JP2006304673A - Method for enhancing substrate specificity of cysteine synthase for phosphoserine - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for enhancing the substrate specificity of a cysteine synthase for phosphoserine. <P>SOLUTION: The method for enhancing the substrate specificity of the cysteine synthase for the phosphoserine is carried out as follows. An arginine or lysine residue is introduced into a specific position in the cysteine synthase having no arginine or lysine residue in a specified designated position of a substrate specificity determinant domain region of the cysteine synthase derived from Aeropyrum pernix. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、システイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性を高める方法に関する。また、本発明はシステイン合成酵素の結晶に関する。さらに本発明は、システインまたはその誘導体の製造方法に関する。   The present invention relates to a method for increasing the substrate specificity of cysteine synthase for phosphoserine. The present invention also relates to crystals of cysteine synthase. The present invention further relates to a method for producing cysteine or a derivative thereof.

超好熱性古細菌アエロパイラム ペルニックスに見出されたシステイン合成酵素は、３
８９残基のアミノ酸からなり、ゲノム解析結果（非特許文献１）からは、O-アセチルセリンとスルフィドからシステインと酢酸を合成する反応を触媒するアセチルセリンスルフヒドリル化酵素(OASS)（反応式１）とアサインされていた。 Cysteine synthase found in the hyperthermophilic archaeon Aeropyram pernicus is 3
The acetylserine sulfhydrylase (OASS), which consists of 89 amino acids and catalyses the reaction of synthesizing cysteine and acetic acid from O-acetylserine and sulfide (Non-Patent Document 1) Was assigned.

しかし、その機能解析の結果、本酵素はアセチルセリンスルフヒドリル化反応だけでなく、ホスホセリンスルフヒドリル化反応(OPSS)（反応式２）も行える新酵素であることが分かった（非特許文献２）。   However, as a result of functional analysis, it was found that this enzyme is a new enzyme capable of performing not only acetylserine sulfhydrylation reaction but also phosphoserine sulfhydrylation reaction (OPSS) (reaction formula 2) (Non-patent Document 2).

ホスホセリンはアセチルセリンと比較して耐熱性が高いため、超好熱性微生物がOPSS活性を持つことは納得できる。   Since phosphoserine has higher heat resistance than acetylserine, it is understandable that hyperthermophilic microorganisms have OPSS activity.

システインおよびその誘導体を酵素を用いて合成する場合、基質の安定性および価格面から、O-アセチルセリンよりもホスホセリンの使用が好まれる。
Kawarabayasi, Y. et al. Complete genome sequence of an aerobic hyper-thermophilic crenarchaeon, Aeropyrum pernix K1. DNA Res. 6, 83-101 (1999) Mino, K. and Ishikawa, K. A novel O-phosphoserine sulfhydrylation reaction catalyzed by O-acetylserine sulfhydrylase from Aeropyrum pernixK1. FEBS Lett. 551, 133-138 (2003) When cysteine and its derivatives are synthesized using an enzyme, phosphoserine is preferred over O-acetylserine in terms of substrate stability and price.
Kawarabayasi, Y. et al. Complete genome sequence of an aerobic hyper-thermophilic crenarchaeon, Aeropyrum pernix K1.DNA Res. 6, 83-101 (1999) Mino, K. and Ishikawa, K. A novel O-phosphoserine sulfhydrylation reaction catalyzed by O-acetylserine sulfhydrylase from Aeropyrum pernixK1. FEBS Lett. 551, 133-138 (2003)

本発明は、システイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性をより高めることを目的とする。   An object of the present invention is to further increase the substrate specificity of cysteine synthase for phosphoserine.

また、本発明はシステイン合成酵素の結晶を提供することを目的とする
さらに本発明は、システインまたはその誘導体の製造方法を提供することを目的とする。 Another object of the present invention is to provide a method for producing cysteine or a derivative thereof.

