JP2006321829A - Copolymer and method for producing the same - Google Patents
Copolymer and method for producing the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006321829A JP2006321829A JP2005143606A JP2005143606A JP2006321829A JP 2006321829 A JP2006321829 A JP 2006321829A JP 2005143606 A JP2005143606 A JP 2005143606A JP 2005143606 A JP2005143606 A JP 2005143606A JP 2006321829 A JP2006321829 A JP 2006321829A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- copolymer
- carbon atoms
- gold
- hydrocarbon group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Abstract
Description
本発明は、共重合体およびその製造方法に係り、特に、化学工学，生命工学，環境，医療などの分野に広く使用される酵素センサ，免疫センサ，表面プラズモン共鳴バイオセンサ，水晶振動子マイクロバランスバイオセンサ，ＤＮＡチップ，分子プローブ，金コロイドなどにおいて金を材料とする基材に生体分子を固定化する際に好適に使用される共重合体およびその製造方法に関する。 The present invention relates to a copolymer and a method for producing the same, and in particular, enzyme sensors, immunosensors, surface plasmon resonance biosensors, and quartz crystal microbalances that are widely used in fields such as chemical engineering, biotechnology, environment, and medicine. The present invention relates to a copolymer suitably used when a biomolecule is immobilized on a base material made of gold in a biosensor, a DNA chip, a molecular probe, a gold colloid, and the like, and a method for producing the same.
血液などの生体成分，工場からの排水，食品などに含まれる特定の物質を、生物が有する高い物質認識能力を利用して特異的に検出・測定するセンサが各種研究・開発されている。このようなセンサでは、生体分子であるタンパク質やＤＮＡなどがセンサチップに固定化されており、この生体分子と測定対象物質との特異的な反応や相互作用を電気化学的あるいは光学的手法で観測することで、測定対象物質を検出したり濃度を測定したりすることが可能となる。 Various researches and developments have been made on sensors that specifically detect and measure specific substances contained in biological components such as blood, wastewater from factories, and foods, using the high substance recognition ability of living organisms. In such a sensor, protein or DNA, which is a biomolecule, is immobilized on a sensor chip, and a specific reaction or interaction between the biomolecule and a measurement target substance is observed by an electrochemical or optical method. By doing so, it becomes possible to detect the substance to be measured and to measure the concentration.
一般に、このような生体分子を用いたセンサをバイオセンサという。バイオセンサは、生体分子が固定化されたセンサチップをセンサ素子として備えており、この生体分子と測定対象物質との特異的な反応や相互作用を電流や光の信号に変換することで、測定対象物質を高い感度で検出したり、測定対象物質の濃度を高い精度で測定したりすることが可能となる。 In general, a sensor using such a biomolecule is called a biosensor. A biosensor is equipped with a sensor chip with a biomolecule immobilized as a sensor element. Measurement is performed by converting a specific reaction or interaction between this biomolecule and a substance to be measured into a current or light signal. It becomes possible to detect the target substance with high sensitivity and to measure the concentration of the measurement target substance with high accuracy.
具体的なバイオセンサとしては、例えば食品や血清などの試料中の果糖（フルクトース）濃度を測定する果糖濃度センサが挙げられる（例えば、特許文献１）。この果糖濃度センサは、フルクトースを還元する酵素の一種であるフルクトース・デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）が作用電極の表面に固定化されており、メディエータとしてコバルト・フェナトロリン錯体を備えている。 Specific biosensors include, for example, a fructose concentration sensor that measures the fructose concentration in a sample such as food or serum (for example, Patent Document 1). In this fructose concentration sensor, fructose dehydrogenase (FDH), which is a kind of enzyme that reduces fructose, is immobilized on the surface of the working electrode, and a cobalt phenatroline complex is provided as a mediator.
フルクトースの測定は、この作用電極を測定バイアル中の試料に浸漬することにより行われる。作用電極の表面に固定化されたＦＤＨ（酸化型）と試料中のフルクトースが酸化還元反応を起こして、酸化型のＦＤＨから還元型のＦＤＨに変換する。この還元型のＦＤＨは更に酸化型のコバルト・フェナントロリン錯体と反応して、還元型のコバルト・フェナントロリン錯体が生じる。この還元型のコバルト・フェナントロリン錯体が作用電極の表面で酸化されることで、電極に電流が流れる。従って、この電流値を測定することで、試料中のフルクトース濃度を定量的に測定することが可能となっている。 The measurement of fructose is performed by immersing this working electrode in the sample in the measurement vial. FDH (oxidized type) immobilized on the surface of the working electrode and fructose in the sample undergo a redox reaction to convert oxidized FDH to reduced FDH. This reduced FDH further reacts with an oxidized cobalt phenanthroline complex to produce a reduced cobalt phenanthroline complex. The reduced type cobalt phenanthroline complex is oxidized on the surface of the working electrode, whereby a current flows through the electrode. Accordingly, by measuring this current value, it is possible to quantitatively measure the fructose concentration in the sample.
このように、バイオセンサは、測定対象物質と特異的に相互作用する生体分子（上記の例では、ＦＤＨ）を利用しているため、測定対象物質以外の他の物質による測定への影響が少なく、高い感度で目的とする物質を測定することが可能となっている。 As described above, since the biosensor uses a biomolecule that specifically interacts with the measurement target substance (in the above example, FDH), there is little influence on the measurement by a substance other than the measurement target substance. The target substance can be measured with high sensitivity.
ところで、この果糖濃度センサは、金を材料とした金電極で作用電極が構成されており、ＦＤＨの固定化にはチオール化合物が用いられている。そして、金電極とチオール化合物のチオール基の間で形成される金‐システアミン結合を介して、金電極の表面にＦＤＨが固定化されている。このような上記果糖濃度センサでは、金‐システアミン結合を介してＦＤＨが電極表面に固定化されているため、金電極の表面に緻密な単分子層を比較的簡便に作製することが可能となっている。 By the way, in this fructose concentration sensor, a working electrode is composed of a gold electrode made of gold, and a thiol compound is used for immobilizing FDH. FDH is immobilized on the surface of the gold electrode via a gold-cysteamine bond formed between the gold electrode and the thiol group of the thiol compound. In such a fructose concentration sensor, since FDH is immobilized on the electrode surface via a gold-cysteamine bond, it becomes possible to relatively easily produce a dense monomolecular layer on the gold electrode surface. ing.
しかしながら、上記のような従来のセンサでは、生体分子が上記チオール化合物を介して電極表面に単に固定化されているに過ぎないため、試料中の生体成分が電極への非特異的に吸着しやすいという不都合があった。ここで非特異的吸着とは、試料中のタンパク質やＤＮＡといった生体成分が電極の表面と相互作用を起こして吸着する現象である。このような非特異的吸着により電極表面に生体成分が吸着すると、電極表面に固定化された生体分子と測定対象物質との電極表面近傍での特異的な反応や相互作用が阻害されたり、電極表面でのメディエータの酸化還元反応が阻害されたりといった現象が発生する。この結果、測定時間の経過に伴って測定値が減衰したり、測定値にノイズが多くなったりして、測定対象物質を正確に測定することが困難となるという不都合があった。 However, in the conventional sensor as described above, since the biomolecule is merely immobilized on the electrode surface via the thiol compound, the biological component in the sample is easily adsorbed nonspecifically to the electrode. There was an inconvenience. Here, non-specific adsorption is a phenomenon in which biological components such as proteins and DNA in a sample interact and interact with the surface of the electrode. When biological components are adsorbed on the electrode surface due to such non-specific adsorption, specific reactions or interactions between the biomolecules immobilized on the electrode surface and the measurement target substance in the vicinity of the electrode surface may be inhibited, The phenomenon that the redox reaction of the mediator on the surface is inhibited occurs. As a result, there is a disadvantage that it is difficult to accurately measure the measurement target substance because the measurement value is attenuated as the measurement time elapses or the measurement value is noisy.
更に、非特異的吸着により電極表面に生体成分が吸着するため、１度測定に使用したセンサチップを再度利用する場合には、前回の測定で吸着した生体成分の汚染により試料中の測定対象物質を正確に測定することが困難となる。
このため、電極表面を洗浄するなどの処理が必要となり、測定に手間がかかるといった不都合があった。また、洗浄により固定化生体成分が脱離してセンサ感度が低下するといった不都合もあった。
一方で、測定のたびに新規のセンサチップを使用する場合には、測定にかかるコストが高くなる。
Furthermore, since biological components are adsorbed on the electrode surface by non-specific adsorption, when the sensor chip used for the measurement once is reused, the measurement target substance in the sample due to contamination of the biological components adsorbed in the previous measurement It becomes difficult to measure accurately.
For this reason, it is necessary to perform a process such as cleaning the electrode surface, and there is an inconvenience that the measurement takes time. In addition, there is also a disadvantage that the sensitivity of the sensor is reduced due to the desorption of the immobilized biological components due to washing.
On the other hand, when a new sensor chip is used for each measurement, the cost for the measurement increases.
従って、かねてから、金を材料とする基材の表面に生体分子を固定化することが可能であり、且つ、試料中の生体成分が基材表面へ非特異的に吸着することを効率的に防止することが可能な材料の開発が望まれていた。 Therefore, it is possible to immobilize biomolecules on the surface of a base material made of gold for a long time, and efficiently prevent non-specific adsorption of biological components in the sample to the surface of the base material. It has been desired to develop materials that can be used.
ところで、本発明の発明者らは、先にホスホリルコリン類似基を有する単量体を構成単位とした重合体を創出している（例えば、特許文献２）。このような重合体は、ホスホリルコリン類似基を分子内に備えている。ホスホリルコリン類似基は、細胞膜の構成成分であるリン脂質が有するホスホリルコリン基と類似する官能基であり、このような官能基を分子内に有する重合体は、細胞膜と同様にタンパク質や血球といった生体成分との相互作用が極めて弱く、これらの生体成分の吸着や変性を抑制する性質を有する。 By the way, the inventors of the present invention have previously created a polymer having a monomer having a phosphorylcholine-like group as a structural unit (for example, Patent Document 2). Such a polymer has a phosphorylcholine-like group in the molecule. The phosphorylcholine-like group is a functional group similar to the phosphorylcholine group of the phospholipid that is a component of the cell membrane, and the polymer having such a functional group in the molecule is a biological component such as a protein or blood cell as well as the cell membrane. Is extremely weak and has the property of suppressing the adsorption and denaturation of these biological components.
更に、このホスホリルコリン類似基を有する単量体と共重合する他の単量体の性質により、得られる共重合体はさまざまな特性を有することが知られている。
そして、このような重合体は医療用コーティング材料や化粧品材料、あるいはコンタクトレンズの素材等として、幅広い分野において使用されている。
Furthermore, it is known that the resulting copolymer has various properties depending on the properties of other monomers copolymerized with the monomer having a phosphorylcholine-like group.
Such polymers are used in a wide range of fields as medical coating materials, cosmetic materials, or contact lens materials.
しかしながら、ホスホリルコリン類似基を有する重合体であって、センサチップの金属基材に生体分子を固定化可能な特性を備えるとともに、基材表面への生体成分の非特異的吸着を効率的に防止することが可能という両方の性質を備えるものについては、未だに開発されていなかった。 However, it is a polymer having a phosphorylcholine-like group and has a property capable of immobilizing biomolecules on the metal substrate of the sensor chip, and efficiently prevents nonspecific adsorption of biological components on the substrate surface. It has not yet been developed for things that have both of these properties.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、酵素センサ，免疫センサ，表面プラズモン共鳴バイオセンサ，水晶振動子マイクロバランスバイオセンサといった各種バイオセンサのセンサチップに対して好適に使用される共重合体であって、センサチップなどの金属基材に生体分子を固定化できるとともに、生体成分の基材への非特異的吸着を効率的に防止することが可能な共重合体および該共重合体の製造方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and the object thereof is suitable for sensor chips of various biosensors such as enzyme sensors, immunosensors, surface plasmon resonance biosensors, and quartz crystal microbalance biosensors. Copolymers that can immobilize biomolecules on metal substrates such as sensor chips and efficiently prevent nonspecific adsorption of biological components to the substrate. It is to provide a method for producing a polymer and the copolymer.
