JP2006337363A - 塩濃度調節装置、それを備えるラボオンチップおよびそれを利用した塩濃度調節方法 - Google Patents

Abstract

【課題】インサイチュで塩濃度調節が可能な塩濃度調節装置を提供する。
【解決手段】ａ）陽イオン交換膜および陰イオン交換膜により規定され、生分子抽出チャンバ、増幅チャンバ、ハイブリダイゼーションチャンバおよび検出チャンバからなる群から選択される反応チャンバと、ｂ）前記陰イオン交換膜および１次電極により規定され、イオン交換媒質を含む１次電極チャンバと、ｃ）前記陽イオン交換膜および２次電極により規定され、イオン交換媒質を含む２次電極チャンバと、を備える塩濃度調節装置である。
【選択図】図２

Description

本発明は、塩濃度調節装置、それを備えるラボオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）およびそれを利用した塩濃度調節方法に関する。

最近、生命工学が発達するにつれて、個体の遺伝情報を構成する塩基配列および蛋白質配列などが明らかになっており、これにより塩基配列分析および疾病診断などを目的とするバイオチップ、特にラボオンチップを開発しようとする動きが活発である。

ラボオンチップは、微細加工技術を利用してＤＮＡ、ＲＮＡまたは蛋白質のような生分子を、細胞を含むサンプルから抽出し、前記生分子の増幅、ハイブリダイゼーションおよび検出反応の全過程を一つのチップ上でインサイチュで処理でき、実験結果の定量分析ができる自動化および小型化されたチップである。

一般的に、ラボオンチップは、生分子を抽出する抽出チャンバ、前記生分子を増幅する増幅チャンバ、前記増幅された生分子と固定化された生分子とがハイブリダイズするハイブリダイゼーションチャンバ、前記ハイブリダイゼーションを検出する検出チャンバ、および前記チャンバ間を連結するマイクロチャネルで構成される。前記抽出チャンバでは、サンプル内の細胞を濃縮し、前記細胞を溶解し、それから生分子を精製する過程が進行される。前記増幅チャンバでは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）のような生分子の増幅反応が行われる。前記ハイブリダイゼーションチャンバの一面には、あらかじめ配列がわかっている生分子が固定化されており、前記固定化された生分子と上記で増幅された生分子との間に結合反応、すなわち、ハイブリダイゼーションがおきる。最後に、前記検出チャンバでは、上記で発生したハイブリダイゼーションの程度が測定される。

前記ラボオンチップは、その操作の各ステップ、例えば、濃縮ステップ、溶解ステップ、精製ステップ、増幅ステップ、ハイブリダイゼーションステップ、洗浄ステップ、乾燥ステップおよび検出ステップにおいて異なる塩濃度を必要とする。このため、従来は、それぞれ異なる塩濃度を持つ溶液をあらかじめ調製した後、上記の各チャンバに異なる塩濃度を持つ溶液を注入した。または、一つのチャンバで前記ステップを行い、ステップごとに異なる塩濃度を持つ溶液を注入する方法を利用した。

例えば、図１は、ラボオンチップの反応チャンバに異なる塩濃度を持つ溶液を提供するための従来装置の構成を示す概略図である。図１を参照すれば、ハイブリダイゼーションのような各反応がおきる反応チャンバ１０１に、洗浄バッファを含むポンプ１０２、異なる塩濃度を持つ溶液を含むポンプ１０３、１０４、１０５および生分子を含有するサンプル溶液を含むポンプ１０６がチャンネル１１６を通じて連結されている。前記ポンプ１０２、１０３、１０４、１０５、１０６およびバルブ１０７、１０８、１０９、１１０、１１１の調節により、塩を含有していない洗浄バッファおよび異なる塩濃度を持つ溶液が前記反応チャンバ１０１に供給され、使われた溶液は、バルブ１１２、１１３の調節によりコンテナ１１４、１１５に排出される。

