JP2006254904A - Cyanophage capable of specifically infecting water bloom-causing blue-green algae of genus microcystis and proliferating, method for controlling water bloom with the cyanophage and agent for controlling water bloom and method for isolating the cyanophage, method for concentrating/purifying, subculture method and preservation method - Google Patents
Cyanophage capable of specifically infecting water bloom-causing blue-green algae of genus microcystis and proliferating, method for controlling water bloom with the cyanophage and agent for controlling water bloom and method for isolating the cyanophage, method for concentrating/purifying, subculture method and preservation method Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、ミクロキスティス(Microcystis)属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージ（すなわち、藍藻感染性ウイルス）、該シアノファージを利用するアオコ防除方法及びアオコ防除剤並びに該シアノファージの単離方法、濃縮・精製方法、継代培養方法及び保存方法に関する。 The present invention relates to a cyano phage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm (that is, a cyanobacterial infectious virus) capable of specifically infecting and proliferating a blue causative cyanobacteria belonging to the genus Microcystis, and a blue cocoon utilizing the cyanophage. The present invention relates to a control method, a scab control agent, and a method for isolating, concentrating and purifying the cyanophage, a subculture method and a storage method.
近年、アオコと呼ばれる藍藻類の大量発生現象が世界中の内水面（天然および人工の湖沼や池など）で頻発している。代表的なアオコ形成種として知られるミクロキスティス（Microcystis）属藍藻の中には、肝臓毒ミクロシスティン（発癌プローモータ活性を有する環状ペプチド毒素）を生産する種が存在する。1990年代半ばには、中国上海近郊において、水源におけるアオコ発生がもたらしたミクロシスティンの蓄積が、同水源由来の水道水を利用する市民に異常に高頻度での肝臓癌発生をもたらした。また1996年には、ブラジルにおいて、水源での本毒素の混入が原因で50人以上の透析患者が死亡するなど、藍藻毒による被害は、人体への健康被害を引き起こすという点で重大である。さらに藍藻毒による被害は、家畜・野生生物の斃死を引き起こすなど畜産業・水産業の分野においても深刻な問題として位置付けられる。また農作物を含む植物への毒素の吸収・蓄積は、農業分野において問題視されている。このように、アオコは飲料水源の質の悪化ならびに農林水産業を含む各種産業を支える水源の質の悪化を引き起こす。さらにアオコの発生による親水環境の劣悪化は、観光経済の不活性化の原因にもなる。わが国でも、各地の水源において有毒藍藻であるミクロキスティス属によるアオコが発生しており、今後、アオコによる水源の毒化による被害の発生・深刻化が懸念される。すでに水産分野では、カナダでのミクロシスティンが原因と思われる肝臓細胞の壊死による養殖サケの大量斃死やイタリアでの食物連鎖を介した魚介類へのミクロシスティンの濃縮事例等が報告されており、消費者の食資源・水資源への信頼を確保するためには、アオコへの具体的な対策の構築が危急の課題であるといえる。言うまでもなく、根本的なアオコ防除技術としては、水圏環境への栄養塩負荷（窒素・リンなどアオコ原因藍藻の栄養分の湖沼等への流入）の減少を図ることが不可欠である。しかし現実には、湖沼等の陸水環境が自然または人間活動に由来する栄養物質の流入先になるケースが多く、内水面の栄養塩レベルの低減という抜本的なアオコ防除対策を講じることは甚だ困難な状態にある。 In recent years, large-scale occurrence of cyanobacteria called blue-green algae has frequently occurred in inland waters (natural and artificial lakes and ponds) around the world. Among the cyanobacteria belonging to the genus Microcystis, which are known as typical aoko-forming species, there are species that produce the liver toxin microcystine (a cyclic peptide toxin having an oncogenic promoter activity). In the mid-1990s, the accumulation of microcystin in the water source near Shanghai in China led to an unusually high incidence of liver cancer in citizens using tap water from the water source. In 1996, the damage caused by cyanobacterial poisons was serious in Brazil, causing more than 50 dialysis patients to die due to contamination of this toxin in the water source. Furthermore, the damage caused by cyanobacteria is regarded as a serious problem in the fields of livestock and fisheries, such as causing drowning of livestock and wildlife. In addition, absorption and accumulation of toxins in plants including agricultural crops are regarded as a problem in the agricultural field. In this way, aoko causes deterioration of the quality of drinking water sources and the quality of water sources that support various industries including agriculture, forestry and fisheries. In addition, the deterioration of the hydrophilic environment due to the occurrence of blue sea urchins also causes inactivation of the tourism economy. Even in Japan, water flies caused by the genus Microkistis, a poisonous cyanobacteria, have occurred in water sources in various regions, and there are concerns about the occurrence and seriousness of damage caused by water poisoning by water flies. Already in the fisheries field, there have been reports of large-scale drowning of cultured salmon due to necrosis of liver cells, which is thought to be caused by microcystin in Canada, and cases of microcystin concentration in seafood via the food chain in Italy. In order to secure consumer confidence in food and water resources, it can be said that the establishment of concrete measures for blue sea urchin is an urgent issue. Needless to say, it is indispensable to reduce the load of nutrients on the aquatic environment (inflow of nutrients of blue-green algae causing blue-green algae such as nitrogen and phosphorus into lakes, etc.) as a fundamental technique for controlling sea lions. However, in reality, there are many cases where inland water environments such as lakes and marshes become inflow destinations of nutrients derived from nature or human activities, and it is unavoidable to take drastic measures to control blue sea bream, such as reducing the level of nutrients on the inland water surface. It is difficult.
近年の研究により、海洋においてウイルスが植物プランクトンの動態（とくに赤潮原因プランクトンの消長）を制御する重要な因子であることが明らかとなってきた。しかしながら、淡水域でのアオコ原因藍藻とそれらに感染するシアノファージとの相互関係に関する研究事例はまだまだ少ないのが現状である。過去に、ミクロキスティス属の一種ミクロキスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）を宿主とするファージが分離されたとの２例の報告（非特許文献１,２）がなされたが、いずれも宿主株の同定ミスによる誤報であり、現在ではいずれも無毒藍藻シネココッカス(Synechococcus)属を宿主とするシアノファージであったことが確認されている（非特許文献３）。また、愛媛県松山市の古池からミクロキスティス・エルギノーサに対するプラーク形成因子（マット状に増殖させたミクロキスティス・エルギノーサに透明なゾーンを形成する0.2μm以下の殺藻因子）を検出した事例（非特許文献４,５）や、オーストラリア（クイーンズランド）のバルーン湖からミクロキスティス・エルギノーサの溶藻に関与すると考えられるポドウイルス科に近い形態学的特徴を持つファージ様粒子を検出した事例が報告されている（非特許文献６）。しかしながら、いずれの実験においてもミクロキスティス・エルギノーサを溶藻するファージの単離ならびに培養系の構築には成功していない。したがって、世界的にみてもミクロキスティス属を宿主とするシアノファージは未だ分離されていない状況であり、研究を目的とした分譲可能な寄託株さえ、いずれの寄託機関にも存在しないのが現状である。
Recent studies have revealed that viruses are an important factor in the dynamics of phytoplankton (especially the change of red tide-causing plankton) in the ocean. However, there are still few studies on the interrelationship between blue-green algae causing freshwater and the cyanophages that infect them. In the past, there were two reports (Non-patent
上述のようなアオコによる被害の甚大さにもかかわらず、アオコに対する予防・防除対策は未だ開発途上の段階にある。これまでに 遮光装置・エアレーション装置・流動化装置等によるアオコ発生の阻止、特殊な捕集装置を備えた船舶によるアオコそのものの回収、アオコ溶藻細菌の利用によるアオコ防除などの対策が提案され、その一部は試験または実施されてきた。しかしながら、これまでのところ効率的なアオコ防除技術は十分に確立されておらず、早急な対策の構築が求められている。
微生物を用いたアオコ防除技術としては、細菌類（粘液細菌を含む）を利用したものがこれまでに数件提案されている（特許文献１、２及び３）。しかしながら、過去にシアノファージを利用したアオコ防除技術に関する特許出願はなされていない。
Despite the huge damage caused by blue sea bream as described above, prevention and control measures for blue sea bream are still in the development stage. So far, measures have been proposed to prevent the occurrence of sea cucumbers using shading equipment, aeration equipment, fluidization equipment, etc., recovery of sea cucumbers themselves by ships equipped with special collection devices, and control of sea cucumbers using the use of blue seaweed bacteria. Some have been tested or implemented. However, so far, efficient aquatic control technology has not been sufficiently established, and the construction of an immediate countermeasure is required.
A number of techniques using bacteria (including myxobacteria) have been proposed as a sea lion control technique using microorganisms (
本発明の主目的は、シアノファージの殺藻能をアオコの発生予防・防除に対して応用することである。シアノファージ利用によるアオコ防除は、他生物や水圏生態系全体への負荷が小さい環境修復技術としてその安全性に高い期待が寄せられており、シアノファージの大量培養技術・散布手法・コスト・安全性評価等の面での諸問題がクリアされれば、実用化への道が開かれるものと期待される。 The main object of the present invention is to apply the algaecidal ability of cyanophage to the prevention and control of the development of blue sea bream. The use of cyanophage is highly anticipated as an environmental remediation technology that places little burden on other organisms and aquatic ecosystems. Mass cultivation technology, spraying method, cost, and safety of cyanophage If problems in terms of evaluation are cleared, it is expected that the way to practical use will be opened.
こうした背景の下、本発明者らは、アオコ原因藍藻の一種であるミクロキスティス・エルギノーサ(Microcystis aeruginosa NIES-298株（有毒株）：環境研究所（茨城県つくば市小野川16-2）保存株)に感染して増殖するファージを世界で初めて単離・培養することに成功し、本発明を完成するに至った。本出願で詳述されるシアノファージ株は、世界で初めてのミクロキスティス属を宿主とするファージの分離事例である。また、形態学的にはミオウイルス科の特徴を有しており、Tucker, S., Pollard, P. Identification of cyanophage Ma-LBP and infection of the cyanobacterium Microcyatis aeruginosa from an Australian subtropical lake by the virus. Appl. Environ. Microbiol. 72(2): 629-635 (2005).（非特許文献６）に示されたポドウイルス科の形態を有するファージ様粒子とはまったく異なるものである。とくに頭部のサイズは前者（Ma-LMM01）が60〜120nmであるのに対し、後者（ポドウイルス科の形態を有するファージ様粒子）では42nmおよび52nmと報告されている。 Under such a background, the present inventors have established a microcystis aeruginosa (Microcystis aeruginosa NIES-298 strain (toxic strain): Environmental Research Institute (16-2 Onogawa, Tsukuba City, Ibaraki Pref.)) The present inventors have succeeded in isolating and cultivating phages that proliferate by infection for the first time in the world and have completed the present invention. The cyanophage strain detailed in this application is the world's first case of isolation of phages hosting the genus Microkistis. It has morphological characteristics of Myoviridae, Tucker, S., Pollard, P. Identification of cyanophage Ma-LBP and infection of the cyanobacterium Microcyatis aeruginosa from an Australian subtropical lake by the virus. Environ. Microbiol. 72 (2): 629-635 (2005). (Non-Patent Document 6). This is completely different from the phage-like particles having the form of the family Podviridae. In particular, the head size of the former (Ma-LMM01) is 60-120 nm, while the latter (phage-like particles having the form of Podviridae) is reported to be 42 nm and 52 nm.
