JP2006500933A

JP2006500933A - Methods and compositions for modifying pre-mRNA splicing

Info

Publication number: JP2006500933A
Application number: JP2004539981A
Authority: JP
Inventors: コール，リシャルト
Original assignee: ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル
Priority date: 2002-09-27
Filing date: 2003-09-26
Publication date: 2006-01-12
Also published as: WO2004028464A3; CA2499880A1; WO2004028464A2; EP1546733A2; AU2003278980A1; US20040137472A1

Abstract

本発明は、プレｍＲＮＡ分子のスプライシング事象を抑制するためにプレｍＲＮＡおよび／またはスプライシング機構のエレメントを本明細書中に記載の方法によって同定した小分子化合物と接触させるステップを含む、プレｍＲＮＡ分子中のスプライシング事象を抑制する方法を提供する。さらに、プレｍＲＮＡ分子のスプライシング事象を誘導するためにプレｍＲＮＡおよび／またはスプライシング機構のエレメントを本明細書中に記載の方法によって同定した小分子化合物と接触させるステップを含む、プレｍＲＮＡ分子中のスプライシング事象を誘導する方法を提供する。さらに、プレｍＲＮＡ分子中の選択的スプライシングまたは異常なスプライシング事象を抑制するために治療有効量の本明細書中に記載の方法によって同定された化合物を患者に投与し、それにより患者を治療するステップを含む、プレｍＲＮＡ分子の選択的または異常なスプライシング事象に関連する障害を有する患者の治療方法を本明細書中に提供する。The present invention includes a step of contacting a pre-mRNA and / or an element of a splicing mechanism with a small molecule compound identified by the methods described herein to suppress a splicing event of the pre-mRNA molecule. A method for suppressing splicing events is provided. Splicing in the pre-mRNA molecule further comprising contacting the pre-mRNA and / or elements of the splicing machinery with a small molecule compound identified by the methods described herein to induce a pre-mRNA molecule splicing event. A method for inducing an event is provided. In addition, administering to the patient a therapeutically effective amount of a compound identified by the methods described herein to inhibit alternative splicing or abnormal splicing events in the pre-mRNA molecule, thereby treating the patient Provided herein is a method of treating a patient having a disorder associated with an alternative or abnormal splicing event of a pre-mRNA molecule.

Description

［関連出願］
本願は、米国特許法１１９条（ｅ）項の下、２００２年９月２７日提出の米国特許仮出願番号６０／４１４，１４１号（参照することによりその内容全体が本明細書中に組み込まれる）の優先権を主張する。 [Related applications]
No. 60 / 414,141 filed Sep. 27, 2002 under the provisions of Section 119 (e) of the U.S. Patent Law, the entire contents of which are hereby incorporated by reference. ) Claim priority.

［発明の分野］
本発明は、プレｍＲＮＡ分子のスプライシング事象の修飾方法および選択的スプライシング事象または異常なスプライシング事象に関連する障害の治療方法、ならびに本発明の方法の実施に有用な化合物および組成物に関する。 [Field of the Invention]
The present invention relates to methods for modifying splicing events of pre-mRNA molecules and methods for treating disorders associated with alternative or abnormal splicing events, as well as compounds and compositions useful in the practice of the methods of the invention.

Ｋｏｌｅｅｔａｌ．に付与された米国特許第５，９７６，８７９号は、異常なスプライシングを阻害して正確なスプライシングに修復するか選択的スプライシングを改変するアンチセンスオリゴヌクレオチドを記載する。 Kole et al. U.S. Pat. No. 5,976,879, issued to, describes antisense oligonucleotides that inhibit aberrant splicing and repair to precise splicing or alter alternative splicing.

本発明は、ａ）化合物を、ｉ）スプライシング事象の非調整下で遺伝子産物を作製するためにｃＤＮＡを発現できないようにするイントロンによって破壊されたｃＤＮＡ、およびｉｉ）スプライシング機構のエレメントと接触させるステップと、ｂ）遺伝子産物を産生するためにｃＤＮＡの発現を検出し、それによりプレｍＲＮＡ分子におけるスプライシング事象を調整することができる化合物を同定するステップとを含む、プレｍＲＮＡ分子のスプライシング事象を調整する（例えば、抑制するか誘導する）ことができる化合物の同定方法を提供する。 The present invention includes a) contacting a compound with i) a cDNA disrupted by an intron that renders the cDNA incapable of expression to produce a gene product under non-regulation of a splicing event, and ii) an element of the splicing machinery. Adjusting the pre-mRNA molecule splicing event comprising: b) detecting the expression of the cDNA to produce the gene product, thereby identifying a compound capable of modulating the splicing event in the pre-mRNA molecule. Methods of identifying compounds that can be (eg, suppressed or induced) are provided.

治療有効量の本明細書中の方法によって同定された化合物を被験体に投与するステップを含む、プレｍＲＮＡ分子の選択的スプライシング事象または異常なスプライシング事象に関連する障害を有する被験体の治療方法をさらに提供する。 A method of treating a subject having a disorder associated with an alternative or abnormal splicing event of a pre-mRNA molecule comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a compound identified by the methods herein. Provide further.

天然タンパク質をコードするＤＮＡを含む細胞中において天然タンパク質の発現をアップレギュレートする方法であって、前記ＤＮＡはその異常なスプライシングにより天然タンパク質をダウンレギュレートさせる変異を含み、前記細胞に本明細書中の方法によって同定された化合物を導入し、それにより前記異常なスプライシングが阻害され、それにより前記天然タンパク質がアップレギュレートされるステップを含む方法をさらに提供する。 A method for up-regulating expression of a natural protein in a cell containing DNA encoding the natural protein, wherein the DNA contains a mutation that down-regulates the natural protein due to its abnormal splicing, wherein Further provided is a method comprising the step of introducing a compound identified by the method therein, thereby inhibiting said abnormal splicing and thereby upregulating said native protein.

さらに、本発明は、選択的スプライシングにより生じるタンパク質をコードするＤＮＡを含む細胞中において選択的スプライシングにより生じる前記タンパク質の発現をアップレギュレートする方法であって、ＤＮＡが選択的スプライシングにより生じるタンパク質をダウンレギュレートさせる第１のスプライシング事象によって調節され、スプライシングを調整するために前記細胞に請求項１の方法によって同定された化合物を導入し、それにより前記第１のスプライシング事象が阻害され、第２のスプライシング事象が起こり、それにより前記別のタンパク質の発現がアップレギュレートされるステップを含む方法を提供する。 Furthermore, the present invention provides a method for up-regulating the expression of the protein produced by alternative splicing in a cell containing DNA encoding the protein produced by alternative splicing, wherein the DNA reduces the protein produced by alternative splicing. A compound identified by the method of claim 1 is introduced into the cell to regulate splicing, wherein the first splicing event is inhibited, wherein the first splicing event is inhibited, There is provided a method comprising the step of causing a splicing event, whereby the expression of said another protein is upregulated.

さらなる実施形態では、本発明は、本発明の方法によって同定された化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を提供する。 In a further embodiment, the present invention provides a composition comprising a compound identified by the method of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

本発明はまた、１つの態様では、プレｍＲＮＡ分子中のスプライシング事象を抑制または誘導するためにプレｍＲＮＡまたはスプライシング機構の他のエレメントを本明細書中に記載の方法によって同定された化合物と接触させるステップを含む、プレｍＲＮＡ分子のスプライシング事象を抑制または誘導する方法を提供する。本発明は、正の（スプライシングの抑制または誘導）効果または負の（スプライシングを抑制も誘導もしない）効果が得られて検出される条件下で、化合物を本明細書中の実施例に記載の細胞および／または本明細書中に記載のスプライシング機構のエレメントと接触させるステップと、スプライシング事象を抑制または誘導することができる化合物として正の効果が得られる化合物を同定するステップと含む、プレｍＲＮＡ分子のスプライシング事象を調整（すなわち、抑制または誘導）することができる化合物の同定方法も提供する。 The invention also, in one aspect, contacts a pre-mRNA or other element of the splicing machinery with a compound identified by the methods described herein to suppress or induce a splicing event in the pre-mRNA molecule. A method of suppressing or inducing a splicing event of a pre-mRNA molecule comprising a step is provided. The invention describes compounds as described in the Examples herein under conditions where a positive (suppression or induction of splicing) effect or a negative (suppression or non-induction of splicing) effect is obtained. Contacting a cell and / or an element of a splicing mechanism described herein and identifying a compound that has a positive effect as a compound capable of suppressing or inducing a splicing event. Also provided are methods of identifying compounds that can modulate (ie, suppress or induce) splicing events.

別の態様では、本発明は、プレｍＲＮＡ分子の選択的または異常なスプライシング事象に関連する障害を有する患者を治療する方法であって、前記プレｍＲＮＡ分子の選択的スプライシング事象または異常なスプライシング事象を抑制または誘導するために、薬学的に許容可能なキャリアおよび本明細書に記載の方法によって同定された治療有効量の化合物を患者に投与し、それにより前記患者を治療するステップを含む方法を提供する。 In another aspect, the invention provides a method of treating a patient having a disorder associated with a pre-mRNA molecule alternative or abnormal splicing event, wherein the pre-mRNA molecule alternative splicing event or aberrant splicing event is performed. Providing a method with a pharmaceutically acceptable carrier and a therapeutically effective amount of a compound identified by the methods described herein for inhibiting or inducing, thereby treating said patient To do.

本発明の上記ならびに他の目的および態様を、本明細書中で下記により詳細に説明する。 These and other objects and aspects of the invention are described in more detail herein below.

イントロンは、ＤＮＡのコード部分（すなわち、「エクソン」）の間に介在する真核生物ＤＮＡの一部である。イントロンおよびエクソンは、ｍＲＮＡの前駆体（すなわち、「プレｍＲＮＡ」）である「一次転写物」と呼ばれるＲＮＡに転写される。エクソンによってコードされる天然タンパク質を産生することができるように、イントロンはプレｍＲＮＡから除去されなければならない（本明細書中で使用される、用語「天然タンパク質」は、天然に存在する野生型または機能的タンパク質をいう）。スプライシングプロセスにおいてプレｍＲＮＡからのイントロンの除去およびその後のエクソンの連結が行われる。 Introns are the parts of eukaryotic DNA that intervene between the coding portions of DNA (ie, “exons”). Introns and exons are transcribed into RNA called the “primary transcript” that is the precursor of mRNA (ie, “pre-mRNA”). Introns must be removed from the pre-mRNA so that the exon-encoded native protein can be produced (as used herein, the term “native protein” refers to the naturally occurring wild type or Functional protein). In the splicing process, intron removal from the pre-mRNA and subsequent exon ligation are performed.