しかしながら、上述のような従来の装置は、ポンプ、バルブ、チャネルおよびコンテナのような部品を多く必要として装置が複雑になり、ステップごとにポンプおよびバルブを作動させて各溶液の供給および排出をしなければならないので、作動時間が長くかかるという短所がある。本発明者らは、前記のような従来技術の問題点を解決するために研究を続けた結果、陽イオンおよび陰イオン交換膜を用いた電気透析法を利用して、電極にかける電圧の極性を変化させることによって、ステップごとにポンプおよびバルブを作動させて異なる濃度の塩溶液を提供する必要がなく、インサイチュで塩濃度調節ができることを確認することによって本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、インサイチュで塩濃度調節が可能な塩濃度調節装置を提供することである。

本発明の他の目的は、前記塩濃度調節装置を備えるラボオンチップを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記塩濃度調節装置を利用して反応チャンバ内溶液の塩濃度を調節する方法を提供することである。

本発明の目的を達成するために、本発明は、ａ）陽イオン交換膜および陰イオン交換膜により規定され、生分子抽出チャンバ、増幅チャンバ、ハイブリダイゼーションチャンバおよび検出チャンバからなる群から選択される反応チャンバと、ｂ）前記陰イオン交換膜および１次電極により規定され、イオン交換媒質を含む１次電極チャンバと、ｃ）前記陽イオン交換膜および２次電極により規定され、イオン交換媒質を含む２次電極チャンバと、を備える塩濃度調節装置を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、塩濃度調節装置を備えるラボオンチップを提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、ａ）上述の塩濃度調節装置の反応チャンバに生分子を含むサンプル溶液を流入させるステップと、ｂ）前記１次電極と前記２次電極との間に第１の極性の電圧を印加するステップと、ｃ）前記１次電極と前記２次電極との間に前記第１の極性の電圧と反対方向の第２の極性の電圧を印加するステップと、を含む反応チャンバ内溶液の塩濃度調節方法を提供する。

本発明による装置および方法を使用すれば、反応チャンバに反応のステップごとにポンプおよびバルブを作動させて異なる濃度の塩溶液を提供する必要がなく、電圧印加の極性、強度および時間などを調節することによって可逆的なインサイチュの塩濃度調節が可能である。

以下、図面を参照して本発明をより詳細に説明する。

本発明の一実施形態は、インサイチュで塩濃度調節が可能な塩濃度調節装置に関する。

図２は、本発明による塩濃度調節装置の一例を示す断面図である。図２を参照すれば、本発明による塩濃度調節装置は、ａ）陽イオン交換膜（ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｃ）２０５および陰イオン交換膜（ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ａ）２０４により規定される反応チャンバ２０１、ｂ）前記陰イオン交換膜（Ａ）２０４および１次電極２０６により規定され、イオン交換媒質２０８を含む１次電極チャンバ２０２、ｃ）前記陽イオン交換膜（Ｃ）２０５および２次電極２０７により規定され、イオン交換媒質２０８’を含む２次電極チャンバ２０３を備える。ここで、「陽イオン交換膜および陰イオン交換膜により規定される」とは、図２に示すように、陽イオン交換膜および陰イオン交換膜を反応チャンバの両側に有する構造をとることを示す。

本発明による塩濃度調節装置において、前記反応チャンバ２０１は、生分子を含むサンプル溶液が流入および流出される流入口２０９および流出口２１０をさらに備えることができる。

図３は、本発明による塩濃度調節装置の他の一例を示す断面図である。図３を参照すれば、本発明による塩濃度調節装置は、ａ）陽イオン交換膜（Ｃ）３０５および陰イオン交換膜（Ａ）３０４により規定される第１反応チャンバ３０１、ｂ）陽イオン交換膜（Ｃ）３０５’および陰イオン交換膜（Ａ）３０４’により規定される第２反応チャンバ３０１’、（ｃ）前記第１反応チャンバ３０１の陽イオン交換膜（Ｃ）３０５および前記第２反応チャンバ３０１’の陰イオン交換膜（Ａ）３０４’により規定され、イオン交換媒質３０８’を含むイオンチャンバ３１１、ｄ）前記第１反応チャンバ３０１の陰イオン交換膜（Ａ）３０４および１次電極３０６により規定され、イオン交換媒質３０８を含む１次電極チャンバ３０２、ｅ）前記第２反応チャンバ３０１’の陽イオン交換膜（Ｃ）３０５’および２次電極３０７により規定され、イオン交換媒質３０８”を含む２次電極チャンバ３０３を備える。

