JP2006292721A - Magnetic body-containing particle, manufacturing method of magnetic body-containing particle, particle for measuring immunity, and immunity measuring method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、クロマト展開性に優れ、高感度な免疫測定を行うことが可能な磁性体内包粒子、磁性体内包粒子の製造方法、免疫測定用粒子及びこれを用いた免疫測定法に関する。 The present invention relates to a magnetic substance-encapsulated particle excellent in chromatographic development and capable of performing highly sensitive immunoassay, a method for producing magnetic substance-encapsulated particle, an immunoassay particle, and an immunoassay method using the same.
測定試料中に含有される被検物質を検出する方法としては、例えば、抗原−抗体反応を利用した酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、ラテックス凝集法、免疫クロマト法等の生物学的反応を利用した種々の方法が提案されている。なかでも、簡便かつ迅速であることから、免疫クロマト法が多用されるようになってきている。 Examples of a method for detecting a test substance contained in a measurement sample include biological reactions such as enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, latex agglutination, and immunochromatography using an antigen-antibody reaction. Various methods used have been proposed. Among these, immunochromatography has been frequently used because it is simple and quick.
免疫クロマト法では、通常、少なくとも２種類の抗体を利用したサンドイッチ法が採用されている。すなわち、金属コロイドや着色粒子を支持体として、アイソトープ、酵素、蛍光物質等で標識された抗体を含む試薬と測定試料とを反応させ、測定試料中に含まれる抗原と標識抗体とを結合し、これをもう一つの抗体が固定化されたクロマト担体に流すことにより、クロマト担体中に抗原を捕捉し、捕捉された抗原を標識をもとに分析するというものである。 In immunochromatography, a sandwich method using at least two kinds of antibodies is usually employed. That is, using a metal colloid or colored particles as a support, a reagent containing an antibody labeled with an isotope, enzyme, fluorescent substance, or the like is reacted with a measurement sample, and the antigen contained in the measurement sample is bound to the labeled antibody. This is passed through a chromatographic carrier on which another antibody is immobilized, whereby the antigen is captured in the chromatographic carrier, and the captured antigen is analyzed based on the label.
このような免疫クロマト法等に供するための支持体として、磁性体内包粒子が注目されている。磁性体内包粒子は、以前からラジオイムノアッセイ等において磁性により効率よく簡便にＢ／Ｆ分離を行うための支持体としての利用が提案されていたが、磁性体内包粒子の磁性量を標識とすることにより、他の標識物質で標識せずに分析を行うことができる等の利点があるとされる（特許文献１〜３）。 Magnetic encapsulated particles have attracted attention as a support for use in such immunochromatography. Magnetic encapsulated particles have been proposed for use as a support for separating B / F efficiently and easily by magnetism in radioimmunoassay and the like, but the magnetic content of magnetic encapsulated particles should be labeled. Therefore, there is an advantage that analysis can be performed without labeling with another labeling substance (Patent Documents 1 to 3).
しかしながら、実際に磁性体内包粒子を免疫クロマト法に用いると、磁性体内包粒子がクロマト担体中に滞留してしまったり、展開させる側のクロマト先端部位付近に不均一に残留してしまったりする等、金属コロイドや着色粒子に比べてクロマト展開性が大きく劣るという問題があった。
本発明は、上記現状に鑑み、クロマト展開性に優れ、高感度な免疫測定を行うことが可能な磁性体内包粒子、磁性体内包粒子の製造方法、免疫測定用粒子及びこれを用いた免疫測定法を提供することを目的とする。 In view of the above-described situation, the present invention provides magnetic inclusion particles that are excellent in chromatographic development and capable of performing highly sensitive immunoassay, a method for producing magnetic inclusion particles, immunoassay particles, and immunoassay using the same. The purpose is to provide the law.
本発明は、有機高分子物質と、上記有機高分子物質中に分散した磁性体とからなる、平均粒子径が５０〜５００ｎｍの磁性体内包粒子であって、上記有機高分子物質中における上記磁性体の分散径が１〜３０ｎｍであり、かつ、上記磁性体を５０〜８０重量％含有する磁性体内包粒子である。
以下に本発明を詳述する。
The present invention relates to a magnetic substance-encapsulated particle having an average particle diameter of 50 to 500 nm, comprising an organic polymer substance and a magnetic substance dispersed in the organic polymer substance, wherein the magnetic substance in the organic polymer substance This is a magnetic substance-encapsulated particle having a body dispersion diameter of 1 to 30 nm and containing 50 to 80% by weight of the magnetic substance.
The present invention is described in detail below.
本発明者らは、磁性体内包粒子を免疫クロマト法に用いた場合に、クロマト展開性が劣る原因について鋭意検討したところ、従来の磁性体内包粒子は自己凝集しやすいことから、二次粒子径が大きくなりクロマト担体の孔を通過しにくくなること、及び、クロマト担体自体にも非特異的に吸着しやすいことが原因であることを見出した。本発明者らは、更に鋭意検討した結果、磁性体内包粒子の平均粒子径を所定の大きさとし、かつ、磁性体の分散径及び含有量が特定の範囲内である磁性体内包粒子を用いた場合に、磁性体内包粒子の自己凝集が抑制され、クロマト展開性が向上するとともに、高感度な免疫測定が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors diligently investigated the cause of poor chromatographic developability when magnetic inclusion particles were used for immunochromatography. As a result, conventional magnetic inclusion particles are prone to self-aggregation. It has been found that this is caused by the fact that it becomes difficult to pass through the pores of the chromatographic carrier and that it is easily adsorbed non-specifically on the chromatographic carrier itself. As a result of further intensive studies, the present inventors used magnetic inclusion particles in which the average particle diameter of the magnetic inclusion particles was a predetermined size, and the dispersion diameter and content of the magnetic substance were within a specific range. In this case, it was found that self-aggregation of magnetic substance-encapsulated particles was suppressed, chromatographic development was improved, and highly sensitive immunoassay became possible, and the present invention was completed.
本発明の磁性体内包粒子は、有機高分子物質と、該有機高分子物質中に分散した磁性体とからなる。
上記有機高分子物質は、本発明の磁性体内包粒子のマトリックスとしての役割を有する。
上記有機高分子物質としては、スチレン系モノマーに由来するセグメントを有する共重合体であることが好ましい。スチレン系モノマーに由来するセグメントを有することにより、本発明の磁性体内包粒子の水系媒体中における分散性が向上する。
The magnetic substance-encapsulated particle of the present invention comprises an organic polymer substance and a magnetic substance dispersed in the organic polymer substance.
The organic polymer substance has a role as a matrix of the magnetic substance-encapsulated particles of the present invention.
The organic polymer substance is preferably a copolymer having a segment derived from a styrene monomer. By having a segment derived from a styrene monomer, the dispersibility of the magnetic substance-encapsulated particles of the present invention in an aqueous medium is improved.
上記スチレン系モノマーとしては特に限定されず、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、クロロメチルスチレン等、又は、二官能性のジビニルベンゼン等が挙げられる。これらのスチレン系モノマーは単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。 The styrene monomer is not particularly limited, and examples thereof include styrene, α-methylstyrene, p-methylstyrene, p-chlorostyrene, chloromethylstyrene, and bifunctional divinylbenzene. These styrenic monomers may be used alone or in combination of two or more.
上記スチレン系モノマーに由来するセグメントの含有量の好ましい下限は６０重量％である。６０重量％未満であると、得られる本発明の磁性体内包粒子の水系媒体中での分散性が劣ることがある。 The minimum with preferable content of the segment derived from the said styrene-type monomer is 60 weight%. If it is less than 60% by weight, the dispersibility of the obtained magnetic substance-encapsulated particles of the present invention in an aqueous medium may be inferior.
上記有機高分子物質は、スチレン系モノマーに由来するセグメントのほかに、反応性官能基を含有するビニルモノマーに由来するセグメントを有していてもよい。反応性官能基を含有するビニルモノマーに由来するセグメントを有することにより、該反応性官能基を介して抗原や抗体を容易に結合することができる。 The organic polymer substance may have a segment derived from a vinyl monomer containing a reactive functional group in addition to a segment derived from a styrene monomer. By having a segment derived from a vinyl monomer containing a reactive functional group, it is possible to easily bind an antigen or an antibody via the reactive functional group.
上記反応性官能基を含有するビニルモノマーの反応性官能基としては、抗原や抗体等を共有結合により結合可能なものであれば特に限定されず、例えば、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、アミノ基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルアミノ基、スルホン酸基等が挙げられる。このような反応性官能基を含有するビニルモノマーとしては特に限定されず、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、グリシジル（メタ）アクリレート、トリエチルアンモニウム（メタ）アクリレート、ジメチルアミノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらの反応性官能基を含有するビニルモノマーは単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。 The reactive functional group of the vinyl monomer containing the reactive functional group is not particularly limited as long as it can bind an antigen or an antibody by a covalent bond. For example, a carboxyl group, a hydroxyl group, an epoxy group, an amino group , Triethylammonium group, dimethylamino group, sulfonic acid group and the like. The vinyl monomer containing such a reactive functional group is not particularly limited. For example, (meth) acrylic acid, (meth) acrylic acid-2-hydroxyethyl, glycidyl (meth) acrylate, triethylammonium (meth) acrylate And dimethylamino (meth) acrylate. The vinyl monomer containing these reactive functional groups may be used independently, and 2 or more types may be used together.
