JP2006340604A - 糖尿病性網膜症・腎症モデル動物 - Google Patents
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Abstract
【課題】カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２の常時活性化が起こった場合に引き起こされる糖尿病の発症機構の解明および糖尿病合併症の治療薬をスクリーニングするために有用な糖尿病合併症を発症するモデル哺乳動物を提供すること。
【解決手段】
ラットインスリン遺伝子プロモーターの下流に、１アミノ酸置換変異カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２をコードする遺伝子、ポリＡ付加−ＳＶ４０遺伝子の２者を接続した融合遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの卵管内に移植し、その後被移植動物を飼育して産まれた仔マウスから前記導入遺伝子を有する仔マウスをトランスジェニックマウスとして選択し、これを数ヶ月飼育することにより糖尿病合併症を発症させることができる。
【選択図】なし
【解決手段】
ラットインスリン遺伝子プロモーターの下流に、１アミノ酸置換変異カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２をコードする遺伝子、ポリＡ付加−ＳＶ４０遺伝子の２者を接続した融合遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの卵管内に移植し、その後被移植動物を飼育して産まれた仔マウスから前記導入遺伝子を有する仔マウスをトランスジェニックマウスとして選択し、これを数ヶ月飼育することにより糖尿病合併症を発症させることができる。
【選択図】なし
Description
本発明は、糖尿病合併症の病態モデル動物に関し、さらに詳しくは、インスリンプロモーター、変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡ、ＳＶ４０−ポリＡシグナルの順に配列された遺伝子が導入されたことで早期に糖尿病を発症し、さらに糖尿病性網膜症・腎症などの糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物、該動物の創製方法並び該動物用いる糖尿病合併症の治療薬のスクリーニング方法に関する。
日本国内の糖尿病患者数は増加の一途をたどり、最新の厚生省統計では推定罹患人口は、７００万人に達する。全世界では現在５０００万人、近い将来は１億人に達すると予想されている。これに伴い糖尿病合併症でクオリティ・オブ・ライフ（quality of life：QOL）が著しく損なわれる患者数も急増している。糖尿病合併症の中でも、血管合併症である糖尿病性腎症、糖尿病網膜症、糖尿病性神経障害は３大合併症と称されている。糖尿病性腎症や糖尿病網膜症の治療としては、透析療法・光凝固療法が主に行われているがそれらはあくまで対症療法であり、未だその根本的治療法は確立していないのが現状である。
一方、遺伝子組み換えによる糖尿病モデル動物に関しては、例えばアンチセンス・グルコキナーゼ遺伝子を染色体に取り込んだ糖尿病モデルマウス（特許文献１）、ヒトインスリン遺伝子プロモーターと、かかるプロモーターの下部に付着される熱衝撃蛋白質７０遺伝子が融合された糖尿病発生遺伝子をマウスに導入した糖尿病発症トランスジェニックマウス（特許文献２）、母親性の発現を示すインプリンティング遺伝子であるＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が導入されたトラスジェニック非ヒト哺乳動物（特許文献３）等が提案されている。
他方，カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２（ＣａＭキナーゼ２：ＣａＭＫ２）は、１９８０年にラット脳において神経伝達物質の一つであるセロトニン生合成の律速酵素であるトリプトファンヒドロキシラーゼを活性化する新しいタイプのカルモジュリン依存性リン酸化酵素として発見された酵素である。この酵素は、通常、Ｃａ２＋濃度依存的に活性化され、インスリン分泌反応において重要な役割を果たす。この酵素の１アミノ酸変異体（２８６番目のスレオニンがアスパラギン酸に置換）は、カルシウム非依存で常時活性化されることが知られている（非特許文献１）。
特開平６−２９２４８５
特開平９−２８３８４
特開２００１−１１２３７３
Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．８１，８９１−９０４，１９９５
他方，カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２（ＣａＭキナーゼ２：ＣａＭＫ２）は、１９８０年にラット脳において神経伝達物質の一つであるセロトニン生合成の律速酵素であるトリプトファンヒドロキシラーゼを活性化する新しいタイプのカルモジュリン依存性リン酸化酵素として発見された酵素である。この酵素は、通常、Ｃａ２＋濃度依存的に活性化され、インスリン分泌反応において重要な役割を果たす。この酵素の１アミノ酸変異体（２８６番目のスレオニンがアスパラギン酸に置換）は、カルシウム非依存で常時活性化されることが知られている（非特許文献１）。
糖尿病は、インスリン依存性の１型糖尿病とインスリン抵抗性の２型糖尿病に分けられるが、いずれも高血糖を放置すると網膜症や腎症など合併症を発症する。
糖尿病性腎症や糖尿病網膜症の最適なモデル動物を開発し、糖尿病合併症の治療・予防への応用を図ることは、科学的重要性と社会的緊急性とを併せ持つ。
本発明の目的は、カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２の常時活性化が起こった場合に引き起こされる糖尿病発症機構の解明および糖尿病合併症発症モデル動物の創製並びに糖尿病合併症発症モデル動物を用いた糖尿病性腎症・糖尿病網膜症・糖尿病神経障害等の糖尿病合併症の治療薬をスクリーニングするための方法の構築である。
糖尿病性腎症や糖尿病網膜症の最適なモデル動物を開発し、糖尿病合併症の治療・予防への応用を図ることは、科学的重要性と社会的緊急性とを併せ持つ。