すなわち、本発明は、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージを提供する。ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻はミクロキスティス・エルギノーサであるとよい。シアノファージはミオウイルス科に属するとよい。本発明の一態様において、シアノファージは、頭部および尾部構造を有し、外膜構造を欠き、頭部は直径約60〜120nmの正二十面体である。この態様において、シアノファージの頭部平均直径は86nmであることが好ましい。尾部構造のうちコア部分は約140〜350nm、鞘は約60〜260nmである。この態様において、コア部分および鞘の平均長は209nmおよび142nmであることが好ましい。本発明のシアノファージとしては、シアノファージ(Cyanophage)Ma-LMM01株(NITE BP-71)、Ma-LMM02株、Ma-LMM03株又はMa-LMM05株などを挙げることができる。本発明のシアノファージは、ゲノムの塩基配列が配列番号１の塩基配列と同一であるか、あるいは少なくとも１つの遺伝子の塩基配列が配列番号１の塩基配列中の対応する遺伝子の塩基配列と９０％以上の相同性を有するものであるとよい。 That is, the present invention provides a cyanophage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm, which can specifically infect and proliferate a microcaustic blue-green algae. Microcystis aeruginosa is the causative cyanobacteria of the genus Microkistis. The cyanophage may belong to the Myoviridae family. In one embodiment of the invention, the cyanophage has a head and tail structure, lacks an outer membrane structure, and the head is an icosahedron having a diameter of about 60-120 nm. In this embodiment, it is preferable that the average diameter of the head of the cyanophage is 86 nm. The core part of the tail structure is about 140 to 350 nm, and the sheath is about 60 to 260 nm. In this embodiment, the average length of the core portion and sheath is preferably 209 nm and 142 nm. Examples of the cyanophage of the present invention include cyanophage Ma-LMM01 strain (NITE BP-71), Ma-LMM02 strain, Ma-LMM03 strain or Ma-LMM05 strain. The cyanophage of the present invention is 90% of the base sequence of the corresponding gene in the base sequence of SEQ ID NO: 1, or the base sequence of at least one gene is identical to the base sequence of SEQ ID NO: 1 It is good to have the above homology.
また、本発明は、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージを含有する液体試料をフィルターで濾過し、得られた濾液をミクロキスティス属のアオコ原因藍藻の培養液に接種して培養を行い、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻の溶藻が観察された培養液を限界希釈することにより前記シアノファージをクローニングする工程を含む、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージの単離方法を提供する。 The present invention also provides a filter for filtering a liquid sample containing cyanophage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm, which can specifically infect and proliferate a microcaustic blue-green algae. Inoculating and culturing a culture solution of the genus Kystius blue-green algae, and then cloning the cyanophage by limiting dilution of the culture solution in which the lytic algae of the blue-green algae causing the microkistis was observed, Provided is a method for isolating cyanophage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm capable of specifically infecting and proliferating with a blue-green algae causing the genus Chitus.
ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージを含有する液体試料としては、該シアノファージに感染しているミクロキスティス属のアオコ原因藍藻を含有する液体試料（例えば、ミクロキスティス属が優占するアオコの終息期の湖水試料、該シアノファージに感染しているミクロキスティス属の藍藻の培養液など）、該ファージを含有する湖底泥の懸濁液、およびその懸濁液を遠心分離して得られた上清などを例示することができる。 A liquid sample containing cyanophage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm capable of specifically infecting and proliferating in the microcystis genus blue-green algae can be used as a liquid sample containing cyanophages of the microkistis genus Liquid samples (eg, aquatic end-of-life lake samples dominated by Microkistis, cultures of Microcystis cyanobacteria infected with the cyanophage, etc.), and lake mud containing the phage Examples thereof include suspensions and supernatants obtained by centrifuging the suspensions.
本発明のシアノファージの単離方法において、動植物プランクトンや細菌類の大部分を除去するため、孔径3μｍ 0.8μｍ,および0.2μｍのメンブレンフィルターで順番に濾過を行うのが適当である。
ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻を培養するための培地としては、MA培地やCB培地などの液体培地、およびこれらの液体培地に寒天またはアガロースを溶かし込み固化させることにより作製した固相培地などを例示することができる。これらの培地成分は、NIES-collection list of strains, 4th ed. (ed.) The National Institute for Environmental Studies, The Environmental Agency, Japan, 127 p. (1994)に示されている。
In the method for isolating cyanophage of the present invention, in order to remove most of animal and phytoplankton and bacteria, it is appropriate to perform filtration sequentially with membrane filters having pore sizes of 3 μm, 0.8 μm, and 0.2 μm.
Examples of culture media for cultivating Microcystis blue-green algae include liquid media such as MA and CB media, and solid media prepared by dissolving agar or agarose in these liquid media and solidifying them. can do. These medium components are shown in the NIES-collection list of strains, 4th ed. (Ed.) The National Institute for Environmental Studies, The Environmental Agency, Japan, 127 p. (1994).
ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻の培養液を調製するためのアオコ原因藍藻は、対数増殖期にあるミクロキスティス・エルギノーサであるとよく、例えば新鮮なCB培地に体積比で約1/10量の対数増殖期末期または定常期初期にあるミクロキスティス・エルギノーサ培養液を接種し、曝気条件下または非曝気条件下において、温度30℃、光強度100μmol photons m-2 s-1、12時間明：12時間暗の培養条件下で2〜3日間培養することで、対数増殖期にあるミクロキスティス・エルギノーサ培養液を調製することができる。曝気は、空気に二酸化炭素を0.3〜0.7%となるよう混合後、培養液中に通気速度を0.5〜1L/分にすることが望ましい。このミクロキスティス・エルギノーサ培養液に該シアノファージを粒子数が藻体細胞数の10-1〜10-10倍になるように接種し培養を行うとよい。ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻の培養は、本発明のシアノファージに感染させる前であるか、後であるかを問わず、曝気条件下または非曝気条件下において、温度15〜32℃、光強度50〜150μmol photons m-2 s-1、明暗周期のある条件下で行うことが好ましい。培養は、溶藻が確認されるまで続けるとよい。 For the preparation of the culture solution of the microcystis blue-green algae, the blue-green algae is preferably Microkistis aeruginosa in the logarithmic growth phase, for example, a logarithm of about 1/10 volume by volume in a fresh CB medium. Inoculated with Microkistis aeruginosa culture solution at the end of growth phase or early stationary phase, aerated or non-aerated, temperature 30 ℃, light intensity 100μmol photons m-2 s-1, 12 hours light: 12 hours By culturing for 2-3 days under dark culture conditions, it is possible to prepare a microcystis aeruginosa culture in the logarithmic growth phase. As for aeration, it is desirable that the aeration rate is 0.5 to 1 L / min in the culture solution after mixing carbon dioxide to 0.3 to 0.7% in the air. It is preferable to inoculate the microphistis aeruginosa culture solution by inoculating the cyanophage so that the number of particles is 10 -1 to 10 -10 times the number of algal cells. The culture of the microcystis blue-green algae is performed at a temperature of 15 to 32 ° C., light intensity under aerated or non-aerated conditions, whether before or after infection with the cyanophage of the present invention. 50-150 μmol photons m−2 s−1, preferably under conditions with a light / dark cycle. The culture is preferably continued until dissolved alga is confirmed.
シアノファージのクローニングにおける限界希釈は、10-1〜10-10倍の希釈段階で行うとよい。
また、本発明は、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージに感染して、溶藻が確認されたミクロキスティス属のアオコ原因藍藻の培養液を遠心処理または濾過し、得られた上清または濾液をミクロキスティス属のアオコ原因藍藻の培養液に接種して培養を行う操作を少なくとも１回繰り返す工程を含む、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージを継代培養する方法を提供する。
The limiting dilution in the cloning of cyanophage is preferably performed at a dilution step of 10 −1 to 10 −10 times.
In addition, the present invention relates to a microcaustis genus cause of microcystis genus in which the algae is confirmed by infecting a cyanophage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm capable of specifically infecting and proliferating in the microcystis genus cyanobacteria. A step of centrifuging or filtering the culture solution of cyanobacteria, and inoculating the obtained supernatant or filtrate into the culture solution of the blue-green algae causing the bacterium belonging to the genus Microkistis at least once; Provided is a method for subculturing a cyanophage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm capable of specifically infecting and proliferating a blue-causing cyanobacteria.
ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージに感染して、溶藻が確認されたミクロキスティス属のアオコ原因藍藻の培養液は、上述のようにして得ることができる。
溶藻が確認されたミクロキスティス属のアオコ原因藍藻の培養液を遠心処理する場合は、5000〜7000 x gの遠心加速度で20〜30分間遠心処理を行い、その上清を得るとよい。上清の表面に一部の藍藻細胞が浮遊している場合は、これをピペット等で除去するとよい。
A culture solution of microcystis genus blue-green algae, which is infected with cyanobacteria with a total length of 0.01 μm to 0.4 μm and capable of proliferating by specifically infecting the microcystis genus Blue-green algae. It can be obtained as described above.
When centrifuging the culture solution of a microcaustic blue-green algae with dissolved algae, the supernatant is preferably obtained by centrifuging at a centrifugal acceleration of 5000 to 7000 xg for 20 to 30 minutes. If some cyanobacterial cells are floating on the surface of the supernatant, they may be removed with a pipette or the like.
溶藻が確認されたミクロキスティス属のアオコ原因藍藻の培養液を濾過する場合は、孔径0.8μmのフィルターで濾過して、その濾液を得るとよい。
遠心処理により得られた上清または濾過により得られた濾液は、対数増殖中のミクロキスティス属の藻類の培養液に接種して培養を行うとよい。培養は、温度15〜32℃、光強度50〜150μmol photons m-2 s-1、明暗周期を与えた条件下で行うことが好ましい。培養液中の藻体の増殖を評価し、継代培養したシアノファージがミクロキスティス属の藻類に対する感染性を保持していることを確認するとよい。
When filtering the culture solution of the microcystis genus Blue-green algae with dissolved alga, it is better to filter with a filter having a pore diameter of 0.8 μm to obtain the filtrate.
The supernatant obtained by centrifugation or the filtrate obtained by filtration is preferably inoculated into a culture solution of microcystis algae during logarithmic growth. The culture is preferably performed under conditions of a temperature of 15 to 32 ° C., a light intensity of 50 to 150 μmol photons m −2 s −1 and a light / dark cycle. It is preferable to evaluate the growth of algal bodies in the culture medium and confirm that the subcultured cyanophage retains the infectivity to microcystis algae.
