JP2006306759A - Medicinal preparation of thrombin - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はトロンビンを支持体上に固定化してなる、創傷治療剤、止血剤などの医薬製剤に関する。 The present invention relates to pharmaceutical preparations such as wound healing agents and hemostatic agents, wherein thrombin is immobilized on a support.
トロンビンの生理的機能としてはフィブリノゲンをフィブリンに変換することによる止血作用が知られている。さらに、主にトロンビンレセプター（PAR1）を通じたシグナルによる線維芽細胞及び血管平滑筋細胞への増殖促進作用、血管新生促進作用（非特許文献１）及びPAR1に依存しない新たな経路による細胞増殖促進機能を有すること（特許文献１）、且つこれらの機能によって創傷治癒促進効果を有することが報告されている。 As a physiological function of thrombin, hemostasis by converting fibrinogen into fibrin is known. Furthermore, the growth promoting action on fibroblasts and vascular smooth muscle cells mainly by signals through the thrombin receptor (PAR1), the angiogenesis promoting action (Non-patent Document 1) and the cell growth promoting function by a new pathway independent of PAR1. (Patent Document 1) and these functions have been reported to have an effect of promoting wound healing.
トロンビンのみでなく種々の支持体を利用した止血剤はこれまで多数の報告がなされている。例えば、アルギン酸とトロンビンをカルボジイミドによって共有結合させた止血剤（特許文献２）、トロンビンとフィブリノゲンからなる止血用包帯（特許文献３）、コラーゲンシート等の生分解性のスポンジ状の支持体にトロンビン、フィブリノゲンを結合させ凍結乾燥させた止血剤、組織シーラント（特許文献４〜７）等が知られている。これらの支持体固定化トロンビンは、全て製造の最終工程で凍結乾燥を行う必要がある。しかしながら、凍結乾燥だけでは支持体に固定化されない、もしくは支持体の柔軟性が損なわれるという問題があった。
本発明はトロンビンが安定に支持体上に固定化され、且つ支持体からのトロンビンの放出速度が使用目的に合わせて制御された、創傷治療剤、止血剤などとして有用な医薬製剤を提供することを課題とする。 The present invention provides a pharmaceutical preparation useful as a wound healing agent, hemostatic agent, etc., in which thrombin is stably immobilized on a support and the release rate of thrombin from the support is controlled according to the intended use. Is an issue.
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、トロンビンと一種又は二種以上の高分子を交互吸着法などのイオン結合によって支持体上に固定化することで安定に固定化されることを見出した。また交互吸着などのイオン結合に用いる電荷を有する高分子、あるいはそれらの組み合わせや積層条件により支持体からのトロンビン放出速度が用途に応じて制御可能なこと、放出速度を制御することで、このような医薬製剤が創傷治療剤、止血剤などとして好適に用いることができることを見出して本発明を完成するに至った。 The present inventor has intensively studied to solve the above problems. As a result, it was found that thrombin and one or more polymers can be stably immobilized by immobilizing on a support by ionic bonding such as an alternating adsorption method. In addition, the thrombin release rate from the support can be controlled according to the application according to the polymer having the charge used for ionic bonds such as alternating adsorption, or a combination thereof and the lamination conditions. The present invention has been completed by finding that a suitable pharmaceutical preparation can be suitably used as a wound healing agent, a hemostatic agent and the like.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）イオン結合によりトロンビンが固定化用の高分子を介して支持体上に層状に固定化されてなるトロンビン層を有する医薬製剤であって、前記トロンビン層が、さらに、その上にイオン結合によって結合された高分子からなる高分子層を備えるトロンビン医薬製剤
。
（２）前記固定化用の高分子及び前記イオン結合によって結合された高分子が塩基性高分子及び／又は酸性高分子である（１）のトロンビン医薬製剤。
（３）前記固定化用の高分子が酸性高分子である（１）又は（２）のトロンビン医薬製剤。
（４）酸性高分子が硫酸基を有する多糖類であることを特徴とする（２）又は（３）のトロンビン医薬製剤。
（５）酸性高分子がヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸のいずれかである（２）〜（４）のいずれかのトロンビン医薬製剤。
（６）前記トロンビン層及び前記イオン結合によって結合された高分子層が交互に積層された（１）〜（５）のいずれかのトロンビン医薬製剤。
（７）前記トロンビン医薬製剤が酸性高分子層／トロンビン層／塩基性高分子層の積層構造を一または複数有する、（１）〜（６）のいずれかのトロンビン医薬製剤。
（８）前記トロンビン医薬製剤が酸性高分子層／塩基性高分子層の積層構造を一または複数有する（７）のトロンビン医薬製剤。
（９）前記トロンビン医薬製剤が最表層に前記イオン結合によって結合された高分子層を有する（１）〜（８）のいずれかのトロンビン医薬製剤。
（１０）前記トロンビン及び前記イオン結合によって結合された高分子が交互吸着法によって固定化されたものである、（１）〜（９）のいずれかのトロンビン医薬製剤。
（１１）支持体が高分子フィルムである（１）〜（１０）のいずれかのトロンビン医薬製剤。
（１２）支持体が不織布である（１）〜（１０）のいずれかのトロンビン医薬製剤。
（１３）トロンビン医薬製剤が創傷治療剤または止血剤である、（１）〜（１２）のいずれかのトロンビン医薬製剤。
That is, the present invention is as follows.
(1) A pharmaceutical preparation having a thrombin layer in which thrombin is immobilized in a layer form on a support through a polymer for immobilization by ionic bonding, wherein the thrombin layer is further ion-bonded thereon A thrombin pharmaceutical preparation comprising a polymer layer comprising a polymer bound by.
(2) The thrombin pharmaceutical preparation according to (1), wherein the immobilizing polymer and the polymer bound by the ionic bond are a basic polymer and / or an acidic polymer.
(3) The thrombin pharmaceutical preparation according to (1) or (2), wherein the immobilizing polymer is an acidic polymer.
(4) The thrombin pharmaceutical preparation of (2) or (3), wherein the acidic polymer is a polysaccharide having a sulfate group.
(5) The thrombin pharmaceutical preparation according to any one of (2) to (4), wherein the acidic polymer is any of heparin, heparan sulfate, chondroitin sulfate, and dextran sulfate.
(6) The thrombin pharmaceutical preparation according to any one of (1) to (5), wherein the thrombin layer and the polymer layer bonded by the ionic bond are alternately laminated.
(7) The thrombin pharmaceutical preparation according to any one of (1) to (6), wherein the thrombin pharmaceutical preparation has one or a plurality of laminated structures of acidic polymer layer / thrombin layer / basic polymer layer.
(8) The thrombin pharmaceutical preparation according to (7), wherein the thrombin pharmaceutical preparation has one or a plurality of laminated structures of acidic polymer layer / basic polymer layer.