上記共重合体は、その他のビニルモノマーに由来するセグメントを有していてもよい。
その他のビニルモノマーとしては特に限定されず、例えば、塩化ビニル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類；アクリロニトリル等の不飽和ニトリル類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、エチレングリコール（メタ）アクリレート、トリフルオロエチル（メタ）アクリレート、ペンタフルオロプロピル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジルメタクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。これら単量体は単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。
The copolymer may have a segment derived from another vinyl monomer.
Other vinyl monomers are not particularly limited. For example, vinyl chloride; vinyl esters such as vinyl acetate and vinyl propionate; unsaturated nitriles such as acrylonitrile; methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, Butyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, stearyl (meth) acrylate, ethylene glycol (meth) acrylate, trifluoroethyl (meth) acrylate, pentafluoropropyl (meth) acrylate, cyclohexyl (meth) And (meth) acrylic acid ester derivatives such as acrylate, glycidyl methacrylate, and tetrahydrofurfuryl (meth) acrylate. These monomers may be used independently and 2 or more types may be used together.
上記共重合体は、架橋性モノマーに由来するセグメントを有していてもよく、これらのセグメントにより架橋が施されていてもよい。
上記架橋性モノマーとしては特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリトリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ジアリルフタレート及びその異性体、トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体等が挙げられる。これら架橋性単量体は単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。
The copolymer may have segments derived from a crosslinkable monomer, and may be crosslinked by these segments.
The crosslinkable monomer is not particularly limited. For example, ethylene glycol di (meth) acrylate, 1,6-hexanediol di (meth) acrylate, neopentylglycol di (meth) acrylate, trimethylolpropane tri (meth) acrylate , Tetramethylol methane tritri (meth) acrylate, tetramethylolpropane tetra (meth) acrylate, diallyl phthalate and isomers thereof, triallyl isocyanurate and derivatives thereof, and the like. These crosslinkable monomers may be used independently and 2 or more types may be used together.
上記磁性体は、上記有機高分子物質中に分散している。
上記磁性体としては特に限定されないが、残留磁気がない超常磁性を有するものが好適である。残留磁気があると自己凝集しやすくなり、クロマト展開性が劣ることがある。
上記超常磁性を有する磁性体としては特に限定されず、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−三酸化二鉄（γ−Ｆｅ２Ｏ３）等の各種フェライト類；鉄、マンガン、コバルト等の金属又はこれらの合金等が挙げられる。なかでもフェライト類が好適であり、なかでも四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）が好適である。
このような磁性体としては、Ｆｅ２＋とＦｅ３＋とを１：２の割合で含む混合液を塩基性の溶液に滴下することでＦｅ３Ｏ４が得られる共沈反応法により調製したもの等を用いることができる。また、フェリコロイドＨＣ−５０（タイホー工業社製）、ＨＸ―２０（シグマハイケミカル社製）等の市販品も用いることができる。
The magnetic substance is dispersed in the organic polymer substance.
Although it does not specifically limit as said magnetic body, The thing which has a superparamagnetism without a residual magnetism is suitable. If there is residual magnetism, self-aggregation tends to occur and chromatographic developability may be poor.
The magnetic body having superparamagnetism is not particularly limited, and various ferrites such as iron trioxide (Fe 3 O 4 ) and γ-diiron trioxide (γ-Fe 2 O 3 ); iron, manganese , Metals such as cobalt, and alloys thereof. Of these, ferrites are preferable, and triiron tetroxide (Fe 3 O 4 ) is preferable.
Examples of such a magnetic material include those prepared by a coprecipitation reaction method in which Fe 3 O 4 is obtained by dropping a mixed solution containing Fe 2+ and Fe 3+ at a ratio of 1: 2 into a basic solution. Can be used. Commercial products such as ferricolloid HC-50 (manufactured by Taiho Kogyo Co., Ltd.) and HX-20 (manufactured by Sigma High Chemical Co., Ltd.) can also be used.
上記有機高分子物質中における磁性体の分散径の下限は１ｎｍ、上限は３０ｎｍである。１ｎｍ未満であると、磁性体の製造自体が困難であることに加え、磁性体の磁性応答特性が減少し、標識として用いたときの感度が低下する。３０ｎｍを超えると、残留磁気を生じやすくなり、自己凝集しやすくなることに加え、磁性体が磁性体内包粒子の表面に露出しやすくなる。好ましい下限は５ｎｍ、好ましい上限は２０ｎｍである。 The lower limit of the dispersion diameter of the magnetic substance in the organic polymer substance is 1 nm, and the upper limit is 30 nm. When the thickness is less than 1 nm, in addition to the difficulty in producing the magnetic material itself, the magnetic response characteristics of the magnetic material are reduced, and the sensitivity when used as a label is lowered. If it exceeds 30 nm, residual magnetism tends to occur, and self-aggregation tends to occur, and in addition, the magnetic substance is likely to be exposed on the surface of the magnetic substance-encapsulated particles. A preferred lower limit is 5 nm and a preferred upper limit is 20 nm.
本発明の磁性体内包粒子中における磁性体の含有量の下限は５０重量％、上限は８０重量％である。５０重量％未満であると、磁性量が低く、極微量の測定対象成分を分析する際に検出が困難となり、８０重量％を超えると、自己凝集しやすくなったり、磁性体内包粒子全体の重量が大きくなり過ぎたりしてクロマト展開性が劣る。好ましい下限は６０重量％、好ましい上限は７０重量％である。 The lower limit of the content of the magnetic substance in the magnetic substance-encapsulated particles of the present invention is 50% by weight, and the upper limit is 80% by weight. If the amount is less than 50% by weight, the amount of magnetism is low, and it becomes difficult to detect when analyzing a very small amount of the measurement target component. If the amount exceeds 80% by weight, self-aggregation tends to occur or the total weight of the magnetic substance-encapsulated particles The chromatographic developability is inferior due to the excessively large. A preferred lower limit is 60% by weight and a preferred upper limit is 70% by weight.
磁性体を５０〜８０重量％含有する磁性体内包粒子は、例えば、製造過程で得られる磁性体内包粒子分散液のうち、ネオジム磁石を用いて１分間で磁石に引き寄せられる磁性体含有率が高い分画を、磁性体内包粒子として分取することができる。
なお、磁性体含有率が８０重量％を超える粒子が生成した場合、磁性体凝集塊になり重合器壁面などに付着するため、混入することはない。
The magnetic substance-encapsulated particles containing 50 to 80% by weight of the magnetic substance have a high content of the magnetic substance that is attracted to the magnet in one minute by using a neodymium magnet in the magnetic substance-encapsulated particle dispersion obtained in the manufacturing process, for example. The fraction can be collected as magnetic inclusion particles.
When particles having a magnetic substance content of more than 80% by weight are produced, they become a magnetic agglomerate and adhere to the wall surface of the polymerizer and are not mixed.
本発明の磁性体内包粒子は、平均粒子径の下限が５０ｎｍ、上限が５００ｎｍである。５０ｎｍ未満であると、媒体中に懸濁させたときの分散安定性が悪くなって自己凝集しやすくなり、５００ｎｍを超えると、クロマト担体の孔を通過しにくくなり、クロマト展開性が劣る。好ましい下限は１００ｎｍ、好ましい上限は４００ｎｍである。 In the magnetic substance-encapsulated particles of the present invention, the lower limit of the average particle diameter is 50 nm, and the upper limit is 500 nm. When the thickness is less than 50 nm, the dispersion stability when suspended in a medium is deteriorated and the self-aggregation is liable to occur. When the thickness exceeds 500 nm, it is difficult to pass through the pores of the chromatographic carrier and the chromatographic developability is poor. A preferred lower limit is 100 nm and a preferred upper limit is 400 nm.
本発明の磁性体内包粒子は、粒子径のＣＶ値が５０％未満であることが好ましい。５０％以上であると、粒子径の大きい粒子がクロマト担体の孔を通過しにくくなり、クロマト担体中に残存することがある。 The magnetic substance-encapsulated particles of the present invention preferably have a particle diameter CV value of less than 50%. When it is 50% or more, particles having a large particle diameter are difficult to pass through the pores of the chromatographic carrier and may remain in the chromatographic carrier.
本発明の磁性体内包粒子は、上記有機高分子物質を構成する炭素元素と上記磁性体を構成する金属元素との構成比率の絶対偏差の好ましい上限が０．３である。
なお、本明細書において絶対偏差とは、上記有機高分子物質を構成する炭素元素と、磁性体を構成する金属元素の同期発光を測定し、粒子毎の炭素元素と金属元素との混在比率のバラツキから算出したその測定データの分散状態を示す偏差値であって、磁性体内包粒子の磁性体含有量のバラツキを示すパラメータである。上記絶対偏差の数値が小さいほど磁性体含有量のバラツキが小さく、すなわち、磁性体内包粒子の均一性が高く、大きいほど磁性体含有量のバラツキが大きい、すなわち、磁性体内包粒子の均一性が低いことを示す。
上記絶対偏差が０．３を超えると、免疫測定法に利用した場合に、測定再現性や定量性が低くなり測定精度が悪化することがあり、得られる測定データの信頼性が低くなる。より好ましい上限は０．２７、更に好ましい上限は０．２５、特に好ましい上限は０．２０である。
In the magnetic substance-encapsulated particles of the present invention, the preferable upper limit of the absolute deviation of the constituent ratio between the carbon element constituting the organic polymer substance and the metal element constituting the magnetic substance is 0.3.