すなわち、本発明による塩濃度調節装置は、２つ以上の反応チャンバを有し（３０１、３０１’）、前記２つ以上の反応チャンバ３０１、３０１’の間に、前記反応チャンバの陽イオン交換膜３０５および陰イオン交換膜３０４’により規定され、イオン交換媒質３０８’を含むイオンチャンバ３１１をさらに備えることができる。

本発明による塩濃度調節装置において、前記反応チャンバ３０１、３０１’は、生分子を含むサンプル溶液が流入する流入口３０９、３０９’および前記サンプル溶液が流出する流出口３１０、３１０’をさらに備えることができる。

本発明による塩濃度調節装置の反応チャンバは、抽出チャンバ、増幅チャンバ、ハイブリダイゼーションチャンバおよび検出チャンバからなる群から選択されるいずれか一つでありうる。望ましくは、前記反応チャンバは、抽出チャンバ、増幅チャンバ、ハイブリダイゼーションチャンバおよび検出チャンバの機能をいずれも行う統合チャンバでありうる。

例えば、前記反応チャンバがハイブリダイゼーションチャンバである場合、前記チャンバ内で生分子が互いにハイブリダイズする。このために一般的に、前記反応チャンバ内の基板にはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ペプチドおよび蛋白質からなる群から選択される生分子が固定化されており、前記反応チャンバに、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドおよび蛋白質で構成された群から選択される生分子を含むサンプル溶液が投入される。

前記基板は、好ましくは、シリコンウェーハ、ガラス、石英、金属およびプラスチックからなる群から選択されるものであり、アミノシラン、ポリ−Ｌ−リジンおよびアルデヒドからなる群から選択される活性基がコーティングされたものが望ましい。

本発明による塩濃度調節装置において、前記陽イオン交換膜は、陽イオンは通過させるが、陰イオン通過には１００％に近い抵抗を表す膜であり、一方、陰イオン交換膜は、陰イオンは通過させるが、陽イオン通過には１００％に近い抵抗を表す膜である。前記陽イオン交換膜および陰イオン交換膜は、当業界で周知のものであり、当業者が容易にこれを購入して使用できるであろう。例えば、前記陽イオン交換膜は、強酸交換膜（ｓｔｒｏｎｇ ａｃｉｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ；−ＳＯ_３ ⁻Ｎａ^＋含む；Ｎａｆｉｏｎ（登録商標）、Ｄｕｐｏｎｔ社製）または弱酸交換膜（ｗｅａｋ ａｃｉｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ；−ＣＯＯ⁻Ｎａ^＋含む）であり、前記陰イオン交換膜は、強塩基（ｓｔｒｏｎｇ ｂａｓｅ；Ｎ^＋（ＣＨ_３）Ｃｌ⁻含む）または弱塩基（ｗｅａｋ ｂａｓｅ；Ｎ（ＣＨ_３）_２含む）でありうる。

前記反応チャンバにサンプル溶液を流入させるためのポンプ、前記反応チャンバからサンプル溶液を流出させるためのポンプおよび上述の流入および流出を調節するためのバルブを追加してもよい。例えば、前記反応チャンバにサンプル溶液を流入させるためのポンプは、チャンネルを通じて前記流入口に連結され、前記反応チャンバからサンプル溶液を流出させるためのポンプは、チャンネルを通じて前記流出口に連結されうる。

前記１次電極および前記２次電極は、それぞれ正および負または負および正の電源に接続されることが望ましい。すなわち、前記１次電極および前記２次電極は、電圧の極性が変わる可変電源に接続されることが望ましい。

前記１次電極と前記２次電極との間に異なる方向の電圧を印加することによって、本発明による塩濃度調節装置の反応チャンバ内溶液の塩濃度を自由に調節できる。これにより、異なる塩濃度を持つチャンバそれぞれで細胞濃縮、細胞溶解、生分子精製、増幅およびハイブリダイゼーションを行う従来方法、または一つのチャンバに上記の反応ごとに異なる濃度の塩溶液を注入する従来方法を改善できる。すなわち、前記電極間の電圧方向を適切に調節することによって、上記の各反応のステップをそれぞれ異なるチャンバ内で行ったり、反応のステップごとに異なる塩濃度を持つ溶液を注入する必要がなく一つの反応チャンバ内の塩濃度を自由に調節できる。

