of the} culture was 6.75 ± 0.2.

培養の完了後、生じた培養物を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、４−５倍容量の１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０で洗浄し、バイオマスを新しい遠心分離管に移して、再び５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。そのバイオマスを５倍容量の１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０緩衝液に再懸濁し、液中プローブと共に１２×で１分間超音波処理した（負荷サイクル：６０％、仕事率：７、パルス：２／秒）。超音波処理後、破壊された細胞を再び５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。封入体を含むペレットを、非変性条件下で５０倍容量の４０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０中の０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンに可溶化し、５０ｒｐｍで振とうしながら室温で一晩、１６から１８時間放置して可溶化を進行させた。可溶化後、純粋なｈＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦを標準品として使用して、ブラッドフォード法に従ってタンパク質濃度を定量した。濃度は４２℃及び３７℃については約１ｍｇ／ｍｌ、２５℃については２〜３ｍｇ／ｍｌであった。０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンへの封入体の可溶化後の総タンパク質の濃度、及びそれぞれ種々の温度で培養したバイオマスから調製したＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体及び生物活性Ｇ−ＣＳＦの割合を表１に示す。Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体及び生物活性Ｇ−ＣＳＦの割合は、それぞれ、（封入体からの抽出後）Ｎ−ラウロイルサルコシンを除去せずに（この希釈でＮ−ラウロイルサルコシンは生物活性測定に干渉しない）可溶化した封入体の生物活性を測定することによって定量した。   After completion of the culture, the resulting culture is centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes, washed with 4-5 volumes of 10 mM Tris HCl / pH = 8.0, the biomass is transferred to a new centrifuge tube and again at 5000 rpm. Centrifuge for 10 minutes. The biomass was resuspended in 5 volumes of 10 mM Tris HCl / pH = 8.0 buffer and sonicated with a probe in solution at 12 × for 1 minute (duty cycle: 60%, power: 7, pulse: 2 / sec). After sonication, the disrupted cells were again centrifuged at 5000 rpm for 30 minutes. The pellet containing inclusion bodies was solubilized in 0.2% N-lauroyl sarcosine in 50 volumes 40 mM Tris HCl / pH = 8.0 under non-denaturing conditions and overnight at room temperature with shaking at 50 rpm. The solubilization was allowed to proceed for 16 to 18 hours. After solubilization, protein concentration was quantified according to the Bradford method using pure hMet-G-CSF as a standard. Concentrations were about 1 mg / ml for 42 ° C. and 37 ° C. and 2-3 mg / ml for 25 ° C. Concentration of total protein after solubilization of inclusion bodies in 0.2% N-lauroyl sarcosine, and correctly folded precursors and bioactive G-CSF of G-CSF prepared from biomass cultured at various temperatures, respectively The ratio is shown in Table 1. The percentage of the correctly folded precursor of G-CSF and the percentage of bioactive G-CSF were determined without removal of N-lauroyl sarcosine (after extraction from inclusion bodies) (at this dilution, N-lauroyl sarcosine was bioactive). Quantification was performed by measuring the biological activity of the solubilized inclusion bodies (which did not interfere with the measurement).

表１に示すデータから明らかなように、封入体内の正しく折りたたまれた前駆体の割合は、低い温度での培養によって著明に上昇した。さらに、０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシン中での封入体の可溶化後に２．５倍までの高い濃度の総タンパク質が得られ、このようにして調製した封入体が基本的により可溶性であることを示唆した。非古典的封入体がこのようにして形成された。

As is apparent from the data shown in Table 1, the proportion of correctly folded precursors in the inclusion bodies was markedly increased by incubation at low temperatures. Furthermore, total protein up to 2.5 times higher concentration is obtained after solubilization of inclusion bodies in 0.2% N-lauroylsarcosine, and the inclusion bodies thus prepared are essentially more soluble Suggested. Nonclassical inclusion bodies were thus formed.

（実施例１）
Ｇ−ＣＳＦの蓄積へのＩＰＴＧによる誘導様式の影響
発酵開始時のＩＰＴＧによる誘導
種々の濃度のＩＰＴＧ（０．０５ｍＭから０．４ｍＭ）による予備実験は、最終ＯＤ_{λ６００ｎｍ}＝２０−３０のバイオマスについて０．１−０．４ｍＭの範囲内でＧ−ＣＳＦの十分に高い、ほぼ同じ蓄積が達成されることを示した。−７０℃の菌株バンクからの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、ＬＢＧ／アンピシリン培地に１：５００の比率で接種し、振とう装置において２５℃、１５０ｒｐｍで１４−１８時間培養した。この培養物を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＴ生産培地に１：２０の比率で発酵槽培養物を接種するための接種培養物として使用し、前記培地に、最終濃度０．４ｍＭになるＩＰＴＧ誘導物質を発酵の開始時に添加した。発酵は、２５℃、５００ｒｐｍ及び気流１ｖｖｍで２０−２３時間、バッチ方式で実施した（７Ｌ実験用発酵槽）。工程の終了時に、培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}は約２５であった。 Example 1
Effect of mode of induction by IPTG on G-CSF accumulation Induction by IPTG at the start of fermentation Preliminary experiments with various concentrations of IPTG (0.05 mM to 0.4 mM) are 0 for biomass with a final OD _{λ600 nm} = 20-30 It was shown that a sufficiently high and nearly identical accumulation of G-CSF was achieved in the range of 1-0.4 mM. E. coli BL21 (DE3) pET3a / P-Fopt5 from a −70 ° C. strain bank was inoculated into the LBG / ampicillin medium at a ratio of 1: 500 and cultured for 14-18 hours at 25 ° C. and 150 rpm in a shaker. This culture was used as an inoculum culture to inoculate a fermenter culture at a ratio of 1:20 in a GYST production medium supplemented with 100 mg / ml ampicillin, and the medium contained IPTG to a final concentration of 0.4 mM. Inducer was added at the start of the fermentation. Fermentation was carried out in batch mode for 20-23 hours at 25 ° C., 500 rpm and airflow 1 vvm (7 L experimental fermenter). At the end of the process, the OD _{λ 600 nm} of the culture was about 25.

前記バイオマスを５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機）、さらなる処理のために凍結した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色後、デンシトメトリー分析を使用して総タンパク質中のＧ−ＣＳＦの割合を測定した。それは３０％〜４０％の範囲であった。   The biomass was centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes (Beckman centrifuge) and frozen for further processing. After SDS-PAGE and Coomassie staining, the percentage of G-CSF in the total protein was measured using densitometric analysis. It ranged from 30% to 40%.

ＯＤ_{６００ｎｍ}≒６．０でのＩＰＴＧによる誘導
培養物がＯＤ_{６００ｎｍ}≒６．０に達したときに最終濃度０．４ｍＭになるＩＰＴＧ誘導物質を添加したことを除いて、工程の開始時の０．４ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導の場合と同様にして発酵を実施した。発酵は、２５℃、５００ｒｐｍ及び気流１ｖｖｍで１８−２０時間、バッチ方式で実施した（７Ｌ実験用発酵槽）。工程の終了時に、培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}は約３０であった。バイオマスを５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機）、さらなる処理のために凍結した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色後、プロフィールデンシトメトリー分析を使用して総タンパク質中のＧ−ＣＳＦの割合を測定し、３０％〜４０％の範囲であった。実施例３で述べるように封入体をバイオマスから単離した。次に、封入体を含むペレットを冷水又は低温１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８緩衝液で洗浄し、１００００ｒｐｍで３０分間再び遠心分離して、非変性条件下で５０倍容量の４０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０中の０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンで可溶化した。１００−１５０ｒｐｍで振とうしながら室温で一晩、１６〜１８時間放置して可溶化を進行させた。可溶化後、純粋なｈＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦを標準品として使用するブラッドフォード法によってタンパク質の濃度を測定した。 Except that the induction cultures with IPTG at OD _{600 nm} ≒ 6.0 was added IPTG inducer to a final concentration of 0.4mM at the time it reaches the _{OD 600nm} ≒ 6.0, 0 at the start of the process. Fermentation was performed as in the case of induction with 4 mM IPTG. Fermentation was carried out in batch mode for 18-20 hours at 25 ° C., 500 rpm and airflow 1 vvm (7 L experimental fermentor). At the end of the process, the OD _{λ 600 nm} of the culture was about 30. The biomass was centrifuged for 5 minutes at 5000 rpm (Beckman centrifuge) and frozen for further processing. After SDS-PAGE and Coomassie staining, profile densitometry analysis was used to determine the percentage of G-CSF in the total protein and ranged from 30% to 40%. Inclusion bodies were isolated from biomass as described in Example 3. The pellet containing inclusion bodies is then washed with cold water or cold 10 mM Tris HCl / pH = 8 buffer, centrifuged again at 10000 rpm for 30 minutes, and 50 volumes of 40 mM Tris HCl / pH = under non-denaturing conditions. Solubilized with 0.2% N-lauroyl sarcosine in 8.0. Solubilization was allowed to proceed for 16-18 hours at room temperature overnight with shaking at 100-150 rpm. After solubilization, protein concentration was measured by the Bradford method using pure hMet-G-CSF as a standard.

総可溶化タンパク質の濃度は、両方の誘導方式後に２〜４ｍｇ／ｍｌの範囲であった。   The concentration of total solubilized protein ranged from 2-4 mg / ml after both induction regimes.

発酵の開始時にＩＰＴＧを添加したとき（即時誘導）又は培養物のＯＤ_{６００ｎｍ}が約６．０のときの封入体内のｈＧ−ＣＳＦの割合の比較
図１は、封入体中のタンパク質組成の結果を示す。 Comparison of the percentage of hG-CSF in inclusion bodies when IPTG is added at the start of fermentation (immediate induction) or when the culture OD _600nm is about 6.0. Figure 1 shows the results of protein composition in inclusion bodies. Show.

方法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％濃縮用ゲル、１５％分離用ゲル、クマシーブリリアントブルーで染色）。   Method: SDS-PAGE (4% concentrating gel, 15% separating gel, stained with Coomassie Brilliant Blue).