In the present specification, the absolute deviation means the synchronous emission of the carbon element that constitutes the organic polymer substance and the metal element that constitutes the magnetic substance, and the mixture ratio of the carbon element and the metal element for each particle. It is a deviation value indicating the dispersion state of the measurement data calculated from the variation, and is a parameter indicating the variation of the magnetic substance content of the magnetic substance-encapsulated particles. The smaller the absolute deviation value, the smaller the variation in the magnetic substance content, that is, the higher the uniformity of the magnetic substance-encapsulated particles, and the larger the value, the greater the variation in the magnetic substance content, that is, the uniformity of the magnetic substance-encapsulated particles. Indicates low.
When the absolute deviation exceeds 0.3, when used in an immunoassay, measurement reproducibility and quantitativeness may be lowered and measurement accuracy may be deteriorated, resulting in reduced reliability of measurement data obtained. A more preferred upper limit is 0.27, a still more preferred upper limit is 0.25, and a particularly preferred upper limit is 0.20.
本発明の磁性体内包粒子を製造する方法としては特に限定されず、例えば、懸濁重合法、マイクロサスペンジョン重合法、ミニエマルジョン重合法、分散重合法等を応用した方法が挙げられる。なかでも、粒子径の小さな粒子を容易に製造することができることから、ミニエマルジョン重合法を応用した方法が好適である。
具体的には、有機溶媒中に磁性体を分散させた磁性体分散液と、モノマー、重合開始剤、及び、共界面活性剤を含有するモノマー溶液とを混合してモノマー混合液を調製する工程１、前記モノマー混合液を、界面活性剤を溶解させた水系媒体に滴下し、微分散させることにより、不均一なモノマー液滴が形成したミニエマルジョン溶液を調製する工程２、前記モノマー液滴を重合させ、磁性体内包粒子分散液を調製する工程３、及び、前記磁性体内包粒子分散液から、磁気分離法により磁性体含有率が５０〜８０重量％の粒子を分画し、回収する工程４を有する磁性体内包粒子の製造方法が挙げられる。このような磁性体内包粒子の製造方法もまた、本発明の１つである。
以下、ミニエマルジョン重合法を応用した本発明の磁性体内包粒子の製造方法を詳しく説明する。
The method for producing the magnetic substance-encapsulated particles of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a method applying a suspension polymerization method, a micro suspension polymerization method, a miniemulsion polymerization method, a dispersion polymerization method and the like. Among these, a method using the miniemulsion polymerization method is preferable because particles having a small particle diameter can be easily produced.
Specifically, a step of preparing a monomer mixture by mixing a magnetic dispersion in which a magnetic substance is dispersed in an organic solvent, and a monomer solution containing a monomer, a polymerization initiator, and a co-surfactant. 1. A step of preparing a mini-emulsion solution in which non-uniform monomer droplets are formed by dripping the monomer mixture into an aqueous medium in which a surfactant is dissolved and finely dispersing the mixture. Step 3 of polymerizing and preparing a magnetic substance-encapsulated particle dispersion, and a step of fractionating and recovering particles having a magnetic substance content of 50 to 80% by weight from the magnetic substance-encapsulated particle dispersion by a magnetic separation method 4 is a method for producing a magnetic substance-encapsulated particle having 4. Such a method for producing a magnetic substance-encapsulated particle is also one aspect of the present invention.
Hereinafter, the method for producing the magnetic substance-encapsulated particles of the present invention using the miniemulsion polymerization method will be described in detail.
本発明の磁性体内包粒子の製造方法では、まず、有機溶媒中に磁性体を分散させた磁性体分散液と、モノマー、重合開始剤、及び、共界面活性剤を含有するモノマー溶液とを混合してモノマー混合液を調製する工程１を行う。
このように、いったん磁性体分散液を調製し、これをモノマーと混合してモノマー混合液を調製することにより、磁性体が上記有機高分子材料からなるマトリックス中に上述の分散径で微分散し、かつ、上述の絶対偏差の値を達成した磁性体の含有量が均一な磁性体内包粒子を得ることができる。
In the method for producing a magnetic substance-encapsulated particle of the present invention, first, a magnetic substance dispersion liquid in which a magnetic substance is dispersed in an organic solvent and a monomer solution containing a monomer, a polymerization initiator, and a co-surfactant are mixed. Then, Step 1 for preparing the monomer mixture is performed.
Thus, once the magnetic dispersion is prepared and mixed with the monomer to prepare the monomer mixture, the magnetic substance is finely dispersed in the matrix made of the organic polymer material with the above-mentioned dispersion diameter. In addition, it is possible to obtain magnetic substance-encapsulated particles having a uniform magnetic substance content that achieves the absolute deviation value described above.
上記磁性体分散液に用いる有機溶媒としては、磁性体の分散性に優れ、磁性体を溶解してしまったりせず、かつ、モノマーと混合可能なものであれば特に限定されない。
このような有機溶媒としては、ブタノールや脂肪族炭化水素系溶媒を含有するものが好適である。上記脂肪族炭化水素系溶媒としては、磁性体の分散性に特に優れることから、炭素数５〜２０の直鎖又は分岐のものが好適であり、炭素数５〜７の直鎖又は分岐のものがより好適である。具体的には、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、イソブタン、イソペンタン等が挙げられる。これらの脂肪族炭化水素系溶媒は単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。
The organic solvent used in the magnetic dispersion liquid is not particularly limited as long as it is excellent in dispersibility of the magnetic substance, does not dissolve the magnetic substance, and can be mixed with the monomer.
As such an organic solvent, a solvent containing butanol or an aliphatic hydrocarbon solvent is suitable. As the aliphatic hydrocarbon solvent, a linear or branched one having 5 to 20 carbon atoms is preferable because the dispersibility of the magnetic substance is particularly excellent, and a straight or branched one having 5 to 7 carbon atoms. Is more preferred. Specific examples include pentane, hexane, heptane, isobutane, isopentane and the like. These aliphatic hydrocarbon solvents may be used alone or in combination of two or more.
上記有機溶媒中における上記脂肪族炭化水素系溶媒の含有量としては、８０重量％以上であることが好ましい。８０重量％未満であると、充分に磁性体を分散させることができず、ひいては得られる磁性体内包粒子中における磁性体の分散径が大きくなったり、磁性体の含有量のバラツキが大きくなったりすることがある。 The content of the aliphatic hydrocarbon solvent in the organic solvent is preferably 80% by weight or more. If it is less than 80% by weight, the magnetic substance cannot be sufficiently dispersed, and as a result, the dispersion diameter of the magnetic substance in the obtained magnetic substance-encapsulated particles becomes large, and the variation in the content of the magnetic substance becomes large. There are things to do.
上記有機溶媒の含有量としては、磁性体に対して好ましい下限が２０重量％、好ましい上限が５００重量％である。２０重量％未満であると、充分に磁性体を分散できないことがあり、５００重量％を超えると、重合工程後に残存溶媒の除去が必要となり操作が煩雑となることがある。より好ましい下限は３０重量％、より好ましい上限は３００重量％である。なお、沸点が高い有機溶媒を用いる場合には、より少ない量を用いることが好ましい。 The content of the organic solvent is preferably 20% by weight and preferably 500% by weight with respect to the magnetic substance. If the amount is less than 20% by weight, the magnetic substance may not be sufficiently dispersed. If the amount exceeds 500% by weight, the residual solvent must be removed after the polymerization step, and the operation may be complicated. A more preferred lower limit is 30% by weight, and a more preferred upper limit is 300% by weight. In addition, when using an organic solvent with a high boiling point, it is preferable to use a smaller amount.
上記重合開始剤としては、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−（２−メチルプロパンニトリル）、２，２’−アゾビス−（２，４−ジメチルペンタンニトリル）、２，２’−アゾビス−（２−メチルブタンニトリル）、１，１’−アゾビス−（シクロヘキサンカルボニトリル）、２，２’−アゾビス−（２，４−ジメチル−４−メトキシバレロニトリル）、２，２’−アゾビス−（２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２’−アゾビス−（２−アミジノプロパン）ヒドロクロリド等のアゾ（アゾビスニトリル）タイプの開始剤、過酸化ベンゾイル、クメンヒドロペルオキシド、過酸化水素、過酸化アセチル、過酸化ラウロイル、過硫酸塩（例えば過硫酸アンモニウム）、過酸エステル（例えばｔ−ブチルペルオクテート、α−クミルペルオキシピバレート及びｔ−ブチルペルオクテート）等の過酸化物タイプのラジカル系重合開始剤等が挙げられる。
これらの重合開始剤は、モノマー混合物液滴の分散液の調製時に添加してもよいし、調整後に別に添加してもよい。
上記重合開始剤の含有量としては特に限定されないが、モノマー１００重量部に対して好ましい下限が０．１重量部、好ましい上限が３０重量部である。
Examples of the polymerization initiator include 2,2′-azobisisobutyronitrile, 2,2′-azobis- (2-methylpropanenitrile), 2,2′-azobis- (2,4-dimethylpentane). Nitrile), 2,2′-azobis- (2-methylbutanenitrile), 1,1′-azobis- (cyclohexanecarbonitrile), 2,2′-azobis- (2,4-dimethyl-4-methoxyvaleronitrile) ), 2,2′-azobis- (2,4-dimethylvaleronitrile), 2,2′-azobis- (2-amidinopropane) hydrochloride and other azo (azobisnitrile) type initiators, benzoyl peroxide , Cumene hydroperoxide, hydrogen peroxide, acetyl peroxide, lauroyl peroxide, persulfates (eg ammonium persulfate), peracid esters (eg t-butyl peroxide) Tate, alpha-cumyl peroxypivalate and t- butyl per octoate) peroxide type radical polymerization initiators such as and the like.
These polymerization initiators may be added when preparing the dispersion liquid of the monomer mixture droplets, or may be added separately after the adjustment.
