JP2006242618A - Diagnosis of cancer using telomere amount by tissue fish method as index - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、正常組織と癌組織との鑑別方法に関し、詳しくは検体中のテロメア量の相対値を測定することにより正常組織と癌組織とを鑑別する癌の診断方法に関する。 The present invention relates to a method for distinguishing between a normal tissue and a cancer tissue, and more particularly to a cancer diagnosis method for distinguishing between a normal tissue and a cancer tissue by measuring the relative value of the amount of telomeres in a specimen.
癌の診断は多くの方法により行われているが、最終的に病理医（日本病理学会認定病理医）による病理診断により確定する（確定診断）。病理診断は、熟練した臨床検査技師が光学顕微鏡用組織切片を作り、病理医が顕微鏡下に癌と正常細胞を観察し、両者の形態の差異により行う。しかし、癌の組織像は発生臓器により異なり、きわめて多彩であるために両者の鑑別は困難なことが多い。また病理医自体の数もごく少数である。そこで、多くの生物学的マーカーによる診断法が行われているが不十分で、最終的には病理医の病理組織診断を凌駕する診断方法は考えられていない。 Cancer diagnosis is performed by many methods, but is finally confirmed by pathological diagnosis by a pathologist (pathologist certified by the Japanese Pathological Society) (definite diagnosis). Pathological diagnosis is performed by a skilled clinical technologist making a tissue section for an optical microscope, and a pathologist observes cancer and normal cells under the microscope, based on the difference in morphology between the two. However, the histological image of cancer differs depending on the organ in which it develops, and because it is extremely diverse, it is often difficult to distinguish between the two. The number of pathologists themselves is also very small. Therefore, many diagnostic methods using biological markers have been carried out, but the method is insufficient, and no diagnostic method that ultimately surpasses the pathological diagnosis of pathologists has been considered.
また、病理医による形態学的診断では、進行癌では正常組織との形態学的所見のへだたりが大きく、診断（すなわち正常と癌の区別）が容易であるが、きわめて初期の癌や早期癌では正常組織との病理組織学的差異が小さく診断が困難である。 In addition, in morphological diagnosis by pathologists, in advanced cancer, the morphological findings from normal tissues are large and easy to diagnose (ie, distinguish between normal and cancer). Cancer is difficult to diagnose because of small histopathological differences from normal tissues.
一方、染色体末端に存在するテロメア（telomere）は細胞***のたびに２００塩基対ずつ短縮する。テロメアが一定以上の長さを維持することで、テロメア同士の癒合や再構築などを予防し、染色体内の遺伝子の恒常性の維持に関与していると考えられている。テロメアの細胞***毎の短縮は、末端複製問題（replication of linear chromosomes presents a special problem）として説明される。これは複製の鋳型となる一本鎖のテロメアＤＮＡ（ＴＴＡＧＧＧ）の３'末端より相補的な塩基配列（ＣＣＣＴＡＡ）が５'末端から３'末端側に複製されるときに、細胞***毎に相補鎖側の最後の５'末端部分が複製されないために生じると考えられている。このように、体細胞では***のたびにテロメアは短縮するが、無限ともいうべき細胞***を必要とする生殖細胞や血液幹細胞では、おもにテロメアを伸長させるタンパク質テロメレースによりテロメアの伸展、維持がはかられている。 On the other hand, telomeres existing at the ends of chromosomes are shortened by 200 base pairs at every cell division. It is thought that telomeres maintain a certain length or more, thereby preventing the fusion and reconstruction of telomeres and maintaining the homeostasis of genes in the chromosome. Telomere shortening per cell division is explained as a replication of linear chromosomes presents a special problem. This is complementary to each cell division when a complementary base sequence (CCCTAA) is replicated from the 3 ′ end to the 3 ′ end of the single-stranded telomeric DNA (TTAGGG) serving as a replication template. It is thought to occur because the last 5 'end portion on the strand side is not replicated. Thus, in somatic cells, telomeres shorten each time they divide, but in germ cells and blood stem cells that require infinite cell division, telomeres that primarily elongate telomeres are not able to extend and maintain telomeres. It is.
