JP2006327962A - Method for separating target substance and molecular complex - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ペプチド、タンパク質、細菌、細胞等の生物学的物質または化学物質の分離方法および、該分離方法において得られる高分子コンプレックスもしくは低分子コンプレックス（以下「分子コンプレックス」と称する）に関する。 The present invention relates to a method for separating biological substances or chemical substances such as peptides, proteins, bacteria, cells and the like, and a high-molecular complex or a low-molecular complex (hereinafter referred to as “molecular complex”) obtained by the separation method.
アフィニティタグが固定された担体を分離剤として用い、目的物質とそれ以外の物質を含む液を接触させて分離剤に目的物質を吸着させ、液と担体を分離し、さらに分離剤から目的物質を脱離させることにより、目的物質を濃縮、精製する方法が知られている。これらの分離剤はたとえば、診断薬担体として用いることができる。
具体的には、担体としてセルロースビーズ、アガロースビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズを用い、これら担体に固定するアフィニティタグと目的物質の組み合わせとして、抗体／ペプチド、抗体／抗原、抗体のフラグメント／抗原、核酸／核酸、タンパク質／核酸、ペプチド／ペプチド、タンパク質／タンパク質、薬物候補物質／タンパク質、グルタチオン／グルタチオン−（S）−トランスフェラーゼ、マルトース／マルトース結合タンパク質、炭水化物／タンパク質、炭水化物誘導体／タンパク質、ペプチドタグ／金属イオン−金属キレート、ペプチド／ＮＴＡ−Ｎｉ、プロテインＡ／抗体、プロテインＧ／抗体、プロテインＬ／抗体、Ｆｃレセプター／抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ジンクフィンガー／核酸、薬物候補物質／ペプチド、薬物候補物質／レセプター、および金属イオン／キレート剤／ポリアミノ酸を用いる方法が知られている。
Using a carrier with an affinity tag fixed as a separating agent, contact the target substance with a liquid containing other substances to adsorb the target substance to the separating agent, separate the liquid and the carrier, and then remove the target substance from the separating agent. A method of concentrating and purifying a target substance by desorption is known. These separating agents can be used, for example, as a diagnostic agent carrier.
Specifically, cellulose beads, agarose beads, latex beads, magnetic beads are used as carriers, and combinations of affinity tags and target substances immobilized on these carriers include antibodies / peptides, antibodies / antigens, antibody fragments / antigens, nucleic acids. / Nucleic acid, protein / nucleic acid, peptide / peptide, protein / protein, drug candidate substance / protein, glutathione / glutathione- (S) -transferase, maltose / maltose binding protein, carbohydrate / protein, carbohydrate derivative / protein, peptide tag / metal Ion-metal chelate, peptide / NTA-Ni, protein A / antibody, protein G / antibody, protein L / antibody, Fc receptor / antibody, biotin / avidin, biotin / streptavidin, zinc finger -/ Methods using nucleic acids, drug candidates / peptides, drug candidates / receptors, and metal ions / chelators / polyamino acids are known.
従来の方法では、これらの分離剤は水溶液中で均一に分散することがなく、懸濁もしくは沈降するように設計されているため、クロマトグラフィー法、濾過分離法、遠心分離法と上澄除去による方法等により、目的物質とそれ以外の物質と分離できる点で優れているものの、担体の単位体積あたりの表面積が小さく、担体上に固定化できるアフィニティタグ量が少なくなり、ある一定量の目的物質を回収するためには多くの分離剤を必要とする問題があった。また、分離剤が水溶液中で均一に分散しないことから分離剤と目的物質が接触する機会が少なくなるため、目的物質を分離剤に吸着するために長い時間を必要とする問題、更には、分離剤を充填した際にできる隙間の体積が大きいため、目的物質を含む液を分離剤に満遍なく接触させるためには、液量を増やす必要があり、目的物質の濃縮効率という点で劣っているという問題がある。 In the conventional method, these separation agents are designed to be suspended or settled without being uniformly dispersed in an aqueous solution, so that they are obtained by chromatography, filtration separation, centrifugation and supernatant removal. Although it is excellent in that the target substance and other substances can be separated by the method, etc., the surface area per unit volume of the carrier is small, and the amount of affinity tag that can be immobilized on the carrier is reduced. There is a problem that a large amount of a separating agent is required to recover the amount. In addition, since the separating agent does not uniformly disperse in the aqueous solution, there are fewer opportunities for the separating agent and the target substance to come into contact with each other. Therefore, it takes a long time to adsorb the target substance to the separating agent. Since the volume of the gap that is created when the agent is filled is large, it is necessary to increase the amount of the liquid in order to bring the liquid containing the target substance into contact with the separating agent evenly, which is inferior in terms of the concentration efficiency of the target substance. There's a problem.
これらの問題は、特に少量多検体を処理する際に大きな問題となっており、診断薬、創薬の分野ではこの問題を解決する一つの手段として、アフィニティタグを固定するための面積を増やすために、単位体積あたりの表面積を増やす方法、たとえば担体のサイズを１ミクロン程度まで小さくする方法が取られている。さらに、濃縮、精製工程を自動化するために、担体を磁石で回収可能にした分離剤が開発されている。このような分離剤を用いることにより、既存の方法と比較し、少量多検体処理において良好な濃縮、精製が可能となる。さらに担体のサイズを小さくすることで、アフィニティタグの固定量を増やすことができるが、ある程度のサイズにおいて担体が受けるブラウン運動の影響が無視できなくなり、担体は水溶液中で自然沈降することがなくなり、水溶液中に均一に分散したコロイド液の様相を示す。このような担体を用いる際には、超高速遠心分離法とを用いることにより担体を分離できるが、多検体処理の際には操作が煩雑となる。また、担体が磁気成分を含む場合には磁気カラム法を使用することで目的物質の分離、濃縮を行うことができるが、操作が煩雑であり、１検体の処理に必要な時間が長く、また、貴重な目的物質を吸着した分離剤が磁気カラムに吸着されて溶出できなくなる場合があるなどの問題が指摘されている。 These problems are particularly serious when processing small amounts of many specimens. In the field of diagnostics and drug discovery, as a means to solve this problem, to increase the area for fixing affinity tags. In addition, a method of increasing the surface area per unit volume, for example, a method of reducing the size of the carrier to about 1 micron is taken. Furthermore, in order to automate the concentration and purification process, a separating agent has been developed in which the carrier can be recovered with a magnet. By using such a separating agent, better concentration and purification can be achieved in a small amount of multi-sample processing as compared with existing methods. By further reducing the size of the carrier, the amount of affinity tag immobilized can be increased, but the effect of Brownian motion on the carrier at a certain size cannot be ignored, and the carrier does not spontaneously settle in an aqueous solution. An aspect of a colloidal solution uniformly dispersed in an aqueous solution is shown. When such a carrier is used, the carrier can be separated by using an ultra-high speed centrifugation method, but the operation becomes complicated when processing multiple samples. In addition, when the carrier contains a magnetic component, the target substance can be separated and concentrated by using the magnetic column method, but the operation is complicated and the time required for processing one specimen is long. However, problems such as the separation agent adsorbing a valuable target substance being adsorbed on a magnetic column and becoming unable to be eluted have been pointed out.
また、他の有力な物質の単離、精製方法として、水性二相系における液−液抽出が知られている。液−液抽出による巨大分子や粒子の分離はよく知られている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。液−液抽出においては主としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−塩系、ＰＥＧ−デキストラン系およびＰＥＧ−でんぷん系が使用されてきた。水性二相系の利点は、特に、微生物のタンパク質の大量処理に適する点であり、微生物の培養上清液のみならず、微生物細胞や細胞の残渣を含む粗細胞抽出物からのタンパク質の精製に適している（非特許文献４、非特許文献５）。生体由来の液体およびその懸濁液の典型的な特徴は、その中に含有される粒子のサイズが比較的小さく、懸濁している固体との密度の差が小さく、抽出物される物質の粘度が高く、また、固体の圧縮性が高いことであり（非特許文献６）、これがタンパク質回収工程の早い段階で行われる遠心分離やろ過分離などの操作による固−液分離法の精製精度が低くなる原因である。水性二相系を用いることにより、固体の除去工程を液−液分離工程に統合することができるので、細胞除去も初期精製工程に組み込まれる（非特許文献４、非特許文献５）。 In addition, liquid-liquid extraction in an aqueous two-phase system is known as another effective method for isolating and purifying substances. Separation of macromolecules and particles by liquid-liquid extraction is well known (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3). In liquid-liquid extraction, mainly polyethylene glycol (PEG) -salt systems, PEG-dextran systems and PEG-starch systems have been used. The advantage of the aqueous two-phase system is that it is particularly suitable for large-scale processing of microbial proteins, not only for microbial culture supernatant but also for purification of proteins from crude cell extracts containing microbial cells and cell residues. Suitable (Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 5). Typical characteristics of biologically derived liquids and their suspensions are the relatively small size of the particles contained in them, the small difference in density from the suspended solids, and the viscosity of the substance to be extracted. And the compressibility of the solid is high (Non-patent Document 6), and this is a low purification accuracy of the solid-liquid separation method by operations such as centrifugation and filtration performed at an early stage of the protein recovery process. Is the cause. By using an aqueous two-phase system, the solid removal step can be integrated with the liquid-liquid separation step, so that cell removal is also incorporated into the initial purification step (Non-patent Documents 4 and 5).
抽出工程の後、相分離は遠心のみならず重力による沈降によっても行うことができる（非特許文献５）。水性二相系は非常に小さい実験室規模から大きな工業規模にまで適用可能であり、従って種々のタンパク質の性質に応じた使用が可能である。工業用目的では、分離時間を短縮化するために市販の遠心分離機を使用することができる。大容量の水性二相系を処理できるような様々な設計の遠心分離機の可能性について研究されている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献７）。これらの研究においては、ポリマー／ポリマー系またはポリマー／塩系を使用し、遠心分離機による水性二相系の連続分離の可能性が示されている。 After the extraction step, phase separation can be performed not only by centrifugation but also by sedimentation by gravity (Non-Patent Document 5). Aqueous two-phase systems are applicable from very small laboratory scales to large industrial scales and can therefore be used depending on the nature of various proteins. For industrial purposes, commercially available centrifuges can be used to shorten the separation time. The possibility of centrifuges of various designs that can handle large volumes of aqueous two-phase systems has been studied (Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 5, Non-Patent Document 7). In these studies, polymer / polymer systems or polymer / salt systems are used and the possibility of continuous separation of aqueous two-phase systems with a centrifuge has been shown.
水性二相系においては、目的物質、例えばタンパク質などは選択的に一つの相（好ましくは軽い相）に分配され、他の物質はもう一方の相（好ましくは重い相）に分配されるべきである。ポリエチレングリコール／塩、ポリエチレングリコール／デキストランや類似の系では、物質の移動に関与する力として、電荷、物質の疎水性または親水性、あるいは物質の立体構造やアフィニティタグとの相互作用が挙げられ、ポリエチレングリコール−アフィニティタグ複合体により水性二相分離上澄に目的物質を多く分配させた報告がある（非特許文献８）。界面活性剤を主成分とする水性二相系において分離を導く力は本質的に疎水性である（非特許文献９）。水性二相系における物質の移動を予見するための研究がなされてはいるが、どのようなモデルも実際の相の動態を示すことができず、予測することすらほとんど不可能である（非特許文献１０）。 In an aqueous two-phase system, the target substance, eg protein, should be selectively distributed in one phase (preferably light phase) and the other substance should be distributed in the other phase (preferably heavy phase). is there. In polyethylene glycol / salt, polyethylene glycol / dextran and similar systems, the forces involved in the movement of the substance include charge, hydrophobicity or hydrophilicity of the substance, or interaction with the three-dimensional structure of the substance and affinity tags, There is a report in which a large amount of a target substance is distributed to an aqueous two-phase separated supernatant by a polyethylene glycol-affinity tag complex (Non-patent Document 8). The force leading to separation in an aqueous two-phase system mainly composed of a surfactant is essentially hydrophobic (Non-patent Document 9). Although studies have been done to predict mass transfer in aqueous two-phase systems, no model can show actual phase dynamics, and it is almost impossible to predict (non-patented Reference 10).
このような問題を解決する一つの方法として、水性二相分離のいずれかの相への分配係数を大きくした目的物質を認識するターゲッティングタンパク質を添加する手法が開発されている。目的物質との複合体を形成した場合においても、ターゲッティングタンパクの効果により希望する相へ目的物質を分配させる研究がある（特許文献１）。
しかしながら、このような手法においても目的物質の分離操作は液量が多くなるなど、濃縮操作としてみた際に簡便とは言えない。
As one method for solving such a problem, a method of adding a targeting protein that recognizes a target substance having a large partition coefficient to any phase of aqueous two-phase separation has been developed. Even when a complex with a target substance is formed, there is a study of distributing the target substance to a desired phase by the effect of the targeting protein (Patent Document 1).
However, even in such a method, the separation operation of the target substance is not simple when viewed as a concentration operation, for example, the amount of liquid increases.
水性二相分離を利用した物質濃縮方法の一つに磁気分離を組み合わせた報告がある（非特許文献１１）。この方法では、目的とするタンパクの性質に依存した二相への分配のみにより分離を行っており、任意の目的物質を収率良く回収することが難しい。
また、アフィニティタグを固定した磁性微粒子による磁性二相分離を利用したプロテインＡの回収の報告がある（非特許文献１２）。しかしながら、用いられたＩｇＧ固定化磁性微粒子は、１５０００ＲＰＭ、１０分の高速遠心分離条件で回収していることから比較的大きな粒子であると考えられる。また、この報告では、プロテインＡ回収後の二相分離時に、磁性微粒子が上澄に分配しており、磁気分離が５分以上必要であることから、凝集
時の粒子径が大きくなりにくいと考えられる。
There is a report in which magnetic separation is combined with one of substance concentration methods using aqueous two-phase separation (Non-patent Document 11). In this method, separation is performed only by partitioning into two phases depending on the properties of the target protein, and it is difficult to recover any target substance with high yield.
In addition, there is a report on the recovery of protein A using magnetic two-phase separation by magnetic fine particles with an affinity tag immobilized (Non-patent Document 12). However, the IgG-immobilized magnetic fine particles used are considered to be relatively large particles because they are collected under high-speed centrifugation conditions at 15000 RPM for 10 minutes. In this report, magnetic particles are distributed in the supernatant during two-phase separation after protein A recovery, and magnetic separation is required for more than 5 minutes. It is done.
一方、アフィニティタグを固定した小粒子径の磁気ビーズを用いた際に発生する上記のような問題を解決する方法として、ビオチンおよびアビジンから選ばれた１種以上が下限臨界溶液温度を有する高分子を介して磁性微粒子に固定された熱応答性磁性微粒子と磁石の磁力を用いた生体物質の分離方法が開発されている（例えば特許文献２参照）。具体的には、この磁性微粒子は、アフィニティタグによる目的物質の吸着を行う際には、分離剤が水溶液中で均一に分散した状態で行うことができ、また、分離剤を回収する際には、溶液温度を変化させ、分離剤に固定化された下限臨界溶液温度または上限臨界溶液温度を有する高分子の効果で分離剤を凝集させて凝集塊とした後に磁石を用いて回収、濃縮することができる。
しかしながら、分離操作に温度の変化を必要とするため、濃縮、精製するべき目的物質によってはこの条件により機能を喪失することが予想され、さらに温和な条件での目的物質の濃縮、精製条件が求められていた。
従って本発明の課題は、分離剤に目的物質を吸着させる際には迅速に目的物質を吸着させるために分離剤が水溶液中で均一分散することができ、また、目的物質を吸着させた分離剤を水溶液から分離する際には凝集を形成して、遠心分離法、濾過分離法、磁気分離法などの分離条件を適用することのできる目的物質の濃縮方法、およびそれにより得られる分子コンプレックス凝集体を提供することである。本発明の更なる課題は、アフィニティタグおよび目的物質の活性を低下させることなく、分離条件を行う方法を提供することにある。本発明の更なる課題は、薬物発見、生化学的研究、または分子生体学的研究において標的物質の濃縮工程で有効に用いることのできる目的物質の濃縮方法を提供することにある。
However, since a change in temperature is required for the separation operation, depending on the target substance to be concentrated and purified, it is expected that the function will be lost due to this condition. It was done.
Accordingly, an object of the present invention is to allow a separating agent to be uniformly dispersed in an aqueous solution in order to quickly adsorb the target substance when the target substance is adsorbed to the separating agent. Method for concentrating a target substance to which separation conditions such as a centrifugal separation method, a filtration separation method, and a magnetic separation method can be applied, and a molecular complex aggregate obtained thereby Is to provide. A further object of the present invention is to provide a method for performing separation conditions without reducing the activity of the affinity tag and the target substance. A further object of the present invention is to provide a method for concentrating a target substance that can be effectively used in a target substance concentration step in drug discovery, biochemical research, or molecular biological research.
本発明者らは種々検討の結果、目的物質と相互作用により結合し得るアフィニティタグを固定した水溶性の親水性物質と、該親水性物質と混和することで分子コンプレックスを形成して凝集を発生させることのできる水溶性の凝集剤との二成分を用いることにより、上記目的を達成できることを見出したものである。すなわち、上記アフィニティタグを固定した親水性物質と、目的物質を含有すると予想される水溶液を混和して、親水性物質と目的物質の複合体を形成する工程、前記工程により目的物質と親水性物質の複合体を含む水溶液に対し、凝集剤を添加して、目的物質と親水性物質および凝集剤の分子コンプレックスを形成する工程、凝集した分子コンプレックスを水溶液から分離する工程、分離された分子コンプレックス凝集体を水により再分散させて水溶液とする工程を含む方法により、容易に目的物質の濃縮、精製を行うことができる。ここで、親水性物質は磁気成分を含む複合体であっても良く、これにより、磁気分離により容易に目的物質を分離することができる。すなわち、本発明は下記の構成よりなるものである。 As a result of various studies, the present inventors have formed a molecular complex by mixing a water-soluble hydrophilic substance with an affinity tag that can bind to the target substance by interaction with the hydrophilic substance to generate aggregation. It has been found that the above object can be achieved by using two components together with a water-soluble flocculant that can be produced. That is, a step of mixing the hydrophilic substance having the affinity tag fixed thereto with an aqueous solution expected to contain the target substance to form a complex of the hydrophilic substance and the target substance, and the target substance and the hydrophilic substance by the above-mentioned step A step of adding a flocculant to an aqueous solution containing the complex of the compound to form a molecular complex of a target substance, a hydrophilic substance and a flocculant, a step of separating the aggregated molecular complex from the aqueous solution, and a separated molecular complex coagulation. The target substance can be easily concentrated and purified by a method including a step of re-dispersing the aggregate with water to obtain an aqueous solution. Here, the hydrophilic substance may be a complex containing a magnetic component, whereby the target substance can be easily separated by magnetic separation. That is, the present invention has the following configuration.