スプライシングプロセスは、転写後且つ翻訳前にＲＮＡで行われ、スプライシング因子によって媒介される一連の反応である。したがって、「プレｍＲＮＡ」は、エクソンおよびイントロンの両方を含むＲＮＡであり、「ｍＲＮＡ」はイントロンが除去されてエクソンが連続的に連結され、その結果リボゾームによってこれらからタンパク質が翻訳され得るＲＮＡである。 The splicing process is a series of reactions performed on RNA after transcription and before translation and mediated by splicing factors. Thus, a “pre-mRNA” is an RNA that contains both exons and introns, and an “mRNA” is an RNA from which introns are removed and exons are ligated together, so that proteins can be translated from them by ribosomes. .

イントロンは、スプライシング機構の一部であり、且つスプライシングに必要である「スプライスエレメント」組によって定義され、スプライシング反応を行う種々のスプライシング因子に結合する比較的短い保存ＲＮＡセグメントである。したがって、各イントロンは、５’スプライス部位、３’スプライス部位、およびこれらの間に存在する分岐点によって定義される。スプライスエレメントはまた、スプライス部位および分岐点からある距離をおいてエクソン中に存在するエクソンスプライシングエンハンサーおよびサイレンサーならびにイントロン中に存在するイントロンスプライシングエンハンサーおよびサイレンサーを含む。スプライス部位および分岐点に加えて、これらのエレメントは、選択的な異常スプライシングおよび構成性スプライシングを調節する。 Introns are relatively short conserved RNA segments that bind to various splicing factors that are part of the splicing mechanism and are defined by a set of “splice elements” that are required for splicing. Thus, each intron is defined by a 5 'splice site, a 3' splice site, and a branch point that exists between them. Splice elements also include exon splicing enhancers and silencers present in exons at a distance from the splice site and branch point and intron splicing enhancers and silencers present in introns. In addition to splice sites and branch points, these elements regulate alternative aberrant and constitutive splicing.

本発明は、一定の小化学分子が特定のプレｍＲＮＡ分子の特定のスプライシング事象を改変することができるという予想外の発見を提供する。これらの小分子は、スプライシング事象を改変する種々の機構によって操作することができる。例えば、本発明の小分子は、１）スプライシング複合体（スプライセオソーム）およびその成分（ｈｎＲＮＰ、ｓｎＲＮＰ、ＳＲ−タンパク質、および他のスプライシング因子またはエレメントなど）の形成および／または機能および／または他の性質を妨害し、それによりプレｍＲＮＡ分子のスプライシング事象を抑制または誘導することができる。別の例として、２）本発明の小分子は、その後特定のスプライセオソームの形成および／または機能に関与する遺伝子産物（例えば、ｈｎＲＮＰ、ｓｎＲＮＰ、ＳＲ−タンパク質、および他のスプライシング因子が含まれ得るが、これらに限定されない）の転写を抑制および／または改変することができる。３）本発明の小分子はまた、その後特定のスプライセオソームの形成および／または機能に関与する遺伝子産物（例えば、ｈｎＲＮＰ、ｓｎＲＮＰ、ＳＲ−タンパク質、および他のスプライシング因子が含まれるが、これらに限定されない）のリン酸化、グリコシル化、および／または他の変異を抑制および／または改変することができる。４）さらに、本発明の小分子は、特定のスプライシング事象が配列特異的様式でのＲＮＡとの塩基対合に関与しない機構を介して抑制または誘導されるように特定のプレｍＲＮＡに結合し、そして／または影響を与えることができる。したがって、本発明の小分子は、アンチセンスまたはアンチジーンオリゴヌクレオチドと異なり、且つ関連しない。 The present invention provides the unexpected discovery that certain small chemical molecules can modify specific splicing events of specific pre-mRNA molecules. These small molecules can be manipulated by various mechanisms that modify the splicing event. For example, the small molecules of the present invention are: 1) formation and / or function and / or others of the splicing complex (spliceosome) and its components (such as hnRNP, snRNP, SR-protein, and other splicing factors or elements) Can prevent or induce pre-mRNA molecule splicing events. As another example, 2) small molecules of the present invention include gene products (eg, hnRNP, snRNP, SR-protein, and other splicing factors that are subsequently involved in the formation and / or function of a particular spliceosome. (But not limited to) transcription can be suppressed and / or modified. 3) Small molecules of the present invention also include gene products (eg, hnRNP, snRNP, SR-protein, and other splicing factors that are subsequently involved in the formation and / or function of specific spliceosomes, including Non-limiting) phosphorylation, glycosylation, and / or other mutations can be suppressed and / or modified. 4) Furthermore, the small molecules of the present invention bind to specific pre-mRNAs such that specific splicing events are suppressed or induced through a mechanism that does not involve base pairing with RNA in a sequence specific manner, And / or can be influenced. Thus, the small molecules of the present invention are different and unrelated to antisense or antigene oligonucleotides.

本発明の化合物によるスプライシング事象の改変には、天然に存在する選択的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅまたはａｌｔｅｒｎａｔｅ）スプライシングの調整が含まれ、正確または所望のスプライシング事象への修復が含まれ、遺伝病を発症し得るかこれに関連する変異によって引き起こされる異常なスプライシング事象の抑制も含まれ得る。 Is alteration of a splicing event with a compound of the invention included adjustment of naturally occurring alternative (alternate or alternate) splicing, repair to an exact or desired splicing event, and can develop a genetic disease? Suppression of abnormal splicing events caused by associated mutations can also be included.

異常なスプライシングの抑制が望ましい実施形態では、天然のＤＮＡおよびプレｍＲＮＡの変異は、新規の異常なスプライスエレメントを作製する置換変異または欠失変異のいずれかであり得る。したがって、異常なスプライスエレメントは、異常なイントロンを定義する異常なスプライスエレメント組の１つのメンバーである。異常なスライスエレメント組の残りのメンバーもまた天然のイントロンを定義するスプライスエレメント組のメンバーであり得る。例えば、変異によって天然の３’スプライス部位の上流（すなわち、５’）および天然の分岐点の下流（すなわち、３’）の両方に新規の異常な３’スプライス部位が作製される場合、天然の５’スプライス部位および天然の分岐点は天然のスプライスエレメント組および異常なスプライスエレメント組の両方のメンバーとして作用し得る。他の状況では、変異により通常優性であるかスプライシングエレメントとして役割を果たさない天然のＲＮＡ領域が活性化されてスプライシングエレメントとして作用し得る。このようなエレメントを、「潜在性」エレメントという。 In embodiments where aberrant splicing suppression is desired, native DNA and pre-mRNA mutations can be either substitutional or deletional mutations that create new aberrant splice elements. Thus, an abnormal splice element is one member of an abnormal splice element set that defines an abnormal intron. The remaining members of the abnormal slice element set may also be members of the splice element set that defines a natural intron. For example, if the mutation creates a new abnormal 3 ′ splice site both upstream of the natural 3 ′ splice site (ie, 5 ′) and downstream of the natural branch point (ie, 3 ′), The 5 'splice site and natural branch point can act as members of both the natural and unusual splice element sets. In other situations, natural RNA regions that are usually dominant due to mutation or do not serve as splicing elements can be activated to act as splicing elements. Such an element is called a “latency” element.

例えば、変異により天然の３’スプライス部位と天然の分岐点との間に存在する新規の異常な変異３’スプライス部位が作製される場合、変異は、異常な変異３’スプライス部位と天然の分岐点との間の潜在性分岐点を活性化することができる。他の状況では、変異により、天然の分岐点と天然の５’スプライス部位との間にさらなる異常な５’スプライス部位が作製され、潜在性３’スプライス部位および異常な変異５’スプライス部位の連続した上流の潜在性分岐点をさらに活性化し得る。この状況では、天然のイントロンが２つの異常なイントロンで分割されるようになり、その間に新規のエクソンが位置付けられる。 For example, if the mutation creates a new abnormal mutant 3 'splice site that exists between the natural 3' splice site and the natural branch point, the mutation may be the abnormal mutant 3 'splice site and the natural branch. A potential branch point between points can be activated. In other situations, the mutation creates an additional abnormal 5 'splice site between the natural branch point and the natural 5' splice site, and the continuation of the latent 3 'splice site and the abnormal mutant 5' splice site. The upstream potential branch point can be further activated. In this situation, the natural intron becomes split by two unusual introns, between which a new exon is located.

さらに、天然のスプライスエレメント（特に、分岐点）もまた異常なスプライスエレメント組のメンバーであるいくつかの状況では、天然のエレメントを遮断して潜在性エレメント（すなわち、潜在性分岐点）を活性化し、天然のスプライスエレメント組の残りのメンバーを集めて正確なスプライシングに不正確なスプライシングを強制することが可能である。潜在性スプライスエレメントが活性化される場合、これはイントロン中または隣接エクソン中の１つのいずれかに存在し得ることもさらに留意のこと。したがって、特定の変異によって作製された異常なスプライスエレメント組に依存して、本発明の化合物は、本発明を実施するために種々の異なるスプライスエレメントを遮断することができる。本発明の化合物は、変異エレメント、潜在性エレメント、または天然のエレメントを遮断することができ、５’スプライス部位、３’スプライス部位、または分岐点を遮断することができる。勿論、上記で考察するように、天然のスプライスエレメントの遮断により潜在性エレメントが活性化され、その後天然のスプライスエレメント組の代理メンバーとして作用し、正確なスプライシングに関与する状況を考慮すると、一般に、天然のイントロンも定義するスプライスエレメントは遮断しない。 In addition, in some situations where natural splice elements (particularly branch points) are also members of an unusual set of splice elements, they block natural elements and activate latent elements (ie, potential branch points). It is possible to collect the remaining members of the natural splice element set to force inaccurate splicing for accurate splicing. Note further that if the cryptic splice element is activated, it may be present either in the intron or in one of the adjacent exons. Thus, depending on the aberrant set of splice elements produced by a particular mutation, the compounds of the invention can block a variety of different splice elements to practice the invention. The compounds of the invention can block mutated, latent or natural elements and can block 5 'splice sites, 3' splice sites or branch points. Of course, as discussed above, considering the situation involved in precise splicing, in general, the latent element is activated by blockade of the natural splice element and then acts as a surrogate member of the natural splice element set. It does not block splice elements that also define natural introns.

他の実施形態では、本発明の化合物の使用によって選択的スプライシング事象を調整することができる。例えば、本発明の化合物を、選択的スプライス部位を含む遺伝子が存在する細胞に移入することができる。化合物の非存在下では、特定の機能を有する遺伝子産物を産生するために第１のスプライシング事象が起こる。本発明の化合物の存在下では、第１のスプライシング事象は阻害され、第２または選択的スプライシング事象が起こり、結果として同一の遺伝子が発現して異なる機能を有する遺伝子産物が産生される。本発明の方法によって選択的スプライシング事象を調整する能力を有する化合物が同定される。 In other embodiments, alternative splicing events can be modulated by the use of compounds of the invention. For example, a compound of the invention can be transferred to a cell in which a gene containing an alternative splice site is present. In the absence of a compound, a first splicing event occurs to produce a gene product with a specific function. In the presence of the compounds of the invention, the first splicing event is inhibited and a second or alternative splicing event occurs, resulting in the production of a gene product with the same gene expressed and different functions. Compounds having the ability to modulate alternative splicing events are identified by the methods of the invention.