本発明の目的は、カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２の常時活性化が起こった場合に引き起こされる糖尿病発症機構の解明および糖尿病合併症発症モデル動物の創製並びに糖尿病合併症発症モデル動物を用いた糖尿病性腎症・糖尿病網膜症・糖尿病神経障害等の糖尿病合併症の治療薬をスクリーニングするための方法の構築である。
高血糖状態の膵臓ランゲルハンス島β細胞では，カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２の活性化が持続していることが推定される。そこで本発明者らは、カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２変異体のタンパク質をコードするｃＤＮＡをインスリンプロモーターの下流に含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することを特徴とするトランスジェニックマウスを創製した。さらに、本発明者らは研究を進め、今般創製したトランスジェニックマウスが、生後２〜３週間で劇症型の糖尿病を１００％発症すること、さらに４ヶ月程度飼育することで、糖尿病性腎症および糖尿病網膜症を発症することを見出し、本発明を完成した。
以下、本発明を詳細に説明する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用されるインスリンプロモーターは、特に限定されないが、例えば、げっ歯類、とりわけ、ラットのインスリンプロモーターが好ましい。また、インスリンプロモーターは、例えば、肝臓由来ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で調製すればよい。具体的なものとして、例えば、ラットインシュリン２遺伝子から得られるプロモーター（配列番号１）が挙げられる。
本発明で使用される変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２は、この酵素の１アミノ酸変異体であり、２８６番目のスレオニンがアスパラギン酸に置換したものである。具体的なものとして、例えば、配列番号３のアミノ酸配列のタンパク質が挙げられる。
この酵素のＤＮＡは、例えば、ＣＤ１マウス脳由来のＤＮＡを２つのＤＮＡ断片に分けて、それぞれを鋳型としてＰＣＲ法で増幅し、得られた各々のＰＣＲ産物をプラスミドに導入後、通常知られた方法で調製すればよい。具体的なものとして、例えば、配列番号２のＤＮＡ配列が挙げられる。
この酵素のＤＮＡは、例えば、ＣＤ１マウス脳由来のＤＮＡを２つのＤＮＡ断片に分けて、それぞれを鋳型としてＰＣＲ法で増幅し、得られた各々のＰＣＲ産物をプラスミドに導入後、通常知られた方法で調製すればよい。具体的なものとして、例えば、配列番号２のＤＮＡ配列が挙げられる。
本発明で使用されるインスリンプロモーター、変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡ、ＳＶ４０−ポリＡシグナルの順に配列された遺伝子は、例えば、変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡおよびＳＶ−４０が導入されたプラスミドから、導入用のＤＮＡ断片を切り出し、それらを通常知られた方法で連結したＤＮＡを有するプラスミドを得、さらにこのプラスミドとインスリンプロモーターを有するプラスミドを用いて、通常知られた方法により調製すればよい。具体的なものとして、例えば、配列番号５のＤＮＡ配列の遺伝子が挙げられる。また、ＳＶ４０−ポリＡシグナルとしては、例えば、配列番号４のＤＮＡ配列が挙げられる。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、例えばげっ歯類等の非ヒト哺乳動物の受精卵にインスリンプロモーター、変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡ、ＳＶ４０−ポリＡシグナルの順に配列された遺伝子を導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、当該非ヒト哺乳動物からインスリンプロモーター、変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡ、ＳＶ４０−ポリＡシグナルの順に配列された遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物を分娩させることにより創製することができる。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット等げっ歯類；ウサギ等の哺乳動物を例示することができるが、創製、育成、使用の簡便さ等からしてマウスが好ましい。また、受精卵への遺伝子の導入方法は特に限定されるものではなく、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法等を例示することができる。
トランスジェニック非ヒト哺乳動物がトランスジェニックマウスの場合を例に挙げてより具体的に説明すると、ラットインスリンプロモーター、変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のタンパク質をコードするｃＤＮＡ、ＳＶ４０−ポリＡシグナルの順に配列した導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することよりトランスジェニックマウスを創製することができる。上記マウスの受精卵としては、特に限定されないが、例えば、ＢＤＦ１マウスの受精卵を用いることが好ましい。また、注入する導入遺伝子の数は受精卵１個当たり１００〜３０００分子が適当である。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、例えば、マウスの尻尾等よりＤＮＡを抽出し、ラットインスリン遺伝子の配列の一部およびカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２に相補的な配列をプライマーとするＰＣＲ法で増幅し、導入遺伝子を確認しながら選択するればよい。ここで選択されたマウスを初代として飼育し、例えば、ＣＤ１マウスと交配して弟２世代マウスを得ることができる。