テロメア長の調節がどのように行われているのかについては未解明の部分が多く、現在も研究が進行中である。新しいテロメア長の測定法として、定量的蛍光in situハイブリダイゼーション法（Quantitative Fluorescent In Situ Hybridization：Ｑ−ＦＩＳＨ法）が、１９９６年にカナダのBC Cancer CenterのLansdorp教授らによって開発された（非特許文献２、３）。Ｑ−ＦＩＳＨ法を用いると、培養細胞を用いて細胞***中期の染色体個々のテロメア長測定を、従来のサザンブロット法よりも正確に行うことができる。 There are many unexplained aspects of how telomere length is regulated, and research is ongoing. As a new telomere length measurement method, quantitative fluorescent in situ hybridization (Q-FISH method) was developed in 1996 by Professor Lansdorp of BC Cancer Center, Canada (non-patent literature). 2, 3). When the Q-FISH method is used, telomere length measurement of individual chromosomes in the middle stage of cell division can be performed using cultured cells more accurately than the conventional Southern blot method.
Ｑ−ＦＩＳＨ法では、培養細胞で細胞***中期の細胞を強制的に作製し、これを収穫しプレパラート上に細胞を散布する。次に、このプレパラートをテロメアでラベルされたＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid：ペプチド核酸）プローブを用いてハイブリダイズし、蛍光顕微鏡で撮影した後、テロメアの光度を画像解析器にかけ、テロメア解析ソフトを用いてテロメア長を測定する。 In the Q-FISH method, cells in the middle stage of cell division are forcibly produced using cultured cells, harvested, and then spread on the preparation. Next, this preparation was hybridized using a PNA (Peptide Nucleic Acid: peptide nucleic acid) probe labeled with a telomere, photographed with a fluorescence microscope, the light intensity of the telomere was applied to an image analyzer, and a telomere analysis software was used. Measure telomere length.
さらに、２００２年頃より、Lansdorp教授らのＱ−ＦＩＳＨ法を応用発展させた、組織切片におけるテロメア量の測定法（組織ＦＩＳＨ法）が開発された（非特許文献４）。この組織ＦＩＳＨ法では、すでに作られたパラフィンブロックより起こすことができ、特異的結合性の高いＰＮＡプローブを用いるためにパラフィン切片上における細胞ごとのテロメア量の測定が可能であり、正常細胞や癌細胞におけるそれぞれのテロメア量が求められる。テロメアの量は、細胞***中期のテロメアシグナルとセントロメアシグナルの光度比によって求められる。 Furthermore, since about 2002, a method for measuring the amount of telomeres in tissue sections (tissue FISH method) was developed by applying the Q-FISH method of Prof. Lansdorp et al. (Non-Patent Document 4). In this tissue FISH method, it is possible to measure the amount of telomeres for each cell on a paraffin section because it uses a PNA probe with high specific binding, which can be caused by a paraffin block that has already been prepared. The amount of each telomere in the cell is determined. The amount of telomeres is determined by the light intensity ratio between the telomere signal and the centromere signal in the middle cell division.
また、多くの癌組織（約９０％）はテロメレースを発現するが、細胞増殖に伴う細胞***回数の増加がより激しいために正常組織に比べてテロメア長が短縮することが知られている。一方、老化の原因の一つとして、テロメアがある一定以上の長さ以下に短くなると、老化細胞となり細胞増殖が停止する。培養細胞や癌組織を用いて、Ｑ−ＦＩＳＨ法を用いた研究により、テロメア短縮が染色体内の遺伝子の不安定性を増加させることが証明されている（非特許文献１）。 In addition, many cancer tissues (about 90%) express telomerase, but it is known that the telomere length is shortened as compared with normal tissues because the number of cell division increases with cell proliferation. On the other hand, as one of the causes of aging, when telomeres become shorter than a certain length, they become senescent cells and cell proliferation stops. Studies using the Q-FISH method using cultured cells and cancer tissues have demonstrated that telomere shortening increases the instability of genes in the chromosome (Non-Patent Document 1).