したがって、特定の実施形態では、本発明は、プレｍＲＮＡ分子のスプライシング事象を抑制または誘導するためにプレｍＲＮＡ分子および／または他のスプライシング機構の他のエレメント（例えば、細胞内）を本明細書中に記載の方法によって同定された化合物と接触させるステップを含む、プレｍＲＮＡ分子のスプライシング事象を抑制または誘導する方法を提供する。抑制または誘導されるスプライシング事象は、異常なスプライシング事象または選択的スプライシング事象のいずれかであり得る。 Thus, in certain embodiments, the present invention provides for the pre-mRNA molecule and / or other elements (eg, intracellular) of the pre-mRNA molecule and / or other splicing mechanisms to suppress or induce the splicing event of the pre-mRNA molecule. A method of inhibiting or inducing a splicing event of a pre-mRNA molecule comprising the step of contacting with a compound identified by the method described in 1. Suppressed or induced splicing events can be either abnormal splicing events or alternative splicing events.

さらに、正の（スプライシングの抑制または誘導）効果または負の（スプライシングを抑制も誘導もしない）効果が得られて検出される条件下で、化合物を本明細書中の実施例１に記載の選択的な異常および／または構成性スプライシングに関与するスプライシングエレメントおよび／または因子と接触させるステップ（例えば、細胞内で）と、スプライシング事象を抑制または誘導することができる化合物として正の効果が得られる化合物を同定するステップと含む、プレｍＲＮＡ分子のスプライシング事象を抑制または誘導することができる化合物の同定方法を本明細書中に提供する。 In addition, the compound may be selected as described in Example 1 herein under conditions where a positive (suppression or induction of splicing) effect or a negative (inhibition or induction of splicing) effect is obtained. In contact with splicing elements and / or factors involved in general abnormalities and / or constitutive splicing (eg, intracellularly) and compounds that have a positive effect as a compound capable of suppressing or inducing splicing events A method for identifying a compound capable of suppressing or inducing a splicing event of a pre-mRNA molecule is provided herein.

さらなる実施形態では、本発明は、薬学的に許容可能なキャリア中にプレｍＲＮＡ分子の選択的スプライシングまたは異常なスプライシングを抑制または誘導するための本明細書中に記載の方法によって同定された化合物を含む組成物を提供する。上記のように、本発明の化合物は、アンチセンスやアンチジーンオリゴヌクレオチドではない。表５は、本発明の化合物の例として本発明のいくつかの化合物の化学構造を示すが、全てを含むことは意図しない。さらなる化合物は、本明細書中に記載のプロトコールによって本明細書中に記載の特徴を有することが同定されているか同定することができる本発明の一部であることが意図される。 In further embodiments, the present invention provides compounds identified by the methods described herein for inhibiting or inducing alternative splicing or aberrant splicing of pre-mRNA molecules in a pharmaceutically acceptable carrier. A composition comprising is provided. As mentioned above, the compounds of the present invention are not antisense or antigene oligonucleotides. Table 5 shows the chemical structures of some compounds of the present invention as examples of compounds of the present invention, but is not intended to include all. Additional compounds are intended to be part of the invention that have been identified or can be identified as having the characteristics described herein by the protocols described herein.

別の実施形態では、本発明は、その異常なおよび／または選択的スプライシングによって天然タンパク質がダウンレギュレートされる変異を有する、天然タンパク質をコードするＤＮＡを含む細胞中の天然タンパク質の発現をアップレギュレートする方法を提供する。より詳細には、ＤＮＡは、本明細書中に記載の特徴を有するプレｍＲＮＡをコードする。本方法は、異常なスプライシング事象を抑制する化合物として本明細書中に記載のように同定された本発明の小分子を細胞に導入するステップと、それにより正確なスプライシングによって天然のイントロンが除去され、細胞によって天然タンパク質が産生されることとを含む。さらなる実施形態では、本発明は、選択的スプライシング事象を調整することが同定されている本発明の小分子を細胞に導入して選択的スプライシングを調整せずに産生されるタンパク質と異なる機能を有するタンパク質が産生されるステップを含む方法を提供する。 In another embodiment, the present invention upregulates the expression of a native protein in a cell comprising DNA encoding the native protein having a mutation that causes the aberrant and / or alternative splicing to down regulate the native protein. Provide a way to rate. More particularly, the DNA encodes a pre-mRNA having the characteristics described herein. The method involves introducing into a cell a small molecule of the invention identified as described herein as a compound that inhibits an abnormal splicing event, thereby removing the natural intron by precise splicing. Natural protein production by the cell. In a further embodiment, the invention has a different function than a protein produced without introducing alternative small molecules of the invention that have been identified to modulate alternative splicing events into the cell and adjusting alternative splicing. A method is provided comprising the step of producing a protein.

本発明はまた、コードされるプレｍＲＮＡの異常なスプライシングによって変異を含むＤＮＡの発現をアップレギュレートするか遺伝子をダウンレギュレートするための本発明の化合物の使用手段を提供する。したがって、１つの実施形態では、本発明は、変異を含むプレｍＲＮＡ分子の異常なスプライシングの抑制方法および／または選択的スプライシング事象の抑制方法を提供する。プレｍＲＮＡ中に存在する場合、変異によりプレｍＲＮＡが不正確にスプライシングされて通常プレｍＲＮＡに起因するｍＲＮＡと異なる異常なｍＲＮＡまたはｍＲＮＡフラグメントが産生される。より詳細には、プレｍＲＮＡ分子は、（ｉ）変異が存在しない場合にスプライシングによって除去されて天然のタンパク質をコードする第１のｍＲＮＡ分子が産生される天然のイントロンを定義する第１のスプライスエレメント組、および（ｉｉ）変異が存在する場合にスプライシングによって除去されて第１のｍＲＮＡ分子と異なる異常な第２のｍＲＮＡ分子が産生される、天然のイントロンと異なる異常なイントロンを定義する変異によって誘導された第２のスプライスエレメント組を含む。本方法は、本明細書中に記載のプレｍＲＮＡ分子および／またはスプライシング機構の他の因子および／またはエレメントを（例えば、細胞内）、プレｍＲＮＡ分子の異常なスプライシング事象を抑制するための本明細書中に記載の方法によって同定された化合物に接触させ、それにより天然のイントロンが正確なスプライシングによって除去されて、細胞によって天然タンパク質が産生されるステップを含む。 The present invention also provides means for using the compounds of the present invention to upregulate the expression of DNA containing mutations or downregulate genes by aberrant splicing of the encoded pre-mRNA. Accordingly, in one embodiment, the present invention provides a method for suppressing aberrant splicing of a pre-mRNA molecule comprising a mutation and / or a method for suppressing an alternative splicing event. If present in the pre-mRNA, the mutation results in incorrect splicing of the pre-mRNA, producing an abnormal mRNA or mRNA fragment that is different from the mRNA that normally results from the pre-mRNA. More particularly, the pre-mRNA molecule is (i) a first splice element that defines a natural intron that is removed by splicing to produce a first mRNA molecule that encodes a natural protein in the absence of a mutation. And (ii) induced by a mutation that defines an abnormal intron that is different from the natural intron, wherein, if present, the mutation removes by splicing to produce an abnormal second mRNA molecule that differs from the first mRNA molecule. Second splice element set. The present methods may include other factors and / or elements of the pre-mRNA molecules and / or splicing mechanisms described herein (eg, intracellularly) to suppress abnormal splicing events of the pre-mRNA molecules. Contacting the compound identified by the method described herein, whereby the natural intron is removed by precise splicing to produce the native protein by the cell.

ＤＮＡの選択的スプライシング事象の調整によってＤＮＡ発現をアップレギュレートするかダウンレギュレートする方法をさらに提供する。本方法は、本明細書中に記載のプレｍＲＮＡ分子ならびに／またはスプライシング機構の他のエレメントおよび／もしくは因子を（例えば、細胞内）選択的スプライシング事象を調整することが同定された本発明の化合物と接触させるステップと、それにより通常のスプライシング事象が阻害されて、通常のスプライシング事象の調節下でＤＮＡ発現をアップレギュレートさせるかダウンレギュレートさせる選択的スプライシング事象が生じることを含む。 Further provided are methods for up-regulating or down-regulating DNA expression by modulating alternative splicing events of DNA. The methods of the invention have been identified as modulating pre-mRNA molecules and / or other elements and / or factors of the splicing machinery described herein to modulate alternative splicing events (eg, intracellular). Contacting with, thereby inhibiting a normal splicing event, resulting in an alternative splicing event that up-regulates or down-regulates DNA expression under the control of the normal splicing event.

本発明の方法、化合物、および組成物は、種々の用途を有する。例えば、これらは、一定期間まで発現される遺伝子発現をダウンレギュレートし、その後遺伝子発現をアップレギュレートすることが望ましい手段を有することが望ましい任意のプロセス（例えば、発酵の増殖期にダウンレギュレートし、且つ発酵の産生期にアップレギュレートする）で有用である。このような用途のために、発現すべき遺伝子は、遺伝子が天然のイントロンを含む限り、産生されるべきタンパク質をコードする任意の遺伝子であり得る。次いで、遺伝子を、その後遺伝子発現をダウンレギュレートする異常なイントロンを定義する異常な第２のスプライスエレメント組を意図的に作製するための部位特異変異誘発（Ｔ．Ｋｕｎｋｅｌに付与された米国特許第４，８７３，１９２号を参照のこと）などの任意の適切な手段によって変異することができる。次いで、標準的な組換え技術によって、遺伝子を適切な発現ベクターに挿入し、発現ベクターを宿主細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞（例えば、ヒト、ラット）などの真核細胞）に挿入することができる。次いで、標準的な技術によって、宿主細胞を培地中で成長させる。変異遺伝子発現のアップレギュレートが望ましい場合、遺伝子発現がアップレギュレートされるように適切な処方物中の本発明の適切な化合物を培養培地に添加することができる。 The methods, compounds, and compositions of the present invention have a variety of uses. For example, they can be any process where it is desirable to down-regulate gene expression expressed for a period of time and then to up-regulate gene expression (eg down-regulate during the growth phase of fermentation). And is up-regulated during the production phase of fermentation. For such applications, the gene to be expressed can be any gene that encodes the protein to be produced as long as the gene contains a natural intron. The gene is then subjected to site-directed mutagenesis (US Patent No. granted to T. Kunkel) to intentionally create an aberrant second splice element set that defines an aberrant intron that subsequently downregulates gene expression. Can be mutated by any suitable means, such as 4,873,192). The gene is then inserted into an appropriate expression vector by standard recombinant techniques, and the expression vector is inserted into a host cell (eg, a eukaryotic cell such as a yeast, insect, or mammalian cell (eg, human, rat)). Can be inserted. The host cells are then grown in medium by standard techniques. If up-regulation of mutant gene expression is desired, the appropriate compound of the invention in an appropriate formulation can be added to the culture medium so that gene expression is up-regulated.