前記１次電極および前記２次電極は、それぞれ白金、金、銅およびパラジウムからなる群から選択される金属を含みうるが、特に限定されない。

前記イオン交換媒質は、電解質水溶液であることが望ましい。前記電解質の種類は特に限定されず、各反応の特性に合わせて当業者により容易に選択されて使われうる。

本発明の他の実施形態は、上述の塩濃度調節装置を備えるラボオンチップに関する。

前記で説明したように、本発明の塩濃度調節装置を使用すれば、一つの反応チャンバ内で各ステップに必要な塩濃度を調節することによって、ステップごとに異なる塩濃度を持つ溶液を注入する必要なく細胞濃縮、細胞溶解、生分子精製、増幅およびハイブリダイゼーションのステップを、一つの反応チャンバ内で行うことができる。

したがって、前記塩濃度調節装置を備えるラボオンチップは、チャンバの数を少なくできるために構造が簡単になるだけでなく、反応のステップごとに異なる塩濃度を持つ溶液を注入および排出する必要がないので工程が簡単になる長所を持つ。

本発明のさらに他の実施形態は、前記塩濃度調節装置を利用して反応チャンバ内溶液の塩濃度を調節する方法に関する。

本発明による反応チャンバ内溶液の塩濃度を調節する方法は、上述の塩濃度調節装置の反応チャンバに生分子を含むサンプル溶液を流入させるステップと、ｂ）前記１次電極と前記２次電極との間に第１の極性の電圧を印加するステップと、ｃ）前記１次電極と２次電極との間に前記第１の極性の電圧と反対方向の第２の極性の電圧を印加するステップと、を含む。

前記生分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドおよび蛋白質からなる群から選択されることが望ましい。

前記反応チャンバは、抽出チャンバ、増幅チャンバ、ハイブリダイゼーションチャンバおよび検出チャンバでからなる群から選択されるいずれか一つでありうる。望ましくは、前記反応チャンバは、抽出チャンバ、増幅チャンバ、ハイブリダイゼーションチャンバおよび検出チャンバの機能をいずれも行う統合チャンバでありうる。

図４Ａおよび４Ｂは、図３の本発明による塩濃度調節装置の作動原理を示す概念図である。図４Ａおよび４Ｂを参照すれば、イオン交換媒質は、塩化ナトリウム水溶液であることが分かる。

まず、反応チャンバに生分子および一定塩を含むサンプル溶液を流入口を通じて反応チャンバに流入させる。流入は、例えば、ポンプおよびバルブにより制御できる。

次いで、前記１次電極と前記２次電極との間に一方向の電圧を印加する。再び図４Ａを参照すれば、１次電極を（−）とし、２次電極を（＋）として電圧を印加する。この場合、１次電極チャンバ３０２内に含まれているイオン交換媒質３０８中の陰イオンであるＣｌ⁻は、陰イオン交換膜（Ａ）３０４を通じて第１反応チャンバ３０１に移動する。また、イオンチャンバ３１１内に含まれているイオン交換媒質３０８’中の陽イオンであるＮａ^＋は陽イオン交換膜（Ｃ）３０５を通じて第１反応チャンバ３０１に移動し、陰イオンであるＣｌ⁻は、陰イオン交換膜（Ａ）３０４’を通じて第２反応チャンバ３０１’に移動する。また、２次電極チャンバ３０３内に含まれているイオン交換媒質３０８”中の陽イオンであるＮａ^＋は、陽イオン交換膜（Ｃ）３０５’を通じて第２反応チャンバ３０１’に移動する。

しかし、第１反応チャンバ３０１および第２反応チャンバ３０１’に注入されたサンプル溶液内に含まれている陽イオンであるＮａ^＋および陰イオンであるＣｌ⁻は、それぞれ陽イオン交換膜（Ｃ）３０５、３０５’および陰イオン交換膜（Ａ）３０４、３０４’を通じて１次電極チャンバ３０２、イオンチャンバ３１１または２次電極チャンバ３０３に移動できない。