すなわち、上記課題は、請求項１の共重合体によれば、下記一般式（１）
ｌ，ｍ，ｎは全構成単位中の各構成単位の割合を示し、ｌは０．７０から０．８７，ｍは０．０３から０．２０，ｎは０．１０から０．２７の範囲であり、ゲルパーミエーションクロマトグラフにより標準ポリエチレングリコールを用いて換算した重量平均分子量が１０，０００から１，０００，０００の範囲である。）で示される共重合体により解決される。
That is, according to the copolymer of
l, m, and n represent the proportion of each structural unit in all structural units, l is 0.70 to 0.87, m is 0.03 to 0.20, and n is 0.10 to 0.27. The weight average molecular weight converted using standard polyethylene glycol by gel permeation chromatography is in the range of 10,000 to 1,000,000. This is solved by a copolymer represented by
この場合、請求項２のように、前記共重合体が、下記一般式（２）
また、上記課題は、請求項３の共重合体の製造方法によれば、少なくともホスホリルコリン類似基および活性エステル基を分子内に含む下記一般式（３）
この場合、請求項４の共重合体の製造方法のように、下記一般式（５）
本発明の共重合体によれば、金含有基材を有するセンサチップなどに適用した場合に、金含有基材の表面に任意の生体分子を固定化できるとともに、試料中の生体成分が基材表面へ非特異的に吸着することを効率的に防止することが可能となる。このように、本発明の共重合体をセンサチップなどへ適用した場合には、電極表面などへ生体成分が非特異的に吸着することによる測定値の減衰といった現象を効率的に防止することができる。従って、測定対象物質を正確に検出したり、測定対象物質の濃度を正確に測定したりすることが可能となる。 According to the copolymer of the present invention, when applied to a sensor chip having a gold-containing substrate, any biomolecule can be immobilized on the surface of the gold-containing substrate, and the biological component in the sample is the substrate. It is possible to efficiently prevent nonspecific adsorption to the surface. As described above, when the copolymer of the present invention is applied to a sensor chip or the like, it is possible to efficiently prevent a phenomenon such as attenuation of a measurement value due to nonspecific adsorption of a biological component to an electrode surface or the like. it can. Therefore, it is possible to accurately detect the measurement target substance and accurately measure the concentration of the measurement target substance.
また、試料中の生体成分が金含有基材の表面に吸着しにくいため、１度使用したセンサチップの再利用が容易であり、測定のたびに新規のセンサチップを使用する必要を低減することが可能となる。従って、測定にかかるコストを低減することが可能となる。 In addition, since the biological components in the sample are difficult to adsorb on the surface of the gold-containing substrate, it is easy to reuse the sensor chip that has been used once, reducing the need to use a new sensor chip for each measurement. Is possible. Therefore, the cost for measurement can be reduced.
また、本発明の製造方法によれば、このような共重合体を、ホスホリルコリン類似基含有単量体と活性エステル基含有単量体の２種類の単量体成分を用いて製造することができる。このように、本発明の製造方法によれば、２種類の単量体成分を用いて比較的簡単な方法により共重合体を合成することが可能であるため、共重合体の合成する際に要する原料のコストを低く抑えることが可能となる。 Further, according to the production method of the present invention, such a copolymer can be produced using two types of monomer components, a phosphorylcholine-like group-containing monomer and an active ester group-containing monomer. . As described above, according to the production method of the present invention, a copolymer can be synthesized by a relatively simple method using two types of monomer components. It is possible to keep the cost of the raw material required low.
以下に、本発明の共重合体について説明する。なお、以下に説明する材料，器具，条件などは本発明を限定するものではなく、本発明の趣旨に沿って各種改変することができることは勿論である。 Below, the copolymer of this invention is demonstrated. It should be noted that the materials, instruments, conditions, and the like described below are not intended to limit the present invention, and various modifications can be made in accordance with the spirit of the present invention.
本発明の共重合体は、ホスホリルコリン類似基と、任意の生体分子とウレタン結合を形成する活性エステル基と、金と吸着するチオール基と、を分子内に有する共重合体（以下、共重合体（Ａ）という）である。この共重合体（Ａ）は、特に金を材料とする基材（以下、金含有基材）に生体分子を固定化する際に好適に使用される。 The copolymer of the present invention is a copolymer having a phosphorylcholine-like group, an active ester group that forms a urethane bond with any biomolecule, and a thiol group that adsorbs gold (hereinafter referred to as copolymer). (Referred to as (A)). This copolymer (A) is particularly preferably used when a biomolecule is immobilized on a base material made of gold (hereinafter referred to as a gold-containing base material).
具体的には、本発明の共重合体は、下記一般式（１）
ｌ，ｍ，ｎは全構成単位中の各構成単位の割合を示し、ｌは０．７０から０．８７，ｍは０．０３から０．２０，ｎは０．１０から０．２７の範囲であり、ゲルパーミエーションクロマトグラフにより標準ポリエチレングリコールを用いて換算した重量平均分子量が１０，０００から１，０００，０００の範囲である。）で示される共重合体である。
Specifically, the copolymer of the present invention has the following general formula (1):
l, m, and n represent the proportion of each structural unit in all structural units, l is 0.70 to 0.87, m is 0.03 to 0.20, and n is 0.10 to 0.27. The weight average molecular weight converted using standard polyethylene glycol by gel permeation chromatography is in the range of 10,000 to 1,000,000. ).
本発明の共重合体（Ａ）はチオール基を分子内に有している。このチオール基は、金との間で非共有結合性の金‐チオール結合を形成する。この金‐チオール結合により、共重合体（Ａ）は金含有基材の表面に吸着して、自己組織化した安定な表面層を形成する。 The copolymer (A) of the present invention has a thiol group in the molecule. This thiol group forms a non-covalent gold-thiol bond with gold. Due to the gold-thiol bond, the copolymer (A) is adsorbed on the surface of the gold-containing substrate to form a self-assembled stable surface layer.
また、共重合体（Ａ）は活性エステル基を分子内に有している。共重合体（Ａ）の活性エステル基は、タンパク質やＤＮＡといった生体分子のアミノ基と反応して、ウレタン結合を形成する。詳細には、タンパク質のＮ末端側のアミノ基や、リシン，アルギニンといった塩基性アミノ酸の側鎖のアミノ基や、ＤＮＡの５'末端をアミノ基で修飾したアミノ修飾ＤＮＡ断片のアミノ基などとウレタン結合を形成する。
このように、本発明の共重合体（Ａ）は、チオール基および活性エステル基を分子内に備えているため、金含有基材の表面に適用した場合には、金含有基材の表面にタンパク質などの生体分子を固定化することが可能となる。
The copolymer (A) has an active ester group in the molecule. The active ester group of the copolymer (A) reacts with an amino group of a biomolecule such as protein or DNA to form a urethane bond. Specifically, the amino group on the N-terminal side of proteins, the amino group on the side chain of basic amino acids such as lysine and arginine, the amino group of amino-modified DNA fragments in which the 5 'end of DNA is modified with an amino group, and urethane Form a bond.
Thus, since the copolymer (A) of the present invention has a thiol group and an active ester group in the molecule, when applied to the surface of the gold-containing base material, It becomes possible to immobilize biomolecules such as proteins.
更に、本発明の共重合体（Ａ）はホスホリルコリン類似基を分子内に有している。このホスホリルコリン類似基は、生体膜の構成成分の１つであるリン脂質極性基（ホスホリルコリン基）と類似した構造をしているため、優れた生体適合性を示し、生体成分との相互作用が極めて小さい。
すなわち、このようなホスホリルコリン類似基を側鎖に有する重合体で表面処理された金表面は、生体膜表面と同様に表面にホスホリルコリン類似基が配向している。このためタンパク質やＤＮＡなどの生体分子との相互作用が極めて弱く、これらの有機物が金表面に吸着することを抑制すると考えられる。
Furthermore, the copolymer (A) of the present invention has a phosphorylcholine-like group in the molecule. This phosphorylcholine-like group has a structure similar to that of a phospholipid polar group (phosphorylcholine group), which is one of the constituent components of biological membranes, and thus exhibits excellent biocompatibility and extremely interacts with biological components. small.
That is, the gold surface treated with a polymer having such a phosphorylcholine-like group in the side chain has the phosphorylcholine-like group oriented on the surface in the same manner as the biological membrane surface. For this reason, the interaction with biomolecules such as protein and DNA is extremely weak, and it is considered that these organic substances are prevented from adsorbing on the gold surface.
また、ホスホリルコリン類似基は、リン酸基のマイナス電荷とコリン類似基のプラス電荷が分子内で打ち消しあうため、電気的に中性な官能基として挙動する。従って、生体内の特定のイオンなどと相互作用を起こしにくく、これらのイオンが静電的に結合することが防止されると考えられる。 The phosphorylcholine-like group behaves as an electrically neutral functional group because the negative charge of the phosphate group and the positive charge of the choline-like group cancel each other in the molecule. Therefore, it is considered that it is difficult to interact with specific ions in the living body and these ions are prevented from binding electrostatically.
このように、本発明の共重合体（Ａ）は、分子内にホスホリルコリン類似基を有しているため、タンパク質やＤＮＡなどの生体成分との相互作用が弱い。従って、金含有基材の表面に適用した場合には、金含有基材の表面にタンパク質などの生体分子を固定化するとともに、金含有基材の表面に生体成分が吸着することを防止することが可能となる。 Thus, since the copolymer (A) of the present invention has a phosphorylcholine-like group in the molecule, the interaction with biological components such as proteins and DNA is weak. Therefore, when applied to the surface of a gold-containing substrate, immobilize biomolecules such as proteins on the surface of the gold-containing substrate and prevent biological components from adsorbing on the surface of the gold-containing substrate. Is possible.
上記共重合体（Ａ）は、分子内にホスホリルコリン類似基を有するホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）と、分子内に活性エステル基を有する活性エステル基含有単量体（ａ２）と、分子内にチオール基を有するチオール基含有単量体（ａ３）と、を構成単位とする共重合体であることが好ましい。 The copolymer (A) comprises a phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1) having a phosphorylcholine-like group in the molecule, an active ester group-containing monomer (a2) having an active ester group in the molecule, A copolymer having a thiol group-containing monomer (a3) having a thiol group therein as a constituent unit is preferable.
上記共重合体（Ａ）の構成単位の一つであるホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）としては、細胞膜の構成成分であるリン脂質が有するホスホリルコリン基と類似した性質を有するホスホリルコリン類似基を側鎖として備え、且つ、分子内に重合性の（メタ）アクリロイル基を有する単量体が挙げられる。 As the phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1), which is one of the constituent units of the copolymer (A), a phosphorylcholine-like group having properties similar to the phosphorylcholine group of the phospholipid that is a constituent of the cell membrane is used. A monomer provided as a side chain and having a polymerizable (meth) acryloyl group in the molecule is exemplified.