本発明の方法、化合物、および処方物はまた、ヒトまたは動物の遺伝子および／または発展的には調整された組織のスプライシング事象（例えば、選択的スプライシング事象）の試験および調整のためのインビトロまたはインビボツールとして有用である。下記の手順または当業者に自明のその修正形態によってこのような実験を行うことができる。 The methods, compounds, and formulations of the present invention may also be used in vitro or in vivo for testing and modulating human or animal genes and / or developmentally regulated tissue splicing events (eg, alternative splicing events). Useful as a tool. Such experiments can be performed by the following procedures or modifications thereof that will be apparent to those skilled in the art.

本発明の化合物および処方物はまた、プレｍＲＮＡの異常なスプライシングを誘導する変異が同定された異常および／または選択的スプライシングに関与する疾患（β−サラセミア（オリゴヌクレオチドがβ−グロビン（特に、ヒト）プレｍＲＮＡに結合する）、αサラセミア（オリゴヌクレオチドがα−グロビンのプレｍＲＮＡに結合する）、テイ・サックス症候群（オリゴヌクレオチドがβ−ヘキソースアミニダーゼαサブユニットのプレｍＲＮＡに結合する）、フェニルケトン尿症（オリゴヌクレオチドがフェニルアラニンヒドロキシラーゼのプレｍＲＮＡに結合する）、および一定の嚢胞性線維症形態（オリゴヌクレオチドが嚢胞性線維症遺伝子のプレｍＲＮＡに結合する）など）の治療における治療薬として有用である（例えば、Ｓ．Ａｋｌｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，７３２４（１９９０）；Ｂ．Ｄｗｏｒｎｉｃｚａｋｅｔａｌ．，Ｇｅｎｏｎｎｉｃｓ１１，２４２（１９９１）；Ｌ−Ｃ．Ｔｓｕｉ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅｎｅｔ．８，３９２（１９９２）を参照のこと）。 The compounds and formulations of the present invention may also be associated with diseases in which mutations that induce abnormal splicing of pre-mRNA have been identified and / or diseases involving alternative splicing (β-thalassemia (oligonucleotides are β-globin (especially humans)). ) Binds to pre-mRNA), α thalassemia (oligonucleotide binds to α-globin pre-mRNA), Tay-Sachs syndrome (oligonucleotide binds to pre-mRNA of β-hexose aminidase α subunit), phenyl As a therapeutic agent in the treatment of ketonuria (oligonucleotide binds to pre-mRNA of phenylalanine hydroxylase), and certain cystic fibrosis forms (such as oligonucleotide binds to pre-mRNA of the cystic fibrosis gene) Useful (e.g. Kli et al., J. Biol. Chem. 265, 7324 (1990); B. Dwornzak et al., Genonics 11, 242 (1991); L-C. Tsui, Trends in Genet. 8, 392 (1992). See

本発明によって治療することができるβ−サラセミアの例には、β¹¹⁰、ＩＶＳ１⁵、ＩＶＳ１⁶、ＩＶＳ２⁶⁵⁴、ＩＶＳ２⁷⁰⁵、およびＩＶＳ２⁷⁴⁵変異クラスのもの（すなわち、β−グロビンプレｍＲＮＡが上記変異を保有する）が含まれるが、これらに限定されない。 Examples of β-thalassemia that can be treated according to the present invention include those of the β ¹¹⁰ , IVS1 ⁵ , IVS1 ⁶ , IVS2 ⁶⁵⁴ , IVS2 ⁷⁰⁵ , and IVS2 ⁷⁴⁵ mutation classes (ie, β-globin pre-mRNA carries the mutations described above). Is included), but is not limited thereto.

本発明の方法によって治療することができるプレｍＲＮＡ分子の選択的または異常なスプライシング事象に関連する他の障害には、ウイルスおよびレトロウイルス感染、がん、心血管疾患、代謝疾患（糖尿病が含まれるが、これに限定されない）、炎症性疾患（関節炎が含まれるが、これに限定されない）、肥満症が含まれるが、これらに限定されない。 Other disorders associated with alternative or abnormal splicing events of pre-mRNA molecules that can be treated by the methods of the present invention include viral and retroviral infections, cancer, cardiovascular diseases, metabolic diseases (diabetes mellitus). Including, but not limited to), inflammatory diseases (including but not limited to arthritis), obesity.

したがって、さらなる実施形態では、本発明は、選択的スプライシング事象を調整するか異常なスプライシング事象を抑制してプレｍＲＮＡ分子の正確なスプライシング事象に修復するための本明細書中に記載の方法によって同定された治療有効量の化合物を含む薬学的に許容可能なキャリアを患者に投与し、それにより患者を治療するステップを含む、プレｍＲＮＡ分子の選択的または異常なスプライシング事象に関連する障害を有する患者の治療方法を提供する。 Thus, in a further embodiment, the present invention is identified by the methods described herein for modulating alternative splicing events or suppressing abnormal splicing events to restore the correct splicing event of the pre-mRNA molecule. A patient having a disorder associated with an alternative or abnormal splicing event of a pre-mRNA molecule comprising administering to the patient a pharmaceutically acceptable carrier comprising a therapeutically effective amount of the compound and thereby treating the patient A method of treatment is provided.

本発明の処方物は、水性キャリアなどの生理学的または薬学的に許容可能なキャリア中の本発明の小分子を含む。したがって、本発明で使用するための処方物には、経口投与、非経口投与（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、および動脈内投与が含まれる）、および局所投与（例えば、嚢胞性線維症もしくは肺癌に罹患した患者の肺への呼吸に適する粒子のエアゾール化処方物の投与、または乾癬患者の経皮投与のためのクリームもしくはローション処方物）に適切なものが含まれるが、これらに限定されない。処方物は、都合よく単位投与形態中に存在することができるか、当分野で周知の任意の方法によって調製することができる。任意の所与の場合の最も適切な投与形態は、当業者によって容易に決定される、被験体、治療される病態の性質および重症度、ならびに使用される特定の活性化合物に依存し得る。 The formulations of the present invention comprise a small molecule of the present invention in a physiologically or pharmaceutically acceptable carrier such as an aqueous carrier. Accordingly, formulations for use in the present invention include oral, parenteral (including subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, and intraarterial) and topical (eg, cystic fibers). Suitable for aerosolized formulations of particles suitable for breathing into the lungs of patients suffering from illness or lung cancer, or creams or lotion formulations for transdermal administration of psoriasis patients). It is not limited. The formulation can conveniently be present in unit dosage form or can be prepared by any method known in the art. The most suitable dosage form for any given case may depend on the subject, the nature and severity of the condition being treated, and the particular active compound used, as readily determined by one skilled in the art.

本発明はまた、上記で考察するように、プレｍＲＮＡ分子の異常または選択的スプライシングに関連する障害を有する患者の遺伝子発現のアップレギュレートのための薬物の調製のための上記特徴を有する本発明の化合物の使用を提供する。本発明の薬物の製造では、化合物を、典型的には、特に、薬学的に許容可能なキャリアと混合する。キャリアは、勿論、処方物中の任意の他の成分と適合するという意味で許容可能であり、患者に有毒であってはならない。キャリアは、固体または液体であり得る。１つまたは複数の化合物を、本発明の処方物中に任意の組み合わせで組み込むことができ、本質的に選択的に１つまたは複数の治療副成分を含む組成物の混合からなる任意の周知の薬学的技術によって調製することができる。 The present invention also has the above features for the preparation of a medicament for upregulation of gene expression in a patient having a disorder associated with pre-mRNA molecule abnormalities or alternative splicing, as discussed above. The use of the compound is provided. In the manufacture of the medicament of the present invention, the compound is typically mixed with a pharmaceutically acceptable carrier, in particular. The carrier is, of course, acceptable in the sense of being compatible with any other ingredient in the formulation and should not be toxic to the patient. The carrier can be solid or liquid. One or more compounds can be incorporated in any combination in the formulations of the present invention, and any known combination consisting essentially of a mixture of compositions optionally containing one or more therapeutic accessory ingredients It can be prepared by pharmaceutical techniques.

本発明の処方物は、活性化合物の滅菌水性および非水性注射溶液を含むことができ、調製物は、好ましくは、意図するレシピエントの血液と等張であり、本質的に発熱物質を含まない。これらの調製物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および処方物を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る。水性および非水性滅菌懸濁系はまた、懸濁化剤および増粘剤を含み得る。処方物は単位用量または多用量コンテナ中に存在することができ（例えば、密封アンプルおよびバイアル）、滅菌液体キャリア（例えば、使用直前に使用する注射用生理食塩水または水）の添加のみが必要なフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保存することができる。 The formulations of the present invention can include sterile aqueous and non-aqueous injection solutions of the active compound, and the preparation is preferably isotonic with the intended recipient's blood and essentially pyrogen-free. . These preparations may contain antioxidants, buffers, bacteriostats, and solutes that make the formulation isotonic with the blood of the intended recipient. Aqueous and non-aqueous sterile suspension systems may also contain suspending agents and thickening agents. The formulation can be present in unit dose or multi-dose containers (eg, sealed ampoules and vials) and only requires the addition of a sterile liquid carrier (eg, injectable saline or water to be used immediately prior to use) It can be stored under freeze-dry (freeze-dry) conditions.

１つの処方物では、本発明の化合物を、非経口投与に適切であり得るリポソームまたは微結晶などの脂質の粒子または小胞内に含めることができる。化合物が粒子中に含まれる限り、粒子は単層または多層などの任意の適切な構造であってよい。このような粒子および小胞には、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート（すなわち、「ＤＯＴＡＰ」）などの正電荷の脂質が特に好ましい。このような脂質粒子の調製は周知である。例えば、Ｊａｎｏｆｆｅｔａｌ．に付与された米国特許第４，８８０，６３５号；Ｋｕｒｏｎｏｅｔａｌ．に付与された米国特許第４，９０６，４７７号；Ｗａｌｌａｃｈに付与された米国特許第４，９１１，９２８号；Ｗａｌｌａｃｈに付与された米国特許第４，９１７，９５１号；Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．に付与された米国特許第４，９２０，０１６号；Ｗｈｅａｔｌｅｙｅｔａｌ．に付与された米国特許第４，９２１，７５７号などを参照のこと。 In one formulation, the compounds of the invention can be contained within particles or vesicles of lipids such as liposomes or microcrystals that may be suitable for parenteral administration. So long as the compound is included in the particle, the particle may be of any suitable structure, such as a single layer or multiple layers. Such particles and vesicles include positive molecules such as N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethyl-ammonium methyl sulfate (ie, “DOTAP”). Charged lipids are particularly preferred. The preparation of such lipid particles is well known. For example, Janoff et al. U.S. Pat. No. 4,880,635 to Kurono et al. U.S. Pat. No. 4,906,477 issued to Wallach; U.S. Pat. No. 4,911,928 issued to Wallach; U.S. Pat. No. 4,917,951 issued to Wallach; Allen et al. U.S. Pat. No. 4,920,016 to Wheatley et al. See, for example, US Pat.