結果的に、前記陽イオンであるＮａ^＋および陰イオンであるＣｌ⁻は、前記第１反応チャンバ３０１および前記第２反応チャンバ３０１’内に濃縮され、一方、前記１次電極チャンバ３０２、前記イオンチャンバ３１１または前記２次電極チャンバ３０３では希釈される。

図４Ａに示すように、上記のように塩濃度が高い場合に、一定条件、例えば、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｅｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）およびＤＮＡを添加すれば、ＤＮＡハイブリダイゼーションがおきる。

次いで、前記１次電極と前記２次電極との間に上記と反対方向の電圧を印加する。図４Ｂを参照すれば、１次電極を（＋）とし、２次電極を（−）として電圧を印加する。この場合、第１反応チャンバ３０１および第２反応チャンバ３０１’に注入されたサンプル溶液内に含まれている陽イオンであるＮａ^＋および陰イオンであるＣｌ⁻は、それぞれ陽イオン交換膜（Ｃ）３０５、３０５’および陰イオン交換膜（Ａ）３０４、３０４’を通じて１次電極チャンバ３０２、イオンチャンバ３１１または２次電極チャンバ３０３に移動する。

一方、１次電極チャンバ３０２、イオンチャンバ３１１および２次電極チャンバ３０３内に含まれているイオン交換媒質３０８、３０８’、３０８”中の陽イオンであるＮａ^＋および陰イオンであるＣｌ⁻は、それぞれ陽イオン交換膜（Ｃ）３０５、３０５’および陰イオン交換膜（Ａ）３０４、３０４’を通じて第１反応チャンバ３０１または第２反応チャンバ３０１’に移動できない。

結果的に、前記陽イオンであるＮａ^＋および陰イオンであるＣｌ⁻は、前記１次電極チャンバ３０２、前記イオンチャンバ３１１または前記２次電極チャンバ３０３では濃縮され、逆に、前記第１反応チャンバ３０１および前記第２反応チャンバ３０１’内では希釈される。

図４Ｂに示すように、上記のように塩濃度が低い場合にＤＮＡ分離反応がおきる。

本発明によるラボオンチップ反応チャンバ内溶液の塩濃度調節方法において、前記ｂ）ステップおよび前記ｃ）ステップを反復できる。望ましくは、前記ｂ）ステップおよび前記ｃ）ステップを調節することによって前記反応チャンバ内溶液の塩濃度を効率的に調節できる。

以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。

＜実施例１ 電圧方向変化による塩濃度変化＞
本実施例では、本発明による塩濃度調節装置において、印加電圧の方向を変化させることによって反応チャンバ内の塩濃度を可逆的に調節できることを確認した。

本実施例に使われた塩濃度調節装置は、図３に図示されている。図３は、本発明による塩濃度調節装置の他の一例を示す断面図である。陽イオン交換膜として−ＳＯ_３ ⁻Ｎａ^＋基を含む膜を使用し、陰イオン交換膜としてＮ^＋（ＣＨ_３）_３Ｃｌ⁻基を含む膜を使用した。また、１次電極として白金を使用し、２次電極として白金を使用した。第１反応チャンバ、第２反応チャンバ、１次電極チャンバ、２次電極チャンバおよびイオンチャンバの体積はそれぞれ１０μｌとした。また、前記イオン交換媒質として１，０００ｍＭのＮａＣｌ水溶液を使用し、前記反応チャンバには、サンプル溶液として１，０００ｍＭのＮａＣｌ水溶液を使用した。

上記のように製造された塩濃度調節装置の１次電極を（−）に、２次電極を（＋）にして電圧を印加した。１次電極と２次電極との間の電圧の大きさは５Ｖであった。０．５分後に電圧の大きさはそのまま保持しつつ極性を逆に調整し、１分後には再び元の極性を持つ電圧を印加し、また１．５分後には反対方向の電圧を印加した。