具体的には、下記一般式（５）で示される化合物が好適に使用される。
このような化合物としては、例えば、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、５−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２−（トリプロピルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２−（トリブチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシブチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシヘキシル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート等が挙げられる。ここで、「（メタ）アクリロイル」とは、メタクリルおよび／またはアクリルを意味する、以下同じ意味で使用する。
なお、上記化合物は、使用に際して単独若しくは混合物として用いることができる。
このうち、入手が特に容易などの理由から、２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート｛＝２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンともいう（以下、ＭＰＣ）｝が好適である。
Examples of such compounds include 2- (meth) acryloyloxyethyl-2- (trimethylammonio) ethyl phosphate, 3- (meth) acryloyloxypropyl-2- (triethylammonio) ethyl phosphate, 4- ( (Meth) acryloyloxybutyl-2- (triethylammonio) ethyl phosphate, 5- (meth) acryloyloxypentyl-2- (triethylammonio) ethyl phosphate, 6- (meth) acryloyloxyhexyl-2- (triethylammonio) ) Ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxyethyl-2- (triethylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxyethyl-2- (tripropylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyl Oxyethyl-2- (tributylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxypropyl-2- (trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxybutyl-2- (trimethylammonio) ethyl phosphate, Examples include 2- (meth) acryloyloxypentyl-2- (trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxyhexyl-2- (trimethylammonio) ethyl phosphate, and the like. Here, “(meth) acryloyl” means methacryl and / or acryl, and is used in the same meaning hereinafter.
In addition, the said compound can be used individually or as a mixture in use.
Among these, 2- (methacryloyloxy) ethyl-2- (trimethylammonio) ethyl phosphate {= 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (hereinafter referred to as MPC)} is preferable because it is particularly easy to obtain.
また、上記共重合体（Ａ）は、活性エステル基含有単量体（ａ２）を構成単位として更に備えている。活性エステル基含有単量体（ａ２）としては、タンパク質やＤＮＡなどのアミノ基とウレタン結合を形成する活性エステル基を有し、且つ、分子内に重合性の（メタ）アクリロイル基を有する単量体が挙げられる。 The copolymer (A) further includes an active ester group-containing monomer (a2) as a structural unit. As the active ester group-containing monomer (a2), a monomer having an active ester group that forms a urethane bond with an amino group such as protein or DNA, and having a polymerizable (meth) acryloyl group in the molecule The body is mentioned.
具体的には、下記一般式（６）で示される化合物が好適に使用される。
このような化合物としては、例えば、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−ｐ−ニトロ安息香酸エステル、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−ｐ−ニトロ安息香酸エステル、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル−ｐ−ニトロ安息香酸エステル、５−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−ｐ−ニトロ安息香酸エステル、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシル−ｐ−ニトロ安息香酸エステル、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、５−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等が挙げられる。
なお、上記化合物は、使用に際して単独若しくは混合物として用いることができる。
このうち、入手が特に容易などの理由から、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−ｐ−ニトロ安息香酸エステル（以下、ＭＮＢ）が好適である。
Examples of such compounds include 2- (meth) acryloyloxyethyl-p-nitrobenzoate, 3- (meth) acryloyloxypropyl-p-nitrobenzoate, 4- (meth) acryloyloxybutyl- p-nitrobenzoic acid ester, 5- (meth) acryloyloxypentyl-p-nitrobenzoic acid ester, 6- (meth) acryloyloxyhexyl-p-nitrobenzoic acid ester, 2- (meth) acryloyloxyethyl-N- Hydroxysuccinimide ester, 3- (meth) acryloyloxypropyl-N-hydroxysuccinimide ester, 4- (meth) acryloyloxybutyl-N-hydroxysuccinimide ester, 5- (meth) acryloyloxypentyl-N-hydroxysuccinimide Ester, 6- (meth) acryloyloxyhexyl -N- hydroxysuccinimide ester.
In addition, the said compound can be used individually or as a mixture in use.
Among these, 2- (meth) acryloyloxyethyl-p-nitrobenzoate (hereinafter referred to as MNB) is preferable because it is particularly easy to obtain.
更に、上記共重合体（Ａ）は、チオール基含有単量体（ａ３）を構成単位として更に備えている。チオール基含有単量体（ａ３）としては、金の表面に吸着する性質を有するチオール基を有し、且つ、分子内に重合性の（メタ）アクリロイル基を有する単量体が挙げられる。 Furthermore, the copolymer (A) further includes a thiol group-containing monomer (a3) as a structural unit. Examples of the thiol group-containing monomer (a3) include a monomer having a thiol group having a property of adsorbing to the gold surface and a polymerizable (meth) acryloyl group in the molecule.
具体的には、下記一般式（７）で示される化合物が好適に使用される。
このような化合物としては、例えば、２−[（２−メルカプトエチル）カルボニルオキシ]エチル（メタ）アクリレート、２−[（３−メルカプトプロピル）アミノカルボニルオキシ]エチル（メタ）アクリレート、２−[（４−メルカプトブチル）カルボニルオキシエチル]（メタ）アクリレート、３−[（２−メルカプトエチル）カルボニルオキシ]プロピル（メタ）アクリレート、３−[（３−メルカプトプロピル）カルボニルオキシ]プロピル（メタ）アクリレート、３−[（４−メルカプトブチル）カルボニルオキシ]プロピル（メタ）アクリレート、４−[（２−メルカプトエチル）カルボニルオキシ]ブチル（メタ）アクリレート、４−[（３−メルカプトプロピル）カルボニルオキシ]ブチル（メタ）アクリレート、４−[（２−メルカプトブチル）カルボニルオキシ]ブチル（メタ）アクリレート、５−[（２−メルカプトエチル）カルボニルオキシ]ペンチル（メタ）アクリレート、５−[（３−メルカプトプロピル）カルボニルオキシ]ペンチル（メタ）アクリレート、５−[（４−メルカプトブチル）カルボニルオキシ]ペンチル（メタ）アクリレート、６−[（２−メルカプトエチル）カルボニルオキシ]ヘキシル（メタ）アクリレート、６−[（２−メルカプトプロピル）カルボニルオキシ]ヘキシル（メタ）アクリレート、６−[（３−メルカプトブチル）カルボニルオキシ]ヘキシル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
なお、上記化合物は、使用に際して単独若しくは混合物として用いることができる。
このうち、入手が特に容易などの理由から、２−[（２−メルカプトエチル）カルボニルオキシ]エチル（メタ）アクリレート（２−ＭＥＥ）が好適である。
Examples of such a compound include 2-[(2-mercaptoethyl) carbonyloxy] ethyl (meth) acrylate, 2-[(3-mercaptopropyl) aminocarbonyloxy] ethyl (meth) acrylate, 2-[( 4-mercaptobutyl) carbonyloxyethyl] (meth) acrylate, 3-[(2-mercaptoethyl) carbonyloxy] propyl (meth) acrylate, 3-[(3-mercaptopropyl) carbonyloxy] propyl (meth) acrylate, 3-[(4-mercaptobutyl) carbonyloxy] propyl (meth) acrylate, 4-[(2-mercaptoethyl) carbonyloxy] butyl (meth) acrylate, 4-[(3-mercaptopropyl) carbonyloxy] butyl ( Meth) acrylate, 4-[(2-mercaptobutyl) Carbonyloxy] butyl (meth) acrylate, 5-[(2-mercaptoethyl) carbonyloxy] pentyl (meth) acrylate, 5-[(3-mercaptopropyl) carbonyloxy] pentyl (meth) acrylate, 5-[(4 -Mercaptobutyl) carbonyloxy] pentyl (meth) acrylate, 6-[(2-mercaptoethyl) carbonyloxy] hexyl (meth) acrylate, 6-[(2-mercaptopropyl) carbonyloxy] hexyl (meth) acrylate, 6 -[(3-mercaptobutyl) carbonyloxy] hexyl (meth) acrylate and the like.
In addition, the said compound can be used individually or as a mixture in use.
Among these, 2-[(2-mercaptoethyl) carbonyloxy] ethyl (meth) acrylate (2-MEE) is preferable because it is particularly easy to obtain.
一般式（１）乃至一般式（３）で示される各単量体（ａ１）乃至（ａ３）は、いずれも（メタ）アクリロイル基を分子内に有している。このため、他の（メタ）アクリロイル基との重合体の形成が容易であり、重合開始剤の濃度や反応時間といった条件を調整することで、所望の重量分子量を有する重合体を比較的容易に合成することができる。 Each of the monomers (a1) to (a3) represented by the general formula (1) to the general formula (3) has a (meth) acryloyl group in the molecule. Therefore, it is easy to form a polymer with other (meth) acryloyl groups, and a polymer having a desired weight molecular weight can be relatively easily adjusted by adjusting conditions such as the concentration of the polymerization initiator and the reaction time. Can be synthesized.
共重合体（Ａ）としては、原料の入手容易性などの理由により、特に、ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）としてＭＰＣ、活性エステル基含有単量体（ａ２）としてＭＮＢ、チオール基含有単量体（ａ３）として２−ＭＥＥの組み合わせにより合成される共重合体が好ましい。具体的には、下記一般式（２）
本発明の共重合体（Ａ）は、上記一般式（１）や一般式（２）に示される構造単位を分子内に有する共重合体であればよく、従って三元共重合体に限定されない。すなわち、上記単量体（ａ１）乃至単量体（ａ３）の他に、他の単量体を構成単位として備える四元以上の共重合体であってもよい。他の単量体としては、上記単量体（ａ１）乃至単量体（ａ３）と同様に、（メタ）アクリロイル基を有する単量体であることが好ましい。
例えば、他の単量体として疎水性側鎖を有する単量体を選択した場合、金含有基材の表面に形成される表面層は分子内や分子間で疎水性側鎖どうしが疎水性相互作用により密に凝集したものとなる。従って、金含有基材の表面への生体分子の接触頻度が更に低下するため、非特異的吸着をより効率的に防止することが可能となる。
The copolymer (A) of the present invention may be a copolymer having a structural unit represented by the general formula (1) or (2) in the molecule, and is not limited to a terpolymer. . That is, in addition to the monomer (a1) to the monomer (a3), a quaternary or more copolymer having another monomer as a structural unit may be used. The other monomer is preferably a monomer having a (meth) acryloyl group as in the case of the monomer (a1) to the monomer (a3).
For example, when a monomer having a hydrophobic side chain is selected as the other monomer, the surface layer formed on the surface of the gold-containing substrate has a hydrophobic mutual chain within the molecule or between the molecules. It becomes densely aggregated by the action. Therefore, since the contact frequency of the biomolecule to the surface of the gold-containing substrate is further reduced, nonspecific adsorption can be more efficiently prevented.
本発明の共重合体（Ａ）において、共重合体の全構成単位中のホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）の含有割合は、モル分率（すなわち、ｌ／ｌ＋ｍ＋ｎ）で０．７０〜０．８７であればよく、特に０．７２〜０．８５の範囲が好ましい。ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）のモル分率が０．７０以下では、共重合体の溶解性の点より好ましくない。
一方、ホスホリルコリン類似基含有単量体のモル分率が０．８７以上では、ホスホリルコリン基が密であり、生体分子を結合して固定化する際に生体分子の接触を妨げるため好ましくない。
In the copolymer (A) of the present invention, the content ratio of the phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1) in all the structural units of the copolymer is 0.70 in terms of mole fraction (ie, 1 / l + m + n). It may be 0.87, and the range of 0.72 to 0.85 is particularly preferable. When the molar fraction of the phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1) is 0.70 or less, it is not preferable from the viewpoint of the solubility of the copolymer.
On the other hand, when the molar fraction of the phosphorylcholine-like group-containing monomer is 0.87 or more, the phosphorylcholine group is dense, which is not preferable because it prevents contact of the biomolecule when binding and immobilizing the biomolecule.