（１）生理学的物質および化学物質から選択される少なくとも一つの目的物質を、該目的物質と相互作用により結合し得るアフィニティタグを固定した水溶性の親水性物質および該親水性物質と混和することで水性二相分離を発現する水溶性の凝集剤の少なくとも二成分を用いて分離する方法であって、該目的物質と結合し得るアフィニティタグを有する親水性物質に該目的物質を作用させて、目的物質と親水性物質との結合体を均一分散系で形
成する工程、該目的物質と親水性物質との結合体に、該親水性物質と水性二液分離可能な複合体を形成する凝集剤を作用させて、高分子コンプレックスもしくは低分子コンプレックス（以下「分子コンプレックス」と称する）の凝集体を形成する工程、該分子コンプレックス凝集体を上澄から分離する工程を含むことを特徴とする目的物質の分離方法。
(1) Mixing at least one target substance selected from physiological substances and chemical substances with a water-soluble hydrophilic substance to which an affinity tag capable of binding by interaction with the target substance is fixed and the hydrophilic substance A separation method using at least two components of a water-soluble flocculant that exhibits aqueous two-phase separation, wherein the target substance is allowed to act on a hydrophilic substance having an affinity tag that can bind to the target substance. A step of forming a conjugate of a target substance and a hydrophilic substance in a uniform dispersion system; a flocculant that forms a complex capable of separating the hydrophilic substance and an aqueous solution into a conjugate of the target substance and the hydrophilic substance; To form an aggregate of a high molecular complex or a low molecular complex (hereinafter referred to as “molecular complex”), and the molecular complex aggregate is separated from the supernatant. The method of separating a target substance which comprises an that step.
（２）生理学的物質および化学物質から選択される少なくとも一つの目的物質を、該目的物質と相互作用により結合し得るアフィニティタグを固定した水溶性の親水性物質と磁気成分との複合体（以下「親水性物質／磁気成分複合体」と称する）および該親水性物質と混和することで水性二相分離を発現する水溶性の凝集剤の少なくとも二成分を用いて分離する方法であって、該目的物質と結合し得るアフィニティタグを有する親水性物質と磁気成分との複合体に該目的物質を作用させて、目的物質と親水性物質／磁気成分複合体との結合体を均一分散系で形成する工程、該目的物質と親水性物質／磁気成分複合体との結合体に、該親水性物質と水性二液分離可能な複合体を形成する凝集剤を作用させて、分子コンプレックス凝集体を形成する工程、該分子コンプレックス凝集体を上澄から分離する工程を含むことを特徴とする目的物質の分離方法。 (2) A complex of a water-soluble hydrophilic substance and a magnetic component to which an affinity tag capable of binding at least one target substance selected from a physiological substance and a chemical substance by interaction with the target substance (hereinafter referred to as a complex substance) A method of separating using at least two components of a water-soluble flocculant that expresses aqueous two-phase separation by mixing with the hydrophilic material, which is referred to as “hydrophilic substance / magnetic component complex” The target substance is allowed to act on a complex of a hydrophilic substance having an affinity tag capable of binding to the target substance and the magnetic component, thereby forming a conjugate of the target substance and the hydrophilic substance / magnetic component complex in a uniform dispersion system. A molecular complex aggregate is formed by allowing an aggregating agent to form a complex that can be separated into an aqueous two-component solution to the conjugate of the target substance and the hydrophilic substance / magnetic component complex. You Step method for separating a target substance which comprises a step of separating the molecular complex aggregates from the supernatant.
（３）上記アフィニティタグが、二種以上の異なるアフィニティタグの連続体であることを特徴とする上記（１）または（２）記載の分離方法。 (3) The separation method according to (1) or (2), wherein the affinity tag is a continuum of two or more different affinity tags.
（４）上記親水性物質がポリオールである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の分離方法。
（５）上記親水性物質がポリサッカライドまたはポリサッカライド誘導体である上記（４）記載の分離方法。
（６）上記親水性物質がデキストラン、デキストリン、セルロース、アガロース、澱粉、カルボキシメチルセルロース、ジエチルアミノセルロース、ヒドロキシアセチルセルロース、ジエチルアミノエチルセルロース、ヒドロキシアセチルセルロース、プルラン、アミロース、ゼラチン、アラビノースガラクタンから選択される少なくとも１種である上記（５）記載の分離方法。
（７）上記親水性物質がデキストランである上記（６）記載の分離方法。
(4) The separation method according to any one of (1) to (3), wherein the hydrophilic substance is a polyol.
(5) The separation method according to (4), wherein the hydrophilic substance is a polysaccharide or a polysaccharide derivative.
(6) The hydrophilic substance is at least one selected from dextran, dextrin, cellulose, agarose, starch, carboxymethylcellulose, diethylaminocellulose, hydroxyacetylcellulose, diethylaminoethylcellulose, hydroxyacetylcellulose, pullulan, amylose, gelatin, and arabinose galactan. The separation method according to (5), wherein
(7) The separation method according to (6), wherein the hydrophilic substance is dextran.
（８）上記親水性物質が水酸基を有する合成ポリオールである上記（４）記載の分離方法。
（９）上記親水性物質がポリビニルアルコールおよびポリアリルアルコールから選択される少なくとも１種である上記（８）記載の分離方法。
（１０）上記親水性物質が水酸基を有する重合性単量体を重合して得られた合成ポリマーである上記（８）記載の分離方法。
（１１）上記親水性物質が、重合性単量体としてアリルアルコール、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセロール−モノ（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレート、３−ヒドロキシブチルアクリレート、３−ヒドロキシプロピルアクリレート、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルアクリレートから選択される少なくとも一種を重合して得られた合成ポリマーである上記（１０）記載の分離方法。
（１２）上記親水性物質が、重合性単量体として、水酸基を保護された、アリルアルコール、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセロール−モノ（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレート、３−ヒドロキシブチルアクリレート、３−ヒドロキシプロピルアクリレート、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルアクリレートから選択される少なくとも一種を重合して得られた合成ポリマーから、該水酸基の保護基を除去した合成ポリマーである上記（１０）記載の分離方法。
(8) The separation method according to (4), wherein the hydrophilic substance is a synthetic polyol having a hydroxyl group.
(9) The separation method according to (8), wherein the hydrophilic substance is at least one selected from polyvinyl alcohol and polyallyl alcohol.
(10) The separation method according to (8), wherein the hydrophilic substance is a synthetic polymer obtained by polymerizing a polymerizable monomer having a hydroxyl group.
(11) The hydrophilic substance is allyl alcohol, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycerol-mono (meth) acrylate, 4-hydroxybutyl acrylate, 3-hydroxybutyl acrylate, 3-hydroxy as a polymerizable monomer. The separation method according to the above (10), which is a synthetic polymer obtained by polymerizing at least one selected from propyl acrylate and 2-hydroxy-2-methylpropyl acrylate.
(12) The hydrophilic substance, as a polymerizable monomer, is a hydroxyl group-protected allyl alcohol, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycerol-mono (meth) acrylate, 4-hydroxybutyl acrylate, 3- The above synthetic polymer obtained by removing the protective group of the hydroxyl group from a synthetic polymer obtained by polymerizing at least one selected from hydroxybutyl acrylate, 3-hydroxypropyl acrylate and 2-hydroxy-2-methylpropyl acrylate ( 10) The separation method described.
（１３）上記親水性物質／磁気成分複合体における磁気成分が、マグネタイト、マグヘマイトおよびヘマタイトから選択される少なくとも一種を含有することを特徴とする上記（
２）〜（１２）のいずれかに記載の分離方法。
（１４）上記親水性物質／磁気成分複合体が、磁気成分表面への親水性物質の物理的な吸着および化学的固定化の少なくともいずれか一方により得られることを特徴とする上記（１３）記載の分離方法。
（１５）上記親水性物質／磁気成分複合体が、親水性物質を含有する水溶液中での鉄イオンの共沈法によって調製されていることを特徴とする上記（１３）記載の分離方法。
（１６）上記親水性物質／磁気成分複合体における磁気成分が、ラテックス磁気ビーズである上記（１３）記載の分離方法。
(13) The magnetic component in the hydrophilic substance / magnetic component composite contains at least one selected from magnetite, maghemite, and hematite.
The separation method according to any one of 2) to (12).
(14) The above-mentioned (13), wherein the hydrophilic substance / magnetic component complex is obtained by at least one of physical adsorption and chemical immobilization of the hydrophilic substance on the surface of the magnetic component. Separation method.
(15) The separation method according to (13), wherein the hydrophilic substance / magnetic component complex is prepared by a coprecipitation method of iron ions in an aqueous solution containing a hydrophilic substance.
(16) The separation method according to (13), wherein the magnetic component in the hydrophilic substance / magnetic component complex is latex magnetic beads.
（１７）上記アフィニティタグと目的物質との組み合わせ（アフィニティタグ／目的物質）が、抗体／ペプチド、抗体／抗原、抗体のフラグメント／抗原、核酸／核酸、タンパク質／核酸、ペプチド／ペプチド、タンパク質／タンパク質、薬物候補物質／タンパク質、グルタチオン／ＧＳＴ、マルトース／マルトース結合タンパク質、炭水化物／タンパク質、炭水化物誘導体／タンパク質、ペプチドタグ／金属イオン−金属キレート、ペプチド／ＮＴＡ−Ｎｉ、プロテインＡ／抗体、プロテインＧ／抗体、プロテインＬ／抗体、Ｆｃレセプター／抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ジンクフィンガー／核酸、薬物候補物質／ペプチド、薬物候補物質／レセプター、および金属イオン／キレート剤／ポリアミノ酸からなる群から選択される少なくとも一種である上記（１）〜（１６）のいずれかに記載の分離方法。
（１８）上記アフィニティタグと目的物質との組み合わせ（目的物質／アフィニティタグ）が、抗体／ペプチド、抗体／抗原、抗体のフラグメント／抗原、タンパク質／核酸、薬物候補物質／タンパク質、炭水化物／タンパク質、炭水化物誘導体／タンパク質、ペプチドタグ／金属イオン−金属キレート、プロテインＡ／抗体、プロテインＧ／抗体、プロテインＬ／抗体、Ｆｃレセプター／抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ジンクフィンガー／核酸、薬物候補物質／ペプチド、および金属イオン／キレート剤／ポリアミノ酸からなる群から選択される少なくとも一種である上記（１）〜（１６）のいずれかに記載の分離方法。
(17) A combination of the affinity tag and the target substance (affinity tag / target substance) is antibody / peptide, antibody / antigen, antibody fragment / antigen, nucleic acid / nucleic acid, protein / nucleic acid, peptide / peptide, protein / protein , Drug candidate / protein, glutathione / GST, maltose / maltose binding protein, carbohydrate / protein, carbohydrate derivative / protein, peptide tag / metal ion-metal chelate, peptide / NTA-Ni, protein A / antibody, protein G / antibody Protein L / antibody, Fc receptor / antibody, biotin / avidin, biotin / streptavidin, zinc finger / nucleic acid, drug candidate / peptide, drug candidate / receptor, and metal ion / chelator / polyamino acid The method of separation according to any one of the above (1) to (16) is at least one selected from that group.
(18) A combination of the affinity tag and the target substance (target substance / affinity tag) is antibody / peptide, antibody / antigen, antibody fragment / antigen, protein / nucleic acid, drug candidate substance / protein, carbohydrate / protein, carbohydrate Derivative / protein, peptide tag / metal ion-metal chelate, protein A / antibody, protein G / antibody, protein L / antibody, Fc receptor / antibody, biotin / avidin, biotin / streptavidin, zinc finger / nucleic acid, drug candidate substance The separation method according to any one of (1) to (16) above, which is at least one selected from the group consisting of: / peptide, and metal ion / chelating agent / polyamino acid.
（１９）アフィニティタグと目的物質の相互作用が、抗体とペプチドの相互作用、抗体と抗原の相互作用、抗体のフラグメントと抗原の相互作用、核酸と核酸の相互作用、タンパク質と核酸の相互作用、ペプチドとペプチドの相互作用、タンパク質とタンパク質の相互作用、薬物候補物質とタンパク質の相互作用、グルタチオンとＧＳＴの相互作用、マルトースとマルトース結合タンパク質の相互作用、炭水化物とタンパク質の相互作用、炭水化物誘導体とタンパク質の相互作用、ペプチドタグと金属イオン−金属キレートの相互作用、ペプチドとＮＴＡ−Ｎｉの相互作用、プロテインＡと抗体の相互作用、プロテインＧと抗体の相互作用、プロテインＬと抗体の相互作用、Ｆｃレセプターと抗体の相互作用、ビオチンとアビジンの相互作用、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用、ジンクフィンガーと核酸の相互作用、薬物候補物質とペプチドの相互作用、薬物候補物質とレセプターの相互作用、および金属イオンとキレート剤とポリアミノ酸の相互作用からなる群から選択される少なくとも一種である上記（１）〜（１６）のいずれかに記載の分離方法。 (19) The interaction between the affinity tag and the target substance is an interaction between the antibody and the peptide, an interaction between the antibody and the antigen, an interaction between the antibody fragment and the antigen, an interaction between the nucleic acid and the nucleic acid, an interaction between the protein and the nucleic acid, Peptide-peptide interaction, protein-protein interaction, drug candidate-protein interaction, glutathione-GST interaction, maltose-maltose-binding protein interaction, carbohydrate-protein interaction, carbohydrate derivative-protein Interaction, peptide tag and metal ion-metal chelate interaction, peptide and NTA-Ni interaction, protein A and antibody interaction, protein G and antibody interaction, protein L and antibody interaction, Fc Interaction between receptor and antibody, interaction between biotin and avidin From the group consisting of biotin and streptavidin interaction, zinc finger and nucleic acid interaction, drug candidate and peptide interaction, drug candidate and receptor interaction, and metal ion, chelator and polyamino acid interaction The separation method according to any one of (1) to (16), which is at least one selected.
（２０）上記親水性物質または上記親水性物質／磁気成分複合体と水性二液分離可能な複合体を形成する凝集剤が、ポリアルキレングリコールである上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の分離方法。
（２１）上記親水性物質または上記親水性物質／磁気成分複合体と水性二液分離可能な複合体を形成する凝集剤が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールランダムコポリマーおよびポリエチレングリコールポリプロピレングリコールブロックコポリマーから選択される少なくとも一種である上記（２０）記載の分離方法。
（２２）上記親水性物質または上記親水性物質／磁気成分複合体と水性二液分離可能な複
合体を形成する凝集剤が、ポリエチレングリコールである上記（２０）記載の分離方法。
(20) The flocculant that forms an aqueous two-component separable complex with the hydrophilic substance or the hydrophilic substance / magnetic component complex is any one of the above (1) to (19), which is a polyalkylene glycol. The separation method described.
(21) The flocculant forming the hydrophilic substance or the hydrophilic substance / magnetic component complex and an aqueous two-component separable complex is composed of polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyethylene glycol polypropylene glycol random copolymer, and polyethylene glycol polypropylene glycol. The separation method according to the above (20), which is at least one selected from block copolymers.
(22) The separation method according to the above (20), wherein the aggregating agent forming the hydrophilic substance or the hydrophilic substance / magnetic component complex and the aqueous two-component separable complex is polyethylene glycol.
（２３）上記親水性物質または上記親水性物質／磁気成分複合体と凝集剤とから得られる分子コンプレックス凝集体を、遠心分離により上澄から分離することを特徴とする上記（２）〜（２２）のいずれかに記載の分離方法。
（２４）上記親水性物質または上記親水性物質／磁気成分複合体と凝集剤とから得られる分子コンプレックス凝集体を、濾過分離により上澄から分離することを特徴とする上記（２）〜（２２）のいずれかに記載の分離方法。
（２５）上記親水性物質または上記親水性物質／磁気成分複合体と凝集剤とから得られる分子コンプレックス凝集体を、磁気分離により上澄から分離することを特徴とする上記（２）〜（２２）のいずれかに記載の分離方法。
(23) The molecular complex aggregate obtained from the hydrophilic substance or the hydrophilic substance / magnetic component complex and an aggregating agent is separated from the supernatant by centrifugation, (2) to (22) ).
(24) The above-mentioned (2) to (22), wherein a molecular complex aggregate obtained from the hydrophilic substance or the hydrophilic substance / magnetic component complex and an aggregating agent is separated from a supernatant by filtration separation. ).
(25) The above-mentioned (2) to (22), wherein a molecular complex aggregate obtained from the hydrophilic substance or the hydrophilic substance / magnetic component complex and a flocculant is separated from the supernatant by magnetic separation. ).
（２６）生理学的物質および化学物質から選択される少なくとも一つの目的物質と、該目的物質と相互作用により結合し得るアフィニティタグを固定した水溶性の親水性物質と、該親水性物質と混和することで水性二相分離を発現する水溶性の凝集剤とを含有する分子コンプレックス。
（２７）生理学的物質および化学物質から選択される少なくとも一つの目的物質と、該目的物質と相互作用により結合し得るアフィニティタグを固定した水溶性の親水性物質と磁気成分との複合体と、該親水性物質と混和することで水性二相分離を発現する水溶性の凝集剤とを含有する分子コンプレックス。
（２８）上記アフィニティタグが、二種以上の異なるアフィニティタグの連続体であることを特徴とする上記（２６）または（２７）記載の分子コンプレックス。
(26) At least one target substance selected from physiological substances and chemical substances, a water-soluble hydrophilic substance to which an affinity tag capable of binding by interaction with the target substance is fixed, and the hydrophilic substance are mixed And a water-soluble flocculant that exhibits aqueous two-phase separation.
(27) a complex of at least one target substance selected from physiological substances and chemical substances, a water-soluble hydrophilic substance to which an affinity tag capable of binding by interaction with the target substance is fixed, and a magnetic component; A molecular complex containing a water-soluble flocculant that develops aqueous two-phase separation by mixing with the hydrophilic substance.
(28) The molecular complex as described in (26) or (27) above, wherein the affinity tag is a continuum of two or more different affinity tags.