封入体の調製のための条件：培養温度２５℃、バッチ方式での発酵の実施、ＯＤ_{６００ｎｍ}≒６．０又は開始時の０．４ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導、冷水又は低温１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０緩衝液による洗浄、０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンでの可溶化。 Conditions for inclusion body preparation: culture temperature 25 ° C., batch fermentation, OD _{600 nm} ≈6.0 or induction with 0.4 mM IPTG at start, cold water or cold 10 mM Tris HCl / pH = 8. Wash with 0 buffer, solubilize with 0.2% N-lauroyl sarcosine.

レーン１：ｈＧ−ＣＳＦ標準品０．６μｇ
レーン２：ＯＤ_{６００ｎｍ}≒６．０での誘導、水による封入体洗浄
レーン３：ＯＤ_{６００ｎｍ}≒６．０での誘導、１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０緩衝液による封入体洗浄
レーン４：分子量標準品（ＬＭＷ−ＢｉｏＲａｄ）
レーン５：開始時の誘導、水による封入体洗浄
レーン６：開始時の誘導、１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０緩衝液による封入体洗浄。 Lane 1: hG-CSF standard 0.6 μg
Lane _{2: OD 600 nm} ≒ 6.0 induction with, inclusion bodies by washing with water Lane _{3: OD 600 nm} ≒ 6.0 induction in, 10 mM Tris HCl / pH = 8.0 inclusion body washing with buffer Lane 4: Molecular weight Standard product (LMW-BioRad)
Lane 5: induction at start, inclusion body wash with water Lane 6: induction at start, inclusion body wash with 10 mM Tris HCl / pH = 8.0 buffer.

結果は、開始時にＩＰＴＧを培地に添加したとき、Ｇ−ＣＳＦの非常に高い含量を有する封入体及び他の大腸菌タンパク質の重要でない不純物が得られることを明らかにしている。ＯＤ_{６００ｎｍ}≒６．０での誘導の場合は、封入体内のＧ−ＣＳＦの含量はまだ非常に高いが、他の大腸菌タンパク質の含量がより高く、その後の単離工程に影響を及ぼす可能性がある。 The results demonstrate that when IPTG is added to the medium at the start, inclusion bodies with a very high content of G-CSF and minor impurities of other E. coli proteins are obtained. In the case of induction at OD _{600 nm} ≈6.0, the content of G-CSF in the inclusion bodies is still very high, but the content of other E. coli proteins is higher, which may affect the subsequent isolation process. is there.

（実施例２）
封入体の溶解度への温度の影響
細胞を２５℃で培養するとき、封入体の溶解度がはるかに高い。界面活性剤による洗浄は、それ故、洗浄液中へのＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の損失を導く。しかし、洗浄は、さもなければクロマトグラフィーなどのその後の精製工程を妨げる可能性がある一部のタンパク質又は宿主細胞生物から生じる他の成分が封入体内に付着又は捕獲されたままであり、その後同時溶解しうるので、少なくとも水で実施すべきである。 (Example 2)
Effect of temperature on inclusion body solubility When cells are cultured at 25 ° C., the inclusion body solubility is much higher. Cleaning with a surfactant therefore leads to the loss of the correctly folded precursor of G-CSF into the cleaning solution. However, washing may leave some proteins or other components from the host cell organism attached or trapped within the inclusion body that could otherwise interfere with subsequent purification steps such as chromatography, and then co-lyse It should be done at least with water.

バイオマスの生成：−７０℃の菌株バンクからの大腸菌培養物ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢＧ培地に１：５００の比率で接種し、その培養物を振とう装置において２５℃、１５０ｒｐｍで１４−１８時間培養した。この培養物を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＴ生産培地に１：２０の比率で発酵槽培養物を接種するための接種培養物として使用し、前記培地に、最終濃度０．４ｍＭになるＩＰＴＧ誘導物質を発酵の開始時に添加した。発酵は、２つの異なる温度で、５００ｒｐｍ及び気流１ｖｖｍでバッチ方式として（７Ｌ実験用発酵槽）実施した：
２５℃、１８−２５時間、工程の終了時に培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}は約２５であった；
３７℃、８−２５時間、工程の終了時に培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}は約２８であった。 Biomass production: E. coli culture BL21 (DE3) pET3a / P-Fopt5 from a strain bank at -70 ° C. is inoculated at a ratio of 1: 500 in LBG medium supplemented with 100 mg / ml ampicillin, and the culture is shaken. Incubation was carried out at 25 ° C. and 150 rpm for 14-18 hours. This culture was used as an inoculum culture to inoculate a fermenter culture at a ratio of 1:20 in a GYST production medium supplemented with 100 mg / ml ampicillin, and the medium contained IPTG to a final concentration of 0.4 mM. Inducer was added at the start of the fermentation. The fermentation was carried out as a batch mode (7 L experimental fermentor) at 500 rpm and airflow 1 vvm at two different temperatures:
At 25 ° C., 18-25 hours, at the end of the process, the OD _{λ 600 nm} of the culture was about 25;
At 37 ° C., 8-25 hours at the end of the process, the OD _{λ 600 nm} of the culture was about 28.

非古典的封入体の単離：発酵の完了後、細菌ペレットを＋４℃、５０００ｒｐｍでの遠心分離によって上清から分離した。湿性細菌ペレットを４倍容量の緩衝液Ｘ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０）に再懸濁した。Ｕｌｔｒａｔｕｒａｘを使用して試料の均質化を実施した。次にホモジナイザーＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ Ｃ−５（ＡＶＥＳＴＩＮ）を使用して１００００から１５０００ｐｓｉ（７０−１１０ＭＰａ）の圧差での１回通過によって細胞を破壊した。１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、可溶性大腸菌タンパク質を含む上清を廃棄し、ペレット（非古典的封入体を含む）を−２０℃で凍結して、非古典的封入体の洗浄及び可溶化実験のために使用した。   Isolation of non-classical inclusion bodies: After completion of the fermentation, the bacterial pellet was separated from the supernatant by centrifugation at + 4 ° C. and 5000 rpm. The wet bacterial pellet was resuspended in 4 volumes of buffer X (10 mM Tris / HCl, pH = 8.0). Sample homogenization was performed using Ultraturax. The cells were then disrupted by a single pass at a pressure differential of 10,000 to 15000 psi (70-110 MPa) using a homogenizer EmulsiFlex C-5 (AVESTIN). After centrifuging at 10,000 rpm for 30 minutes, the supernatant containing soluble E. coli protein is discarded and the pellet (including non-classical inclusion bodies) is frozen at −20 ° C. to wash and solubilize the non-classical inclusion bodies. Used for.

非古典的封入体洗浄の以下の実験を実施した（図２）：
Ａ．水による封入体の洗浄
所定量の非古典的封入体を１０倍容量の冷水（＋４℃）に再懸濁し、＋４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、この工程を同じ容量の冷水に関して反復した。両方の洗浄後の上清においてブラッドフォード法（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準品として使用する）に従ってタンパク質の量を定量した。タンパク質組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。 The following experiment of non-classical inclusion body washing was performed (FIG. 2):
A. Washing inclusion bodies with water Re-suspend a volume of non-classical inclusion bodies in 10 volumes of cold water (+ 4 ° C.), centrifuge at + 4 ° C., 10000 rpm for 10 minutes and repeat this process for the same volume of cold water did. The amount of protein was quantified in the supernatant after both washes according to the Bradford method (bovine serum albumin (BSA) was used as a standard). The protein composition was analyzed by SDS-PAGE.

水の品質：水はＭｉｌｌｉ−Ｑ ＲＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）装置を使用して調製した。   Water quality: Water was prepared using a Milli-Q RG (Millipore) apparatus.

Ｂ．緩衝液Ｘ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０）による封入体の洗浄
所定量の非古典的封入体を１０倍容量の低温緩衝液Ｘ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０）（＋４℃）に再懸濁し、＋４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、この工程を同じ容量の低温緩衝液Ｘに関して反復した。両方の洗浄後の上清においてブラッドフォード法（ＢＳＡを標準品として使用する）に従ってタンパク質の量を定量した。タンパク質組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。 B. Washing Inclusion Body with Buffer X (10 mM Tris / HCl, pH 8.0) Predetermined amount of non-classical inclusion body into 10 volumes of cold buffer X (10 mM Tris / HCl, pH 8.0) (+ 4 ° C.) The process was repeated for the same volume of cold buffer X, resuspended and centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes at + 4 ° C. The amount of protein was quantified in both washed supernatants according to the Bradford method (BSA is used as a standard). The protein composition was analyzed by SDS-PAGE.

Ｃ．１％デオキシコール酸ナトリウムによる封入体の洗浄
所定量の非古典的封入体を１０倍容量の低温（＋４℃）緩衝液Ｗ（１％デオキシコール酸ナトリウム、５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び５ｍＭ ＥＤＴＡを加えた５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に再懸濁し、氷上で３０分間放置して、＋４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その上清においてブラッドフォード法（ＢＳＡを標準品として使用する）に従ってタンパク質の量を定量した。タンパク質組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。 C. Washing Inclusion Body with 1% Sodium Deoxycholate A given amount of non-classical inclusion body was added to 10 volumes of cold (+ 4 ° C.) buffer W (1% sodium deoxycholate, 5 mM dithiothreitol (DTT) and 5 mM EDTA. In 50 mM Tris / HCl, pH 9.0), and left on ice for 30 minutes and centrifuged at + 4 ° C. and 10,000 rpm for 10 minutes. The amount of protein was quantified in the supernatant according to the Bradford method (BSA is used as a standard). The protein composition was analyzed by SDS-PAGE.