また、共重合体（Ａ）の全構成単位中の活性エステル基含有単量体（ａ２）の含有割合は、モル分率（すなわち、ｍ／ｌ＋ｍ＋ｎ）で０．０３〜０．２０であればよく、特に０．０５〜０．１８の範囲が好適である。活性エステル基含有単量体（ａ２）のモル分率が０．０３以下では、金基材の表面に固定化される生体分子の量が少なくなるため、センサチップのセンシング能力が低くなり好ましくない。
一方、活性エステル基含有単量体（ａ２）のモル分率が０．２０以上では、全体的な疎水性が高まるため、生体分子が共重合体（Ａ）に効率的に結合しにくくなり、生体分子の固定化量が多くなりにくいという理由により好ましくない。また、活性エステル基間の自然な架橋反応進行により共重合体が不溶となりやすいため好ましくない。
Moreover, if the content rate of the active ester group containing monomer (a2) in all the structural units of the copolymer (A) is 0.03 to 0.20 in terms of molar fraction (ie, m / l + m + n). In particular, the range of 0.05 to 0.18 is suitable. When the molar fraction of the active ester group-containing monomer (a2) is 0.03 or less, the amount of biomolecule immobilized on the surface of the gold substrate is decreased, which is not preferable because the sensing ability of the sensor chip is lowered.
On the other hand, when the molar fraction of the active ester group-containing monomer (a2) is 0.20 or more, the overall hydrophobicity is increased, so that the biomolecule is difficult to efficiently bind to the copolymer (A). This is not preferable because the amount of biomolecule immobilized is difficult to increase. In addition, the copolymer tends to become insoluble due to the natural cross-linking reaction between the active ester groups, which is not preferable.
更に、共重合体（Ａ）の全構成単位中のチオール基含有単量体（ａ３）の含有割合は、モル分率（すなわち、ｎ／ｌ＋ｍ＋ｎ）で０．１０〜０．２７であればよく、特に０．１２〜０．２５の範囲が好適である。チオール基含有単量体（ａ３）のモル分率が０．１０以下では、金基材の表面に固定化される共重合体（Ａ）の量が少なくなるため、固定化される生体分子が金基材から脱落しやすくなり好ましくない。
一方、チオール基含有単量体（ａ３）のモル分率が０．２７以上では、チオール基間の酸化架橋反応が進行するため、共重合体が不要になりやすく好ましくない。
Furthermore, the content ratio of the thiol group-containing monomer (a3) in all the structural units of the copolymer (A) may be 0.10 to 0.27 in terms of molar fraction (ie, n / l + m + n). In particular, the range of 0.12 to 0.25 is suitable. When the molar fraction of the thiol group-containing monomer (a3) is 0.10 or less, the amount of the copolymer (A) immobilized on the surface of the gold substrate decreases, so that the biomolecule to be immobilized is removed from the gold substrate. It is not preferable because it tends to fall off.
On the other hand, when the molar fraction of the thiol group-containing monomer (a3) is 0.27 or more, an oxidative crosslinking reaction between thiol groups proceeds, so that a copolymer is not necessary and is not preferable.
また、共重合体（Ａ）の重量平均分子量は、特に限定されないが、好ましくは、ゲルパーミエーションクロマトグラフにより標準ポリエチレングリコールを用いて換算した重量平均分子量が１０，０００〜１，０００，０００であればよい。より好ましくは１００，０００〜８００，０００である。重合体の重量平均分子量が１０，０００より少ないと、極性溶媒への溶解度が大きくなり、金基材の表面に吸着した共重合体（Ａ）が脱離しやすくなるため好ましくない。一方、重量平均分子量が１，０００，０００より多いと、極性溶媒への溶解性が低下しすぎることがあるため好ましくない。 Further, the weight average molecular weight of the copolymer (A) is not particularly limited, but preferably, the weight average molecular weight converted using standard polyethylene glycol by gel permeation chromatography is 10,000 to 1,000,000. I just need it. More preferably, it is 100,000-800,000. When the weight average molecular weight of the polymer is less than 10,000, the solubility in a polar solvent is increased, and the copolymer (A) adsorbed on the surface of the gold substrate is easily detached, which is not preferable. On the other hand, if the weight average molecular weight is more than 1,000,000, the solubility in a polar solvent may be too low, which is not preferable.
本発明の共重合体（Ａ）の種類としては、ランダム共重合体，ブロック共重合体，グラフト共重合体など、公知の重合体のいずれであってもよい。各単量体の重合は、溶液重合，乳化重合，懸濁重合等の公知の方法を用いて行われる。この際、必要に応じて重合系を、窒素，アルゴン等の不活性ガスで置換して、あるいはこの不活性ガスの雰囲気下において重合を行われるとよい。 The type of the copolymer (A) of the present invention may be any of known polymers such as a random copolymer, a block copolymer, and a graft copolymer. The polymerization of each monomer is performed using a known method such as solution polymerization, emulsion polymerization, suspension polymerization or the like. At this time, the polymerization may be carried out by replacing the polymerization system with an inert gas such as nitrogen or argon as necessary, or under an atmosphere of this inert gas.
重合に際しては、公知のラジカル重合開始剤を用いることができる。ラジカル重合開始剤としては、例えば、２，２−アゾビス（２−アミジノプロピル）二塩酸塩、４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２−アゾビス（２−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）二塩酸塩、２，２−アゾビスイソブチルアミド二水和物、２，２−アゾビスイソブチロニトリル、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ラウロイル、アゾビスイソブチロニトリル、２，２ −アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート等が挙げられる。特に、４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）あるいは２，２−アゾビスイソブチロニトリルが好適である。 In the polymerization, a known radical polymerization initiator can be used. Examples of the radical polymerization initiator include 2,2-azobis (2-amidinopropyl) dihydrochloride, 4,4-azobis (4-cyanovaleric acid), 2,2-azobis (2- (5-methyl- 2-Imidazolin-2-yl) propane) dihydrochloride, 2,2-azobisisobutyramide dihydrate, 2,2-azobisisobutyronitrile, ammonium persulfate, potassium persulfate, benzoyl peroxide, diisopropyl Peroxydicarbonate, t-butylperoxy-2-ethylhexanoate, t-butylperoxypivalate, t-butylperoxydiisobutyrate, lauroyl peroxide, azobisisobutyronitrile, 2,2-azobis (2, 4-dimethylvaleronitrile), t-butylperoxyneodecanoate and the like. In particular, 4,4-azobis (4-cyanovaleric acid) or 2,2-azobisisobutyronitrile is preferable.
これらのラジカル重合開始剤は単独で用いても混合物で用いてもよい。また、重合開始剤には各種レドックス系の促進剤を用いても良い。重合開始剤の使用量は、単量体組成物１００重量部に対して０．０５〜３．０重量部が好ましい。反応温度は４０〜８０℃が好ましく、特に５０〜７０℃が好適である。
ラジカル重合開始剤の種類や濃度、反応時間や反応温度などを適便選択することにより、所望の重量平均分子量を有する共重合体（Ａ）を得ることが可能となる。
また、重合体の精製は、再沈殿法，透析法，精密濾過法，限外濾過法など一般的な精製方法により行うことができる。
These radical polymerization initiators may be used alone or in a mixture. Various redox accelerators may be used as the polymerization initiator. The amount of the polymerization initiator used is preferably 0.05 to 3.0 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the monomer composition. The reaction temperature is preferably from 40 to 80 ° C, particularly preferably from 50 to 70 ° C.
By appropriately selecting the type and concentration of the radical polymerization initiator, the reaction time, the reaction temperature, and the like, it becomes possible to obtain the copolymer (A) having a desired weight average molecular weight.
The polymer can be purified by a general purification method such as a reprecipitation method, a dialysis method, a microfiltration method, or an ultrafiltration method.
本発明の共重合体（Ａ）を製造する方法としては、単量体（ａ１）乃至単量体（ａ３）の３種類の単量体を混合して重合反応を行わせる方法がある。具体的には、まず単量体（ａ１）乃至単量体（ａ３）をそれぞれ適当量秤量して溶媒に溶解させ、所定の重合開始剤の存在下で適当な温度，気圧条件の下で所定時間反応させることにより、本発明の共重合体（Ａ）を合成することが可能である。 As a method for producing the copolymer (A) of the present invention, there is a method in which three kinds of monomers (a1) to (a3) are mixed to carry out a polymerization reaction. Specifically, first, each of monomers (a1) to (a3) is weighed in an appropriate amount and dissolved in a solvent, and in the presence of a predetermined polymerization initiator, a predetermined temperature and pressure are determined. It is possible to synthesize the copolymer (A) of the present invention by reacting for a period of time.
しかしながら、このような方法では、共重合体合成のために異なる３種類の単量体を用意する必要があり、原料のコストが高くなる。
そこで、本発明では、まずホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）と活性エステル基含有単量体（ａ２）からなる共重合体（以下、合成中間体という）を合成して、その後で、分子内にチオール基及びアミノ基を有する炭素数１〜４の化合物（以下、システアミン類という）を溶液に混合して、活性エステル基と反応させる。そして、この反応により、活性エステルのうちの一部をチオール基含有側鎖に変換する。
However, in such a method, it is necessary to prepare three different types of monomers for copolymer synthesis, which increases the cost of raw materials.
Therefore, in the present invention, a copolymer (hereinafter referred to as a synthetic intermediate) composed of a phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1) and an active ester group-containing monomer (a2) is synthesized first, A compound having 1 to 4 carbon atoms having a thiol group and an amino group therein (hereinafter referred to as cysteamines) is mixed in a solution and reacted with an active ester group. And by this reaction, a part of active ester is converted into a thiol group containing side chain.
具体的には、まずホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）と活性エステル基含有単量体（ａ２）を、上述した重合開始剤から選択される適当な重合開始剤の存在下、適当な温度条件で反応させて２種類に単量体から構成される合成中間体（下記反応式（Ｉ）の一般式（３）で示される共重合体）を合成する。 Specifically, the phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1) and the active ester group-containing monomer (a2) are first subjected to a suitable temperature in the presence of a suitable polymerization initiator selected from the polymerization initiators described above. A synthetic intermediate (a copolymer represented by the general formula (3) in the following reaction formula (I)) is synthesized by reacting under conditions.
続いて、反応溶液中にシステアミン類（下記反応式（Ｉ）の一般式（４）で示される化合物）を適当量加えて、下記反応式（Ｉ）に示す反応工程を行う。この反応により、合成中間体を構成する活性エステル基含有ユニットの一部とシステアミン類のアミノ基が反応して、両者の間で安定な共有結合が形成される。その結果、ホスホリルコリン類似基，活性エステル基およびチオール基の３種類の官能基を分子内に含む共重合体（Ａ）（下記反応式（Ｉ）の一般式（１）で示される化合物）が生成するとともに、アルコール（下記反応式（Ｉ）の一般式（８）で示される化合物）が生成する。
このような２段階の合成反応を採用することで、ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）および活性エステル基含有単量体（ａ２）という２種類の原料を単量体として、目的とする本発明の共重合体（Ａ）を合成することが可能となる。従って、共重合体（Ａ）を合成する際に要する原料のコストを低く抑えることができる。
また、合成中間体にシステアミン類を混合して反応させるという比較的簡単な反応により、合成中間体を目的とする共重合体（Ａ）に変換することができるため、共重合体（Ａ）の合成に要する手間が少なくすむ。
By adopting such a two-step synthesis reaction, two kinds of raw materials, a phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1) and an active ester group-containing monomer (a2), are used as monomers. It becomes possible to synthesize the copolymer (A) of the invention. Therefore, the cost of the raw material required when synthesizing the copolymer (A) can be kept low.
Further, since the synthetic intermediate can be converted into the target copolymer (A) by a relatively simple reaction of mixing and reacting the synthetic intermediate with cysteamines, the copolymer (A) Less time is required for synthesis.
なお、上記システアミン類としては、アミノメタンチオール、２−アミノエタンチオール、３−アミノプロパンチオール、４−アミノブタンチオール等が挙げられる。このうち、入手容易性などの理由により、２−アミノエタンチオール（Ｈ２ＮＣ２Ｈ４ＳＨ、システアミンともいう）が好ましい。 Examples of the cysteamines include aminomethanethiol, 2-aminoethanethiol, 3-aminopropanethiol, 4-aminobutanethiol and the like. Of these, 2-aminoethanethiol (H 2 NC 2 H 4 SH, also referred to as cysteamine) is preferable for reasons such as availability.