化合物の投薬量は、実施される特定の方法、被験体に投与される場合、被験体の疾患、病態、特定の処方物、投与経路などに依存する。ヒトなどの被験体に投与するために、約０．００１、０．０１、０．１、または１．０ｍｇ／Ｋｇから約５０、１００、または１５０ｍｇ／Ｋｇまでの投薬量を使用する。 The dosage of the compound will depend on the particular method being performed and, when administered to a subject, the subject's disease, condition, particular formulation, route of administration and the like. A dosage of about 0.001, 0.01, 0.1, or 1.0 mg / Kg to about 50, 100, or 150 mg / Kg is used for administration to a subject such as a human.

本発明を例示するために以下の例を記載するが、本発明を制限すると解釈されない。 The following examples are included to illustrate the invention but are not to be construed as limiting the invention.

＜ライブラリースクリーニング＞
１０，０００個の薬物様小分子の市販のライブラリーを、β−グロビン遺伝子を正確なスプライシングパターンに修復する能力についてスクリーニングした。２００から５００ｋＤまでの分子量範囲の分子は構造が多様であり、薬理作用団（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）特性を有するものを予め選択した。 <Library screening>
A commercial library of 10,000 drug-like small molecules was screened for the ability to repair the β-globin gene to the correct splicing pattern. Molecules in the molecular weight range from 200 to 500 kD were preselected to have a variety of structures and to have pharmacophore properties.

ＥＧＦＰ（増強（ｅｎｈａｎｃｅｄ）緑色蛍光タンパク質）構築物で安定にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞株を使用してスクリーニングを行った。この構築物は、サラセミア変異を含むβ−グロビン遺伝子のイントロン２によって破壊されたＥＧＦＰｃＤＮＡを含み（図１）、ＣＭＶプロモーターの調節下にあった。この構築物を使用して、２つの異なる細胞株（一方は、６５４位の変異（ＩＶＳ２−６５４ＥＧＦＰ）であり、他方は７０５位の変異（ＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ）である）を作製した。 Screening was performed using a HeLa cell line stably transfected with an EGFP (enhanced green fluorescent protein) construct. This construct contained the EGFP cDNA disrupted by intron 2 of the β-globin gene containing the thalassemia mutation (FIG. 1) and was under the control of the CMV promoter. This construct was used to create two different cell lines, one at position 654 (IVS2-654 EGFP) and the other at position 705 (IVS2-705U EGFP).

ＩＶＳ２−６５４またはＩＶＳ２−７０５のいずれかにサラセミア変異を保有するヒトβ−グロビン遺伝子でのＨｅＬａ細胞の安定なトランスフェクションによってβ−グロビン細胞株を得た。クローン化遺伝子は、即時型サイトメガロウイルスプロモーターの調節下にあった（Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ，ｅｔａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１２８４０−１２８４４）。ＩＶＳ２−６５４ＥＧＦＰ細胞株は当分野で周知である（Ｓａｚａｎｉ（２００１）ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ．２９：３９６５−３９７４）。ＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞株を、同一の様式で異なるプラスミドを使用して作製した。ＨｅＬａ細胞を、５％ウマ血清、５％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミン、および１％ゲンタマイシン／カナマイシンを含むＳＭＥＭ中で成長させた。 A β-globin cell line was obtained by stable transfection of HeLa cells with a human β-globin gene carrying a thalassemia mutation in either IVS2-654 or IVS2-705. The cloned gene was under the control of the immediate cytomegalovirus promoter (Sierakska, et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 12840-12844). The IVS2-654 EGFP cell line is well known in the art (Sazani (2001) Nucl Acids Res. 29: 3965-3974). The IVS2-705U EGFP cell line was generated using different plasmids in the same manner. HeLa cells were grown in SMEM containing 5% horse serum, 5% fetal calf serum, 1% L-glutamine, and 1% gentamicin / kanamycin.

両構築物のために、変異イントロン２でのＥＧＦＰの破壊により、機能的ＥＧＦＰタンパク質の産生が欠失する。細胞を正確なスプライシングに修復する場合、イントロン２を切り出し、機能的ＥＧＦＰタンパク質を作製する（Ｓａｚａｎｉ（２００１）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２９：３９６５−３９７４）。これにより、蛍光顕微鏡で容易に検出可能な蛍光シグナルが得られる。 For both constructs, disruption of EGFP at mutant intron 2 abolishes production of functional EGFP protein. When cells are repaired to correct splicing, intron 2 is excised and a functional EGFP protein is made (Sazani (2001) Nucl. Acids Res. 29: 3965-3974). This provides a fluorescent signal that can be easily detected with a fluorescence microscope.

ブラックウェルの透明な底の９６ウェルプレートに１３×１０⁴細胞／ｍｌの細胞を１００μｌ／ウェルでプレートした。プレートの末端の列（列１〜１２）はコントロール列であり、残りの列を化合物で処理した。コントロール列では、ポジティブコントロールＥＧＦＰ細胞を、ネガティブコントロールとして使用する未処理細胞と交互に並べた。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは小化合物を使用せずに正確なスプライシングに修復する代償性変異を有するＩＶＳ２−６５４ＥＧＦＰ構築物を含む細胞株をポジティブコントロールとして使用した。未処理ＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞またはＩＶＳ２−６５４ＥＧＦＰ細胞をネガティブコントロールとして使用した。 Black well clear bottom 96-well plates were plated at 13 × 10 ⁴ cells / ml at 100 μl / well. The end row of the plate (rows 1-12) was the control row and the remaining rows were treated with compounds. In the control row, positive control EGFP cells were alternately arranged with untreated cells used as negative controls. A cell line containing the IVS2-654 EGFP construct with a compensatory mutation that restores correct splicing without the use of antisense oligonucleotides or small compounds was used as a positive control. Untreated IVS2-705U EGFP cells or IVS2-654 EGFP cells were used as negative controls.

化合物は、１０，０００個の小分子の無作為化ライブラリーおよび全ライブラリーの化合物の説明書からなるＰｒｉｍｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）であり、その生成物全体が本明細書中で参照することにより組み込まれる。化合物を、２０μｌのＤＭＳＯで約５００ｇ／ｍｏｌの分子量に希釈し、それにより濃度は約１０ｍＭであった。化合物を、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ゲンタマイシン／カナマイシンのみを含む無血清ＳＭＥＭ培地で１００μＭの濃度までさらに１００倍希釈した。 The compound is Prime Collection (Chembridge Corporation, San Diego, Calif.) Consisting of a randomized library of 10,000 small molecules and a description of the compounds in the entire library, the entire product of which is described herein. Incorporated by reference. The compound was diluted to a molecular weight of about 500 g / mol with 20 μl DMSO, so that the concentration was about 10 mM. The compound was further diluted 100-fold to a concentration of 100 μM in serum-free SMEM medium containing only 1% L-glutamine and 1% gentamicin / kanamycin.

プレーティングから２４時間後、細胞からＨｅＬａ培地を除去し、２×血清を含む７５μｌ（１０％ウシ胎児血清、１０％ウマ血清、１％Ｌ−グルタミン、および１％ゲンタマイシン／カナマイシンを含むＳＭＥＭ）の培地を添加した。その後、７５μｌの希釈化合物を各ウェルに添加し、各ウェルに一定量の化合物を添加して最終濃度を５０μＭとし、培地中の血清量を１倍にした。 24 hours after plating, HeLa medium was removed from the cells and 75 μl containing 2 × serum (SMEM containing 10% fetal calf serum, 10% horse serum, 1% L-glutamine, and 1% gentamicin / kanamycin). Medium was added. Thereafter, 75 μl of diluted compound was added to each well, and a fixed amount of compound was added to each well to give a final concentration of 50 μM and the serum volume in the medium was doubled.

処理から２４時間後、培地を除去し、細胞を１５０μｌの１×ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を、１００μｌの２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を使用して固定した。ＰＦＡを５〜１０分間細胞上に残したままにし、細胞を、１×ＰＢＳで２回洗浄し、最後の洗浄後にウェル中の１５０μｌのＰＢＳを除去した。次いで、細胞を、ＦＩＴＣフィルターを使用したＯｌｙｍｐｕｓ倒立蛍光顕微鏡で１０倍または２０倍の倍率で試験した。目視によって蛍光を検出した。プレートリーダーは予想される低レベルのＥＧＦＰ蛍光の検出には感度が不十分であるので、蛍光プレートリーダーを使用する試みは失敗した。化合物が細胞に蛍光を発生させるかどうかを決定するために（化合物は正確なスプライシングであることを示す）、処理細胞を未処理細胞と比較した。 Twenty-four hours after treatment, the medium was removed and the cells were washed twice with 150 μl of 1 × PBS. Cells were then fixed using 100 μl of 2% paraformaldehyde (PFA). PFA was left on the cells for 5-10 minutes and the cells were washed twice with 1 × PBS and 150 μl of PBS in the wells was removed after the last wash. Cells were then examined at 10x or 20x magnification on an Olympus inverted fluorescence microscope using a FITC filter. Fluorescence was detected visually. Attempts to use a fluorescent plate reader failed because the plate reader is not sensitive enough to detect the expected low level of EGFP fluorescence. To determine whether the compound fluoresces the cells (indicating that the compound is the correct splicing), treated cells were compared to untreated cells.

化合物を陽性と示すために使用した基準は以下であった。細胞は処理後に健常なままでなければならなかった（化合物が比較的高い試験濃度であっても有毒でないことを示す）。さらに、蛍光は、全ての細胞全体でほとんど均一でなければならなかった。この基準は、多数の化合物が種々の自己蛍光レベルを有し、それにより細胞蛍光を生じさせる化合物との区別が困難であるという事実によって複雑になった。ストランド、小片、またはクランプ中に大量の自己蛍光化合物を含むウェルも潜在的な陽性と見なした。 The criteria used to show compounds as positive were: Cells had to remain healthy after treatment (indicating that the compound is not toxic even at relatively high test concentrations). Furthermore, the fluorescence had to be almost uniform across all cells. This criterion has been complicated by the fact that many compounds have different levels of autofluorescence and are therefore difficult to distinguish from compounds that produce cellular fluorescence. Wells containing large amounts of autofluorescent compounds in strands, strips, or clamps were also considered potential positives.