Ｄ．１％トリトンＸ−１００による封入体の洗浄
所定量の非古典的封入体を、１％トリトンＸ−１００を加えた１０倍容量の低温（＋４℃）緩衝液Ｘ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０）に再懸濁し、氷上で３０分間放置して、＋４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その上清においてブラッドフォード法（ＢＳＡを標準品として使用する）に従ってタンパク質の量を定量した。タンパク質組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。 D. Washing Inclusion Body with 1% Triton X-100 A given amount of non-classical inclusion body was added to 10 volumes of cold (+ 4 ° C.) buffer X (10 mM Tris / HCl, pH = 1% Triton X-100 added). 8.0), left on ice for 30 minutes, and centrifuged at 10000 rpm for 10 minutes at + 4 ° C. The amount of protein was quantified in the supernatant according to the Bradford method (BSA is used as a standard). The protein composition was analyzed by SDS-PAGE.

Ｅ．２Ｍ尿素による封入体の洗浄
所定量の非古典的封入体を、２Ｍ尿素を加えた１０倍容量の低温（＋４℃）緩衝液Ｘ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０）に再懸濁し、氷上で３０分間放置して、＋４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その上清においてブラッドフォード法（ＢＳＡを標準品として使用する）に従ってタンパク質の量を定量した。タンパク質組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。 E. Washing inclusion bodies with 2M urea Re-suspend a predetermined amount of non-classical inclusion bodies in 10 volumes of cold (+ 4 ° C.) buffer X (10 mM Tris / HCl, pH = 8.0) plus 2M urea. The sample was left on ice for 30 minutes and centrifuged at + 4 ° C. and 10,000 rpm for 10 minutes. The amount of protein was quantified in the supernatant according to the Bradford method (BSA is used as a standard). The protein composition was analyzed by SDS-PAGE.

Ｆ．８Ｍ尿素による封入体の洗浄
所定量の非古典的封入体を、８Ｍ尿素を加えた１０倍容量の低温（＋４℃）緩衝液Ｘ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０）に再懸濁し、氷上で３０分間放置して、＋４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その上清においてブラッドフォード法（ＢＳＡを標準品として使用する）に従ってタンパク質の量を定量した。 F. Washing Inclusion Body with 8M Urea A predetermined amount of non-classical inclusion body is resuspended in 10 volumes of cold (+ 4 ° C.) buffer X (10 mM Tris / HCl, pH = 8.0) plus 8M urea. The sample was left on ice for 30 minutes and centrifuged at + 4 ° C. and 10,000 rpm for 10 minutes. The amount of protein was quantified in the supernatant according to the Bradford method (BSA is used as a standard).

タンパク質組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図２は、培養温度（２５℃又は３７℃）に関する封入体の可溶化の比較を示す。   The protein composition was analyzed by SDS-PAGE. FIG. 2 shows a comparison of inclusion body solubilization with respect to culture temperature (25 ° C. or 37 ° C.).

方法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％濃縮用ゲル、１５％分離用ゲル、クマシーブリリアントブルーで染色）。   Method: SDS-PAGE (4% concentrating gel, 15% separating gel, stained with Coomassie Brilliant Blue).

非古典的封入体の作製のための条件：培養温度：２５℃（レーン４−１０）及び３７℃（レーン１２−１８、２０）、バッチ方式での発酵の実施、開始時に０．４ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導、冷水又は低温１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０緩衝液又は１％デオキシコール酸ナトリウム又は１％トリトンＸ−１００又は２Ｍ尿素又は８Ｍ尿素による洗浄。   Conditions for production of non-classical inclusion bodies: culture temperature: 25 ° C. (lanes 4-10) and 37 ° C. (lanes 12-18, 20), performing batch fermentation, with 0.4 mM IPTG at the start Induction, wash with cold water or cold 10 mM Tris HCl / pH = 8.0 buffer or 1% sodium deoxycholate or 1% Triton X-100 or 2M urea or 8M urea.

レーン１：分子量標準品（ＬＭＷ−ＢｉｏＲａｄ）
レーン２：タンパク質の可溶性分画（ホモジネート上清）
レーン３：総タンパク質
レーン４：水による非古典的封入体の１回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン５：水による非古典的封入体の２回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン６：１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０による非古典的封入体の１回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン７：１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０による非古典的封入体の２回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン８：１％デオキシコール酸ナトリウムによる非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン９：２Ｍ尿素による非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１０：１％トリトンＸ−１００による非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１１：分子量標準品（ＬＭＷ−ＢｉｏＲａｄ）
レーン１２：水による非古典的封入体の１回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１３：水による非古典的封入体の２回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１４：１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０による非古典的封入体の１回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１５：１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０による非古典的封入体の２回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１６：１％デオキシコール酸ナトリウムによる非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１７：２Ｍ尿素による非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１８：１％トリトンＸ−１００による非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１９：標準ｈＧ−ＣＳＦ、０．６μｇ
レーン２０：８Ｍ尿素による非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質。 Lane 1: molecular weight standard (LMW-BioRad)
Lane 2: soluble fraction of protein (homogenate supernatant)
Lane 3: Total protein Lane 4: Solubilized protein after first wash of non-classical inclusion bodies with water
Lane 5: Solubilized protein after second wash of non-classical inclusion bodies with water Lane 6: Solubilized protein after first wash of non-classical inclusion bodies with 10 mM Tris HCl / pH = 8.0 Lane 7 : Solubilized protein after second wash of non-classical inclusion bodies with 10 mM Tris HCl / pH = 8.0 Lane 8 Solubilized protein after washing of non-classical inclusion bodies with 1% sodium deoxycholate Lane 9 : Solubilized protein after washing non-classical inclusion bodies with 2M urea Lane 10: Solubilized protein after washing non-classical inclusion bodies with 1% Triton X-100 Lane 11: Molecular weight standards (LMW-BioRad)
Lane 12: solubilized protein after first wash of non-classical inclusion bodies with water
Lane 13: Solubilized protein after second wash of non-classical inclusion bodies with water Lane 14: Solubilized protein after first wash of non-classical inclusion bodies with 10 mM Tris HCl / pH = 8.0 Lane 15 : Solubilized protein after second wash of non-classical inclusion bodies with 10 mM Tris HCl / pH = 8.0 Lane 16 Solubilized protein after washing of non-classical inclusion bodies with 1% sodium deoxycholate Lane 17 : Solubilized protein after washing non-classical inclusion bodies with 2 M urea Lane 18: Solubilized protein after washing non-classical inclusion bodies with 1% Triton X-100 Lane 19: Standard hG-CSF, 0.6 μg
Lane 20: solubilized protein after washing of non-classical inclusion bodies with 8M urea.

図２に示すように、細胞を３７℃で培養したとき（レーン１２−１８、２０）よりも細胞を２５℃で培養したとき（レーン４−１０）の方が非古典的封入体の溶解度が上昇した。細胞を２５℃で培養したとき、界面活性剤（１％デオキシコール酸塩又は１％トリトンＸ−１００）及び２Ｍ尿素による洗浄は、異種タンパク質の大部分が洗浄液と共に失われたため、もはや不可能であり（レーン８、９、１０）、細胞を３７℃で培養した場合は、界面活性剤（１％デオキシコール酸塩、レーン１６）、２Ｍ尿素（レーン１７）及び１％トリトンＸ−１００（レーン１８）による洗浄がまだ可能であった。図からわかるように、３７℃の培養温度で得られた非古典的封入体は８Ｍ尿素でのみ可溶化することができた（レーン２０）。   As shown in FIG. 2, the solubility of non-classical inclusion bodies is greater when cells are cultured at 25 ° C. (lanes 4-10) than when cells are cultured at 37 ° C. (lanes 12-18, 20). Rose. When cells are cultured at 25 ° C., washing with detergent (1% deoxycholate or 1% Triton X-100) and 2M urea is no longer possible because most of the foreign protein is lost with the wash. Yes (lanes 8, 9, 10), when cells were cultured at 37 ° C., detergent (1% deoxycholate, lane 16), 2M urea (lane 17) and 1% Triton X-100 (lane Cleaning according to 18) was still possible. As can be seen, the non-classical inclusion bodies obtained at a culture temperature of 37 ° C. could only be solubilized with 8M urea (lane 20).

（実施例４）
封入体内のＧ−ＣＳＦの蓄積及びＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合への発酵の実施の影響
バッチ方式又はフェドバッチ方式で発酵を実施することにより、非古典的封入体におけるＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の高い割合を得ることができる。 Example 4
Effect of performing fermentation on the accumulation of G-CSF in inclusion bodies and the proportion of correctly folded precursors of G-CSF G-CSF in non-classical inclusion bodies by performing fermentation in batch or fed-batch mode A high proportion of correctly folded precursors can be obtained.

バッチ方式での発酵の実施
−７０℃の菌株バンクからの大腸菌培養物ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢＧ培地に１：５００の比率で接種し、その培養物を振とう装置において２５℃、１５０ｒｐｍで１４−１８時間培養した。この培養物を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＴ生産培地に１：２０の比率で発酵槽培養物を接種するための接種培養物として使用し、前記培地に、最終濃度０．４ｍＭとなるＩＰＴＧ誘導物質を発酵の開始時又は培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}が６である指数的増殖期初期に添加した。発酵は、２５℃、５００ｒｐｍ及び気流１ｖｖｍ（７Ｌ実験用発酵槽）で１８−２５時間、バッチ方式で実施した。工程の終了時、培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}は、誘導の開始時には約２５、遅い方の誘導の場合には３０であった。バイオマスを５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機）、さらなる処理のために凍結した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色後、デンシトメトリー分析を使用して総タンパク質中のＧ−ＣＳＦの割合を測定した。前記割合は３０％から４０％の範囲であった。 Performing the fermentation in a batch mode-E. coli culture BL21 (DE3) pET3a / P-Fopt5 from a strain bank at 70 ° C. is inoculated at a ratio of 1: 500 in LBG medium supplemented with 100 mg / ml ampicillin The object was cultured for 14-18 hours at 25 ° C. and 150 rpm in a shaker. This culture is used as an inoculum culture to inoculate a fermenter culture at a ratio of 1:20 in a GYST production medium supplemented with 100 mg / ml ampicillin, in which IPTG has a final concentration of 0.4 mM. _Inducers were added at the start of fermentation or early in the exponential growth phase when the culture OD _{λ 600 nm} was 6. Fermentation was carried out in a batch mode at 25 ° C., 500 rpm and airflow 1 vvm (7 L experimental fermentor) for 18-25 hours. At the end of the process, the OD _{λ 600 nm} of the culture was about 25 at the start of induction and 30 for the later induction. The biomass was centrifuged for 5 minutes at 5000 rpm (Beckman centrifuge) and frozen for further processing. After SDS-PAGE and Coomassie staining, the percentage of G-CSF in the total protein was measured using densitometric analysis. The proportion was in the range of 30% to 40%.