上記共重合体（Ａ）を溶解する溶媒としては、水、各種緩衝溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルオキシド、アセトニトリル、ジオキサン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、シクロヘキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドンなどが挙げられる。また、２種類以上の溶媒を混合した混合溶媒を使用することも可能である。混合溶媒としては、上記溶媒のうち有機溶剤と水との混合物等が挙げられる。
このうち特に、溶解性の観点から、メタノール、エタノール、イソプロパノールといったアルコール類が好ましい。
Solvents for dissolving the copolymer (A) include water, various buffer solutions, methanol, ethanol, isopropanol, N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, dioxane, methyl ethyl ketone, ethyl acetate, tetrahydrofuran, cyclohexane, N, N-dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone and the like can be mentioned. It is also possible to use a mixed solvent in which two or more kinds of solvents are mixed. Examples of the mixed solvent include a mixture of an organic solvent and water among the above solvents.
Of these, alcohols such as methanol, ethanol and isopropanol are particularly preferred from the viewpoint of solubility.
共重合体（Ａ）は、前述したように金含有基材の表面に金‐チオール結合により吸着している。金含有基材としては金を含有する基材であればよく、純金や金合金などが挙げられる。金合金は、コバルト，ニッケル，鉄などの金属と金との合金である。金含有基材の形態としては、表面に共重合体（Ａ）を吸着できればどのような形態でもよく、例えば金メッキや金箔などが挙げられる。 As described above, the copolymer (A) is adsorbed on the surface of the gold-containing substrate by a gold-thiol bond. The gold-containing base material may be a base material containing gold, and examples thereof include pure gold and a gold alloy. The gold alloy is an alloy of a metal such as cobalt, nickel, and iron with gold. The form of the gold-containing substrate may be any form as long as the copolymer (A) can be adsorbed on the surface, and examples thereof include gold plating and gold foil.
本発明の共重合体（Ａ）を金含有基材へ吸着させる際に、事前に金含有基材の表面を研磨したり、洗浄したりするなどして有機物等を取り除いておくことが好ましい。
金含有基材の表面を研磨する方法としては、目の細かいサンドペーパーで研磨したり、アルミナ粉末やダイヤモンドペーストなどを不織布などに含ませて金含有基材の表面を擦ったりする方法により行われる。
When the copolymer (A) of the present invention is adsorbed to the gold-containing substrate, it is preferable to remove organic substances or the like by polishing or washing the surface of the gold-containing substrate in advance.
The method for polishing the surface of the gold-containing substrate is performed by polishing with a fine sandpaper, or by rubbing the surface of the gold-containing substrate by adding alumina powder or diamond paste to a nonwoven fabric or the like. .
金含有基材の表面を洗浄する方法としては、例えばＰｉｒａｎｈａ溶液（３０％硫酸と過酸化水素水を約３対１で混合した溶液）に５〜３０分間浸漬することで行うことが好ましい。更に、金含有基材を浸漬した溶液に超音波を印加しつつ洗浄を行うと、金含有基材の表面をより清浄に洗浄することが可能となる。洗浄後は、脱イオン水や純粋などで洗浄溶液を洗い流す。 As a method for cleaning the surface of the gold-containing substrate, for example, it is preferably performed by immersing in a Piranha solution (a solution in which 30% sulfuric acid and hydrogen peroxide solution are mixed in about 3 to 1) for 5 to 30 minutes. Furthermore, when cleaning is performed while applying ultrasonic waves to the solution in which the gold-containing base material is immersed, the surface of the gold-containing base material can be cleaned more cleanly. After washing, wash away the washing solution with deionized water or pure water.
本発明の共重合体（Ａ）の金含有基材への吸着は、共重合体（Ａ）を溶解した溶液を金含有基材の表面に塗布したり、金含有基材を溶液に浸漬したりするなどの方法により行われる。金含有基材の表面に接触した共重合体（Ａ）は、金とチオール基との間で形成される非共有結合性の金‐チオール結合により金の表面に自発的に吸着して、自己組織化した表面層を形成する。なお、金含有基材への共重合体（Ａ）の接触時間は、約５〜３０分程度で十分であるが、例えば２〜５時間行うことで、配向性の高い表面層を形成することが可能となる。このようは配向性の高い表面層では、活性エステル基が金含有基材の表面から外方に向かって整列しているため、生体分子とウレタン結合を起こしやすく、生体分子の固定化が容易である。 The adsorption of the copolymer (A) of the present invention to the gold-containing substrate is performed by applying a solution in which the copolymer (A) is dissolved to the surface of the gold-containing substrate or immersing the gold-containing substrate in the solution. It is done by such a method. The copolymer (A) in contact with the surface of the gold-containing substrate spontaneously adsorbs on the gold surface by the non-covalent gold-thiol bond formed between the gold and the thiol group, Form an organized surface layer. The contact time of the copolymer (A) to the gold-containing substrate is sufficient for about 5 to 30 minutes, but for example, a surface layer with high orientation is formed by performing for 2 to 5 hours. Is possible. In such a highly oriented surface layer, the active ester groups are aligned outward from the surface of the gold-containing substrate, so that urethane bonds with biomolecules are likely to occur, and biomolecules can be easily immobilized. is there.
金含有基材へ共重合体（Ａ）を吸着させた後、水などの溶媒で金含有基材の表面を洗浄して遊離の共重合体（Ａ）を除去する。洗浄後は水などの溶媒中に浸漬した状態で保存することが可能である。また、必要に応じて金含有基材表面を乾燥させて保存することもできる。この場合、大気中で自然乾燥させたり、窒素ガスなどの不活性ガス雰囲気で乾燥させたりすることで行われる。 After the copolymer (A) is adsorbed on the gold-containing substrate, the surface of the gold-containing substrate is washed with a solvent such as water to remove the free copolymer (A). After washing, it can be stored in a state immersed in a solvent such as water. Moreover, the gold-containing substrate surface can be dried and stored as necessary. In this case, it is carried out by natural drying in the air or by drying in an inert gas atmosphere such as nitrogen gas.
金含有基材へ共重合体（Ａ）を吸着させた後、所望の生体分子を固定化する工程が行われる。生体分子の種類は、後述するように検出・測定する対象となる目的物質に応じて選択する。例えば、グルコースを検出・測定するグルコースセンサの場合は、グルコースオキシダーゼである。その他、抗体やＤＮＡなどの所望の生体分子を、目的に応じて適宜選択して固定化することが可能である。 After the copolymer (A) is adsorbed on the gold-containing substrate, a step of immobilizing a desired biomolecule is performed. The type of biomolecule is selected according to the target substance to be detected and measured as described later. For example, in the case of a glucose sensor that detects and measures glucose, it is glucose oxidase. In addition, desired biomolecules such as antibodies and DNA can be appropriately selected and immobilized according to the purpose.
金含有基材への生体分子の固定化は、水やリン酸緩衝液などの溶液中で、共重合体（Ａ）を吸着させた金含有基材と生体分子を接触させることで行われる。反応温度としては、４〜４０℃が好ましく、特に４℃が好適である。この反応温度は、結合させる生体分子の特性に応じて適宜選択されるが、一般に、４℃以下では共重合体（Ａ）の活性化エステル基と生体分子のアミノ基との反応が起こりにくく、４０℃以上では、活性化エステル基の安定性から好ましくない。活性化エステルの安定性と反応性の観点から、反応温度は４℃程度が好ましい。 The biomolecule is immobilized on the gold-containing base material by bringing the gold-containing base material on which the copolymer (A) is adsorbed into contact with the biomolecule in a solution such as water or a phosphate buffer. As reaction temperature, 4-40 degreeC is preferable and 4 degreeC is especially suitable. This reaction temperature is appropriately selected according to the characteristics of the biomolecule to be bound, but generally, the reaction between the activated ester group of the copolymer (A) and the amino group of the biomolecule hardly occurs at 4 ° C. or less, A temperature of 40 ° C. or higher is not preferable due to the stability of the activated ester group. From the viewpoint of stability and reactivity of the activated ester, the reaction temperature is preferably about 4 ° C.
また、ｐＨの条件としては、ｐＨ７．０〜８．５が好ましく、特にｐＨ７．６〜７．８が好適である。ｐＨが７．０以下では活性化エステル基と生体分子のアミノ基との反応が進行しにくく、ｐＨが８．５以上では、活性化エステル基が自然に加水分解するため好ましくない。 The pH condition is preferably pH 7.0 to 8.5, particularly preferably pH 7.6 to 7.8. When the pH is 7.0 or less, the reaction between the activated ester group and the amino group of the biomolecule hardly proceeds, and when the pH is 8.5 or more, the activated ester group is naturally hydrolyzed, which is not preferable.
（センサチップ）
次に、本発明の共重合体（Ａ）をセンサチップに適用した場合について、図を参照しながら説明する。図１は本発明の共重合体が適用されたセンサチップの上面斜視図、図２は本発明の共重合体が適用されたセンサチップの横断面を示した模式図である。図１に示すように、本発明のセンサチップ１は、シラノール基含有基材としてのガラス基板３と、金含有基材としての金電極５を主要な構成要素としている。
なお、本実施形態では、ガラス基板３と金電極５を有するセンサチップの例について記載しているが、本発明のセンサチップは電極としての用途に限定されない。例えば、後述する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法におけるセンサチップのように電極以外の用途であってもよく、シラノール基含有基材および金含有基材の両方を備えたセンサチップであればどのようなセンサチップであってもよい。
(Sensor chip)
Next, the case where the copolymer (A) of the present invention is applied to a sensor chip will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a top perspective view of a sensor chip to which the copolymer of the present invention is applied, and FIG. 2 is a schematic view showing a cross section of the sensor chip to which the copolymer of the present invention is applied. As shown in FIG. 1, the
In this embodiment, an example of a sensor chip having the
センサチップ１の形状は、バイオセンサの分野において一般的に使用される公知の形状である。すなわち、図１に示すように、ガラス基板３は矩形状をした平板部材であり、その表面中央部には方形形状をした金電極５が配設されている。本実施形態において、金電極５はセンサチップの作用電極として機能している。金電極５の厚さは約５０ｎｍで、ガラス基板３の背面に設けられた図示しないリードと接続されており、電極表面に存在する生体分子やメディエータの酸化還元反応によって生じる電流を図示しない測定装置に導出することが可能となっている。
また、図２に示すように、金電極５の表面には共重合体（Ａ）が吸着している。
The shape of the
In addition, as shown in FIG. 2, the copolymer (A) is adsorbed on the surface of the
本発明の共重合体（Ａ）は、上記一般式（３）で示されるチオール基含有単量体（ａ３）由来のチオール基を分子内に有している。上述したように、チオール基は金含有基材と金‐チオール結合により吸着する性質を有する。従って、共重合体（Ａ）は金含有基材の表面に吸着する性質を有している。以下に、共重合体（Ａ）と金含有基材との吸着反応を、図を示して説明する。 The copolymer (A) of the present invention has a thiol group derived from the thiol group-containing monomer (a3) represented by the general formula (3) in the molecule. As described above, the thiol group has a property of being adsorbed by a gold-containing substrate and a gold-thiol bond. Therefore, the copolymer (A) has a property of adsorbing on the surface of the gold-containing substrate. Hereinafter, the adsorption reaction between the copolymer (A) and the gold-containing substrate will be described with reference to the drawings.