また、本発明は、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージの懸濁液をフィルターで濾過した後、ポリエチレングリコールを添加し、2〜10℃の温度で放置し、遠心分離により濃縮することで得られたシアノファージの懸濁液を塩化セシウムステップ密度勾配中において111,000 x g以上の遠心加速度で1〜2時間超遠心分離して精製することによる、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージの濃縮・精製方法を提供する。111,000 x g以上の遠心加速度で超遠心分離する時間は1〜2時間であり、好ましくは1時間である。本発明の方法において、ミクロキスティス属に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージの懸濁液に、塩化ナトリウム（終濃度4%）、クロロホルム（終濃度0.5%）を添加・撹拌し、孔径0.8μｍのフィルターで濾過して得られた濾液に終濃度10％となるようポリエチレングリコールを添加し2〜10℃に一夜放置後、7,000 x gで40分間遠心分離してファージ-ポリエチレングリコール複合体を沈殿させることにより、シアノファージ粒子を濃縮するとよい。得られたペレットは、SMバッファー（50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM MgSO4・7H2O, 0.01% ゼラチン, pH 7.5）で懸濁し、等量のクロロホルムを添加して撹拌後、7,500 x gで20分間遠心するとよい。また、ファージ粒子の感染性を高く維持する方法として、クロロホルムを添加しない方法も推奨される。さらに本発明は、得られたファージ粒子濃縮液を1.45〜1.70g/mlの塩化セシウムステップ密度勾配中において111,000 x gで1時間以上超遠心分離して白濁バンドとして得ることによるシアノファージの精製方法を提供する。
In addition, the present invention filters a suspension of cyanophage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm, which can specifically infect and proliferate a microcaustic blue-green algae, and then adds polyethylene glycol, Cyanophage suspension obtained by standing at 2-10 ° C and concentrating by centrifugation is ultracentrifuged at a centrifugal acceleration of 111,000 xg or more for 1-2 hours in a cesium chloride step density gradient. Provided is a method for concentrating and purifying cyanophage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm, which can be specifically infected and proliferated by a purified microcystis-causing cyanobacteria. The time of ultracentrifugation at a centrifugal acceleration of 111,000 xg or more is 1 to 2 hours, preferably 1 hour. In the method of the present invention, a suspension of cyanophage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm capable of specifically infecting and proliferating with Microcystis is added to sodium chloride (
さらに、本発明は、アオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージを有効成分として含むアオコ防除剤を提供する。
さらにまた、本発明は、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージを水域に散布することからなるアオコ防除方法を提供する。
Furthermore, the present invention provides a sea cucumber control agent comprising, as an active ingredient, a cyanophage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm capable of specifically infecting and proliferating a blue causative cyanobacteria.
Furthermore, the present invention provides a method for controlling sea cucumber, which comprises spraying cyanobacteria having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm, which can specifically infect and proliferate a microcaustic genus cyanobacteria in the water.
本明細書において、「アオコ防除」とは、アオコの発生を予防すること、アオコの発生を小規模化すること、発生したアオコを駆除することを含む概念である。
アオコ防除の対象となる水域は、天然・人工を問わずいかなる水域であってもよいが、アオコ発生水域やアオコの頻発する水域など、アオコが現在発生している水域、アオコが現在発生していないが将来発生することが予想される水域をアオコ防除の対象とするとよい。
In the present specification, the “controlling of the sea bream” is a concept that includes preventing the occurrence of the sea bream, reducing the scale of the sea bream, and extinguishing the sea bream that has occurred.
The water area subject to the control of blue-green can be any water regardless of whether it is natural or man-made. Water areas that are not expected but are expected to occur in the future should be targeted for blue-green algae control.
ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージを固定化剤に包埋したものを、水域の底泥中に設置・埋設してもよい。これにより、シアノファージを継続的に同水域に放出させることができ、アオコの発生しにくい条件を作り出し、アオコ発生を予防または小規模化することができる。
シアノファージを包埋するための固定化剤としては、合成高分子ゲル、合成樹脂プレポリマー、天然多糖類、中空糸膜、シリコンポリマー、活性炭、マイクロカプセル、滅菌処理を施した湖底泥等を例示することができる。
Even if you install and embed a cyanophage of 0.01 μm to 0.4 μm in length in the bottom mud of the water area that can specifically infect and propagate the microcystis-causing cyanobacteria Good. Thereby, cyanophage can be continuously released into the same water area, and conditions under which aquatic can hardly be generated can be created, and the occurrence of aquatic can be prevented or reduced in scale.
Examples of immobilizing agents for embedding cyanophages include synthetic polymer gels, synthetic resin prepolymers, natural polysaccharides, hollow fiber membranes, silicon polymers, activated carbon, microcapsules, sterilized lake bottom mud, etc. can do.
ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージを固定化剤に包埋したものを耐水性のネットまたは容器に入れて、アオコの頻発する水域内で筏、ブイ、船舶係留施設および／または船舶に吊す、あるいは固定してもよい。この方法によっても、シアノファージを継続的に同水域に放出させることができ、アオコの発生しにくい条件を作り出し、アオコ発生を予防または小規模化することが可能である。 Frequent occurrence of blue sea bream in a water-resistant net or container with a cyanophage of 0.01 μm to 0.4 μm in length embedded in a fixing agent that can specifically infect and propagate the microcaustic blue-green algae May be hung or anchored in dredged water, buoys, ship mooring facilities and / or ships within the water area. Also by this method, cyanophage can be continuously released into the same water area, and it is possible to create conditions that prevent the occurrence of blue sea cucumber and to prevent or reduce the scale of blue sea bream.
また、本発明は、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージの懸濁液を-196〜-80℃に保存することを含む、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージを保存する方法を提供する。 The present invention also includes storing a suspension of cyanophage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm at −196 to −80 ° C. capable of specifically infecting and proliferating a microcaustic blue-green algae. The present invention provides a method for preserving cyanophage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm, which can specifically infect and grow a microcaustic blue-green algae.
凍結保存をする場合には、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージ懸濁液をそのまま、あるいはジメチルスルホオキシド（終濃度5〜20％）等の凍結保護剤を添加・混合後に-80〜-196℃で凍結保存するとよい。懸濁液の状態で保存する場合には、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージ懸濁液を4℃暗所に保存するとよい。-20℃以上の温度での保存の場合には大幅な力価の減少が、また4℃保存の場合には時間経過とともに緩やかな力価の減少がそれぞれ起こるため、長期保存には-80℃以下の超低温条件下での保存が推奨される。
In the case of cryopreservation, a cyanophage suspension having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm, which can specifically infect and grow a microcaustic genus cyanobacteria, can be used as it is, or dimethyl sulfoxide (
本明細書において、「アオコ」とは、藍藻類の急激な増殖に伴い主に内水面（天然および人工の湖沼、河川、池など）の色が変化する現象を指す。この用語は、ミクロシスティン等のシアノトキシン（藍藻毒）の水圏環境中へ放出の有無または水産生物へのシアノトキシンの蓄積または斃死等の被害の有無に関わらず広く用いられる。有害アオコの原因となる藍藻としては、ミクロキスティス属、アナベナ属、ノストク属、ホルミディウム属、アファニゾメノン属、プランクトスリクス属などが挙げられる。ミクロキスティス属に属する種としてはミクロキスティス・エルギノーサ、ミクロキスティス・ヴェーゼンベルギー、ミクロキスティス・フロスアクエ、ミクロキスティス・ノヴァセキ、ミクロキスティス・イクチオブラーベ、ミクロキスティス・ヴィリディスなどが挙げられ、とくにその一部は世界各地の水源で発生する有毒種であり問題視されている。 In the present specification, “aoko” refers to a phenomenon in which the color of the inner water surface (natural and artificial lakes, rivers, ponds, etc.) changes mainly due to rapid growth of cyanobacteria. This term is widely used regardless of whether cyanotoxin (cyanophyceae) such as microcystin is released into the aquatic environment or whether there is damage such as accumulation of cyanotoxin in the aquatic product or drowning. Examples of cyanobacteria causing caustic mushrooms include the genus Microkistis, Anabena, Nostok, Holmidium, Aphanizomenon, and Planktriscus. Species belonging to the genus Microkistis include Microkistis aeruginosa, Microkistis vesen Belgium, Microkistis floss aquee, Microkistis novaseki, Microkistis ixiobrave, Microkistis viridis, especially some of them. Is a toxic species that occurs in water sources around the world and is regarded as a problem.
ファージとは、感染した宿主細胞内においてのみ増殖しうる感染性をもった球形、マッチ棒状、レモン型、または繊維状などの微小構造体を指し、真正細菌・古細菌・藍藻類といった原核生物を宿主とするウイルスである。このうち藍藻を宿主とするものを「シアノファージ」と呼称する。シアノファージは、通常の原核生物や真核生物のように周囲の栄養分を取り込む、あるいは光合成を行うことにより二***で増殖することはできず、宿主藍藻細胞に感染し、宿主細胞の生合成系を利用することでのみ自己の複製を行う。この点で、シアノファージは細菌とは全く異なる微生物因子である。また、藍藻類を溶藻する細菌類（溶藻細菌）と比較して宿主特異性が著しく高いのが特徴である。なお、「宿主特異性が高い」とは、病原性寄生生物（この場合はシアノファージ）が感染し増殖しうる宿主生物種の範囲（宿主域）が狭いことを意味する。 Phages refer to microscopic structures such as spheres, match rods, lemons, or fibers that can only grow in infected host cells. Prokaryotes such as eubacteria, archaea, and cyanobacteria The virus is the host. Among these, those using cyanobacteria as a host are referred to as “cyanophages”. Cyanophage cannot be propagated in two divisions by taking in surrounding nutrients or carrying out photosynthesis like ordinary prokaryotes and eukaryotes, and infects host cyanobacterial cells, host cell biosynthesis system Replicate itself only by using. In this respect, cyanophage is a microbial factor that is completely different from bacteria. In addition, the host specificity is remarkably high as compared with bacteria that dissolve cyanobacteria (lytic alga bacteria). “High host specificity” means that the range (host range) of host species that can infect and propagate pathogenic parasites (in this case, cyanophage) is narrow.
本発明により、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージが提供された。また、本発明により、該シアノファージを利用するアオコ防除剤、アオコ防除方法、並びに該シアノファージの単離方法、継代培養方法、濃縮・精製方法、および保存方法が提供された。本発明のシアノファージを用いることにより、アオコの発生を予防、小規模化、および／またはアオコを駆除することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, there is provided a cyanophage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm, which can specifically infect and proliferate a microcaustic blue-green algae. In addition, according to the present invention, there are provided a scab control agent, a scab control method, and a cyanophage isolation method, subculture method, concentration / purification method, and storage method using the cyanophage. By using the cyanophage of the present invention, it is possible to prevent, reduce the scale, and / or control the aquatic outbreak.