(9) The thrombin pharmaceutical formulation according to any one of (1) to (8), wherein the thrombin pharmaceutical formulation has a polymer layer bonded to the outermost layer by the ionic bond.
(10) The thrombin pharmaceutical preparation according to any one of (1) to (9), wherein the thrombin and the polymer bound by the ionic bond are immobilized by an alternate adsorption method.
(11) The thrombin pharmaceutical preparation according to any one of (1) to (10), wherein the support is a polymer film.
(12) The thrombin pharmaceutical preparation according to any one of (1) to (10), wherein the support is a nonwoven fabric.
(13) The thrombin pharmaceutical preparation according to any one of (1) to (12), wherein the thrombin pharmaceutical preparation is a wound therapeutic agent or a hemostatic agent.
本発明の医薬製剤はトロンビンが交互吸着などのイオン結合により結合された高分子層で保護されて安定に固定化されている。したがって、電荷を有する高分子の選択、それらの組み合わせ、積層条件等により支持体からのトロンビンの放出速度が用途に応じて制御可能であるので、創傷治療剤、止血剤などとして好適に用いることができる。
さらに、一般に、トロンビン溶液を常温で乾燥させた場合は、活性は完全に失われるので凍結乾燥が避けられないのに対し、本発明のように交互吸着などのイオン結合によってトロンビンを固定し高分子層で保護した場合は、凍結せずに常温で乾燥させた場合でもトロンビン活性の低下が小さい。交互吸着などのイオン結合によってトロンビンと電荷を有する高分子を適宜回数交互吸着すると所望の固定化量を容易に得られる。しかも、医薬製剤として投与した場合の生体内における溶出量の低下が小さい。したがって、本発明の医薬製剤は製造も容易であり、保存性にも優れている。
In the pharmaceutical preparation of the present invention, thrombin is protected and stably immobilized with a polymer layer bound by ionic bonds such as alternating adsorption. Therefore, since the release rate of thrombin from the support can be controlled according to the use by selecting the charged polymers, their combination, lamination conditions, etc., they can be used suitably as wound healing agents, hemostatic agents, etc. it can.
Furthermore, in general, when the thrombin solution is dried at room temperature, the activity is completely lost, so that lyophilization is unavoidable. On the other hand, as in the present invention, thrombin is immobilized by ionic bonds such as alternating adsorption. When the layer is protected, the decrease in thrombin activity is small even when it is dried at room temperature without freezing. A desired amount of immobilization can be easily obtained by alternately adsorbing thrombin and a charged polymer by ionic bonds such as alternating adsorption. Moreover, the decrease in the amount of elution in a living body when administered as a pharmaceutical preparation is small. Therefore, the pharmaceutical preparation of the present invention is easy to produce and excellent in storage stability.
本発明の医薬製剤は、イオン結合によりトロンビンが固定化用の高分子を介して支持体上に層状に固定化されてなるトロンビン層を有する医薬製剤であって、前記トロンビン層が、さらに、その上にイオン結合によって結合された高分子からなる高分子層を備えるトロンビン医薬製剤である。トロンビンと高分子をイオン結合によって結合させるためには、トロンビン及び高分子を交互吸着法によって支持体上に固定化することが好ましい。トロンビン及び高分子は交互に層状に固定化されることが好ましい。
交互吸着法とは、正電荷を有する高分子の水溶液と、負電荷を有する高分子の水溶液とを用意し、これらに、被着体を交互に接触させる（浸漬する）ことにより、被着体上に高分子を交互に積層する方法である。交互吸着によるタンパク質の積層に関しては特開平９−１０７９５２に開示されている。
The pharmaceutical preparation of the present invention is a pharmaceutical preparation having a thrombin layer in which thrombin is immobilized in a layer form on a support through a polymer for immobilization by ionic bonding, and the thrombin layer further comprises It is a thrombin pharmaceutical preparation provided with a polymer layer composed of a polymer bonded thereon by ionic bonds. In order to bind thrombin and polymer by ionic bond, it is preferable to immobilize thrombin and polymer on the support by an alternate adsorption method. Thrombin and polymer are preferably immobilized in layers alternately.
The alternate adsorption method is to prepare an aqueous solution of a polymer having a positive charge and an aqueous solution of a polymer having a negative charge, and by alternately contacting (immersing) the adherend in these, This is a method of alternately laminating polymers on the top. JP-A-9-107952 discloses a method for stacking proteins by alternating adsorption.
本発明の医薬製剤の製造において、高分子は酸性高分子、塩基性高分子のいずれか一方又は両方を用いることができる。
酸性高分子としては、トロンビンの等電点であるpH7.4未満のpH、例えば、pH6.0の溶液中で負電荷を有する高分子を用いることができる。具体的には、硫酸基又はカルボキシル基を有する高分子を挙げることができる。硫酸基を有する高分子としては、硫酸基を有する多糖類などが挙げられ、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸などが挙げられる。カルボキシル基を有する高分子としては、アルギン酸、ヒアルロン酸などが挙げられる。
硫酸基を有する多糖類に対しトロンビンはエクソサイトIIを介した特異的親和性を有し、その親和性はpHにあまり影響されないため、酸性高分子として硫酸化多糖を用いた場合には、より安定で強い交互吸着が達成される。
In the production of the pharmaceutical preparation of the present invention, as the polymer, either one or both of an acidic polymer and a basic polymer can be used.
As the acidic polymer, a polymer having a negative charge in a solution having a pH lower than 7.4, for example, pH 6.0, which is the isoelectric point of thrombin, can be used. Specific examples thereof include a polymer having a sulfate group or a carboxyl group. Examples of the polymer having a sulfate group include polysaccharides having a sulfate group, such as heparin, heparan sulfate, chondroitin sulfate, and dextran sulfate. Examples of the polymer having a carboxyl group include alginic acid and hyaluronic acid.
Thrombin has a specific affinity via exosite II for polysaccharides with sulfate groups, and the affinity is not greatly affected by pH, so when sulfated polysaccharides are used as acidic polymers, Stable and strong alternating adsorption is achieved.
塩基性の高分子としては、トロンビンの等電点であるpH7.4より大きいpHの溶液中で正電荷を有する高分子を用いることができる。具体的には、例えば、キトサン、ポリリジンなどを用いることができる。 As the basic polymer, a polymer having a positive charge in a solution having a pH higher than pH 7.4, which is the isoelectric point of thrombin, can be used. Specifically, for example, chitosan, polylysine and the like can be used.