本発明の糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いる糖尿病網膜症および／または糖尿病腎症等の糖尿病合併症の治療薬をスクリーニングする方法としては、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えば雄のトランスジェニックマウスに、被検物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られた尿の尿糖値や、眼球の付け根部分や尻尾などから採血した血液の血糖値等の測定や生存率等を検討することにより、該被検物質の糖尿病治療効果を評価することができる。
[実施例]
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により何ら制限されるものではない。
実施例１
（ラットインスリンプロモーターの調製）
ラットインスリン２遺伝子のプロモーターDNA断片は、Wistar ラット肝臓由来ゲノムDNAを鋳型としてＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法で 論文 [Lomedico et al., セル（Cell）18巻、545-558頁、1979年]中のDNA配列を参考にして723bpを増幅して得られた。用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、その中にBamHI認識配列およびXmaI認識配列を形成するように修飾した以下のものを用いた。
5’-AAGGATCCCCCCAACCACTCCAAGTGG-3’（配列番号6),
5’-TACCCGGGTAGCTGGTCACTTAGGGCTG-3’（配列番号7)
得られたPCR産物をBamHIおよびXmaIで消化後、プラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）の当該制限酵素部位に導入した。
得られたラットインスリン２遺伝子DNA断片の遺伝子配列（BamHI-XmaI断片723 bp）を配列番号1に示す。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により何ら制限されるものではない。
実施例１
（ラットインスリンプロモーターの調製）
ラットインスリン２遺伝子のプロモーターDNA断片は、Wistar ラット肝臓由来ゲノムDNAを鋳型としてＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法で 論文 [Lomedico et al., セル（Cell）18巻、545-558頁、1979年]中のDNA配列を参考にして723bpを増幅して得られた。用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、その中にBamHI認識配列およびXmaI認識配列を形成するように修飾した以下のものを用いた。
5’-AAGGATCCCCCCAACCACTCCAAGTGG-3’（配列番号6),
5’-TACCCGGGTAGCTGGTCACTTAGGGCTG-3’（配列番号7)
得られたPCR産物をBamHIおよびXmaIで消化後、プラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）の当該制限酵素部位に導入した。
得られたラットインスリン２遺伝子DNA断片の遺伝子配列（BamHI-XmaI断片723 bp）を配列番号1に示す。
実施例２
（変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡの調製）
アミノ酸変異型（286番目のスレオニンがアスパラギン酸に置換された）カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αをコードするDNA断片は、ＣＤ１マウス脳由来complementary DNAを鋳型としてＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法で 論文 [Mayford et al., セル（Cell）81巻、891-904頁、1995年] を参考にして2つのDNA断片（A fragment, B fragment）に分けて増幅して得られた。
A fragmentの増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、その中にXmaI認識配列およびAatII認識配列を形成するように修飾した以下のものを用いた。
5’-TTCCCGGGTACCCCTGCCTGCCCAGTGCCA-3’（配列番号8）,
5’-TCGACGTCCTCCTGTCTGTGCATGCAGGAA-3’（配列番号9）
得られたPCR産物（A fragment）を末端がT（１塩基）突出したプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）に導入した。
B fragmentの増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、その中にAatII認識配列およびBamHI認識配列を形成するように修飾した以下のものを用いた。
5’-AGGACGTCGACTGCCTGAAGAAGTTCAATG-3’（配列番号10),
5’-TTGGATCCCGTCAATGCGGCAGGACGGAGG-3’（配列番号11)
得られたPCR産物（B fragment）を末端がT（１塩基）突出したプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）に導入した。
A fragmentを導入したプラスミドをXmaIおよびAatIIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片、B fragmentを導入したプラスミドをAatIIおよびBamHIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片、XmaIおよびBamHIで消化済みのプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）の３者を等モル比にて混合し、３者が連結したDNAを作製した。
得られたカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αをコードするDNA断片は、PCR法による制限酵素部位AatII導入により本来の遺伝子とは異なり286番目のスレオニンがアスパラギン酸に置換されたキナーゼをコードする。
得られた変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αDNA断片の遺伝子配列（XmaI-BamHI断片1475 bp）を配列番号2に示す。
また、配列番号2のＤＮＡがコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号3に示す。
（変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡの調製）
アミノ酸変異型（286番目のスレオニンがアスパラギン酸に置換された）カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αをコードするDNA断片は、ＣＤ１マウス脳由来complementary DNAを鋳型としてＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法で 論文 [Mayford et al., セル（Cell）81巻、891-904頁、1995年] を参考にして2つのDNA断片（A fragment, B fragment）に分けて増幅して得られた。
A fragmentの増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、その中にXmaI認識配列およびAatII認識配列を形成するように修飾した以下のものを用いた。
5’-TTCCCGGGTACCCCTGCCTGCCCAGTGCCA-3’（配列番号8）,
5’-TCGACGTCCTCCTGTCTGTGCATGCAGGAA-3’（配列番号9）
得られたPCR産物（A fragment）を末端がT（１塩基）突出したプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）に導入した。
B fragmentの増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、その中にAatII認識配列およびBamHI認識配列を形成するように修飾した以下のものを用いた。
5’-AGGACGTCGACTGCCTGAAGAAGTTCAATG-3’（配列番号10),
5’-TTGGATCCCGTCAATGCGGCAGGACGGAGG-3’（配列番号11)
得られたPCR産物（B fragment）を末端がT（１塩基）突出したプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）に導入した。
A fragmentを導入したプラスミドをXmaIおよびAatIIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片、B fragmentを導入したプラスミドをAatIIおよびBamHIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片、XmaIおよびBamHIで消化済みのプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）の３者を等モル比にて混合し、３者が連結したDNAを作製した。
得られたカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αをコードするDNA断片は、PCR法による制限酵素部位AatII導入により本来の遺伝子とは異なり286番目のスレオニンがアスパラギン酸に置換されたキナーゼをコードする。
得られた変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αDNA断片の遺伝子配列（XmaI-BamHI断片1475 bp）を配列番号2に示す。
また、配列番号2のＤＮＡがコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号3に示す。
実施例３
（インスリンプロモーター／変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２／ＳＶ４０−ポリＡ含有ＤＮＡの調製）
変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αDNA断片を導入したプラスミドをXmaIおよびBamHIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片（XmaI-BamHI断片1475 bp）、ポリＡ付加シグナルおよびイントロンを含むＳＶ４０遺伝子をBglIIおよびEcoRIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片（BglII-EcoRI断片1604 bp、配列番号4）、XmaIおよびEcoRIで消化済みのプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）の３者を等モル比にて混合し、３者が連結したDNAを作製した。
さらに、ラットインスリン２遺伝子DNA断片を導入したプラスミドをXmaIおよびBamHIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片（BamHI-XmaI断片723 bp）、変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αDNAとＳＶ４０遺伝子を導入したプラスミドをXmaIおよびEcoRIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片（XmaI-EcoRI断片3073 bp）、BamHIおよびEcoRIで消化済みのプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）の３者を等モル比にて混合し、３者が連結した融合DNAを持つプラスミドを作製した。このプラスミド内部には5’端から、ラットインスリン２遺伝子DNA、変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αDNA、ＳＶ４０遺伝子が順に接続されており、全3790 bpのインサートを持つ。この融合遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号5に示す。