以下、本発明を詳細に説明する。
ミクロキスティス・エルギノーサは、アオコ原因藍藻の一種であり、細胞の長径は約3〜5μm、自然界中では通常 単細胞または粘質性多糖類で包まれた群体の形で存在する。春季から秋季に増殖してアオコを形成するケースが多く、国内ではほぼ毎年、琵琶湖、三方湖、霞ヶ浦等、全国各地の湖沼等で本種によるアオコの発生が報告されている。また世界的にも広範に分布し、欧州、北アメリカ、南アメリカ、オーストラリア、アジア等で本種によるアオコの発生が報告されている。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Microcystis aeruginosa is a kind of blue-green algae that has a major axis of about 3 to 5 μm. In nature, it usually exists in the form of a single cell or a group of viscous polysaccharides. In many cases, it grows from spring to autumn to form blue sea bream. In Japan, the occurrence of blue sea bream by this species is reported almost every year in Lake Biwa, Lake Mikata, Kasumigaura, etc. In addition, it is widely distributed worldwide, and the occurrence of blue sea bream caused by this species has been reported in Europe, North America, South America, Australia, Asia and other countries.
本発明のシアノファージは、ミクロキスティス・エルギノーサに特異的に感染して増殖しうる。ミクロキスティス・エルギノーサに特異的に感染して増殖しうるシアノファージは、頭部および尾部構造を有し、外膜構造を欠き、頭部は直径約60〜120nm（平均86nm）の正二十面体、尾部構造のうちコア部分は約140〜350nm（平均長209nm）、鞘は約60〜260nm（平均長142nm）である。このシアノファージに感染したミクロキスティス・エルギノーサ細胞内では娘ファージ粒子が形成され、宿主細胞の崩壊に伴いそれらが環境中に放出されることで、新たな（すなわち、未感染の）ミクロキスティス・エルギノーサ細胞の感染・死滅を誘発する。また、該シアノファージの宿主特異性は高く、これまでのところ、ミクロキスティス・エルギノーサ以外の藍藻類および真核性植物プランクトンに対する影響は全く検出されていない。 The cyanophage of the present invention can be specifically infected with Microcystis aeruginosa and proliferate. Cyanophage, which can specifically infect and grow Microcystis aeruginosa, has a head and tail structure, lacks an outer membrane structure, and the head is an icosahedron with a diameter of about 60 to 120 nm (average 86 nm). In the tail structure, the core part is about 140 to 350 nm (average length 209 nm), and the sheath is about 60 to 260 nm (average length 142 nm). Daughter phage particles are formed in the microcystis aeruginosa cells infected with this cyanophage and released into the environment as the host cell breaks down, resulting in a new (ie, uninfected) microkistis aeruginosa. Induces cell infection and death. In addition, the host specificity of the cyanophage is high, and so far no effects on cyanobacteria other than Microkistis aeruginosa and eukaryotic phytoplankton have been detected.
本発明のシアノファージは、以下のようにして単離することができる。まず、ミクロキスティス属の藻類に特異的に感染して増殖しうるファージに感染しているミクロキスティス属の藻類を含有する湖沼等の試水（例えば、ミクロキスティス属の優占するアオコの終息期の湖水）または湖沼等の底泥中に存在するシアノファージを懸濁させたCB培地を孔径0.2μmのフィルターで濾過して得られた濾液等を、対数増殖状態にあるミクロキスティス属の藻類の培養液に接種し、30℃、12時間明：12時間暗の明暗のサイクルで5〜7日間、50〜150μmol photons m-2 s-1の白色蛍光灯の照射下で培養する。光強度は市販の光量子計を用いて測定することができる。 The cyanophage of the present invention can be isolated as follows. First, water samples such as lakes and marshes containing microcystis algae that are infected with phages that can specifically infect and proliferate microcystis algae (for example, the ending stage of the blue-tailed octopus dominantly Of CB medium suspended in cyanobacteria existing in the bottom mud of lakes and lakes, etc., with a filtrate obtained by filtering with a 0.2 μm pore size filter, The culture solution is inoculated and cultured at 30 ° C., 12 hours light: 12 hours dark light-dark cycle for 5-7 days under irradiation of 50-150 μmol photons m −2 s −1 white fluorescent lamp. The light intensity can be measured using a commercially available photon meter.
ミクロキスティス属の藻類の培養液は、この藻類を予めマイクロピペット法、プレート塗沫法、または限界希釈法によりクローニングして、株化しておき、CB培地に接種後、50〜150μmol photons m-2 s-1の白色蛍光灯を12時間明：12時間暗の明暗サイクルで照射し、15〜32℃で培養、好ましくは30℃で培養することにより調製できる。培養温度は30℃が最適である。新鮮な滅菌済みCB培地に対し体積比で約1/10量の対数増殖期末期または定常期初期にあるミクロキスティス属藻類の培養液を接種し上記条件下においた場合、培養開始後約2〜3日で対数増殖期に入る。 As for the culture solution of the microcystis algae, this algae was previously cloned by micropipette method, plate smearing method or limiting dilution method, established, and inoculated into CB medium, then 50-150 μmol photons m -2 It can be prepared by irradiating a white fluorescent lamp of s -1 with a light / dark cycle of 12 hours light: 12 hours dark and culturing at 15 to 32 ° C, preferably at 30 ° C. The optimum culture temperature is 30 ° C. When inoculated with a culture solution of microcystis algae at the end of the logarithmic growth period or the early stationary phase of about 1/10 volume by volume ratio against fresh sterilized CB medium, and under the above conditions, about 2 to The logarithmic growth phase starts in 3 days.
次いで、ミクロキスティス属の藻類の溶藻が観察された培養液をミクロキスティス属の藻類用培地で限界希釈することによりシアノファージをクローニングする。ミクロキスティス属を培養するための培地としてはMA培地やCB培地などを例示することができる。限界希釈は次のようにして行うとよい。まず、ミクロキスティス属の藻類の溶藻が観察された培養液を採取し、CB培地で100〜10-10倍に段階希釈し、各希釈液を対数増殖中のミクロキスティス属の藻類の培養液に接種する。これらを、例えば30℃、100μmol photons m-2s-1、12時間明：12時間暗の明暗周期条件下で14日間培養する。培養後、ミクロキスティス属の藻類の溶藻が観察された最も希釈段階の高いものを選択して、その培養液について上記の段階希釈法による処理を少なくとも２回繰り返す。最終の段階希釈法による処理の後、ミクロキスティス属の藻類の溶藻が観察された培養液のうち、最も希釈段階の高い培養液を採取して、対数増殖中のミクロキスティス属の藻類の培養液に接種し、溶藻せしめる。以上の操作をもって、本発明のシアノファージのクローニングの完了とみなすことができる。 Next, the cyanophage is cloned by limiting dilution of the culture solution in which the algae of the microcystis algae is observed with a culture medium for the microcystis algae. Examples of the medium for culturing Microcystis include MA medium and CB medium. Limit dilution may be performed as follows. First, collect the culture溶藻algae Microcystis spp was observed, and serially diluted to 10 0 - 10 -10 fold with CB medium, culture of Microcystis genus algae exponentially growing each dilution Inoculate the solution. These are cultured for 14 days under light-dark cycle conditions of, for example, 30 ° C., 100 μmol photons m −2 s −1 , 12 hours light: 12 hours dark. After culturing, the one with the highest dilution level in which the algae of the genus Microcystis is observed is selected, and the treatment by the above-described serial dilution method is repeated at least twice for the culture solution. After treatment by the final serial dilution method, among the culture fluids in which microcystis algae were observed, the culture solution with the highest dilution level was collected to culture the logarithmically growing microcystis algae. Inoculate the solution and let it dissolve. The above operation can be regarded as the completion of cloning of the cyanophage of the present invention.
シアノファージのクローニングが完了したミクロキスティス属の藻類の培養液、すなわちシアノファージ懸濁液を孔径0.8μmのフィルターで濾過することにより細胞残さを除去した後、濾液を上記の要領で段階希釈法によって処理して得られた各希釈段階における死滅ウェル数から、統計的計算により濾液中に存在したシアノファージの感染性粒子密度を推定することができる。具体的には、各希釈段階で溶藻が起こったウェル数から西原らの計算ソフトを用いて最確数を算出することが可能である（西原力, 蔵野憲秀, 篠田純男. マイクロコンピュータによる最確数の計算. 衛生化学32(3): 226-228(1986)）。また、同濾液をDAPI (4'-6-diaminido-2-phenylindole)、SYBR Green I等の核酸染色剤で染色後、蛍光顕微鏡下で直接観察により計数、またはフローサイトメータにより計数することで濾液中に存在するシアノファージの粒子密度を算定することができる。蛍光顕微鏡としてはOLYMPUS社 BX50などを、フローサイトメータとしてはBeckman Coulter社EPICS XLなどをそれぞれ例示することができる。 After removing the cell residue by filtering the culture solution of the microcystis algae in which cloning of cyanophage is completed, that is, the suspension of cyanophage with a filter having a pore diameter of 0.8 μm, the filtrate is subjected to serial dilution as described above. The infectious particle density of cyanophage present in the filtrate can be estimated by statistical calculation from the number of dead wells in each dilution step obtained by the treatment. Specifically, the most probable number can be calculated from the number of wells in which the algae occurred at each dilution stage using Nishihara et al.'S calculation software (Riki Nishihara, Norihide Kurano, Juno Shinoda. Calculation of the exact number. Sanitary chemistry 32 (3): 226-228 (1986)). In addition, after staining the filtrate with a nucleic acid stain such as DAPI (4'-6-diaminido-2-phenylindole) or SYBR Green I, the filtrate can be counted by direct observation under a fluorescence microscope, or by counting with a flow cytometer. The particle density of cyanophage present therein can be calculated. Examples of the fluorescence microscope include OLYMPUS BX50, and examples of the flow cytometer include Beckman Coulter EPICS XL.
本発明のシアノファージをアオコ発生水域に散布することにより、アオコを防除することができる。アオコの防除にあたっては、本発明のシアノファージの培養液、同濾液、またはその遠心上清をそのまま使用してもよいが、本発明のシアノファージを活性成分として含む製剤を調製してこれを使用してもよい。本発明のアオコ防除方法およびアオコ防除剤は、自然環境中にすでに存在している宿主特異性の高いシアノファージを利用するので、生態系への負荷が小さな環境修復技術として、その安全性に高い期待が寄せられる。また、本発明のアオコ防除剤は、他の通常の薬剤と異なり、シアノファージ自体に（宿主細胞への感染を介した）自己複製能が備わっているため、少量の投入で広範囲へのアオコ制御効果が期待できる。また、シアノファージを固定化剤に包埋したものを筏、ブイ、船舶係留施設および／または船舶に吊す、あるいは固定する、または底泥中に設置し、シアノファージを継続的に環境中に放出させる方法も推奨される。この方法は、シアノファージの希釈拡散を抑え、アオコ防除の対象となる水域に長期間にわたり高いシアノファージ密度を維持させる上で有効であると考えられる。固定化剤としては、合成高分子ゲル、合成樹脂プレポリマー、天然多糖類、中空糸膜、シリコンポリマー、活性炭、マイクロカプセル、各種増粘剤、滅菌済みの湖底泥等を利用することができる。 By spraying the cyanophage of the present invention into the water generating area, the water can be controlled. In controlling the sea cucumber, the culture solution of the cyanophage of the present invention, the same filtrate, or the centrifugal supernatant thereof may be used as it is, but a preparation containing the cyanophage of the present invention as an active ingredient is prepared and used. May be. Since the method for controlling sea lions and the agent for controlling sea lions according to the present invention uses cyanophage having high host specificity that already exists in the natural environment, it is highly safe as an environmental remediation technique with a small burden on the ecosystem. Expectation. In addition, unlike the other conventional agents, the aquo control agent of the present invention has a self-replicating ability (via infection to the host cell) itself, so that the aquo control can be controlled over a wide range with a small amount of input. The effect can be expected. Also, cyanophages embedded in immobilizing agents can be suspended in anchors, buoys, ship mooring facilities and / or ships, or placed in bottom mud, and cyanophages can be continuously released into the environment. It is also recommended that This method is considered to be effective in suppressing the dilution diffusion of cyanophage and maintaining a high density of cyanophage over a long period of time in the water area that is the target for control of blue sea bream. As the immobilizing agent, synthetic polymer gel, synthetic resin prepolymer, natural polysaccharide, hollow fiber membrane, silicon polymer, activated carbon, microcapsule, various thickeners, sterilized lake bottom mud, and the like can be used.