図３は金含有基材の表面での金原子と共重合体（Ａ）のチオール基との吸着反応を示す説明図である。図２に示すように、この共重合体（Ａ）のチオール基は、金含有基材の金原子との間で非共有結合性の金‐チオール結合を形成する（図中点線で示した結合）。この金‐チオール結合により、共重合体（Ａ）は金電極５の表面に吸着して、自己組織化した安定な表面層を形成する。
FIG. 3 is an explanatory view showing the adsorption reaction between the gold atom and the thiol group of the copolymer (A) on the surface of the gold-containing substrate. As shown in FIG. 2, the thiol group of the copolymer (A) forms a non-covalent gold-thiol bond with the gold atom of the gold-containing substrate (the bond indicated by the dotted line in the figure). ). By this gold-thiol bond, the copolymer (A) is adsorbed on the surface of the
また、共重合体（Ａ）は、上記一般式（２）で示される活性エステル基含有単量体（ａ２）由来の活性エステル基を分子内に有している。上述したように、活性エステル基はアミノ基を有する生体分子とアミド結合により結合する性質を有する。従って、共重合体（Ａ）は金含有基材の表面に生体分子を固定化する性質を備えている。以下に、共重合体（Ａ）と生体分子との結合反応を、図を示して説明する。 Moreover, the copolymer (A) has an active ester group derived from the active ester group-containing monomer (a2) represented by the general formula (2) in the molecule. As described above, the active ester group has a property of binding to a biomolecule having an amino group through an amide bond. Accordingly, the copolymer (A) has a property of immobilizing biomolecules on the surface of the gold-containing substrate. Hereinafter, the bonding reaction between the copolymer (A) and the biomolecule will be described with reference to the drawings.
図４は金含有基材の表面での共重合体（Ａ）と生体分子の結合反応を示す説明図である。この図に示すように、共重合体（Ａ）の活性エステル基は、タンパク質やＤＮＡといった生体分子７のアミノ基と反応して、ウレタン結合を形成する。詳細には、タンパク質のＮ末端側のアミノ基や、リシン，アルギニンといった塩基性アミノ酸由来の側鎖のアミノ基や、ＤＮＡの５'末端をアミノ基で修飾したアミノ修飾ＤＮＡ断片のアミノ基などとウレタン結合を形成する。
従って、本発明の共重合体（Ａ）は、金含有基材を有するセンサチップに適用した場合に、金含有基材の表面にタンパク質などの生体分子７を固定化することが可能となる。
FIG. 4 is an explanatory view showing a binding reaction between the copolymer (A) and the biomolecule on the surface of the gold-containing substrate. As shown in this figure, the active ester group of the copolymer (A) reacts with the amino group of the biomolecule 7 such as protein or DNA to form a urethane bond. Specifically, the amino group on the N-terminal side of proteins, the amino group of side chains derived from basic amino acids such as lysine and arginine, the amino group of an amino-modified DNA fragment in which the 5 ′ end of DNA is modified with an amino group, etc. Form a urethane bond.
Therefore, when the copolymer (A) of the present invention is applied to a sensor chip having a gold-containing substrate, it is possible to immobilize biomolecules 7 such as proteins on the surface of the gold-containing substrate.
更に、本発明の共重合体（Ａ）は、上述したようにチオール基と活性エステル基を分子内に有しているため、上述のように生体分子をセンサチップの金属表面に固定化することが可能である。更に、共重合体（Ａ）は分子内にホスホリルコリン類似基を有している。このホスホリルコリン類似基は、上述したように生体成分との相互作用が小さいため、生体成分の金含有基材への非特異的吸着を効率的に防止することができる。 Furthermore, since the copolymer (A) of the present invention has a thiol group and an active ester group in the molecule as described above, the biomolecule is immobilized on the metal surface of the sensor chip as described above. Is possible. Furthermore, the copolymer (A) has a phosphorylcholine-like group in the molecule. Since the phosphorylcholine-like group has a small interaction with the biological component as described above, nonspecific adsorption of the biological component to the gold-containing substrate can be efficiently prevented.
本発明の共重合体（Ａ）は、このような性質を備えているため、化学工学，生命工学，環境，医療などの幅広い分野において、金を材料とする基材の表面に生体分子を固定化する用途に用いることが可能である。
具体的な用途としては、例えば、酵素センサ，免疫センサ，表面プラズモン共鳴バイオセンサ，水晶振動子マイクロバランスバイオセンサといった各種バイオセンサやＤＮＡチップ，分子プローブ，金コロイドなどが挙げられる。
Since the copolymer (A) of the present invention has such properties, biomolecules are immobilized on the surface of a gold-based substrate in a wide range of fields such as chemical engineering, biotechnology, environment, and medicine. It is possible to use it for the purpose of making it.
Specific examples include various biosensors such as enzyme sensors, immunosensors, surface plasmon resonance biosensors, and quartz crystal microbalance biosensors, DNA chips, molecular probes, and gold colloids.
酵素センサは、酵素反応を利用したセンサである。一般的に、酵素は特定の基質とのみ反応する基質特異性を有している。このため、酵素をセンサ素子として利用することで、特定の物質を高感度に検出・測定することが可能になる。
酵素センサの具体例としては、先に挙げた果糖（フルクトース）濃度センサ，グルコースセンサ，尿素センサなどが挙げられる。
The enzyme sensor is a sensor using an enzyme reaction. In general, enzymes have substrate specificity that reacts only with specific substrates. For this reason, a specific substance can be detected and measured with high sensitivity by using an enzyme as a sensor element.
Specific examples of the enzyme sensor include the fructose concentration sensor, glucose sensor, urea sensor, and the like mentioned above.
グルコースセンサは、酵素としてグルコースオキシダーゼを用いて、血液や食品などの試料中のグルコースを検出・測定するセンサである。グルコースオキシダーゼは、基質であるグルコースを酸化してグルコノラクトンと過酸化水素を生成する。グルコースセンサは、この酸化反応の過程で減少する酸素の量、あるいは増加する過酸化水素の量を酸素電極などで直接モニタリングすることで、試料中のグルコース濃度を測定する。
あるいは、測定溶液中にベンゾキノンなどのメディエータを加えておき、過酸化水素とメディエータとの間で酸化還元反応を生じさせ、生成する酸化型のメディエータを電極で還元することによりメディエータ濃度を測定する。そして、測定されたメディエータ濃度から、試料中のグルコース濃度を測定することも可能である。
A glucose sensor is a sensor that detects and measures glucose in a sample such as blood or food using glucose oxidase as an enzyme. Glucose oxidase oxidizes glucose as a substrate to produce gluconolactone and hydrogen peroxide. The glucose sensor measures the glucose concentration in the sample by directly monitoring the amount of oxygen that decreases in the course of this oxidation reaction or the amount of hydrogen peroxide that increases, using an oxygen electrode or the like.
Alternatively, a mediator such as benzoquinone is added to the measurement solution, an oxidation-reduction reaction is caused between hydrogen peroxide and the mediator, and the generated mediator is reduced with an electrode to measure the mediator concentration. It is also possible to measure the glucose concentration in the sample from the measured mediator concentration.
尿素センサは、酵素としてウレアーゼを用いて、尿などの試料中の尿素を検出・測定するセンサである。ウレアーゼは、基質である尿素を加水分解して炭酸とアンモニアを生成する。尿素センサは、アンモニアの増加に伴う水素イオン濃度の減少を、ｐＨメータなどでモニタリングすることにより、試料中の尿素濃度を測定する。あるいは、上述のグルコースセンサと同様に、メディエータを介して間接的に尿素濃度を測定する。 A urea sensor is a sensor that detects and measures urea in a sample such as urine using urease as an enzyme. Urease hydrolyzes the substrate urea to produce carbonic acid and ammonia. The urea sensor measures the urea concentration in the sample by monitoring the decrease in the hydrogen ion concentration accompanying the increase in ammonia with a pH meter or the like. Alternatively, the urea concentration is indirectly measured via a mediator as in the above-described glucose sensor.
本発明の共重合体（Ａ）は、上記各種酵素のアミノ基とウレタン結合により結合する一方、センサの素子であるセンサチップの基材である金含有基材と金‐チオール結合により吸着する。従って、各種の酵素を金含有基材の表面に固定化することが可能となる。 The copolymer (A) of the present invention is bonded to an amino group of each of the above enzymes by a urethane bond, and is adsorbed by a gold-containing substrate that is a sensor chip substrate that is a sensor element and a gold-thiol bond. Therefore, various enzymes can be immobilized on the surface of the gold-containing substrate.
また、免疫センサは、抗体の抗原認識能を利用したセンサである。抗体は、特定の抗原を認識して特異的に結合する性質を有している。このため、免疫センサとして利用することで、特定の物質を高感度に検出・測定することが可能となる。 An immunosensor is a sensor that utilizes the antigen recognition ability of an antibody. The antibody has a property of recognizing and binding specifically to a specific antigen. For this reason, a specific substance can be detected and measured with high sensitivity by using it as an immunosensor.
免疫センサは、測定対象となる抗体である免疫グロブリンを検出素子として固定化した構造を備えている。免疫グロブリンは、抗原のエピトープと結合する領域である可変ドメインと、それ以外の定常領域とから構成される。本発明の共重合体（Ａ）は、主として定常領域のアミノ基とウレタン結合する。
免疫センサでの測定対象の検出方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した方法や、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を利用した方法など、公知の方法で検出することが可能である。
The immunosensor has a structure in which immunoglobulin as an antibody to be measured is immobilized as a detection element. An immunoglobulin is composed of a variable domain, which is a region that binds to an epitope of an antigen, and other constant regions. The copolymer (A) of the present invention mainly forms a urethane bond with an amino group in the stationary region.
As a method for detecting an object to be measured by an immunosensor, it is possible to detect by a known method such as a method using surface plasmon resonance (SPR) or a method using crystal resonator microbalance (QCM).
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法は、金などの光反射性の高い薄膜を蒸着したプリズムにレーザ光を照射して、レーザ光の入射角を変化させて反射光強度の減衰をモニタリングすることで、薄膜表面で起こる反応を検出する方法である。 The surface plasmon resonance (SPR) method irradiates a laser beam on a prism on which a light reflecting thin film such as gold is deposited, changes the incident angle of the laser beam, and monitors the attenuation of the reflected light intensity. This is a method for detecting a reaction occurring on the surface of a thin film.
水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法は、金などの電極を配した水晶振動子の電極表面に物質が付着すると、付着量に応じて共振周波数が変化する現象を利用して、試料中の所定の物質を検出したり、濃度を測定したりする方法である。 The quartz crystal microbalance (QCM) method uses a phenomenon in which when a substance adheres to the surface of a quartz crystal electrode provided with an electrode such as gold, the resonance frequency changes in accordance with the amount of adhesion. It is a method of detecting the substance of this and measuring the concentration.
上記いずれの方法でも、本発明の共重合体（Ａ）を介して金の表面にモノクローナル抗体を担持させ、所定の抗原と反応させることで、試料中の所定の分子を高精度で検出したり、濃度を測定したりすることが可能となる。 In any of the above methods, a monoclonal antibody is supported on the gold surface via the copolymer (A) of the present invention and reacted with a predetermined antigen to detect a predetermined molecule in a sample with high accuracy. The concentration can be measured.
ＤＮＡチップは、金などの基材の表面に所定のＤＮＡ断片が結合したマイクロアレイを複数備えた基板である。ＤＮＡチップは医療，化学，生命工学などの幅広い分野で利用される。
例えば、発がん性遺伝子を検出するＤＮＡチップでは、発がん性遺伝子と相補的な塩基配列を有するプローブＤＮＡを本発明の共重合体（Ａ）を介して電極としての金含有基材の表面に結合しておく。そして、血液などの試料をＤＮＡチップに接触させて、目的遺伝子をコードするＤＮＡとプローブＤＮＡをハイブリダイズさせる。更に、二本鎖ＤＮＡにインターカレートする酸化還元物質をＤＮＡチップに導入する。試料中に目的遺伝子が含まれる場合には、目的遺伝子をコードするＤＮＡとプローブＤＮＡとが相補的に結合するため、酸化還元物質がインターカレートされるため、電極表面での酸化還元物質の濃度が低くなる。
A DNA chip is a substrate provided with a plurality of microarrays in which a predetermined DNA fragment is bonded to the surface of a substrate such as gold. DNA chips are used in a wide range of fields such as medicine, chemistry, and biotechnology.