（２９）上記親水性物質がポリオールである上記（２６）〜（２８）のいずれかに記載の分子コンプレックス。
（３０）上記親水性物質がポリサッカライドまたはポリサッカライド誘導体である上記（２９）記載の分子コンプレックス。
（３１）上記親水性物質がデキストラン、デキストリン、セルロース、アガロース、澱粉、カルボキシメチルセルロース、ジエチルアミノセルロース、ヒドロキシアセチルセルロース、ジエチルアミノエチルセルロース、ヒドロキシアセチルセルロース、プルラン、アミロースおよびゼラチン、アラビノースガラクタンから選択される少なくとも１種である上記（３０）記載の分子コンプレックス。
（３２）上記親水性物質がデキストランである上記（３１）記載の分子コンプレックス。
(29) The molecular complex according to any one of (26) to (28), wherein the hydrophilic substance is a polyol.
(30) The molecular complex according to the above (29), wherein the hydrophilic substance is a polysaccharide or a polysaccharide derivative.
(31) The hydrophilic substance is at least one selected from dextran, dextrin, cellulose, agarose, starch, carboxymethylcellulose, diethylaminocellulose, hydroxyacetylcellulose, diethylaminoethylcellulose, hydroxyacetylcellulose, pullulan, amylose and gelatin, and arabinose galactan The molecular complex according to the above (30), wherein
(32) The molecular complex according to the above (31), wherein the hydrophilic substance is dextran.
（３３）上記親水性物質が水酸基を有する合成ポリオールである上記（２９）記載の分子コンプレックス。
（３４）上記親水性物質がポリビニルアルコールおよびポリアリルアルコールから選択される少なくとも１種である上記（３３）記載の分子コンプレックス。
（３５）上記親水性物質が水酸基を有する重合性単量体を重合して得られた合成ポリマーである上記（３３）記載の分子コンプレックス。
（３６）上記親水性物質が、重合性単量体としてアリルアルコール、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセロール−モノ（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレート、３−ヒドロキシブチルアクリレート、３−ヒドロキシプロピルアクリレートおよび２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルアクリレートから選択される少なくとも一種を重合して得られた合成ポリマーである上記（３５）記載の分子コンプレックス。（３７）上記親水性物質が、重合性単量体として、水酸基を保護された、アリルアルコール、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセロール−モノ（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレート、３−ヒドロキシブチルアクリレート、３−ヒドロキシプロピルアクリレートおよび２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルアクリレートから選択される少なくとも一種を重合して得られた合成ポリマーから、該水酸基の保護基
を除去した合成ポリマーである上記（３５）記載の分子コンプレックス。
(33) The molecular complex according to the above (29), wherein the hydrophilic substance is a synthetic polyol having a hydroxyl group.
(34) The molecular complex according to the above (33), wherein the hydrophilic substance is at least one selected from polyvinyl alcohol and polyallyl alcohol.
(35) The molecular complex according to (33) above, wherein the hydrophilic substance is a synthetic polymer obtained by polymerizing a polymerizable monomer having a hydroxyl group.
(36) The hydrophilic substance may be allyl alcohol, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycerol-mono (meth) acrylate, 4-hydroxybutyl acrylate, 3-hydroxybutyl acrylate, 3-hydroxy as a polymerizable monomer. The molecular complex according to the above (35), which is a synthetic polymer obtained by polymerizing at least one selected from propyl acrylate and 2-hydroxy-2-methylpropyl acrylate. (37) Allyl alcohol, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycerol-mono (meth) acrylate, 4-hydroxybutyl acrylate, 3-hydroxyl-protected hydroxy group as a polymerizable monomer. The above-mentioned synthetic polymer obtained by removing the hydroxyl protecting group from a synthetic polymer obtained by polymerizing at least one selected from hydroxybutyl acrylate, 3-hydroxypropyl acrylate and 2-hydroxy-2-methylpropyl acrylate ( 35) The molecular complex described.
（３８）上記親水性物質／磁気成分複合体における磁気成分が、マグネタイト、マグヘマイトおよびヘマタイトから選択される少なくとも一種を含有することを特徴とする上記（２７）〜（３７）のいずれかに記載の分子コンプレックス。
（３９）上記親水性物質／磁気成分複合体が、磁気成分表面への親水性物質の物理的な吸着および化学的固定化の少なくともいずれか一方により得られることを特徴とする上記（３８）記載の分子コンプレックス。
（４０）上記親水性物質／磁気成分複合体が、親水性物質を含有する水溶液中での鉄イオンの共沈法によって調製されていることを特徴とする上記（３８）記載の分子コンプレックス。
（４１）上記親水性物質／磁気成分複合体における磁気成分が、ラテックス磁気ビーズである上記（３８）記載の分子コンプレックス。
(38) The magnetic component in the hydrophilic substance / magnetic component composite contains at least one selected from magnetite, maghemite, and hematite, as described in any one of (27) to (37) above Molecular complex.
(39) The above-mentioned (38), wherein the hydrophilic substance / magnetic component complex is obtained by at least one of physical adsorption and chemical immobilization of the hydrophilic substance on the surface of the magnetic component. Molecular complex.
(40) The molecular complex as described in (38) above, wherein the hydrophilic substance / magnetic component complex is prepared by a coprecipitation method of iron ions in an aqueous solution containing a hydrophilic substance.
(41) The molecular complex according to the above (38), wherein the magnetic component in the hydrophilic substance / magnetic component complex is latex magnetic beads.
（４２）上記アフィニティタグと目的物質との組み合わせ（アフィニティタグ／目的物質）が、抗体／ペプチド、抗体／抗原、抗体のフラグメント／抗原、核酸／核酸、タンパク質／核酸、ペプチド／ペプチド、タンパク質／タンパク質、薬物候補物質／タンパク質、グルタチオン／ＧＳＴ、マルトース／マルトース結合タンパク質、炭水化物／タンパク質、炭水化物誘導体／タンパク質、ペプチドタグ／金属イオン−金属キレート、ペプチド／ＮＴＡ−Ｎｉ、プロテインＡ／抗体、プロテインＧ／抗体、プロテインＬ／抗体、Ｆｃレセプター／抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ジンクフィンガー／核酸、薬物候補物質／ペプチド、薬物候補物質／レセプター、および金属イオン／キレート剤／ポリアミノ酸からなる群から選択される少なくとも一種である上記（２６）〜（４１）のいずれかに記載の分子コンプレックス。 (42) The combination of the affinity tag and the target substance (affinity tag / target substance) is antibody / peptide, antibody / antigen, antibody fragment / antigen, nucleic acid / nucleic acid, protein / nucleic acid, peptide / peptide, protein / protein , Drug candidate / protein, glutathione / GST, maltose / maltose binding protein, carbohydrate / protein, carbohydrate derivative / protein, peptide tag / metal ion-metal chelate, peptide / NTA-Ni, protein A / antibody, protein G / antibody Protein L / antibody, Fc receptor / antibody, biotin / avidin, biotin / streptavidin, zinc finger / nucleic acid, drug candidate / peptide, drug candidate / receptor, and metal ion / chelator / polyamino acid Molecular complex according to any one of the above (26) to (41) is at least one selected from that group.
（４３）アフィニティタグと目的物質の相互作用が、抗体とペプチドの相互作用、抗体と抗原の相互作用、抗体のフラグメントと抗原の相互作用、核酸と核酸の相互作用、タンパク質と核酸の相互作用、ペプチドとペプチドの相互作用、タンパク質とタンパク質の相互作用、薬物候補物質とタンパク質の相互作用、グルタチオンとＧＳＴの相互作用、マルトースとマルトース結合タンパク質の相互作用、炭水化物とタンパク質の相互作用、炭水化物誘導体とタンパク質の相互作用、ペプチドタグと金属イオン−金属キレートの相互作用、ペプチドとＮＴＡ−Ｎｉの相互作用、プロテインＡと抗体の相互作用、プロテインＧと抗体の相互作用、プロテインＬと抗体の相互作用、Ｆｃレセプターと抗体の相互作用、ビオチンとアビジンの相互作用、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用、ジンクフィンガーと核酸の相互作用、薬物候補物質とペプチドの相互作用、薬物候補物質とレセプターの相互作用、および金属イオンとキレート剤とポリアミノ酸の相互作用からなる群から選択される少なくとも一種である上記（２６）〜（４１）のいずれかに記載の分子コンプレックス。 (43) The interaction between the affinity tag and the target substance is an interaction between the antibody and the peptide, an interaction between the antibody and the antigen, an interaction between the antibody fragment and the antigen, an interaction between the nucleic acid and the nucleic acid, an interaction between the protein and the nucleic acid, Peptide-peptide interaction, protein-protein interaction, drug candidate-protein interaction, glutathione-GST interaction, maltose-maltose-binding protein interaction, carbohydrate-protein interaction, carbohydrate derivative-protein Interaction, peptide tag and metal ion-metal chelate interaction, peptide and NTA-Ni interaction, protein A and antibody interaction, protein G and antibody interaction, protein L and antibody interaction, Fc Interaction between receptor and antibody, interaction between biotin and avidin From the group consisting of biotin and streptavidin interaction, zinc finger and nucleic acid interaction, drug candidate and peptide interaction, drug candidate and receptor interaction, and metal ion, chelator and polyamino acid interaction The molecular complex according to any one of (26) to (41), which is at least one selected.
（４４）上記親水性物質または上記親水性物質／磁気成分複合体と水性二液分離可能な複合体を形成する凝集剤が、ポリアルキレングリコールである上記（２６）〜（４３）のいずれかに記載の分子コンプレックス。
（４５）上記親水性物質または上記親水性物質／磁気成分複合体と水性二液分離可能な複合体を形成する凝集剤が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールランダムコポリマーおよびポリエチレングリコールポリプロピレングリコールブロックコポリマーから選択される少なくとも一種である上記（４４）記載の分子コンプレックス。
（４６）上記親水性物質または上記親水性物質／磁気成分複合体と水性二液分離可能な複合体を形成する凝集剤が、ポリエチレングリコールである上記（４４）記載の分子コンプレックス。
(44) The flocculant that forms an aqueous two-component separable complex with the hydrophilic substance or the hydrophilic substance / magnetic component complex is any one of the above (26) to (43), which is a polyalkylene glycol. The molecular complex described.
(45) The flocculant forming the hydrophilic substance or the hydrophilic substance / magnetic component complex and an aqueous two-component separable complex is composed of polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyethylene glycol polypropylene glycol random copolymer, and polyethylene glycol polypropylene glycol. The molecular complex according to the above (44), which is at least one selected from block copolymers.
(46) The molecular complex according to the above (44), wherein the aggregating agent that forms an aqueous two-component separable complex with the hydrophilic substance or the hydrophilic substance / magnetic component complex is polyethylene glycol.
（４７）上記親水性物質または上記親水性物質／磁気成分複合体と凝集剤とから得られる分子コンプレックス凝集体を、遠心分離により上澄から分離することを特徴とする上記（２６）〜（４６）のいずれかに記載の分子コンプレックス。
（４８）上記親水性物質または上記親水性物質／磁気成分複合体と凝集剤とから得られる分子コンプレックス凝集体を、濾過分離により上澄から分離することを特徴とする上記（２６）〜（４６）のいずれかに記載の分子コンプレックス。
（４９）上記親水性物質または上記親水性物質／磁気成分複合体と凝集剤とから得られる分子コンプレックス凝集体を、磁気分離により上澄から分離することを特徴とする上記（２６）〜（４６）のいずれかに記載の分子コンプレックス。
（５０）上記分子コンプレックス凝集体を上澄から分離する工程によって、分離された該分子コンプレックス凝集体を水に再分散させて水溶液とする工程を含むことを特徴とする上記（１）または（２）記載の目的物質の分離方法。
(47) The molecular complex aggregate obtained from the hydrophilic substance or the hydrophilic substance / magnetic component complex and the flocculant is separated from the supernatant by centrifugation, (26) to (46) ).
(48) The above-mentioned (26) to (46), wherein a molecular complex aggregate obtained from the hydrophilic substance or the hydrophilic substance / magnetic component complex and a flocculant is separated from the supernatant by filtration separation. ).
(49) The molecular complex aggregate obtained from the hydrophilic substance or the hydrophilic substance / magnetic component complex and an aggregating agent is separated from the supernatant by magnetic separation, (26) to (46) ).
(50) The above-mentioned (1) or (2), comprising a step of re-dispersing the separated molecular complex aggregate in water by the step of separating the molecular complex aggregate from the supernatant to form an aqueous solution. ) A method for separating the target substance as described.
本発明によれば、目的物質を迅速かつ効率よく濃縮することができる。特に本発明によれば、氷冷下においても迅速に目的物の回収が可能であり、熱に不安定なタンパク質などの生物学的物質を好適に回収することができる。
更に、本発明によれば、アフィニティタグおよび目的物質の活性を低下させることなく、分離条件を適宜設定して、容易に目的物質を分離することができる。
本発明の方法は、特に、薬物発見、生化学的研究、または分子生体学的研究において標的物質の濃縮工程で有効に用いることができる。
According to the present invention, the target substance can be concentrated quickly and efficiently. In particular, according to the present invention, a target substance can be quickly recovered even under ice-cooling, and biological substances such as heat-labile proteins can be preferably recovered.
Furthermore, according to the present invention, the target substance can be easily separated by appropriately setting the separation conditions without reducing the activities of the affinity tag and the target substance.
The method of the present invention can be effectively used in a target substance concentration step, particularly in drug discovery, biochemical research, or molecular biological research.
＜親水性物質＞
本発明の水溶性の親水性物質は、磁性あるいは非磁性のいずれであっても良く、構造中に水酸基を有することが好ましく、構造中にポリオールを有することが特に好ましい。
ポリオールとしては、デキストラン、デキストリン、セルロース、アガロース、澱粉、ジェラン等のポリサッカライド類、カルボキシメチルセルロース、ジエチルアミノセルロース、ヒドロキシアセチルセルロース、ヒドロキシアセチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、ジエチルアミノエチルセルロース、ジエチルアミノエチルデキストラン等のポリサッカライド誘導体、ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコールなどの合成ポリオール、重合性単量体として、アリルアルコール、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセロール−モノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド等の水酸基を有する重合性単量体の少なくとも一種を重合成分として含有する重合体、酢酸エステル型、トリメチルシリルエーテル型、ｔ−ブトキシカルボニルオキシ型の保護された水酸基を有するビニルアルコールを含む重合性単量体の少なくとも一種を重合成分として含有する重合体から水酸基の保護を除去して得られるポリビニルアルコールランダムコポリマーなどを挙げることができる。これらのポリオールは１種単独または２種以上組み合わせて使用することができる。
<Hydrophilic substance>
The water-soluble hydrophilic substance of the present invention may be either magnetic or non-magnetic, preferably has a hydroxyl group in the structure, and particularly preferably has a polyol in the structure.
Polyols include polysaccharides such as dextran, dextrin, cellulose, agarose, starch, gellan, and polysaccharide derivatives such as carboxymethylcellulose, diethylaminocellulose, hydroxyacetylcellulose, hydroxyacetylcellulose, carboxymethyldextran, diethylaminoethylcellulose, diethylaminoethyldextran, etc. , Synthetic polyols such as polyvinyl alcohol and polyallyl alcohol, and polymerizable monomers such as allyl alcohol, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycerol-mono (meth) acrylate, 2-hydroxyethyl (meth) acrylamide and the like A polymer containing at least one polymerizable monomer having a polymerization component, acetate type, Polyvinyl alcohol obtained by removing protection of hydroxyl groups from a polymer containing as a polymerization component at least one polymerizable monomer containing a vinyl alcohol having a protected hydroxyl group of the limethylsilyl ether type or t-butoxycarbonyloxy type. Examples thereof include alcohol random copolymers. These polyols can be used singly or in combination of two or more.
なかでも、ポリサッカライド類またはポリサッカライド誘導体等の糖骨格を含有する中性のポリマーが好ましい。具体的には、水性二相分配用の相を形成する作用を有するものであればよく、グルコース骨格などの糖骨格を含有する水溶性ポリマーであって、電気的に中性のポリマーであり、例えばデキストランなどの澱粉、より好ましくは、デキストランが挙げられる。デキストランとしては、実験により最適な重量平均分子量を持つものを選んで使用することができ、例えば重量平均分子量10,000〜100,000のもの、重量平均分子量60,000〜600,000のもの、さらには重量平均分子量67,300〜500,900のものが挙げられ、例えばシグマ社などから入手できる。 Among these, neutral polymers containing a sugar skeleton such as polysaccharides or polysaccharide derivatives are preferable. Specifically, it may be any water-soluble polymer containing a sugar skeleton such as a glucose skeleton, as long as it has an action of forming a phase for aqueous two-phase partitioning, and is an electrically neutral polymer. For example, starch such as dextran, more preferably dextran is used. As the dextran, those having an optimum weight average molecular weight can be selected and used by experiments, for example, those having a weight average molecular weight of 10,000 to 100,000, those having a weight average molecular weight of 60,000 to 600,000, and further having a weight average molecular weight of 67,300 to 500,900. For example, it can be obtained from Sigma.
親水性物質が磁気成分との複合体であって磁性を有する場合、親水性物質／磁気成分複合体に含有される磁気成分は、たとえば磁性微粒子であり、磁性金属微粒子、磁性酸化物微粒子などを挙げることができる。これらの磁性微粒子は、必要に応じて、希土類元素や遷移金属元素を含有していても良い。磁性金属微粒子としては、たとえば、Ｆｅ−Ｃｏ、Ｆｅ−Ｎｉ、Ｆｅ−Ａｌ、Ｆｅ−Ｎｉ−Ａｌ、Ｆｅ−Ｃｏ−Ｎｉ、Ｆｅ−Ｎｉ−Ａｌ−Ｚｎ、Ｆｅ−Ａｌ−Ｓｉなどの金属微粒子を挙げることができる。磁性酸化物微粒子として、ＦｅＯｘ（４／３≦ｘ≦３／２）で表される酸化鉄（フェライト）型の強磁性微粒子、Ｆｅの一部がＮｉ、Ｃｏで一部置換されたフェライトを挙げることができる。より具体的には、磁性微粒子の素材として、マグネタイト、酸化ニッケル、フェライト、コバルト鉄酸化物、バリウムフェライト、炭素鋼、タングステン鋼、ＫＳ鋼、希土類コバルト磁石、マグヘマイト、ヘマタイト等の微粒子を挙げることができる。なかでも、マグネタイト、マグヘマイトおよびヘマタイトが好ましく利用できる。これらの磁性微粒子の形状は、球状、針状、紡錘状、無定形のいずれでもよい。 When the hydrophilic substance is a complex with a magnetic component and has magnetism, the magnetic component contained in the hydrophilic substance / magnetic component complex is, for example, a magnetic fine particle, such as a magnetic metal fine particle or a magnetic oxide fine particle. Can be mentioned. These magnetic fine particles may contain a rare earth element or a transition metal element as necessary. Examples of magnetic metal fine particles include metal fine particles such as Fe-Co, Fe-Ni, Fe-Al, Fe-Ni-Al, Fe-Co-Ni, Fe-Ni-Al-Zn, and Fe-Al-Si. Can be mentioned. Examples of magnetic oxide fine particles include iron oxide (ferrite) type ferromagnetic fine particles represented by FeOx (4/3 ≦ x ≦ 3/2), and ferrite in which part of Fe is partially substituted with Ni and Co. be able to. More specifically, examples of the magnetic fine particles include fine particles such as magnetite, nickel oxide, ferrite, cobalt iron oxide, barium ferrite, carbon steel, tungsten steel, KS steel, rare earth cobalt magnet, maghemite, and hematite. it can. Among these, magnetite, maghemite and hematite can be preferably used. The shape of these magnetic fine particles may be spherical, needle-shaped, spindle-shaped, or amorphous.