反応チャンバ内溶液の伝導度の変化を、伝導度測定装置（堀場製作所社製）を使用して測定した。測定は、１０μｌ程度のサンプル溶液に脱イオン水を添加して１０ｍｌに希釈した後、伝導度測定プローブを浸漬して行った。前記で測定された伝導度から反応チャンバ内溶液のＮａＣｌ濃度を計算した。計算原理は、測定可能な大きい体積（〜１０ｍｌ）でのＮａＣｌ濃度対伝導度を測定すれば、これらの間に直線的な比例関係があるので、どの濃度がどの程度の伝導度を持っているか分かるということに基づく。したがって、１０００倍希釈した１０ｍｌの伝導度が１ｍＳ／ｍならば、原溶液１０μｌの伝導度は１Ｓ／ｍと換算可能である。前記で測定および計算された伝導度およびＮａＣｌ濃度の変化は、図５Ａおよび図５Ｂに図示されている。

図５Ｂに示すように、電圧を印加する前の反応チャンバ内溶液のＮａＣｌ濃度は１０００ｍＭであり、電圧を一方向に印加した後に０．５分までＮａＣｌ濃度は低下して６５４ｍＭになり、印加電圧の方向を変えれば１分まで８７０ｍＭに回復され、また印加電圧の方向を変えれば１．５分まで７０７ｍＭに落ちた。前記結果から、本発明による塩濃度調節装置に印加される電圧の方向を変化させることによって反応チャンバ内の塩濃度を可逆的に調節できるということを確認した。

＜実施例２ 経時的な塩濃度変化＞
本実施例では、本発明による塩濃度調節装置において、経時的な反応チャンバ内の塩濃度の変化を確認した。

本実施例に使われた塩濃度調節装置は、前記実施例１で使用したものと同じものであり、印加された電圧の大きさも同一であった。

まず、前記反応チャンバ内にサンプル溶液として１００ｍＭのＮａＣｌ水溶液を注入し、１次電極を（−）とし、２次電極を（＋）として電圧を印加した。前記実施例１の方法を利用して０．５分単位でＮａＣｌの濃度を測定した。その結果を図６Ａに示した。図６Ａに示したように、経時的にＮａＣｌ濃度は１００ｍＭから２２６ｍＭに上昇した。

次いで、前記反応チャンバ内にサンプル溶液として１０００ｍＭのＮａＣｌ水溶液を注入し、１次電極を（＋）とし、２次電極を（−）として電圧を印加した。前記実施例１の方法を利用して０．５分単位でＮａＣｌの濃度を測定した。その結果を図６Ｂに示した。図６Ｂに示したように、経時的にＮａＣｌ濃度は１０００ｍＭから１１０ｍＭに低下した。

前記結果から、本発明による塩濃度調節装置を利用すれば、電圧印加時間によって塩濃度を増大または減少させることができ、反応チャンバ内の塩濃度を調節できることを確認することができた。

＜実施例３ 塩濃度変化およびＤＮＡハイブリダイゼーションの程度の比較＞
本実施例では、本発明による塩濃度調節装置による反応チャンバ内の塩濃度の変化がＤＮＡハイブリダイゼーションの程度に及ぼす影響を確認した。

このために、まず前記実施例１の塩濃度調節装置の反応チャンバ内の基板上にＤＮＡを固定化してマイクロアレイを製作した。まず、プローブとして配列番号１の一本鎖のポリヌクレオチドのＮ−末端をアミン基に置換した後、シリル化スライド（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社製）にスポッティングした。スポッティングバッファは２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）を使用した。スポッティング後に乾燥器に置いて結合を誘導した後、０．２％ ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｐｈａｔｅ）で２分間、３次蒸溜水で２分間洗浄して結合されていないオリゴヌクレオチドを除去した。前記シリル化スライドを９５℃で２分間処理して変性を誘導した後、ブロッキング溶液（１．０ｇＮａＢＨ_４、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３００ｍＬ、ＥｔＯＨ１００ｍＬ）で１５分間、０．２％ＳＤＳ溶液で１分間、３次蒸溜水で２分間それぞれ洗浄して常温で乾燥させてマイクロアレイを製作した。