次に、本発明のシアノファージを継代培養する方法について説明する。
本発明のシアノファージに感染して、溶藻が確認されたミクロキスティス属の藻類の培養液を孔径0.8μmのフィルターで濾過することにより細胞残さを除去し、得られた濾液を対数増殖中のミクロキスティス属の藻類の培養液に接種して培養を行う。培養液中の細胞密度を光学顕微鏡、蛍光顕微鏡（G励起）下で経日的にモニターする方法、あるいはクロロフィル測定装置を用いることにより、その後の藻体の増殖を評価することができる。クロロフィル測定装置としては米国ターナーデザイン社製10-AU-CEなどを例示することができる。これにより、上記の方法で継代培養したシアノファージが、ミクロキスティス属の藻類に対する感染性を保持していることが確認できる。
Next, a method for subculturing the cyanophage of the present invention will be described.
The cell residue was removed by filtering the culture solution of the microcystis algae in which the algae was confirmed infected with the cyanophage of the present invention with a filter having a pore diameter of 0.8 μm, and the obtained filtrate was subjected to logarithmic growth. Cultivate by inoculating a culture solution of microcystis algae. Subsequent growth of algal bodies can be evaluated by using a method of monitoring the cell density in the culture solution under an optical microscope, fluorescence microscope (G excitation), or a chlorophyll measuring device. Examples of the chlorophyll measuring device include 10-AU-CE manufactured by Turner Design of the United States. Thereby, it can confirm that the cyanophage subcultured by said method hold | maintains the infectivity with respect to the microcystis genus algae.
本発明のシアノファージ接種後、溶藻が確認された宿主培養液は、孔径0.8μmのフィルターで濾過後、密封保冷することで、大幅な力価の低下を伴うことなく保存することが可能である。シアノファージ懸濁液をそのまま、あるいはジメチルスルホオキシド（終濃度5〜20％）等の凍結保護剤を添加・混合後に-80〜-196℃で凍結保存するとよい。懸濁液の状態で保存する場合には、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージ懸濁液を4℃暗所に保存するとよい。-20℃以上の温度域での保存の場合、力価の減少がみられる場合があるため、長期保存には-80℃以下の超低温条件下での保存が推奨される。
After inoculating the cyanophage of the present invention, the host culture solution in which dissolved alga has been confirmed can be stored without significant decrease in titer by filtering and sealing and cooling with a filter having a pore size of 0.8 μm. is there. The cyanophage suspension may be stored as it is, or cryopreserved at −80 to −196 ° C. after adding and mixing a cryoprotectant such as dimethyl sulfoxide (
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. The scope of the present invention is not limited by these examples.
〔実施例１〕
材料および方法
供試プランクトンの培養条件
シアノファージの分離には、茨城県霞ヶ浦から分離されたミクロキスティス・エルギノーサ NIES-298株（環境研究所保存株）を用いた。同株の培養にはCB培地を用い、培養は温度30℃、光強度100 μmol photons m-2 s-1、12時間明：12時間暗の明暗周期条件下で行った。
[Example 1]
Materials and methods
Culture conditions of test plankton For separation of cyanophages, Microkistis aeruginosa strain NIES-298 (Environmental Research Institute preservation strain) isolated from Kasumigaura, Ibaraki Prefecture was used. CB medium was used for the culture of the same strain, and the culture was performed under a light-dark cycle condition of a temperature of 30 ° C., light intensity of 100 μmol photons m −2 s −1 , 12 hours light: 12 hours dark.
シアノファージの分離
殺藻因子の分離に供した試水は、2003年8月24日に京都府広沢池ならびに2003年8月25日に福井県三方湖で採取した。試水を孔径0.2μmのフィルターで濾過し、(1) 液体培養法（96ウェルプレートで宿主と濾液を１ウェルあたり100μlずつ混合する方法）、(2) プラークアッセイ（濾液1mlを対数増殖期中期の宿主ミクロキスティス・エルギノーサNIES-298株の培養液1mlと混合し、30分間反応させ、37℃でインキュベートしたCB培地2.5ml（0.72％ L. M. P. agaroseを含む）と混合し、その混合液を、あらかじめシャーレに流し込み固めておいたCB培地20ml（0.4％ L. M. P. agaroseを含む）上に流し込み固化、その後シャーレを裏返しにして12時間明：12時間暗、30℃、光強度100μmol photons m-2 s-1で2週間培養する方法）、(3) 集積培養法（宿主培養液50mlとろ過試水25mlを混合して2週間培養した後に(2)に示した方法でプラークアッセイを行なう方法）、の3種類の方法を用いてミクロキスティス・エルギノーサNIES-298株を宿主とするシアノファージの探索を行なった。また、対照として滅菌済みのCB培地を同様にそれぞれ接種した実験区を設け、上述の条件下で培養を行った。宿主培養の状態を肉眼、光学顕微鏡、または蛍光顕微鏡観察により実験区（濾液接種区）と対照区（CB培地接種区）の間で比較し、実験区における溶藻の有無を確認した。
Separation of cyanophage Sample water used for separation of the algicidal factor was collected on August 24, 2003 in Hirosawaike, Kyoto Prefecture and on August 25, 2003 in Lake Mikata, Fukui Prefecture. The test water is filtered through a filter with a pore size of 0.2 μm, (1) liquid culture method (method in which the host and filtrate are mixed at 100 μl per well in a 96-well plate), and (2) plaque assay (1 ml of filtrate is in the middle of the logarithmic growth phase) Mixed with 1 ml of the culture medium of the host microcystis aeruginosa strain NIES-298, reacted for 30 minutes and incubated with 37 ml of CB medium (containing 0.72% LMP agarose). Pour into 20 ml of CB medium (contained 0.4% LMP agarose) that has been poured into a petri dish and solidify, then turn the dish upside down for 12 hours: 12 hours dark, 30 ° C, light intensity 100 μmol photons m -2 s -1 (3) Concentration culture method (Method of performing plaque assay by the method shown in (2) after mixing for 2 weeks after mixing 50 ml of host culture solution and 25 ml of filtration test water) Microkistis erugino using different methods The service NIES-298 strain was carried out a search for cyanophage to host. Further, as a control, an experimental group in which a sterilized CB medium was similarly inoculated was provided and cultured under the above-described conditions. The state of the host culture was compared between the experimental group (filtrate inoculated group) and the control group (CB medium inoculated group) by observation with the naked eye, light microscope, or fluorescence microscope to confirm the presence or absence of dissolved alga in the experimental group.
殺藻因子をクローニングすることを目的とし、以下のように限界希釈法を2回繰り返し行った。上述の培養で溶藻が確認された培養液、または宿主固相培養上に生じたプラークを採取して得たシアノファージを対数増殖中のミクロキスティス・エルギノーサNIES-298株の培養液に接種して得たシアノファージ懸濁液をそれぞれ孔径0.2μmのフィルターで濾過後、CB培地で100〜10-10倍に段階希釈した。その後、各希釈液100μlを対数増殖中のミクロキスティス・エルギノーサNIES-298株の培養液150μlに接種した。実験には96穴マイクロプレートを使用し、各希釈段階につき8本立てで接種を行った。また、CB培地のみを接種したものを対照実験区として設けた。これらを上述の条件下で14日間培養した。溶藻が見られたウェルのうち、最も高い希釈段階で接種を行ったウェル中の溶藻培養液を採取し、再度上述の段階希釈法による処理を試みた。2回目の処理で溶藻が見られたウェルのうち、最高希釈段階の溶藻培養液200μlを採取し、孔径0.2μmのフィルターで濾過後、その濾液を対数増殖中のミクロキスティス・エルギノーサNIES-298株の培養液1mlに接種し、溶藻せしめた。以上の操作をもって、殺藻因子のクローニングが完了したものとみなした。また、得られた殺藻因子懸濁液をDAPI(4'-6-diaminido-2-phenylindole)で染色後、蛍光顕微鏡下で観察し、混在する細菌（コンタミネーション）の有無を確認するとともに、対数増殖期のミクロキスティス・エルギノーサNIES-298株培養25mlに対して感染多重度（接種されたシアノファージ数の宿主細胞数に対する割合、すなわち１宿主細胞あたり何個のシアノファージが接種されたかを示す数値）が0.01以下となるよう接種し、CB培地を接種した対照区と比較することで殺藻性の確認を行った。 In order to clone the algicidal factor, the limiting dilution method was repeated twice as follows. Inoculate the culture solution of Microchitis eruginosa strain NIES-298 in logarithmic growth with the culture solution in which the algae has been confirmed in the above-mentioned culture or the cyanophage obtained by collecting plaques produced on the host solid phase culture. after filtration obtained was cyanophage suspension with a filter of each pore size 0.2 [mu] m, it was serially diluted 10 0 - 10 -10 fold with CB medium. Thereafter, 100 μl of each diluted solution was inoculated into 150 μl of a culture solution of Microcystis aeruginosa strain NIES-298 that was growing logarithmically. A 96-well microplate was used for the experiment, and inoculation was performed in 8 tubes at each dilution stage. Moreover, what inoculated only CB culture medium was provided as a control experiment group. These were cultured for 14 days under the conditions described above. Among the wells in which lysed alga were found, the lysed broth in the well inoculated at the highest dilution level was collected, and the above-described serial dilution method was tried again. Of the wells where algae were found in the second treatment, 200 μl of the highest dilution stage of algal broth was collected, filtered through a 0.2 μm pore size filter, and the filtrate was logarithmically growing Microcystis aeruginosa NIES- Inoculated into 1 ml of the culture solution of 298 strains and allowed to dissolve. With the above operation, it was considered that cloning of the algicidal factor was completed. The resulting algicidal factor suspension was stained with DAPI (4'-6-diaminido-2-phenylindole) and then observed under a fluorescence microscope to confirm the presence of mixed bacteria (contamination). Multiplicity of infection (indicating the ratio of inoculated cyanophage to the number of host cells, that is, how many cyanophages were inoculated per host cell) for 25 ml culture of Microcystis aeruginosa strain NIES-298 in logarithmic growth phase (Numerical value) was inoculated to be 0.01 or less, and the algicidal property was confirmed by comparing with the control group inoculated with CB medium.