上記磁性微粒子は親水性物質、アフィニティタグなどへの親和性を高めるために表面処理を施しても良い。表面処理は、シラン系カップリング処理、チタン系カップリング処理、リン酸系カップリング処理、塩酸、硫酸などによる酸処理、水酸化ナトリウムなどによるアルカリ処理などの処理を行うことができる。 The magnetic fine particles may be subjected to a surface treatment in order to increase the affinity for hydrophilic substances, affinity tags and the like. The surface treatment can be performed by a silane coupling treatment, a titanium coupling treatment, a phosphoric acid coupling treatment, an acid treatment with hydrochloric acid, sulfuric acid, or the like, or an alkali treatment with sodium hydroxide or the like.
磁性微粒子の沈降物が確認できるまでの時間が３０秒程度の短時間でも良い場合、平均粒子径は１ｎｍ〜１０μｍである。上記磁性微粒子は水溶液中で均一に分散し、長時間において、沈降物が発生しないことが好ましく、平均粒子径は、１ｎｍ〜３００ｎｍであることが好ましい。
また、上記磁性微粒子がポリスチレンやポリメチルアクリレートのようなラテックスにより表面を被覆された磁気成分、ラテックスビーズ中に上記磁性微粒子が分散された磁気成分であっても良い。このラテックス磁気ビーズの平均粒子径は、２０ｎｍ〜３００ｎｍであることが好ましい。
When the time until the precipitate of the magnetic fine particles can be confirmed may be as short as about 30 seconds, the average particle diameter is 1 nm to 10 μm. The magnetic fine particles are uniformly dispersed in an aqueous solution, and it is preferable that precipitates are not generated for a long time, and the average particle diameter is preferably 1 nm to 300 nm.
The magnetic fine particles may be a magnetic component whose surface is coated with a latex such as polystyrene or polymethyl acrylate, or a magnetic component in which the magnetic fine particles are dispersed in latex beads. The latex magnetic beads preferably have an average particle size of 20 nm to 300 nm.
磁性を有する親水性物質に関して、上記ポリオールと上記磁気成分の複合化様式としては、物理的な吸着や共有結合形成を挙げることができる。
また、磁性を有する親水性物質は、ポリオールを含む鉄イオン水溶液にアンモニア、水酸化ナトリウムなどのアルカリを添加する共沈法により得られる、ポリオールにより被覆されたフェライト微粒子を用いても良い（たとえば、特開平６−９２６４０号公報参照）。
より具体的には、例えば米国特許第４４５２７７３号に記載されているように、デキストラン５０質量％水溶液（１０ｍｌ）中に、塩化第二鉄・六水和物（１．５１ｇ）および塩化第一鉄・四水和物（０．６４ｇ）混合水溶液（１０ｍｌ）を加えて撹拌し、６０〜６５℃に水浴中で７．４（Ｖ／Ｖ）％アンモニア水溶液をｐＨ１０〜１１程度になるように滴下しながら加熱し、１５分反応させる方法により得ることができる。
Regarding the hydrophilic substance having magnetism, examples of the composite mode of the polyol and the magnetic component include physical adsorption and covalent bond formation.
Further, the magnetic hydrophilic substance may be ferrite fine particles coated with a polyol obtained by a coprecipitation method in which an alkali such as ammonia or sodium hydroxide is added to an iron ion aqueous solution containing a polyol (for example, JP, 6-92640, A).
More specifically, as described in, for example, U.S. Pat. No. 4,452,773, ferric chloride hexahydrate (1.51 g) and ferrous chloride in a 50% by weight aqueous solution (10 ml) of dextran. -Add a tetrahydrate (0.64 g) mixed aqueous solution (10 ml) and stir, and drop 7.4 (V / V)% aqueous ammonia solution at 60-65 ° C in a water bath so that the pH is about 10-11. It can be obtained by a method of heating and reacting for 15 minutes.
本発明で用いる磁性を有する親水性物質に求められる性状として、物質回収操作に際して、水溶液中で均一分散していることが挙げられる。磁性を有する親水性物質水溶液に凝集が発生した場合は、攪拌処理、超音波処理、加熱処理により、再分散して使用することができる。磁性を有する親水性物質は、上記操作後、１分以上水溶液として安定に均一分散し、凝集、沈殿を生じないことが望ましく、好ましくは、２週間以上、さらに好ましくは６ヶ月以上の期間、凝集、沈殿を生じないことが好ましい。
この経時変化は、たとえば、透明なサンプル瓶に磁性を有する親水性物質の水溶液を添加し、通常は、常温、好ましくは４℃から３７℃の温度条件で静置し、一定期間ごとに沈査の発生を目視するか、もしくは１０秒以内の磁気回収操作を行うことによって確認できる。
The property required for the hydrophilic substance having magnetism used in the present invention includes being uniformly dispersed in an aqueous solution during the substance recovery operation. When aggregation occurs in the magnetic hydrophilic substance aqueous solution, it can be used by being redispersed by stirring treatment, ultrasonic treatment, and heat treatment. It is desirable that the hydrophilic substance having magnetism is stably dispersed uniformly as an aqueous solution for 1 minute or more after the above operation, and does not cause aggregation or precipitation, and preferably aggregates for a period of 2 weeks or more, more preferably 6 months or more. It is preferable that no precipitation occurs.
This change with time is, for example, by adding an aqueous solution of a hydrophilic substance having magnetism to a transparent sample bottle, and usually leaving it at room temperature, preferably 4 ° C to 37 ° C. The occurrence can be confirmed by visual observation or by performing a magnetic recovery operation within 10 seconds.
磁性を有する親水性物質が水溶液中で均一分散している場合では、磁気回収操作を行っても、該水溶液は磁性流体として挙動し、磁気回収できない。一方、沈査が発生している場合は、上記条件で即座に沈査が回収されることから、確認は容易に行える。このような操作により、磁性を有する親水性物質の経時変化を確認することができる。 When a hydrophilic substance having magnetism is uniformly dispersed in an aqueous solution, even if a magnetic recovery operation is performed, the aqueous solution behaves as a magnetic fluid and cannot be magnetically recovered. On the other hand, if a scrutiny has occurred, the scrutiny is collected immediately under the above conditions, so confirmation can be easily performed. By such an operation, it is possible to confirm a change with time of the hydrophilic substance having magnetism.
＜アフィニティタグ／目的物質＞
本発明では、親水性物質に固定化されたアフィニティタグと、該アフィニティタグに結合する目的物質は特に限定されず、種々のものを適宜使用することができる。
<Affinity tag / target substance>
In the present invention, the affinity tag immobilized on the hydrophilic substance and the target substance bound to the affinity tag are not particularly limited, and various substances can be used as appropriate.
アフィニティタグとしては、ストレプトアビジン、単量体ストレプトアビジン、ストレプトアビジンの結合特性を有する分子、アビジン、単量体アビジン、アビジンの結合特性を有する分子、ストレプトアクチン、単量体ストレプトアクチン、ストレプトアクチンの結合特性を有する分子、エクストラビジン、単量体エクストラビジン、エクストラビジンの結合特性を有する分子、ニュートラビジン、単量体ニュートラビジン、ニュートラビジンの結合特性を有する分子、プロテインＡ、プロテインＡの結合特性を有する分子、プロテインＬ、プロテインＬの結合特性を有する分子、プロテインＧ、プロテインＧの結合特性を有する分子、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／Ｇの結合特性を有する分子、プロテインＬ／Ａ、プロテインＬ／Ａの結合特性を有する分子、カルモデュリン、カルモデュリンの結合特性を有する分子、ビオチン、ビオチンの結合特性を有する分子、金属キレート、グルタチオン、アンチセンスＤＮＡ、オリゴｄＴ、抗体等が挙げられる。 Affinity tags include streptavidin, monomeric streptavidin, molecules with binding properties of streptavidin, avidin, monomeric avidin, molecules with binding properties of avidin, streptavidin, monomeric streptactin, and streptavidin. Molecules with binding properties, extravidin, monomeric extravidin, molecules with extravidin binding properties, neutravidin, monomeric neutravidin, molecules with binding properties of neutravidin, protein A, protein A binding properties Molecule, protein L, molecule having protein L binding property, protein G, molecule having protein G binding property, protein A / G, molecule having protein A / G binding property, protein L / A, protein L / A Molecules with binding properties, calmodulin, molecules having binding properties of calmodulin, biotin, molecular, metal chelate having the binding properties of biotin, glutathione, antisense DNA, oligo dT, antibodies, and the like.
本発明で用いることのできる親水性物質に固定化されたアフィニティタグと、吸着される目的物質との組み合わせの例としては、例えば、抗体／ペプチド、抗体／ 抗原、抗体フラグメント／抗原、抗体／抗原フラグメント、抗体フラグメント／抗原フラグメント、抗体／ハプテン、酵素／基質、酵素／インヒビター、酵素／補因子、タンパク質／基質、核酸／核酸、タンパク質／核酸、ペプチド／ペプチド、タンパク質／タンパク質、低分子／タンパク質、グルタチオン／ＧＳＴ、マルトース／マルトース結合タンパク質、糖質／タンパク質、糖質誘導体／タンパク質、金属結合タグ／金属／キレート、ペプチド／ＮＴＡ、レクチン／糖質、レセプター／ホルモン、レセプター／エフェクター、相補的核酸／核酸、エフェクター／細胞表面レセプター、プロテインＡ／抗体、プロテインＧ／抗体、プロテインＬ／抗体、Ｆｃレセプター／抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、薬物／レセプター、ジンクフィンガー／核酸、低分子／ペプチド、低分子／タンパク質、糖質／タンパク質（マルトース／ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質））、低分子／レセプター、または金属イオン／キレート剤、ＮＴＡ／Ｎｉ２＋／ポリアミノ酸タグ（例えば、ポリヒスチジン）、グルタチオン／ＧＳＴ、抗ＧＦＰ／ＧＦＰ融合タンパク質、またはＭｙｃ／Ｍａｘの組み合わせが挙げられる。 Examples of a combination of an affinity tag immobilized on a hydrophilic substance that can be used in the present invention and a target substance to be adsorbed include, for example, antibody / peptide, antibody / antigen, antibody fragment / antigen, antibody / antigen Fragment, antibody fragment / antigen fragment, antibody / hapten, enzyme / substrate, enzyme / inhibitor, enzyme / cofactor, protein / substrate, nucleic acid / nucleic acid, protein / nucleic acid, peptide / peptide, protein / protein, small molecule / protein, Glutathione / GST, maltose / maltose binding protein, carbohydrate / protein, carbohydrate derivative / protein, metal binding tag / metal / chelate, peptide / NTA, lectin / carbohydrate, receptor / hormone, receptor / effector, complementary nucleic acid / Nucleic acid, effector / cell surface Scepter, protein A / antibody, protein G / antibody, protein L / antibody, Fc receptor / antibody, biotin / avidin, biotin / streptavidin, drug / receptor, zinc finger / nucleic acid, small molecule / peptide, small molecule / protein, Carbohydrate / protein (maltose / MBP (maltose binding protein)), small molecule / receptor, or metal ion / chelator, NTA / Ni 2+ / polyamino acid tag (eg, polyhistidine), glutathione / GST, anti-GFP / GFP Examples include fusion proteins or combinations of Myc / Max.
＜結合様式＞
本発明においては、親水性物質にアフィニティタグを固定するための種々の方法を用いることができる。アフィニティタグは、適切な任意の手段（例えば、共有結合、水素結合、イオン結合または疎水結合）によって固定され得る。また、親水性物質とアフィニティタグの結合中に、本発明に記載の他のアフィニティタグ／目的物質の組み合わせを利用でき、アフィニティタグが二種以上の異なるアフィニティタグの連続体であってもよく、たとえば、ビオチン／アビジンの吸着を介して親水性物質と抗体とを結合させる場合、親水性物質−ビオチン／アビジン／ビオチン化された抗体の組み合わせが利用できる。
<Binding style>
In the present invention, various methods for fixing an affinity tag to a hydrophilic substance can be used. The affinity tag can be immobilized by any suitable means (eg, covalent bond, hydrogen bond, ionic bond or hydrophobic bond). Further, during the binding between the hydrophilic substance and the affinity tag, other affinity tag / target substance combinations described in the present invention can be used, and the affinity tag may be a continuum of two or more different affinity tags, For example, when a hydrophilic substance and an antibody are bound via biotin / avidin adsorption, a combination of hydrophilic substance-biotin / avidin / biotinylated antibody can be used.
ここで親水性物質とビオチンは共有結合により固定されていることが望ましく、たとえば、１級アミンを有するビオチン誘導体とアルデヒド基を有するデキストランを還元的アミノ化の手法により結合させる方法が挙げられる。アルデヒド基を有するデキストランは
、デキストランの還元末端をそのまま利用するか、アルカリ処理などの操作によりデキストランのグリコシド結合を開裂させて低分子量の末端にアルデヒド基を有するデキストランを発生させるか、もしくは過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化試薬を用いて、デキストラン構造中のビシナルジオールを発生することにより得られる。
Here, it is desirable that the hydrophilic substance and biotin are immobilized by a covalent bond, and examples thereof include a method in which a biotin derivative having a primary amine and dextran having an aldehyde group are bound by a reductive amination technique. For dextran having an aldehyde group, the reducing end of dextran is used as it is, or the glycoside bond of dextran is cleaved by an operation such as alkali treatment to generate dextran having a low molecular weight end, or periodate It is obtained by generating vicinal diol in the dextran structure using an oxidizing reagent such as sodium.
また、他の方法として、ポリオールにアルカリ条件下で、エピクロロヒドリンを反応させて、グリシジル基を有するデキストランとし、アミノ化ビオチンを反応させる方法、ポリオールにアルカリ存在下で、クロロ酢酸を反応させ、カルボキシメチル化ポリオールとした後、ジエチルアミノプロピルエチルカルボジイミド・イオダイド（WSC・I）存在下にアミンを有するビオチンと反応させる方法が挙げられる。上記アミノ化ビオチンのようにアフィニティタグがアミノ基、場合によっては水酸基、メルカプト基を有する場合は、上記と類似の方法により、親水性物質にアフィニティタグを導入できることは当業者にとって周知である。 Another method is to react a polyol with an epichlorohydrin under alkaline conditions to obtain dextran having a glycidyl group to react with aminated biotin, and to react a polyol with chloroacetic acid in the presence of an alkali. And carboxymethylated polyol, and then reacting with biotin having an amine in the presence of diethylaminopropylethylcarbodiimide iodide (WSC · I). It is well known to those skilled in the art that when the affinity tag has an amino group, in some cases a hydroxyl group or a mercapto group, like the above aminated biotin, the affinity tag can be introduced into the hydrophilic substance by a method similar to the above.
また、メルカプト基を有するアフィニティタグを親水性物質に固定する場合は、マレイミドを構造中に導入した親水性物質と該アフィニティタグを混和することで、簡便に達成できる。マレイミド基を導入する際には、たとえば、スルホサクシンイミジル−４−[Ｎ−マレイミドメチル]シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、１ｍｇ、Ｐｉｅｒｃｅ製）を用いる方法が簡便である。 In addition, when an affinity tag having a mercapto group is immobilized on a hydrophilic substance, it can be easily achieved by mixing the affinity tag with a hydrophilic substance having maleimide introduced into the structure. When introducing a maleimide group, for example, a method using sulfosuccinimidyl-4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC, 1 mg, manufactured by Pierce) is convenient.
結合させる目的物質としては、抗体分子などのタンパク質、核酸、多糖類などを挙げることができる。これら生体高分子は、通常、そのままではメルカプト基を有さないので、下記のような処理が施される。タンパク質の場合は、その中に含有される−ＳＳ−結合を還元することにより、メルカプト基に変換することができる。また、核酸の場合、例えばヌクレオチドを構成する塩基が有するアミノ基を２−イミノチオランと反応させてチオール化することにより、ＳＨ基を導入することができる。また、多糖類の場合、例えばアミノ糖が有するアミノ基を２−イミノチオランと反応させてチオール化することにより、ＳＨ基を導入することができる。これらの処理方法は、それ自体公知であり、Traut and Kenney 1977 Protein Crosslinking, Plenum Pub.Co.、およびKing et al.,1978 Biochemistry vol 17,1499に記載されている。 Examples of the target substance to be bound include proteins such as antibody molecules, nucleic acids, polysaccharides and the like. Since these biopolymers usually do not have mercapto groups as they are, the following treatment is performed. In the case of protein, it can be converted to a mercapto group by reducing the -SS- bond contained therein. In the case of a nucleic acid, for example, an SH group can be introduced by thiolation by reacting an amino group of a base constituting a nucleotide with 2-iminothiolane. In the case of polysaccharides, for example, an SH group can be introduced by thiolation by reacting an amino group of an amino sugar with 2-iminothiolane. These processing methods are known per se and are described in Traut and Kenney 1977 Protein Crosslinking, Plenum Pub. Co., and King et al., 1978 Biochemistry vol 17,1499.
本発明にあっては、固定するアフィニティタグは、元の生体高分子を部分分解して得られるフラグメント（断片）または大腸菌などで生産された組換え抗体分子フラグメントであってもよい。ここで、部分分解とは、生体高分子を完全に分解することなく、一部を分解して複数個のフラグメントを得る処理をいう。従って、本発明では、例えば抗体分子を部分分解して、または大腸菌などにより組換え抗体分子フラグメントを生産して、生理活性を有する構造を含むフラグメントを得、必要に応じてＳＨ基に変換する処理を行ったのち、生体高分子としての該フラグメントを親水性物質に固定することができる。親水性物質とアフィニティタグとを接触させマレイミド基とＳＨ基を反応させることにより、アフィニティタグが固定化された親水性物質が得られる。 In the present invention, the affinity tag to be immobilized may be a fragment (fragment) obtained by partially decomposing the original biopolymer or a recombinant antibody molecule fragment produced in E. coli or the like. Here, partial decomposition refers to a process of partially decomposing and obtaining a plurality of fragments without completely decomposing the biopolymer. Therefore, in the present invention, for example, a process in which an antibody molecule is partially decomposed or a recombinant antibody molecule fragment is produced by Escherichia coli or the like to obtain a fragment having a physiologically active structure, and converted to an SH group as necessary. Then, the fragment as a biopolymer can be fixed to a hydrophilic substance. By contacting the hydrophilic substance with the affinity tag and reacting the maleimide group and the SH group, a hydrophilic substance having the affinity tag immobilized thereon can be obtained.