前記基板に固定化されているプローブにハイブリダイズする配列番号２の一本鎖のポリヌクレオチドを蛍光標識した。前記蛍光標識した標的ＤＮＡ １ｎＭ、ＮａＣｌ １００ｍＭおよび分子量８，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有するハイブリダイゼーション溶液を、上記の塩濃度調節装置の反応チャンバ（マイクロアレイを含む）に投入し、前記マイクロアレイと蛍光表示された標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを４２℃で行った。前記ハイブリダイゼーションと同時に１次電極を（−）に、２次電極を（＋）にして電圧を印加した。電圧の大きさは５Ｖであった。２×ＳＳＣで室温で５分間２回洗浄した後、空気中で乾燥させた。蛍光強度は、乾燥後にスライドをＡｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）４０００Ｂでスキャンし、スキャン結果をＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）Ｐｒｏ４．１で分析して確認した。

経時的な反応チャンバ内の塩濃度の変化を図７Ａに示し、経時的な反応チャンバ内のハイブリダイゼーションの程度に比例する蛍光強度の変化を図７Ｂに示した。図７Ａに示すように、０分での反応チャンバ内の塩濃度は１０００ｍＭであり、経時的に低下し、２分での塩濃度は１１０ｍＭであった。一方、図７Ｂに示すように、０分での蛍光強度は１４７５５であり、経時的に減少し、２分での蛍光強度は１０７７であった。前記結果から、反応チャンバ内の調節された塩濃度はＤＮＡのハイブリダイゼーションの程度に比例するということを確認できた。

＜実施例４ 塩濃度によるＤＮＡ溶出度の比較＞
本実施例では、本発明による塩濃度調節装置による反応チャンバ内の塩濃度がＤＮＡ溶出に及ぼす影響を確認した。

このために前記実施例３と類似した方法を利用してＤＮＡを固定したマイクロアレイを作製した。ただし、ＤＮＡとしてＰＢＲ３２２を使用した。すなわち、２０％ＰＥＧ、１Ｍ塩化ナトリウムおよび１０μｇのＰＢＲ３２２を含む溶液を前記反応チャンバに注入して、基板上に結合されていない前記ＤＮＡの量を調べた。前記溶液の注入後、１次電極を（−）、２次電極を（＋）として２分間電圧を印加した。電圧の大きさは５Ｖであった。基板に固定化されずに溶出したＤＮＡの量をＵＶで測定し、その結果を図８に示した。図８に示すように、電圧を印加する前の１Ｍの塩濃度の場合（塩濃度調節前）、結合せずに溶出するＤＮＡの量は少ないが、２分間電圧を印加した後（塩濃度調節後）の溶出ＤＮＡ量は増加し、０．１Ｍの塩濃度で計算した対照群（０．１Ｍ）とほぼ同じになった。図８中、「脱イオン水」は、塩濃度が０である脱イオン水で測定した溶出ＤＮＡ量を表す。本発明の塩濃度調節装置により調節された塩濃度は、ＤＮＡの分離度に反比例することが確認された。

＜実施例５ 経時的なｐＨ変化＞
本実施例では、本発明による塩濃度調節装置において、経時的な反応チャンバ内のｐＨ変化を確認した。

本実施例では、前記実施例２と同じ方法を使用し、１分ごとに反応チャンバ内のｐＨを測定した。サンプル溶液として１ＭのＮａＣｌ水溶液を用いた。その結果を図９Ａおよび図９Ｂに示した。図９Ａは、本発明による塩濃度調節装置により反応チャンバ内の塩濃度が高くなる場合のｐＨ変化であり、図９Ｂは、反応チャンバ内の塩濃度が低くなる場合のｐＨ変化である。図９Ａおよび図９Ｂに示すように、３分間の作動の間、反応チャンバ内のｐＨ変化は０．１以下であった。前記結果から、本発明による塩濃度調節装置を使用すれば、塩濃度を自由に調節できると同時にｐＨを一定に維持できることが確認できた。

したがって、本発明による装置および方法を使用して電圧印加の方向、強度および時間などを調節すれば、反応チャンバ内のｐＨを一定に維持しながら塩濃度を可逆的にインサイチュで調節できるということが分かる。正確な印加電圧の方向、強度および時間は所望の塩濃度、電解質の濃度および反応チャンバの体積などによって変わり、これは当業者の実験により容易に決定できる。