Although it does not specifically limit as content of the said polymerization initiator, A preferable minimum is 0.1 weight part with respect to 100 weight part of monomers, and a preferable upper limit is 30 weight part.
上記共界面活性剤としては、ミニエマルジョン重合において一般的に用いられているものであれば特に限定されないが、例えば、ヘキサデカン、スクアラン、シクロオクタン等のＣ８〜Ｃ３０の直鎖、分岐鎖、環状アルカン類；ステアリルメタクリレート、ドデシルメタクリレート等のＣ８〜Ｃ３０アルキルアクリレート；セチルアルコール等のＣ８〜Ｃ３０アルキルアルコール；ドデシルメルカプタン等のＣ８〜Ｃ３０アルキルチオール；ポリウレタン、ポリエステル、ポリスチレン等のポリマー類；長鎖脂肪族又は芳香族カルボン酸類、長鎖脂肪族又は芳香族カルボン酸エステル類、長鎖脂肪族又は芳香族アミン類、ケトン類、ハロゲン化アルカン類、シラン類、シロキサン類、イソシアネート類等が挙げられる。なかでも、炭素数が１２以上のアルカン類が好適であり、なかでも炭素数１２〜２０のアルカン類がより好適である。これらの共界面活性剤は単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。
上記共界面活性剤の含有量としては特に限定されないが、モノマー１００重量部に対して好ましい下限が０．１重量部、好ましい上限が５０重量部である。
The co-surfactant is not particularly limited as long as it is generally used in miniemulsion polymerization. For example, C 8 -C 30 straight chain, branched chain such as hexadecane, squalane, cyclooctane, etc. cyclic alkanes; C 8 -C 30 alkyl thiols such as dodecyl mercaptan;; C 8 -C 30 alkyl alcohols such as cetyl alcohol; stearyl methacrylate, C 8 -C 30 alkyl acrylate and dodecyl methacrylate polyurethane, polyester, polystyrene, etc. Polymers; long chain aliphatic or aromatic carboxylic acids, long chain aliphatic or aromatic carboxylic esters, long chain aliphatic or aromatic amines, ketones, halogenated alkanes, silanes, siloxanes, isocyanate And the like. Of these, alkanes having 12 or more carbon atoms are preferable, and alkanes having 12 to 20 carbon atoms are more preferable. These cosurfactants may be used alone or in combination of two or more.
Although it does not specifically limit as content of the said co-surfactant, A preferable minimum is 0.1 weight part with respect to 100 weight part of monomers, and a preferable upper limit is 50 weight part.
上記磁性体分散液とモノマーとを混合してモノマー混合液を調製する際には、必要に応じて後述するような界面活性剤を用いてもよい。 When the monomer dispersion is prepared by mixing the magnetic dispersion liquid and the monomer, a surfactant as described later may be used as necessary.
本発明の磁性体内包粒子の製造方法では、次いで、上記モノマー混合液を、界面活性剤を溶解させた水系媒体に滴下し、微分散させることにより、不均一なモノマー液滴が形成したミニエマルジョン溶液を調製する工程２を行う。 In the method for producing magnetic substance-encapsulated particles of the present invention, the above-mentioned monomer mixture is then dropped onto an aqueous medium in which a surfactant is dissolved and finely dispersed to form a miniemulsion in which non-uniform monomer droplets are formed. Step 2 of preparing the solution is performed.
上記水系媒体としては特に限定されず、通常は蒸留水やイオン交換水等が用いられる。 It does not specifically limit as said aqueous medium, Usually, distilled water, ion-exchange water, etc. are used.
上記界面活性剤としては特に限定されず、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤のいずれも用いることができる。なかでも、アニオン性界面活性剤が好適である。 The surfactant is not particularly limited, and any of an anionic surfactant, a cationic surfactant, and a nonionic surfactant can be used. Of these, anionic surfactants are preferred.
上記アニオン性界面活性剤としては特に限定されず、例えば、ドデシルベンゼンスルホネート、デシルベンゼンスルホネート、ウンデシルベンゼンスルホネート、トリデシルベンゼンスルホネート、ノニルベンゼンスルホネート及びこれらのナトリウム、カリウム、アンモニウム塩等が挙げられる。 The anionic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include dodecyl benzene sulfonate, decyl benzene sulfonate, undecyl benzene sulfonate, tridecyl benzene sulfonate, nonyl benzene sulfonate, and sodium, potassium, and ammonium salts thereof.
上記カチオン性界面活性剤としては特に限定されず、例えば、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。 The cationic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include cetyltrimethylammonium promide, hexadecylpyridinium chloride, hexadecyltrimethylammonium chloride and the like.
上記ノニオン性界面活性剤としては特に限定されず、例えば、ポリビニルアルコール等が挙げられる。また、上記ノニオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｘ−１１４、Ｘ−３０５、Ｎ−１０１（以上、ユニオンカーバイド社製）、Ｔｗｅｅｎ ２０、４０、６０、８０、８５（以上、アイ・シー・アイ社製）、Ｂｒｉｊ ３５、５８、７６、９８（以上、アイ・シー・アイ社製）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（シェル社製）、Ｉｇｅｐｏｌ ＣＯ５３０、ＣＯ６３０、ＣＯ７２０、ＣＯ７３０（ローヌ・プーラン社製）等の市販のものを用いることができる。これらのなかでは、アニオン性界面活性剤が好ましい。 The nonionic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include polyvinyl alcohol. Examples of the nonionic surfactant include Triton X-100, X-114, X-305, N-101 (above, manufactured by Union Carbide), Tween 20, 40, 60, 80, 85 (above. , Made by ICI), Brij 35, 58, 76, 98 (above, made by ICI), Nonidet P-40 (made by Shell), Igepol CO530, CO630, CO720, CO730 (Rhone) A commercially available product such as (made by Pulan Co., Ltd.) can be used. Of these, anionic surfactants are preferred.
上記界面活性剤としては、上記モノマーと重合可能な反応基を有する反応性界面活性剤も用いることができる。上記反応基としては、例えば、ビニル基、アリル基、（メタ）アクリロイル基等のエチレン性不飽和基が好適である。
このような反応性界面活性剤としては特に限定されず、例えば、特開平９−２７９０７３号公報等に記載されるものが挙げられる。具体的には、上記アニオン性界面活性剤としては、例えば、ラウリル（アリルベンゼン）スルホン酸塩、ラウリルスチレンスルホン酸塩、ステアリル（アリルベンゼン）スルホン酸塩、ステアリルスチレンスルホン酸塩等のアルキルベンゼンスルホン酸塩類又はそれらのポリエチレンオキサイド付加物類；ラウリルアリルスルホ琥珀酸エステル、ラウリルビニルスルホ琥珀酸エステル、ステアリルアリルスルホ琥珀酸エステル、ステアリルビニルスルホ琥珀酸エステル等のアルキルスルホ琥珀酸エステル類又はそれらのポリエチレンオキサイド付加物類；（メタ）アクリル酸ラウリルスルホン酸塩、オレイルスルホン酸塩等のアルキル又はアルケニルスルホン酸塩類、（メタ）アクリル酸ステアリル硫酸塩、オレイル硫酸塩等のアルキル又はアルケニル硫酸塩類又はそれらのポリエチレンオキサイド付加物類等が挙げられる。
As the surfactant, a reactive surfactant having a reactive group polymerizable with the monomer can also be used. As said reactive group, ethylenically unsaturated groups, such as a vinyl group, an allyl group, and a (meth) acryloyl group, are suitable, for example.
Such a reactive surfactant is not particularly limited, and examples thereof include those described in JP-A-9-279073. Specifically, examples of the anionic surfactant include alkylbenzene sulfonic acids such as lauryl (allylbenzene) sulfonate, lauryl styrene sulfonate, stearyl (allyl benzene) sulfonate, and stearyl styrene sulfonate. Salts or their polyethylene oxide adducts; alkyl sulfosuccinates such as lauryl allyl sulfosuccinate, lauryl vinyl sulfosuccinate, stearyl allyl sulfosuccinate, stearyl vinyl sulfosuccinate, or their polyethylene oxide Adducts; alkyl or alkenyl sulfonates such as (meth) acrylic acid lauryl sulfonate and oleyl sulfonate; alkyl such as (meth) acrylic acid stearyl sulfate and oleyl sulfate; Alkenyl sulfates or polyethylene oxide adducts thereof, and the like.
上記カチオン性界面活性剤としては、例えば、ラウリルトリアリルアンモニウムクロライド、ステアリルトリアリルアンモニウムクロライド、ジステアリルジアリルアンモニウムクロライド等の第４級アンモニウム塩類等が挙げられる。 Examples of the cationic surfactant include quaternary ammonium salts such as lauryl triallyl ammonium chloride, stearyl triallyl ammonium chloride, and distearyl diallyl ammonium chloride.
上記ノニオン性界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールオクチル（アリルフェニル）エーテル、ポリエチレングリコールノニル（アリルフェニル）エーテル、ポリエチレングリコールオレイルフェニルエーテル等のポリエチレングリコールアルキル又はアルケニルフェニルエーテル類；モノステアリル酸モノアリルグリセリル、ジステアリン酸モノアリルグリセリル等のグリセリン脂肪酸エステル類又はそれらのポリエチレンオキサイド付加物類；モノステアリン酸モノアリルソルビタン、トリステアリン酸モノアリルソルビタン等のソルビタン脂肪酸エステル類又はそれらのポリエチレンオキサイド付加物類；ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸のポリエチレンオキサイドエステル類等が挙げられる。 Examples of the nonionic surfactant include polyethylene glycol alkyl or alkenyl phenyl ethers such as polyethylene glycol octyl (allylphenyl) ether, polyethylene glycol nonyl (allylphenyl) ether, polyethylene glycol oleyl phenyl ether; monoallyl monoallylate Glycerin fatty acid esters such as glyceryl and monoallyl glyceryl distearate or polyethylene oxide adducts thereof; sorbitan fatty acid esters such as monoallyl sorbitan monostearate and monoallyl sorbitan tristearate or polyethylene oxide adducts thereof; Polyethylene glycol mono (meth) acrylate, polyethylene glycol di (meth) acrylate, etc. Polyethylene oxide esters of acrylic acid and the like.