支持体としては、トロンビンを交互吸着により固定化できるものであれば特に制限されず、例えば、支持体の性状としては、電荷を有していても良いし、有しなくても良い。すなわち、電荷を有しない高分子フィルムや不織布などであっても電荷を有する物質を塗布して電荷を付与して用いることができる。支持体の形状としては、特に制限されないが、例えば、シート状、ビーズ状の形状にすることができる。
高分子フィルムとしては、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、などが挙げられる。
具体的には、これらの高分子フィルムは電荷を有しないか、有していても極めて小さいので、例えば、軟性塩化ビニルなどの高分子フィルムに、電荷を有する物質、例えば、キトサンやアルギン酸などを塗布して電荷を付与したものを用いることが好ましい。軟性塩化ビニルにキトサン又はアルギン酸等を塗布する場合、例えば、中性で不溶性のキトサンを１％程度の酢酸等、酸性条件にて溶かし、その溶液をフィルムに塗り、その後乾燥することによって電荷を付与した支持体を得ることができる。また、高分子フィルムに対しコロナ処理、オゾン処理、プラズマ処理等の表面処理を行うことによって極性の大きな官能基を高分子に導入し、電荷を付与すると共に親水性の向上を図ることができる。そして、電荷を有する物質を塗布する際にも表面処理を行うとより効率的に電荷を有する物質を付着することが出来る。
The support is not particularly limited as long as thrombin can be immobilized by alternate adsorption. For example, the support may have a charge or may not have a charge. That is, even a polymer film or non-woven fabric having no charge can be used by applying a substance having a charge and applying the charge. The shape of the support is not particularly limited, and can be, for example, a sheet shape or a bead shape.
Examples of the polymer film include vinyl chloride, vinylidene chloride, polyethylene, polyethylene terephthalate, and the like.
Specifically, since these polymer films have no charge or are extremely small even if they have a charge, for example, a polymer film such as soft vinyl chloride is charged with a substance having a charge such as chitosan or alginic acid. It is preferable to use a material that has been applied and charged. When applying chitosan or alginic acid to soft vinyl chloride, for example, neutral and insoluble chitosan is dissolved in about 1% acetic acid in acidic conditions, the solution is applied to a film, and then dried to give an electric charge. Can be obtained. In addition, by performing surface treatment such as corona treatment, ozone treatment, plasma treatment, etc. on the polymer film, a highly polar functional group can be introduced into the polymer to impart charge and improve hydrophilicity. Further, if a surface treatment is performed even when a substance having a charge is applied, the substance having a charge can be more efficiently attached.
また、不織布を支持体として用いることもできる。不織布としては、アルギン酸などの電荷を有する物質を不織布として用いてもよいし、キチンなどのそれ自体それほど電荷を持たない物質に対しても、対となる正負の電荷を有する高分子同士をその上に塗布や交互吸着などで積層させて表面の電荷を増幅することによってトロンビンを効率的に固定化することができる。不織布としては、そのほかにも、ポリグリコール酸、キトサンなどが挙げられる。 Moreover, a nonwoven fabric can also be used as a support. As the non-woven fabric, a material having a charge such as alginic acid may be used as the non-woven fabric, and a polymer having a positive and negative charge as a pair is also formed on a non-charged material such as chitin. The thrombin can be efficiently immobilized by amplifying the charge on the surface by laminating by coating or alternating adsorption. Other non-woven fabrics include polyglycolic acid and chitosan.
電荷を有する支持体を高分子溶液及びトロンビン溶液に交互に浸漬させることで、トロンビンを支持体上に固定化することができる。
交互吸着に用いるトロンビンおよび高分子溶液の濃度は特に制限されないが、標準的には、トロンビン溶液が0.001〜0.01mg/ml、高分子溶液は0.1〜1mg/mlである。また、必要に応じて酸、塩基などの添加あるいは緩衝液の使用によって、タンパク質および高分子が充分に荷電を持つようになるｐＨに溶液のｐＨを調整することもできる。
各溶液への浸漬時間は特に制限されないが、通常、それぞれの溶液に１〜30分間浸漬する。なお、各溶液に浸漬したのちには吸着されない高分子やトロンビンの洗浄操作を行う
ことが好ましい。
交互吸着は繰り返し行ってもよい。すなわち、支持体を高分子溶液、トロンビン溶液、さらに、高分子溶液、トロンビン溶液というように浸漬を繰り返し行ってもよい。
交互吸着の回数を調節することで目的のトロンビン固定化量が得られる。
Thrombin can be immobilized on the support by alternately immersing the charged support in the polymer solution and the thrombin solution.
The concentrations of thrombin and polymer solution used for alternate adsorption are not particularly limited, but typically, thrombin solution is 0.001 to 0.01 mg / ml, and polymer solution is 0.1 to 1 mg / ml. In addition, the pH of the solution can be adjusted to a pH at which the protein and the polymer are sufficiently charged by adding an acid, a base, or the like, or using a buffer as necessary.
Although the immersion time in each solution is not particularly limited, it is usually immersed in each solution for 1 to 30 minutes. In addition, it is preferable to perform washing | cleaning operation of the polymer | macromolecule and thrombin which are not adsorbed after being immersed in each solution.
Alternate adsorption may be repeated. That is, the substrate may be repeatedly immersed in a polymer solution, a thrombin solution, a polymer solution, and a thrombin solution.
The target amount of thrombin immobilized can be obtained by adjusting the number of alternating adsorptions.
浸漬の順序は電荷が交互になるような順序が好ましい。
例えば、酸性高分子又は塩基高分子のいずれか一方とトロンビンを交互吸着させる場合、
（ｉ）酸性高分子→トロンビン（pH7.4未満の溶液）→酸性高分子→トロンビン（pH7.4未満の溶液）の順、又は
（ii）塩基性高分子→トロンビン（pH7.4超の溶液）→塩基性高分子→トロンビン（pH7.4超の溶液）の順で交互吸着させることができる。
また、酸性高分子、塩基性高分子の両方とトロンビンを交互吸着させる場合は、
（iii）酸性高分子→トロンビン（pH7.4未満の溶液）→塩基性高分子→酸性高分子→トロンビン（pH7.4超の溶液）→塩基性高分子の順、又は
（iv）塩基性高分子→トロンビン（pH7.4超の溶液）→酸性高分子→塩基性高分子→トロンビン（pH7.4超の溶液）→塩基性高分子の順などの順番により交互吸着させることができる。ただし、交互吸着の順序はこれらに限定されない。
具体例としては、コンドロイチン硫酸→トロンビン（pH６から７）→キトサン（pＨ７.４超）の順で交互吸着させる場合などが挙げられる。
The order of immersion is preferably such that the charges alternate.
For example, when adsorbing thrombin alternately with either acidic polymer or base polymer,
(I) acidic polymer → thrombin (solution below pH 7.4) → acid polymer → thrombin (solution below pH 7.4) or (ii) basic polymer → thrombin (solution above pH 7.4) ) → basic polymer → thrombin (solution of pH 7.4 or higher) in this order.