フェドバッチ方式での発酵の実施
２５℃、５００ｒｐｍ及び気流１ｖｖｍ（７Ｌ実験用発酵槽）で２５．５−３０時間、フェドバッチ方式で発酵を実施した。ひとたび培地中のグルコースが消費され、すなわちバッチ工程（前記のように実施）が終了し、及び培地のｐＨが上昇すれば、０．０５−０．１μ／時の比増殖速度を提供するように１００ｍｇ／ｌアンピシリンを加えた２０％グルコース溶液の供給を開始した。７−７．５時間の供給後（合計２５．５−３０時間）、培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}が約４２になったときに工程を終了した。バイオマスを５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機）、さらなる処理のために凍結した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色後、バッチ方式で発酵を実施する場合と同様の高いレベルに維持されるＧ−ＣＳＦの蓄積をデンシトメトリー分析によって測定した。前記蓄積は３０％から４０％の範囲であった。非古典的封入体を実施例３で述べたようにバイオマスから単離した。非古典的封入体を含むペレットを冷水で洗い、再び１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、非変性条件下で５０倍容量の４０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０中の０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンに可溶化した。１００−１５０ｒｐｍで振とうしながら室温で一晩、１６から１８時間放置して可溶化を進行させた。可溶化後、純粋なｈＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦを標準品として使用するブラッドフォード法によってタンパク質濃度を定量した。 Implementation of fermentation in a fed-batch mode Fermentation was performed in a fed-batch mode for 25.5-30 hours at 25 ° C., 500 rpm, and an airflow of 1 vvm (7 L experimental fermentor). To provide a specific growth rate of 0.05-0.1 μ / hr once the glucose in the medium is consumed, ie the batch process (performed as described above) is finished and the pH of the medium is increased. Feeding of a 20% glucose solution with 100 mg / l ampicillin was started. After 7-7.5 hours feeding (25.5-30 hours total), the process was terminated when the culture OD _{λ600 nm} was about 42. The biomass was centrifuged for 5 minutes at 5000 rpm (Beckman centrifuge) and frozen for further processing. After SDS-PAGE and Coomassie staining, the accumulation of G-CSF maintained at a high level similar to that performed when the fermentation was performed in a batch mode was measured by densitometric analysis. The accumulation ranged from 30% to 40%. Non-classical inclusion bodies were isolated from biomass as described in Example 3. The pellet containing the non-classical inclusion bodies was washed with cold water, centrifuged again at 10000 rpm for 30 minutes, and 0.2% N-lauroyl in 50 volumes 40 mM Tris HCl / pH = 8.0 under non-denaturing conditions. Solubilized in sarcosine. Solubilization was allowed to proceed for 16-18 hours at room temperature overnight with shaking at 100-150 rpm. After solubilization, protein concentration was quantified by the Bradford method using pure hMet-G-CSF as a standard.

タンパク質の濃度は、どちらの発酵実施原理後も、２から４ｍｇ／ｍｌの範囲であった。Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体又は生物活性Ｇ−ＣＳＦの割合を、Ｎ−ラウロイルサルコシンを除去せずに（この希釈でＮ−ラウロイルサルコシンは生物活性測定に干渉しない）可溶化した比古典的封入体の生物活性を測定することによって定量した。   Protein concentrations ranged from 2 to 4 mg / ml after both fermentation practices. Proportion of correctly folded precursor of G-CSF or bioactive G-CSF was solubilized without removing N-lauroyl sarcosine (N-lauroyl sarcosine does not interfere with bioactivity measurement at this dilution) Quantification by measuring the biological activity of the inclusion bodies.

以下の表２は、発酵の実施方法及び誘導様式に依存したＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合を示す。   Table 2 below shows the percentage of correctly folded precursor of G-CSF depending on the method of fermentation and the mode of induction.

表２に示すデータから明らかなように、すべての場合に生物活性時の高い割合が得られ、バッチ方式で発酵を実施することによって最も高い割合が得られた。

As is clear from the data shown in Table 2, in all cases a high percentage of biological activity was obtained, and the highest percentage was obtained by performing the fermentation in a batch mode.

（実施例５）
Ｇ−ＣＳＦの蓄積及びＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合へのラクトースによる誘導の影響
−７０℃の菌株バンクからの大腸菌培養物ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢＧ培地に１：５００の比率で接種し、その培養物を振とう装置において２５℃、１５０ｒｐｍで１４−１８時間培養した。この培養物を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＹＳＴ改変生産培地に１：２０の比率で発酵槽培養物を接種するための接種培養物として使用し、但し、グルコースの代わりにグリセロール（６ｇ／ｌ）及びラクトース（２ｇ／ｌ又は４ｇ／ｌ）を炭素ソースとして使用し、これらは同時に、ＩＰＴＧに代わる発現誘導物質でもあった。発酵は、２５℃、５００ｒｐｍ及び気流１ｖｖｍ（７Ｌ実験用発酵槽）で１７−２１時間、バッチ方式で実施した。工程の終了時に培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}は約２０であった。バイオマスを５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機）、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ＝８緩衝液で１回洗浄して、さらなる処理のために凍結した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色後、デンシトメトリー分析を使用してＧ−ＣＳＦの蓄積を測定し、２ｇ／ｌラクトースによる誘導については２７％及び４ｇ／ｌによる誘導では３３％であった。非古典的封入体を実施例３で述べたようにバイオマスから単離した。非古典的封入体を含むペレットを冷水で洗い、再び１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、非変性条件下で５０倍容量の４０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０中の０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンに可溶化した。１００−１５０ｒｐｍで振とうしながら室温で一晩、１６から１８時間放置して可溶化を進行させた。 (Example 5)
Effect of lactose induction on G-CSF accumulation and percentage of correctly folded precursors of G-CSF-E. coli culture BL21 (DE3) pET3a / P-Fopt5 from a strain bank at 70 ° C. at 100 mg / ml The LBG medium supplemented with ampicillin was inoculated at a ratio of 1: 500, and the culture was cultured at 25 ° C. and 150 rpm for 14-18 hours in a shaker. This culture is used as an inoculum culture for inoculating fermentor cultures at a 1:20 ratio in LYST modified production medium supplemented with 100 mg / ml ampicillin, except that glycerol (6 g / l instead of glucose). ) And lactose (2 g / l or 4 g / l) were used as carbon sources, which were also expression inducers replacing IPTG at the same time. Fermentation was carried out in a batch mode for 17-21 hours at 25 ° C., 500 rpm and airflow 1 vvm (7 L experimental fermentor). At the end of the process, the OD _{λ 600 nm} of the culture was about 20. The biomass was centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes (Beckman centrifuge), washed once with 10 mM Tris / HCl, pH = 8 buffer and frozen for further processing. After SDS-PAGE and Coomassie staining, densitometric analysis was used to measure G-CSF accumulation, 27% for induction with 2 g / l lactose and 33% for induction with 4 g / l. Non-classical inclusion bodies were isolated from biomass as described in Example 3. The pellet containing the non-classical inclusion bodies was washed with cold water, centrifuged again at 10000 rpm for 30 minutes, and 0.2% N-lauroyl in 50 volumes 40 mM Tris HCl / pH = 8.0 under non-denaturing conditions. Solubilized in sarcosine. Solubilization was allowed to proceed for 16-18 hours at room temperature overnight with shaking at 100-150 rpm.

表３は、ラクトースによる生産菌株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５の誘導によって得られた非古典的封入体中のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体又は生物活性Ｇ−ＣＳＦの割合（％）を示す。   Table 3 shows the percentage of correctly folded precursors of G-CSF or bioactive G-CSF in non-classical inclusion bodies obtained by induction of lactose producing strain, E. coli BL21 (DE3) pET3a / P-Fopt5 (%).

表３から明らかなように、ラクトースによる誘導の使用により、２５℃で培養したとき、少なくとも２３％という封入体中のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合が得られた。

As is apparent from Table 3, the use of lactose induction resulted in a percentage of correctly folded precursor of G-CSF in inclusion bodies of at least 23% when cultured at 25 ° C.

