JP2006346626A - 反応チップ - Google Patents

Abstract

【課題】 サンプル液が微細な流路を通る際、気泡の影響を受けることなくスムーズに流路を流れ、流路の途中に分岐点があっても均等に分岐して流れて行くような反応チップを提供すること。
【解決手段】 サンプル液を収容する収容用ウェル３と、この収容用ウェル３に収容されたサンプル液を送液する送液流路５と、この送液流路５を通って送液されるサンプル液と試料とを反応させる反応用ウェル４と、この反応用ウェル４の下流で外部と繋がる開口部１７とを設けた基板２を有する反応チップ１であって、基板２に収容用ウェル３と送液流路５と反応用ウェル４とを覆い、且つ開口部１７を開口させるようにしてシート材１６を設け、開口部１７と反応用ウェル４との間に疎水性フィルター８を設けた。
【選択図】 図１

Description

本発明は、ＤＮＡ同士の結合、その他の化合物の結合などを反応チップ上で行う際、各反応部に均等にサンプル液を充填できるような構造を持つ反応チップに関するものである。

従来の反応チップの中には、サンプル液が流路上を流れて分岐していくようなタイプのものがあり、例えば、ブロックを、平坦な表面を互いに接合させた第１及び第２の基板を以って構成し、反応場、供給流路及び回収流路をこれらの基板の接合面に形成し、供給流路及び回収流路を外部へ連通させる供給用開口及び回収用開口を形成したものが開示されている（特許文献１参照）。
特開２００２−２４３７３４号公報

上記のような流路及びウェルが被覆状態とされた反応チップにサンプル液を送液しようとする場合、流路及びウェル内でサンプル液と流路内の気体との置き換えがスムーズに行われなければならない。しかし、わずかな開口では微細な流路や小さいウェル内では、サンプル液と気体との置き換えがスムーズに行われず、うまく送液できないことがある。一度、気泡が詰まって流動できなくなったサンプル液は、その先にはなかなか流れて行かないため、流れやすい流路のみに次々と流れて行ってしまう。そのため、各流路及び反応部にサンプル液が均等に流れないという問題があった。

本発明は、このような事情を考慮してなされたもので、サンプル液が微細な流路を通る際、気泡の影響を受けることなくスムーズに流路を流れ、流路の途中に分岐点があっても均等に分岐して流れて行くような反応チップを提供することを目的とする。

そこで、本発明において上記目的を達成するために、まず請求項１に係る発明は、サンプル液を収容する収容部と、この収容部に収容されたサンプル液を送液する流路と、この流路を通って送液されるサンプル液と試料とを反応させる反応部と、この反応部の下流で外部と繋がる開口部とを設けた基板を有する反応チップであって、基板に収容部と流路と反応部とを覆い、且つ開口部を開口させるようにして被覆材を設け、開口部と反応部との間に疎水性フィルターを設けたこと特徴とする。

請求項２記載の発明は、請求項１に係る発明において、基板には、表面処理が施されていることを特徴とする。

請求項１記載の発明によれば、反応部と開口部との間に疎水性フィルターが設けられているので、収容部、流路及び反応部内の空気を外部へと逃がすことができる。したがって、気泡の影響を受けることなく、サンプル液が流路内をスムーズに流れることができ、各流路及び反応部へサンプル液を均等に送液することができる。また、反応部内のサンプル液が気泡の含まれないものとなるため、高い検出結果を得ることができる。

請求項２記載の発明によれば、基板に表面処理が施されるので、サンプル液と空気との入れ替えがスムーズに行われ、サンプル液に含まれた気泡が流路に詰まり難くなる。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。
図１は、本発明における一実施形態を示す図であって、本発明を適用した反応チップ１の構成図を示すものである。この反応チップ１は、略長方形の板状の基板２に、サンプル液を収容する収容用ウェル（収容部）３と、サンプル液及び試料を反応させるための複数の反応用ウェル（反応部）４とを有し、これら複数の反応用ウェル４と収容用ウェル３とは、互いを連結すべく分岐を繰り返した送液流路（流路）５によって連結されている。そして、各反応用ウェル４に対応し、各々の下流に位置する開口用ウェル１８は、溝部６によって各反応用ウェル４と連結されている。