＜凝集剤＞
本発明においては、親水性物質を簡便に回収可能とするための手法として、親水性物質と分子コンプレックスを形成し凝集体を形成する凝集剤が使用される。
本発明において凝集剤とは、上記親水性物質と分子コンプレックスを形成可能な物質であり、たとえば、ポリアルキレングリコール構造を有する物質が挙げられ、具体的にはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール−ランダムコポリマー、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール−ブロックコポリマーが挙げられる。
<Flocculant>
In the present invention, a flocculant that forms a molecular complex with the hydrophilic substance to form an aggregate is used as a technique for easily recovering the hydrophilic substance.
In the present invention, the flocculant is a substance capable of forming a molecular complex with the hydrophilic substance, and examples thereof include substances having a polyalkylene glycol structure, and specifically include polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyethylene glycol-polypropylene. Examples include glycol-random copolymers, polyethylene glycol-polypropylene glycol-block copolymers.
また、本発明の他の実施形態として、ポリ−メトキシエトキシ（メタ）アクリレート、ポリ−ジエチレングリコール−（メタ）アクリレート−メチルエーテル、ポリ−トリエチレングリコール−（メタ）アクリレート−メチルエーテル、ポリ−テトラエチレングリコール−（メタ）アクリレート−メチルエーテル、およびこれらのランダムおよびブロックコポリマーもまた凝集剤として挙げることができる。 Further, as other embodiments of the present invention, poly-methoxyethoxy (meth) acrylate, poly-diethylene glycol- (meth) acrylate-methyl ether, poly-triethylene glycol- (meth) acrylate-methyl ether, poly-tetraethylene Glycol- (meth) acrylate-methyl ether and their random and block copolymers can also be mentioned as flocculants.
なかでも、「ポリアルキレングリコール」としては、水性二相分配用の相を形成する作用を有するものであればよく、より親水性ポリマーあるいはより疎水性ポリマーと組み合わせることにより、分配用の相を形成することが知られたものが挙げられる。該ポリアルキレングリコールは、水溶性のもので、実験により最適なものを決定し、それを選んで使用することができ、好ましくはポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、より好ましくは、ポリエチレングリコールである。該ポリエチレングリコールは、実験により最適な分子量を持つものを選んで使用することができ、例えばおおよそ200〜25,000の範囲の数平均分子量を持つもの、好ましくは約3,000〜20,000、より好ましくは約6,000〜15,000、もっと好ましくは約8,000〜10,000の範囲の数平均分子量を持つものが挙げられ、例えばシグマ社、和光純薬などから入手できる。 Among them, the “polyalkylene glycol” is not particularly limited as long as it has an action of forming a phase for aqueous two-phase distribution, and forms a phase for distribution by combining with a more hydrophilic polymer or a more hydrophobic polymer. What is known to do. The polyalkylene glycol is water-soluble, and an optimum one determined by experiment can be selected and used, and is preferably polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, more preferably polyethylene glycol. . The polyethylene glycol having an optimum molecular weight can be selected and used by experiment, for example, having a number average molecular weight in the range of about 200 to 25,000, preferably about 3,000 to 20,000, more preferably about 6,000 to Those having a number average molecular weight in the range of 15,000, more preferably about 8,000 to 10,000, are available, for example, from Sigma, Wako Pure Chemicals.
凝集剤は粉末のまま使用することもできるが、好ましくは水溶液として用いることが好ましく、この場合の凝集剤濃度は好ましくは３０質量％以下である。この濃度以上では、粘度が高くなりすぎるなど、扱いが難しくなり、とくに少量を分取する際に大きな問題となる。親水性物質との凝集体を形成するために、凝集剤濃度を上げる必要があるなど、凝集剤を粉末として使用する必要がある場合には、水から凍結乾燥したものを利用することが望ましい。 Although the flocculant can be used as a powder, it is preferably used as an aqueous solution. In this case, the flocculant concentration is preferably 30% by mass or less. Above this concentration, it becomes difficult to handle, for example, the viscosity becomes too high, and it becomes a big problem especially when fractionating a small amount. In order to form an agglomerate with a hydrophilic substance, it is desirable to use a lyophilized product from water when the aggregating agent needs to be used as a powder, for example, it is necessary to increase the aggregating agent concentration.
＜目的物質の回収＞
アフィニティタグを固定した親水性物質は、水もしくはリン酸ナトリウムバッファー、ＴＲＩＳバッファー、サリンバッファーなどに溶解させた後、目的物質を含むと予想されるサンプルと混和し、軽く攪拌した後、１０秒〜１５分程度インキュベートすることにより、目的物質を吸着することができる。粘度の高いサンプルを用いた場合など、目的物質の吸着に時間を要すると考えられる場合は、混和、攪拌操作、インキュベートの時間を1時間程度まで延長する必要がある。これらの操作は室温で行っても良いが、目的物質の性状にあわせて、氷冷下で行っても良い。
<Recovery of target substance>
The hydrophilic substance to which the affinity tag is fixed is dissolved in water or sodium phosphate buffer, TRIS buffer, sarin buffer, etc., mixed with a sample expected to contain the target substance, stirred gently, and then 10 seconds to The target substance can be adsorbed by incubating for about 15 minutes. If it takes time to adsorb the target substance, such as when using a highly viscous sample, it is necessary to extend the mixing, stirring, and incubation times to about 1 hour. These operations may be performed at room temperature, or may be performed under ice cooling according to the properties of the target substance.
＜凝集体の形成＞
本発明において、凝集体である親水性物質と凝集剤の分子コンプレックスは、親水性物質の水溶液と凝集剤の水溶液を加え、適切な方法で混和することによって形成される。本発明に使用できる混和方法として、マグネティックスターラーによる攪拌、メカニカルスターラーによる攪拌、ボルテックスミキサーによる混和、タッピングによる混和などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
<Formation of aggregate>
In the present invention, the molecular complex of a hydrophilic substance and an aggregating agent which are aggregates is formed by adding an aqueous solution of a hydrophilic substance and an aqueous solution of an aggregating agent and mixing them by an appropriate method. Examples of the mixing method that can be used in the present invention include, but are not limited to, stirring with a magnetic stirrer, stirring with a mechanical stirrer, mixing with a vortex mixer, mixing by tapping, and the like.
親水性物質と目的物質および凝集剤の混合液に対して、凝集剤の添加量は、乾燥質量で１〜２０％程度が良好である。特に好ましくは、凝集剤が６〜１２質量％の場合である。この操作は室温で行っても良いが、目的物質の性状にあわせて、氷冷下で行っても良い。 The amount of the flocculant added to the liquid mixture of the hydrophilic substance, the target substance and the flocculant is preferably about 1 to 20% by dry mass. Particularly preferred is the case where the flocculant is 6 to 12% by mass. This operation may be performed at room temperature, or may be performed under ice cooling according to the properties of the target substance.
＜凝集体の回収＞
本発明において、得られた凝集体の回収は、遠心分離操作と上澄除去によるペレット化、濾過分離操作による液体除去によるペレット化等により、行うことができる。また、磁気成分を含む親水性物質を用いた場合は、上記の回収方法のほかに凝集体の回収方法として、磁気分離によるペレット化を挙げることができる。この操作は室温で行っても良いが、目的物質の性状にあわせて、氷冷下で行っても良い。
<Collecting aggregates>
In the present invention, the obtained aggregates can be collected by centrifugation operation and pelletization by supernatant removal, pelletization by liquid removal by filtration separation operation, and the like. When a hydrophilic substance containing a magnetic component is used, in addition to the above-described recovery method, pelletization by magnetic separation can be used as a method for recovering aggregates. This operation may be performed at room temperature, or may be performed under ice cooling according to the properties of the target substance.
水性二相を構成する液相系は、それを攪拌してよく混合する。攪拌混合処理は、当業者に知られた手法を適用でき、例えば、容器を手で上下に激しく数回振ることにより行ってもよいし、あるいはハンドミキサー（例えば、immuno mixer; シノテスト社） を使用して、30秒程度それにかけることにより行ったり、その両者を組み合わせて行ってもよい。攪拌混合処理された液体を含有する容器は、遠心分離に付すことにより凝集体を回収することができる。遠心分離の処理条件は、実験により適切な条件を選択することができ、二相に相分離させることができる条件であれば特に限定されることなく条件を選ぶことができ、例えば、約5,000〜8,000rpm、より好ましくは約6,000〜7,000rpmで、約１〜60分間、より好ましくは約５〜20分間、さらに好ましくは約８〜15分間処理し、二相に相分離させることができる。相分離させた二相のうち、上相は、ポリアルキレングリコールに富んだ相であり、本相に目的物質を抽出採取することができる。相分離させた二相系から上相を採取するのは、例えばマイクロピペットなどを使用して行うことができる。 The liquid phase system constituting the aqueous two phase is mixed well with stirring. For the stirring and mixing treatment, a method known to those skilled in the art can be applied. For example, the container may be shaken up and down several times by hand, or a hand mixer (eg, immuno mixer; Sinotest) may be used. Then, it may be performed by spending about 30 seconds or a combination of both. Aggregates can be collected by subjecting the container containing the liquid subjected to the stirring and mixing treatment to centrifugation. The treatment conditions for the centrifugation can be selected appropriately by experiment, and can be selected without particular limitation as long as the conditions allow phase separation into two phases. It can be processed at 8,000 rpm, more preferably about 6,000 to 7,000 rpm, for about 1 to 60 minutes, more preferably about 5 to 20 minutes, and even more preferably about 8 to 15 minutes, and the phases can be separated into two phases. Of the two phases subjected to phase separation, the upper phase is a phase rich in polyalkylene glycol, and the target substance can be extracted and collected in this phase. The upper phase can be collected from the phase-separated two-phase system using, for example, a micropipette.
分離した上相は、必要に応じて洗浄処理を施すことができる。同様に、分離した下相についても、再度抽出分離処理をして、その結果、得られた上相を最初に得られた該上相を併せた後、洗浄処理を施すこともできるが、こうした再抽出分離処理を組み合わせると、操作が煩雑になるというマイナスが生じる。該分離した上相の洗浄処理は、先ず該上相に少なくとも糖骨格を含有する中性のポリマーと混合することにより行われる。上相は、上記相分離させた二相系から採取されたものを、直ぐに使用してもよいし、あるいは採取後一旦保存されていたものを使用してもよく、通常、採取された上相はそれを濃縮などすることなくそのまま使用される。上記上相と混合される成分は、それが固体状態で使用してもよいが、通常、好ましくは、水溶液で使用する。分離した上相の洗浄処理系において、洗浄液には、適したイオン成分が含まれていてもよい。好適なイオン成分としては、上記したリン酸イオンが挙げられる。 The separated upper phase can be washed as necessary. Similarly, the separated lower phase can be extracted and separated again, and as a result, the obtained upper phase can be combined with the first obtained upper phase and then washed. Combining the re-extraction / separation process has a negative effect that the operation becomes complicated. The separated upper phase is washed by first mixing it with a neutral polymer containing at least a sugar skeleton in the upper phase. As the upper phase, one collected from the two-phase system separated from the above phase may be used immediately, or one that has been stored once after collection may be used. Is used as it is without concentrating it. The component mixed with the upper phase may be used in a solid state, but is usually preferably used in an aqueous solution. In the separated upper phase cleaning treatment system, the cleaning liquid may contain a suitable ionic component. Suitable ion components include the above-described phosphate ions.
該分離した上相の洗浄処理系を構成する液相系は、それを攪拌してよく混合する。攪拌混合処理は、当業者に知られた手法を適用でき、例えば、上記水性二相分配系におけると同様にして行ってよい。次に該攪拌混合処理された液体を含有する容器は、通常、遠心分離に付される。遠心分離の処理条件は、実験により適切な条件を選択することができ、二相に相分離させることができる条件であれば特に限定されることなく条件を選ぶことができ、例えば、上記水性二相分配系における遠心分離と同様にして行うことができる。目的物質を含んでいる相を採取するのは、上記と同様にして、例えばマイクロピペットなどを使用して行うことができる。 The liquid phase system constituting the separated upper phase washing treatment system is stirred and mixed well. For the stirring and mixing treatment, a technique known to those skilled in the art can be applied. Next, the container containing the stirred and mixed liquid is usually subjected to centrifugation. The treatment conditions for the centrifugation can be selected appropriately by experiment, and can be selected without particular limitation as long as the conditions allow the phase separation into two phases. It can be performed in the same manner as the centrifugation in the phase distribution system. The phase containing the target substance can be collected in the same manner as described above using, for example, a micropipette.
＜再処理と精製＞
上記分離操作において、ペレット中に上澄成分が残存していることがある。回収される目的物質の純度を上げるためには、得られたペレットを再分散させ、再度凝集操作、凝集体の回収操作を行う方法等を採用することができる。
<Reprocessing and purification>
In the separation operation, a supernatant component may remain in the pellet. In order to increase the purity of the target substance to be recovered, a method of re-dispersing the obtained pellets and performing an agglomeration operation, an aggregate recovery operation, or the like can be employed.
＜凝集体の再分散＞
得られたペレットは、分子コンプレックス凝集体の塊であり、このペレットは、水に再分散させて、水溶液として使用することができる。なお、この水は、純水だけでなく、リン酸ナトリウムバッファー、TRISバッファー、サリンバッファーであってもよい。
<Redispersion of aggregates>
The obtained pellet is a lump of molecular complex aggregate, and this pellet can be redispersed in water and used as an aqueous solution. This water may be not only pure water but also sodium phosphate buffer, TRIS buffer, and sarin buffer.
＜具体的濃縮方法＞
以下に、種々の目的物質／アフィニティタグの組み合わせにおける本発明の濃縮方法を更に具体的に詳述する。
<Specific concentration method>
Hereinafter, the concentration method of the present invention in various target substance / affinity tag combinations will be described in more detail.
Ａ．親水性物質とアフィニティタグを固定した態様
親水性物質とアフィニティタグの結合部分は、各種の一般的な結合方法によって結合可能である。結合方法としては、限定的ではないが、化学的修飾、共有結合、強イオンまたは水素結合、リンカーの使用などが含まれる。好ましい方法は標準的な臭化シアン（ＣＮＢｒ）結合を使用している。この結合は親水性物質をＣＮＢｒで処理した後、アフィニティタグを加え、インキュベーションすることによって達成される。アフィニティタグのアミノ基はＣＮＢｒリンカーに共有結合によって結合する。
A. Embodiment in which hydrophilic substance and affinity tag are fixed The binding part of the hydrophilic substance and the affinity tag can be bound by various general binding methods. Coupling methods include, but are not limited to, chemical modification, covalent bonding, strong ion or hydrogen bonding, the use of linkers, and the like. A preferred method uses standard cyanogen bromide (CNBr) linkages. This binding is achieved by treating the hydrophilic substance with CNBr, then adding an affinity tag and incubating. The amino group of the affinity tag is covalently bound to the CNBr linker.
結合処理するための別の方法としては、過ヨウ素酸ナトリウムによる親水性物質のアルデヒド化とアフィニティタグのアミノ基によるイミン形成、続くシアノホウ化水素ナトリウムもしくはホウ化水素ナトリウムによる処理による２級アミンへの変換する還元的アミノ化の手法により結合を形成することが可能である。
限定的ではないが、過酸化水素、エピクロロヒドリン、１，４−ブタンジオールジグリシドールエーテル、塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、ヒドロキシサクシンイミドエステル、置換塩化スルホニル、またはフルオロメチルピリジニウム塩、および同様な方法で適合された抗原が含まれる。
Another method for binding treatment includes aldehyde formation of a hydrophilic substance with sodium periodate and imine formation with an amino group of an affinity tag, followed by treatment with sodium cyanoborohydride or sodium borohydride to a secondary amine. Bonds can be formed by reductive amination techniques that convert.
Without limitation, hydrogen peroxide, epichlorohydrin, 1,4-butanediol diglycidol ether, cyanuric chloride, carbonyldiimidazole, hydroxysuccinimide ester, substituted sulfonyl chloride, or fluoromethylpyridinium salt, and the like Antigens adapted by the method are included.
上記手法により調製された親水性物質と抗体の複合物を用いて、タンパクを濃縮する方法は下記のとおりである。
１）目的タンパク質の生産菌を培養し、得られた細胞懸濁液を破砕し、細胞破砕懸濁液を調製する。
２）目的タンパク質のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を調製し、親水性物質に結合させる。
３）目的タンパク質を捕獲可能な抗体の結合した親水性物質と目的タンパク質を含む細胞破砕懸濁液を加え、混合液とし、目的タンパク質／抗体−親水性物質の結合体を生成させる。
４）前記混合液に凝集剤を加え、攪拌もしくはピペッティングを行い、目的タンパク質／抗体−親水性物質／凝集剤の複合体を凝集させる。
５）遠心分離装置を用いて、凝集物を沈降させ、上澄をピペットなどにより注意深く除去する。
６）目的によっては、結合体からタンパク質を分離し、また、標識抗体などで目的タンパク量を定量する。
A method for concentrating protein using a composite of a hydrophilic substance and an antibody prepared by the above method is as follows.
1) Culturing the target protein producing bacteria, crushing the obtained cell suspension to prepare a cell disruption suspension.
2) A polyclonal antibody or monoclonal antibody of the target protein is prepared and bound to a hydrophilic substance.
3) An antibody-bound hydrophilic substance capable of capturing the target protein and a cell disruption suspension containing the target protein are added to form a mixed solution to generate a target protein / antibody-hydrophilic substance conjugate.
4) An aggregating agent is added to the mixed solution, and stirring or pipetting is performed to aggregate the target protein / antibody-hydrophilic substance / aggregating agent complex.
5) Use a centrifuge to settle the aggregates, and carefully remove the supernatant with a pipette or the like.
6) Depending on the purpose, the protein is separated from the conjugate, and the amount of the target protein is quantified with a labeled antibody or the like.