セントロメア（centromere：動原体ともいう）は、有糸***時に紡錘体が結合し、極への移動に際し重要な役割を演じる染色体の部分であり、染色体が有糸***により分配されるのに必要なＤＮＡ配列により構成される。ヒトでは、約１７０塩基対のアルフォイド配列（アルファサテライト配列ともいう）が数百キロ塩基対から数メガ塩基対にわたって直鎖繰返し配列をつくってセントロメアのＤＮＡ配列を構成する。アルフォイド配列に特異的に結合するタンパク質ＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂ、−Ｃその他のタンパク質が複合体を作りヒト動原体として機能する。
解決しようとする課題は、特別な訓練を受けた病理医を必要としない、優れた癌の診断方法を開発することである。 The problem to be solved is to develop an excellent cancer diagnostic method that does not require specially trained pathologists.
上記課題を解決するために、本発明者らは、癌細胞とテロメア短縮との関係に着目し、これを癌の診断に応用できるのではないかと考えた。しかし、テロメア長の測定法のゴールデンスタンダードであるサザンブロット法では、異なる細胞からのDNAの混在と測定値の誤差が大きく、これを診断に応用することはできなかった。 In order to solve the above problems, the present inventors focused on the relationship between cancer cells and telomere shortening, and thought that this could be applied to cancer diagnosis. However, the Southern blot method, which is the golden standard for measuring telomere length, has a large mix of DNA from different cells and errors in the measured values, which could not be applied to diagnosis.
そこで、本発明者らは、組織中の細胞ごとのテロメア量の測定に適した組織ＦＩＳＨ法を応用して、細胞ごとのテロメア量を求めることにより癌の診断ができるのではないかと考えた。前述のように、組織ＦＩＳＨ法では、組織切片上でテロメアとセントロメアに対する蛍光標識特異的プローブをテロメアとセントロメアに結合させ、その蛍光量比からテロメアとセントロメアの比を求め、テロメアシグナルとセントロメアシグナルの比によってテロメア量を相対的に求めることができる。 Therefore, the present inventors thought that cancer can be diagnosed by obtaining a telomere amount for each cell by applying a tissue FISH method suitable for measuring a telomere amount for each cell in the tissue. As described above, in the tissue FISH method, a fluorescent label-specific probe for telomere and centromere is bound to telomere and centromere on a tissue section, and the ratio of telomere and centromere is obtained from the fluorescence amount ratio. The telomere amount can be relatively determined by the ratio.
本発明者らは、多くの組織において細胞ごとのテロメア測定を行うことにより、正常細胞と癌細胞には明らかなテロメア量の差があることを見出し、テロメア量を指標として両者を鑑別する方法をさらに検討した。 The present inventors have found that there is a clear difference in the amount of telomere between normal cells and cancer cells by performing telomere measurement for each cell in many tissues, and a method of distinguishing both using telomere amount as an index. Further investigation was made.
詳しくは、病理診断用の４〜６μmの厚さの組織切片を用いて、蛍光色素(Cy3, FITC, Cy5等)で標識したテロメアとセントロメアに対するＰＮＡプローブ（テロメアとセントロメアに特異的に結合する）でハイブリダイズし、両者の相対的光量、つまりＴ／ＣＲ（Telomere/Centromere Ration：テロメアシグナル／セントロメアシグナルの比）を求めてみると、癌組織と非癌組織のＴ／ＣＲの分布は全く異なることを見出した。 Specifically, using 4 to 6 μm thick tissue sections for pathological diagnosis, PNA probes for telomeres and centromeres labeled with fluorescent dyes (Cy3, FITC, Cy5, etc.) (specifically bind to telomeres and centromeres) And the relative light intensity of both, that is, T / CR (Telomere / Centromere Ration), the distribution of T / CR in cancerous tissue and non-cancerous tissue is completely different. I found out.