基板２は、所定の厚みを有して長方形状に形成されている。この基板２は、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）などの樹脂が用いられる。このような合成樹脂を用いて基板２を作成すれば、耐熱性、耐薬品性、成形加工性などに優れているため好ましい。また、基板２の素材としてガラスを用いてもよい。

このような基板２の長手方向一端側の中央部に、厚さ方向に凹む円形状の収容用ウェル３が設けられており、サンプル液を収容するものである。この収容用ウェル３は、樹脂切削、或いは、樹脂成型によって形成される。基板２として、例えば、ポリカーボネート（ＰＣ）などのような硬質の樹脂が用いられている場合には、樹脂切削法による形成が好ましい。一方、基板２が、例えばポリプロピレン（ＰＰ）などの軟質な材料を用いて構成されている場合には、樹脂成型法による形成が好ましい。したがって、その形成方法は、基板２の材質によって適宜選択される。
なお、収容用ウェル３の形状は、検出に用いられるサンプル液を充分に収容可能な大きさとなっていればその形状は問わないが、加工の施し易い円形状が好ましい。

収容用ウェル３には、収容用ウェル３内に収容されるサンプル液を送液するための送液流路５が連結されている。この送液流路５は、収容用ウェル３と同じ深さで、基板２の長手方向他端側へ向かって分岐を繰り返して形成されている。詳しくは、収容用ウェル３の一端から基板２の長手方向に沿って伸びる流路９と、その末端の第１分岐点１０から２股に分岐し、互いに相反すべく基板２の幅方向両側に延出し、途中位置から基板２の長手方向に沿う姿勢で基板２の長手方向他端側へと形成される第１分岐流路１１と、各第１分岐流路１１の末端の第２分岐点１２からさらに２股に分岐して、第１分岐流路１１と同様に形成される第２分岐流路１３と、これら各第２分岐流路１３の末端の最終分岐点１４からさらにまた２股に分岐して、第１分岐流路１１及び第２分岐流路１３と同様に形成される最終分岐流路１５とから送液流路５が構成されている。

このように、送液流路５は、収容用ウェル３の一端から基板２の長手方向に沿うとともに、基板２の長手方向他端側へ向かって数回の分岐を繰り返して構成されている。これによって、サンプル液が各分岐流路１１，１３を均等に流れて最終分岐流路１５に達したときには、検出に必要な量となったサンプル液が送液されるようになっている。
したがって、送液流路５の分岐の回数は、送液すべきサンプル液の量によって設定される。また、反応用ウェル４一つ一つを、最終的に独立した流路１５上に作ることで、試料を予め反応用ウェル４に保持させておく場合、送液後の試料のコンタミネーションを防ぐことができる。

そして、各最終分岐流路１５の末端には、サンプル液と試料とを反応させる反応用ウェル４がそれぞれ設けられている。この反応用ウェル４は、平面視円形状を呈してなり、検出を行うのに充分な深さを有して形成されている。このとき、上記収容用ウェル３及び送液流路５と同じ深さに形成してもよいが、これらの深さより深く設定してもよい。これにより、試料を予め反応用ウェル４内に保持させておく際、試料を反応用ウェル４内に確実に保持させておくことが可能となる。
また、基板２に反応用ウェル４を形成する際には、上記収容用ウェル３と同様、樹脂切削、或いは、樹脂成型によって形成される。

各反応用ウェル４には、図１に示すように、送液流路５とは反対側に伸びる溝部６がそれぞれ形成されている。これら各溝部６は、所定の長さで基板２の長手方向に沿って形成されており、各々の末端には、平面視略円形状を呈する開口用ウェル１８が形成されている。このような開口用ウェル１８及び溝部６は、上記収容用ウェル３及び反応用ウェル４と同様、樹脂切削、或いは、樹脂成型によって形成される。

このような基板２には、サンプル液が送液流路５内をスムーズに流動できるように、表面処理が施行される。表面処理としては、プラズマ処理、コロナ処理や、バフ処理など各親水化処理が挙げられる。基板２に表面処理を施すことにより、収容用ウェル３から反応用ウェル４内にサンプル液を送液する際、送液流路５をつたわって速やかに流動するようになるため充填しやすく、さらに、基板２内の空気がうまく逃げていき、サンプル液内に気泡が混入してしまうことがなくなる。