本発明は、システイン合成酵素の結晶、システイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性を高める方法およびホスホセリンを基質としてシステインまたはその誘導体を製造する方法を提供するものである。
１． ホスホセリンに対する基質特異性を有するシステイン合成酵素の結晶であって、単位格子定数がa=b=78.87Å, c=275.91Åである、上記結晶。
２． 配列番号１の２９７位および／または２９８位に対応する位置にアルギニンまたはリジン残基を有しないシステイン合成酵素において、該２９７位および／または２９８位にアルギニンまたはリジン残基を導入することを特徴とするシステイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性を高める方法。
３． 配列番号１の２９７位および／または２９８位に対応する位置にアルギニンまたはリジン残基を有するシステイン合成酵素において、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐに対応する以下の位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換することを特徴とするシステイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性を高める方法：
(1) 配列番号１の２９５位、２９６位及び２９９位に対応するアミノ酸残基の群から選ばれる少なくとも１種；
(2) 配列番号１の１５３位（Ｓｅｒ）、２０２位（Ｓｅｒ）、２０３位（Ｔｈｒ）、２２５位（Ｐｈｅ）及び２６２位（Ｔｈｒ）に対応するアミノ酸残基の群から選ばれる少なくとも１種。
４． ホスホセリンを、配列番号１の２９７位および／または２９８位に対応する位置にアルギニンまたはリジン残基を有するシステイン合成酵素（但し、配列番号１に記載のＯＰＳＳ．Ａｐ由来のシステイン合成酵素を除く）及びＳＨ基含有化合物と反応させることを特徴とする、システインまたはその誘導体の製造方法。
５． 前記システイン合成酵素が、以下の(i)〜(viii)のいずれかに記載のシステイン合
成酵素である請求項４に記載のシステインの製造方法：
(i)配列番号２に記載のスルフォロバス トコダイイ アセチルセリンスルフヒドリル化
酵素（OASS.St）または、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８
位に対応する位置以外の改変体；
(ii) 配列番号３に記載のサーモプラズマ ヴォルカニウムのアセチルセリンスルフヒド
リル化酵素（OASS.Tv）または、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位に対応する位置
以外がさらに置換、付加、欠失または挿入された改変体；
(iii) 配列番号４に記載のパイロコッカス フリオサスのアセチルセリンスルフヒドリル化酵素（OASS.Pf）または、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９
８位に対応する位置以外がさらに置換、付加、欠失または挿入された改変体；
(iv) 配列番号５に記載のサルモネラ菌由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素（OASS-A.Sty）において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２
９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(v) 配列番号６に記載のホウレンソウ由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素（OASS.sp）において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８
位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(vi) 配列番号７に記載のサーモトガマリティマ由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵
素（OASS.Tm）において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／ま
たは２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(vii) 配列番号８に記載のヒト由来シスタチオニンβ合成酵素（CBS.human）において、
少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(viii) 配列番号９に記載の酵母由来シスタチオニンβ合成酵素（CBS.Sc）において、少
なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体。 The present invention provides a crystal of cysteine synthase, a method for increasing the substrate specificity of cysteine synthase for phosphoserine, and a method for producing cysteine or a derivative thereof using phosphoserine as a substrate.
1. A crystal of cysteine synthetase having substrate specificity for phosphoserine, wherein the unit cell constants are a = b = 78.87Å and c = 275.91Å.
2. In a cysteine synthase having no arginine or lysine residue at a position corresponding to position 297 and / or 298 of SEQ ID NO: 1, an arginine or lysine residue is introduced into the position 297 and / or 298 To increase the substrate specificity of cysteine synthase for phosphoserine.
3. In a cysteine synthase having an arginine or lysine residue at a position corresponding to position 297 and / or 298 of SEQ ID NO: 1, the OPSS. A method for increasing the substrate specificity of cysteine synthase for phosphoserine, wherein an amino acid at the following position corresponding to Ap is substituted with an arginine or lysine residue
(1) at least one selected from the group of amino acid residues corresponding to positions 295, 296 and 299 of SEQ ID NO: 1;
(2) At least one selected from the group of amino acid residues corresponding to positions 153 (Ser), 202 (Ser), 203 (Thr), 225 (Phe), and 262 (Thr) of SEQ ID NO: 1. .
4). A cysteine synthase having a arginine or lysine residue at a position corresponding to positions 297 and / or 298 of SEQ ID NO: 1 (except for a cysteine synthase derived from OPSS. Ap described in SEQ ID NO: 1) and A method for producing cysteine or a derivative thereof, which comprises reacting with an SH group-containing compound.
5. The method for producing cysteine according to claim 4, wherein the cysteine synthetase is the cysteine synthetase according to any one of the following (i) to (viii):
(i) Sulfolobus tokodaii acetylserine sulfhydrylase (OASS.St) described in SEQ ID NO: 2 or OPSS. Ap at position 297 and / or 298
Variants other than the position corresponding to the position;
(ii) Thermoplasma volcanium acetylserine sulfhydrylase (OASS.Tv) described in SEQ ID NO: 3 or OPSS. A variant further substituted, added, deleted or inserted except for the position corresponding to position 297 of Ap;
(iii) Pyrococcus furiosus acetylserine sulfhydrylase (OASS.Pf) described in SEQ ID NO: 4 or OPSS. Ap at position 297 and / or 29
A variant in which substitution, addition, deletion, or insertion other than the position corresponding to position 8 is further performed;
(iv) In Salmonella-derived acetylserine sulfhydrylase (OASS-A. Sty) described in SEQ ID NO: 5, at least OPSS. Ap position 297 and / or 2
A variant in which the amino acid at the position corresponding to position 98 is substituted with an arginine or lysine residue;
(v) In spinach-derived acetylserine sulfhydrylase (OASS.sp) described in SEQ ID NO: 6, at least OPSS. Ap at position 297 and / or 298
A variant in which the amino acid at the position corresponding to the position is substituted with an arginine or lysine residue;
(vi) In the thermotoga maritima-derived acetylserine sulfhydrylase (OASS.Tm) described in SEQ ID NO: 7, at least OPSS. A variant in which the amino acid at the position corresponding to position 297 and / or position 298 of Ap is substituted with an arginine or lysine residue;
(vii) In the human-derived cystathionine β synthase (CBS.human) described in SEQ ID NO: 8,
At least the OPSS. A variant in which the amino acid at the position corresponding to position 297 and / or position 298 of Ap is substituted with an arginine or lysine residue;
(viii) In yeast-derived cystathionine β synthase (CBS.Sc) described in SEQ ID NO: 9, at least OPSS. A variant in which the amino acid at the position corresponding to position 297 and / or position 298 of Ap is substituted with an arginine or lysine residue.