（実施例６）
Ｇ−ＣＳＦの蓄積及びＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合へのＮａＣｌによる誘導の影響
−７０℃の菌株バンクからの大腸菌培養物ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢＯＮ培地に１：２０の比率で接種し、その日に振とう装置において２５℃、１６０ｒｐｍで８時間培養した。この培養物１ｍｌを、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＰＯＮ培地２０ｍｌに接種するための接種培養物として使用し、前記培地に、開始時又はＯＤ_{λ６００ｎｍ}≒０．５の時点、すなわち培養の約３時間後に最終濃度１．２ＭになるＮａＣｌ誘導物質を添加した。どちらの場合も、培養物を振とう装置において２５℃、１６０ｒｐｍで２０−２４時間培養した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、培養が完了した後この培養物５ｍｌを５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次にペレットを１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０ １５ｍｌに再懸濁した。試料を、４×ＳＤＳ−ＤＴＴを含む試料緩衝液（ｐＨ＝８．７）と３：１の比率で混合し、９５℃で１０分間加熱して、遠心分離し、その上清をゲルに負荷した。Ｇ−ＣＳＦの蓄積を表４に提示しており、表４は、種々の培地及び誘導方式での生産菌株ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５のＧ−ＣＳＦの蓄積の比較を示している。表に示すように、１．２Ｍ ＮａＣｌを開始時に、すなわち製造者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって推奨されている従来のＯＤ_{λ６００ｎｍ}≒０．５の時点ではなく接種時に培地に添加したときにより高いＧ−ＣＳＦの蓄積が得られた。 (Example 6)
Effect of NaCl induction on G-CSF accumulation and the proportion of correctly folded precursors of G-CSF. E. coli culture BL21 (DE3) pET3a / P-Fopt5 from a strain bank at 70 ° C. at 100 mg / ml The LBON medium supplemented with ampicillin was inoculated at a ratio of 1:20 and cultured for 8 hours at 25 ° C. and 160 rpm in a shaking apparatus on that day. 1 ml of this culture is used as an inoculum culture to inoculate 20 ml of GYSPON medium supplemented with 100 mg / ml ampicillin, which is added to the medium at the beginning or when OD _{λ600 nm ≈0.5} , ie about 3 hours of culture A NaCl inducer was added later to a final concentration of 1.2M. In both cases, the culture was cultured for 20-24 hours at 25 ° C. and 160 rpm in a shaker. For SDS-PAGE analysis, 5 ml of this culture was centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes after the culture was complete. The pellet was then resuspended in 15 ml of 10 mM Tris HCl / pH = 8.0. The sample is mixed with sample buffer (pH = 8.7) containing 4 × SDS-DTT at a ratio of 3: 1, heated at 95 ° C. for 10 minutes, centrifuged, and the supernatant is loaded onto the gel. did. G-CSF accumulation is presented in Table 4, which shows a comparison of G-CSF accumulation of the production strain BL21-SI pET3a / P-Fopt5 in various media and induction modes. As shown in the table, higher G-CSF when 1.2M NaCl was added to the medium at the start, ie, at the time of inoculation rather than the conventional OD _{λ600nm ≈0.5} recommended by the manufacturer (Life Technologies) The accumulation of was obtained.

Ｇ−ＣＳＦアッセイに関して報告した数値は、図３に示すクマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー分析によって得た。相対的割合は、Ｉｍａｇｉｎｇ ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ＧＳ６７０型装置（ＢｉｏＲａｄ）でのゲルのプロフィール分析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｔプログラム；ＢｉｏＲａｄ）によって決定した。

The values reported for the G-CSF assay were obtained by densitometric analysis of an SDS-PAGE gel stained with Coomassie brilliant blue as shown in FIG. Relative proportions were determined by gel profile analysis (Molecular analyst program; BioRad) on an Imaging densitometer GS670 model (BioRad).

図３は、非古典的封入体中のタンパク質の組成物を示す。   FIG. 3 shows the composition of the protein in non-classical inclusion bodies.

方法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％濃縮用ゲル、１５％分離用ゲル、クマシーブリリアントブルーで染色）。   Method: SDS-PAGE (4% concentrating gel, 15% separating gel, stained with Coomassie Brilliant Blue).

非古典的封入体の作製のための条件：生産菌株ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、培養温度２５℃、振とうフラスコでの発酵、非誘導培養又はＯＤ_{λ６００ｎｍ}≒０．５の時点で又は開始時に１．２Ｍ ＮａＣｌによる誘導。 Conditions for production of non-classical inclusion bodies: production strain BL21-SI pET3a / P-Fopt5, culture temperature 25 ° C., fermentation in shake flasks, non-induced culture or OD _{λ600 nm ≈0.5} or start Sometimes induction with 1.2 M NaCl.

レーン１：ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、非誘導培養
レーン２：ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、ＯＤ_{λ６００ｎｍ}≒０．５の時点で１．２Ｍ ＮａＣｌによる誘導
レーン３：ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、ＯＤ_{λ６００ｎｍ}≒０．５の時点で１．２Ｍ ＮａＣｌによる誘導
レーン４：ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、開始時に１．２Ｍ ＮａＣｌによる誘導
レーン５：ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、開始時に１．２Ｍ ＮａＣｌによる誘導
レーン６：ｒｈＧ−ＣＳＦ ０．６μｇ
生物活性の定量及び非古典的封入体洗浄実験のための試料の調製
生物活性の分析及び非古典的封入体洗浄実験のために、より多量のバイオマスを調製した。−７０℃の菌株バンクからの大腸菌培養物ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢＯＮ培地に１：２０の比率で接種し、その日に振とう装置において２５℃、１６０ｒｐｍで８時間培養した。この培養物の１０ｍｌアリコートを、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＰＯＮ培地８×２００ｍｌに接種し、前記培地に、開始時に最終濃度１．２ＭとなるＮａＣｌ誘導物質を添加した。前記培養物を振とう装置において２５℃、１６０ｒｐｍで２４時間培養した。非古典的封入体を実施例３で述べたようにバイオマスから単離した。次に、非古典的封入体を含むペレットを冷水で洗い、実施例９で述べるように０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンで可溶化した。可溶化後、純粋なｈＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦを標準品として使用するブラッドフォード法に従ってタンパク質濃度を測定した。総可溶化タンパク質の濃度は２−３ｍｇ／ｍｌの範囲であった。 Lane 1: BL21-SI pET3a / P-Fopt5, non-induced culture Lane 2: BL21-SI pET3a / P-Fopt5, induction with 1.2M NaCl at OD _{λ600 nm ≈0.5} Lane 3: BL21-SI pET3a / P-Fopt5, induction with 1.2M NaCl when OD _λ600nm ≈ 0.5 Lane 4: BL21-SI pET3a / P-Fopt5, induction with 1.2M NaCl at the start Lane 5: BL21-SI pET3a / P-Fopt5 Induction with 1.2 M NaCl at the start Lane 6: 0.6 μg rhG-CSF
Quantification of bioactivity and sample preparation for non-classical inclusion body washing experiments Larger amounts of biomass were prepared for bioactivity analysis and non-classical inclusion body washing experiments. E. coli culture BL21-SI pET3a / P-Fopt5 from a strain bank at −70 ° C. is inoculated at a ratio of 1:20 in LBON medium supplemented with 100 mg / ml ampicillin and on that day at 25 ° C., 160 rpm For 8 hours. A 10 ml aliquot of this culture was inoculated into 8 × 200 ml of GYSPON medium supplemented with 100 mg / ml ampicillin, and NaCl inducer was added to the medium to a final concentration of 1.2 M at the start. The culture was cultured in a shaker at 25 ° C. and 160 rpm for 24 hours. Non-classical inclusion bodies were isolated from biomass as described in Example 3. The pellet containing the non-classical inclusion bodies was then washed with cold water and solubilized with 0.2% N-lauroyl sarcosine as described in Example 9. After solubilization, protein concentration was measured according to the Bradford method using pure hMet-G-CSF as a standard. The total solubilized protein concentration ranged from 2-3 mg / ml.

従って、表５は、１．２Ｍ ＮａＣｌによる生産菌株、大腸菌ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５の誘導によって得た非古典的封入体中のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体又は生物活性Ｇ−ＣＳＦの割合を示す。   Thus, Table 5 shows the correctly folded precursor or bioactive G-CSF of G-CSF in non-classical inclusion bodies obtained by induction of the production strain with 1.2 M NaCl, E. coli BL21-SI pET3a / P-Fopt5. Shows the percentage of CSF.

表５から明らかなように、２５℃で培養したとき１．２Ｍ ＮａＣｌによる異種遺伝子の発現の誘導により、生産菌株、大腸菌ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５に関してＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体（又は生物活性Ｇ−ＣＳＦ）の高い割合が得られた。

As is apparent from Table 5, G-CSF correctly folded precursor for the production strain, E. coli BL21-SI pET3a / P-Fopt5, by induction of heterologous gene expression by 1.2 M NaCl when cultured at 25 ° C. A high proportion of (or bioactive G-CSF) was obtained.

非古典的封入体の溶解度
２５℃で培養したとき１．２Ｍ ＮａＣｌによる異種遺伝子の発現の誘導により、生産菌株、大腸菌ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５に関して封入体の溶解度が大きく上昇した。ここでも、界面活性剤による非古典的封入体の洗浄は、Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の洗浄液への損失を導く。これは、種々の溶媒での洗浄に関する非古典的封入体の溶解度の比較を示す図４によって明らかにされる。 Solubility of non-classical inclusion bodies When cultured at 25 ° C., the induction of heterologous genes by 1.2 M NaCl greatly increased the solubility of inclusion bodies for the production strain, E. coli BL21-SI pET3a / P-Fopt5. Again, washing of the non-classical inclusion bodies with the surfactant leads to loss of the correctly folded precursor of G-CSF to the wash solution. This is demonstrated by FIG. 4, which shows a comparison of the solubility of non-classical inclusion bodies for washing with various solvents.

方法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％濃縮用ゲル、１５％分離用ゲル、クマシーブリリアントブルーで染色）。   Method: SDS-PAGE (4% concentrating gel, 15% separating gel, stained with Coomassie Brilliant Blue).

非古典的封入体の作製のための条件：菌株ＢＬ２１（ＳＩ）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、培養温度２５℃、振とうフラスコでの発酵、１．２Ｍ ＮａＣｌによる誘導、水又は１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０又は１％デオキシコール酸ナトリウム又は１％トリトンＸ−１００又は２Ｍ尿素による洗浄。   Conditions for production of non-classical inclusion bodies: strain BL21 (SI) pET3a / P-Fopt5, culture temperature 25 ° C., fermentation in shake flask, induction with 1.2 M NaCl, water or 10 mM Tris HCl / pH = Wash with 8.0 or 1% sodium deoxycholate or 1% Triton X-100 or 2M urea.

非古典的封入体を２５℃で振とうフラスコにおいて作製し、開始時に培地に添加した１．２ｍＭ ＮａＣｌで誘導した。   Nonclassical inclusion bodies were made in shake flasks at 25 ° C. and induced with 1.2 mM NaCl added to the medium at the start.