このように形成される基板２の溝部６には、その一部を埋めるようにして、疎水性フィルター８が設けられている。より詳しくは、図１に示すように、反応用ウェル４及び開口用ウェル１８から所定の距離をおいた溝部６の中央部分に設けられる。疎水性フィルター８には、耐久性がよく、化学的に不活性な基材であって、薄片、破片等が生じる虞のない材料が好ましく、ここでは高密度ポリエチレンが用いられる。

実際に、この高密度ポリエチレンを疎水性フィルター８として用いる場合には、予め、先端の細いピンセット等で細かく砕いておく。そして、細かく砕かれた高密度ポリエチレンを各溝部６の上に載せて隙間なく押し詰めるようにして設けることで疎水性フィルター８が構成される。このとき、疎水性フィルター８を溝部６から基板２の表面にはみ出すようにして設け、図２に示すように、粘着テープ２０で基板２の表面に固定する。疎水性フィルター８を設ける範囲としては、長さ８ｍｍ、幅２ｍｍ程度が好ましい。

このように、疎水性フィルター８を溝部６からはみ出すようにして設けることにより、溝部６内に完全に疎水性フィルター８が詰まっている状態とすることができる。また、粘着テープ２０によって基板２に固定し易くなるためよい。
なお、疎水性フィルター８を設ける際、ミクロスパーテル等の柄の部分を押し当てた後、親指等で強く押し詰めることによって溝部６内に隙間なく埋められる。

そして、基板２に、疎水性フィルター８を設けた後、この基板２の一部を被覆するようにしてシート材（被覆材）１６が設けられる。シート材１６は、基板２に沿って長方形状を呈しており、その長手方向長さは、基板２よりも短く形成されている。そして、シート材１６は、収容用ウェル３、送液流路５及び反応用ウェル４を覆い、且つ、開口用ウェル１８を被覆しないようにして、基板２の表面に接着させて設けられる。詳しくは、シート材１６を基板２の長手方向一側、すなわち、収容用ウェル３側に偏って配置させ、シート材１６を反応用ウェル４側の溝部６の一部と疎水性フィルター８とを完全に被覆するようにして設けられる。
なお、シート材１６は、開口用ウェル１８を覆わなければ、溝部６の全体を完全に被覆するようにして設けてもよい。

シート材１６の接着方法としては、シート材１６の裏面に接着剤を塗布して基板２に接着させてもよいし、基板２の表面及び疎水性フィルター８を固定している粘着テープ２０の上に接着剤を塗布してシート材１６を接着させてもよい。または、裏面側にヒートシール材が付いたシート材１６を基板２上に載置させ、その上からヒートシールしてもよい。その場合、収容用ウェル３、送液流路５、反応用ウェル４及び一部の溝部６の外枠のみに熱をかけてもよいし、基板２の表面全体に熱をかけてもよい。さらに、別の方法としては、予め、温めておいた基板２の表面にシート材１６を載置させ、その上から圧力をかけることで接着してもよい。また、シート材１６の各側縁を基板２に粘着テープ２０等で固定してもよい。

上記のいずれかの方法でシート材１６を基板２に設けることによって、収容用ウェル３、送液流路５、反応用ウェル４、溝部６の一部及び疎水性フィルター８は、略密閉された状態となる。但し、開口用ウェル１８は、シート材１６で被覆しないでおくため、開口用ウェル１８が外部へと繋がる開口部１７とされる。

次に、上述したように構成される反応チップ１に、サンプル液を注入する場合について述べる。
サンプル液は、例えば、ピペットマンやシリンジ等を用いて反応用ウェル４内に注入される。この場合、反応用ウェル４はシート材１６で被覆されているので、ピペットマンや針の先端で収容用ウェル３上のシート材１６を突き破り、ピペットマンやシリンジを収容用ウェル３に押し当てた状態でサンプル液を反応用ウェル４内へ圧入させる。このように、ピペットマンやシリンジ等でサンプル液を圧入させることによって、同時に、サンプル液が収容用ウェル３から送液流路５を通って反応用ウェル４へと送液される。また、ピペットマンやシリンジ等で、収容ウェル３にサンプル液を注入後、シート材１６の穴のあいた部分を粘着テープ２０等で覆い、その上から圧力をかけることによりサンプル液を反応用ウェル４内に注入してもよい。