すなわち、Ｔ／ＣＲの分布のパターンは、癌ではほぼすべての細胞（９０％以上）のＴ／ＣＲが１．０未満であるが、正常では２〜５までに広く分布する。癌細胞のＴ／ＣＲの分布のピーク値は０．５程度で１．０をこえることはないが、正常では１．０程度である。Ｔ／ＣＲの平均値は、癌細胞では１以下であることがほとんどであるが、正常では２以上である。 That is, the distribution pattern of T / CR is widely distributed from 2 to 5 in normal cases, although T / CR of almost all cells (90% or more) in cancer is less than 1.0. The peak value of the T / CR distribution of cancer cells is about 0.5 and does not exceed 1.0, but is normally about 1.0. The average value of T / CR is mostly 1 or less in cancer cells, but 2 or more in normal cases.
このように、本発明者らは、癌組織と非癌組織のＴ／ＣＲの分布がはっきりと異なることから、Ｔ／ＣＲを指標として正常組織と癌組織を鑑別できることを見出し、本発明の完成に至った。 Thus, the present inventors have found that the distribution of T / CR between cancerous tissue and non-cancerous tissue is clearly different, so that normal tissue and cancerous tissue can be differentiated using T / CR as an indicator, and the present invention has been completed. It came to.
従って、本発明者らは以下の発明を提供する。
（１）被験者より採取した検体中のテロメア量のセントロメア量に対する相対値を測定することを特徴とする、正常組織と癌組織を鑑別する方法。
（２）前記（１）の方法において、前記テロメア量のセントロメア量に対する相対値が、組織ＦＩＳＨ法によるテロメアとセントロメアの蛍光標識シグナルの相対的光量（Ｔ／ＣＲ）として測定される方法。
（３）以下の工程を含む、組織ＦＩＳＨ法を用いた、正常組織と癌組織との鑑別方法：
（ａ）ある組織から採取した癌が疑われる検体、及び同じ組織から採取した非癌検体を、蛍光色素で標識したテロメアとセントロメアのそれぞれに対するＰＮＡプローブでハイブリダイズする工程、
（ｂ）癌が疑われる検体及び非癌検体を蛍光顕微鏡下で撮影する工程、
（ｃ）撮影された画像を解析し、癌が疑われる検体及び非癌検体の各検体中の細胞ごとのテロメアとセントロメアの蛍光標識シグナルの相対的光量（Ｔ／ＣＲ）を測定し、各検体におけるＴ／ＣＲの分布のパターン、Ｔ／ＣＲのピーク値、及びＴ／ＣＲの平均値を求める工程、
（ｄ）癌が疑われる検体及び非癌検体の各検体におけるＴ／ＣＲの分布のパターン、Ｔ／ＣＲのピーク値、及びＴ／ＣＲの平均値を比較解析する工程、
（ｅ）前記比較解析した結果から、正常組織と癌組織とを鑑別する工程。
（４）以下の工程を含む、組織ＦＩＳＨ法を用いた、癌の検出方法：
（ａ）ある組織から採取した癌が疑われる検体を、蛍光色素で標識したテロメアとセントロメアに対するそれぞれのＰＮＡプローブでハイブリダイズする工程、
（ｂ）検体を蛍光顕微鏡下で撮影する工程、
（ｃ）撮影された画像を解析し、検体中の細胞ごとのテロメアとセントロメアの蛍光標識シグナルの相対的光量（Ｔ／ＣＲ）を測定し、検体におけるＴ／ＣＲの分布のパターンを求め、検体の９０％以上細胞のＴ／ＣＲが１．０未満であるときに癌であるとする工程。
（５）以下の工程を含む、組織ＦＩＳＨ法を用いた、癌の検出方法：
（ａ）ある組織から採取した癌が疑われる検体を、蛍光色素で標識したテロメアとセントロメアに対するそれぞれのＰＮＡプローブでハイブリダイズする工程、
（ｂ）検体を蛍光顕微鏡下で撮影する工程、
（ｃ）撮影された画像を解析し、検体中の細胞ごとのテロメアとセントロメアの蛍光標識シグナルの相対的光量（Ｔ／ＣＲ）を測定し、検体におけるＴ／ＣＲのピーク値を求め、Ｔ／ＣＲのピーク値が１．０未満であるときに癌であるとする工程。
（６）以下の工程を含む、組織ＦＩＳＨ法を用いた、癌を検出する方法：
（ａ）ある組織から採取した癌が疑われる検体を、蛍光色素で標識したテロメアとセントロメアに対するそれぞれのＰＮＡプローブでハイブリダイズする工程、
（ｂ）検体を蛍光顕微鏡下で撮影する工程、
（ｃ）撮影された画像を解析し、検体中の細胞ごとのテロメアとセントロメアの蛍光標識シグナルの相対的光量（Ｔ／ＣＲ）を測定し、検体におけるＴ／ＣＲの平均値を求め、Ｔ／ＣＲの平均値が１．０未満であるときに癌であるとする工程。
（７）蛍光色素で標識したテロメアとセントロメアに対するそれぞれのＰＮＡプローブ、組織ＦＩＳＨ用ハイブリダイス溶液、及びテロメア解析ソフトを含む、癌診断用キット。
Accordingly, the present inventors provide the following inventions.