本発明によれば、システイン合成酵素の基質特異性に関し、アセチルセリンよりも安価で耐熱性に優れたホスホセリンに対する基質特異性を高めることができ、システインまたはその誘導体をより効率よく製造することができるようになる。 According to the present invention, with respect to the substrate specificity of cysteine synthase, the substrate specificity for phosphoserine, which is cheaper and superior in heat resistance than acetylserine, can be increased, and cysteine or a derivative thereof can be produced more efficiently. It becomes like this.

本発明は、ホスホセリンスルフヒドリル化酵素（OPSS）の遺伝子操作によるタンパク質工学的手法でホスホセリンに対する基質特異性をより高めるか、或いは、本来ホスホセリンに基質特異性がなくO-アセチルセリンと種々の求核試薬とからシステインおよびその誘導体を合成できるシステイン合成酵素（アセチルセリンスルフヒドリル化酵素; OASS）をホスホセリンスルフヒドリル化酵素（OPSS）に変換することを特徴とする。   The present invention further increases the substrate specificity for phosphoserine by a protein engineering technique by genetic manipulation of phosphoserine sulfhydrylase (OPSS), or originally has no substrate specificity for phosphoserine and O-acetylserine and various nucleophilicity. It is characterized by converting cysteine synthase (acetylserine sulfhydrylase; OASS) capable of synthesizing cysteine and its derivatives from reagents into phosphoserine sulfhydrylase (OPSS).