サンプル液は、疎水性フィルター８を通過することができないため、疎水性フィルター８によって溝部６内でせき止められるが、空気は疎水性フィルター８を通過する。これにより、基板２内の空気が開口用ウェル１８の開口部１７から逃げることができ、収容用ウェル３、送液流路５及び反応用ウェル４内の空気とサンプル液との置き換えをスムーズに行うことができる。このように、疎水性フィルター８を設けて基板２内の空気を逃がすことによって、サンプル液内に気泡が含まれることを防ぐことができる。
また、開口用ウェル１８を設けておくことにより、送液したサンプル液が万が一、疎水性フィルター８を通過してしまった場合でも、多少の量であれば、基板２の表面や外部に漏れ出すことなく、開口用ウェル１８内に留めることができるのでよい。

また、溝部６を幅広に形成するか、或いは、その長手方向長さを少し長めに形成するなどして、疎水性フィルター８から漏れ出したサンプル液を溝部６内で留めることのできる形状にし、開口用ウェル１８の代替となるようにしてもよい。この場合、反応用ウェル４の下流であって、さらに疎水性フィルター８よりも下流となる溝部６の一部が、外部へと繋がる開口部１７となる。

なお、上記においては、疎水性フィルター８を完全に被覆するようにしてシート材１６を設けているが、疎水性フィルター８の端部を被覆しないようにシート材１６を設けてもよい。この場合、疎水性フィルター８の端部が外部へと繋がる開口部１７となる。
さらに、上述したような開口部１７は、サンプル液の注入と同時に、基板２内の空気をスムーズに外部へと逃がすことのできる大きさに設定される。

このように、反応用ウェル４と開口用ウェル１８との間に疎水性フィルター８が設けられているので、収容用ウェル３、送液流路５及び反応用ウェル４内の空気を外部へと逃がすことができる。したがって、気泡の影響を受けることなく、サンプル液が送液流路５内をスムーズに流れるので、送液流路５の途中に分岐点があっても、各分岐流路１１，１３，１５及び反応用ウェル４へサンプル液を均等に送液することができる。また、反応用ウェル４内のサンプル液が気泡の含まれないものとなるため、高い検出結果を得ることができる。

また、基板２には、上記したいずれかの親水化処理による表面処理が施されているので、サンプル液と空気との入れ替えがスムーズに行われ、サンプル液に含まれた気泡が送液流路５に詰まり難くなる。

なお、溝部６の深さは、反応用ウェル４と同様の深さで形成してもよいが、反応用ウェル４よりも浅く設定することも可能である。これにより、反応用ウェル４からの反応液の流入を抑えながら反応用ウェル４内の空気を逃がすことができる。

本発明の反応チップ１は、例えば、抗原抗体反応及びＤＮＡ反応の検出などに用いることができる。
抗原抗体反応による抗原検出の場合、例えば、予め反応チップ１の各反応用ウェル４内に認識物質として抗原を含む試料を入れておき、後から検出物質として抗体を含むサンプル液を添加し、認識物質または、検出物質のいずれかに標識物質を付けておくことで、反応の有無を検出できる。標識物質としては、蛍光などの発光物質が一般的に用いられる。発光物質の発光が可視光の場合、反応用ウェル４の上部又は下部から検出するため、反応チップ１又はシール材１６、粘着テープ２０は、透明であることが好ましい。

ＤＮＡの検出の場合、例えば、予め反応チップ１の反応用ウェル４内に認識物質として核酸プローブを用意しておき、その後、血液等から抽出したＤＮＡを検体物質とし、ハイブリダイゼーションさせることにより、ＤＮＡの検出を行うことができる。その際、検出物質または認識物質のいずれかに標識物質を付けておけば、その標識物質の有無を検出することにより検出が可能となる。また、認識物質である核酸プローブとして配列の異なる核酸を複数用意することで検体物質としてのＤＮＡがどのような配列であるかを検出することができる。さらに、反応チップ１は、一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）の解析にも用いることができる。