(1) A method for distinguishing between normal tissue and cancer tissue, comprising measuring a relative value of a telomere amount in a sample collected from a subject with respect to a centromere amount.
(2) The method according to (1), wherein the relative value of the telomere amount to the centromere amount is measured as a relative light quantity (T / CR) of telomere and centromere fluorescently labeled signals by tissue FISH method.
(3) A method for differentiating between normal tissue and cancer tissue using the tissue FISH method, including the following steps:
(A) a step of hybridizing a specimen suspected of cancer collected from a tissue and a non-cancer specimen collected from the same tissue with a PNA probe for each of telomere and centromere labeled with a fluorescent dye;
(B) a step of photographing a specimen suspected of cancer and a non-cancer specimen under a fluorescence microscope;
(C) The photographed image is analyzed, and the relative light quantity (T / CR) of the telomere and centromere fluorescently labeled signals for each cell in each of the specimens suspected of cancer and non-cancer specimens is measured. Obtaining a T / CR distribution pattern, T / CR peak value, and T / CR average value in
(D) a step of comparing and analyzing a T / CR distribution pattern, a T / CR peak value, and a T / CR average value in each of a specimen suspected of cancer and a non-cancer specimen;
(E) A step of distinguishing normal tissue from cancer tissue from the result of the comparative analysis.
(4) Cancer detection method using tissue FISH method including the following steps:
(A) a step of hybridizing a specimen suspected of cancer collected from a tissue with respective PNA probes for telomere and centromere labeled with a fluorescent dye;
(B) a step of photographing the specimen under a fluorescence microscope;
(C) Analyzing the photographed image, measuring the relative light quantity (T / CR) of the telomere and centromere fluorescent labeling signal for each cell in the specimen, obtaining the T / CR distribution pattern in the specimen, 90% or more of the cells, wherein the T / CR of cells is less than 1.0.
(5) Cancer detection method using tissue FISH method including the following steps:
(A) a step of hybridizing a specimen suspected of cancer collected from a tissue with respective PNA probes for telomere and centromere labeled with a fluorescent dye;
(B) a step of photographing the specimen under a fluorescence microscope;
(C) Analyzing the photographed image, measuring the relative light quantity (T / CR) of the telomere and centromere fluorescently labeled signals for each cell in the specimen, determining the T / CR peak value in the specimen, A step of having cancer when the peak value of CR is less than 1.0.
(6) A method for detecting cancer using tissue FISH method, comprising the following steps:
(A) a step of hybridizing a specimen suspected of cancer collected from a tissue with respective PNA probes for telomere and centromere labeled with a fluorescent dye;
(B) a step of photographing the specimen under a fluorescence microscope;
(C) Analyzing the captured image, measuring the relative light quantity (T / CR) of the telomere and centromere fluorescently labeled signals for each cell in the specimen, obtaining the average value of T / CR in the specimen, A step of determining cancer when the average value of CR is less than 1.0.