また、本発明によりホスホセリンに対して基質特異性を有するシステイン合成酵素の結晶構造が明らかにされたため、ホスホセリンの基質特異性をさらに高める等のタンパク質変異体の設計を適切に行うことができる。
さらに配列番号２〜４のＯＡＰＰは、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８位に対応する位置にアルギニンまたはリジン残基を有しているので、ホスホセリンを基質としてシステインを生産する能力を有していると推定される。従って、配列番号２〜４の該酵素あるいはその２９７位および２９８位に対応する以外の位置が置換、付加、欠失または挿入された改変体をホスホセリン及びＳＨ基含有化合物と反応させることで、システインまたはその誘導体を製造することができる。
さらに、配列番号５〜９のＯＡＰＰまたはＣＢＳ（シスタチオニンβ合成酵素）を含むシステイン合成酵素において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換し、必要に応じてさらに２９７位および２９８位に対応する以外の位置がさらに置換、付加、欠失または挿入された改変体は、ホスホセリンを基質としてシステインまたはその誘導体を生産する能力を有していると推定される。従って、配列番号５〜９のＯＡＰＰまたはＣＢＳ（シスタチオニンβ合成酵素）において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換し、必要に応じてさらに２９７位および２９８位に対応する以外の位置がさらに置換、付加、欠失または挿入された改変体をホスホセリン及びＳＨ基含有化合物と反応させることで、システインまたはその誘導体を製造することができる。
ＳＨ基含有化合物としては、Ｒ−ＳＨ（Ｒは、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよいアリール基を示し、これらの基の置換基としてはフッ素原子、カルボニル基、アルコキシ基、ニトロ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、複素環基、ＣＯＯＨ，アルコキシカルボニル基、アシル基、アルカノイル基、アルキルチオ基、アシルアミノ基、アルカノイルアミノ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基、アルキル基などが挙げられ、置換基の数としては１〜３個が例示される）で表される化合物が挙げられる。アルキル基（アルコキシ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルキルチオ基等に含まれるアルキル基を含む）の炭素数としては、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好
ましくは１〜６個、特に１〜４個であり、直鎖又は分枝を有していてもよい。アリール基（アリールオキシ基、アラルキル基に含まれるアリール基を含む）の炭素数は５〜１８個好ましくは６〜１０個である。
<アエロパイラムペルニックスのホスホセリンスルフヒドリル化酵素のリン酸基の認識に
関与する部位の同定>
本酵素の結晶構造を、多波長異常分散法により、2.0Åの分解能で決定した。モノマー
は新規なα/βフォールドを含むN-末端側ドメインを含む。中間のドメインとC-末端側の
ドメインは、既存の酵素であるサルモネラ菌由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素ならびにヒト由来シスタチオニンβ合成酵素と類似している。補酵素であるピリドキサールリン酸は127番目のリジンとシッフ塩基結合している（図２）。 Moreover, since the crystal structure of cysteine synthase having substrate specificity for phosphoserine has been clarified by the present invention, protein variants such as further increasing the substrate specificity of phosphoserine can be appropriately designed.
Furthermore, the OAPP of SEQ ID NOs: 2 to 4 is an OPSS. Since it has an arginine or lysine residue at a position corresponding to position 297 and / or position 298 of Ap, it is presumed to have the ability to produce cysteine using phosphoserine as a substrate. Accordingly, by reacting the enzyme of SEQ ID NOs: 2 to 4 or a variant in which positions other than those corresponding to positions 297 and 298 are substituted, added, deleted or inserted with phosphoserine and an SH group-containing compound, Alternatively, derivatives thereof can be produced.
Further, in a cysteine synthase including OAPP or CBS (cystathionine β synthase) of SEQ ID NOs: 5 to 9, at least OPSS. The amino acid at the position corresponding to positions 297 and / or 298 of Ap is substituted with an arginine or lysine residue, and further positions other than those corresponding to positions 297 and 298 are further substituted, added, deleted or The inserted variant is presumed to have the ability to produce cysteine or a derivative thereof using phosphoserine as a substrate. Accordingly, in OAPP or CBS (cystathionine β synthase) of SEQ ID NOs: 5 to 9, at least OPSS. The amino acid at the position corresponding to positions 297 and / or 298 of Ap is substituted with an arginine or lysine residue, and further positions other than those corresponding to positions 297 and 298 are further substituted, added, deleted or Cysteine or a derivative thereof can be produced by reacting the inserted variant with a phosphoserine and an SH group-containing compound.
As the SH group-containing compound, R-SH (R represents an alkyl group which may be substituted, an aralkyl group which may be substituted, or an aryl group which may be substituted. Is a fluorine atom, carbonyl group, alkoxy group, nitro group, hydroxyl group, cyano group, amino group, monoalkylamino group, dialkylamino group, heterocyclic group, COOH, alkoxycarbonyl group, acyl group, alkanoyl group, alkylthio group, acylamino A group, an alkanoylamino group, an aralkyloxy group, an aryloxy group, an alkyl group, and the like, and the number of substituents is 1 to 3). The carbon number of the alkyl group (including the alkyl group contained in the alkoxy group, monoalkylamino group, dialkylamino group, alkylthio group, etc.) is 1 to 20, preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 6 Number, especially 1 to 4, and may have a straight chain or a branch. The aryl group (including the aryl group included in the aryloxy group and aralkyl group) has 5 to 18 carbon atoms, preferably 6 to 10 carbon atoms.
<Identification of the site involved in the recognition of the phosphate group of Aeropyram pernicus phosphoserine sulfhydrylase>
The crystal structure of the enzyme was determined with a resolution of 2.0 mm by the multiwavelength anomalous dispersion method. The monomer contains an N-terminal domain containing a novel α / β fold. The intermediate domain and the C-terminal domain are similar to the existing enzymes acetylserine sulfhydrylase derived from Salmonella and cystathionine β synthase derived from human. The coenzyme pyridoxal phosphate is linked to the 127th lysine by a Schiff base (FIG. 2).

決定した立体構造情報に基づいて、ホスホセリンを結合したモデルを構築して、活性部位を検証した結果、297番目のアルギニンと298番目アルギニン（特に297番目のアルギニ
ン）のは、ホスホセリンのリン酸基の近傍に配置すると予測された（図２）。そこで蛋白質工学的手法で297番目のアルギニンをアラニンに変えた変異型酵素を調製した。 Based on the determined three-dimensional structure information, a model that binds phosphoserine was constructed and the active site was verified. As a result, the 297th arginine and the 298th arginine (especially the 297th arginine) It was predicted to be placed in the vicinity (FIG. 2). Therefore, a mutated enzyme in which 297th arginine was changed to alanine was prepared by protein engineering.

この変異型酵素を用いて、ホスホセリンスルフヒドリル化反応およびアセチルセリンスルフヒドリル化反応との比較を行った。比活性を測定した結果を表１に示す。   Using this mutant enzyme, a phosphoserine sulfhydrylation reaction and an acetylserine sulfhydrylation reaction were compared. The results of measuring specific activity are shown in Table 1.