レーン１：タンパク質の可溶性分画（ホモジネート上清）
レーン２：分子量標準品（ＬＭＷ−ＢｉｏＲａｄ）
レーン３：総タンパク質
レーン４：水による非古典的封入体の１回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン５：水による非古典的封入体の２回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン６：１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０による非古典的封入体の１回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン７：１％デオキシコール酸ナトリウムによる非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン８：２Ｍ尿素による非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン９：１％トリトンＸ−１００による非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質。 Lane 1: Soluble fraction of protein (homogenate supernatant)
Lane 2: molecular weight standard (LMW-BioRad)
Lane 3: Total protein Lane 4: Solubilized protein after first wash of non-classical inclusion bodies with water
Lane 5: Solubilized protein after second wash of non-classical inclusion bodies with water Lane 6: Solubilized protein after first wash of non-classical inclusion bodies with 10 mM Tris HCl / pH = 8.0 Lane 7 Solubilized protein after washing non-classical inclusion bodies with 1% sodium deoxycholate Lane 8: Solubilized protein after washing non-classical inclusion bodies with 2M urea Lane 9 Non-classical with 1% Triton X-100 Solubilized protein after washing of the inclusion bodies.

（実施例７）
封入体中のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合への、ストレスを生じさせることができる添加物、例えばエタノール又はプロパノールの影響
−７０℃の菌株バンクからの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢＰＧ培地（１０ｇ／ｌファイトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ）に１：５００の比率で接種し、振とう装置において２５℃、１６０ｒｐｍで１７時間培養した。この培養物１０ｍｌを、最終濃度０．４ｍＭになるＩＰＴＧ誘導物質を即時添加した培地２００ｍｌに接種した；
−１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＰ培地（対照）；
−エタノール（培地中の最終エタノール濃度３％）を添加した１００ｍｇ／ｍｌアンピシリン補足ＧＹＳＰ培地；
−イソプロパノール（培地中の最終イソプロパノール濃度３％）を添加した１００ｍｇ／ｍｌアンピシリン補足ＧＹＳＰ培地。 (Example 7)
Effect of additives capable of generating stress, such as ethanol or propanol, on the proportion of correctly folded precursors of G-CSF in inclusion bodies-E. coli BL21 (DE3) pET3a / from strain bank at 70 ° C P-Fopt5 was inoculated at a ratio of 1: 500 in LBPG medium (10 g / l phyton, 5 g / l yeast extract, 10 g / l NaCl) supplemented with 100 mg / ml ampicillin, and 25 ° C., 160 rpm in a shaking apparatus. For 17 hours. 10 ml of this culture was inoculated into 200 ml of medium immediately added with an IPTG inducer to a final concentration of 0.4 mM;
-GYSP medium supplemented with 100 mg / ml ampicillin (control);
-100 mg / ml ampicillin supplemented GYSP medium supplemented with ethanol (final ethanol concentration 3% in the medium);
-100 mg / ml ampicillin supplemented GYSP medium supplemented with isopropanol (final isopropanol concentration 3% in the medium).

次に、対照（１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＰ培地）の場合は培養物を振とう装置において２５℃、１６０ｒｐｍで２４時間培養した。エタノール又はイソプロパノールを添加した１００ｍｇ／ｍｌアンピシリン補足ＧＹＳＰ培地の場合は、どちらの物質の添加も増殖を緩慢化するので、同じ条件下で３４時間培養した。非古典的封入体を実施例３で述べたようにバイオマスから単離した。次に、非古典的封入体を含むペレットを冷水で洗い、実施例９で述べるように０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンの添加によって可溶化した。   Next, in the case of a control (GYSP medium supplemented with 100 mg / ml ampicillin), the culture was cultured for 24 hours at 25 ° C. and 160 rpm in a shaker. In the case of 100 mg / ml ampicillin-supplemented GYSP medium supplemented with ethanol or isopropanol, the addition of either substance slows down the growth, and the cells were cultured under the same conditions for 34 hours. Non-classical inclusion bodies were isolated from biomass as described in Example 3. The pellet containing the non-classical inclusion bodies was then washed with cold water and solubilized by addition of 0.2% N-lauroyl sarcosine as described in Example 9.

従って、表６は、０．４ｍＭ ＩＰＴＧ及びストレスを生じさせることができるエタノール又はプロパノールの添加による、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリン補足ＧＹＳＰ培地中の生産菌株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５の誘導によって得た非古典的封入体中のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合（％）を示す。   Thus, Table 6 shows the induction of the production strain, E. coli BL21 (DE3) pET3a / P-Fopt5, in 100 mg / ml ampicillin supplemented GYSP medium by the addition of 0.4 mM IPTG and ethanol or propanol capable of producing stress. The percentage of correctly folded precursor of G-CSF in the resulting non-classical inclusion bodies is shown.

表６から明らかなように、ストレスタンパク質の引き金となるエタノール又はプロパノールの添加は、非古典的封入体中のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体又は生物活性Ｇ−ＣＳＦの割合を上昇させる。

As can be seen from Table 6, the addition of ethanol or propanol to trigger the stress protein increases the proportion of correctly folded precursors of G-CSF or bioactive G-CSF in non-classical inclusion bodies.

（実施例８）
緩衝液中の尿素による非古典的封入体の可溶化
２Ｍ尿素を含む緩衝液Ｚ（４０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ＝８．０）１２ｍｌを、あらかじめ冷水で洗浄した湿性非古典的封入体０．３０ｇに加えた（実施例３参照）。均質化後、非古典的封入体を、８０ｒｐｍで穏やかに振とうしながら２０℃で１６時間可溶化した。その溶液を１４０００ｒｐｍ、＋１０℃で１０分間遠心分離し、ペレットを廃棄した。可溶化非古典的封入体を含む上清を、総タンパク質含量の定量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び生物活性の測定のために使用した。 (Example 8)
Solubilization of non-classical inclusion bodies with urea in buffer 12 ml of buffer Z (40 mM Tris / HCl pH = 8.0) containing 2 M urea was added to 0.30 g of wet non-classical inclusion bodies previously washed with cold water. Added (see Example 3). After homogenization, the non-classical inclusion bodies were solubilized at 20 ° C. for 16 hours with gentle shaking at 80 rpm. The solution was centrifuged at 14000 rpm at + 10 ° C. for 10 minutes and the pellet was discarded. Supernatants containing solubilized non-classical inclusion bodies were used for quantification of total protein content, SDS-PAGE analysis and measurement of biological activity.

ブラッドフォード法（ｈＭｅｔＧ−ＣＳＦを標準品として使用する）に従ったタンパク質濃度：２．６ｍｇ／ｍｌ、総可溶化タンパク質：３１ｍｇ（可溶化タンパク質の量：湿性非古典的封入体の量に対して約１０％）。   Protein concentration according to Bradford method (hMetG-CSF is used as a standard): 2.6 mg / ml, total solubilized protein: 31 mg (amount of solubilized protein: relative to the amount of wet non-classical inclusion bodies) About 10%).

Ｇ−ＣＳＦの生物活性：約１．５×１０^７ＩＵ／ｍｇ。 Bioactivity of G-CSF: about 1.5 × 10 ⁷ IU / mg.

（実施例９）
緩衝液中のＮ−ラウロイルサルコシンによる非古典的封入体の可溶化
０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンを含む緩衝液Ｚ（４０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ＝８．０）１５．６ｍｌを、あらかじめ冷水で洗浄した湿性非古典的封入体０．３１ｇに加えた（実施例３参照）。均質化後、非古典的封入体を、１００−５０ｒｐｍで振とうしながら室温（２０−２２℃）で１時間可溶化し、最終濃度４０μＭとなるように０．１Ｍ ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏを添加して酸化（すなわちジスルフィド結合形成）を促進した。８０ｒｐｍ、２０℃で一晩（１６時間）、振とうを継続した。翌日その溶液を１４０００ｒｐｍ、＋１０℃で１０分間遠心分離し、ペレットを廃棄した。ＤＯＷＥＸ０．３９ｇが添加されるようにＤＯＷＥＸ（ＤＯＷＥＸ１×４ Ｓｉｇｍａ）を使用することにより、可溶化非古典的封入体を含む上清からＮ−ラウロイルサルコシンを除去し、その溶液を１００−１５０ｒｐｍ、室温（２０−２２℃）で１時間振とうした。ペレットを廃棄した。可溶化非古典的封入体の溶液を、総タンパク質含量の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び生物活性の測定のために使用した。ブラッドフォード法（ｈＭｅｔＧ−ＣＳＦを標準品として使用する）に従ったタンパク質濃度：４．４ｍｇ／ｍｌ、総可溶化タンパク質含量：６８ｍｇ（可溶化タンパク質の量：湿性非古典的封入体の量に対して約２０％）。 Example 9
Solubilization of non-classical inclusion bodies with N-lauroyl sarcosine in buffer 15.6 ml of buffer Z (40 mM Tris / HCl pH = 8.0) containing 0.2% N-lauroyl sarcosine was previously washed with cold water Was added to 0.31 g of wet non-classical inclusion bodies (see Example 3). After homogenization, the non-classical inclusion bodies were solubilized at room temperature (20-22 ° C.) for 1 hour with shaking at 100-50 rpm, and 0.1 M CuSO ₄ × 5H ₂ O was added to a final concentration of 40 μM. Addition promoted oxidation (ie disulfide bond formation). Shaking was continued overnight (16 hours) at 80 rpm and 20 ° C. The next day, the solution was centrifuged at 14000 rpm and + 10 ° C. for 10 minutes and the pellet was discarded. By using DOWEX (DOWEX 1 × 4 Sigma) such that 0.39 g of DOWEX is added, N-lauroyl sarcosine is removed from the supernatant containing the solubilized non-classical inclusion bodies, and the solution is 100-150 rpm, room temperature Shake for 1 hour at (20-22 ° C). The pellet was discarded. Solutions of solubilized non-classical inclusion bodies were used for determination of total protein content, SDS-PAGE analysis and measurement of biological activity. Protein concentration according to Bradford method (using hMetG-CSF as standard): 4.4 mg / ml, total solubilized protein content: 68 mg (amount of solubilized protein: relative to the amount of wet non-classical inclusion bodies) About 20%).