(7) A kit for diagnosing cancer comprising each PNA probe for telomere and centromere labeled with a fluorescent dye, a hybrid solution for tissue FISH, and telomere analysis software.
本発明を用いることにより、特別な訓練を受けた病理医を必要とせずに、正常組織と癌組織を鑑別できる。 By using the present invention, normal tissue and cancer tissue can be differentiated without requiring a specially trained pathologist.
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の癌の診断方法では、癌化及び癌の進行に伴ってテロメアが短縮すること、つまり、癌細胞におけるテロメア長が正常細胞におけるテロメア長よりも短いことを利用し、被験者から採取した検体におけるテロメア量のセントロメア量に対する相対値を指標として、当該検体における癌細胞の有無を診断する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the method for diagnosing cancer according to the present invention, a sample collected from a subject using the fact that telomeres are shortened as canceration and cancer progress, that is, the telomere length in cancer cells is shorter than the telomere length in normal cells. Using the relative value of the telomere amount to the centromere amount as an index, the presence or absence of cancer cells in the sample is diagnosed.
本発明においては、診断対象となる組織又は器官は特に限定されるものではなく、例えば、脳、脳下垂体、脊髄、唾液腺、胸腺、甲状腺、肺、***、皮膚、骨格筋、心臓、肝臓、脾臓、副腎、膵臓、食道、胃、小腸、大腸、直腸膀胱、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨髄（白血病など）、末梢単核球等が挙げられる。***を対象とする診断の場合、乳頭腫と乳頭腺管癌は病理診断はきわめて困難であるが、本方法では容易である。また、食道を対象とする場合、上皮内癌の判定は、異論があるが、ごく早期の上皮内癌でも鑑別可能である。 In the present invention, the tissue or organ to be diagnosed is not particularly limited, for example, brain, pituitary gland, spinal cord, salivary gland, thymus, thyroid, lung, breast, skin, skeletal muscle, heart, liver, Examples include spleen, adrenal gland, pancreas, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, rectal bladder, prostate, testicle, ovary, placenta, uterus, bone marrow (leukemia, etc.), peripheral mononuclear cells and the like. In the case of diagnosis for the breast, papilloma and ductal ductal carcinoma are difficult to diagnose, but are easy with this method. In addition, in the case of targeting the esophagus, the determination of carcinoma in situ is controversial, but it can be distinguished even in very early carcinoma in situ.
診断対象となる癌の病変の程度としては、進行した状態の癌のみならず、前癌病変の状態の組織も対象となる。つまり、本発明において、癌とは前癌病変も含む概念である。また、本発明において、非癌組織（非癌細胞）または正常組織（正常細胞）とは、従来用いられている一般的な診断方法によって癌の徴候が全く見られない組織（細胞）を意味する。 The degree of lesions of cancer to be diagnosed includes not only advanced cancers but also tissues of precancerous lesions. That is, in the present invention, cancer is a concept including precancerous lesions. In the present invention, the non-cancerous tissue (non-cancerous cell) or normal tissue (normal cell) means a tissue (cell) in which no sign of cancer is observed by a general diagnostic method conventionally used. .
本発明者らは、進行した癌よりも前癌病変や上皮内癌においてテロメアがより短縮する傾向があることを見出している。特定の理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、老化に伴う癌発生率の上昇が、テロメア短縮に起因する染色体の不安定性によるのではないかと考えている。一方、癌ではテロメレース活性獲得などによりテロメア長がわずかに回復する。そのため、進行した癌よりも前癌病変においてテロメアがより短縮化しているのではないかと考えている。 The inventors have found that telomeres tend to be shortened more in precancerous lesions and in situ cancer than in advanced cancers. Without being bound by any particular theory, the present inventors believe that the increase in cancer incidence associated with aging may be due to chromosomal instability due to telomere shortening. On the other hand, in cancer, the telomere length is slightly recovered by acquiring telomerase activity. Therefore, we believe that telomeres are shortened more in precancerous lesions than in advanced cancers.