変異型酵素のアセチルセリンスルフヒドリル化反応の相対比活性は野性型酵素と比較して、74%であったのに対して、ホスホセリンスルフヒドリル化反応の相対比活性は0.5％以下であった。このことから、297番目のアルギニンはホスホセリンの負に荷電したリン酸
基の認識に関与する重要な残基の1つであり、この残基が、ホスホセリンスルフヒドリル
化活性に必要であることが示された。 The relative specific activity of the mutated enzyme acetylserine sulfhydrylation reaction was 74% compared to the wild-type enzyme, whereas the relative specific activity of the phosphoserine sulfhydrylation reaction was 0.5% or less. This indicates that the 297th arginine is one of the important residues involved in the recognition of the negatively charged phosphate group of phosphoserine, and this residue is required for phosphoserine sulfhydrylation activity. It was done.

図１にアミノ酸配列のアライメントを示す。図１における記号の意味を以下に示す：
OPSS.Ap: アエロパイラムペルニックス ホスホセリンスルフヒドリル化酵素
OASS.St: スルフォロバス トコダイイ アセチルセリンスルフヒドリル化酵素と予測さ
れている遺伝子産物
OASS.Tv: サーモプラズマ ヴォルカニウムのアセチルセリンスルフヒドリル化酵素と予
測されている遺伝子産物
OASS.Pf: パイロコッカス フリオサスのアセチルセリンスルフヒドリル化酵素と予測されている遺伝子産物
OASS-A.Sty: サルモネラ菌由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素
OASS.sp: ホウレンソウ由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素
OASS.Tm: サーモトガマリティマ由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素と予測されて
いる遺伝子産物
CBS.human: ヒト由来シスタチオニンβ合成酵素
CBS.Sc: 酵母由来シスタチオニンβ合成酵素
図１中において、▼は、アエロパイラムペルニックス ホスホセリンスルフヒドリル化酵素の297番目のアルギニンに相当する位置を示す。 FIG. 1 shows the alignment of amino acid sequences. The meanings of the symbols in FIG. 1 are as follows:
OPSS.Ap: Aeropyram Pernicus phosphoserine sulfhydrylase
OASS.St: Sulfolobus tokodaii Acetylserine sulfhydrylase and predicted gene product
OASS.Tv: Thermoplasma Volcanium acetylserine sulfhydrylase and predicted gene product
OASS.Pf: Pyrococcus furiosus acetylserine sulfhydrylase and predicted gene product
OASS-A.Sty: Acetylserine sulfhydrylase from Salmonella
OASS.sp: Spinach-derived acetylserine sulfhydrylase
OASS.Tm: A predicted gene product of acetylserine sulfhydrylase from Thermotoga maritima
CBS.human: Human cystathionine β synthase
CBS.Sc: Yeast-derived cystathionine β synthase In FIG. 1, ▼ indicates the position corresponding to the 297th arginine of Aeropyram pernicus phosphoserine sulfhydrylase.

アエロパイラムペルニックス由来ホスホセリンスルフヒドリル化酵素の297番目のアル
ギニンに相当するアミノ酸は、超好熱性古細菌サーモプラズマ ヴォルカニウムのアセチルセリンスルフヒドリル化酵素と予測されている遺伝子産物において、アルギニンであり、超耐熱性古細菌スルフォロバス トコダイイ、パイロコッカス フリオサスのアセチルセリンスルフヒドリル化酵素と予測されている遺伝子産物において、リジンである。リジンはアルギニンと同様に正の電荷を持つ塩基性アミノ酸である。上記の超好熱性古細菌のアセチルセリンスルフヒドリル化酵素と予測されている遺伝子産物は、いずれもホスホセリンスルフヒドリル化反応を触媒する可能性がある。すなわち、これら２９７番目と２９８番目周辺（２９５−３００番目）に相当する非塩基性アミノ酸を塩基性アミノ酸に変換することで、OPSSのホスホセリンに対する基質特異性をさらに高めることができる。また、構造から予想すると、図２で示したホスホセリンのリン酸残基から半径５オングストロームに存在するアミノ酸残基を改変することで、この変換が可能であることを示唆する。この残基には、１５３（Ser）,２０２（Ser）,２０３（Thr）,２２５（Phe）,２６２（Thr）が該当する。 The amino acid corresponding to the 297th arginine of the phosphoserine sulfhydrylase from Aeropyram pernicus is arginine in the gene product predicted to be the acetylserine sulfhydrylase of the hyperthermophilic archaeon Thermoplasma volcanium. The thermostable archaea Sulfolobus tokodaii, Pyrococcus furiosus is a lysine in the predicted gene product of acetylserine sulfhydrylase. Lysine, like arginine, is a basic amino acid with a positive charge. Any of the gene products predicted to be acetylserine sulfhydrylases of the above hyperthermophilic archaea may catalyze the phosphoserine sulfhydrylation reaction. That is, the substrate specificity of OPSS for phosphoserine can be further increased by converting the non-basic amino acids corresponding to the 297th and 298th surroundings (295-300th) to basic amino acids. Further, as predicted from the structure, it is suggested that this conversion is possible by modifying the amino acid residue present at a radius of 5 angstroms from the phosphate residue of phosphoserine shown in FIG. This residue corresponds to 153 (Ser), 202 (Ser), 203 (Thr), 225 (Phe), and 262 (Thr).