最初のスクリーニングにより、ＩＶＳ２−６５４またはＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞のいずれかに対して試験した１０，０００種の化合物から全部で１３２種が正であった（緑色蛍光を発する化合物）。陽性の化合物の存在下での細胞蛍光の例を、図２に示す。僅かに輝く細胞蛍光を示す化合物（図２、パネルＡ）、細胞蛍光が低レベルの自己蛍光を示す化合物（図２、パネルＢ）、低レベルの細胞蛍光しか示さない化合物（図２、パネルＣ）が検出可能であった。 Initial screening revealed a total of 132 out of 10,000 compounds tested against either IVS2-654 or IVS2-705U EGFP cells (compounds emitting green fluorescence). An example of cell fluorescence in the presence of positive compounds is shown in FIG. Compounds that show slightly shining cell fluorescence (FIG. 2, panel A), compounds that show low levels of autofluorescence (FIG. 2, panel B), compounds that show only low levels of cellular fluorescence (FIG. 2, panel C) ) Was detectable.

１３２種の陽性の化合物のうち、１３種によりＩＶＳ２−６５４ＥＧＦＰ細胞のみが蛍光を発し、１６種はＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞に特異的であった。他の１０３種の陽性の化合物は、両細胞株に蛍光を発した。１３２種の陽性の化合物のうち、約１５％しか均一に分布した中程度または高レベルの光を発すると記録されなかった。別の２０％は低レベルの蛍光を発し、３０％は非常にわずかであった。残りの３５％は斑点であるか、化合物自己蛍光の小粒がいくらか存在していた。 Of the 132 positive compounds, 13 caused only IVS2-654 EGFP cells to fluoresce, and 16 were specific for IVS2-705U EGFP cells. The other 103 positive compounds fluoresced in both cell lines. Of the 132 positive compounds, only about 15% was emitted with a moderately or high level of light evenly distributed. Another 20% emitted a low level of fluorescence and 30% was very slight. The remaining 35% were spots or some compound autofluorescent particles were present.

ＩＶＳ２−７０５ＵおよびＩＶＳ２−６５４ＥＧＦＰ細胞株を、１３２種の陽性の化合物で２回処理し、蛍光顕微鏡で分析した。最初に陽性と同定されたいくつかの化合物が第２の試験で検出可能な蛍光シグナルを発しないことに留意した。従って、いくつかの処理したウェルに自己蛍光化合物の小粒を満たした。 IVS2-705U and IVS2-654 EGFP cell lines were treated twice with 132 positive compounds and analyzed with a fluorescence microscope. Note that some of the compounds initially identified as positive do not emit a detectable fluorescent signal in the second test. Therefore, some treated wells were filled with granules of autofluorescent compound.

＜ＥＧＦＰに陽性の化合物のＲＴ−ＰＣＲ分析＞
ＥＧＦＰ細胞で認められた蛍光がスプライシングをシフトする化合物の結果であるかどうかを決定するために、ＲＴ−ＰＣＲベースのアッセイを行った。このアッセイは、異常にスプライシングした産物がイントロン２の一部を含むので正確にスプライシングされた産物よりも僅かに長いことを証明する。したがって、エクソン２および３中に存在するプライマーを使用して、産物をＰＣＲ増幅し、アクリルアミドゲルでの産物の泳動によってサイズの相違を検出する。 <RT-PCR analysis of compounds positive for EGFP>
To determine if the fluorescence observed in EGFP cells was the result of a compound that shifted splicing, an RT-PCR based assay was performed. This assay demonstrates that the abnormally spliced product is slightly longer than the correctly spliced product because it contains a portion of intron 2. Therefore, the primers present in exons 2 and 3 are used to PCR amplify the product and detect size differences by running the product on an acrylamide gel.

ＩＶＳ２−７０５ＵおよびＩＶＳ２−６５４ＥＧＦＰ細胞を陽性の化合物で再処理して顕微鏡で試験した後、ＴＲＩ−ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を使用して総ＲＮＡを単離した。全部で２００ｎｇのＲＮＡを、製造者の説明書に従って、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した。７０℃で１５分間逆転写ステップを行った。ＰＣＲステップは、９５℃で３分間を１サイクル、９５℃で１分間および６５℃で１分間を１８サイクルでインキュベートした。β−グロビンｍＲＮＡ増幅のために、逆方向プライマーはヒトβ−グロビン遺伝子のエクソン３の６〜２８位にわたり、正方向プライマーはエクソン２の２１〜４３にわたっていた。ＥＧＦＰｍＲＮＡ増幅のために、逆方向プライマーは、５’−ＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣ−３’（配列番号１）であり、正方向プライマーは５’−ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧ−３’（配列番号２）であった。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、８％未変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィで視覚化した。 IVS2-705U and IVS2-654 EGFP cells were retreated with positive compounds and examined under a microscope, and then total RNA was analyzed using TRI-REAGENT® (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH). Isolated. A total of 200 ng RNA was analyzed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using rTth DNA polymerase (Perkin-Elmer, Boston, Mass.) According to the manufacturer's instructions. A reverse transcription step was performed at 70 ° C. for 15 minutes. The PCR step was incubated for 1 cycle at 95 ° C for 3 minutes, 1 minute at 95 ° C and 1 minute at 65 ° C for 18 cycles. For β-globin mRNA amplification, the reverse primer spanned positions 6-28 of exon 3 of the human β-globin gene and the forward primer spanned 21-43 of exon 2. For EGFP mRNA amplification, the reverse primer was 5'-GTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTC-3 '(SEQ ID NO: 1) and the forward primer was 5'-CGTAAACGGCCACAAGTTCAGCG-3' (SEQ ID NO: 2). RT-PCR products were separated on an 8% native polyacrylamide gel and visualized by autoradiography.

図３は、いくつかの陽性の化合物で処理したＥＧＦＰ細胞由来のＲＴ−ＰＣＲ産物を使用したポリアクリルアミドゲルの例を示す。異常なバンドと正確なバンドとの比の比較によって、修正量を決定した。図３中の異常なバンドは全て類似の強度であり、正確なバンドを容易に同定可能である。 FIG. 3 shows an example of a polyacrylamide gel using RT-PCR products from EGFP cells treated with some positive compounds. The amount of correction was determined by comparing the ratio of the abnormal band to the exact band. All abnormal bands in FIG. 3 have similar intensities, and an accurate band can be easily identified.

ＲＴ−ＰＣＲによってＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞を修正する化合物を、表１で＋サインによって示す。ＩＶＳ２−６５４ＥＧＦＰ細胞を修正する化合物を表２に示す。ＲＴ−ＰＣＲによって全部で１１種の化合物がＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞を修正し、１１種の化合物がＩＶＳ２−６５４ＥＧＦＰ細胞を修正した。これらの修正させる化合物のうち、２種のみが両ＥＧＦＰ細胞株を修正した。 Compounds that modify IVS2-705U EGFP cells by RT-PCR are shown in Table 1 by the + sign. Compounds that modify IVS2-654 EGFP cells are shown in Table 2. A total of 11 compounds modified IVS2-705U EGFP cells and 11 compounds modified IVS2-654 EGFP cells by RT-PCR. Of these compounds to be corrected, only two corrected both EGFP cell lines.

^*化合物自体が自己蛍光を発せず高レベルの蛍光を緩和する化合物を（＋）サインで示した。Ａ（＋／−）は、僅かなレベルの蛍光を発する化合物または細胞に蛍光を発生させることに加えていくらか自己蛍光を発する化合物を示す。Ａ（−）は、化合物が検出可能なレベルの蛍光を発生させないことを示す。
^#ＲＴ−ＰＣＲによって修正させる化合物を、（＋）サインで示す。 ^{* The} compound itself does not emit autofluorescence and the compound that relaxes high level fluorescence is indicated by (+) sign. A (+/−) indicates a compound that emits a slight level of fluorescence or a compound that produces some autofluorescence in addition to producing fluorescence in the cell. A (-) indicates that the compound does not generate a detectable level of fluorescence.
^# Compounds corrected by RT-PCR are indicated by (+) sign.

これらの結果は、化合物は配列特異的様式で正確なスプライシングに修復することができることを示す。ＲＴ−ＰＣＲによって決定した蛍光の存在とスプライシングの修正との間の相関関係を得ることは困難である。しかし、一般に、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて修正させる化合物は、蛍光顕微鏡で分析した場合にかならずしも検出可能な蛍光を発しない。 These results indicate that the compounds can be repaired to precise splicing in a sequence specific manner. It is difficult to obtain a correlation between the presence of fluorescence as determined by RT-PCR and correction of splicing. In general, however, compounds that are corrected in RT-PCR assays do not necessarily emit detectable fluorescence when analyzed with a fluorescence microscope.

＜陽性の化合物でのβ−グロビン細胞株の処理＞
治療的に有意な細胞株には、ＩＶＳ２−７０５およびＩＶＳ２−６５４ β−グロビン細胞株が含まれる。これらのβ−グロビン細胞は、ＥＧＦＰと異なるエクソン配列を有し、本明細書中に提供した化合物の配列特異性をさらに調査することが可能である。β−グロビン細胞を上記で提供した１３２種全ての陽性の化合物で処理し、その後蛍光顕微鏡で試験した。β−グロブリン細胞はＥＧＦＰ構築物を含まないので、スプライシングの修正により蛍光シグナルを発しない。したがって、検出された任意の蛍光は、化合物の自己蛍光に起因する可能性が高かった。しかし、ほとんどのβ−グロビン細胞は、同一の化合物で処理したＥＧＦＰ細胞に等しい蛍光レベルを示した。これは、ＥＧＦＰ細胞で認められた蛍光のほとんどがスプライシングを修正する化合物よりもむしろ化合物の自己蛍光の結果であることを示した。しかし、上記のように、化合物の自己蛍光は、この修正によって生じた蛍光をマスキングし得るとしても、正確なスプライシングの修復を妨げない。したがって、ＲＴ−ＰＣＲの実施により化合物がスプライシングを修正することが解明された。 <Treatment of β-globin cell line with positive compound>
Therapeutically significant cell lines include the IVS2-705 and IVS2-654 β-globin cell lines. These β-globin cells have exon sequences that differ from EGFP, and the sequence specificity of the compounds provided herein can be further investigated. β-globin cells were treated with all 132 positive compounds provided above and then examined with a fluorescence microscope. Since β-globulin cells do not contain the EGFP construct, they do not emit a fluorescent signal due to splicing modifications. Therefore, any fluorescence detected was likely due to compound autofluorescence. However, most β-globin cells showed fluorescent levels equal to EGFP cells treated with the same compound. This indicated that most of the fluorescence observed in EGFP cells was a result of compound autofluorescence rather than compounds that correct splicing. However, as noted above, the compound's autofluorescence does not prevent correct splicing repair, even though it may mask the fluorescence produced by this modification. Thus, it was found that performing the RT-PCR compound corrects splicing.