さらに、得られたファージ懸濁液について、DAPI (4'-6-diaminido-2-phenylindole)染色による直接計数値と、プラークアッセイおよび限界希釈法（MPN法）による力価の測定・比較を行った。これにより、生産された粒子のうちで感染力を持つ粒子が占める割合を推定した。 Furthermore, the obtained phage suspensions were directly counted by DAPI (4'-6-diaminido-2-phenylindole) staining, and the titer was measured and compared by plaque assay and limiting dilution method (MPN method). It was. Thus, the proportion of particles produced by infectious particles among the produced particles was estimated.
シアノファージの保存
シアノファージ接種後、溶藻が確認された宿主培養液を孔径0.8μmのフィルターで濾過後、それぞれ0.5mlを、凍結保護剤無添加、グリセロール添加（終濃度10%）、DMSO添加（ジメチルスルホオキシド：終濃度10%）、またはセルバンカー２添加（日本全薬工業(株)製：終濃度50%）の各条件下で、-196℃および-80℃にそれぞれ14日間保存した。また、凍結保護剤無添加試料については-20℃および4℃で同様の保存を行った。その後、実験開始時のシアノファージ懸濁液の力価を保存開始後7日目および14日目の力価と比較した。力価の測定は、上述の段階希釈法により得られた結果、すなわち各希釈段階で溶藻が起こったウェル数から西原らの計算ソフト（西原力, 蔵野憲秀, 篠田純男. マイクロコンピュータによる最確数の計算. 衛生化学32(3): 226-228(1986)）を用いて最確数を算出する方法により行った。
Storage of cyanophage After inoculation with cyanophage, the host culture solution in which the algae was confirmed was filtered through a filter with a pore size of 0.8 μm, and 0.5 ml each was added with no cryoprotectant, glycerol added (
透過型電子顕微鏡による微視的観察
得られたシアノファージによる溶藻培養液を感染多重度が0.001〜1となるよう対数増殖中のミクロキスティス株の培養液に接種した。接種前に採取したサンプルおよび接種後に経時的に採取したサンプルについて、常法により固定包埋処理後、JEOL社製JEM-1010透過型電子顕微鏡による観察を行った。また、溶藻培養液中のシアノファージの形態観察をネガティブ染色法により行った。
Microscopic Observation by Transmission Electron Microscope The obtained lysed algal broth was inoculated into the culture solution of the logarithmic microcystis strain so that the multiplicity of infection was 0.001-1. A sample collected before inoculation and a sample collected over time after inoculation were observed by a JEOL JEM-1010 transmission electron microscope after fixed embedding by a conventional method. In addition, the morphology of cyanophage in the lysed culture was observed by negative staining.
接種実験（１）
上述のシアノファージを感染多重度が10-1〜10-9になるよう対数増殖中のミクロキスティス株培養液に接種後、上述の培養条件下で6日間培養し、宿主細胞密度の変化を直接計数法により追跡した。対照区として、0.2μmで濾過したシアノファージ懸濁液をオートクレーブ処理（121℃ x 15分）したものを接種した実験区を設けた。
Inoculation experiment (1)
After inoculating the above-mentioned cyanophage into a logarithmically growing microcystis strain culture medium so that the multiplicity of infection is 10 -1 to 10 -9 , the cells are cultured for 6 days under the above-mentioned culture conditions, and changes in host cell density are directly observed Followed by counting method. As a control group, there was provided an experimental group inoculated with an autoclaved (121 ° C. × 15 minutes) cyanophage suspension filtered at 0.2 μm.
接種実験（２）
一段階増殖実験により該シアノファージの増殖特性を測定した。具体的には、該シアノファージを感染多重度が１以上になるよう対数増殖中のミクロキスティス株培養液に接種後、宿主細胞密度の変化ならびに培養液中のシアノファージ力価およびシアノファージ粒子密度の変化を経時的に測定した。力価については上述の方法で最確数を算出することにより、また粒子密度はSYBR Green Iによる染色を施した試料を直接蛍光顕微鏡下で観察し被染色粒子数を計数する方法によりそれぞれ測定した。得られた結果から、該シアノファージの潜伏時間およびバーストサイズ（１感染細胞から放出される感染性を持った娘シアノファージ粒子数）を算出した。
また、感染の継続性について検討するため、溶藻培養液を孔径0.8μmのフィルターで濾過して得られた濾液50μlを対数増殖中の（シアノファージに感染していない）ミクロキスティス株培養液1 mlに接種するという操作を3回以上繰り返し行った。また、対照として滅菌済みCB培地を接種した実験区を設け、ともに上述の条件下で培養を行い、増殖を比較した。
Inoculation experiment (2)
The growth properties of the cyanophage were measured by a one-step growth experiment. Specifically, after inoculating the cyanophage into a logarithmically growing microcystis strain culture so that the multiplicity of infection is 1 or more, changes in host cell density, cyanophage titer and cyanophage particle density in the culture Was measured over time. Regarding the titer, the most probable number was calculated by the above-mentioned method, and the particle density was measured by directly observing a sample stained with SYBR Green I under a fluorescence microscope and counting the number of particles to be stained. . From the obtained results, the incubation time and burst size of the cyanophage (number of daughter cyanophage particles having infectivity released from one infected cell) were calculated.
In addition, in order to examine the continuity of the infection, 50 μl of the filtrate obtained by filtering the lysed algal broth with a filter having a pore size of 0.8 μm was used for the growth of logarithmic microcystis strain 1 (not infected with cyanophage). The operation of inoculating ml was repeated 3 times or more. In addition, an experimental group inoculated with sterilized CB medium was provided as a control, and both were cultured under the above-mentioned conditions to compare the growth.
宿主特異性の検討
表1に示した対数増殖中の各藻体株培養液800μlに対して、上述の溶藻培養液を孔径0.8μmのフィルターで濾過して得られた濾液40μlをそれぞれ接種し、上述の条件下で培養を行った。また、対照としてそれぞれの宿主培養に適した培地（無菌化済みのもの）を接種した実験区を設けた。実験は各実験区につき2本立てで行い、経日的に光学顕微鏡により各株培養の細胞の状態を観察し、その後の藻体の増殖を評価した。接種14日後までに溶藻が確認されなかったものについては、該シアノファージの宿主ではないものと判定した。
Examination of host specificity Each logarithmic growth culture solution shown in Table 1 is inoculated with 40 μl of the filtrate obtained by filtering the above-mentioned algal culture solution through a filter with a pore size of 0.8 μm. The culture was performed under the above-mentioned conditions. As a control, an experimental group inoculated with a medium (sterilized) suitable for each host culture was provided. The experiment was performed in two sets for each experimental group, and the state of cells of each strain culture was observed with an optical microscope over time, and the subsequent growth of algal bodies was evaluated. Those for which no algae were confirmed by 14 days after inoculation were determined not to be the cyanophage host.
シアノファージの濃縮・精製およびシアノファージの核酸・タンパク質の分析
対数増殖中のミクロキスティス株培養液に該シアノファージを接種して溶藻液、すなわち該シアノファージ懸濁液を得た。これを孔径0.8μｍのフィルターで濾過して得られた濾液に、終濃度10％となるようポリエチレングリコールを添加し、4℃に一夜放置後、7,000 x gで40分間遠心分離した。得られたシアノファージのペレットをSMバッファー（50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM MgSO4・7H2O, 0.01% ゼラチン, pH 7.5）に懸濁後、塩化セシウムステップ密度勾配遠心法によりさらに精製した。具体的には、1.45〜1.70g/mlの塩化セシウムステップ密度勾配中において111,000 x gで1時間遠心分離を行い、白濁バンドとして得られたシアノファージ濃縮画分を抜き取った。このシアノファージ濃縮画分をTEバッファー（10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA）で透析することにより、精製されたシアノファージ懸濁液を得た。
得られた精製シアノファージ懸濁液に、プロテイナーゼKを終濃度1mg/ml、ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)を終濃度0.5%、EDTAを終濃度20mMとなるようにそれぞれ添加し、55℃で1.5時間処理した。処理後、フェノール-クロロホルム抽出により核酸を抽出し、透析終了後、パルスフィールドゲル電気泳動に供した。また、得られた核酸溶液に、各種制限酵素（SpeI, XhoI, XbaI, BamHI, EcoRI, EcoRV, HincII, HindIII, NotI, PstI, SacI, SalI, ScaI, SmaI）をそれぞれ添加し、30℃で16時間（SmaIのみ）または37℃で16時間（SmaI以外の制限酵素）処理した。得られた各反応産物を、アガロースゲル上で泳動し、実験に用いた各制限酵素に対する該シアノファージゲノムの感受性を確認した。
さらに該シアノファージの構造タンパク質を以下の方法で調べた。上記の精製シアノファージ懸濁液に４倍量のサンプル・バッファー(62.5 mM Tris-HCl, 5% 2-メルカプトエタノール, 2 % SDS, 25 % グリセロール, 0.01 % ブロモフェノルブルー)を添加後、100℃で5分間処理した。得られたタンパク質溶液を、15% SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルー溶液への浸析または銀染色法による染色後、該シアノファージの主要構造タンパク質のサイズ推定を行った。
Concentration / purification of cyanophage and analysis of nucleic acid / protein of cyanophage The microcystis strain culture solution during logarithmic growth was inoculated with the cyanophage to obtain an algae solution, ie, the cyanophage suspension. Polyethylene glycol was added to the filtrate obtained by filtering this with a filter having a pore diameter of 0.8 μm so as to have a final concentration of 10%, left at 4 ° C. overnight, and then centrifuged at 7,000 × g for 40 minutes. The resulting cyanophage pellet was suspended in SM buffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM MgSO 4 .7H 2 O, 0.01% gelatin, pH 7.5), and further purified by cesium chloride step density gradient centrifugation. . Specifically, centrifugation was performed at 111,000 xg for 1 hour in a cesium chloride step density gradient of 1.45 to 1.70 g / ml, and a cyanophage-enriched fraction obtained as a cloudy band was extracted. The enriched cyanophage fraction was dialyzed against TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) to obtain a purified cyanophage suspension.
To the resulting purified cyanophage suspension, proteinase K was added to a final concentration of 1 mg / ml, sodium lauryl sulfate (SDS) to a final concentration of 0.5%, and EDTA to a final concentration of 20 mM. Processed. After the treatment, nucleic acid was extracted by phenol-chloroform extraction, and after completion of dialysis, it was subjected to pulse field gel electrophoresis. In addition, various restriction enzymes (SpeI, XhoI, XbaI, BamHI, EcoRI, EcoRV, HincII, HindIII, NotI, PstI, SacI, SalI, ScaI, SmaI) were added to the obtained nucleic acid solution, respectively. Treatment was carried out for a period of time (SmaI only) or at 37 ° C. for 16 hours (restriction enzymes other than SmaI). Each obtained reaction product was run on an agarose gel, and the sensitivity of the cyanophage genome to each restriction enzyme used in the experiment was confirmed.