For example, in a DNA chip for detecting a carcinogenic gene, a probe DNA having a base sequence complementary to the carcinogenic gene is bound to the surface of a gold-containing substrate as an electrode via the copolymer (A) of the present invention. Keep it. Then, a sample such as blood is brought into contact with the DNA chip, and the DNA encoding the target gene and the probe DNA are hybridized. Furthermore, a redox substance that intercalates into double-stranded DNA is introduced into the DNA chip. When the target gene is contained in the sample, since the DNA encoding the target gene and the probe DNA are complementarily bound, the redox substance is intercalated, so the concentration of the redox substance on the electrode surface Becomes lower.
一方、試料中に目的遺伝子が含まれない場合には、目的遺伝子をコードするＤＮＡとプローブＤＮＡとが相補的に結合しないため、酸化還元物質がインターカレートされず、電極表面の酸化還元物質の濃度が上記ハイブリダイズする場合と比較して高くなる。
従って、電極で酸化還元物質の濃度を測定することで、目的遺伝子の有無やその含有量を測定することが可能となる。
On the other hand, when the target gene is not contained in the sample, the DNA encoding the target gene and the probe DNA do not bind complementarily, so that the redox substance is not intercalated and the redox substance on the electrode surface is not intercalated. The concentration is higher than in the case of the above hybridization.
Therefore, the presence or absence of the target gene and its content can be measured by measuring the concentration of the redox substance with the electrode.
ＤＮＡチップは、このような発ガン性遺伝子や肥満遺伝子などの遺伝子解析や、遺伝子組み換え作物などの検査、目的遺伝子をターゲットとした薬剤のスクリーニングといった目的に幅広く使用される。
その他、本発明の共重合体（Ａ）は、分子プローブや金コロイドなどの金を材料とする基材に生体分子を固定化する目的で使用することも可能である。
すなわち、本発明の共重合体（Ａ）の用途は上記各種バイオセンサに限定されず、金を材料とする基材に生体分子を固定化するあらゆる用途に適用することが可能である。
DNA chips are widely used for such purposes as gene analysis of such carcinogenic genes and obesity genes, inspection of genetically modified crops, and screening of drugs targeting target genes.
In addition, the copolymer (A) of the present invention can be used for the purpose of immobilizing biomolecules on a substrate made of gold such as a molecular probe or gold colloid.
That is, the use of the copolymer (A) of the present invention is not limited to the various biosensors described above, and can be applied to any use for immobilizing a biomolecule on a base material made of gold.
以下に、実施例を用いて本発明の内容をより具体的に説明する。なお、以下に説明する材料，部材，配置等は、本発明を限定するものではなく、本発明の趣旨に沿って各種改変することができることは勿論である。
本例では、共重合体（Ａ）を構成する単量体のうち、ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）として２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２−トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート（以下、ＭＰＣ）、活性エステル基含有単量体（ａ２）として２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−ｐ−ニトロ安息香酸エステル（以下、ＭＮＢ）、チオール基含有単量体（ａ３）として２−[（２−メルカプトエチル）カルボニルオキシ]エチル（メタ）アクリレート（以下、２−ＭＥＥ）を構成単位とする、上記一般式（２）に係る共重合体を使用した。
また、生体分子としてグルコースオキシダーゼを固定化したグルコースセンサに、この共重合体（Ａ）を適用した例について説明する。
Hereinafter, the contents of the present invention will be described more specifically with reference to examples. It should be noted that materials, members, arrangements, and the like described below do not limit the present invention, and it is needless to say that various modifications can be made in accordance with the spirit of the present invention.
In this example, among the monomers constituting the copolymer (A), 2- (methacryloyloxy) ethyl-2-trimethylammonio) ethyl phosphate (hereinafter referred to as MPC) as the phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1). ), 2- (meth) acryloyloxyethyl-p-nitrobenzoate (hereinafter referred to as MNB) as the active ester group-containing monomer (a2), and 2-[(2- The copolymer which concerns on the said General formula (2) which uses a mercaptoethyl) carbonyloxy] ethyl (meth) acrylate (henceforth, 2-MEE) as a structural unit was used.
An example in which this copolymer (A) is applied to a glucose sensor in which glucose oxidase is immobilized as a biomolecule will be described.
（共重合体（Ａ）の合成例）
共重合体（Ａ）の合成は、ＭＰＣとＭＮＢとのモル比が８０：２０の中間体を合成し、その後に、この中間体にシステアミンを反応させることで行った。
具体的には、まず、粉末状のＭＰＣ（日本油脂株式会社製）を２．４ｇ、ＭＮＢ０．８９ｇを、エタノールを重合溶媒として１．０ｍｏｌ／ｌとなるように溶解して、３０ｍｌの反応溶液を作成した。
(Synthesis example of copolymer (A))
The copolymer (A) was synthesized by synthesizing an intermediate having a molar ratio of MPC and MNB of 80:20, and then reacting this intermediate with cysteamine.
Specifically, first, 2.4 g of powdered MPC (manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) and 0.89 g of MNB were dissolved so as to be 1.0 mol / l using ethanol as a polymerization solvent, and 30 ml of reaction solution was obtained. It was created.
続いて、この反応溶液を１００ｍｌの三口フラスコに入れて、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル（関東化学株式会社製）を０．５ｍＭとなるように溶解させたのち、溶液中にアルゴンガスを２００ｍｌ／ｍｉｎで１０分間導入してアルゴン置換を行った。その後、反応溶液をオイルバス中で６５℃、５時間反応させることで、中間体（ＭＰＣ−ＭＮＢ二元共重合体）を合成した。 Subsequently, this reaction solution is put into a 100 ml three-necked flask, and azobisisobutyronitrile (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) is dissolved as a polymerization initiator so as to have a concentration of 0.5 mM, and then argon gas is added to the solution. Was introduced at 200 ml / min for 10 minutes to perform argon substitution. Thereafter, the reaction solution was reacted in an oil bath at 65 ° C. for 5 hours to synthesize an intermediate (MPC-MNB binary copolymer).
上記合成反応の後、ＭＰＣ−ＭＮＢ二元共重合体を含む溶液２０ｍｌ中に、粉末状のシステアミン塩酸塩（東京化成株式会社製）を１０ｍｍｏｌ／ｌとなるように溶解させて、４℃、１２時間反応させることで、ＭＰＣ−ＭＮＢ二元共重合体の活性エステル基（ｐ−ニトロフェニルエステル基）とシステアミンのアミノ基を反応させた。 After the above synthesis reaction, powdery cysteamine hydrochloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) is dissolved in 20 ml of a solution containing MPC-MNB binary copolymer so as to have a concentration of 10 mmol / l. By reacting for a period of time, the active ester group (p-nitrophenyl ester group) of the MPC-MNB binary copolymer was reacted with the amino group of cysteamine.
上記合成反応で得られた反応溶液５０ｍｌを、阻止分子量３，５００の１２０ｍｌ透析チューブ（ＰＩＥＲＣＥ社製、ＳｎａｋｅＳｋｉｎ、Ｐｌｅａｔｅｄ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｔｕｂｉｎｇ）に入れ、純水（電気抵抗率２×１０６Ω・ｃｍ）５０００ｍｌを入れたガラス容器中に浸漬してマグネチックスターラーを用いて２５℃で４８時間撹拌して透析を行い、反応溶液中の未反応の単量体であるＭＰＣ，ＭＮＢと、システアミン、および重合開始剤を除去した。
続いて、０．１Ｎの塩酸２ｍｌを添加した純水５０００ｍｌを入れたガラス容器中で、２５℃で７２時間撹拌して再度透析を行った。その後、透析チューブから試料を回収して２００ｍｌ用凍結乾燥用フラスコに入れ、凍結乾燥機（東京理化器械株式会社製、ＦＤＵ−１１００）で４８時間真空状態にて凍結乾燥を行うことで溶媒を除去して淡黄色の粉末を乾燥重量で１．２ｇ得た。
50 ml of the reaction solution obtained by the above synthesis reaction was put into a 120 ml dialysis tube (PIERCE, SnakeSkin, Pleated Dialyzation Tubing) having a blocking molecular weight of 3,500, and pure water (
Subsequently, the mixture was stirred for 72 hours at 25 ° C. in a glass container containing 5000 ml of pure water added with 2 ml of 0.1N hydrochloric acid, and dialyzed again. Thereafter, the sample is collected from the dialysis tube, placed in a 200 ml freeze-drying flask, and the solvent is removed by freeze-drying in a vacuum state for 48 hours with a freeze-dryer (FDU-1100, manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.). As a result, 1.2 g of a light yellow powder was obtained by dry weight.
上記合成例で得られた共重合体（Ａ）について、１）ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）構造単位のモル分率、２）活性エステル基含有単量体（ａ２）構造単位のモル分率、３）チオール基含有単量体（ａ３）構造単位のモル分率の測定を行った。
１）〜３）共重合体（Ａ）中の各単量体構造単位のモル分率については、仕込み組成中のモル分率と、合成した重合体中のモル分率の両方を算出した。共重合体（Ａ）中のモル分率は、リンの定量試験により算出した。
その結果、各単量体構成単位のモル分率は、単量体（ａ１）：単量体（ａ２）：単量体（ａ３）＝８０：１０：１０であった。
Regarding copolymer (A) obtained in the above synthesis example, 1) molar fraction of phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1) structural unit, 2) active ester group-containing monomer (a2) mole of structural unit Fraction 3) The molar fraction of the thiol group-containing monomer (a3) structural unit was measured.
1) to 3) About the mole fraction of each monomer structural unit in the copolymer (A), both the mole fraction in the charged composition and the mole fraction in the synthesized polymer were calculated. The molar fraction in the copolymer (A) was calculated by a phosphorus quantitative test.
As a result, the molar fraction of each monomer structural unit was monomer (a1): monomer (a2): monomer (a3) = 80: 10: 10.
続いて、重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。重量平均分子量（Ｍｗ）は、得られた共重合体（Ａ）をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定することで行った。カラムとしてＡＷＭ−Ｈ（東ソー株式会社製）、溶出溶媒として０．１５ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液、標準試料としてポリエチレングリコール（東ソー株式会社製、ＴＳＫ Ｓｔａｎｄａｒｄ）を溶解した０．１５ｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液を使用した。重量平均分子量（Ｍｗ）の計算は、日本分光社製クロマトデータ処理用プログラム ＪＡＳＣＯ−ＢＯＲＷＩＮを使用した。カラムに試料５０μｌを充填し、溶出溶媒を流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで連続導入して測定を行った。
その結果、重合平均分子量（Ｍｗ）は、４．０×１０４であった。
Subsequently, the weight average molecular weight (Mw) was measured. The weight average molecular weight (Mw) was measured by measuring the obtained copolymer (A) by gel permeation chromatography (GPC). AWM-H (manufactured by Tosoh Corporation) as a column, 0.15 mol / l phosphate buffer as an elution solvent, and 0.15 mol / l phosphoric acid dissolved in polyethylene glycol (TSK Standard, manufactured by Tosoh Corporation) as a standard sample Buffer was used. The weight average molecular weight (Mw) was calculated using JASCO-BORWIN, a chromatographic data processing program manufactured by JASCO Corporation. The column was packed with 50 μl of sample, and the elution solvent was continuously introduced at a flow rate of 0.5 ml / min for measurement.
As a result, the polymerization average molecular weight (Mw) was 4.0 × 10 4 .