（インスリンプロモーター／変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２／ＳＶ４０−ポリＡ含有ＤＮＡの調製）
変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αDNA断片を導入したプラスミドをXmaIおよびBamHIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片（XmaI-BamHI断片1475 bp）、ポリＡ付加シグナルおよびイントロンを含むＳＶ４０遺伝子をBglIIおよびEcoRIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片（BglII-EcoRI断片1604 bp、配列番号4）、XmaIおよびEcoRIで消化済みのプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）の３者を等モル比にて混合し、３者が連結したDNAを作製した。
さらに、ラットインスリン２遺伝子DNA断片を導入したプラスミドをXmaIおよびBamHIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片（BamHI-XmaI断片723 bp）、変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αDNAとＳＶ４０遺伝子を導入したプラスミドをXmaIおよびEcoRIで消化したのちにゲルで切り出したinsert DNA断片（XmaI-EcoRI断片3073 bp）、BamHIおよびEcoRIで消化済みのプラスミド（pBlueScript SK-：米国Stratagene社）の３者を等モル比にて混合し、３者が連結した融合DNAを持つプラスミドを作製した。このプラスミド内部には5’端から、ラットインスリン２遺伝子DNA、変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２αDNA、ＳＶ４０遺伝子が順に接続されており、全3790 bpのインサートを持つ。この融合遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号5に示す。
実施例４
（導入遺伝子の調製）
配列番号4のDNA配列を含むプラスミドDNAを抽出した後、制限酵素NotIとSalIで切断して1.0％のアガロースゲル（Agarose gel）で電気泳動（electrophoresis）して3.8 ｋbの変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２α発現遺伝子DNAを含むアガロースゲル断片を切り出し、GeneClean Kit（Bio101社）を用いて精製した。そして、DNAの濃度が3ng/μlになるように10mM Tris-HCl(pH 7.4)/0.1mM EDTA(pH 8.0)溶液で希釈した後、マイクロインジェクションに使用した（導入遺伝子の構造を図１示す）。
（導入遺伝子の調製）
配列番号4のDNA配列を含むプラスミドDNAを抽出した後、制限酵素NotIとSalIで切断して1.0％のアガロースゲル（Agarose gel）で電気泳動（electrophoresis）して3.8 ｋbの変異型カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２α発現遺伝子DNAを含むアガロースゲル断片を切り出し、GeneClean Kit（Bio101社）を用いて精製した。そして、DNAの濃度が3ng/μlになるように10mM Tris-HCl(pH 7.4)/0.1mM EDTA(pH 8.0)溶液で希釈した後、マイクロインジェクションに使用した（導入遺伝子の構造を図１示す）。
実施例５
（トランスジェニックマウスの作製）
受精卵採取用のマウスstrainはBDF1(日本クレア社)を用いた。***促進剤投与後に交尾させた翌日の受精卵を雌マウスの卵管より採取して、極細のガラスピペットを用いて上記DNA溶液（3ng/μl）を受精卵の雄性前核に注入した。翌日までこれらの受精卵を培養したのちに自然分娩により20日後に出産させた。うまれた20匹のマウスを飼育し、4週齢で尾の一部からDNAを抽出して、PCR法により、導入遺伝子DNAの導入の有無を検査した。導入遺伝子の増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、ラットインスリン遺伝子の配列の一部、およびカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２に相補的な配列からなる以下の２本のプライマーを用いた。
5’-GTGGGCTATGGGTTTGTGGAAGGAGA-3’（配列番号12）,
5’-TTCCTCGAAGAGCTGGTACTCTTCC-3’（配列番号13）
PCRによるスクリーニングの結果、３匹がトランスジェニックマウスであることが確認された。
これらの初代トランスジェニックマウスを飼育し、CD1マウス（日本チャールス・リバー社）と交配して、第２世代（F1）マウスを得た。トランスジェニックマウス３匹ともF1マウスへの導入遺伝子の子孫伝達（Germ-line transmission）が確認され、系統化を確認した。
（トランスジェニックマウスの作製）