本発明において診断対象となる癌の種類としては、例えば、食道癌の上皮内癌、乳癌、大腸癌等があり、これには前癌病変としての活動性潰瘍性大腸炎等も含まれる。きわめて初期の癌（上皮内癌）や早期癌の病理医による形態学的診断（病理診断）は、これらの初期癌が病理学的、形態学的に正常との差異が小さく困難であるが、本方法では容易にテロメア長に差異が見いだされ、初期や早期の癌の診断に好適といえる。早期や初期の癌では、正常からの病理組織学的差異が小さく病理診断が困難だが、本方法では進行癌と同様に区別（診断）できる。 Examples of the type of cancer to be diagnosed in the present invention include esophageal carcinoma in situ, breast cancer, colon cancer and the like, including active ulcerative colitis as a precancerous lesion. Morphological diagnosis (pathological diagnosis) by a pathologist for very early cancer (carcinoma in situ) and early cancer is difficult because these early cancers are pathologically and morphologically different from normal. In this method, a difference is easily found in telomere length, and it can be said that this method is suitable for early and early cancer diagnosis. In early and early cancers, the histopathological difference from normal is small and pathological diagnosis is difficult, but this method can be distinguished (diagnosed) in the same way as advanced cancer.
本発明においては、テロメア量の測定は、組織ＦＩＳＨ法を応用して行うのが好適である。したがって、検体は、診断対象となる組織又は器官の細胞の染色体が顕微鏡下で観察可能であるように採取し、採取された検体は、ＦＩＳＨ法によるテロメアの染色が可能であるように処理して用いる。組織ＦＩＳＨ法では、すでに作られたパラフィンブロックより起こした試料を用いることができるから、実際に臨床で用いる場合には、病理検査で用いる通常の組織切片（多くは細胞***間期の細胞）に対して本発明の方法を適用するのも便宜であろう。この場合、固定は、例えば、１０％緩衝ホルマリン、４％ホルムアルデヒドで行ったものが好ましいが、これに限定されない。 In the present invention, the telomere amount is preferably measured by applying the tissue FISH method. Therefore, the specimen is collected so that the chromosomes of the cells of the tissue or organ to be diagnosed can be observed under a microscope, and the collected specimen is processed so as to be capable of staining telomeres by the FISH method. Use. In the tissue FISH method, it is possible to use a sample generated from a paraffin block that has already been prepared. Therefore, when actually used in clinical practice, a normal tissue section used for pathological examination (mostly cells in the interphase cell division) is used. On the other hand, it may be convenient to apply the method of the present invention. In this case, the fixation is preferably performed with, for example, 10% buffered formalin and 4% formaldehyde, but is not limited thereto.
本発明においては、組織切片上で、テロメアとセントロメアそれぞれに対する蛍光標識プローブによりハイブリダイゼーションを行う組織ＦＩＳＨ法を用いて、テロメアとセントロメアに対する特異的な標識の蛍光量比（Ｔ／ＣＲ）からテロメア量を測定する。 In the present invention, the amount of telomere is determined from the fluorescence amount ratio (T / CR) of a specific label for telomere and centromere using a tissue FISH method in which hybridization is performed with a fluorescently labeled probe for each of telomere and centromere on a tissue section. Measure.