一方、アエロパイラムペルニックス由来ホスホセリンスルフヒドリル化酵素の297番目
のアルギニンに相当するアミノ酸は、サルモネラ菌、ホウレンソウのアセチルセリンスルフヒドリル化酵素、サーモトガマリティマ由来のアセチルセリンスルフヒドリル化酵素と推定されている遺伝子では、グリシンである。すなわち、サルモネラ菌、ホウレンソウ、サーモトガマリティマ由来等のアセチルセリンスルフヒドリル化酵素において上記グリシンおよび電荷がないアミノ酸を正電荷のアミノ酸、例えばリジンおよびアルギニンに変えることで、OASS活性にOPSS活性（ホスホセリンスルフヒドリル化反応）を付与できる。また、構造から予想すると、図２で示したホスホセリンのリン酸残基から半径５オングストロームに存在するアミノ酸残基を改変することで、この変換が可能であることを示唆する。 On the other hand, the amino acid corresponding to the 297th arginine of the phosphoserine sulfhydrylase derived from Aeropyram pernicus is the gene that is presumed to be an acetylserine sulfhydrylase from Salmonella and spinach and an acetylserine sulfhydrylase from Thermotoga maritima Then, glycine. In other words, in acetylserine sulfhydrylating enzymes derived from Salmonella, spinach, thermotoga maritima, etc., the above glycine and non-charged amino acids are changed to positively charged amino acids such as lysine and arginine, whereby OPSS activity (phosphoserine sulfhydryl) is changed. Chemical reaction). Further, as predicted from the structure, it is suggested that this conversion is possible by modifying the amino acid residue present at a radius of 5 angstroms from the phosphate residue of phosphoserine shown in FIG.

以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。
実施例１
アエロパイラムペルニックス由来のホスホセリンスルフヒドリル化酵素遺伝子を、論文１（K. Mino and K. Ishikawa, Journal of Bacteriology (2003) 185, pp2277-2284）
の方法で大腸菌の発現ベクター（pET ベクター）に組み込んだ。本ベクターで、大腸菌Rosetta(DE3)を形質転換する。得られた形質転換体を、論文２（S. Doublie Methods Enzymology 276, pp523-530）の方法で培養し、メチオニンがセレノメチオニンに変換した目的酵素（ホスホセリンスルフヒドリル化酵素）を調製した。得られた酵素は、論文１の方法で精製した（ただし、酸化防止の目的で、使用した全ての緩衝液には10mMジチオスレイトールを加えた）。精製した酵素（セレノメチオニン変換ホスホセリンスルフヒドリル化酵素）は、論文３（K. Mino, Y. Oda, M. Ataka and K. Ishikawa, Acta crystallography D(2003) 59, pp338-340）の方法を、少し改良した方法で結晶化した。酵素溶液は、緩衝
液（0.1mM ピリドキサールリン酸、 3mMメルカプトエタノールを含む50mM リン酸緩衝液
（pH7.5））に透析し、２０mg/mlになるまで限外ろ過膜で濃縮した。結晶化のための緩衝液（0.2 M Sodium acetate、3mM メルカプトエタノール、 21% PEG8000を含む0.1 M Sodium cacodylate 緩衝液（pH7.0））を調製した。結晶化は、CrystalClearStrip(Hampton Research) を使用してsitting-drop法で行った。本溶液と濃縮酵素溶液とを、0.0035mlづ
つ混合し、リザーバーに結晶化のための緩衝液 0.1ml を加え約２週間で結晶（0.5 mm程
度）が生じた。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples.
Example 1
The phosphoserine sulfhydrylase gene derived from Aeropyram pernicus is described in paper 1 (K. Mino and K. Ishikawa, Journal of Bacteriology (2003) 185, pp2277-2284).
This was incorporated into an E. coli expression vector (pET vector). E. coli Rosetta (DE3) is transformed with this vector. The obtained transformant was cultured by the method of paper 2 (S. Doublie Methods Enzymology 276, pp523-530) to prepare a target enzyme (phosphoserine sulfhydrylase) in which methionine was converted to selenomethionine. The obtained enzyme was purified by the method of paper 1 (however, for the purpose of antioxidation, 10 mM dithiothreitol was added to all the buffers used). The purified enzyme (selenomethionine-converting phosphoserine sulfhydrylase) was obtained by the method described in paper 3 (K. Mino, Y. Oda, M. Ataka and K. Ishikawa, Acta crystallography D (2003) 59, pp338-340). Crystallization occurred with a slightly improved method. The enzyme solution was dialyzed against a buffer solution (50 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.1 mM pyridoxal phosphate, 3 mM mercaptoethanol), and concentrated with an ultrafiltration membrane until 20 mg / ml. A buffer solution for crystallization (0.2 M sodium acetate, 3 mM mercaptoethanol, 0.1 M sodium cacodylate buffer solution (pH 7.0) containing 21% PEG8000) was prepared. Crystallization was performed by the sitting-drop method using CrystalClearStrip (Hampton Research). This solution and concentrated enzyme solution were mixed in 0.0035 ml units, and 0.1 ml of crystallization buffer was added to the reservoir, and crystals (about 0.5 mm) were formed in about 2 weeks.