Furthermore, the structural protein of the cyanophage was examined by the following method. After adding 4 times the amount of sample buffer (62.5 mM Tris-HCl, 5% 2-mercaptoethanol, 2% SDS, 25% glycerol, 0.01% bromophenol blue) to the above purified cyanophage suspension, 100 Treated at 5 ° C for 5 minutes. The obtained protein solution was subjected to 15% SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and after immersing in Coomassie brilliant blue solution or staining by silver staining method, the size of the main structural protein of the cyanophage was estimated.
シアノファージゲノムの全塩基配列
上述の精製シアノファージ懸濁液よりDNAを精製し、Hydroshear (genemachines社)を用いて1〜6kbに剪断後、さらに2〜4kbサイズの断片画分をアガロースゲル電気泳動法およびゲル抽出法により精製した。得られた断片をpUC118/Hinc II vectorへ挿入後、エレクトロポレーションにより大腸菌（Invitrogen社製ElectroMAX DH10B compitent cell）細胞内へ導入し、プレーティングして抗生物質耐性による選択を行った。生じたコロニーから、プラスミドDNAを調製後、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用いて塩基配列解読を行い、得られた配列のアセンブル作業を行った。冗長度が低い部分については周辺配列に基づくプライマーセットの作製、PCRによる該当領域の増幅およびシーケンシングを行い、該ウイルスのゲノムマップの全塩基配列を決定した。この塩基配列に基づき、該シアノファージゲノム上にコードされている遺伝情報の推定をBLAST等のデータベースを用いて行った。
Complete base sequence of the cyanophage genome DNA was purified from the above-described purified cyanophage suspension, sheared to 1-6 kb using Hydroshear (genemachines), and then a 2-4 kb fragment fraction was subjected to agarose gel electrophoresis. And purified by gel extraction method. After the obtained fragment was inserted into pUC118 / Hinc II vector, it was introduced into E. coli (Invitrogen ElectroMAX DH10B competent cell) cells by electroporation, plated and selected for antibiotic resistance. From the resulting colonies, plasmid DNA was prepared, and then the base sequence was decoded using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, and the resulting sequence was assembled. For the portion with low redundancy, a primer set based on the peripheral sequence was prepared, the corresponding region was amplified and sequenced by PCR, and the entire nucleotide sequence of the virus genome map was determined. Based on this base sequence, genetic information encoded on the cyanophage genome was estimated using a database such as BLAST.
結果および考察
シアノファージの分離
シアノファージ分離実験の結果、ミクロキスティス・エルギノーサNIES-298株は、各試水の0.2μm以下の画分を接種することにより、細胞の色素が失われ、死滅に至った。一方、滅菌済みCB培地を接種した実験区では、藻体の死滅は観察されず、増殖の順調な継続が確認された。得られた溶藻試料をクローニングすることで、これまでに表２に示すシアノファージのクローン株が分離された。これらのシアノファージ株は蛍光顕微鏡観察の結果、無菌状態にあることが確認されており、本発明者らにより安定に保持されている。また、研究目的での分譲が可能な状態にある。さらに、表２に示すシアノファージのクローン株のうちCyanophage Ma-LMM01株は、平成１７年１月２５日付けで独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されている（受託番号：NITE BP-71）。Cyanophage Ma-LMM01株は、図１に示すとおり、ミクロキスティス・エルギノーサNIES-298株の培養を速やかに溶藻せしめる強力な殺藻力を有する。
得られた該シアノファージ懸濁液の直接計数値および力価を比較した結果、頭部にDNAを持つ粒子のうち7.5%以下が感染性を持つことが明らかとなった。一般のミオウイルス科のファージの場合、鞘の収縮していない粒子のみが感染力を持つことが知られており、該シアノファージ粒子についても一部の鞘が収縮していないファージ粒子のみが感染性をしめしたものと考えられる。したがって、本ファージの利用に当たっては、収縮した鞘を持たない粒子の割合をできるだけ多くして用いることで、効率的なアオコ防除への適用が可能になるものと考えられる。
以下に、Cyanophage Ma-LMM01株に関する性状解析の結果を述べる。
Results and Discussion
Based on cyanophage separation cyanophage separation experiment, Microcystis aeruginosa NIES-298 strain by inoculating 0.2μm following fractions of each water samples, the cells of the dye is lost, leading to death. On the other hand, in the experimental group inoculated with the sterilized CB medium, the death of the alga bodies was not observed, and it was confirmed that the growth continued smoothly. By cloning the obtained algal sample, cyanophage clones shown in Table 2 were isolated so far. As a result of observation with a fluorescence microscope, these cyanophage strains have been confirmed to be in a sterile state and are stably maintained by the present inventors. In addition, it can be sold for research purposes. Further, among the cyanophage clones shown in Table 2, Cyanophage Ma-LMM01 strain was deposited with the Patent Microorganism Depositary, National Institute of Technology and Evaluation on January 25, 2005 (Accession Number: NITE BP-71). As shown in FIG. 1, the Cyanophage Ma-LMM01 strain has a powerful algicidal ability to rapidly dissolve the culture of Microkistis aeruginosa strain NIES-298.
As a result of comparing the direct count value and titer of the obtained cyanophage suspension, it was revealed that 7.5% or less of the particles having DNA on the head had infectivity. In the case of general myoviridae phages, it is known that only the non-shrinking particles of the sheath have infectivity, and only the phage particles in which some of the cyanophage particles are not shrunk are also infected. It is thought that it was sexual. Therefore, in using this phage, it can be considered that application to efficient aquatic control becomes possible by using as much as possible the proportion of particles having no contracted sheath.
The results of characterization of Cyanophage Ma-LMM01 strain are described below.
シアノファージの安定性
保存実験に供したシアノファージCyanophage Ma-LMM01懸濁液および各条件下に置いた該シアノファージ懸濁液の0日目、7日目、および14日目の力価を比較した結果、凍結保護剤添加の有無にかかわらず-80℃または-196℃（液体窒素中）での凍結条件下では該シアノファージの力価はほとんど低下しないことが判明した。-20℃の条件下で凍結保護剤無添加のシアノファージ懸濁液を凍結保存した場合には、顕著な力価の減少がみられた。また、4℃での冷暗所保存では、緩やかな力価の低下がみられた（図２）。以上の結果から、凍結保護剤添加の有無にかかわらず-80℃以下の超低温条件下において該シアノファージ懸濁液を安定な状態で保存することが可能であることが明らかとなった。
Compare the titers of the Cyanophage Cyanophage Ma-LMM01 suspension used in the Cyanophage Stability Preservation Experiment and the Cyanophage Suspensions under each condition on the 0th, 7th, and 14th days As a result, it was found that the titer of the cyanophage hardly decreased under freezing conditions at −80 ° C. or −196 ° C. (in liquid nitrogen) regardless of the addition of a cryoprotectant. When the cyanophage suspension containing no cryoprotectant was stored frozen at −20 ° C., a significant decrease in titer was observed. In addition, when stored in a cool dark place at 4 ° C, there was a gradual decrease in titer (Fig. 2). From the above results, it was revealed that the cyanophage suspension can be stored in a stable state under an ultralow temperature condition of −80 ° C. or lower regardless of whether or not a cryoprotectant is added.
透過型電子顕微鏡による微視的観察結果
透過型電子顕微鏡による細胞切片およびシアノファージCyanophage Ma-LMM01粒子の観察結果を図３に示した。該シアノファージの接種区では、接種から6-12時間目には一部の細胞の崩壊が確認された。透過型電子顕微鏡による観察の結果、殺藻因子接種から52時間後の宿主細胞内では該シアノファージ様の頭部粒子が多数検出された（図３Ｂ,Ｃ）。これに対して、対照実験として滅菌済みCB培地を接種した実験区では藻体細胞は活発な増殖を継続し、透過型電子顕微鏡による細胞切片観察の結果、健常な細胞内構造が観察された（図３Ａ）。
溶藻培養液をネガティブ染色法により観察した結果、ミオウイルス科の形態学的特徴を示すファージ粒子が多数観察された。（図３Ｄ−Ｆ）。粒子は頭部および尾部構造を有し、外膜構造を欠き、頭部は直径約60〜120nm（平均86nm）の正二十面体、尾部構造のうちコア部分は約140〜350nm（平均長209nm）、鞘は約60〜260nm（平均長142nm）であった。このように鞘には収縮性あるものと推察された。また尾部の先端に球形の構造体を持つ粒子も希に観察された。この球形構造体は、シアノファージそのものの部品ではなく、宿主細胞由来の膜構造体であると考えられる（図３Ｆ）。
Results of Microscopic Observation with Transmission Electron Microscope The results of observation of cell sections and cyanophage Cyanophage Ma-LMM01 particles with a transmission electron microscope are shown in FIG. In the inoculated area of the cyanophage, the decay of some cells was confirmed 6-12 hours after the inoculation. As a result of observation with a transmission electron microscope, a large number of the cyanophage-like head particles were detected in the host cells 52 hours after inoculation with the algicidal factor (FIGS. 3B and 3C). In contrast, in the experimental group inoculated with sterilized CB medium as a control experiment, algal cells continued to proliferate, and as a result of observation of cell sections with a transmission electron microscope, a healthy intracellular structure was observed ( FIG. 3A).
As a result of observing the lysed broth by negative staining, a large number of phage particles showing morphological characteristics of the myoviridae were observed. (FIGS. 3D-F). The particle has a head and tail structure, lacks an outer membrane structure, the head is an icosahedron having a diameter of about 60 to 120 nm (average 86 nm), and the core portion of the tail structure is about 140 to 350 nm (average length 209 nm) ), Sheath was about 60-260 nm (average length 142 nm). Thus, it was speculated that the sheath was contractible. In addition, particles with a spherical structure at the tip of the tail were rarely observed. This spherical structure is not a part of cyanophage itself, but is considered to be a membrane structure derived from a host cell (FIG. 3F).
接種実験（１）結果
異なる感染多重度で該シアノファージを接種した場合のミクロキスティス・エルギノーサ NIES-298株対数増殖期培養の細胞密度の推移を図４に示した。その結果、感染多重度が高い場合には溶藻に至るまでの日数が約4日、感染多重度がさらに低い場合には溶藻までに6日を要した。これらの結果は、該シアノファージに感染したミクロキスティス・エルギノーサ細胞内で形成された娘ファージ粒子が、宿主細胞の崩壊に伴い環境中（この場合は培養液中）に放出され、新たな（すなわち未感染の）ミクロキスティス・エルギノーサ細胞の感染・死滅を誘発していることを示している。熱処理した該シアノファージを接種した対照区では溶藻はみられなかった。
Inoculation Experiment (1) Results FIG. 4 shows the transition of the cell density in the logarithmic growth phase culture of Microcystis aeruginosa NIES-298 when the cyanophage was inoculated at different multiplicity of infection. As a result, when the multiplicity of infection was high, it took about 4 days to reach the alga, and when the multiplicity of infection was even lower, it took 6 days to reach the alga. These results indicate that daughter phage particles formed in the microcystis aeruginosa cells infected with the cyanophage are released into the environment (in this case in the culture medium) as the host cells decay and are renewed (ie, This indicates that it induces infection and death of Microcystis aeruginosa cells (uninfected). In the control group inoculated with the heat-treated cyanophage, no algae were observed.