When alternately adsorbing both acidic and basic polymers and thrombin,
(Iii) acidic polymer → thrombin (solution below pH 7.4) → basic polymer → acidic polymer → thrombin (solution above pH 7.4) → basic polymer, or (iv) basic high It can be alternately adsorbed in the order of molecule → thrombin (solution of pH 7.4) → acid polymer → basic polymer → thrombin (solution of pH 7.4) → basic polymer. However, the order of alternate adsorption is not limited to these.
As a specific example, the case of alternately adsorbing in the order of chondroitin sulfate → thrombin (
トロンビンの放出速度は使用する高分子の荷電および分子量によっても調整出来る。
すなわち、（I）（II）のように酸性高分子又は塩基高分子のいずれか一方とトロンビンを交互吸着させた場合は、生体内において放出の比較的速いトロンビン含有医薬製剤が得られる。トロンビンの等電点は約７．４であり、血液等生理的pＨに近い。よって使用時に血液や体液に接触したトロンビンの電荷はほぼ中性になる。この為電荷を有する高分子とトロンビン間のイオン結合が消失または著しく低下し、すみやかに放出されると思われる。
この場合、ビーズ状の支持体に固定化することで出血性の胃潰瘍などに対する経口用途の止血剤として用いることも可能である。
一方、（III）（IV）のように酸性高分子及び塩基性高分子の両方とトロンビンを交互吸着させ
た場合、すなわち、トロンビンが酸性高分子と塩基性高分子にはさまれるように交互吸着させた場合、特に、はさまれた構造が複数連続している場合は、トロンビンの放出速度が遅くなり、徐放性のトロンビン含有医薬製剤が得られる。この理由は、投与時、生理的条件（例えばpＨ7.4）においてトロンビン（等電点pＨ7.4）の電荷は消失して結合は解かれるが、酸性高分子及び塩基性高分子間の結合は保持される為と考えられる。
このような医薬製剤は、長時間治癒効果を発揮する為に効果が長時間持続する必要のある創傷治療剤などとして使用することが出来る。
The thrombin release rate can also be adjusted by the charge and molecular weight of the polymer used.
That is, when either acidic polymer or base polymer and thrombin are alternately adsorbed as in (I) and (II), a thrombin-containing pharmaceutical preparation that is relatively rapidly released in vivo can be obtained. The isoelectric point of thrombin is about 7.4, which is close to physiological pH such as blood. Therefore, the charge of thrombin that comes into contact with blood or body fluid during use becomes almost neutral. For this reason, the ionic bond between the charged polymer and thrombin disappears or remarkably decreases, and it is considered that the ion is released promptly.
In this case, it can also be used as a hemostatic agent for oral use against hemorrhagic gastric ulcer and the like by immobilizing it on a bead-like support.
On the other hand, when both acidic and basic polymers and thrombin are alternately adsorbed as in (III) and (IV), that is, thrombin is alternately adsorbed so that it is sandwiched between acidic and basic polymers. In particular, when a plurality of sandwiched structures are continuous, the thrombin release rate becomes slow, and a sustained-release thrombin-containing pharmaceutical preparation is obtained. The reason for this is that at the time of administration, the charge of thrombin (isoelectric point pH 7.4) disappears under physiological conditions (eg pH 7.4) and the bond is released, but the bond between acidic polymer and basic polymer is It is thought to be retained.
Such a pharmaceutical preparation can be used as a wound treatment agent or the like whose effect needs to last for a long time in order to exhibit a long-term healing effect.
不織布を支持体として用いたものとして、例えば、キチン不織布にコンドロイチン硫酸、キトサンとトロンビンを交互吸着させた医薬製剤が挙げられる。殆ど電荷を有していないキチン不織布上にキトサンやコンドロイチン硫酸等の荷電を有する高分子を塗布や交互吸着によって積層させて、さらにその上にトロンビンとそれらの高分子とを交互吸着させることで本発明の医薬製剤を得ることが出来る。
また、アルギン酸を用いたものとして、アルギン酸不織布にキトサンやコンドロイチン硫酸等の荷電を有する高分子を塗布や交互吸着などで積層させて、さらにその上にトロンビンとそれらの高分子とを交互吸着させて得られる医薬製剤を挙げることが出来る。
一般に、トロンビン溶液に不織布を浸し単純に凍結乾燥した場合にはトロンビンが固定化しない、もしくは、塩、アミノ酸、糖類などを含有する溶液を用いた場合、その組成に
よっては不織布の柔軟性が失われる。一方、上記のような方法にて不織布上で交互吸着を行った場合においては、常温でトロンビンが固定化し、しかも、不織布の柔軟性が損なわれることは無い。
As a thing using a nonwoven fabric as a support body, the pharmaceutical formulation which made the chitin nonwoven fabric adsorb | suck chondroitin sulfate, chitosan, and thrombin alternately is mentioned, for example. This is done by laminating a charged polymer such as chitosan or chondroitin sulfate on a chitin non-woven fabric that has almost no charge, and then adsorbing thrombin and these polymers alternately on it. The pharmaceutical preparation of the invention can be obtained.
In addition, using alginic acid, a charged polymer such as chitosan or chondroitin sulfate is laminated on an alginate nonwoven fabric by alternating adsorption or the like, and thrombin and those polymers are alternately adsorbed on it. Mention may be made of the pharmaceutical preparations obtained.
Generally, when a non-woven fabric is dipped in a thrombin solution and simply lyophilized, thrombin does not fix, or when a solution containing salt, amino acid, saccharide, etc. is used, the non-woven fabric may lose its flexibility depending on its composition . On the other hand, when alternating adsorption is performed on the nonwoven fabric by the method as described above, thrombin is fixed at room temperature, and the flexibility of the nonwoven fabric is not impaired.
高分子フィルムを支持体として用いたものとして、例えば、軟性塩化ビニル上にキトサン又はアルギン酸等を吸着させ、その上にトロンビンを吸着させたものなどが挙げられる。
一般的に塩や高分子等と蛋白質をフィルム上で凍結乾燥した場合は、これらがフィルムに固定化しない、もしくはフィルムに固定化した場合でもフィルムの物理的性質（柔軟性）が失われることが多い。しかしながら、本発明のように交互吸着にてフィルム上にトロンビンを固定化した場合に、フィルムの物理的性質（柔軟性）が損なわれることは殆ど無い。
創傷治癒においては、「創傷治療の常識非常識」（三輪書店）、「これからの創傷治療」（医学書院）などにおいて、創傷及び床ずれ等の患部を乾燥させず、湿潤状況下に保つ事で良好な治癒が期待される事が記載されている。即ち、サランラップ（登録商標）等により患部を覆うだけでも良好な治癒が期待される（褥瘡のラップ療法）ことが知られている。
したがって、本発明の高分子フィルムにトロンビンを交互吸着させた医薬製剤のように、柔軟性を保持し、且つトロンビンを除放することのできるフィルム状医薬製剤を用いることで、湿潤療法（ラップ療法）にさらにトロンビンによる創傷治癒促進効果を付与した創傷治療フィルムを容易に得ることができる。
As what used a polymer film as a support body, what adsorb | sucked thrombin on chitosan or alginic acid etc. on soft vinyl chloride, for example is mentioned.