上記手法により調製された親水性物質とグルタチオンの複合物を用いて、グルタチオン−（Ｓ）−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパクを濃縮する方法は下記のとおりである。
１）グルタチオン−（Ｓ）−トランスフェラーゼ融合タンパクを生産するように形質転換した生産菌を培養し、得られた細胞懸濁液を破砕し、細胞破砕懸濁液を調製する。
２）グルタチオンの結合した親水性物質とグルタチオン−（Ｓ）−トランスフェラーゼ融合タンパク質を含む細胞破砕懸濁液を加え、混合液とし、グルタチオン−（Ｓ）−トランスフェラーゼ融合タンパク質／グルタチオン−親水性物質の結合体を生成させる。
３）前記混合液に凝集剤を加え、攪拌もしくはピペッティングを行い、グルタチオン−（Ｓ）−トランスフェラーゼ融合タンパク質／グルタチオン−親水性物質／凝集剤の複合体を凝集させる。
４）遠心分離装置を用いて、凝集物を沈降させ、上澄をピペットなどにより注意深く除去する。
５）目的によっては、結合体からタンパク質を分離、もしくはグルタチオン−（Ｓ）−トランスフェラーゼと目的タンパクの切り出しを行い、また、標識抗体などで目的タンパク量を定量する。
A method for concentrating glutathione- (S) -transferase (GST) fusion protein using a complex of a hydrophilic substance and glutathione prepared by the above method is as follows.
1) A production bacterium transformed so as to produce a glutathione- (S) -transferase fusion protein is cultured, and the resulting cell suspension is disrupted to prepare a cell disruption suspension.
2) A cell disruption suspension containing a glutathione-bound hydrophilic substance and glutathione- (S) -transferase fusion protein is added to form a mixed solution, and the glutathione- (S) -transferase fusion protein / glutathione-hydrophilic substance is bound. Generate a body.
3) An aggregating agent is added to the mixed solution, and stirring or pipetting is performed to aggregate the glutathione- (S) -transferase fusion protein / glutathione-hydrophilic substance / aggregating agent complex.
4) Use a centrifuge to settle the aggregates, and carefully remove the supernatant with a pipette or the like.
5) Depending on the purpose, the protein is separated from the conjugate, or glutathione- (S) -transferase and the target protein are excised, and the amount of the target protein is quantified with a labeled antibody or the like.
上記手法により調製された親水性物質とイミノジ酢酸ニッケルの複合物を用いて、ヒス
チジン−タグ融合タンパクを濃縮する方法は下記のとおりである。
１）ヒスチジン−タグ融合タンパクを生産するように形質転換した生産菌を培養し、得られた細胞懸濁液を破砕し、細胞破砕懸濁液を調製する。
２）ビオチンを結合させた親水性物質と、アビジンを含むサリンバッファーを加えて混合液とし、親水性物質−ビオチン／アビジン複合体を形成させる。さらに上記複合体に、ビオチン−イミノジ酢酸ニッケルを加えて、親水性物質−ビオチン／アビジン／ビオチン−イミノジ酢酸ニッケル複合体を形成させる。
３）親水性物質−ビオチン／アビジン／ビオチン−イミノジ酢酸ニッケル複合体と、ヒスチジン−タグ融合タンパクを含む細胞破砕懸濁液を加え、混合液とし、親水性物質−ビオチン／アビジン／ビオチン−イミノジ酢酸ニッケル複合体／ヒスチジン−タグ融合タンパクの結合体を生成させる。
４）前記混合液に凝集剤を加え、攪拌もしくはピペッティングを行い、親水性物質−ビオチン／アビジン／ビオチン−イミノジ酢酸ニッケル複合体／ヒスチジン−タグ融合タンパク／凝集剤の複合体を凝集させる。
５）遠心分離装置を用いて、凝集物を沈降させ、上澄をピペットなどにより注意深く除去する。
６）目的によっては、結合体からイミノジ酢酸ニッケル融合タンパクを分離、また、標識抗体などで目的タンパク量を定量する。
A method for concentrating a histidine-tag fusion protein using a composite of a hydrophilic substance and nickel iminodiacetate prepared by the above method is as follows.
1) A production bacterium transformed so as to produce a histidine-tag fusion protein is cultured, and the resulting cell suspension is disrupted to prepare a cell disruption suspension.
2) A hydrophilic substance to which biotin is bound and a sarin buffer containing avidin are added to form a mixed solution to form a hydrophilic substance-biotin / avidin complex. Furthermore, biotin-iminodiacetate is added to the complex to form a hydrophilic substance-biotin / avidin / biotin-iminodiacetate complex.
3) A hydrophilic substance-biotin / avidin / biotin-iminodiacetate complex and a cell disruption suspension containing histidine-tag fusion protein are added to form a mixed solution, and the hydrophilic substance-biotin / avidin / biotin-iminodiacetic acid is added. A nickel complex / histidine-tag fusion protein conjugate is generated.
4) An aggregating agent is added to the mixed solution, and stirring or pipetting is performed to aggregate the hydrophilic substance-biotin / avidin / biotin-nickel iminodiacetate complex / histidine-tag fusion protein / aggregating agent complex.
5) Use a centrifuge to settle the aggregates, and carefully remove the supernatant with a pipette or the like.
6) Depending on the purpose, the nickel iminodiacetate fusion protein is separated from the conjugate, and the amount of the target protein is quantified with a labeled antibody or the like.
上記手法により調製された親水性物質とアンチセンスＤＮＡの複合物を用いて、目的ＤＮＡを濃縮する方法は下記のとおりである。
１）目的ＤＮＡを含有する細胞破砕懸濁液を調製する。
２）目的ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを親水性物質に結合させる。
３）目的ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを結合させた親水性物質と目的ＤＮＡを含む細胞破砕懸濁液を加えてハイブリダイズさせ、目的ＤＮＡ／目的ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ−親水性物質の結合体を生成させる。
４）前記混合液に凝集剤を加え、攪拌もしくはピペッティングを行い、目的ＤＮＡ／目的ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ−親水性物質／凝集剤の複合体を凝集させる。
５）遠心分離装置を用いて、凝集物を沈降させ、上澄をピペットなどにより注意深く除去する。
６）目的によっては、結合体から目的ＤＮＡを分離し、また、標識用ＤＮＡなどで目的ＤＮＡ量を定量する。
The method of concentrating the target DNA using the composite of the hydrophilic substance and antisense DNA prepared by the above method is as follows.
1) A cell disruption suspension containing the target DNA is prepared.
2) A DNA having a sequence complementary to the target DNA is bound to a hydrophilic substance.
3) A hydrophilic substance to which DNA having a sequence complementary to the target DNA is bound and a cell disruption suspension containing the target DNA are added and hybridized, and the target DNA / DNA having a sequence complementary to the target DNA- A conjugate of hydrophilic material is generated.
4) An aggregating agent is added to the mixed solution, and stirring or pipetting is performed to agglomerate a complex of DNA-hydrophilic substance / aggregating agent having a sequence complementary to the target DNA / target DNA.
5) Use a centrifuge to settle the aggregates, and carefully remove the supernatant with a pipette or the like.
6) Depending on the purpose, the target DNA is separated from the conjugate, and the amount of the target DNA is quantified with a labeling DNA or the like.
上記手法により調製された親水性物質とオリゴｄＴの複合物を用いて、ｍＲＮＡを濃縮する方法は下記のとおりである。
１）目的ｍＲＮＡを含有する細胞破砕懸濁液を調製する。
２）オリゴｄＴを親水性物質に結合させる。
３）オリゴｄＴを結合させた親水性物質とｍＲＮＡを含む細胞破砕懸濁液を加えてハイブリダイズさせ、ｍＲＮＡ／オリゴｄＴ−親水性物質の結合体を生成させる。
４）前記混合液に凝集剤を加え、攪拌もしくはピペッティングを行い、ｍＲＮＡ／オリゴｄＴ−親水性物質／凝集剤の複合体を凝集させる。
５）遠心分離装置を用いて、凝集物を沈降させ、上澄をピペットなどにより注意深く除去する。
６）目的によっては、結合体からｍＤＮＡを分離し、また、ブロッティングの手法により定量する。
A method for concentrating mRNA using a complex of hydrophilic substance and oligo dT prepared by the above method is as follows.
1) A cell disruption suspension containing the target mRNA is prepared.
2) The oligo dT is bound to a hydrophilic substance.
3) A hydrophilic substance to which oligo dT is bound and a cell disruption suspension containing mRNA are added and hybridized to form a mRNA / oligo dT-hydrophilic substance conjugate.
4) An aggregating agent is added to the mixed solution, and stirring or pipetting is performed to aggregate the mRNA / oligo dT-hydrophilic substance / aggregating agent complex.
5) Use a centrifuge to settle the aggregates, and carefully remove the supernatant with a pipette or the like.
6) Depending on the purpose, mDNA is separated from the conjugate and quantified by a blotting technique.
Ｂ．リンカーを介しての親水性物質とアフィニティタグを固定した態様
親水性物質とアフィニティタグを結合させるためには、上記のような共有結合を用いるかわりに、アビジン／ビオチン−セットなどの標準的なリンカーも使用可能である。アビジン／ビオチンおよびそれらの誘導体を用いる場合には、親水性物質およびアフィニティ
タグにそれぞれビオチンあるいはアビジンを導入しておく必要がある。
親水性物質とアフィニティタグを結合させるためにリンカーを用いるほかは、上記Ａの態様と同様である。
B. An embodiment in which a hydrophilic substance and an affinity tag are fixed via a linker In order to bind a hydrophilic substance and an affinity tag, a standard linker such as avidin / biotin-set is used instead of using the covalent bond as described above. Can also be used. When using avidin / biotin and derivatives thereof, it is necessary to introduce biotin or avidin into the hydrophilic substance and the affinity tag, respectively.
The embodiment is the same as the embodiment A except that a linker is used to bind the hydrophilic substance and the affinity tag.
Ｃ．親水性物質／磁気成分複合体とアフィニティタグを固定した態様
従来知られている方法により、磁性を付与した親水性物質を得ることができる。
磁性を付与した親水性物質とアフィニティタグの結合部分は、各種の一般的な結合方法によって結合可能である。結合方法としては、限定的ではないが、化学的修飾、共有結合、強イオンまたは水素結合、リンカーの使用などが含まれる。好ましい方法は標準的な臭化シアン（ＣＮＢｒ）結合を使用している。この結合は親水性物質をＣＮＢｒで処理した後、アフィニティタグを加えた後、インキュベーションすることによって達成される。アフィニティタグのアミノ基はＣＮＢｒリンカーに共有結合によって結合する。
C. A mode in which a hydrophilic substance / magnetic component complex and an affinity tag are fixed A hydrophilic substance imparted with magnetism can be obtained by a conventionally known method.
The binding portion between the hydrophilic substance imparted with magnetism and the affinity tag can be bound by various common binding methods. Coupling methods include, but are not limited to, chemical modification, covalent bonding, strong ion or hydrogen bonding, the use of linkers, and the like. A preferred method uses standard cyanogen bromide (CNBr) linkages. This binding is achieved by treating the hydrophilic substance with CNBr, adding an affinity tag, and then incubating. The amino group of the affinity tag is covalently bound to the CNBr linker.
結合処理するための別の方法としては、過ヨウ素酸ナトリウムによる親水性物質のアルデヒド化とアフィニティタグのアミノ基によるイミン形成、続くシアン化ホウ素ナトリウムもしくは水素化ホウ素ナトリウムによる処理による２級アミンへの変換する還元的アミノ化の手法により結合を形成することが可能である。
限定的ではないが、過酸化水素、エピクロロヒドリン、１，４−ブタンジオールジグリシドールエーテル、塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、ヒドロキシサクシンイミドエステル、置換塩化スルホニル、またはフルオロメチルピリジニウム塩、および同様な方法で適合された抗原が含まれる。
Another method for binding treatment includes aldehyde formation of a hydrophilic substance with sodium periodate and imine formation with an amino group of an affinity tag, followed by treatment with sodium borohydride or sodium borohydride to a secondary amine. Bonds can be formed by reductive amination techniques that convert.
Without limitation, hydrogen peroxide, epichlorohydrin, 1,4-butanediol diglycidol ether, cyanuric chloride, carbonyldiimidazole, hydroxysuccinimide ester, substituted sulfonyl chloride, or fluoromethylpyridinium salt, and the like Antigens adapted by the method are included.
アフィニティタグを結合させた磁性微粒子／親水性物質の複合体は磁石によって回収することはできないが、凝集剤を添加してアフィニティタグを結合させた磁性微粒子／親水性物質／凝集剤の複合体とすることによって、磁石での回収が可能となる。
この際、磁性を付与した親水性物質によって捕獲されていない物質は、磁気回収されないため、物質の濃縮とともに、精製できる。
The magnetic fine particle / hydrophilic substance complex to which the affinity tag is bound cannot be recovered by the magnet, but the magnetic fine particle / hydrophilic substance / flocculating agent complex to which the affinity tag is bound by adding the flocculant By doing so, recovery with a magnet becomes possible.
At this time, since the substance not captured by the hydrophilic substance imparted with magnetism is not magnetically recovered, it can be purified together with the concentration of the substance.
上記手法により調製された磁性を付与された親水性物質と抗体の複合物を用いて、タンパクを濃縮する方法は下記のとおりである。
１）目的タンパク質の生産菌を培養し、得られた細胞懸濁液を破砕し、細胞破砕懸濁液を調製する。
２）目的タンパク質のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を調製し、磁性を付与された親水性物質に結合させる。
３）目的タンパク質を捕獲可能な抗体の結合した磁性を付与された親水性物質と目的タンパク質を含む細胞破砕懸濁液を加え、混合液とし、目的タンパク質／抗体−磁性を付与された親水性物質の結合体を生成させる。
４）前記混合液に凝集剤を加え、攪拌もしくはピペッティングを行い、目的タンパク質／抗体−磁性を付与された親水性物質／凝集剤の複合体を凝集させる。
５）ネオジ磁石を用いて凝集を磁気回収し、上澄をピペットなどにより注意深く除去する。
６）目的によっては、結合体からタンパク質を分離し、また、標識抗体などで目的タンパク量を定量する。
A method for concentrating protein using a composite of a hydrophilic substance imparted with magnetism and an antibody prepared by the above method is as follows.
1) Culturing the target protein producing bacteria, crushing the obtained cell suspension to prepare a cell disruption suspension.
2) A polyclonal antibody or monoclonal antibody of the target protein is prepared and bound to a hydrophilic substance imparted with magnetism.
3) Add a hydrophilic substance to which the antibody capable of capturing the target protein to which magnetism is attached and a cell disruption suspension containing the target protein are added to form a mixed solution, and the target substance / antibody-hydrophilic substance to which magnetism is provided To produce a conjugate of
4) An aggregating agent is added to the mixed solution, and stirring or pipetting is performed to aggregate the target substance / antibody-magnetically imparted hydrophilic substance / aggregating agent complex.
5) Magnetically collect the aggregate using a neodymium magnet, and carefully remove the supernatant with a pipette or the like.
6) Depending on the purpose, the protein is separated from the conjugate, and the amount of the target protein is quantified with a labeled antibody or the like.
上記手法により調製された磁性を付与された親水性物質とグルタチオンの複合物を用いて、グルタチオン−（Ｓ）−トランスフェラーゼ融合タンパクを濃縮する方法は下記のとおりである。
１）グルタチオン−（Ｓ）−トランスフェラーゼ融合タンパクを生産するように形質転換した生産菌を培養し、得られた細胞懸濁液を破砕し、細胞破砕懸濁液を調製する。
２）グルタチオンの結合した磁性を付与された親水性物質とグルタチオン−（Ｓ）−ト
ランスフェラーゼ融合タンパク質を含む細胞破砕懸濁液を加え、混合液とし、グルタチオン−（Ｓ）−トランスフェラーゼ融合タンパク質／グルタチオン−磁性を付与された親水性物質の結合体を生成させる。
３）前記混合液に凝集剤を加え、攪拌もしくはピペッティングを行い、グルタチオン−（Ｓ）−トランスフェラーゼ融合タンパク質／グルタチオン−磁性を付与された親水性物質／凝集剤の複合体を凝集させる。
４）ネオジ磁石を用いて凝集を磁気回収し、上澄をピペットなどにより注意深く除去する。
５）目的によっては、結合体からタンパク質を分離、もしくはグルタチオン−（Ｓ）−トランスフェラーゼと目的タンパクの切り出しを行い、また、標識抗体などで目的タンパク量を定量する。
A method for concentrating glutathione- (S) -transferase fusion protein using a composite of magnetically imparted hydrophilic substance and glutathione prepared by the above method is as follows.
1) A production bacterium transformed so as to produce a glutathione- (S) -transferase fusion protein is cultured, and the resulting cell suspension is disrupted to prepare a cell disruption suspension.
2) Glutathione-bound hydrophilic substance and glutathione- (S) -transferase fusion protein-containing cell disruption suspension are added to prepare a mixed solution of glutathione- (S) -transferase fusion protein / glutathione- A conjugate of a hydrophilic substance imparted with magnetism is generated.
3) An aggregating agent is added to the mixed solution, and stirring or pipetting is performed to aggregate the glutathione- (S) -transferase fusion protein / glutathione-magnetically imparted hydrophilic substance / aggregating agent complex.
4) Magnetically collect the aggregate using a neodymium magnet and carefully remove the supernatant with a pipette or the like.
5) Depending on the purpose, the protein is separated from the conjugate, or glutathione- (S) -transferase and the target protein are excised, and the amount of the target protein is quantified with a labeled antibody or the like.
上記手法により調製された磁性を付与された親水性物質とイミノジ酢酸ニッケルの複合物を用いて、ヒスチジン−タグ融合タンパクを濃縮する方法は下記のとおりである。
１）ヒスチジン−タグ融合タンパクを生産するように形質転換した生産菌を培養し、得られた細胞懸濁液を破砕し、細胞破砕懸濁液を調製する。
２）ビオチンを結合させた親水性物質と、アビジンを含むサリンバッファーを加えて混合液とし、親水性物質−ビオチン／アビジン複合体を形成させる。さらに上記複合体に、ビオチン−イミノジ酢酸ニッケルを加えて、親水性物質−ビオチン／アビジン／ビオチン−イミノジ酢酸ニッケル複合体を形成させる。
３）前記混合液に凝集剤を加え、攪拌もしくはピペッティングを行い、ヒスチジン−タグ融合タンパク／イミノジ酢酸ニッケル−磁性を付与された親水性物質／凝集剤の複合体を凝集させる。
４）ネオジ磁石を用いて凝集を磁気回収し、上澄をピペットなどにより注意深く除去する。
５）目的によっては、結合体からイミノジ酢酸ニッケル融合タンパクを分離、また、標識抗体などで目的タンパク量を定量する。
A method for concentrating a histidine-tag fusion protein using a composite of a hydrophilic substance imparted with magnetism prepared by the above technique and nickel iminodiacetate is as follows.