接種実験（２）結果
該シアノファージ接種後6〜12時間目にかけて、シアノファージ力価の急増が観察されたことから、感染から宿主崩壊に伴う娘ファージ粒子の放出までに要する時間、すなわち潜伏時間は約6〜12時間と判断された。同時間帯における宿主細胞密度の減少と、力価の上昇度より、１宿主細胞から崩壊時に放出される感染性を持つ娘シアノファージ粒子数は50〜170と算出された。この結果は3回の試験結果に基づくものである。実験データの一例を表３に示した。
該シアノファージの最大収量は、直接計数の結果、約3ｘ109粒子/mlであった。また、連続した植え継ぎ実験の結果、該シアノファージは対数増殖中のミクロキスティス・エルギノーサ細胞を速やかにかつ繰り返し溶藻せしめることが確認された。これらの結果およびSuttle, C. A. Cyanophages and their role in the ecology of cyanobacteria. In: Whitton, B. A., Potts, M. (eds.), The Ecology of Cyanobacteria: Their Diversity in Time and Space. Kluwer Academic Publishers, Boston, pp. 563-589 (2000).（非特許文献３）の提案したシアノファージ命名法に基づき、該シアノファージ株を「Cyanophage Ma-LMM01（Microcystis aeruginosa (Ma)を宿主とする三方湖(Lake Mikata)由来のMyovirus科のシアノファージ(Cyanophage)、株番号01の意）」と命名した。Cyanophage Ma-LMM01株の性状解析結果を引き続き解説する。
Results of inoculation experiment (2) Since a rapid increase in cyanophage titer was observed between 6 and 12 hours after inoculation of cyanophage, the time required from the infection to the release of daughter phage particles accompanying host disruption That is, the incubation time was determined to be about 6-12 hours. From the decrease in host cell density and the increase in titer during the same period, the number of daughter cyanobacterial particles having infectivity released from one host cell upon decay was calculated to be 50-170. This result is based on the results of three tests. An example of experimental data is shown in Table 3.
The maximum yield of the cyanophage was about 3 × 10 9 particles / ml as a result of direct counting. In addition, as a result of continuous planting experiments, it was confirmed that the cyanophages rapidly and repeatedly lysed microcystis aeruginosa cells during logarithmic growth. These results and Suttle, CA Cyanophages and their role in the ecology of cyanobacteria.In: Whitton, BA, Potts, M. (eds.), The Ecology of Cyanobacteria: Their Diversity in Time and Space.Kluwer Academic Publishers, Boston, pp. 563-589 (2000). based on the proposed cyanophage nomenclature (non-Patent Document 3), the cyano phage strain "cyanophage Ma-LMM01 the (Microcystis aeruginosa (Ma) as a host Mikata (L ake M ikata) derived from the M yovirus family cyanophage (cyanophage), was designated as strain number meaning of 01) ". The results of characterization of Cyanophage Ma-LMM01 strain will be explained continuously.
宿主特異性
Cyanophage Ma-LMM01株は、表１に示した18株の淡水産藍藻株および真核性微細藻類株のうち、標的種であるミクロキスティス・エルギノーサ NIES-298株を除くすべての藻類株に対して殺藻性を示さなかった。この実験結果から、該シアノファージがミクロキスティス・エルギノーサに対して高度に特異的な感染性を有するシアノファージであることが明らかとなった。
Host specificity
Cyanophage Ma-LMM01 is a cultivar of 18 freshwater cyanobacteria and eukaryotic microalgae strains shown in Table 1, except for the target species Microkistis aeruginosa NIES-298. It did not show algicidal properties. From this experimental result, it was clarified that the cyanophage was a cyanophage having highly specific infectivity to Microcystis aeruginosa.
精製シアノファージ粒子のゲノムおよびタンパク質
塩化セシウムステップ密度勾配遠心法によりCyanophage Ma-LMM01粒子を１本の白濁バンドとして精製することができた（図５）。
Cyanophage Ma-LMM01株より抽出された核酸は鎖長約162kbpの直鎖２本鎖DNAであり（図６A）、実験に用いた各種制限酵素（BamHI, EcoRI, EcoRV, HincII, HindIII, NotI, PstI, SacI, SalI, ScaI, SmaI, SpeI, XhoI, XbaI）に対して感受性であった（図６Ｂ）。ショットガンクローニングにより得られた断片配列をアセンブルすることで、環状のゲノムマップが得られた。この環状２本鎖DNAゲノムマップの全長は162109bpであり、その上には多種多様な遺伝子がコードされていることが確認された（図７）。Cyanophage Ma-LMM01株ゲノムの塩基配列を配列表の配列番号１に示した。ゲノムマップは環状であり、この配列に従って複製された鎖長約162kbpの直鎖２本鎖DNAゲノムがファージ粒子中に収納されていると考えられる。全ゲノム塩基配列または複数の遺伝子の塩基配列の相同性が90％以上、好ましくは97％以上のものは、同種のウイルスであると考えられる。配列の同一性は、ClustalW等のアラインメント用ソフト（Tompson, J. D., D. G. Higgins, and T. J. Gibson, Improved sensitivity of profile searches through the use of sequence weights and gap excision. Comput. Appilc. Biosci. 10:19-29 (1994).）を使用することにより算出することができる。この塩基配列に関するデータベース解析の結果、本ゲノムにコードされていると予測されたタンパク質の一部を表４に示した。
また、Cyanophage Ma-LMM01株は少なくとも４種の主要構造タンパク質（84±5kDa, 47±5kDa, 38±5kDa, 26±5kDa）をもつことがSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により示された（図８）。
Cyanophage Ma-LMM01 particles could be purified as a single cloudy band by purified cyanophage particle genome and protein cesium chloride step density gradient centrifugation (FIG. 5).
The nucleic acid extracted from the Cyanophage Ma-LMM01 strain is a linear double-stranded DNA having a chain length of about 162 kbp (FIG. 6A), and various restriction enzymes used in the experiment (BamHI, EcoRI, EcoRV, HincII, HindIII, NotI, PstI). , SacI, SalI, ScaI, SmaI, SpeI, XhoI, XbaI) (FIG. 6B). A circular genome map was obtained by assembling the fragment sequences obtained by shotgun cloning. The full length of this circular double-stranded DNA genome map is 162109 bp, and it was confirmed that a wide variety of genes were encoded on it (FIG. 7). The base sequence of the Cyanophage Ma-LMM01 strain genome is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The genome map is circular, and it is considered that a linear double-stranded DNA genome having a chain length of about 162 kbp replicated according to this sequence is housed in the phage particle. Those having a homology of the whole genome base sequence or the base sequence of a plurality of genes of 90% or more, preferably 97% or more, are considered to be the same type of virus. Sequence identity is determined by alignment software such as ClustalW (Tompson, JD, DG Higgins, and TJ Gibson, Improved sensitivity of profile searches through the use of sequence weights and gap excision. Comput. Appilc. Biosci. 10: 19-29 (1994).). Table 4 shows a part of the proteins predicted to be encoded in this genome as a result of database analysis on this nucleotide sequence.
Moreover, it was shown by SDS polyacrylamide gel electrophoresis that the Cyanophage Ma-LMM01 strain has at least four major structural proteins (84 ± 5 kDa, 47 ± 5 kDa, 38 ± 5 kDa, 26 ± 5 kDa) (FIG. 8). .
このように、本発明者らは、ミクロキスティス属のアオコ原因藍藻に特異的に感染して増殖しうる、全長0.01μｍ〜0.4μｍのシアノファージを分離することに成功した。シアノファージは宿主藍藻に感染することで爆発的に増殖する能力を有することから、小規模の現場投与かつ低コストでのアオコ発生予防およびアオコ駆除に多大な効果が期待できること、該シアノファージは天然湖水から分離されたものであること、ならびに該シアノファージはミクロキスティス属の藍藻に特異的に感染し殺藻することを考慮すると、該シアノファージの散布はミクロキスティス属の藍藻によるアオコの防除法として有効であることが期待される。また、該シアノファージには高い保存性が備わっている上、きわめて小型であることから、固定化剤に包埋したものをアオコ頻発水域において筏、ブイ、船舶係留施設及び／又は船舶に吊す、または固定する、あるいは同水域の底泥中に設置し、シアノファージを継続的に環境中に放出させることからなるアオコの発生予防および駆除方法を提供する上で有利な要件を備えているといえる。 As described above, the present inventors succeeded in isolating a cyanophage having a total length of 0.01 μm to 0.4 μm, which can specifically infect and proliferate a microcaustic blue-green algae. Since cyanophage has the ability to grow explosively by infecting host cyanobacteria, it can be expected to have a great effect on small-scale on-site administration and low-cost prevention and control of blue-green algae. Considering that it is isolated from the lake water and that the cyanophage specifically infects and kills the microcystis cyanobacteria, spraying of the cyanophage is a method for controlling blue-green algae with the microcystis cyanobacteria. Is expected to be effective. In addition, since the cyanophage has high storage stability and is extremely small, the one embedded in the immobilizing agent is hung on a dredge, buoy, ship mooring facility and / or ship in the frequent water area of aoko. Alternatively, it can be said that it has advantageous requirements for providing a method for preventing and eliminating blue-tailed sea urchin, which consists of fixing or installing it in the bottom mud of the same water area and continuously releasing cyanophage into the environment. .
（表１）
（表２）
（表３）
（表４）
（表５）
表４（続き）
Table 4 (continued)
（表６）
表４（続き）
Table 4 (continued)
（表７）
表４（続き）
Table 4 (continued)
（表８）
表４（続き）
Table 4 (continued)
（表９）
表４（続き）
Table 4 (continued)
本発明によりシアノファージを利用したアオコ防除が可能となった。 According to the present invention, it is possible to control sea cucumber using cyanophage.
＜配列番号１＞
配列番号１は、Cyanophage Ma-LMM01株ゲノムマップ全体の塩基配列を示す。なお、本マップは多数のファージゲノム（直鎖2本鎖DNA）の配列をアセンブルした結果であり、全体としては環状となるため、配列番号１に示す配列の5’末端（塩基番号1）と3’末端（塩基番号162109）は連結している。
<SEQ ID NO: 1>
SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the entire Cyanophage Ma-LMM01 strain genome map. This map is the result of assembling the sequences of a large number of phage genomes (linear double-stranded DNA). Since the whole is circular, the 5 ′ end (base number 1) of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 The 3 ′ end (base number 162109) is linked.
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