In general, when salts, polymers, and proteins and proteins are lyophilized on a film, they may not be immobilized on the film, or even if they are immobilized on the film, the physical properties (flexibility) of the film may be lost. Many. However, when thrombin is immobilized on the film by alternating adsorption as in the present invention, the physical properties (flexibility) of the film are hardly impaired.
In wound healing, it is good to keep the affected areas such as wounds and bedsores in a damp condition without being dried in "common sense insane knowledge of wound treatment" (Miwa Shoten), "future wound treatment" (Medical School), etc. It is described that a good healing is expected. That is, it is known that good healing is expected only by covering the affected area with Saran Wrap (registered trademark) or the like (decubitus wrap therapy).
Therefore, by using a film-form pharmaceutical preparation that retains flexibility and can release thrombin like a pharmaceutical preparation in which thrombin is alternately adsorbed to the polymer film of the present invention, wet therapy (lap therapy) ) And a wound healing film provided with the effect of promoting wound healing by thrombin can be easily obtained.
本発明の医薬製剤において支持体上に交互吸着させるトロンビンは、血液凝固作用及び／又は細胞増殖促進作用などの薬効を有する限り、特に制限されず、ヒトのトロンビンであってもよいし、非ヒト動物のトロンビンであってもよい。ただし、本発明の医薬製剤を人に適用する場合は、ヒト由来トロンビン又は牛由来トロンビンを用いることが好ましい。野生型ヒトトロンビンのアミノ酸配列は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔのデータベースにアクセション番号Ｐ００７３４として開示されている。
トロンビンは、例えば、ヒト又は非ヒト動物から精製したものを用いることができる。例えば、ヒト又は非ヒト動物などの血漿から抽出して精製したプロトロンビンにカルシウム塩とトロンボプラスチンを作用させることにより得られるトロンビンを用いることができる。
また、トロンビンは、市販のものを用いてもよいし、化学合成したものを用いてもよい。
さらに、トロンビンは、遺伝子組換えにより得られるトロンビンを用いることもできる。例えば、ヒトや非ヒト動物のトロンビン遺伝子やプロトロンビン遺伝子を、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの宿主で発現させることにより生産される組換えトロンビンを用いてもよい。プロトロンビンを組換え生産する場合は、得られたプロトロンビンをエカリンなどで活性化して用いる。組換えトロンビンの製造方法の詳細については、例えば、国際公開０３／００４６４１号パンフレットを参照できる。
The thrombin alternately adsorbed on the support in the pharmaceutical preparation of the present invention is not particularly limited as long as it has a drug effect such as blood coagulation action and / or cell growth promotion action, and may be human thrombin or non-human. It may be animal thrombin. However, when the pharmaceutical preparation of the present invention is applied to humans, it is preferable to use human-derived thrombin or bovine-derived thrombin. The amino acid sequence of wild type human thrombin is disclosed as Accession No. P00734 in the Swissprot database.
As the thrombin, for example, one purified from a human or non-human animal can be used. For example, thrombin obtained by allowing calcium salt and thromboplastin to act on prothrombin extracted and purified from plasma of human or non-human animals can be used.
As thrombin, a commercially available product or a chemically synthesized product may be used.
Furthermore, thrombin obtained by gene recombination can also be used as thrombin. For example, recombinant thrombin produced by expressing a human or non-human animal thrombin gene or prothrombin gene in a host such as Escherichia coli, yeast, insect cells, or animal cells may be used. When recombinantly producing prothrombin, the obtained prothrombin is activated with ecarin or the like. The details of the method for producing recombinant thrombin can be referred to, for example, International Publication No. 03/004641.
支持体にトロンビンを固定化し、そのトロンビン上にさらに一回又は複数回の交互吸着によって塩基性高分子または酸性高分子を積層する。この時、最表層を高分子にすることにより、固定化したトロンビンの酵素活性の安定性を飛躍的に増すことが可能である。安定性が増すことで医薬製剤として使用する場合に室温で長期間保存することが可能となる。
通常、トロンビン等の蛋白質を室温下、真空管層または送風等によって乾燥させた場合完全に活性を失うが、交互吸着法によってトロンビンを支持体に固定化した場合、支持体は凍結乾燥せずに室温で真空乾燥または室温で送風等によって乾燥した場合でもトロンビン活性を有する。
真空乾燥又は送風乾燥は凍結乾燥に比較すると簡便な工程で行うことが出来る。
Thrombin is immobilized on the support, and a basic polymer or acidic polymer is further laminated on the thrombin by one or more alternate adsorptions. At this time, the stability of the enzyme activity of the immobilized thrombin can be dramatically increased by using a polymer as the outermost layer. Increased stability enables long-term storage at room temperature when used as a pharmaceutical formulation.
Usually, when a protein such as thrombin is dried at room temperature by vacuum tube layer or air blowing, the activity is completely lost, but when thrombin is immobilized on the support by the alternate adsorption method, the support is not lyophilized at room temperature. And thrombin activity even when dried by vacuum drying or blowing at room temperature.
Vacuum drying or blow drying can be performed by a simple process as compared with freeze drying.
本発明の医薬製剤はトロンビンの薬効を利用した医薬製剤として用いることができる。例えば、トロンビンの止血作用を利用した止血剤として用いることができる。トロンビンの細胞増殖促進作用、血管新生促進作用を利用した創傷治療剤として用いることもできる。
本発明の医薬製剤は、例えば、シート状にし、創傷部位や止血部位に貼ることによって用いることができる。
The pharmaceutical preparation of the present invention can be used as a pharmaceutical preparation utilizing the medicinal effect of thrombin. For example, it can be used as a hemostatic agent utilizing the hemostatic action of thrombin. It can also be used as a therapeutic agent for wounds utilizing thrombin's cell growth promoting action and angiogenesis promoting action.
The pharmaceutical preparation of the present invention can be used, for example, by making it into a sheet and sticking it to a wound site or a hemostatic site.