なお、認識物質は複数あってもよく、検出物質が蛍光標識されていない場合には、認識物質のひとつが標識されていればよい。このように、複数の認識物質からなる場合には認識物質を複数種用意し、多段階反応を行ってＳＮＰを検出する場合にも、反応チップ１を用いることが可能である。さらに、反応チップ１は、ＤＮＡ同士の結合に限らず、有機合成や環境分析などにも利用が可能である。また、認識物質は反応用ウェル４内に固定してもよいし、固定させずに保持させておくだけでもよい。

また、検出方法は、蛍光検出に限った方法だけでなく、比色、化学発光、沈殿、発熱法等も利用することができる。

次に、上述した反応チップ１を実際に試験に用いる場合について、説明する。

図１に示すように、三菱樹脂株式会社製の厚さ２ｍｍのポリカーボネートの基板２に、機械的切削加工により、収容用ウェル３、反応用ウェル４及びこれらを繋ぐ送液流路５、さらに、反応用ウェル４と開口用ウェル１８とを繋ぐ溝部６を形成した。そして、反応用ウェル４の下流の溝部６に疎水性フィルター８を設けることになるが、この疎水性フィルター８としては、例えば、ピペットチップにコンタミネーションを防ぐ目的で付いているような、疎水性の高密度ポリエチレンフィルターをピンセットで細かく砕き、ミクロスパーテルの柄の部分で溝部６に押し当てるようにして埋め込んだ。疎水性フィルター８の大きさは、１つの流路あたり８ｍｍ×２ｍｍ位の大きさにし、溝部６の両脇にも溢れ出るようにして押し詰めた後、疎水性フィルター８を基板２に固定すべく、上方から粘着テープ２０を貼着させた。このように、溝部６内には完全に疎水性フィルター８が詰まっている状態にする。次に、開口用ウェル１８は被覆しないようにして基板２上からＰＥＴ１２／ＤＬ／ＡＢＦ６５Ｃなるシート材１６を載置させ、粘着テープ２０で基板２に固定した。そして、ピペットマンでプロモフェノールブルー水溶液を吸い上げ、ピペットチップの先で収容用ウェル３上のシート材１６を突き破り、収容用ウェル３に押し当ててプロモフェノールブルー水溶液を注入し、送液させた。

（比較例１）
厚さ２ｍｍのポリカーボネートの基板２に、実施例と同様に機械的切削加工を施して収容用ウェル３、反応用ウェル４、開口用ウェル１８、送液流路５及び溝部６を形成した後、基板２の表面全体を覆うようにしてＰＥＴ１２／ＤＬ／ＡＢＦ６５Ｃからなるシート材１６を載置させ、粘着テープ２０によって基板２と固定した。
そして、上記実施例と同様の方法でプロモフェノールブルー水溶液を吸い上げ、ピペットチップの先で収容用ウェル３上のシート材１６を突き破り、収容用ウェル３に押し当ててプロモフェノールブルー水溶液を注入し送液させた。

以上の実験結果は、以下のようになった。
実験例１の方法により、サンプル液を送液することで、サンプル液が疎水性フィルター８を通過することなく疎水性フィルター８で留まり、反応用ウェル４内に均等に送液することが出来た。

本発明における一実施形態の反応チップを示す平面図である。 本発明における一実施形態の反応チップを示す断面図である。

符号の説明

１ 反応チップ
２ 基板
３ 収容用ウェル（収容部）
４ 反応用ウェル（反応部）
５ 送液流路（流路）
８ 疎水性フィルター
１６ シート材（被覆材）
１７ 開口部

Claims (2)

1. サンプル液を収容する収容部と、
   該収容部に収容された前記サンプル液を送液する流路と、
   該流路を通って送液される前記サンプル液と試料とを反応させる反応部と、
   該反応部の下流で外部と繋がる開口部とを設けた基板を有する反応チップであって、
   前記基板に前記収容部と前記流路と前記反応部とを覆い、且つ前記開口部を開口させるようにして被覆材を設け、
   前記開口部と前記反応部との間に疎水性フィルターを設けたこと特徴とする反応チップ。
2. 前記基板には、表面処理が施されていることを特徴とする請求項１記載の反応チップ。

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