上記反応性界面活性剤としては、例えば、アニオン性界面活性剤であるアクアロンＨＳ−１０（第一工業製薬社製）、Ａｎｔｏｘ−ＭＳ−６０、ＲＡ−１０００シリーズ、Ａｎｔｏｘ−ＭＳ−２Ｎ（日本乳化剤社製）、アデカリアソープＳＥ−１０Ｎ（旭電化工業社製）、テラムルＳ−１８０Ａ（花王社製）、エレミノールＪＳ−２（三洋化成工業社製）；カチオン性界面活性剤であるＲＦ―７５１（日本乳化剤社製）；ノニオン性界面活性剤であるアデカリアソープＮＥ−１０（旭電化工業社製）、ブレンマーＰＥ−２００、ブレンマーＰＥ−３５０、ブレンマーＰＥ−４００（日本油脂社製）等の市販品が挙げられる。 Examples of the reactive surfactant include Aqualon HS-10 (Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.), Antox-MS-60, RA-1000 series, and Antox-MS-2N (Nippon Emulsifier) which are anionic surfactants. Adekaria soap SE-10N (Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.), Teramuru S-180A (Kao Co., Ltd.), Eleminol JS-2 (Sanyo Kasei Kogyo Co., Ltd.); RF-751, a cationic surfactant (Manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.); Adequaria soap NE-10 (manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.) which is a nonionic surfactant, Blemmer PE-200, Blemmer PE-350, Blemmer PE-400 (manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), etc. A commercial item is mentioned.
これらの界面活性剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
上記界面活性剤の含有量としては、モノマー１００重量部に対し好ましい下限は０．０１重量部、好ましい上限が５重量部であり、より好ましい下限は０．１重量部、より好ましい上限は３０重量部である。
These surfactants may be used alone or in combination of two or more.
As the content of the surfactant, a preferable lower limit is 0.01 part by weight and a preferable upper limit is 5 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the monomer, a more preferable lower limit is 0.1 part by weight, and a more preferable upper limit is 30 parts by weight. Part.
上記モノマー混合液からなる液滴を微分散させる方法としては特に限定されず、例えば、界面活性剤を含有する水系媒体中に上記モノマー混合液を加え、高い剪断力を発生させる剪断混合装置によって乳化させる方法等の従来公知の方法を用いることができる。
上記剪断混合装置としては特に限定されず、例えば、ピストンホモジナイザー、マイクロ流動化装置（例えば、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（みずほ工業社製））、超音波分散機等が挙げられる。なかでも、プローブ式の超音波分散機が好適に用いられる。
The method for finely dispersing the droplets composed of the monomer mixture is not particularly limited. For example, the monomer mixture is added to an aqueous medium containing a surfactant and emulsified by a shear mixing device that generates a high shear force. Conventionally known methods such as a method of making them can be used.
The shear mixer is not particularly limited, and examples thereof include a piston homogenizer, a microfluidizer (for example, Microfluidizer (manufactured by Mizuho Kogyo Co., Ltd.)), an ultrasonic disperser, and the like. Of these, a probe-type ultrasonic disperser is preferably used.
微分散させる際に超音波分散機を用いる場合、超音波出力の好ましい下限は５Ｗ、好ましい上限は２００Ｗである。５Ｗ未満であると、分散力不足により大きな液滴が生じ、次工程の重合反応が困難となることがあり、２００Ｗを超えると、所望の磁性体内包粒子が得られないことがある。
また、超音波の照射時間としては、超音波出力にもよるが、１０〜３０秒の範囲で行うことが好ましい。
When an ultrasonic disperser is used for fine dispersion, the preferable lower limit of the ultrasonic output is 5 W, and the preferable upper limit is 200 W. If it is less than 5 W, large droplets are generated due to insufficient dispersion force, and the polymerization reaction in the next step may be difficult. If it exceeds 200 W, desired magnetic encapsulated particles may not be obtained.
Moreover, although it is based also on an ultrasonic output as an ultrasonic irradiation time, it is preferable to carry out in the range for 10 to 30 seconds.
ここで、完全に均一なモノマー液滴を形成させる、一般的なミニエマルジョン重合法の場合、高含有率の磁性体内包粒子を得ることができない。
本明細書において、不均一とは、液滴が均一になる前に分散工程を止めることであって、磁気分離法により回収する磁性体内包粒子については、粒子径や磁性体含有量は粒子毎に不均一ということではない。不均一になる条件は、数値化することは難しいが、超音波ホモジナイザーの出力が低く、かつ、処理時間が短い条件で実現できている。
また、不均一なモノマー液滴とは、超音波分散処理の際、磁性体内包量によってモノマー液滴が、同じ超音波出力であっても液滴の***効率が変わることを利用し、系全体としては液滴径が均一に至るまでの不均一な状態で処理を終えることにより得られる。また、この方法により得られるモノマー液滴は、液滴径を均一にする場合よりも磁性体含有率の高い液滴になる。また、磁性体内包粒子は、モノマー液滴が不均一な状態で重合後、磁気分離法により磁性体含有率が高く、かつ、均一性の高い分画を回収することにより得られる。
Here, in the case of a general mini-emulsion polymerization method in which completely uniform monomer droplets are formed, it is not possible to obtain magnetic content-encapsulated particles having a high content.
In this specification, the term “non-uniform” means that the dispersion step is stopped before the droplets become uniform. For magnetic inclusion particles recovered by the magnetic separation method, the particle diameter and magnetic substance content are the same for each particle. This is not to say that it is uneven. It is difficult to quantify the non-uniform condition, but it can be realized under the condition that the output of the ultrasonic homogenizer is low and the processing time is short.
Non-uniform monomer droplets use the fact that the droplet splitting efficiency changes depending on the amount of magnetic inclusions during the ultrasonic dispersion process even if the monomer droplets have the same ultrasonic output. Can be obtained by finishing the treatment in a non-uniform state until the droplet diameter becomes uniform. Further, the monomer droplets obtained by this method are droplets having a higher magnetic substance content than when the droplet diameter is made uniform. Further, the magnetic substance-encapsulated particles can be obtained by polymerizing the monomer droplets in a non-uniform state and then collecting a fraction having a high magnetic substance content and high uniformity by a magnetic separation method.
本発明の免疫測定用磁性粒子の製造方法においては、超音波出力や乳化時間を調整し、不均一な乳化状態で微分散処理を終了する。このように完全均一なモノマー液滴にしないことにより、磁性体含有率の高い磁性体内包粒子を得ることができる。 In the method for producing magnetic particles for immunoassay of the present invention, the ultrasonic output and the emulsification time are adjusted, and the fine dispersion process is terminated in a non-uniform emulsified state. By avoiding such a completely uniform monomer droplet, it is possible to obtain magnetic substance-encapsulated particles having a high magnetic substance content.
本発明の磁性体内包粒子の製造方法では、次いで、前記モノマー液滴を重合させ、磁性体内包粒子分散液を調製する工程３を行う。
上記重合は、通常５０〜９５℃で５〜２４時間程度加熱することにより行う。
In the method for producing a magnetic substance-encapsulated particle according to the present invention, next, Step 3 of polymerizing the monomer droplets to prepare a magnetic substance-encapsulated particle dispersion is performed.
The polymerization is usually carried out by heating at 50 to 95 ° C. for about 5 to 24 hours.
本発明の磁性体内包粒子の製造方法では、次いで、前記磁性体内包粒子分散液から、磁気分離法により磁性体含有率が５０〜８０重量％の粒子を分画し、回収する工程４を行う。 In the method for producing a magnetic substance-encapsulated particle according to the present invention, the step 4 of fractionating and recovering particles having a magnetic substance content of 50 to 80% by weight from the magnetic substance-encapsulated particle dispersion by a magnetic separation method is then performed. .
上記分画の方法としては特に限定されず、例えば、遠心分離法、磁気分離法等の精製方法が挙げられる。これにより、所望の平均粒子径、磁性体分散径及び磁性体含有量を有するものを採取することができ、本発明の磁性体内包粒子を得ることができる。
特に、精製方法のなかでも、磁気分離法が好適に用いられる。磁気分離の処理時間を短くすることで磁性体含有率の高い磁性体内包粒子を回収することができる。
The fractionation method is not particularly limited, and examples thereof include purification methods such as a centrifugal separation method and a magnetic separation method. Thereby, what has a desired average particle diameter, a magnetic substance dispersion diameter, and magnetic substance content can be extract | collected, and the magnetic substance inclusion particle | grains of this invention can be obtained.
In particular, the magnetic separation method is preferably used among the purification methods. By shortening the treatment time of magnetic separation, magnetic substance-encapsulated particles having a high magnetic substance content can be recovered.
本発明の磁性体内包粒子は、磁性体の含有量が多いことから、本発明の磁性体内包粒子に抗原又は抗体を結合又は吸着させ、免疫測定用粒子をすることにより、極微量の磁性体内包粒子であっても磁性量の検出が可能となり、高感度な免疫測定を行うことができる。
このような免疫測定用粒子もまた、本発明の１つである。
Since the magnetic substance-encapsulated particle of the present invention has a large content of magnetic substance, an extremely small amount of magnetic substance is obtained by binding or adsorbing an antigen or an antibody to the magnetic substance-encapsulated particle of the present invention to form an immunoassay particle. Even in the case of encapsulated particles, the amount of magnetism can be detected, and highly sensitive immunoassay can be performed.
Such immunoassay particles are also one aspect of the present invention.
また、本発明の磁性体内包粒子は、平均粒子径が５０〜５００ｎｍであり、かつ、磁性体の分散径が１〜３０ｎｍであることから、自己凝集を抑制することができ、本発明の磁性体内包粒子を支持体として、抗原や抗体等を結合又は吸着させた免疫測定用粒子は、通常孔径が５〜２０μｍであるクロマト担体中を容易に展開（移動）することができる。更に、クロマト担体に非特異的に吸着することもないことから、クロマト展開性にも極めて優れる。従って、本発明の免疫測定用粒子を用いれば、磁性体内包粒子の磁性量を標識として分析を行う免疫測定法、特に免疫クロマト法を好適に行うことができる。
このような本発明の免疫測定用粒子を用いた免疫測定法もまた、本発明の１つである。
In addition, since the magnetic substance-encapsulated particles of the present invention have an average particle diameter of 50 to 500 nm and a magnetic substance dispersion diameter of 1 to 30 nm, self-aggregation can be suppressed, and the magnetic particles of the present invention can be suppressed. The immunoassay particles to which antigens or antibodies are bound or adsorbed using the encapsulated particles as a support can be easily developed (moved) in a chromatographic carrier having a pore size of usually 5 to 20 μm. Furthermore, since it does not adsorb non-specifically to the chromatographic carrier, it is extremely excellent in chromatographic developability. Therefore, when the immunoassay particles of the present invention are used, an immunoassay method, particularly an immunochromatography method, in which analysis is performed using the magnetic content of the magnetic substance-encapsulated particles as a label can be suitably performed.
Such an immunoassay method using the immunoassay particles of the present invention is also one aspect of the present invention.
本発明によれば、磁性体内包粒子の平均粒子径を所定の大きさとし、かつ、磁性体の分散径及び含有量が特定の範囲内である磁性体内包粒子を用いた場合に、磁性体内包粒子の自己凝集が抑制され、クロマト展開性が向上するとともに、高感度な免疫測定を可能することができる。
本発明によれば、クロマト展開性に優れ、高感度な免疫測定を行うことが可能な磁性体内包粒子、磁性体内包粒子の製造方法、免疫測定用粒子及びこれを用いた免疫測定法を提供することができる。
According to the present invention, when the magnetic substance-encapsulated particles are used in which the average particle diameter of the magnetic substance-encapsulated particles is a predetermined size and the dispersion diameter and content of the magnetic substance are within a specific range. Self-aggregation of particles is suppressed, chromatographic developability is improved, and highly sensitive immunoassay is possible.
According to the present invention, there are provided a magnetic substance-encapsulated particle having excellent chromatographic developability and capable of performing highly sensitive immunoassay, a method for producing a magnetic substance-encapsulated particle, an immunoassay particle and an immunoassay method using the same. can do.
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）
（１）磁性体内包粒子の作製
磁性流体「フェリコロイドＨＣ５０（タイホー工業社製）」１０．０ｇ（磁性体５ｇ含有）をインキュベーター中で８０℃にて１２時間乾燥し、濃縮された磁性流体７．０ｇを得た。得られた磁性流体にヘキサン３ｇを加えて、一晩放置し、磁性体を分散させて磁性体分散液を得た。
得られた磁性体分散液の全量に対して、スチレン１０ｇ、ヘキサデカン０．８ｇ及び２，２’−アゾビスイソブチロニトリル０．０５ｇを加え、スターラーを用いて氷冷下で混合してモノマー混合液を得た。
Example 1
(1) Preparation of magnetic body-encapsulated particles 10.0 g (containing 5 g of magnetic substance) of a magnetic fluid “Ferricolloid HC50 (made by Taiho Kogyo Co., Ltd.)” was dried in an incubator at 80 ° C. for 12 hours, and concentrated magnetic fluid 7 0.0 g was obtained. 3 g of hexane was added to the obtained magnetic fluid and left overnight to disperse the magnetic material to obtain a magnetic material dispersion.
10 g of styrene, 0.8 g of hexadecane and 0.05 g of 2,2′-azobisisobutyronitrile are added to the total amount of the obtained magnetic dispersion, and the mixture is mixed under ice cooling using a stirrer. A mixture was obtained.
次いで、水１００ｇにドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．８ｇを溶解させた水溶液を、得られたモノマー混合液を加え、出力２００Ｗのプローブ型の超音波ホモジナイザー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ２５０、Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて、氷冷下、出力目盛り５（７０Ｗ）で２分間処理して、磁性体を含むモノマー混合液の液滴が水中に分散したミニエマルジョン溶液を調製した。
得られたミニエマルジョン溶液を窒素雰囲気下、８０℃で、２４時間重合することにより、磁性体内包粒子分散液を得た。
次いで、得られた磁性体内包粒子分散液のうち、ネオジム磁石を用いて１分間で磁石に引き寄せられる磁性体含有率が高い分画を、磁性体内包粒子として分取した。
Next, an aqueous solution obtained by dissolving 0.8 g of sodium dodecylbenzenesulfonate in 100 g of water was added to the obtained monomer mixture, and a probe type ultrasonic homogenizer (Sonifier model 250, manufactured by Branson) with an output of 200 W was used. Under ice-cooling, the mixture was treated for 2 minutes at an output scale of 5 (70 W) to prepare a mini-emulsion solution in which droplets of a monomer mixture containing a magnetic substance were dispersed in water.
The obtained mini-emulsion solution was polymerized at 80 ° C. for 24 hours under a nitrogen atmosphere to obtain a magnetic substance-encapsulated particle dispersion.
Next, of the obtained magnetic substance-encapsulated particle dispersion, a fraction having a high magnetic substance content that was attracted to the magnet in one minute using a neodymium magnet was fractionated as magnetic substance-encapsulated particles.
得られた磁性体内包粒子について、動的光散乱光度計（Ｐｈｏｔａｌ ＰＡＲ−ＩＩＩＳ、大塚電子社製）を用いて動的光散乱法により粒子径を測定したところ、平均粒子径は２６３ｎｍであった。また、得られた磁性体内包粒子を水で希釈し、金属メッシュで支持したコロジオン膜上に沈着固定した後、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、磁性体の分散径を測定したところ、１０〜２５ｎｍであった。更に、ＴＧ−ＤＴＡ分析により磁性体内包粒子中の磁性体含有量を測定したところ６７重量％であった。 When the particle diameter of the obtained magnetic substance-encapsulated particles was measured by a dynamic light scattering method using a dynamic light scattering photometer (Photo PAR-IIIS, manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.), the average particle diameter was 263 nm. . Moreover, after diluting the obtained magnetic substance-encapsulated particles with water and depositing and fixing on a collodion film supported by a metal mesh, the dispersion diameter of the magnetic substance was measured using a transmission electron microscope (TEM). It was 10-25 nm. Furthermore, the magnetic substance content in the magnetic substance-encapsulated particles was measured by TG-DTA analysis and found to be 67% by weight.
（２）免疫測定用粒子の作製
得られた磁性体内包粒子５．０ｍｇにｐＨ９．５の水酸化カリウム水溶液１ｍＬを加え、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離後、上清を除去し、分散液に存在する界面活性剤を除去した。続いて、得られた磁性体内包粒子に、０．０２Ｍリン酸バッファー１．０ｍＬを添加し、超音波で再分散後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離し、上清を除去した。この遠心洗浄操作を３回繰り返した。
(2) Preparation of immunoassay particles 1 mL of aqueous potassium hydroxide solution at pH 9.5 was added to 5.0 mg of the magnetically encapsulated particles obtained, centrifuged at 15000 RPM for 20 minutes, the supernatant was removed, and the dispersion was added. Any surfactant present was removed. Subsequently, 1.0 mL of 0.02 M phosphate buffer was added to the obtained magnetic substance-encapsulated particles, redispersed with ultrasound, and centrifuged at 15000 RPM for 20 minutes to remove the supernatant. This centrifugal washing operation was repeated three times.
続いて、得られた磁性体内包粒子に、０．０２Ｍリン酸バッファー１．０ｍＬを添加し、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体１００μｇ加え、３７℃恒温槽中で２時間攪拌した。その後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、未反応の抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体を除去した。なお、粒子への抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体結合量は、上清の蛋白濃度測定から仕込みの７２％であることを確認した。 Subsequently, 1.0 mL of 0.02 M phosphate buffer was added to the obtained magnetic substance-encapsulated particles, 100 μg of anti-α-hCG monoclonal antibody was added, and the mixture was stirred in a 37 ° C. constant temperature bath for 2 hours. Thereafter, centrifugation was performed at 15000 RPM for 20 minutes to remove unreacted anti-α-hCG monoclonal antibody. The amount of anti-α-hCG monoclonal antibody bound to the particles was confirmed to be 72% of the preparation based on the protein concentration measurement of the supernatant.
得られた磁性体内包粒子を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。その後、磁性体内包粒子を、牛血清アルブミンが１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、３７℃恒温槽で１時間撹拌し、ブロッキング処理を行った。次いで、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、牛血清アルブミン及びグリセロールを各々１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに分散させ、免疫測定用粒子を得た。 The obtained magnetic substance-encapsulated particles were suspended in 1 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 6.5) and centrifuged again. Thereafter, the magnetic substance-encapsulated particles are suspended in 1 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 6.5) adjusted so that bovine serum albumin has a concentration of 1% (w / v) and stirred in a 37 ° C. constant temperature bath for 1 hour. Then, blocking treatment was performed. Next, centrifugation was carried out at 15000 RPM for 20 minutes, and 100 mM phosphoric acid adjusted so that bovine serum albumin and glycerol each had a concentration of 1% (w / v) and sodium azide to a concentration of 0.01% (w / v). It was dispersed in 1 mL of a buffer solution (pH 7.5) to obtain immunoassay particles.
（実施例２）
出力２００Ｗのプローブ型の超音波ホモジナイザー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ２５０、Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて、氷冷下、出力目盛り３（３０Ｗ）で５分間処理したこと以外は、実施例１と同様にして、平均粒子径３１０ｎｍ、磁性体の分散径１０〜２５ｎｍ、磁性体の含有量６２重量％の磁性体内包粒子及び免疫測定用粒子を得た。
(Example 2)
The average particle size was the same as in Example 1 except that it was treated with an output scale 3 (30 W) for 5 minutes under ice cooling using a probe-type ultrasonic homogenizer (Sonifer model 250, manufactured by Branson) with an output of 200 W. Magnetic body-encapsulated particles and immunoassay particles having a diameter of 310 nm, a magnetic dispersion diameter of 10 to 25 nm, and a magnetic substance content of 62% by weight were obtained.
（比較例１）
磁性流体「フェリコロイドＨＣ５０」４．０ｇ（磁性体２ｇ含有）をインキュベーター中で８０℃にて１２時間乾燥し、濃縮された磁性流体３．０ｇを得た。次いで、得られた磁性流体にヘキサン１ｇを加え、一晩放置し、磁性体分散液を得た。
得られた磁性体分散液について、出力４００Ｗのプローブ型の超音波ホモジナイザー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ４５０、Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて出力目盛り５（１１０Ｗ）で１０分間処理したこと、及び、磁性体内包粒子分散液のうち、ネオジム磁石を用いて５分間で磁石に引き寄せられる分画を磁性体内包粒子として分取したこと以外は実施例１と同様にして、平均粒子径１８０ｎｍ、磁性体の分散径１０〜２５ｎｍ、磁性体の含有量３６重量％の磁性体内包粒子及び免疫測定用粒子を得た。
(Comparative Example 1)
The magnetic fluid “Ferricolloid HC50” (4.0 g, containing 2 g of magnetic substance) was dried in an incubator at 80 ° C. for 12 hours to obtain 3.0 g of concentrated magnetic fluid. Next, 1 g of hexane was added to the obtained magnetic fluid and allowed to stand overnight to obtain a magnetic dispersion.
The obtained magnetic dispersion liquid was treated with an output scale 5 (110 W) for 10 minutes using a probe type ultrasonic homogenizer (Sonifier model 450, manufactured by Branson) with an output of 400 W, and the magnetic substance-encapsulated particle dispersion liquid Of these, the average particle diameter was 180 nm and the dispersion diameter of the magnetic substance was 10 to 25 nm, in the same manner as in Example 1, except that the fraction attracted to the magnet in 5 minutes using a neodymium magnet was collected as magnetic substance-encapsulated particles. Thus, a magnetic substance-encapsulated particle and an immunoassay particle having a magnetic substance content of 36% by weight were obtained.
（比較例２）
０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸第一鉄水溶液５０ｍＬと、０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸第二鉄水溶液５０ｍＬとの混合液に、更に２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム１１０ｍＬを混合し、マグネタイトを得た。得られたマグネタイト５ｇに５重量％のオレイン酸ナトリウム溶液４０ｇを添加し、オレイン酸によって被覆された磁性体を得た。得られた磁性体５ｇにヘキサン１ｇを加え、磁性体分散液を得た。
得られた磁性体分散液について、出力４００Ｗのプローブ型の超音波ホモジナイザー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ４５０、Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて、出力目盛り５（１１０Ｗ）で１０分間処理したこと、及び、磁性体内包粒子分散液のうち、ネオジム磁石を用いて５分間で磁石に引き寄せられる分画を磁性体内包粒子として分取したこと以外は実施例１と同様にして、平均粒子径２３０ｎｍ、磁性体の分散径２０〜４０ｎｍ、磁性体の含有量４１重量％の磁性体内包粒子及び免疫測定用粒子を得た。
(Comparative Example 2)
A mixed solution of 50 mL of 0.5 mol / L ferrous sulfate aqueous solution and 50 mL of 0.5 mol / L ferric sulfate aqueous solution was further mixed with 110 mL of 2 mol / L sodium hydroxide to obtain magnetite. 40 g of a 5 wt% sodium oleate solution was added to 5 g of the obtained magnetite to obtain a magnetic material coated with oleic acid. 1 g of hexane was added to 5 g of the obtained magnetic material to obtain a magnetic material dispersion.
The obtained magnetic dispersion liquid was treated with an output scale of 5 (110 W) for 10 minutes using a probe type ultrasonic homogenizer (Sonifier model 450, manufactured by Branson) with an output of 400 W, and dispersion of the magnetic substance encapsulated particles In the same manner as in Example 1 except that the fraction attracted to the magnet in 5 minutes by using a neodymium magnet was separated as magnetic substance-encapsulated particles, the average particle diameter was 230 nm, and the dispersion diameter of the magnetic substance was 20 to 20 Magnetic body-encapsulated particles and immunoassay particles having a content of 40 nm and a magnetic substance content of 41% by weight were obtained.
（比較例３）
実施例１で得られた磁性体分散液について、出力４００Ｗのプローブ型の超音波ホモジナイザー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ４５０、Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて、出力目盛り７（１４０Ｗ）で１０分間処理したこと、及び、磁性体内包粒子分散液のうち、ネオジム磁石を用いて６０分間で磁石に引き寄せられる分画を磁性体内包粒子として分取したこと以外は、実施例１と同様にして、平均粒子径１１０ｎｍ、磁性体の分散径１０〜３０ｎｍ、磁性体の含有量２８重量％の磁性体内包粒子及び免疫測定用粒子を得た。
(Comparative Example 3)
The magnetic dispersion obtained in Example 1 was treated with an output scale of 7 (140 W) for 10 minutes using a probe-type ultrasonic homogenizer (Sonifier model 450, manufactured by Branson) with an output of 400 W, and magnetic An average particle diameter of 110 nm, magnetic material, as in Example 1, except that the fraction entrained in the encapsulated particle dispersion using a neodymium magnet was collected as a magnetic encapsulated particle in 60 minutes. Magnetic particle-containing particles and immunoassay particles having a dispersion diameter of 10 to 30 nm and a magnetic substance content of 28% by weight were obtained.
（比較例４）
市販の磁性体内包粒子（エスタポールＭ１―０３０／４０、メルク社製、平均粒子径４２０ｎｍ、磁性体の分散径１５〜３５ｎｍ、磁性体の含有量４０．２重量％）を用い、磁性体内包粒子１２．５ｍｇにｐＨ９．５の水酸化カリウム水溶液１ｍＬを加え、１５０００ＲＰＭにて１０分間遠心分離後、上清を除去し、分散液に添加されている界面活性剤を除去した。続いて、得られた沈渣に、０．０２Ｍリン酸バッファーを６２５μＬ、予め調整した２％濃度のカルボジイミド溶液（ＰＢＳバッファー）を０．６２５ｍＬ添加し、３７℃恒温槽中で１．５時間攪拌した。反応溶液は、１５０００ＲＰＭにて１０分間遠心分離を行い、上清を除去後、０．０２Ｍリン酸バッファー１．２ｍＬを添加し、超音波で再分散した。この遠心洗浄操作を３回繰り返し、未反応のカルボジイミドを除去した。
(Comparative Example 4)
Using commercially available magnetic substance-encapsulated particles (Estapol M1-030 / 40, manufactured by Merck & Co., Inc., average particle diameter 420 nm, magnetic dispersion diameter 15 to 35 nm, magnetic substance content 40.2% by weight) To 12.5 mg of the particles, 1 mL of a potassium hydroxide aqueous solution having a pH of 9.5 was added and centrifuged at 15000 RPM for 10 minutes, and then the supernatant was removed to remove the surfactant added to the dispersion. Subsequently, 625 μL of 0.02M phosphate buffer and 0.625 mL of a 2% carbodiimide solution (PBS buffer) prepared in advance were added to the resulting precipitate, and the mixture was stirred for 1.5 hours in a 37 ° C. constant temperature bath. . The reaction solution was centrifuged at 15000 RPM for 10 minutes, and after removing the supernatant, 1.2 mL of 0.02M phosphate buffer was added and redispersed with ultrasound. This centrifugal washing operation was repeated three times to remove unreacted carbodiimide.
続いて、得られた沈渣に、０．１Ｍホウ酸バッファー１．２ｍＬを添加し、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体２００μｇ加え、３７℃恒温槽中で一晩攪拌した。翌日、反応溶液に３０ｍＭグリシン溶液（ホウ酸バッファー）５０μＬを添加し、３７℃恒温槽中で３０分間攪拌した。その後、１５０００ＲＰＭにて１０分間遠心分離を行い、未反応の抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体を除去した。なお、粒子への抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体結合量は、上清の蛋白濃度測定から仕込みの６５％であることを確認した。 Subsequently, 1.2 mL of 0.1 M borate buffer was added to the resulting precipitate, 200 μg of anti-α-hCG monoclonal antibody was added, and the mixture was stirred overnight in a 37 ° C. constant temperature bath. On the next day, 50 μL of a 30 mM glycine solution (borate buffer) was added to the reaction solution, and the mixture was stirred in a 37 ° C. constant temperature bath for 30 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15000 RPM for 10 minutes to remove unreacted anti-α-hCG monoclonal antibody. The amount of anti-α-hCG monoclonal antibody bound to the particles was confirmed to be 65% of the amount prepared from the protein concentration measurement of the supernatant.