［実施例１］
軟性塩化ビニルフィルム（４ｃｍ×５ｃｍ）（タフ二―ル、100μm、日本ウェーブロック社製）にコロナ処理（SOFTAL社製 electronic GmbH Hamburg Type3003）を行い、1mg/mlのキトサン（和光純薬社製、キトサン1000）0.１％酢酸溶液100mlに浸漬した後、室温にて真空状態で乾燥させた。
乾燥後のフィルムを下記溶液A,B,Cの順を1サイクルとし、それぞれの溶液に順に２０分ずつ４回浸漬した。溶液A,B,C浸漬終了時に精製水（100ｍｌ）に1分間浸漬して洗浄した。
溶液A；0.01%コンドロイチン硫酸（和光純薬社製）（水酸化ナトリウムでpH8.5に調製）
溶液B；トロンビン溶液（１０μｇ/ml バッファー組成10mM Tris-HCl pH8.5）
溶液C；0.01%キトサン溶液（和光純薬社製、キトサン水溶性）（水酸化ナトリウムでpH8.5に調製）
サンプルとして1サイクル目と4サイクル目の浸漬が終了したフィルムから洗浄時に浸漬した精製水を十分切った後、それぞれ1cm2切り抜き、１M NaCl 50mM NaHCO3 1ｍｌに2時間浸しトロンビンを完全に溶出させた後、溶出したトロンビン活性をchromozyme TH （SIGMA社製）によって測定した。測定に際しては、予めchromozyme THを用いて測定した標準トロンビン活性の検量線から換算した。イオン結合でトロンビンを高分子に結合しただけではトロンビンの活性は殆ど損なわれないので、便宜的にトロンビンの活性が全く損なわれていないものと仮定し、得られたトロンビン活性値から、溶出したトロンビン量を算出し、トロンビンの固定化量とした。結果は、1サイクル目のフィルムからの溶出は0.4μｇ/ｃｍ2、４サイクル目のフィルムからの溶出は1.3μｇ/ｃｍ2であった。
[Example 1]
Soft vinyl chloride film (4cm x 5cm) (Tough Neil, 100μm, manufactured by Nippon Wavelock Co., Ltd.) is corona treated (SOFTAL Electronic GmbH Hamburg Type3003), and 1mg / ml chitosan (Wako Pure Chemicals, Chitosan 1000) was immersed in 100 ml of a 0.1% acetic acid solution and then dried in vacuum at room temperature.
The dried film was immersed in the respective solutions A, B, and C in the order of one cycle, and each solution was soaked four times for 20 minutes. At the end of immersion of solutions A, B, and C, they were immersed in purified water (100 ml) for 1 minute for cleaning.
Solution A: 0.01% chondroitin sulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (adjusted to pH 8.5 with sodium hydroxide)
Solution B: Thrombin solution (10 μg /
Solution C: 0.01% chitosan solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, water-soluble chitosan) (adjusted to pH 8.5 with sodium hydroxide)
Thoroughly elute thrombin by thoroughly cutting out the purified water soaked at the time of washing from the film after the first cycle and the fourth cycle soaking as a sample, then cutting out 1 cm 2 each and soaking in 1 ml of
［実施例２］
キチン不織布（３ｃｍ×３ｃｍ；べスキチン、ユニチカ社製）を1mg/mlのキトサン（和光純薬社製、キトサン1000）0.1%酢酸溶液100mlに浸漬した後、室温にて真空状態で乾燥させた。
乾燥後のキチン不織布を溶液A,B,Cの順を1サイクルとし、それぞれの溶液に順に２０分ずつ浸漬した。実施例１同様にA,B,C浸漬の終了時に精製水（100ｍｌ）に1分間浸漬し洗浄した。
サンプルとして各サイクル終了毎の不織布から洗浄時に浸漬した精製水を十分切った後、１ｃｍ2ずつ切り取り、それぞれ1M NaCl 50mM NaHCO3 1ｍｌに浸しトロンビンを完全に溶出させた後、溶出したトロンビン固定化量を実施例１同様に測定した。各サイクルにおけるサンプルのトロンビン固定化量は図1のようになった。
[Example 2]
A chitin non-woven fabric (3 cm × 3 cm; Besquitin, manufactured by Unitika Co., Ltd.) was immersed in 100 ml of a 1 mg / ml chitosan (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Chitosan 1000) 0.1% acetic acid solution, and then dried at room temperature in a vacuum state.
The dried chitin nonwoven fabric was immersed in each solution for 20 minutes in order, with the order of solutions A, B, and C as one cycle. In the same manner as in Example 1, at the end of the A, B, C immersion, it was immersed in purified water (100 ml) for 1 minute and washed.
Thoroughly cut the purified water soaked from the nonwoven fabric at the end of each cycle as a sample, cut 1 cm 2 at a time, soak each in 1 ml of
［実施例３］
アルギン酸不織布（４×４cm；ソーブサンプラス、アルケア社製）を直接、溶液Ｃ、Ａ、Ｂの順を1サイクルとし、それぞれの溶液に２０分ずつ４回浸漬した。実施例１同様にA,B,C浸漬終了時に精製水（100ｍｌ）に1分間浸漬し洗浄した。
サンプルとして各サイクル終了毎の不織布から洗浄時に浸漬した精製水を十分切った後
、１ｃｍ2ずつ切り取り それぞれ1M NaCl 50mM NaHCO3 1ｍｌに浸しトロンビンを完全に溶出させた後、溶出したトロンビン活性をchromozyme TH （SIGMA社製）によって測定した。各サンプルのトロンビン固定化量を実施例１同様に測定した。各サイクルにおけるサンプルのトロンビン固定化量は図２のようになった。
[Example 3]
Alginic acid non-woven fabric (4 × 4 cm; Sorb Samplus, manufactured by ALCARE) was directly immersed in each solution four times for 20 minutes with the order of solutions C, A, and B as one cycle. In the same manner as in Example 1, at the end of immersion in A, B and C, the sample was immersed in purified water (100 ml) for 1 minute and washed.
Thoroughly cut the purified water soaked from the nonwoven fabric at the end of each cycle as a sample, and then cut 1 cm 2 at a time. Each soaked in 1 ml of
［実施例４］
キチン不織布（３ｃｍ×３ｃｍ；べスキチン、ユニチカ社製）を直接、溶液A,B,C,Aの順に２０分間ずつ浸漬した。浸漬の終了時に精製水（100ｍｌ）に1分間浸漬し洗浄した。得られた不織布を凍結乾燥しハイバリア専用保存袋（アズワン社製）にアイディ乾燥剤(アズワン社製)を入れ密閉し、３７℃にて２週間保存し、保存前後の固定化トロンビン量を実施例１同様に測定比較した。凍結乾燥前は1.17μｇ/ｃｍ2であったのに対し、凍結乾燥直後は0.873μｇ／ｃｍ2であり、凍結乾燥してもトロンビンの固定化量、活性とも低下は認められなかった。また、１週間保存後は1.01μｇ/ｃｍ2、2週間後は0.926μg/cm2であり、凍結乾燥前に比べ活性低下は認められなかった。
[Example 4]
A chitin non-woven fabric (3 cm × 3 cm; Besquitin, manufactured by Unitika Ltd.) was directly immersed for 20 minutes in the order of solutions A, B, C, A. At the end of the immersion, it was immersed in purified water (100 ml) for 1 minute and washed. The obtained non-woven fabric was freeze-dried and sealed with a high-barrier storage bag (manufactured by AS ONE) with IDY desiccant (manufactured by AS ONE) sealed and stored at 37 ° C. for 2 weeks. The measurement was compared in the same manner. While pre-lyophilization was 1.17μg / cm 2, after freeze-drying was 0.873μg / cm 2, the amount of immobilized thrombin and lyophilized to decrease both activities were observed. Moreover, after storage for 1 week, it was 1.01 μg / cm 2 , and after 2 weeks it was 0.926 μg / cm 2 , and no decrease in activity was observed compared to before lyophilization.