得られた結晶は、SPring-8 のビームラインBL40B2において、３波長のX線を照射し、その結晶の反射データの収集を行った。振動角は1°で１８０フレームのデータを収集した
（表２）。 The obtained crystal was irradiated with three wavelengths of X-rays at the SPring-8 beam line BL40B2, and the reflection data of the crystal was collected. The vibration angle was 1 °, and 180 frames of data were collected (Table 2).

分解能は2.2Åで、MAD法により本酵素の構造解析を行った。位相はSOLVEで決定し、TURBO-FRODO でモデルを構築した後、REFMAC で構造の精密化を行った。その結果、本酵素は２回軸で対称付けられる２量体構造を形成していた。その活性部位構造を図２に示す。   The resolution was 2.2 mm, and the structure of this enzyme was analyzed by the MAD method. The phase was determined by SOLVE, the model was constructed by TURBO-FRODO, and the structure was refined by REFMAC. As a result, the enzyme formed a dimeric structure that was symmetric with respect to the 2-fold axis. The active site structure is shown in FIG.

アセチルセリンおよびリン酸セリンに対する酵素活性は、論文１、４（K. Mino and K.
Ishikawa, FEBS Letters (2003) 551,pp133-138）の方法で測定した。２９７番目のアルギニン残基は、タンパク質工学的手法（site-directed mutagenesis）で、アラニン残基
に変換した。本変異体酵素は、論文１の手法で調製・精製した。 Enzyme activity against acetylserine and serine phosphate is described in the papers 1 and 4 (K. Mino and K.
Ishikawa, FEBS Letters (2003) 551, pp133-138). The 297th arginine residue was converted to an alanine residue by site-directed mutagenesis. This mutant enzyme was prepared and purified by the technique of paper 1.

アミノ酸配列のアラインメントを示す。Amino acid sequence alignment is shown. アエロパイラムペルニックスのホスホセリンスルフヒドリル化酵素の活性部位近傍の構造を示す。The structure in the vicinity of the active site of the phosphoserine sulfhydrylating enzyme of Aeropyram pernicus is shown.

Claims (5)