受精卵採取用のマウスstrainはBDF1(日本クレア社)を用いた。***促進剤投与後に交尾させた翌日の受精卵を雌マウスの卵管より採取して、極細のガラスピペットを用いて上記DNA溶液（3ng/μl）を受精卵の雄性前核に注入した。翌日までこれらの受精卵を培養したのちに自然分娩により20日後に出産させた。うまれた20匹のマウスを飼育し、4週齢で尾の一部からDNAを抽出して、PCR法により、導入遺伝子DNAの導入の有無を検査した。導入遺伝子の増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、ラットインスリン遺伝子の配列の一部、およびカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２に相補的な配列からなる以下の２本のプライマーを用いた。
5’-GTGGGCTATGGGTTTGTGGAAGGAGA-3’（配列番号12）,
5’-TTCCTCGAAGAGCTGGTACTCTTCC-3’（配列番号13）
PCRによるスクリーニングの結果、３匹がトランスジェニックマウスであることが確認された。
これらの初代トランスジェニックマウスを飼育し、CD1マウス（日本チャールス・リバー社）と交配して、第２世代（F1）マウスを得た。トランスジェニックマウス３匹ともF1マウスへの導入遺伝子の子孫伝達（Germ-line transmission）が確認され、系統化を確認した。
実施例６
（トランスジェニックマウスの性質）
F1マウスでの糖尿病発症率について血糖測定器（Accu-checkII、ロシュ・ダイアグノステイクス社）を用いて調べた。その結果、３系統のトランスジェニックマウス系列の全てがF1世代で顕性糖尿病（随時血糖400以上）を生後４週齢以内に発症した。F1世代におけるトランスジェニックマウスの糖尿病発症率は３系統とも100％であった。膵臓切片の免疫組織化学により、トランスジェニックマウス膵β細胞は抗カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２α抗体により強陽性に染色された。
（トランスジェニックマウスの性質）
F1マウスでの糖尿病発症率について血糖測定器（Accu-checkII、ロシュ・ダイアグノステイクス社）を用いて調べた。その結果、３系統のトランスジェニックマウス系列の全てがF1世代で顕性糖尿病（随時血糖400以上）を生後４週齢以内に発症した。F1世代におけるトランスジェニックマウスの糖尿病発症率は３系統とも100％であった。膵臓切片の免疫組織化学により、トランスジェニックマウス膵β細胞は抗カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２α抗体により強陽性に染色された。
生後8週齢ではトランスジェニックマウス膵ランゲルハンス島は非常に小型で、インスリン産生細胞はほとんど消滅し主にグルカゴン産生細胞により構成されており、正常の野性型マウスの膵ランゲルハンス島と比較するとその違いは明らかであった。このトランスジェニックマウスの血糖値は600-1500の高値を示し、６か月生存率は50-70％程度と低率で、極めて重症の１型糖尿病を100％発症することが明らかになった。
実施例７
（トランスジェニックマウスの糖尿病性腎症）
トランスジェニックマウス（Tgマウス）腎臓の検索により、生後20週齢ではTgマウス腎臓は３系統とも腎腫大（1.5〜2.0倍）し、PAM染色にて腎糸球体にメサンギウム基質の増生などの糸球体硬化病変を起こしておりヒト糖尿病性腎症の類似病変像を示した（図２）。同週齢の野性型マウスの腎臓糸球体像（図３）と比べるとその違いは明瞭であった。さらにトランスジェニックマウス腎臓では強度高血糖の結果生じた糸球体内グリコーゲン顆粒を反映するArmanni-Ebstein病変が確認されるとともに、その糸球体基底膜にはAGE（Advanced Glycation Endproducts）様の顆粒状沈着物が認められた。
（トランスジェニックマウスの糖尿病性腎症）
トランスジェニックマウス（Tgマウス）腎臓の検索により、生後20週齢ではTgマウス腎臓は３系統とも腎腫大（1.5〜2.0倍）し、PAM染色にて腎糸球体にメサンギウム基質の増生などの糸球体硬化病変を起こしておりヒト糖尿病性腎症の類似病変像を示した（図２）。同週齢の野性型マウスの腎臓糸球体像（図３）と比べるとその違いは明瞭であった。さらにトランスジェニックマウス腎臓では強度高血糖の結果生じた糸球体内グリコーゲン顆粒を反映するArmanni-Ebstein病変が確認されるとともに、その糸球体基底膜にはAGE（Advanced Glycation Endproducts）様の顆粒状沈着物が認められた。
実施例８
（トランスジェニックマウスの糖尿病網膜症）
生後20週齢トランスジェニックマウスマウスの網膜の病理組織切片像を解析した。その結果、Ganglion Cell Layer（GC）とOuter Nuclear Layer（ON）各神経細胞層の脱落・減少などの糖尿病性網膜症に見られる病理所見が認められた（図４）。同週齢の野性型マウスの網膜組織（図５）は各神経細胞層が正常に保たれており、その違いは明瞭に認められた。
（トランスジェニックマウスの糖尿病網膜症）
生後20週齢トランスジェニックマウスマウスの網膜の病理組織切片像を解析した。その結果、Ganglion Cell Layer（GC）とOuter Nuclear Layer（ON）各神経細胞層の脱落・減少などの糖尿病性網膜症に見られる病理所見が認められた（図４）。同週齢の野性型マウスの網膜組織（図５）は各神経細胞層が正常に保たれており、その違いは明瞭に認められた。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、とりわけ、げっ歯類であるトランスジェニックマウスは、カルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２の常時活性化が起こった場合に引き起こされる糖尿病の発症機構の解明するために有用であり、さらに本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、とりわけ、げっ歯類であるトランスジェニックマウスを化合物のスクリーニングに用いることにより、糖尿病のみならず、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症などの糖尿病合併症の治療薬をスクリーニングすることができ、糖尿病、糖尿病合併症の医薬品の開発に有用である。
Claims (18)