［実施例５］
キチン不織布（３ｃｍ×３ｃｍ；ベスキチン、ユニチカ社製）を直接、溶液A,B,C,A,B,C,A,Bの順に２０分間ずつ浸漬した。浸漬の終了時に精製水（100ｍｌ）に1分間浸漬し洗浄した。得られた不織布を凍結乾燥しハイバリア専用保存袋（アズワン社製）に アイディ乾燥剤(アズワン社製)を入れ密閉し、３７℃にて３週間保存し、保存前後の固定化トロンビン量を実施例１同様に測定比較した。保存前、１０日後、１７日後のトロンビン活性を図３に示す。17日後も凍結乾燥前と同等の活性を保持していることがわかった。
[Example 5]
A chitin non-woven fabric (3 cm × 3 cm; Besquitin, manufactured by Unitika) was directly immersed for 20 minutes in the order of solutions A, B, C, A, B, C, A, B. At the end of the immersion, it was immersed in purified water (100 ml) for 1 minute and washed. The obtained non-woven fabric was freeze-dried and sealed in a high barrier storage bag (manufactured by AS ONE) with AID desiccant (manufactured by AS ONE), sealed, stored at 37 ° C for 3 weeks, and the amount of immobilized thrombin before and after storage was measured. The measurement was compared in the same manner. The thrombin activity after 10 days, 17 days after storage is shown in FIG. After 17 days, it was found that the same activity as before lyophilization was retained.
［比較例１］
キチン不織布（３ｃｍ×３ｃｍ；べスキチン、ユニチカ社製）を溶液A,Bの順に２０分間ずつ浸漬した。溶液A,Bの浸漬終了時にそれぞれ精製水100ｍｌに1分間浸漬し洗浄した。得られた不織布を凍結乾燥しハイバリア専用保存袋（アズワン社製）にアイディ乾燥剤（アズワン社製）に入れ密閉し、３７℃にて１週間保存し、保存前後の固定化トロンビン量を実施例１同様に測定した。凍結乾燥前は1.2μｇ/ｃｍ2であったのに対し１週間保存後は0.60μｇ/ｃｍ2でありトロンビンの固定化量および活性は半分に低下した。
[Comparative Example 1]
A chitin nonwoven fabric (3 cm × 3 cm; Besquitin, manufactured by Unitika Co., Ltd.) was immersed in the order of solutions A and B for 20 minutes each. At the end of immersion of solutions A and B, each was immersed in 100 ml of purified water for 1 minute and washed. The obtained non-woven fabric was freeze-dried, sealed in a high barrier exclusive storage bag (manufactured by ASONE) in an ID drying agent (manufactured by ASONE), sealed, stored at 37 ° C. for 1 week, and the amount of immobilized thrombin before and after storage was measured. 1 was measured. After 1 week storage while pre-lyophilization was 1.2 ug / cm 2 is immobilized amount and activity of thrombin was 0.60μg / cm 2 was reduced by half.
［実施例６］
実施例１記載の方法で軟性塩化ビニル上に溶液A,B,Cの順に２０分間ずつ2サイクル浸漬して固定化した後、25℃にて真空状態で3時間乾燥した。
実施例１の方法に従い活性を測定したところ、乾燥前のトロンビン固定化量は0.037μｇ/ｍｌであり乾燥後のトロンビン固定化量は0.024μｇ/ｍｌであった。交互吸着によってトロンビンを固定化した場合、常温にて真空乾燥した場合でも６０％以上の活性が保存されることがわかった。
[Example 6]
The solution A, B, C was immersed in soft vinyl chloride for 2 minutes in the order of 20 minutes in the manner described in Example 1 for immobilization, and then dried at 25 ° C. in a vacuum state for 3 hours.
When the activity was measured according to the method of Example 1, the amount of thrombin immobilized before drying was 0.037 μg / ml, and the amount of thrombin immobilized after drying was 0.024 μg / ml. It was found that when thrombin was immobilized by alternating adsorption, 60% or more of the activity was preserved even when vacuum dried at room temperature.
［実施例７］
キチン不織布（３ｃｍ×３ｃｍ；べスキチン、ユニチカ）を1mg/mlのキトサン（和光純薬社製、キトサン1000）0.1%酢酸溶液100mlに浸漬後、室温にて真空状態で乾燥させた。
乾燥後のキチン不織布を溶液B,C,B,C,B,C,Bの順に２０分間ずつ浸した。溶液B,Cの浸漬終了時にそれぞれ精製水100ｍｌに1分間浸漬し洗浄した。
不織布から洗浄時に浸漬した精製水を十分切った後、得られたトロンビン固定化キチン不織布をPBS（リン酸緩衝化生理食塩水 pH7.4）に浸し15分、30分、45分、1200分後のサンプルを作成し、活性測定を実施例１と同様に行った。得られた活性の結果を図４に示す。図４の縦軸は、トロンビン固定化キチン不織布を1cm2数箇所切り抜き、50mM NaHCO3 と1M
NaCl 1mlとの混合液に2時間浸漬し、トロンビンを完全に溶出させて求めた吸着量に対する各サンプルの溶出量の百分比である。この結果、キトサンとトロンビンによる交互吸着
体はPBS中において15分以内にほぼ全てのトロンビンが不織布より溶出されたことが判った。
[Example 7]
A chitin nonwoven fabric (3 cm × 3 cm; Besquitin, Unitika) was immersed in 100 ml of a 1 mg / ml chitosan (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Chitosan 1000) 0.1% acetic acid solution, and dried in a vacuum state at room temperature.
The dried chitin nonwoven fabric was soaked in the order of solutions B, C, B, C, B, C, B for 20 minutes. At the end of immersion of solutions B and C, each was immersed in 100 ml of purified water for 1 minute and washed.