ホスホセリンに対する基質特異性を有するシステイン合成酵素の結晶であって、単位格子定数がa=b=78.87Å, c=275.91Åである、上記結晶。 A crystal of cysteine synthetase having substrate specificity for phosphoserine, wherein the unit cell constants are a = b = 78.87Å and c = 275.91Å. 配列番号１の２９７位および／または２９８位に対応する位置にアルギニンまたはリジン残基を有しないシステイン合成酵素において、該２９７位および／または２９８位にアルギニンまたはリジン残基を導入することを特徴とするシステイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性を高める方法。 In a cysteine synthase having no arginine or lysine residue at a position corresponding to position 297 and / or 298 of SEQ ID NO: 1, an arginine or lysine residue is introduced at position 297 and / or 298 To increase the substrate specificity of cysteine synthase for phosphoserine. 配列番号１の２９７位および／または２９８位に対応する位置にアルギニンまたはリジン残基を有するシステイン合成酵素において、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐに対応する以下の位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換することを特徴とするシステイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性を高める方法：
(1) 配列番号１の２９５位、２９６位及び２９９位に対応するアミノ酸残基の群から選ばれる少なくとも１種；
(2) 配列番号１の１５３位（Ｓｅｒ）、２０２位（Ｓｅｒ）、２０３位（Ｔｈｒ）、２２５位（Ｐｈｅ）及び２６２位（Ｔｈｒ）に対応するアミノ酸残基の群から選ばれる少なくとも１種。 In a cysteine synthase having an arginine or lysine residue at a position corresponding to position 297 and / or 298 of SEQ ID NO: 1, the OPSS. A method for increasing the substrate specificity of cysteine synthase for phosphoserine, wherein an amino acid at the following position corresponding to Ap is substituted with an arginine or lysine residue:
(1) at least one selected from the group of amino acid residues corresponding to positions 295, 296 and 299 of SEQ ID NO: 1;
(2) At least one selected from the group of amino acid residues corresponding to positions 153 (Ser), 202 (Ser), 203 (Thr), 225 (Phe), and 262 (Thr) of SEQ ID NO: 1. . ホスホセリンを、配列番号１の２９７位および／または２９８位に対応する位置にアルギニンまたはリジン残基を有するシステイン合成酵素（但し、配列番号１に記載のＯＰＳＳ．Ａｐ由来のシステイン合成酵素を除く）及びＳＨ基含有化合物と反応させることを特徴とする、システインまたはその誘導体の製造方法。 A cysteine synthase having an arginine or lysine residue at a position corresponding to positions 297 and / or 298 of SEQ ID NO: 1 (except for a cysteine synthase derived from OPSS. Ap described in SEQ ID NO: 1) and A method for producing cysteine or a derivative thereof, which comprises reacting with an SH group-containing compound. 前記システイン合成酵素が、以下の(i)〜(viii)のいずれかに記載のシステイン合成酵素
である請求項４に記載のシステインの製造方法：
(i)配列番号２に記載のスルフォロバス トコダイイ アセチルセリンスルフヒドリル化
酵素（OASS.St）または、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８
位に対応する位置以外の改変体；
(ii) 配列番号３に記載のサーモプラズマ ヴォルカニウムのアセチルセリンスルフヒド
リル化酵素（OASS.Tv）または、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位に対応する位置
以外がさらに置換、付加、欠失または挿入された改変体；
(iii) 配列番号４に記載のパイロコッカス フリオサスのアセチルセリンスルフヒドリル化酵素（OASS.Pf）または、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９
８位に対応する位置以外がさらに置換、付加、欠失または挿入された改変体；
(iv) 配列番号５に記載のサルモネラ菌由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素（OASS-A.Sty）において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２
９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(v) 配列番号６に記載のホウレンソウ由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素（OASS.sp）において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８
位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(vi) 配列番号７に記載のサーモトガマリティマ由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵
素（OASS.Tm）において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／ま
たは２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(vii) 配列番号８に記載のヒト由来シスタチオニンβ合成酵素（CBS.human）において、
少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(viii) 配列番号９に記載の酵母由来シスタチオニンβ合成酵素（CBS.Sc）において、少
なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体。 The method for producing cysteine according to claim 4, wherein the cysteine synthetase is the cysteine synthetase according to any one of the following (i) to (viii):
(i) Sulfolobus tokodaii acetylserine sulfhydrylase (OASS.St) described in SEQ ID NO: 2 or OPSS. Ap at position 297 and / or 298
Variants other than the position corresponding to the position;
(ii) Thermoplasma volcanium acetylserine sulfhydrylase (OASS.Tv) described in SEQ ID NO: 3 or OPSS. A variant further substituted, added, deleted or inserted except for the position corresponding to position 297 of Ap;
(iii) Pyrococcus furiosus acetylserine sulfhydrylase (OASS.Pf) described in SEQ ID NO: 4 or OPSS. Ap at position 297 and / or 29
A variant in which substitution, addition, deletion, or insertion other than the position corresponding to position 8 is further performed;
(iv) In Salmonella-derived acetylserine sulfhydrylase (OASS-A. Sty) described in SEQ ID NO: 5, at least OPSS. Ap position 297 and / or 2
A variant in which the amino acid at the position corresponding to position 98 is substituted with an arginine or lysine residue;
(v) In spinach-derived acetylserine sulfhydrylase (OASS.sp) described in SEQ ID NO: 6, at least OPSS. Ap at position 297 and / or 298
A variant in which the amino acid at the position corresponding to the position is substituted with an arginine or lysine residue;
(vi) In the thermotoga maritima-derived acetylserine sulfhydrylase (OASS.Tm) described in SEQ ID NO: 7, at least OPSS. A variant in which the amino acid at the position corresponding to position 297 and / or position 298 of Ap is substituted with an arginine or lysine residue;
(vii) In the human-derived cystathionine β synthase (CBS.human) described in SEQ ID NO: 8,
At least the OPSS. A variant in which the amino acid at the position corresponding to position 297 and / or position 298 of Ap is substituted with an arginine or lysine residue;
(viii) In yeast-derived cystathionine β synthase (CBS.Sc) described in SEQ ID NO: 9, at least OPSS. A variant in which the amino acid at the position corresponding to position 297 and / or position 298 of Ap is substituted with an arginine or lysine residue.

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