陽性の化合物で処理したＩＶＳ２−７０５およびＩＶＳ２−６５４ β−グロブリン細胞から単離された総ＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲアッセイを行った。ＩＶＳ２−７０５およびＩＶＳ２−６５４ β−グロブリン細胞についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を表１および表２にそれぞれ示す。１３種の化合物がＩＶＳ２−７０５β−グロブリン細胞を修正し、たった１種の化合物がＩＶＳ２−６５４ β−グロブリン細胞を修正した。この化合物（化合物ＣＣ８）は、４つ全ての試験細胞株を修正する唯一の化合物であった。 RT-PCR assays were performed on total RNA isolated from IVS2-705 and IVS2-654 β-globulin cells treated with positive compounds. Tables 1 and 2 show the RT-PCR results for IVS2-705 and IVS2-654 β-globulin cells, respectively. Thirteen compounds modified IVS2-705 β-globulin cells and only one compound modified IVS2-654 β-globulin cells. This compound (Compound CC8) was the only compound that modified all four test cell lines.

蛍光データおよびＲＴ−ＰＣＲの結果は、蛍光レベルと修正量との間に明らかな相関関係はないことを示す（すなわち、蛍光が強ければ必ずしも修正量が多いというわけではない）。化合物による修正量は少なすぎて蛍光顕微鏡で検出することができなかった。たった１つの化合物が、ＲＴ−ＰＣＲによって有意に高いレベルで修正した。さらに、自己蛍光を発する多数の化合物は、あたかも高レベルで修正するかのようである。これらの同一の化合物がＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて任意の修正が認められる場合、正確なバンドは、偽って認められた高レベルの蛍光よりも弱い。さらに、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいてスプライシングの修正が示された化合物の大部分は、ＥＧＦＰおよびβ−グロビン細胞の両方で蛍光を発した。 Fluorescence data and RT-PCR results show that there is no clear correlation between the fluorescence level and the amount of correction (ie, the stronger the fluorescence, the greater the amount of correction). The amount of correction by the compound was too small to be detected with a fluorescence microscope. Only one compound was corrected at a significantly higher level by RT-PCR. In addition, many compounds that emit autofluorescence appear to correct at a high level. If these same compounds show any correction in the RT-PCR assay, the correct band is weaker than the falsely observed high level of fluorescence. Furthermore, the majority of compounds that showed splicing correction in the RT-PCR assay fluoresced in both EGFP and β-globin cells.

＜蛍光を生じない化合物の分析＞
蛍光量は修正量と十分に相関しないので、実際にスプライシングをシフトさせるいくつかの化合物は、検出可能な蛍光が存在しないことにより最初のスクリーニングで見逃されていたかもしれない。コントロールとして、ＥＧＦＰ細胞で蛍光を発しなかった２０種の化合物のパネルを無作為に選択した。ＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰおよびＩＶＳ２−７０５ β−グロブリン細胞を、陰性の化合物で処理し、蛍光顕微鏡で試験した。最初のスクリーングの場合、これらの化合物によりＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞は蛍光を発しなかった。さらに、ＩＶＳ２−７０５ β−グロブリン細胞で蛍光は検出されなかった。したがって、ＥＧＦＰ細胞での蛍光について陰性の化合物もβ−グロビン細胞で負である。 <Analysis of compounds that do not produce fluorescence>
Since the amount of fluorescence does not correlate well with the correction amount, some compounds that actually shift splicing may have been missed in the initial screen due to the absence of detectable fluorescence. As a control, a panel of 20 compounds that did not fluoresce in EGFP cells was randomly selected. IVS2-705U EGFP and IVS2-705 β-globulin cells were treated with negative compounds and examined with a fluorescence microscope. In the first screening case, these compounds did not cause IVS2-705U EGFP cells to fluoresce. Furthermore, no fluorescence was detected in IVS2-705 β-globulin cells. Thus, compounds that are negative for fluorescence in EGFP cells are also negative in β-globin cells.

上記の陰性の化合物パネルで処理したＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰおよびＩＶＳ２−７０５ β−グロブリン細胞についてＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。これらの化合物では、いずれの細胞株も蛍光を発しなかったが、いくつかの化合物はＲＴ−ＰＣＲによってこれらの細胞株を修正した。試験した２０種の化合物のうちの２種は、ＩＶＳ２−７０５β−グロビン細胞を修正し、２０種のうちの５種がＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞を修正した。これらの結果は、本明細書中で使用したＥＧＦＰスクリーニングでは正確なスプライシングに修復することができる化合物の全てが同定されないことを示す。 RT-PCR analysis was performed on IVS2-705U EGFP and IVS2-705 β-globulin cells treated with the negative compound panel described above. None of these cell lines fluoresced with these compounds, but some compounds corrected these cell lines by RT-PCR. Two of the 20 compounds tested modified IVS2-705β-globin cells and 5 of the 20 modified IVS2-705U EGFP cells. These results indicate that the EGFP screen used herein does not identify all of the compounds that can be repaired to accurate splicing.

＜化合物の特異性＞
表３でまとめるように、表１に示した結果は、いくつかの化合物はＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰおよびＩＶＳ２−７０５ β−グロブリン細胞の両方でスプライシングを修正し、いくつかの化合物は一方または他方のみのスプライシングを修正することを示す。いくつかの化合物は、ＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞におけるＡからＵに変化する７１１位での変異を除いて、イントロン配列が実質的に同一であるので、両方の細胞株でスプライシングをシフトすることができる。しかし、７１１位の塩基およびエクソン配列は細胞株で異なる。したがって、これらのエレメントがスプライシングのシフトのために特定の化合物を使用するいかなる機構においても重要な役割を果たす場合、２つの細胞株間で修正が異なる。 <Specificity of compound>
As summarized in Table 3, the results shown in Table 1 show that some compounds correct splicing in both IVS2-705U EGFP and IVS2-705 β-globulin cells, and some compounds are only one or the other. Indicates to correct splicing. Some compounds can shift splicing in both cell lines because the intron sequence is substantially identical except for a mutation at position 711 that changes from A to U in IVS2-705U EGFP cells. . However, the base at position 711 and the exon sequence are different in cell lines. Thus, if these elements play an important role in any mechanism that uses a particular compound for a splicing shift, the corrections differ between the two cell lines.

陽性の化合物で処理したＩＶＳ２−６５４ＥＧＦＰおよびＩＶＳ２−６５４ β−グロビン細胞から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を、表４にまとめる。ＩＶＳ２−６５４ＥＧＦＰ細胞を修正する化合物数は、ＩＶＳ２−７０５ β−グロビンまたはＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞を修正する化合物数と類似している。対照的に、たった１つの化合物しかＩＶＳ２−６５４ β−グロビン細胞を修正しないようである。これら２つのＩＶＳ２−６５４細胞株は、同一のβ−グロビンイントロン２配列を有する。 The results of RT-PCR analysis of RNA isolated from IVS2-654 EGFP and IVS2-654 β-globin cells treated with positive compounds are summarized in Table 4. The number of compounds that modify IVS2-654 EGFP cells is similar to the number of compounds that modify IVS2-705 β-globin or IVS2-705U EGFP cells. In contrast, only one compound appears to modify IVS2-654 β-globin cells. These two IVS2-654 cell lines have the same β-globin intron 2 sequence.

全体的に見れば、ＩＶＳ２−６５４ＥＧＦＰおよびＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰを修正させる化合物数は同一であった。 Overall, the number of compounds that modify IVS2-654 EGFP and IVS2-705U EGFP was the same.

＜化合物ＤＤ２＞
１つの化合物が実質的に完全にスプライシングを修正した。この化合物をＤＤ２と命名し、このリード化合物と同程度の修正レベルの他の化合物は無かった。前にＲＴ−ＰＣＲによってＩＶＳ２−７０５ β−グロビン細胞を修正すると同定されたいくつかの化合物を、ＤＤ２を使用した第２のＲＴ−ＰＣＲで試験した（図４）。 <Compound DD2>
One compound corrected splicing substantially completely. This compound was named DD2 and there was no other compound at the same level of correction as this lead compound. Several compounds previously identified as correcting IVS2-705 β-globin cells by RT-PCR were tested in a second RT-PCR using DD2 (FIG. 4).

結果は、化合物ＤＤ２により高い効率でＩＶＳ２−７０５ β−グロビン細胞を修正することを示す。ＤＤ２によるＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞の修正ははるかに低い（図５）。ＩＶＳ２−７０５ＵＲＧＦＰ細胞で認められた修正量の減少は、ＥＧＦＰ細胞をＤＤ２で処理した場合に低レベルの蛍光が認められるという事実の説明となり得る。ＤＤ２によりＩＶＳ２−７０５ β−グロビン細胞のスプライシングの修正と同一の効率でＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞のスプライシングが修正される場合、強い蛍光が予想される。しかし、ＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞に対する修正レベルは、潜在的に低すぎて有意な蛍光を発しない（図６）。化合物ＤＤ２によりＩＶＳ２−７０５β−グロビン細胞に対して低レベルの蛍光も発し、この化合物がいくらか自己蛍光を発し得ることを示す。 The results show that compound DD2 corrects IVS2-705 β-globin cells with high efficiency. The correction of IVS2-705U EGFP cells by DD2 is much lower (FIG. 5). The reduction in the amount of correction observed in IVS2-705U RGFP cells may explain the fact that low levels of fluorescence are observed when EGFP cells are treated with DD2. Strong fluorescence is expected when DD2 modifies splicing of IVS2-705U EGFP cells with the same efficiency as that of splicing correction of IVS2-705 β-globin cells. However, the level of correction for IVS2-705U EGFP cells is potentially too low to fluoresce significantly (FIG. 6). Compound DD2 also emits a low level of fluorescence to IVS2-705β-globin cells, indicating that this compound can emit some autofluorescence.

ＤＤ２は用量依存性様式でスプライシングを修正する
ＩＶＳ２−７０５ β−グロビン細胞を、一定範囲の濃度のＤＤ２で処理した。試験濃度は、０．１μＭから５０μＭまでであった。化合物は、用量依存性のスプライシング修正を示した（図７）。スプライシングを修正する濃度範囲は比較的狭く、最も低い修正濃度は１０μＭであり、約２０％の修正を示した。３０μＭの濃度で約６０％が修正され、５０μＭでの処理で約８５％のスプライシングが修正された（５０μＭは、最初のスクリーニングでの細胞処理に使用した濃度であった）。これらの結果は、ＩＶＳ２−７０５ β−グロブリン処理に使用した化合物ＤＤ２濃度の増加によって得られるβ−グロビンｍＲＮＡの修正量が増加することを示す。 DD2 corrects splicing in a dose-dependent manner IVS2-705 β-globin cells were treated with a range of concentrations of DD2. Test concentrations were from 0.1 μM to 50 μM. The compound showed a dose-dependent splicing correction (Figure 7). The concentration range that corrects splicing is relatively narrow, with the lowest correction concentration being 10 μM, indicating approximately 20% correction. About 30% was corrected at a concentration of 30 μM and about 85% was corrected by treatment at 50 μM (50 μM was the concentration used for cell treatment in the initial screening). These results indicate that the amount of correction of β-globin mRNA obtained by increasing the concentration of compound DD2 used for IVS2-705 β-globulin treatment increases.