- インスリンプロモーター、変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡ、ＳＶ４０−ポリＡシグナルの順に配列された遺伝子が導入され、糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のＤＮＡが配列番号３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である請求項１記載の糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- インスリンプロモーターがラットインスリンプロモーターである請求項１〜２のいずれかに記載の糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- トランスジェニック非ヒト哺乳動物がげっ歯類である請求項３に記載の糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- げっ歯類がマウスである請求項４に記載の糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 生後２〜３週間で糖尿病を発症し、４〜７ヶ月で糖尿病網膜症および糖尿病性腎症を発症する請求項５記載のマウス。
- 糖尿病合併症が糖尿病網膜症および糖尿病性腎症である請求項１〜５のいずれかに記載の糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 請求項１〜７のいずれか記載の糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする糖尿病合併症治療薬のスクリーニング方法。
- 糖尿病合併症治療薬が糖尿病網膜症の治療薬および／または糖尿病性腎症の治療薬である請求項８のスクリーニング方法。
- インスリンプロモーター、変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のタンパク質をコードするｃＤＮＡ、ＳＶ４０−ポリＡシグナルの順に配列した導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をトランスジェニック非ヒト哺乳動物の受精卵の雄性前核に導入し、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から前記ｃＤＮＡを有する仔のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を選択することを特徴とする糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の創製方法。
- 変異型のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ２のタンパク質が、配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする請求項１０記載の糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の創製方法。
- インスリンプロモーターがラットインスリンプロモーターである請求項１０〜１１のいずれかに記載の糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の創製方法。
- トランスジェニック非ヒト哺乳動物がげっ歯類である請求項１２に記載の糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の創製方法。
- げっ歯類がマウスである請求項１３に記載の糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の創製方法。
- マウスが生後２〜３週間で糖尿病を発症し、４〜７ヶ月で糖尿病網膜症および糖尿病性腎症を発症するマウスである請求項１４記載の非ヒト哺乳動物の創製方法。
- 糖尿病合併症が糖尿病網膜症および糖尿病性腎症である請求項１０〜１４のいずれかに記載の糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の創製方法。
- 請求項１０〜１６のいずれか記載の創製方法で創製された糖尿病合併症を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする糖尿病合併症治療薬のスクリーニング方法。
- 糖尿病合併症治療薬が糖尿病網膜症の治療薬および／または糖尿病性腎症の治療薬である請求項１７のスクリーニング方法。
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| CN111979195A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-11-24 | 四川大学华西医院 | 糖尿病视网膜病变全视网膜体外培养模型的构建方法 |
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2005
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Non-Patent Citations (1)
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| JPN6010064091, 第２７回日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集, 20041125, ｐ． １００９， ３ＰＢ−４９０ * |
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN111979195A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-11-24 | 四川大学华西医院 | 糖尿病视网膜病变全视网膜体外培养模型的构建方法 |
| CN111979195B (zh) * | 2020-09-04 | 2023-06-02 | 四川大学华西医院 | 糖尿病视网膜病变全视网膜体外培养模型的构建方法 |
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