1) A production bacterium transformed so as to produce a histidine-tag fusion protein is cultured, and the resulting cell suspension is disrupted to prepare a cell disruption suspension.
2) A hydrophilic substance to which biotin is bound and a sarin buffer containing avidin are added to form a mixed solution to form a hydrophilic substance-biotin / avidin complex. Furthermore, biotin-iminodiacetate is added to the complex to form a hydrophilic substance-biotin / avidin / biotin-iminodiacetate complex.
3) An aggregating agent is added to the mixed solution, and stirring or pipetting is performed to aggregate the histidine-tag fusion protein / iminodiacetate-magnetically imparted hydrophilic substance / aggregating agent complex.
4) Magnetically collect the aggregate using a neodymium magnet and carefully remove the supernatant with a pipette or the like.
5) Depending on the purpose, the nickel iminodiacetate fusion protein is separated from the conjugate, and the amount of the target protein is quantified with a labeled antibody or the like.
上記手法により調製された磁性を付与された親水性物質とアンチセンスＤＮＡの複合物を用いて、目的ＤＮＡを濃縮する方法は下記のとおりである。
１）目的ＤＮＡを含有する細胞破砕懸濁液を調製する。
２）目的ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを磁性を付与された親水性物質に結合させる。
３）目的ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを結合させた磁性を付与された親水性物質と目的ＤＮＡを含む細胞破砕懸濁液を加えてハイブリダイズさせ、目的ＤＮＡ／目的ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ−磁性を付与された親水性物質の結合体を生成させる。
４）前記混合液に凝集剤を加え、攪拌もしくはピペッティングを行い、目的ＤＮＡ／目的ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ−磁性を付与された親水性物質／凝集剤の複合体を凝集させる。
５）ネオジ磁石を用いて凝集を磁気回収し、上澄をピペットなどにより注意深く除去する。
６）目的によっては、結合体から目的ＤＮＡを分離し、また、標識用ＤＮＡなどで目的ＤＮＡ量を定量する。
A method of concentrating the target DNA using a composite of a hydrophilic substance imparted with magnetism and an antisense DNA prepared by the above method is as follows.
1) A cell disruption suspension containing the target DNA is prepared.
2) A DNA having a sequence complementary to the target DNA is bound to a hydrophilic substance imparted with magnetism.
3) Add a hydrophilic substance with magnetism combined with a DNA having a sequence complementary to the target DNA and a cell disruption suspension containing the target DNA to hybridize and complement the target DNA / target DNA. A DNA-magnetically bound hydrophilic substance having a sequence is produced.
4) An aggregating agent is added to the mixed solution, and stirring or pipetting is performed to agglomerate the complex of hydrophilic substance / aggregating agent imparted with DNA-magnetism having a sequence complementary to the target DNA / target DNA.
5) Magnetically collect the aggregate using a neodymium magnet, and carefully remove the supernatant with a pipette or the like.
6) Depending on the purpose, the target DNA is separated from the conjugate, and the amount of the target DNA is quantified with a labeling DNA or the like.
上記手法により調製された磁性を付与された親水性物質とオリゴｄＴの複合物を用いて、ｍＲＮＡを濃縮する方法は下記のとおりである。
１）目的ｍＲＮＡを含有する細胞破砕懸濁液を調製する。
２）オリゴｄＴを磁性を付与された親水性物質に結合させる。
３）オリゴｄＴを結合させた磁性を付与された親水性物質とｍＲＮＡを含む細胞破砕懸
濁液を加えてハイブリダイズさせ、ｍＲＮＡ／オリゴｄＴ−磁性を付与された親水性物質の結合体を生成させる。
４）前記混合液に凝集剤を加え、攪拌もしくはピペッティングを行い、ｍＲＮＡ／オリゴｄＴ−磁性を付与された親水性物質／凝集剤の複合体を凝集させる。
５）ネオジ磁石を用いて凝集を磁気回収し、上澄をピペットなどにより注意深く除去する。
６）目的によっては、結合体からｍＤＮＡを分離し、また、ブロッティングの手法により定量する。
A method of concentrating mRNA using a composite of a hydrophilic substance imparted with magnetism and oligo dT prepared by the above method is as follows.
1) A cell disruption suspension containing the target mRNA is prepared.
2) The oligo dT is bonded to a hydrophilic substance imparted with magnetism.
3) Add a hydrophilic substance to which magnetism is imparted with oligo dT and a cell disruption suspension containing mRNA and hybridize to generate a conjugate of mRNA / oligo dT-hydrophilic substance to which magnetism is imparted. Let
4) An aggregating agent is added to the mixed solution, and stirring or pipetting is performed to aggregate the mRNA / oligo dT-magnetized hydrophilic substance / aggregating agent complex.
5) Magnetically collect the aggregate using a neodymium magnet, and carefully remove the supernatant with a pipette or the like.
6) Depending on the purpose, mDNA is separated from the conjugate and quantified by a blotting technique.
Ｄ．リンカーを介して、親水性物質／磁気成分複合体とアフィニティタグを固定した態様
親水性物質とアフィニティタグを結合させるためにリンカーを用いるほかは、上記Ｃの態様と同様である。
D. A mode in which the hydrophilic substance / magnetic component complex and the affinity tag are immobilized via a linker The same as the mode C described above except that a linker is used to bind the hydrophilic substance and the affinity tag.
以下に本発明を実施例により例証するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
検討に用いた試薬のうち、下記のものは以下のようにして調製した。
（6−アミノヘキシルビオチンアミドの合成）
窒素ライン、還流塔、マグネティックスターラーバーを装備した１００ｍL二口フラスコに、ビオチン−N−ヒドロキシサクシンイミドエステル（１．０ｇ）、DMF（１８ｍL）を加え、懸濁液とした。窒素雰囲気下、６０℃で攪拌し、均一に溶解させた。１．６−ヘキサメンチレンジアミン（２．５ｇ）を加えた後、６０℃で３．５時間攪拌した後、室温に戻した。攪拌下、酢酸エチル（１５０ｍL）を加え、析出した白色粉末を減圧下メンブランフィルターを用いて吸引濾過し、酢酸エチル（５０ｍL）で３度、ジエチルエーテル（２０ｍL）で２度洗浄した。得られた白色粉末をジエチルエーテル（２０ｍL）に懸濁させ、３０分攪拌した後、再度減圧下吸引濾過を行った。得られた白色粉末を減圧化、４０℃で乾燥させた。収量１．１２ｇ。
The present invention is illustrated below by examples, but the present invention is not limited to these examples.
Of the reagents used in the study, the following were prepared as follows.
(Synthesis of 6-aminohexylbiotinamide)
Biotin-N-hydroxysuccinimide ester (1.0 g) and DMF (18 mL) were added to a 100 mL two-necked flask equipped with a nitrogen line, a reflux tower, and a magnetic stir bar to obtain a suspension. The mixture was stirred at 60 ° C. in a nitrogen atmosphere and dissolved uniformly. 1.6-hexamenthylenediamine (2.5 g) was added, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 3.5 hours, and then returned to room temperature. Under stirring, ethyl acetate (150 mL) was added, and the precipitated white powder was subjected to suction filtration using a membrane filter under reduced pressure, and washed 3 times with ethyl acetate (50 mL) and twice with diethyl ether (20 mL). The obtained white powder was suspended in diethyl ether (20 mL), stirred for 30 minutes, and then suction filtered again under reduced pressure. The resulting white powder was dried under reduced pressure at 40 ° C. Yield 1.12 g.
（ポリエチレングリコール水溶液の調製）
マグネティックスターラーバーを装備した１５０ｍＬガラス瓶に、ポリエチレングリコール（６ＫＤａ、２．５ｇ）、超純水（９７．５ｇ）、ジエチルピロカーボネート（０．１ｍＬ）を加えた後、蓋を閉めて室温で一昼夜攪拌した。１２０℃４０分の条件でオートクレーブ滅菌した。
(Preparation of aqueous polyethylene glycol solution)
After adding polyethylene glycol (6 KDa, 2.5 g), ultrapure water (97.5 g), and diethylpyrocarbonate (0.1 mL) to a 150 mL glass bottle equipped with a magnetic stirrer bar, the lid is closed and the mixture is stirred overnight at room temperature. did. Autoclave sterilization was performed at 120 ° C. for 40 minutes.
（塩化鉄水溶液の調製）
マグネティックスターラーバーを装備した５００ｍＬのビーカーに塩化第二鉄・六水和物（８１．９ｇ） および塩化第一鉄・四水和物（２９．８ｇ）、超純水（１８８．３ｇ）を入れ、窒素をバブリングしながら室温で２時間攪拌して均一に溶解させた。得られた溶液を減圧下吸引濾過し、得られた黄褐色液を３００ｍＬにメスアップした。なお、超純水は、ミリポア製Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑ（商品名）を使用して調製した。
(Preparation of aqueous iron chloride solution)
Put a ferric chloride hexahydrate (81.9 g), ferrous chloride tetrahydrate (29.8 g), and ultrapure water (188.3 g) into a 500 mL beaker equipped with a magnetic stir bar. The mixture was stirred for 2 hours at room temperature while bubbling nitrogen and dissolved uniformly. The obtained solution was subjected to suction filtration under reduced pressure, and the resulting tan solution was made up to 300 mL. The ultrapure water was prepared using Direct-Q (trade name) manufactured by Millipore.
実施例１
末端ビオチン化デキストランの合成とアビジン回収を、以下の方法で行った。
マグネティックスターラーバーを装備した５０ｍＬナス方フラスコに、デキストラン（４０ＫＤａ、１．０ｇ）、超純水（１０ｍＬ）を加え、攪拌して均一に溶解させた。別途、マグネティックスターラーバーを装備した１０ｍＬビーカーに実施例２の６−アミノヘキシルビオチンアミド（５０ｍｇ）、ＤＭＦ（９．９５ｇ）を加え、均一に溶解させた。６−アミノヘキシルビオチンアミドＤＭＦ溶液（２ｇ）をデキストラン水溶液に加えた。反応液に窒素を５分間バブリングさせた後、活栓にて反応容器を封止し、室温で１週間攪拌した。
減圧化溶媒を完全に留去し、超純水（１０ｍＬ）を加え、３時間攪拌を行い、減圧下メンブランフィルターを用いて吸引濾過を行った。超純水（５ｍＬ）で２度洗浄を行い、得られた濾液を１００ｍＬナス型フラスコに移し、凍結乾燥させた。収量９９８ｍｇ。ビオチン導入量（10μmol／ｍＬ、Biotin Quantitation Kit（Ｐｉｅｒｃｅ製）で測定）
得られたビオチン導入デキストラン（１０ｍｇ）を超純水（９９０ｍｇ）に溶解させた液（１０μＬ）を１．５ｍLスクリューキャップチューブに移し、アビジンのサリンバッファー（０．１g/mL、５０μＬ）を加えて、ボルテックスミキサーを用いて10秒間攪拌した。ポリエチレングリコール水溶液（３０μＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて10秒間攪拌し、凝集体を発生させた。ネオジ磁石をスクリューキャップチューブの側面に配し、5分間静置し凝集体をペレットとした。ピペッターを用いて、上澄を注意深く除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりペレット画分にアビジンのバンドを確認した。
Example 1
Synthesis of terminal biotinylated dextran and avidin recovery were performed by the following method.
Dextran (40 KDa, 1.0 g) and ultrapure water (10 mL) were added to a 50 mL eggplant-shaped flask equipped with a magnetic stirrer bar and stirred to dissolve uniformly. Separately, 6-aminohexylbiotinamide (50 mg) and DMF (9.95 g) of Example 2 were added to a 10 mL beaker equipped with a magnetic stirrer bar and dissolved uniformly. 6-Aminohexylbiotinamide DMF solution (2 g) was added to the aqueous dextran solution. After bubbling nitrogen through the reaction solution for 5 minutes, the reaction vessel was sealed with a stopcock and stirred at room temperature for 1 week.
The depressurized solvent was completely distilled off, ultrapure water (10 mL) was added, the mixture was stirred for 3 hours, and suction filtration was performed using a membrane filter under reduced pressure. Washing was performed twice with ultrapure water (5 mL), and the obtained filtrate was transferred to a 100 mL eggplant-shaped flask and freeze-dried. Yield 998 mg. Biotin introduction amount (10μmol / mL, measured with Biotin Quantitation Kit (Pierce))
A solution (10 μL) of the obtained biotin-introduced dextran (10 mg) dissolved in ultrapure water (990 mg) was transferred to a 1.5 mL screw cap tube, and avidin sarin buffer (0.1 g / mL, 50 μL) was added. The mixture was stirred for 10 seconds using a vortex mixer. An aqueous polyethylene glycol solution (30 μL) was added, and the mixture was stirred for 10 seconds using a vortex mixer to generate aggregates. A neodymium magnet was placed on the side of the screw cap tube and allowed to stand for 5 minutes to give aggregates as pellets. The supernatant was carefully removed using a pipettor. Avidin bands were confirmed in the pellet fraction by SDS-PAGE.
実施例２
ビオチン導入デキストラン被覆マグネタイトの調製（米国特許第４５２７７３号に記載されている方法）、アビジン回収を、下記の方法により行った。
メカニカルスターラー、還流塔、窒素ラインを装備した２Ｌ３つ口フラスコにデキストラン（和光純薬製、４０ＫＤａ）の５．０質量％水溶液（１Ｌ）を入れ、攪拌下６５℃に加熱した。上記塩化鉄水溶液（１００ｍＬ）を滴下し、滴下終了後１０分間攪拌した後、ｐＨ１０〜１１程度になるように２８質量％アンモニア水溶液を滴下しながら、３０分間攪拌した。この溶液を減圧下吸引濾過し、得られた濾液の一部（１００ｍＬ）に対して、イオン交換水（５Ｌ）を用いた透析操作を、３時間を４度と１２時間を１度とを１サイクルとして、２サイクル行った。この操作で平均粒子径が１０２±１５．４ｎｍの、デキストランが固定された磁性微粒子が得られた。
Example 2
Preparation of biotin-introduced dextran-coated magnetite (method described in US Pat. No. 4,527,773) and avidin recovery were performed by the following methods.
A 5.0 mass% aqueous solution (1 L) of dextran (manufactured by Wako Pure Chemicals, 40 KDa) was placed in a 2 L three-necked flask equipped with a mechanical stirrer, a reflux tower, and a nitrogen line, and heated to 65 ° C. with stirring. The iron chloride aqueous solution (100 mL) was added dropwise and stirred for 10 minutes after the completion of the dropwise addition, and then stirred for 30 minutes while dropping a 28% by mass aqueous ammonia solution so that the pH was about 10-11. The solution was subjected to suction filtration under reduced pressure, and a portion (100 mL) of the obtained filtrate was subjected to dialysis using ion-exchanged water (5 L), 3 hours at 4 degrees and 12 hours at 1 degree. As a cycle, two cycles were performed. By this operation, magnetic fine particles having an average particle diameter of 102 ± 15.4 nm and having fixed dextran were obtained.
アルデヒド基を有するデキストラン被覆マグネタイトを調製するために、メカニカルスターラー、還流塔、窒素ラインを装備した２００ｍＬ３つ口フラスコに上記方法で調製したデキストラン被覆マグネタイト水溶液（１００ｍＬ）を加え、過ヨウ素酸ナトリウム（１０ｍｇ）を超純水（１ｍＬ）に溶解させたものを添加し、５０℃で５時間攪拌を行い、室温へ冷却した。
この磁性微粒子は特に精製せずに次の反応に用いた。平均粒子径は１１０±１５．７ｎｍであった。
In order to prepare a dextran-coated magnetite having an aldehyde group, a dextran-coated magnetite aqueous solution (100 mL) prepared by the above method was added to a 200 mL three-necked flask equipped with a mechanical stirrer, a reflux tower and a nitrogen line, and sodium periodate (10 mg). ) Was dissolved in ultrapure water (1 mL), stirred at 50 ° C. for 5 hours, and cooled to room temperature.
The magnetic fine particles were used for the next reaction without any particular purification. The average particle size was 110 ± 15.7 nm.
ビオチンを導入したデキストラン被覆マグネタイトを調製するために、マグネティックスターラーバーを装備した２０ｍＬナス型フラスコに、上記で調製したアルデヒド基を有するデキストラン被覆マグネタイト水溶液（１０ｍＬ）を入れた。
別途、８ｍＬ試験管に６−アミノヘキシルビオチンアミド（１０ｍｇ）、ＤＭＦ（１．９９ｇ）を入れ、６０℃まで加熱した後、超音波処理を行い、均一に溶解させた。６−アミノヘキシルビオチンアミドＤＭＦ溶液（５００ｍｇ）を上記２０ｍＬナス型フラスコに入れ、窒素を５分間バブリングした後、活栓をして２４時間攪拌した。
別途、８ｍＬ試験管に水素化ホウ素ナトリウム（１０ｍｇ）を超純水（１ｍＬ）に溶解させた発泡液の一部（１ｍＬ）を上記２０ｍＬナス型フラスコに添加した。２０ｍＬナス型フラスコに綿詮で蓋をし、２４時間攪拌した。
この溶液を減圧下吸引濾過し、得られた濾液に対して、イオン交換水（５００ｍＬ）を用いた透析操作を、１時間を３度と１９時間を１度行った。この操作で平均粒子径が１０９±３７ｎｍの、ビオチンが導入され、またデキストランが固定化された磁性微粒子が得られた。
ビオチン導入量（420nmol／ｍＬ、Biotin Quantitation Kit（Ｐｉｅｒｃｅ製）で測定）
In order to prepare dextran-coated magnetite into which biotin was introduced, a 20 mL eggplant-shaped flask equipped with a magnetic stirrer bar was charged with the dextran-coated magnetite aqueous solution (10 mL) having the aldehyde group prepared above.
Separately, 6-aminohexylbiotinamide (10 mg) and DMF (1.99 g) were placed in an 8 mL test tube, heated to 60 ° C., and then subjected to ultrasonic treatment to be dissolved uniformly. 6-Aminohexylbiotinamide DMF solution (500 mg) was placed in the 20 mL eggplant-shaped flask, and after bubbling nitrogen for 5 minutes, the stopper was put on and stirred for 24 hours.
Separately, a part (1 mL) of a foaming solution prepared by dissolving sodium borohydride (10 mg) in ultrapure water (1 mL) in an 8 mL test tube was added to the 20 mL eggplant type flask. The 20 mL eggplant-shaped flask was capped with a cotton candy and stirred for 24 hours.
This solution was subjected to suction filtration under reduced pressure, and the resulting filtrate was subjected to dialysis using ion-exchanged water (500 mL) for 3 hours for 1 hour and once for 19 hours. By this operation, magnetic fine particles having an average particle diameter of 109 ± 37 nm into which biotin was introduced and dextran was immobilized were obtained.