上記実施例は、本発明の例示であり、本発明を制限すると解釈されない。本発明を、以下の特許請求の範囲によって説明し、特許請求の範囲の等価物も含まれる。 The above examples are illustrative of the invention and are not to be construed as limiting the invention. The invention is described by the following claims, including the equivalents of the claims.

β−グロブリン遺伝子のイントロン２で妨害されたＥＧＦＰｃＤＮＡを含むＥＧＦＰ構築物を示す図である。イントロン２内の６５４位または７０５位の２つの点変異により異常な５’スプライス部位および活性な同一の潜在性３’スプライス部位が得られる。正確なスプライス部位が依然として存在していてもこれらのスプライス部位を優先的に使用する。異常なスプライシングパターン（右側に示す）の結果として、スプライシングされたＥＧＦＰｍＲＮＡ中にイントロン２の一部が保持される。これにより、機能的ＥＧＦＰタンパク質産生が抑制され、緑色蛍光を発生しない。しかし、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用または小分子の使用によって正確なスプライシング（左側に示す）に修復することができる場合、イントロンは完全にスプライシングされて機能的ＥＧＦＰタンパク質を産生することができる。下のパネルの小さな矢印は、ＲＴ−ＰＣＲで使用したプライマーを示す。FIG. 5 shows an EGFP construct containing EGFP cDNA interrupted by intron 2 of the β-globulin gene. Two point mutations at position 654 or 705 in intron 2 result in an aberrant 5 'splice site and an active identical latent 3' splice site. These splice sites are preferentially used even if the correct splice sites are still present. As a result of the unusual splicing pattern (shown on the right), a portion of intron 2 is retained in the spliced EGFP mRNA. Thereby, functional EGFP protein production is suppressed and green fluorescence is not generated. However, introns can be completely spliced to produce a functional EGFP protein if it can be repaired to precise splicing (shown on the left) by using antisense oligonucleotides or small molecules. The small arrow in the lower panel indicates the primer used in RT-PCR. 陽性の化合物で処理した細胞の例を示す図である。パネルＡ：化合物ＢＢ２で処理したＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞の強い蛍光。パネルＢ：化合物Ｈ４で処理したＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞の非常に低レベルの蛍光を有する自己蛍光化合物。パネルＣ：化合物Ｆ８で処理したＩＶＳ２−６５４ＵＥＧＦＰ細胞の低レベルの蛍光。パネルＤ：化合物Ｃ１１で処理したＩＶＳ２−６５４ＵＥＧＦＰ細胞の蛍光を有する自己蛍光化合物のスポット。パネルＥ：ポジティブコントロール細胞株は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは小化合物を使用せずに正確なスプライシングに修復する代償性（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ）変異を有するＥＧＦＰ６５４構築物を有する。これらの細胞は構成性にＧＦＰを発現する。パネルＦ：未処理のＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞。Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立蛍光顕微鏡を使用して蛍光を検出した。It is a figure which shows the example of the cell processed with the positive compound. Panel A: Strong fluorescence of IVS2-705U EGFP cells treated with compound BB2. Panel B: Autofluorescent compound with very low level of fluorescence of IVS2-705U EGFP cells treated with compound H4. Panel C: Low level fluorescence of IVS2-654U EGFP cells treated with Compound F8. Panel D: Spot of autofluorescent compound with fluorescence of IVS2-654U EGFP cells treated with compound C11. Panel E: The positive control cell line has an EGFP654 construct with a compensatory mutation that restores to correct splicing without the use of antisense oligonucleotides or small compounds. These cells constitutively express GFP. Panel F: Untreated IVS2-705U EGFP cells. Fluorescence was detected using an Olympus inverted fluorescence microscope. いくつかの陽性の化合物で処理したＩＶＳ２−６５４ＥＧＦＰ細胞またはＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。修正を容易に同定可能なゲルの例を示す。ネガティブコントロールレーンは、未処理ＩＶＳ２−６５４ＥＧＦＰ細胞である。FIG. 6 shows RT-PCR analysis of RNA isolated from IVS2-654 EGFP cells or IVS2-705U EGFP cells treated with several positive compounds. An example of a gel where the correction can be easily identified is shown. The negative control lane is untreated IVS2-654 EGFP cells. 他の陽性の化合物と比較して修正レベルが高い化合物ＤＤ２で処理したＩＶＳ２−７０５β−グロブリン細胞から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。レーン１および２は、未処理ＩＳＶ２−７０５β−グロブリン細胞である。FIG. 5 shows RT-PCR analysis of RNA isolated from IVS2-705β-globulin cells treated with compound DD2 with a higher correction level compared to other positive compounds. Lanes 1 and 2 are untreated ISV2-705β-globulin cells. 他の陽性の化合物と比較してＩＶＳ２−７０５ＥＧＦＰ細胞の修正レベルが低いＤＤ２で処理したＩＶＳ２−７０５ＥＧＦＰ細胞から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。レーン１および２は、未処理ＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞である。FIG. 7 shows RT-PCR analysis of RNA isolated from IVS2-705 EGFP cells treated with DD2, which has a lower level of correction of IVS2-705 EGFP cells compared to other positive compounds. Lanes 1 and 2 are untreated IVS2-705U EGFP cells. 化合物ＤＤ２によりＩＶＳ２−７０５ＥＧＦＰ細胞およびβ−グロブリンＨｅＬａ細胞が蛍光を発することを証明する図である。パネルＡ：ポジティブコントロール細胞株は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは小化合物を使用せずに正確なスプライシングに修復する代償性変異を有するＥＧＦＰ６５４構築物を有する。これらの細胞はＧＦＰを構成性に発現する。パネルＢ：ネガティブコントロールは未処理ＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞である。パネルＣ：５０μＭＤＤ２で処理したＩＶＳ２−７０５ＵＥＧＦＰ細胞。パネルＤ：５０μＭＤＤ２で処理したＩＶＳ２−７０５ β−グロブリン細胞。Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立蛍光顕微鏡を使用して蛍光を検出した。It is a figure which proves that IVS2-705 EGFP cell and (beta) -globulin HeLa cell fluoresce with compound DD2. Panel A: The positive control cell line has an EGFP654 construct with a compensatory mutation that restores correct splicing without using antisense oligonucleotides or small compounds. These cells constitutively express GFP. Panel B: Negative control is untreated IVS2-705U EGFP cells. Panel C: IVS2-705U EGFP cells treated with 50 μM DD2. Panel D: IVS2-705 β-globulin cells treated with 50 μM DD2. Fluorescence was detected using an Olympus inverted fluorescence microscope. 化合物ＤＤ２によりＩＶＳ２−７０５ β−グロブリン細胞のスプライシングが用量依存的に修正されることを示す図である。細胞を化合物で処理し、２４時間インキュベートした。ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲアッセイを行った。ＰＮＡ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの自由な取り込みによるＩＶＳ２−７０５ β−グロブリン細胞の修正をコントロールとして使用した。FIG. 11 shows that compound DD2 modifies splicing of IVS2-705 β-globulin cells in a dose-dependent manner. Cells were treated with compounds and incubated for 24 hours. RNA was isolated and RT-PCR assay was performed. A correction of IVS2-705 β-globulin cells by free incorporation of PNA-2 antisense oligonucleotide was used as a control.

Claims

ａ）化合物を、
ｉ）スプライシング事象の非調整下で遺伝子産物を作製するためにｃＤＮＡを発現できないようにするイントロンによって破壊されたｃＤＮＡ、および
ｉｉ）スプライシング機構のエレメント、
と接触させるステップと、
ｂ）遺伝子産物を産生するためにｃＤＮＡの発現を検出し、それによりプレｍＲＮＡ分子におけるスプライシング事象を調整することができる化合物を同定するステップと
を含む、プレｍＲＮＡ分子のスプライシング事象を調整することができる化合物の同定方法。 a) a compound
i) cDNA disrupted by an intron that renders the cDNA incapable of expression in order to make the gene product under unregulated splicing events;
Contacting with
b) adjusting the splicing event of the pre-mRNA molecule, comprising detecting the expression of the cDNA to produce the gene product, thereby identifying a compound that can modulate the splicing event in the pre-mRNA molecule. A method for identifying possible compounds.

請求項１の方法によって同定された化合物に、細胞を接触させるステップを含む、細胞中のプレｍＲＮＡ分子のスプライシング事象を抑制する方法。 A method of inhibiting a splicing event of a pre-mRNA molecule in a cell comprising the step of contacting the cell with a compound identified by the method of claim 1.

請求項１の方法によって同定された化合物に、細胞を接触させるステップを含む、細胞中のプレｍＲＮＡ分子のスプライシング事象を誘導する方法。 A method of inducing a splicing event of a pre-mRNA molecule in a cell comprising the step of contacting the cell with a compound identified by the method of claim 1.

治療有効量の請求項１の方法によって同定された化合物を被験体に投与するステップを含む、プレｍＲＮＡ分子の選択的スプライシングまたは異常なスプライシング事象に関連する障害を有する被験体の治療方法。 A method of treating a subject having a disorder associated with alternative splicing of an pre-mRNA molecule or an abnormal splicing event, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a compound identified by the method of claim 1.

天然タンパク質をコードするＤＮＡを含む細胞中の天然タンパク質の発現をアップレギュレートする方法であって、ＤＮＡはその異常なスプライシングにより天然タンパク質をダウンレギュレートさせる変異を含み、請求項１の方法によって同定された化合物を細胞に導入し、それにより前記異常なスプライシングが阻害され、それにより前記天然タンパク質がアップレギュレートされるステップを含む、方法。 A method of upregulating the expression of a natural protein in a cell containing DNA encoding the natural protein, wherein the DNA contains a mutation that downregulates the natural protein due to its abnormal splicing, identified by the method of claim 1 Introducing the compound to a cell, thereby inhibiting said abnormal splicing, thereby up-regulating said native protein.

選択的スプライシングにより生じる（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）タンパク質をコードするＤＮＡを含む細胞中における選択的スプライシングにより生じる前記タンパク質の発現をアップレギュレートする方法であって、ＤＮＡが選択的スプライシングにより生じる前記タンパク質をダウンレギュレートさせる第１のスプライシング事象によって調節され、スプライシングを調整するために細胞に請求項１の方法によって同定された化合物を導入し、それにより前記第１のスプライシング事象が阻害され、第２のスプライシング事象が起こり、それにより選択的スプライシングにより生じる前記タンパク質の発現がアップレギュレートされるステップを含む、方法。 A method for up-regulating the expression of a protein produced by alternative splicing in a cell comprising DNA encoding a protein that is generated by alternative splicing, wherein the DNA down-regulates the protein produced by alternative splicing A compound identified by the method of claim 1 that is regulated by the first splicing event to regulate and regulate splicing, whereby the first splicing event is inhibited and the second splicing event is The method comprising the step of up-regulating the expression of said protein that occurs and thereby results from alternative splicing.

請求項１の方法によって同定された化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物。
A composition comprising a compound identified by the method of claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier.