JP2006292712A

JP2006292712A - 免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具

Info

Publication number: JP2006292712A
Application number: JP2005146531A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiro Takagi; 和博高木; Atsushi Tateno; 敦史立野
Original assignee: GC Corp; GC Dental Industiral Corp
Current assignee: GC Corp
Priority date: 2005-03-17
Filing date: 2005-05-19
Publication date: 2006-10-26

Abstract

【課題】免疫クロマトグラフィー法において、多孔質膜中の浸透性が極めて悪い唾液等を媒体として検出する場合でも、安価で簡単に検出感度を上げることが可能な免疫クロマトグラフィー用の多孔質膜を提供する。
【解決手段】略短冊状の多孔質膜に、目的とする抗原のみに付く標識抗体が移動可能な状態で一端に含まれ、該抗原のみに付く標識抗体とは別の補足抗体が中程に固定され、吸水体が他端に固定された免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具において、吸水体の最大幅が多孔質膜の吸水体との境界幅よりも広いことを特徴とする検査用具とする。
【選択図】図２

Description

本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫クロマトグラフィー法の検出感度を向上させた免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具に関する。

従来から、細菌の検査等には抗原抗体反応を利用した検査法が実施されてきた。例えば酵素抗体法は、酵素を用いた発色濃度で検体の同定・定量を行う方法であるが、抗体を直接操作するために特殊な洗浄器や煩雑で正確な操作が必要とされ、更に酵素反応を行うためのインキュベーターが必要であった。また蛍光抗体法は、抗体を蛍光色素で標識し抗体と反応した抗原を特異的に染色させる方法であるが、測定器として蛍光顕微鏡を必要とするために一般的ではなかった。

そのため抗原抗体反応を簡便に利用する方法が数多く提案されてきた。例えばクロマトグラフィーを利用した測定方法がある（例えば、特許文献１，特許文献２，特許文献３，特許文献４，特許文献５，特許文献６参照。）。この方法は、採取した体液等の検体を抗体を含んだ試験溶液に混入して多孔質膜に染み込ませるだけで、抗原の有無や量を知ることができる簡便性に優れた方法である。このような方法は一般に免疫クロマトグラフィー法とも呼ばれており、その同定・定量の原理も詳細に開示されている（例えば、非特許文献１参照。）。

一般的な免疫クロマトグラフィー法では二つの抗体を用いて検体の検出を行う。第一の抗体はメンブレン等から成る略短冊状の多孔質膜のサンプルが滴下される一端に含まれており、その抗体はラテックス粒子や金コロイド粒子といったもので標識されている（以下、標識抗体と称する。）。滴下されたサンプル中に検出対象の検体が存在すると標識抗体が検体を認識して結合する。この検体と標識抗体との複合体が毛細管現象により標識抗体が含まれていた端とは反対側の端に取り付けられている濾紙等から成る吸水体へ向かって流れる。その過程で、多孔質膜の中程に存在する第二の抗体（以下、捕捉抗体と称する。）が例えば帯状に固定化されているので、この捕捉抗体により検体と標識抗体との複合体が認識・捕捉され、その結果として可視シグナルとして（この場合では帯状に）多孔質膜状に表れ検出されるのである。

この技術を応用して検体中の抗原の有無を簡易に識別し得る診断装置がいくつも開発され、例えば特定の細菌に感染しているかどうかを迅速に診断することができるようになった。ところが、診断すべき対象物が通常は体内に存在しない、例えばレジオネラ菌、インフルエンザウイルス、病原性大腸菌等の場合であれば、単にその診断すべき対象物が存在するか否かの判定、即ち陽性か陰性かを判定すればよいのであるが、診断すべき対象物が例えば齲蝕原生細菌の中でも齲蝕の発症と極めて関連が高いとされるミュータンス連鎖球菌等の場合では、抗原の量も把握できることが望まれるのである。しかしながら、前述したような免疫診断装置で抗原の量を知るためには金コロイド等で標識された抗体と結合した抗原の着色量から推定しなければならず、一般に着色の度合を目視で判定し抗原の量を把握することは極めて困難であった。

そこで免疫クロマトグラフィー法の感度を向上させる方法が検討されており、例えば増感剤を含ませる方法等がある（例えば、特許文献７参照。）。中でも最も安価で簡単な方法としては多孔質膜上で補足抗体を固定している部位（以後、検出部と称することがある。）の多孔質膜の幅、長さ、面積もしくは体積を標識抗体が含まれる部位よりも小さくする増感方法である（例えば、特許文献８参照。）。

この方法は、低濃度のサンプルであっても標識抗体を検出部で集中させることでその感度を高めている。しかしながら、例えばミュータンス連鎖球菌の検出のように不純物質を多く含むために多孔質膜中の浸透性が極めて悪い唾液等を媒体をとして検出する場合では、検出部の幅等を小さくしてサンプルを集中させることが多孔質膜の詰まりを促進してしまい検出ができなかった。

米国特許第５，５９１，６４５号公報米国特許第４，８５５，２４０号公報米国特許第４，４３５，５０４号公報米国特許第４，９８０，２９８号公報特開昭６１−１４５４５９号公報特開平６−１６０３８８号公報特開２００３−２８７５４１号公報特開２０００−２９２４２５号公報Ｓｅ−ＨｗａｎＰａｅｋ，Ｓｅｕｎｇ−ＨｗａＬｅｅ，Ｊｏｕｎｇ−ＨａｗａｎＣｈｏａｎｄＹｏｕｎｇ−ＳａｎｇＫｉｍ，「ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｒａｐｉｄＯｎｅ−Ｓｔｅｐｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃａｓｓａｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ」，２２，５３−６０，２０００

そこで本発明は、免疫クロマトグラフィー法において、多孔質膜中の浸透性が極めて悪い唾液等を媒体として検出する場合でも、安価で簡単に検出感度を上げることが可能な免疫クロマトグラフィー用の検査用具を提供することを課題とする。

本発明者等は前記課題を解決するために鋭意検討した結果、従来と同じ検出時間内でより大量に検出部へサンプルを導くことができれば、滴下したサンプルを標識抗体を検出部で集中させることなく検出の感度を高めることが可能であることに着目した。その手段としては特開平４−２５４７６１号公報に開示されているように多孔質膜の浸透性を高めたり吸収体の吸収能力を高めればいいのであるが、その方法では必ず材質の変更が必要となってしまう。そこで、吸収体の幅を多孔質膜の幅より広くしたところ、多孔質膜を浸透してきたサンプルが多孔質膜の幅を超えた吸水体部へも流れて行くので、同じ材質であれば単位時間当たりのサンプルの吸収量を飛躍的に向上させることが可能であることを見出して本発明を完成した。

即ち本発明は、略短冊状の多孔質膜に、目的とする抗原のみに付く標識抗体が移動可能な状態で一端に含まれ、該抗原のみに付く標識抗体とは別の補足抗体が中程に固定され、吸水体が他端に固定された免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具において、吸水体の最大幅が多孔質膜の吸水体との境界幅よりも広いことを特徴とする検査用具であり、略短冊状の多孔質膜の幅が２〜１０ｍｍ，標識抗体から吸収体までの最短距離が多孔質膜の幅以上で５〜１５ｍｍであることが好ましい検査用具である。

本発明に係る免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具は、多孔質膜に対する浸透性が極めて悪い唾液等を媒体として検体を検出する場合でも、多孔質膜中に唾液等のサンプルが詰まること無く安価で簡単に検出感度を上げることが可能な免疫クロマトグラフィー用の検査用具である。

以下、図面により本発明に係る免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具ついて詳細に説明する。図１は従来の免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具の説明図。図２は本発明に係る免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具の実施例を示す説明図。図３は本発明に係る免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具の他の実施例を示す説明図である。

従来の免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具の多くは、図１に示したように濾紙等から成る吸水体の幅の殆ど全てが多孔質膜の幅と同じになっていた。

図中１は本発明に係る免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具であり、略短冊状の多孔質膜に、目的とする検体である抗原のみに付く標識抗体が移動可能な状態で一端に含まれ、同じ目的とする検体のみに付く該標識抗体とは別の補足抗体が中程に固定され、吸水体が他端に固定された従来と同じ構成の検査用具である。

図面中１ａは多孔質膜であり、一般的にメンブレンフィルターと呼ばれる高分子フィルターであり、同等の孔径を有する孔が連続的に連なった形状を有し物質を通過させる性状と蛋白質を吸着する性状を持っている。

本発明に係る免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具は、従来の免疫クロマトグラフィー法に用いられている多孔質膜１ａであれば特に限定されずに使用することが可能であり、従来の多孔質膜と同様に一端に特定の抗原（例えば齲蝕原性細菌）とのみ結合し得る金コロイド粒子等で標識された標識抗体Ｍが含浸等により移動可能な状態で含まれており、多孔質膜１ａの中程には前記抗原とのみ結合し得る標識抗体Ｍとは別の抗体である捕捉抗体Ｃが固定されている。このとき、標識抗体Ｍは多孔質膜１ａの表面に付着して移動し難くなるため、ガラス繊維等の疎水性の媒体に含浸させてから多孔質膜１ａの一端に接するように設置するのが一般的である。

多孔質膜１ａを構成する高分子材料は特に限定されないが、具体例を挙げればニトロセルロース、再生セルロース、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ナイロン、ポリカーボネート、セルロースアセテートを例示することができる。即ち、本発明で用いる多孔質膜１ａは従来から市販・使用されているものが自由に使用可能であり特に限定されない。

図中の２は多孔質膜１ａ中でサンプルを効率よく移動させるための吸収体であり、多孔質膜１ａの他端に固定されている。吸収体２は多孔質膜１ａよりもサンプルの吸収性能が高いことが好ましいがその素材は特に限定されず、例えば、濾紙，吸い取り紙，紙タオル等の紙が最も好ましい。その他にも脱脂綿，石英ウール，ガラスウール，ウール，絹，綿，麻，アクリル，レーヨン，ナイロン，ニトロセルロース，酢酸セルロース，再生セルロース，ガラス繊維等の繊維から成る布や不織布等も使用することができる。また、デキストラン，ムタン，レバン，セルロースパウダー等を固形に形成したものも使用可能である。サンプルである検体が滴下部に滴下された後、サンプルは多孔質膜１ａ中を浸透して吸収体２へ向かって多孔質膜１ａ中を移動し続ける。

本発明に係る免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具１は、他端に固定された吸水体２の最大幅２ｗが多孔質膜の吸水体との境界幅１ｗよりも広いことを特徴とする。多孔質膜１ａを浸透してきたサンプルが多孔質膜の吸水体との境界幅１ｗよりも広い吸水体２に流れると、吸水体の最大幅２ｗが多孔質膜の吸水体との境界幅１ｗと等しい又は小さい場合と比較して単位時間当たりのサンプルの吸収量を飛躍的に高めることが可能であり、その結果、多孔質膜１ａや吸収体２の材質を特に変更しなくても同じ検出時間における検出感度を高めることが可能なのである。勿論、多孔質膜１ａの形状変更や流動性及び吸収体２の吸収能力を高めたものと組み合わせてもより高い感度を得ることができる。特に他端に固定された吸水体の最大幅２ｗが多孔質膜の吸水体との境界幅１ｗよりも２倍以上広いと更に吸収効率が高くなるので好ましい。

本発明に係る免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具１は、略短冊状の多孔質膜の吸水体との境界幅１ｗが２〜１０ｍｍ，標識抗体Ｍから吸収体２までの最短距離Ｌが多孔質膜の吸水体との境界幅１ｗ以上で且つ５〜１５ｍｍであることがより高い感度を得ることができるので好ましい。

略短冊状の多孔質膜の吸水体との境界幅１ｗが２ｍｍ未満であると多孔質膜中の浸透性が極めて悪い唾液等を媒体として検出することが難しくなる。１０ｍｍを超えると吸水体の幅を広くする効果が減少する傾向がある。標識抗体Ｍから吸収体２までの最短距離Ｌが多孔質膜の吸水体との境界幅１ｗ未満又は最短距離Ｌが５ｍｍ未満では、検出のための距離が不足して補足抗体を固定することが難しくなる。また最短距離Ｌが１５ｍｍを超えるとサンプルの吸収量を高める効果が低下する傾向がある。

本発明に係る免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具１においては、吸収体２を略短冊状の多孔質膜１ａの上に接して取り付けることが好ましい。しかし、多孔質膜１ａと吸収体２が同じ材質であれば一体で形成されていても良い。

吸収体２を多孔質膜１ａの上に接して取り付ける際に吸収体２の幅が一律でない場合は、吸収体の最大幅２ｗを持つ部位が多孔質膜１ａの上に接している面２ａに含まれていることが吸収の効率の点から好ましい。更に、吸収体の最大幅２ｗは吸収体２の最も一端側（多孔質膜の標識抗体が含まれている側）に存在することがより高い吸収力を得ることができるので好ましい。

＜ミュータンス連鎖球菌の検出＞
「特異抗体の作製」
ミュータンス連鎖球菌としてストレプトコッカス・ミュータンス（ATCC25175菌株）を培養し、ホルムアルデヒド水溶液で生育を停止させた。この菌の分散液をそのままマウスに免疫し、KohlerとMilsteinによる細胞融合によるハイブリドーマの樹立法に基づいて樹立したハイブリドーマを培養し、その培養液を限界希釈法によりスクリーニングして得た抗体を、抗体によっては後述する標識を行って以下に示す精製抗体を各二種類ずつ得た。

「ＳＭ１抗体」…ストレプトコッカス・ミュータンスに対する捕捉抗体
「ＳＭ２抗体」…ストレプトコッカス・ミュータンスに対する標識抗体

「特異抗体への標識」
ＳＭ２抗体には粒径４０ｎｍの金コロイドを標識した。金コロイドは市販品（British Biocell International社製）のものを使用し、ウシ血清アルブミン（商品名：ＢＳＡ、シグマケミカルカンパニー社製）１％、非イオン性界面活性剤（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０、シグマケミカルカンパニー社製）１％を添加したリン酸緩衝液で抗体濃度０．１μｇ／ｍｌとなるように希釈した。

＜多孔質膜＞
多孔質膜としてニトロセルロースメンブレン（商品名：HiFlow Membrane HF075、日本ミリポア社製）を幅５ｍｍ×長さ２３ｍｍ×厚さ約０．４ｍｍの長方形に切り出した。ストレプトコッカス・ミュータンスに対する捕捉抗体であるＳＭ１抗体を１％ウシ血清アルブミン含有５０ｍＭりん酸緩衝液に１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した。この抗体液を前記ニトロセルロースメンブレンの中央部に長手方向と直角にマイクロピペットで凡そ１μｇ／ｃｍとなるように塗布し含浸させた。

このニトロセルロースメンブレンの他端に幅１０ｍｍ、長さ２０ｍｍ、厚さ１．５ｍｍの形状の濾紙（商品名：CFSP223、日本ミリポア社製）を吸収体として多孔質膜の他端が吸水体幅に対する中央部で吸水体と３ｍｍ重なるように固定した。また、多孔質膜の吸収体が固定された側と反対の一端から５ｍｍの箇所に鉛筆で直線を引いて標識抗体を滴下する滴下部とした（標識抗体から吸収体までの最短距離は１５ｍｍとなる。）。３７℃にて２時間乾燥し、検査直前までデシケーター中に保管した。同様に濾紙の幅のみを１５，２０ｍｍに変更した検査用具を作製した。

＜比較例＞
吸水体の幅が多孔質膜の幅と同じ５ｍｍの検査用具であって吸収体の長さが２０ｍｍ，４０ｍｍである検査用具を比較例１及び２、吸水体が幅１５ｍｍ×長さ２０ｍｍであって多孔質膜の標識抗体から吸収体までの最短距離が２０ｍｍまたは４０ｍｍの検査用具を比較例３及び４とした。

＜吸水量＞
多孔質膜の一端を５ｍｍの直線まで純水に浸し１５分後の吸水量を重量から算出した。結果を表１に纏めて示す。

１．被験者から唾液を採取し、唾液２５０μＬを特願２００１−９２７６９に開示されている方法で処理し、唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス菌数を蛍光光度計により計測し、その数が１×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ、７．５×１０^５ＣＦＵ／ｍＬ、５×１０^５ＣＦＵ／ｍＬになるように調整した。
２．それぞれ球径４０ｎｍの金コロイドで標識したストレプトコッカス・ミュータンスに対する標識抗体であるＳＭ２抗体液２５μＬに処理唾液３００μＬを加え試験液とした。
３．この試験液に各標識抗体に対応した捕捉抗体が塗布含浸させてある多孔質膜１の一端を浸し、試験液を染み込ませ、１５分後に抗体反応の検出の有無を目視にて観察した。

表１

表１から明らかなように、純水の吸収量は吸収体の最大幅が大きくなるにつれて向上し、特に多孔質膜の幅５ｍｍの２倍以上である実施例１〜６の吸収量が多い。吸収量は吸収体の長さや面積との関係が少なく吸収体の最大幅に大きく依存していることが分かる。また吸収体の最大幅が多孔質膜の吸水体との境界幅よりも大きくても標識抗体から吸収体までの最短距離が１５ｍｍを超える２０ｍｍ又は４０ｍｍでは高い吸水量を得難くなることが分かる。

抗体反応の結果は、細胞濃度が１×１０^６ＣＦＵ／ｍＬであると従来の検査用具と同じである比較例１及び２であっても検出可能であるが、その濃度が低くなるにつれて本発明に係る検査用具の方が吸水量が高いために検出感度が良いことが分かる。

従来の免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具の説明図。図２は本発明に係る免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具の実施例を示す説明図。図３は本発明に係る免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具の他の実施例を示す説明図。

符号の説明

１多孔質膜
１ｗ多孔質膜の吸水体との境界幅
２吸水体
２ａ多孔質膜の上に接している面
２ｗ吸水体の最大幅
Ｍ標識抗体
Ｃ補足抗体
Ｌ標識抗体から吸収体までの最短距離

Claims

略短冊状の多孔質膜（１ａ）に、目的とする抗原のみに付く標識抗体（Ｍ）が移動可能な状態で一端に含まれ、該抗原のみに付く標識抗体（Ｍ）とは別の補足抗体（Ｃ）が中程に固定され、吸水体（２）が他端に固定された免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具において、吸水体の最大幅（２ｗ）が多孔質膜の吸水体との境界幅（１ｗ）よりも広いことを特徴とする検査用具（１）。
略短冊状の多孔質膜の吸水体との境界幅（１ｗ）が２〜１０ｍｍ，標識抗体（Ｍ）から吸収体（２）までの最短距離（Ｌ）が多孔質膜の吸水体との境界幅（１ｗ）以上で且つ５〜１５ｍｍである請求項１に記載の検査用具（１）。