得られた沈渣を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。得られた沈渣を、牛血清アルブミンが１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、３７℃恒温槽で３０分間撹拌し、ブロッキング処理を行った。その後、１５０００ＲＰＭにて１０分間遠心分離を行い、その沈渣を牛血清アルブミン及びグリセロールを各々５％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに分散させ、免疫測定用粒子を得た。 The obtained sediment was suspended in 1 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 6.5), and centrifuged again. The obtained sediment was suspended in 1 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 6.5) adjusted to a bovine serum albumin concentration of 1% (w / v), and stirred for 30 minutes in a 37 ° C. constant temperature bath. Blocking treatment was performed. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15000 RPM for 10 minutes, and the sediment was adjusted so that bovine serum albumin and glycerol each had a concentration of 5% (w / v) and sodium azide had a concentration of 0.01% (w / v). Particles for immunoassay were obtained by dispersing in 1 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.5).
（評価）
実施例１〜２及び比較例１〜４で得られた免疫測定用粒子について、以下の方法により性能評価を行った。
(Evaluation)
About the particle | grains for immunoassay obtained in Examples 1-2 and Comparative Examples 1-4, performance evaluation was performed with the following method.
ニトロセルロースメンブレン（ＳＲＨＦ Ｐ７０、日本ミリポア社製）を幅２０ｃｍ×長さ６ｃｍに裁断し、その長さ方向上端より２ｃｍの部位（反応部位）に、抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を２．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス塩酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解した溶液を幅０．７ｍｍの直線状に塗布した。その後、３７℃で２時間乾燥した後、牛血清アルブミン（和光純薬社製）を１重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液に１時間浸漬し、ブロッキング処理を行った。さらにその後、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムを０．１重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液にて洗浄後、シリカゲルデシケーター内で室温下にて乾燥し、抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を固定化した試験片を得た。 A nitrocellulose membrane (SRHF P70, manufactured by Nippon Millipore) is cut into a width of 20 cm and a length of 6 cm, and an anti-β-hCG monoclonal antibody is 2.0 mg / mL at a site (reaction site) 2 cm from the upper end in the length direction. A solution dissolved in Tris-HCl buffer (10 mmol / L, pH 7.4) was applied in a straight line having a width of 0.7 mm so as to have a concentration of 0.5 mm. Thereafter, after drying at 37 ° C. for 2 hours, 1 in a solution obtained by dissolving bovine serum albumin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in a phosphate buffer solution (100 mmol / L, pH 7.5) to a concentration of 1% by weight. It was immersed for a period of time and subjected to a blocking treatment. Further, after washing with a solution obtained by dissolving sodium laurylbenzenesulfonate in a phosphate buffer solution (100 mmol / L, pH 7.5) so as to have a concentration of 0.1% by weight, the mixture was washed at room temperature in a silica gel desiccator. The test piece which dried and fixed the anti- beta-hCG monoclonal antibody was obtained.
得られた試験片を幅５ｍｍに裁断し、長さ方向上端に幅５ｍｍ×長さ２０ｍｍの吸水パッド（ＡＰ２２、日本ミリポア社製）を、下端に幅５ｍｍ×長さ１５ｍｍのコンジュゲートパッド（グラスファイバー、日本ミリポア社製）を重ね、透明なテープで固定して試験片とした。 The obtained test piece was cut into a width of 5 mm, a water absorption pad (AP22, manufactured by Nihon Millipore) with a width of 5 mm × length 20 mm at the upper end in the length direction, and a conjugate pad (glass) with a width of 5 mm × length 15 mm at the lower end. Fiber, manufactured by Nihon Millipore) and fixed with a transparent tape to obtain a test piece.
試験液として、牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）、トリトン−１００ ０．０３％（ｗ／ｖ）、及び、ｈＣＧ濃度が０ｍＩＵ／ｍＬ、１０ｍＩＵ／ｍＬ、５０ｍＩＵ／ｍＬ、１００ｍＩＵ／ｍＬになるような生理食塩水を調製した。
次いで、各試験液２００μＬに免疫測定用粒子１０μｇを添加、混合した後、作製した試験片のコンジュゲートパッドに１００μＬをそれぞれ滴下した。
As test solutions, bovine serum albumin 1% (w / v), Triton-100 0.03% (w / v), and hCG concentrations become 0 mIU / mL, 10 mIU / mL, 50 mIU / mL, 100 mIU / mL Such a physiological saline was prepared.
Next, 10 μg of immunoassay particles were added to and mixed with 200 μL of each test solution, and then 100 μL was dropped onto the conjugate pad of the prepared test piece.
滴下から２０分経過後、市販のＧＭＲセンサ（差動磁界センサ、ＮＶＥ社製）を用いて、試験片の反応部位の磁性量を測定した。
測定結果を表１に示した。
After 20 minutes from the dropping, the amount of magnetism at the reaction site of the test piece was measured using a commercially available GMR sensor (differential magnetic field sensor, manufactured by NVE).
The measurement results are shown in Table 1.
表１に示したように、実施例１〜２で作製した免疫測定用粒子では、滴下から２０分後において、ｈＣＧ濃度を０ｍＩＵ／ｍＬとした場合を除いた全ての試験片で一定の磁性量が検出された。また、検出された磁性量は、ｈＣＧ濃度に依存していることが確認された。これにより、実施例１で作製した免疫測定用粒子は、磁性を標識とする免疫測定法に有用であることが判った。 As shown in Table 1, in the immunoassay particles prepared in Examples 1 and 2, a constant magnetic amount was obtained in all the test pieces except for the case where the hCG concentration was 0 mIU / mL 20 minutes after the dropping. Was detected. Moreover, it was confirmed that the detected amount of magnetism depends on the hCG concentration. Thus, it was found that the immunoassay particles produced in Example 1 are useful for immunoassay methods using magnetism as a label.
一方、比較例１、３で作製した免疫測定用粒子では、ｈＣＧが高濃度の場合、磁性量が確認できたが、ｈＣＧが低濃度（比較例１：１０ｍＩＵ／ｍＬ、比較例３：５０ｍＩＵ／ｍＬ）の場合は、磁性量が検出限界以下であるため、検出できなかった。
また、比較例２、４で作製した免疫測定用粒子では、何れの試験片においても反応部位及び反応部位までの部位で免疫測定用粒子に基づく着色が認められた。特に、コンジュゲートパッドを重ねた部位付近の着色があり、免疫測定用粒子が滞留していることが認められた。また、被検物質が存在しない場合（０ｍＩＵ／ｍＬ）にも、磁性量が検出されていることから、非特異的に反応部位に免疫測定用粒子が捕捉されてしまうことが判った。
On the other hand, in the immunoassay particles prepared in Comparative Examples 1 and 3, when hCG was at a high concentration, the amount of magnetism could be confirmed, but hCG was at a low concentration (Comparative Example 1: 10 mIU / mL, Comparative Example 3: 50 mIU / In the case of mL), since the amount of magnetism was below the detection limit, it could not be detected.
In addition, in the immunoassay particles prepared in Comparative Examples 2 and 4, coloring was observed based on the immunoassay particles in any test piece at the reaction site and the site up to the reaction site. In particular, there was a coloration in the vicinity of the site where the conjugate pad was superimposed, and it was confirmed that the particles for immunoassay were retained. Further, even when the test substance was not present (0 mIU / mL), it was found that the immunoassay particles were captured nonspecifically at the reaction site because the magnetic amount was detected.
本発明によれば、クロマト展開性に優れ、高感度な免疫測定を行うことが可能な磁性体内包粒子、磁性体内包粒子の製造方法、免疫測定用粒子及びこれを用いた免疫測定法を提供することができる。 According to the present invention, there are provided a magnetic substance-encapsulated particle having excellent chromatographic developability and capable of performing highly sensitive immunoassay, a method for producing a magnetic substance-encapsulated particle, an immunoassay particle, and an immunoassay method using the same. can do.
Claims (9)
前記モノマー混合液を、界面活性剤を溶解させた水系媒体に滴下し、微分散させることにより、不均一なモノマー液滴が形成したミニエマルジョン溶液を調製する工程２、
前記モノマー液滴を重合させ、磁性体内包粒子分散液を調製する工程３、及び、
前記磁性体内包粒子分散液から、磁気分離法により磁性体含有率が５０〜８０重量％の粒子を分画し、回収する工程４を有する
ことを特徴とする磁性体内包粒子の製造方法。 Step 1 of preparing a monomer mixture by mixing a magnetic dispersion in which a magnetic substance is dispersed in an organic solvent, and a monomer solution containing a monomer, a polymerization initiator, and a cosurfactant.
Step 2 of preparing a mini-emulsion solution in which non-uniform monomer droplets are formed by dripping the monomer mixture into an aqueous medium in which a surfactant is dissolved and finely dispersing the mixture.
Step 3 of polymerizing the monomer droplets to prepare a magnetic substance-encapsulated particle dispersion, and
A method for producing magnetic inclusion particles, comprising a step 4 of fractionating and collecting particles having a magnetic substance content of 50 to 80% by weight from the magnetic inclusion particle dispersion by magnetic separation.
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