更に、分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量（Ｍｗ／Ｍｎ））を測定した。分子量分布についても、上記Ｍｗの測定と同様に、ＧＰＣにより測定した。数平均分子量については、上述の重量平均分子量と同様にＧＰＣより測定した。
その結果、分子量分布は２．４であった。
Furthermore, molecular weight distribution (weight average molecular weight / number average molecular weight (Mw / Mn)) was measured. The molecular weight distribution was also measured by GPC as in the above Mw measurement. The number average molecular weight was measured by GPC in the same manner as the above weight average molecular weight.
As a result, the molecular weight distribution was 2.4.
（共重合体（Ａ）の金含有基材への吸着）
上記合成例で得られた共重合体（Ａ）を、グルコースセンサのセンサチップ上に形成された金含有基材表面に吸着させた。
センサチップは、矩形状のガラス基板の表面の一区画に、厚さ約５０ｎｍの金で形成された基材が積層した構造となっているものを使用した。
まず、上記合成例で得られた粉末状の共重合体（Ａ）を９５％エタノールに溶解した。続いて、このエタノール溶液を入れたガラス容器中に、金含有基材領域が完全に浸るようにセンサチップを浸漬して、２５℃，５分間で吸着反応を行った。
反応の後、センサチップをエタノール溶液中から引き上げて、金含有基材の表面を純水で洗い流すことにより洗浄を行い、未反応の共重合体（Ａ）を除去した。
(Adsorption of copolymer (A) to gold-containing substrate)
The copolymer (A) obtained in the above synthesis example was adsorbed on the surface of the gold-containing substrate formed on the sensor chip of the glucose sensor.
As the sensor chip, a sensor chip having a structure in which a base material formed of gold having a thickness of about 50 nm is laminated on a section of a surface of a rectangular glass substrate.
First, the powdery copolymer (A) obtained in the above synthesis example was dissolved in 95% ethanol. Subsequently, the sensor chip was immersed in the glass container containing the ethanol solution so that the gold-containing substrate region was completely immersed, and an adsorption reaction was performed at 25 ° C. for 5 minutes.
After the reaction, the sensor chip was pulled up from the ethanol solution and washed by rinsing the surface of the gold-containing substrate with pure water to remove the unreacted copolymer (A).
（生体分子の金含有基材への固定化）
続いて、金含有基材へ共重合体（Ａ）を吸着させたセンサチップに、生体分子であるグルコースオキシダーゼを反応させることで、金含有基材表面へグルコースオキシダーゼを固定化した。
まず、ｐＨ７．４の０．１５ｍＭリン酸緩衝液にグルコースオキシダーゼ（シグマ社製）を１ｍｇ／ｍｌとなるように混合して、酵素溶液を作成した。続いて、共重合体（Ａ）を金含有基材の表面に吸着させたセンサチップをこの酵素溶液に浸漬して、ｐＨ７．６、反応温度４℃で２４時間反応させた。反応の後、０．１５ｍＭリン酸緩衝液でセンサチップの表面を洗浄して、未反応のグルコースオキシダーゼをセンサチップ表面から除去した。
(Immobilization of biomolecules on gold-containing substrates)
Subsequently, glucose oxidase was immobilized on the gold-containing substrate surface by reacting glucose oxidase, which is a biomolecule, with the sensor chip having the copolymer (A) adsorbed on the gold-containing substrate.
First, glucose oxidase (manufactured by Sigma) was mixed with 0.15 mM phosphate buffer having a pH of 7.4 so as to be 1 mg / ml to prepare an enzyme solution. Subsequently, a sensor chip having the copolymer (A) adsorbed on the surface of the gold-containing substrate was immersed in the enzyme solution and reacted at pH 7.6 and a reaction temperature of 4 ° C. for 24 hours. After the reaction, the surface of the sensor chip was washed with 0.15 mM phosphate buffer to remove unreacted glucose oxidase from the surface of the sensor chip.
（グルコースセンサの性能試験）
作成したグルコースセンサチップを電流測定器にセットし、グルコース濃度０〜５００ｍＭまで変化させた溶液中にセンサチップを浸漬して、電流測定器で電流値を測定した。その結果、グルコース濃度と電流値との間に良好な直線性が得られた。
(Performance test of glucose sensor)
The prepared glucose sensor chip was set in an electric current measuring device, the sensor chip was immersed in a solution in which the glucose concentration was changed to 0 to 500 mM, and the current value was measured with the electric current measuring device. As a result, good linearity was obtained between the glucose concentration and the current value.
１ センサチップ
３ ガラス基板
５ 金電極
７ 生体分子
Ａ 共重合体（Ａ）
1
Claims (4)
ｌ，ｍ，ｎは全構成単位中の各構成単位の割合を示し、ｌは０．７０から０．８７，ｍは０．０３から０．２０，ｎは０．１０から０．２７の範囲であり、ゲルパーミエーションクロマトグラフにより標準ポリエチレングリコールを用いて換算した重量平均分子量が１０，０００から１，０００，０００の範囲である。）
で示される共重合体。 The following general formula (1)
l, m, and n represent the proportion of each structural unit in all structural units, l is 0.70 to 0.87, m is 0.03 to 0.20, and n is 0.10 to 0.27. The weight average molecular weight converted using standard polyethylene glycol by gel permeation chromatography is in the range of 10,000 to 1,000,000. )
A copolymer represented by
で示される共重合体であることを特徴とする請求項１記載の共重合体。 The copolymer is represented by the following general formula (2)
The copolymer according to claim 1, which is a copolymer represented by the following formula.
で示される合成中間体に、
下記一般式（４）
で示される化合物を反応させて、前記活性エステル基のうち一部の側鎖をチオール基含有側鎖に変換する工程を備えることを特徴とする共重合体の製造方法。 The following general formula (3) containing at least a phosphorylcholine-like group and an active ester group in the molecule
In the synthetic intermediate represented by
The following general formula (4)
A method for producing a copolymer, comprising the step of reacting a compound represented by formula (1) to convert a part of the active ester groups into side chains containing thiol groups.
で示されるホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）と、
下記一般式（６）
で示される活性エステル基含有単量体（ａ２）を重合させて、前記合成中間体を製造する工程を更に備えることを特徴とする請求項３記載の共重合体の製造方法。 The following general formula (5)
A phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1) represented by:
The following general formula (6)
The method for producing a copolymer according to claim 3, further comprising the step of polymerizing the active ester group-containing monomer (a2) represented by formula (1) to produce the synthetic intermediate.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005143606A JP2006321829A (en) | 2005-05-17 | 2005-05-17 | Copolymer and method for producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005143606A JP2006321829A (en) | 2005-05-17 | 2005-05-17 | Copolymer and method for producing the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006321829A true JP2006321829A (en) | 2006-11-30 |
Family
ID=37541738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005143606A Withdrawn JP2006321829A (en) | 2005-05-17 | 2005-05-17 | Copolymer and method for producing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2006321829A (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102854293A (en) * | 2012-09-27 | 2013-01-02 | 广州高通生物技术有限公司 | Chip, preparation method, application and method for screening drugs |
| WO2014075373A1 (en) * | 2012-11-14 | 2014-05-22 | 上海集成电路研发中心有限公司 | Silicon nanowire chip for simultaneously detecting mirnas and protein markers, detecting method and application thereof |
| JPWO2013002021A1 (en) * | 2011-06-27 | 2015-02-23 | 日油株式会社 | Polymer and production method thereof |
| CN114981326A (en) * | 2019-11-28 | 2022-08-30 | 京瓷株式会社 | Copolymer, measuring device and measuring carrier |
| WO2023276772A1 (en) * | 2021-06-29 | 2023-01-05 | Ｐｈｃホールディングス株式会社 | Polymer, reagent layer, and sensor |
-
2005
- 2005-05-17 JP JP2005143606A patent/JP2006321829A/en not_active Withdrawn
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2013002021A1 (en) * | 2011-06-27 | 2015-02-23 | 日油株式会社 | Polymer and production method thereof |
| CN102854293A (en) * | 2012-09-27 | 2013-01-02 | 广州高通生物技术有限公司 | Chip, preparation method, application and method for screening drugs |
| WO2014048116A1 (en) * | 2012-09-27 | 2014-04-03 | 广州高通生物技术有限公司 | Chip, preparation method and use thereof and method for screening drug |
| CN102854293B (en) * | 2012-09-27 | 2015-07-08 | 广州高通生物技术有限公司 | Chip, preparation method, application and method for screening drugs |
| WO2014075373A1 (en) * | 2012-11-14 | 2014-05-22 | 上海集成电路研发中心有限公司 | Silicon nanowire chip for simultaneously detecting mirnas and protein markers, detecting method and application thereof |
| CN114981326A (en) * | 2019-11-28 | 2022-08-30 | 京瓷株式会社 | Copolymer, measuring device and measuring carrier |
| CN114981326B (en) * | 2019-11-28 | 2023-12-22 | 京瓷株式会社 | Copolymer, measuring device and measuring carrier |
| WO2023276772A1 (en) * | 2021-06-29 | 2023-01-05 | Ｐｈｃホールディングス株式会社 | Polymer, reagent layer, and sensor |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Frederix et al. | Enhanced performance of an affinity biosensor interface based on mixed self-assembled monolayers of thiols on gold | |
| Welch et al. | Polymer brushes for electrochemical biosensors | |
| Iskierko et al. | Molecularly imprinted polymers for separating and sensing of macromolecular compounds and microorganisms | |
| Scouten et al. | Enzyme or protein immobilization techniques for applications in biosensor design | |
| Liu et al. | Enantioselective molecular imprinting polymer coated QCM for the recognition of l-tryptophan | |
| Cullen et al. | Polymeric brushes as functional templates for immobilizing ribonuclease A: study of binding kinetics and activity | |
| Sarıkaya et al. | Molecularly imprinted surface plasmon resonance (SPR) sensor for uric acid determination | |
| Iwata et al. | Covalent immobilization of antibody fragments on well-defined polymer brushes via site-directed method | |
| US20160291001A1 (en) | Conductive hydrogels for affinity sensing | |
| Prieto-Simón et al. | Electrochemical biosensors featuring oriented antibody immobilization via electrografted and self-assembled hydrazide chemistry | |
| Sola et al. | Synthesis of clickable coating polymers by postpolymerization modification: applications in microarray technology | |
| Wiarachai et al. | Clickable and Antifouling Platform of Poly [(propargyl methacrylate)-ran-(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)] for Biosensing Applications | |
| Dou et al. | Ultrasensitive poly (boric acid) hydrogel-coated quartz crystal microbalance sensor by using UV pressing-assisted polymerization for saliva glucose monitoring | |
| Uygun et al. | Molecularly imprinted sensors—New sensing technologies | |
| JP2006321829A (en) | Copolymer and method for producing the same | |
| Rastogi et al. | Preventing nonspecific adsorption on polymer brush covered gold electrodes using a modified ATRP initiator | |
| JP2006322717A (en) | Sensor chip and its manufacturing method | |
| JP2006177914A (en) | Surface having thick polymer layer, and preparation method therefor | |
| JP2004528414A (en) | Phosphorus-containing polymers for optical signal converters | |
| Won et al. | Bioelectrocatalytic signaling from immunosensors with back‐filling immobilization of glucose oxidase on biorecognition surfaces | |
| JP5409671B2 (en) | Affinity hydrogel and its label-independent detection method | |
| US11899012B2 (en) | Single-chain polymer-based target receptors for use in electrochemical detection of target analytes | |
| Naraprawatphong et al. | Development of protein-recognition SPR devices by combination of SI-ATRP with biomolecular imprinting using protein ligands | |
| JP7443396B2 (en) | Copolymers, measuring devices and measuring carriers | |
| Haupt | Molecularly imprinted polymers as recognition elements in sensors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080805 |