Biotin introduction amount (420 nmol / mL, measured with Biotin Quantitation Kit (Pierce))
得られたビオチン導入デキストラン被覆マグネタイト水溶液（１０μＬ）を１．５ｍL
スクリューキャップチューブに移し、アビジンのサリンバッファー（０．１g/mL、５０μＬ）を加えて、ボルテックスミキサーを用いて10秒間攪拌した。ポリエチレングリコール水溶液（３０μＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて10秒間攪拌し、凝集体を発生させた。ネオジ磁石をスクリューキャップチューブの側面に配し、5分間静置し凝集体をペレットとした。このとき上澄は無色透明であり、ビオチン導入デキストラン被覆マグネタイトが良好に分離されていることを確認した。ピペッターを用いて、上澄を注意深く除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより磁気ペレット画分にアビジンのバンドを確認した。
1.5 mL of the obtained biotin-introduced dextran-coated magnetite aqueous solution (10 μL)
It moved to the screw cap tube, the sarin buffer (0.1g / mL, 50 microliters) of avidin was added, and it stirred for 10 second using the vortex mixer. An aqueous polyethylene glycol solution (30 μL) was added, and the mixture was stirred for 10 seconds using a vortex mixer to generate aggregates. A neodymium magnet was placed on the side of the screw cap tube and allowed to stand for 5 minutes to give aggregates as pellets. At this time, the supernatant was colorless and transparent, and it was confirmed that the biotin-introduced dextran-coated magnetite was well separated. The supernatant was carefully removed using a pipettor. Avidin bands were confirmed in the magnetic pellet fraction by SDS-PAGE.
実施例３
ポリビニルアルコール被覆マグネタイトの調製と磁気分離は、下記の方法で行った。
メカニカルスターラー、還流塔、窒素ラインを装備した１００ｍＬ３つ口フラスコにポリオールであるポリビニルアルコール（和光純薬社製、分子量２２ＫＤａ）の１質量％水溶液（６０ｍＬ）を入れ、メカニカルスターラーで攪拌し、この混合溶液を５０℃に昇温した後、ｐＨ１０〜１１程度になるように２８質量％アンモニア水溶液を滴下しながら、１時間攪拌した。この溶液を減圧下吸引濾過し、得られた濾液の一部（１００ｍＬ）に対して、イオン交換水（５Ｌ）を用いた透析操作を、３時間を４度と１２時間を１度とを１サイクルとして、２サイクル行った。この操作で平均粒子径が５０±２３．４ｎｍのポリビニルアルコールが固定された磁性微粒子が得られた。
Example 3
Preparation and magnetic separation of the polyvinyl alcohol-coated magnetite were performed by the following methods.
A 100% three-necked flask equipped with a mechanical stirrer, reflux tower and nitrogen line is charged with a 1% by weight aqueous solution (60 mL) of polyvinyl alcohol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., molecular weight 22 KDa) as a polyol, and stirred with a mechanical stirrer. After the temperature of the solution was raised to 50 ° C., the solution was stirred for 1 hour while dropping a 28% by mass aqueous ammonia solution so that the pH was about 10-11. The solution was subjected to suction filtration under reduced pressure, and a portion (100 mL) of the obtained filtrate was subjected to dialysis using ion-exchanged water (5 L), 3 hours at 4 degrees and 12 hours at 1 degree. As a cycle, two cycles were performed. By this operation, magnetic fine particles to which polyvinyl alcohol having an average particle diameter of 50 ± 23.4 nm was fixed were obtained.
得られたポリビニルアルコール被覆マグネタイト水溶液（１０μＬ）を１．５ｍLスクリューキャップチューブに移し、サリンバッファー（５０μＬ）を加えて、ボルテックスミキサーを用いて10秒間攪拌した。ポリエチレングリコール水溶液（３０μＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて10秒間攪拌し、凝集体を発生させた。ネオジ磁石をスクリューキャップチューブの側面に配し、5分間静置し凝集体をペレットとした。このとき、上澄は透明であり、上記手法により、良好にポリビニルアルコール被覆マグネタイトが分離可能であることを確認した。 The obtained polyvinyl alcohol-coated magnetite aqueous solution (10 μL) was transferred to a 1.5 mL screw cap tube, sarin buffer (50 μL) was added, and the mixture was stirred for 10 seconds using a vortex mixer. An aqueous polyethylene glycol solution (30 μL) was added, and the mixture was stirred for 10 seconds using a vortex mixer to generate aggregates. A neodymium magnet was placed on the side of the screw cap tube and allowed to stand for 5 minutes to give aggregates as pellets. At this time, the supernatant was transparent, and it was confirmed that the polyvinyl alcohol-coated magnetite could be satisfactorily separated by the above method.
実施例４
グリシジル基を導入したデキストラン被覆マグネタイトの調製と凝集体形成および磁気分離性能の確認を、下記の方法で行った。
還流塔、マグネティックスターラーバーを装備した２０ｍＬナス型フラスコに実施例５のデキストランが固定化されたマグネタイト水溶液（１０ｍＬ）、エピクロロヒドリン（１００ｍｇ）、トリエチルアミン（１ｇ）を加え、６０℃で加熱しながら８時間強攪拌した。反応液に酢酸エチル（１５ｍＬ）を加え、分液操作を行った。水層に対してさらに酢酸エチル（１５ｍＬ）で２度洗浄を行った。
水層を５０ｍＬナス型フラスコへ移し、減圧下溶媒を留去し、水の蒸発が確認できた段階で濃縮を停止した。得られた水層に対してイオン交換水（５００ｍＬ）を用いた１時間の透析操作を４度行った。この操作で平均粒子径が１０２±１５．４ｎｍの、グリシジル基が導入されたデキストラン被覆磁性微粒子が得られた。
Example 4
Preparation of dextran-coated magnetite having a glycidyl group introduced therein and formation of aggregates and confirmation of magnetic separation performance were performed by the following methods.
A 20 mL eggplant type flask equipped with a reflux tower and a magnetic stirrer bar was added with an aqueous magnetite solution (10 mL) in which dextran of Example 5 was immobilized, epichlorohydrin (100 mg), and triethylamine (1 g), and heated at 60 ° C. The mixture was stirred vigorously for 8 hours. Ethyl acetate (15 mL) was added to the reaction solution, and a liquid separation operation was performed. The aqueous layer was further washed twice with ethyl acetate (15 mL).
The aqueous layer was transferred to a 50 mL eggplant type flask, the solvent was distilled off under reduced pressure, and concentration was stopped when the evaporation of water was confirmed. The obtained aqueous layer was subjected to dialysis operation for 4 hours using ion-exchanged water (500 mL) four times. By this operation, dextran-coated magnetic fine particles introduced with a glycidyl group and having an average particle diameter of 102 ± 15.4 nm were obtained.
得られたグリシジル導入デキストラン被覆マグネタイト水溶液（１０μＬ）を１．５ｍLスクリューキャップチューブに移し、サリンバッファー（５０μＬ）を加えて、ボルテックスミキサーを用いて10秒間攪拌した。ポリエチレングリコール水溶液（３０μＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて10秒間攪拌し、凝集体を発生させた。ネオジ磁石をスクリューキャップチューブの側面に配し、5分間静置し凝集体をペレットとした。このとき、上澄は透明であり、上記手法により、良好にグリシジル導入デキストラン被覆マグネタイトが分離可能であることを確認した。 The obtained glycidyl-introduced dextran-coated magnetite aqueous solution (10 μL) was transferred to a 1.5 mL screw cap tube, sarin buffer (50 μL) was added, and the mixture was stirred for 10 seconds using a vortex mixer. An aqueous polyethylene glycol solution (30 μL) was added, and the mixture was stirred for 10 seconds using a vortex mixer to generate aggregates. A neodymium magnet was placed on the side of the screw cap tube and allowed to stand for 5 minutes to give aggregates as pellets. At this time, the supernatant was transparent, and it was confirmed that the glycidyl-introduced dextran-coated magnetite was satisfactorily separated by the above method.
実施例５
アミノ基を導入したデキストラン被覆マグネタイトの調製と凝集体形成および磁気分離
性能の確認を、下記の方法で行った。
還流塔、マグネティックスターラーバーを装備した５ｍＬナス型フラスコに実施例１０のグリシジル基を導入したデキストラン被覆マグネタイト水溶液（４ｍＬ）、トリス（２−アミノエチル）アミン（１０ｍｇ）、トリエチルアミン（１００ｍｇ）を加え、６０℃で加熱しながら３時間強攪拌した。得られた反応液に対して、イオン交換水（３００ｍＬ）を用いた透析操作を、１時間を４度行った。この操作で平均粒子径が１１２±１６．８ｎｍの、アミノ基が導入されたデキストラン被覆磁性微粒子が得られた。
得られたアミノ基を導入したデキストラン被覆マグネタイト水溶液（１０μＬ）を１．５ｍLスクリューキャップチューブに移し、サリンバッファー（５０μＬ）を加えて、ボルテックスミキサーを用いて10秒間攪拌した。ポリエチレングリコール水溶液（３０μＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて10秒間攪拌し、凝集体を発生させた。ネオジ磁石をスクリューキャップチューブの側面に配し、5分間静置し凝集体をペレットとした。このとき、上澄は透明であり、上記手法により、良好にアミノ基を導入したデキストラン被覆マグネタイトが分離可能であることを確認した。
Example 5
Preparation of dextran-coated magnetite having amino groups introduced therein and formation of aggregates and confirmation of magnetic separation performance were carried out by the following methods.
A dextran-coated magnetite aqueous solution (4 mL) into which a glycidyl group of Example 10 was introduced, a tris (2-aminoethyl) amine (10 mg), and triethylamine (100 mg) were added to a 5 mL eggplant-shaped flask equipped with a reflux tower and a magnetic stir bar. The mixture was vigorously stirred for 3 hours while heating at 60 ° C. A dialysis operation using ion-exchanged water (300 mL) was performed 4 times for 1 hour on the obtained reaction solution. By this operation, dextran-coated magnetic fine particles introduced with amino groups and having an average particle diameter of 112 ± 16.8 nm were obtained.
The obtained dextran-coated magnetite aqueous solution (10 μL) into which amino groups had been introduced was transferred to a 1.5 mL screw cap tube, sarin buffer (50 μL) was added, and the mixture was stirred for 10 seconds using a vortex mixer. An aqueous polyethylene glycol solution (30 μL) was added, and the mixture was stirred for 10 seconds using a vortex mixer to generate aggregates. A neodymium magnet was placed on the side of the screw cap tube and allowed to stand for 5 minutes to give aggregates as pellets. At this time, the supernatant was transparent, and it was confirmed that the dextran-coated magnetite into which the amino group was successfully introduced was separable by the above method.
実施例６
グルタチオンを導入したデキストラン被覆マグネタイトの調製と凝集体形成および磁気分離性能の確認を下記の方法で行った。
マグネティックスターラーバーを装備した５ｍＬナス型フラスコに実施例１０のアミノ基導入デキストラン被覆マグネタイト水溶液（２ｍＬ）にスルホサクシンイミジル−４−[Ｎ−マレイミドメチル]シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、１ｍｇ、Ｐｉｅｒｃｅ製）を加えて室温で１分間攪拌し、１時間放置した。３７℃に設定したシェーカー付きの恒温層で、６０ＲＰＭで３０分震とうし、得られた反応液をセントリコン−３（ミリポア製）で５００μＬ程度に濃縮し、超純水を用いて２ｍＬにメスアップした。この濃縮−希釈操作を５度繰り返す。この操作でマレイミド基が導入されたデキストラン被覆磁性微粒子が得られた。
Example 6
Preparation of dextran-coated magnetite introduced with glutathione, formation of aggregates and confirmation of magnetic separation performance were performed by the following methods.
To a 5 mL eggplant-shaped flask equipped with a magnetic stir bar, the amino group-introduced dextran-coated magnetite aqueous solution (2 mL) of Example 10 was added to sulfosuccinimidyl-4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC, 1 mg, manufactured by Pierce) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 minute and allowed to stand for 1 hour. Shake at 60 RPM for 30 minutes in a thermostatic chamber with a shaker set at 37 ° C, concentrate the resulting reaction solution to about 500 µL with Centricon-3 (Millipore), and make up to 2 mL with ultrapure water. did. This concentration-dilution operation is repeated 5 times. By this operation, dextran-coated magnetic fine particles into which maleimide groups were introduced were obtained.
マグネティックスターラーバーを装備した５ｍＬナス型フラスコにマレイミド基を導入したデキストラン被覆マグネタイト水溶液（２ｍＬ）に１Ｍリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４、１００μＬ）を加えて攪拌し、全体として４７ｍＭのリン酸バッファー液とした。別途、グルタチオン（１ｍｇ）を５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４、９９μＬ）に溶解させたものの一部（５μＬ）を加え、１分間攪拌した後、５℃で２２時間放置した。得られた反応液をセントリコン−３（ミリポア製）で５００μＬ程度に濃縮し、超純水を用いて２ｍＬにメスアップする。この濃縮−希釈操作を５度繰り返した。この操作でグルタチオンが導入されたデキストラン被覆磁性微粒子が得られた。 1M sodium phosphate buffer (pH 7.4, 100 μL) is added to a dextran-coated magnetite aqueous solution (2 mL) into which a maleimide group has been introduced into a 5 mL eggplant-shaped flask equipped with a magnetic stirrer bar, and the whole is stirred to form a 47 mM phosphate buffer solution. It was. Separately, a part (5 μL) of glutathione (1 mg) dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 7.4, 99 μL) was added, stirred for 1 minute, and then allowed to stand at 5 ° C. for 22 hours. The obtained reaction solution is concentrated to about 500 μL with Centricon-3 (manufactured by Millipore) and made up to 2 mL with ultrapure water. This concentration-dilution operation was repeated 5 times. By this operation, dextran-coated magnetic fine particles into which glutathione was introduced were obtained.
得られたグルタチオンを導入したデキストラン被覆マグネタイト水溶液（１０μＬ）を１．５ｍLスクリューキャップチューブに移し、サリンバッファー（５０μＬ）を加えて、ボルテックスミキサーを用いて10秒間攪拌した。ポリエチレングリコール水溶液（３０μＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて10秒間攪拌し、凝集体を発生させた。ネオジ磁石をスクリューキャップチューブの側面に配し、5分間静置し凝集体をペレットとした。このとき、上澄は透明であり、上記手法により、良好にアミノ基を導入したデキストラン被覆マグネタイトが分離可能であることを確認した。 The obtained dextran-coated magnetite aqueous solution (10 μL) into which glutathione was introduced was transferred to a 1.5 mL screw cap tube, sarin buffer (50 μL) was added, and the mixture was stirred for 10 seconds using a vortex mixer. An aqueous polyethylene glycol solution (30 μL) was added, and the mixture was stirred for 10 seconds using a vortex mixer to generate aggregates. A neodymium magnet was placed on the side of the screw cap tube and allowed to stand for 5 minutes to give aggregates as pellets. At this time, the supernatant was transparent, and it was confirmed that the dextran-coated magnetite into which the amino group was successfully introduced was separable by the above method.
本発明は、診断、分子生物学に関する研究、プロテオミクスに関する研究、または薬物スクリーニングのための物質濃縮手段として利用することができる。 The present invention can be used as a substance concentration means for diagnosis, research on molecular biology, research on proteomics, or drug screening.
Claims (50)
および２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルアクリレートから選択される少なくとも一種を重合して得られた合成ポリマーである請求項１０記載の分離方法。 The hydrophilic substance is allyl alcohol, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycerol-mono (meth) acrylate, 4-hydroxybutyl acrylate, 3-hydroxybutyl acrylate, 3-hydroxypropyl acrylate, and the like as polymerizable monomers. The separation method according to claim 10, which is a synthetic polymer obtained by polymerizing at least one selected from 2-hydroxy-2-methylpropyl acrylate.
チドとＮＴＡ−Ｎｉの相互作用、プロテインＡと抗体の相互作用、プロテインＧと抗体の相互作用、プロテインＬと抗体の相互作用、Ｆｃレセプターと抗体の相互作用、ビオチンとアビジンの相互作用、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用、ジンクフィンガーと核酸の相互作用、薬物候補物質とペプチドの相互作用、薬物候補物質とレセプターの相互作用、および金属イオンとキレート剤とポリアミノ酸の相互作用からなる群から選択される少なくとも一種である請求項１〜１６のいずれかに記載の分離方法。 Interaction between affinity tag and target substance is interaction between antibody and peptide, interaction between antibody and antigen, interaction between antibody fragment and antigen, interaction between nucleic acid and nucleic acid, interaction between protein and nucleic acid, peptide and peptide Interaction, protein-protein interaction, drug candidate substance-protein interaction, glutathione-GST interaction, maltose-maltose-binding protein interaction, carbohydrate-protein interaction, carbohydrate derivative-protein interaction , Interaction between peptide tag and metal ion-metal chelate, interaction between peptide and NTA-Ni, interaction between protein A and antibody, interaction between protein G and antibody, interaction between protein L and antibody, Fc receptor and antibody Interaction, biotin and avidin interaction, biochi Select from the group consisting of: interaction between streptavidin and zinc finger and nucleic acid, drug candidate and peptide interaction, drug candidate and receptor interaction, and metal ion, chelator and polyamino acid interaction The separation method according to claim 1, wherein the separation method is at least one kind.
−Ｎｉ、プロテインＡ／抗体、プロテインＧ／抗体、プロテインＬ／抗体、Ｆｃレセプター／抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ジンクフィンガー／核酸、薬物候補物質／ペプチド、薬物候補物質／レセプター、および金属イオン／キレート剤／ポリアミノ酸からなる群から選択される少なくとも一種である請求項２６〜４１のいずれかに記載の分子コンプレックス。 The combination of the affinity tag and the target substance (affinity tag / target substance) is antibody / peptide, antibody / antigen, antibody fragment / antigen, nucleic acid / nucleic acid, protein / nucleic acid, peptide / peptide, protein / protein, drug candidate Substance / protein, glutathione / GST, maltose / maltose binding protein, carbohydrate / protein, carbohydrate derivative / protein, peptide tag / metal ion-metal chelate, peptide / NTA
Ni, protein A / antibody, protein G / antibody, protein L / antibody, Fc receptor / antibody, biotin / avidin, biotin / streptavidin, zinc finger / nucleic acid, drug candidate / peptide, drug candidate / receptor, and The molecular complex according to any one of claims 26 to 41, which is at least one selected from the group consisting of metal ions / chelating agents / polyamino acids.
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