Ｇ−ＣＳＦの生物活性：約４．０−４．５×１０^７ＩＵ／ｍｇ−ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏの添加とは無関係。 Bioactivity of G-CSF: unrelated to addition of about 4.0-4.5 × 10 ⁷ IU / mg-CuSO ₄ × 5H ₂ O.

（実施例１０）
緩衝液中のＮＤＳＢによる非古典的封入体の可溶化
０．２％の濃度の種々のＮＤＳＢ（非界面活性スルホベタイン）を添加した、４０倍過剰の緩衝液Ｚ（４０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ＝８．０）を、あらかじめ冷水で洗浄した湿性非古典的封入体の０．１６ｇアリコートに加えた（実施例３参照）。ＮＤＳＢ１９５、ＮＤＳＢ２０１、ＮＤＳＢ２１１及びＮＤＳＢ２５６を使用した。均質化後、非古典的封入体の試料を、８０ｒｐｍで振とうしながら２０℃で一晩可溶化した。平行実験において、最初の３０分間の可溶化期間後、酸化を促進するため、最終濃度４０μＭになるように０．１Ｍ ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏを添加した。翌日遠心分離した後、非溶解ペレットを廃棄し、上清を、事前の処理を行わずに、総タンパク質含量の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び生物活性の測定のために使用した。ブラッドフォード法（ｈＭｅｔＧ−ＣＳＦを標準品として使用する）に従ったタンパク質濃度：すべての場合に約３．６ｍｇ／ｍｌ、それ故総タンパク質含量：約２４ｍｇ（可溶化タンパク質の量：湿性非古典的封入体の量に対して約１５％）。 (Example 10)
Solubilization of non-classical inclusion bodies by NDSB in buffer 40-fold excess of Buffer Z (40 mM Tris / HCl pH = 8, with addition of 0.2% concentration of various NDSBs (non-surfactant sulfobetaine) 0.0) was added to a 0.16 g aliquot of wet non-classical inclusion bodies previously washed with cold water (see Example 3). NDSB195, NDSB201, NDSB211 and NDSB256 were used. After homogenization, a sample of non-classical inclusion bodies was solubilized overnight at 20 ° C. with shaking at 80 rpm. In parallel experiments, 0.1 M CuSO ₄ × 5H ₂ O was added to a final concentration of 40 μM after the initial 30 minute solubilization period to promote oxidation. After centrifugation the next day, the undissolved pellet was discarded and the supernatant was used for determination of total protein content, SDS-PAGE analysis and measurement of biological activity without prior treatment. Protein concentration according to the Bradford method (hMetG-CSF is used as a standard): about 3.6 mg / ml in all cases, hence total protein content: about 24 mg (amount of solubilized protein: wet non-classical About 15% relative to the amount of inclusions).

Ｇ−ＣＳＦの生物活性：約３−４×１０^７ＩＵ／ｍｇ−ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏの添加とは無関係。 Bioactivity of G-CSF: Not related to addition of about 3-4 × 10 ⁷ IU / mg-CuSO ₄ × 5H ₂ O.

（実施例１１）
緩衝液中のＤＭＳＯによる非古典的封入体の可溶化
５％ＤＭＳＯを添加した、４０倍過剰の緩衝液Ｚ（４０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ＝８．０）を、あらかじめ冷水で洗浄した非古典的封入体０．１６ｇに加えた（実施例３参照）。均質化後、非古典的封入体を、８０ｒｐｍで振とうしながら２０℃で一晩可溶化した。平行実験において、最初の３０分間の可溶化期間後、酸化を促進するため、最終濃度４０μＭになるように０．１Ｍ ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏを添加した。翌日遠心分離した後、沈殿物を廃棄し、上清を、事前の処理を行わずに、総タンパク質含量の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び生物活性の測定のために使用した。ブラッドフォード法（ｈＭｅｔＧ−ＣＳＦを標準品として使用する）に従ったタンパク質濃度：約３．６ｍｇ／ｍｌ、それ故総タンパク質含量：約２４ｍｇ（可溶化タンパク質の量：湿性非古典的封入体の量に対して約１５％）。 (Example 11)
Solubilization of non-classical inclusion bodies with DMSO in buffer Non-classical inclusions pre-washed with cold water in a 40-fold excess of Buffer Z (40 mM Tris / HCl pH = 8.0) with addition of 5% DMSO 0.16 g of body (see Example 3). After homogenization, the non-classical inclusion bodies were solubilized overnight at 20 ° C. with shaking at 80 rpm. In parallel experiments, 0.1 M CuSO ₄ × 5H ₂ O was added to a final concentration of 40 μM after the initial 30 minute solubilization period to promote oxidation. After centrifugation the next day, the precipitate was discarded and the supernatant was used for measurement of total protein content, SDS-PAGE analysis and measurement of biological activity without prior treatment. Protein concentration according to Bradford method (using hMetG-CSF as standard): about 3.6 mg / ml, hence total protein content: about 24 mg (amount of solubilized protein: amount of wet non-classical inclusion bodies About 15%).

Ｇ−ＣＳＦの生物活性：約４×１０^７ＩＵ／ｍｇ−ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏの添加とは無関係。 Bioactivity of G-CSF: unrelated to addition of about 4 × 10 ⁷ IU / mg-CuSO ₄ × 5H ₂ O.

（実施例１２）
インビトロでのＧ−ＣＳＦの生物活性の試験
既知の方法（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ Ｕら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ １３，９−２０（１９９５））に従った細胞系ＮＦＳ−６０に関する増殖アッセイの使用及び国際標準ヒト組換えＧ−ＣＳＦ（８８／５０２、酵母細胞由来；ＮＩＢＳＣ Ｐｏｔｔｅｒｓ Ｂａｒ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）；（Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ Ａ Ｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７９，１１７−１２６（１９９５））の使用によってＧ−ＣＳＦの生物活性を測定した。 (Example 12)
Testing in vitro bioactivity of G-CSF Use of proliferation assay for cell line NFS-60 according to known methods (Hammerling U et al., J Pharm Biomed Anal 13, 9-20 (1995)) and international standard human population G-CSF organisms by use of modified G-CSF (88/502, yeast cell derived; NIBSC Potters Bar, Hertfordshire, UK); (Mire-Sluis A R et al., J Immunol Methods 179, 117-126 (1995)) Activity was measured.

図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色による、本発明に従った様々な条件に依存して得られた封入体内のタンパク質組成の分析を示す。FIG. 1 shows an analysis of protein composition in inclusion bodies obtained depending on various conditions according to the invention by SDS-PAGE and protein staining. 図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色によって分析したときの、本発明に従った培養温度（２５℃又は３７℃）に依存する封入体の可溶化の比較を示す。FIG. 2 shows a comparison of solubilization of inclusion bodies depending on the culture temperature (25 ° C. or 37 ° C.) according to the invention when analyzed by SDS-PAGE and protein staining. 図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色による、本発明に従った様々な条件に依存する封入体内のタンパク質組成の分析を示す。FIG. 3 shows analysis of protein composition in inclusion bodies depending on various conditions according to the present invention by SDS-PAGE and protein staining. 図４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色によって分析したときの、本発明に従った種々の溶液による洗浄／可溶化に依存する封入体の可溶化の比較を示す。FIG. 4 shows a comparison of inclusion body solubilization depending on washing / solubilization with various solutions according to the present invention as analyzed by SDS-PAGE and protein staining.

Claims (37)