本発明は、生分子分析の関連技術分野に好適に用いられる。

反応チャンバに異なる塩濃度を持つ溶液を提供するための従来装置の構成を示す概略図である。 本発明による塩濃度調節装置の一実施形態を示す断面図である。 本発明による塩濃度調節装置の他の一実施形態を示す断面図である。 図３の本発明による塩濃度調節装置の一実施形態の作動原理を示す概念図である。 図３の本発明による塩濃度調節装置の一実施形態の作動原理を示す概念図である。 実施例１で測定された印加電圧の方向による反応チャンバ内の伝導度変化を示すグラフである。 図５Ａの伝導度から計算された反応チャンバ内のＮａＣｌ濃度変化を示すグラフである。 実施例２で測定された経時的な反応チャンバ内のＮａＣｌ濃度変化を示すグラフである。 実施例２で測定された経時的な反応チャンバ内のＮａＣｌ濃度変化を示すグラフである。 実施例３で測定された経時的な反応チャンバ内の塩濃度の変化を示すグラフである。 実施例３で測定された経時的な反応チャンバ内のハイブリダイゼーションの程度に比例する蛍光強度の変化を示すグラフである。 実施例４で測定された塩濃度調節によるＤＮＡ溶出量を示すグラフである。 実施例５で測定された経時的な反応チャンバ内のｐＨ変化を示すグラフである。 実施例５で測定された経時的な反応チャンバ内のｐＨ変化を示すグラフである。

符号の説明

１０１、２０１、３０１、３０１’ 反応チャンバ、
１０２、１０３、１０４、１０５、１０６ ポンプ、
１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３ バルブ、
１１４、１１５ コンテナ、
１１６ チャンネル、
２０２、３０２ １次電極チャンバ、
２０３、３０３ ２次電極チャンバ、
２０４、３０４、３０４’ 陰イオン交換膜（Ａ）、
２０５、３０５、３０５’ 陽イオン交換膜（Ｃ）、
２０６、３０６ １次電極、
２０７、３０７ ２次電極、
２０８、２０８’、３０８、３０８’、３０８” イオン交換媒質、
２０９、３０９、３０９’ 流入口、
２１０、３１０、３１０’ 流出口、
３１１ イオンチャンバ。

Claims (11)

1. ａ）陽イオン交換膜および陰イオン交換膜により規定され、生分子抽出チャンバ、増幅チャンバ、ハイブリダイゼーションチャンバおよび検出チャンバからなる群から選択される反応チャンバと、
   ｂ）前記陰イオン交換膜および１次電極により規定され、イオン交換媒質を含む１次電極チャンバと、
   ｃ）前記陽イオン交換膜および２次電極により規定され、イオン交換媒質を含む２次電極チャンバと、
   を備える塩濃度調節装置。
2. ２つ以上の前記反応チャンバを有し、前記反応チャンバ間に、前記反応チャンバの陽イオン交換膜および陰イオン交換膜により規定され、イオン交換媒質を含むイオンチャンバをさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の塩濃度調節装置。
3. 前記反応チャンバは、生分子を含むサンプル溶液が流入する流入口、および前記サンプル溶液が流出する流出口をさらに備えることを特徴とする請求項１または２に記載の塩濃度調節装置。
4. 前記生分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドおよび蛋白質からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の塩濃度調節装置。
5. 前記１次電極および前記２次電極は、それぞれ正および負の電源に接続されるか、それぞれ負および正の電源に接続されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の塩濃度調節装置。
6. 前記１次電極および前記２次電極は、それぞれ白金、金、銅およびパラジウムからなる群から選択される金属を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の塩濃度調節装置。
7. 前記イオン交換媒質は、電解質水溶液であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の塩濃度調節装置。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の塩濃度調節装置を備えるラボオンチップ。
9. ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の塩濃度調節装置の反応チャンバに生分子を含むサンプル溶液を流入させるステップと、
   ｂ）前記１次電極と前記２次電極との間に第１の極性の電圧を印加するステップと、
   ｃ）前記１次電極と前記２次電極との間に前記第１の極性の電圧と反対方向の第２の極性の電圧を印加するステップと、
   を含む反応チャンバ内溶液の塩濃度調節方法。
10. 前記ｂ）ステップおよび前記ｃ）ステップを反復することを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. 前記生分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドおよび蛋白質からなる群から選択されることを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。

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