After thoroughly purifying the purified water soaked from the nonwoven fabric during washing, the resulting thrombin-immobilized chitin nonwoven fabric is immersed in PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) for 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, and 1200 minutes. The sample was prepared and the activity was measured in the same manner as in Example 1. The results of the activity obtained are shown in FIG. The vertical axis in FIG. 4 is a cutout of several 1 cm 2 portions of a thrombin-immobilized chitin nonwoven fabric, 50 mM NaHCO 3 and 1 M
It is the percentage of the elution amount of each sample with respect to the adsorption amount obtained by immersing in a mixed solution with 1 ml of NaCl for 2 hours to completely elute thrombin. As a result, it was found that almost all thrombin was eluted from the non-woven fabric within 15 minutes in PBS by the alternating adsorbent of chitosan and thrombin.
［実施例８］
キチン不織布（３ｃｍ×３ｃｍ；べスキチン、ユニチカ社製）を溶液A,B,C,A,B,C,A,B,C,A,Bの順に２０分間ずつ浸した。溶液A,B,Cの浸漬終了時にそれぞれ精製水100ｍｌに1分間浸漬し洗浄した。
洗浄時に浸漬した精製水を十分切った後、得られたトロンビン固定化キチン不織布をPBS（pH7.4）に浸し、30分、45分、60分、120分、210分、360分後のサンプルを作成し、活性測定を実施例１と同様に行った。得られた活性を図５に示す。縦軸は図４と同じである。この結果より、コンドロイチン硫酸、トロンビン、キトサンの交互吸着体はPBS中において、6時間にわたり徐々にトロンビンが不織布より溶出することが判る。また、実施例７のキトサン、トロンビンにより交互吸着法で固定化された場合に比較し、より、ゆっくり溶出されることが判った。
[Example 8]
A chitin non-woven fabric (3 cm × 3 cm; Besquitin, manufactured by Unitika) was immersed for 20 minutes in the order of solutions A, B, C, A, B, C, A, B, C, A, B. At the end of immersion of solutions A, B, and C, each was immersed in 100 ml of purified water for 1 minute and washed.
Thoroughly drain the purified water soaked at the time of washing, soak the resulting thrombin-immobilized chitin nonwoven fabric in PBS (pH 7.4), and sample after 30 minutes, 45 minutes, 60 minutes, 120 minutes, 210 minutes, 360 minutes The activity was measured in the same manner as in Example 1. The obtained activity is shown in FIG. The vertical axis is the same as in FIG. From this result, it can be seen that thrombin gradually elutes from the nonwoven fabric over 6 hours in the alternating adsorbent of chondroitin sulfate, thrombin, and chitosan in PBS. In addition, it was found that elution was performed more slowly than in the case of immobilization by the alternate adsorption method with chitosan and thrombin in Example 7.
［実施例９］
キチン不織布（４×４ｃｍ、ベスキチン、ユニチカ社製）を下記の溶液D,E,D,E, D,E,D,Eの順にそれぞれ２０分間浸漬した。溶液D,Eの浸漬終了時にそれぞれ精製水100ｍｌに1分間浸漬し洗浄した。
不織布から洗浄時に浸漬した精製水を十分切った後、得られたトロンビン固定化キチン不織布をPBS（pH7.4）に浸し、3分、5分、15分、120分後のサンプルを作成し、活性測定を実施例１と同様に行った。得られた活性を図６に示す。縦軸は図４と同じである。この結果、アルギン酸、トロンビンの交互吸着体はPBS中において、3分後に約８０％のトロンビンが溶出されることが判った。
D：0.01%アルギン酸（和光純薬社製、アルギン酸、非膨潤性）水溶液を水酸化ナトリウムでpH6に調製。
E：10μg/mlトロンビン溶液（10mM リン酸バッファー、pH6）
[Example 9]
Chitin nonwoven fabric (4 × 4 cm, Besquitin, manufactured by Unitika) was immersed in the following solutions D, E, D, E, D, E, D, and E for 20 minutes, respectively. At the end of immersion of solutions D and E, each was immersed in 100 ml of purified water for 1 minute and washed.
After thoroughly purifying the purified water soaked at the time of washing from the nonwoven fabric, the obtained thrombin-immobilized chitin nonwoven fabric is immersed in PBS (pH 7.4), and samples after 3 minutes, 5 minutes, 15 minutes, 120 minutes are created, The activity measurement was performed in the same manner as in Example 1. The obtained activity is shown in FIG. The vertical axis is the same as in FIG. As a result, it was found that about 80% of thrombin was eluted after 3 minutes in the alternating adsorbate of alginic acid and thrombin in PBS.
D: An aqueous solution of 0.01% alginic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., alginic acid, non-swellable) was adjusted to
E: 10 μg / ml thrombin solution (10 mM phosphate buffer, pH 6)
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009128474A1 (en) | 2008-04-16 | 2009-10-22 | 財団法人化学及血清療法研究所 | Method of producing thrombin-immobilized bioabsorbable sheet preparation |
| WO2010143711A1 (en) * | 2009-06-11 | 2010-12-16 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | Wound-covering material |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000510357A (en) * | 1996-04-04 | 2000-08-15 | イムノ・アクチエンゲゼルシャフト | Hemostatic sponge based on collagen |
| JP2002515300A (en) * | 1998-05-19 | 2002-05-28 | ジ アメリカン ナショナル レッド クロス | Hemostatic sandwich bandage |
| JP2006503612A (en) * | 2002-09-10 | 2006-02-02 | アメリカン ナショナル レッド クロス | Hemostatic bandage |
| WO2006025592A1 (en) * | 2004-08-31 | 2006-03-09 | Oxygenix Co., Ltd. | Thin-filmy polymeric structure and method of preparing the same |
| WO2006033433A1 (en) * | 2004-09-24 | 2006-03-30 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Wound remedy |
-
2005
- 2005-04-27 JP JP2005129567A patent/JP2006306759A/en active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000510357A (en) * | 1996-04-04 | 2000-08-15 | イムノ・アクチエンゲゼルシャフト | Hemostatic sponge based on collagen |
| JP2002515300A (en) * | 1998-05-19 | 2002-05-28 | ジ アメリカン ナショナル レッド クロス | Hemostatic sandwich bandage |
| JP2006503612A (en) * | 2002-09-10 | 2006-02-02 | アメリカン ナショナル レッド クロス | Hemostatic bandage |
| WO2006025592A1 (en) * | 2004-08-31 | 2006-03-09 | Oxygenix Co., Ltd. | Thin-filmy polymeric structure and method of preparing the same |
| WO2006033433A1 (en) * | 2004-09-24 | 2006-03-30 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Wound remedy |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009128474A1 (en) | 2008-04-16 | 2009-10-22 | 財団法人化学及血清療法研究所 | Method of producing thrombin-immobilized bioabsorbable sheet preparation |
| US9149557B2 (en) | 2008-04-16 | 2015-10-06 | The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Process for preparing bioabsorbable sheet preparation holding thrombin |
| WO2010143711A1 (en) * | 2009-06-11 | 2010-12-16 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | Wound-covering material |
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