異種タンパク質としてのタンパク質の発現を含み、発現後に前記異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体が封入体内に蓄積される、タンパク質の生産のための方法。   A method for the production of a protein comprising the expression of a protein as a heterologous protein, wherein a correctly folded precursor of said heterologous protein is accumulated in inclusion bodies after expression. 異種タンパク質としてのタンパク質の生合成を実施することを含み、
前記異種タンパク質の前駆体が微生物の封入体内で形成され、その前駆体が非変性条件下で生物活性異種タンパク質を形成できるように生合成を実施すること；
前記前駆体を非変性条件下で封入体から単離し、それによって生物活性異種タンパク質を形成すること、
の工程を含む、タンパク質の生産のための方法。 Performing biosynthesis of the protein as a heterologous protein,
Performing biosynthesis so that the precursor of the heterologous protein is formed in the inclusion body of the microorganism, and the precursor can form a bioactive heterologous protein under non-denaturing conditions;
Isolating said precursor from inclusion bodies under non-denaturing conditions, thereby forming a bioactive heterologous protein;
A method for the production of a protein comprising the steps of: 前記異種タンパク質が、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＨＳＡ、デオキシリボヌクレアーゼ、ＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターフェン及びインターロイキンを含む群から選択される、請求項１又は２に記載のタンパク質の生産のための方法。   The heterologous protein is selected from the group comprising G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EGF, HSA, deoxyribonuclease, FGF, TNF-α, TNF-β, interphene and interleukin. Or a method for the production of the protein according to 2. 前記選択された異種タンパク質がＧ−ＣＳＦである、請求項１又は２に記載のタンパク質の生産のための方法。   The method for the production of a protein according to claim 1 or 2, wherein the selected heterologous protein is G-CSF. 前記発現を細菌及び酵母から成る群より選択される生物において実施する、先行請求項のいずれかに記載のタンパク質の生産のための方法。   A method for the production of a protein according to any preceding claim, wherein the expression is carried out in an organism selected from the group consisting of bacteria and yeast. 前記発現を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において実施する、請求項５に記載のタンパク質の生産のための方法。   6. A method for the production of a protein according to claim 5, wherein the expression is carried out in E. coli. 前記異種タンパク質が、発現系において使用する宿主細胞の総タンパク質量に対して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、特に少なくとも約３０％の割合で封入体内に蓄積する、先行請求項のいずれかに記載のタンパク質の生産のための方法。   Any of the preceding claims, wherein said heterologous protein accumulates in inclusion bodies in a proportion of at least about 10%, preferably at least about 20%, in particular at least about 30%, relative to the total amount of host cells used in the expression system. A method for the production of a protein according to claim 1. 前記封入体が主として非変性条件下で溶解されうる、先行請求項のいずれかに記載のタンパク質の生産のための方法。   A method for the production of a protein according to any of the preceding claims, wherein the inclusion bodies can be dissolved primarily under non-denaturing conditions. 前記方法が、培養温度、培地の組成、誘導様式、発酵の実施原理、ストレスを生じさせることができる物質の添加、及び補助タンパク質の同時発現から成る群より選択される１以上のパラメータを調節することを含む生合成の実施方法を含む、先行請求項のいずれかに記載のタンパク質の生産のための方法。   The method regulates one or more parameters selected from the group consisting of culture temperature, medium composition, induction mode, fermentation principle, addition of substances capable of causing stress, and co-expression of auxiliary proteins. A method for the production of a protein according to any preceding claim, comprising a method of performing biosynthesis comprising: 前記培養温度が約２０℃〜３０℃である、請求項９に記載の方法。   The method according to claim 9, wherein the culture temperature is about 20 ° C. to 30 ° C. 前記培養温度が約２５℃である、請求項１０に記載の方法。   The method of claim 10, wherein the culture temperature is about 25 ° C. 前記誘導様式の調節が、ＩＰＴＧ、ラクトース及びＮａＣｌから成る群より誘導物質を選択することを含む、請求項９から１１のいずれかに記載の方法。   12. A method according to any of claims 9 to 11, wherein the modulation of the induction mode comprises selecting an inducer from the group consisting of IPTG, lactose and NaCl. 前記選択された誘導物質がＩＰＴＧである、請求項１２に記載の方法。   13. The method of claim 12, wherein the selected inducer is IPTG. ＩＰＴＧの濃度が０．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲内である、請求項１３に記載の方法。   14. The method of claim 13, wherein the concentration of IPTG is in the range of 0.1 mM to 1 mM. ＩＰＴＧの濃度が約０．４ｍＭである、請求項１４に記載の方法。   15. The method of claim 14, wherein the concentration of IPTG is about 0.4 mM. 前記誘導様式の調節が、発酵の開始時に誘導物質を添加することを含む、請求項９から１５のいずれかに記載の方法。   16. A method according to any of claims 9 to 15, wherein the modulation of the induction mode comprises adding an inducer at the start of fermentation. 前記生合成の実施原理が、バッチ方式での発酵の実施、フェドバッチ方式での発酵の実施及び振とうフラスコでの発酵を含む群から選択される、請求項９から１６のいずれかに記載の方法。   Method according to any of claims 9 to 16, wherein the biosynthetic implementation principle is selected from the group comprising performing fermentation in batch mode, performing fermentation in fed-batch mode and fermentation in shake flasks. . 前記選択された発酵実施原理がバッチ方式である、請求項１７に記載の方法。   18. The method of claim 17, wherein the selected fermentation performance principle is batch mode. 前記培地が、ＧＹＳＴ、ＧＹＳＰ、ＬＹＳＰ、ＬＹＳＴ、ＬＢＯＮ及びＧＹＳＰＯＮを含む群から選択される、請求項９から１８のいずれかに記載の方法。   The method according to any one of claims 9 to 18, wherein the medium is selected from the group comprising GYST, GYSP, LYSP, LYST, LBON and GYSPON. 前記選択された培地がＧＹＳＴ又はＧＹＳＰである、請求項１８に記載の方法。   The method according to claim 18, wherein the selected medium is GYST or GYSP. ストレスを生じさせることができる前記添加物が、エタノール及びプロパノールから成る群より選択される、請求項９から２０のいずれかに記載の方法。   21. A method according to any one of claims 9 to 20, wherein the additive capable of causing stress is selected from the group consisting of ethanol and propanol. 前記封入体の洗浄をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。   A method according to any preceding claim, further comprising cleaning the inclusion body. 前記洗浄を、トリス／ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液及び水から成る群より選択される溶液を用いて実施する、請求項２２に記載の方法。   23. The method of claim 22, wherein the washing is performed with a solution selected from the group consisting of Tris / HCl buffer, phosphate buffer, acetate buffer, citrate buffer, and water. 前記選択された緩衝液の濃度が約１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲内である、請求項２３に記載の方法。   24. The method of claim 23, wherein the concentration of the selected buffer is in the range of about 1 mM to 10 mM. 前記選択された溶液が水である、請求項２３に記載の方法。   24. The method of claim 23, wherein the selected solution is water. 前記封入体の可溶化をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載のタンパク質の生産のための方法。   A method for the production of a protein according to any preceding claim, further comprising solubilization of the inclusion bodies. 封入体を単離すること；
場合により前記封入体を洗浄すること；及び
前記封入体を非変性条件下で可溶化処理に供すること
の工程を含む、タンパク質が異種タンパク質として発現され、微生物の封入体内で形成される、微生物を使用したタンパク質の生産のための方法。 Isolating inclusion bodies;
Optionally washing the inclusion body; and subjecting the inclusion body to a solubilization treatment under non-denaturing conditions, wherein the protein is expressed as a heterologous protein and formed in the inclusion body of the microorganism. Method for the production of the protein used. 封入体における前記異種タンパク質の形成を請求項１から２５のいずれかに従って実施する、請求項２７に記載の方法。   28. The method of claim 27, wherein the formation of the heterologous protein in inclusion bodies is performed according to any of claims 1-25. 非変性濃度（１−２Ｍ）の尿素、非変性濃度（０．０５−０．２５％（ｍ／ｖ））のＮ−ラウロイルサルコシン、低い非変性濃度の両性界面活性剤、非界面活性スルホベタイン（ＮＤＳＢ）、ベタイン、サルコシン、カルバモイルサルコシン、タウリン、ＤＭＳＯから成る群より選択される可溶化剤、並びにＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ及びＭＥＳから成る群より選択される、高い可溶化濃度の緩衝液を用いて可溶化を実施する、請求項２６又は２７に記載の方法。   Non-denaturing concentration (1-2M) urea, non-denaturing concentration (0.05-0.25% (m / v)) N-lauroyl sarcosine, low non-denaturing concentration of amphoteric surfactant, non-surfacting sulfobetaine (NDSB), betaine, sarcosine, carbamoylsarcosine, taurine, DMSO, and a solubilizing buffer selected from the group consisting of HEPES, HEPPS, MES, ACES and MES The method according to claim 26 or 27, wherein solubilization is carried out using 選択された溶媒がＮ−ラウロイルサルコシンである、請求項２９に記載の方法。   30. The method of claim 29, wherein the selected solvent is N-lauroyl sarcosine. Ｎ−ラウロイルサルコシンの濃度が約０．１％〜０．２５％の範囲内である、請求項３０に記載の方法。   32. The method of claim 30, wherein the concentration of N-lauroyl sarcosine is in the range of about 0.1% to 0.25%. Ｎ−ラウロイルサルコシンの濃度が約０．２％である、請求項３０に記載の方法。   32. The method of claim 30, wherein the concentration of N-lauroyl sarcosine is about 0.2%. 生合成を実施する方法についてのパラメータが以下のように：
・培養温度：約２０−３０℃、好ましくは約２５℃
・培地の組成：ＧＹＳＴ、ＧＹＳＰ、ＬＹＳＰ、ＬＹＳＴ、ＬＢＯＮ及びＧＹＳＰＯＮ、好ましくはＧＹＳＴ及びＧＹＳＰから成る群から選択される
・発酵のタイプ：バッチ方式
・誘導様式：発酵の開始時に、任意に予備培養工程を実施する場合はその予備培養工程後に、ＩＰＴＧを添加して、最終ＩＰＴＧ濃度を約０．３〜０．６ｍＭ、好ましくは約０．４ｍＭに調整する
選択される、生合成による生物活性Ｇ−ＣＳＦの生産のための方法。 The parameters for how to perform biosynthesis are as follows:
Culture temperature: about 20-30 ° C, preferably about 25 ° C
-Medium composition: GYST, GYSP, LYSP, LYST, LBON and GYSPON, preferably selected from the group consisting of GYST and GYSP-Fermentation type: batch method-Induction mode: optional pre-culture step at the start of fermentation Is selected after the pre-culture step by adding IPTG to adjust the final IPTG concentration to about 0.3-0.6 mM, preferably about 0.4 mM. A method for the production of CSF. 前記方法が、封入体を単離すること及び単離した封入体を水で洗浄することをさらに含む、請求項３３に記載の生物活性Ｇ−ＣＳＦの生産のための方法。   34. The method for production of bioactive G-CSF according to claim 33, wherein the method further comprises isolating inclusion bodies and washing the isolated inclusion bodies with water. 前記方法が、約０．１〜０．２５％、好ましくは約０．２％の濃度のＮ−ラウロイルサルコシンによる封入体の可溶化をさらに含む、請求項３３又は３４に記載の生物活性Ｇ−ＣＳＦの生産のための方法。   35. The bioactive G- of claim 33 or 34, wherein the method further comprises solubilization of inclusion bodies with N-lauroyl sarcosine at a concentration of about 0.1-0.25%, preferably about 0.2%. A method for the production of CSF. 生産される生物活性異種タンパク質、例えばＧ−ＣＳＦを、非変性条件下で実施する精製工程によって最終的に精製する、先行請求項のいずれかに記載の方法。   The method according to any of the preceding claims, wherein the produced bioactive heterologous protein, eg G-CSF, is finally purified by a purification step carried out under non-denaturing conditions. 薬剤の製造のための、請求項１から３５のいずれかに従って生産され、好ましくは請求項３６に従って精製される、生物活性異種タンパク質、例えばＧ−ＣＳＦの使用。   Use of a bioactive heterologous protein, such as G-CSF, produced according to any of claims 1-35, preferably purified according to claim 36, for the manufacture of a medicament.

Images