テロメア及びセントロメアのプローブは、特異的に結合するプローブであれば特に限定されない。例えば、テロメアのプローブとしては、市販されている、蛍光色素標識したtelo-Cy3（TTAGGGに相補的な、5’末端−CCTAAA−3’末端の6塩基配列の3回繰り返しtelo Cy3、株式会社ファスマックDNA合成事業部製）を用いることができる。セントロメアプローブは、別の蛍光色素を標識したcenp1（Cenp1 FITC、株式会社ファスマックDNA合成事業部製）を用いる。正常細胞ではcenp1が分子染色するセントロメア部分の蛍光量は、４６染色体の総量では、ほぼ一定と考えられ、Ｔ／ＣＲによりテロメア長を相対的に知ることができる。組織ＦＩＳＨ法のハイブリダイズの条件は、非特許文献３、４に記載されるようなin situハイブリダイゼーション法の条件を適宜改変して適用することができ、原則的に細胞***期のテロメアＱ−ＦＩＳＨ法の応用が容易である。
The telomere and centromere probes are not particularly limited as long as they are specifically bound probes. For example, as a telomere probe, a commercially available fluorescent dye-labeled telo-Cy3 (complementing TTAGGG, 5'-terminal-CCTAAA-3'-terminal 6-base sequence three-fold telo Cy3, Mac DNA Synthesis Division) can be used. As the centromere probe, cenp1 (Cenp1 FITC, manufactured by Fasmac DNA Synthesis Division) labeled with another fluorescent dye is used. In normal cells, the fluorescence amount of the centromere portion where cenp1 is molecularly stained is considered to be almost constant for the total amount of chromosome 46, and the telomere length can be known relatively by T / CR. The conditions for hybridization in the tissue FISH method can be applied by appropriately modifying the conditions of the in situ hybridization method as described in
ハイブリダイズの後、ＣＣＤカメラを取り付けた蛍光顕微鏡で、スライドグラスの観察と撮影を行い、撮影された画像の解析により、細胞ごとのＴ／ＣＲを求めることができる。具体的には、細胞核内のテロメアとセントロメアに結合したプローブの蛍光量を異なるフィルターで蛍光顕微鏡の視野で捉え、両者の蛍光量を顕微鏡下に別々に測光が可能なＣＣＤカメラを用いて撮影し、画像解析ソフト付きコンピュータに画像を取り込み、蛍光シグナルを画像解析ソフトを用いて定量化する。 After hybridization, the T / CR for each cell can be obtained by observing and photographing the slide glass with a fluorescence microscope equipped with a CCD camera and analyzing the photographed image. Specifically, the fluorescence amount of the probe bound to the telomere and centromere in the cell nucleus is captured in the field of view of the fluorescence microscope with different filters, and both fluorescence amounts are photographed using a CCD camera that can measure light separately under the microscope. The image is taken into a computer with image analysis software, and the fluorescence signal is quantified using the image analysis software.
解析装置は当業者が個々に工夫すればよいが、一例を述べると、例えば、高感度デジタル冷却ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社／ORCA-ER-1394）を装着したニコン80i蛍光顕微鏡による撮像を画像解析用ソフトimage-Pro Plus（プラネトロン社）により8ビット画像に処理しテロメア解析ソフトTFL2004でＴ／ＣＲとして解析することができる。 The analysis device can be individually devised by those skilled in the art. For example, for example, image analysis using a Nikon 80i fluorescence microscope equipped with a high-sensitivity digitally cooled CCD camera (Hamamatsu Photonics / ORCA-ER-1394) The software can be processed into 8-bit images with image-Pro Plus (Planetron) and analyzed as T / CR with telomere analysis software TFL2004.
本発明においては、正常組織と癌組織においてＴ／ＣＲを比較することにより、正常組織と癌組織を鑑別することができる。すなわち、正常組織と癌組織から採取した検体中において、細胞ごとのテロメアとセントロメアの蛍光標識シグナルの相対的光量（Ｔ／ＣＲ）を測定し、各検体におけるＴ／ＣＲの分布のパターン、Ｔ／ＣＲのピーク値、及びＴ／ＣＲの平均値を求めて比較解析することにより、正常組織と癌組織を鑑別することができる。解析の指標は、一般的には次のようになるであろう。 In the present invention, normal tissue and cancer tissue can be differentiated by comparing T / CR in normal tissue and cancer tissue. That is, in a sample collected from normal tissue and cancer tissue, the relative light quantity (T / CR) of the telomere and centromere fluorescent labeling signal for each cell is measured, and the distribution pattern of T / CR in each sample, T / CR, Normal tissue and cancer tissue can be differentiated by obtaining a peak value of CR and an average value of T / CR for comparative analysis. The analysis index will generally be as follows.
Ｔ／ＣＲの分布のパターンは、癌細胞と正常細胞では異なり、癌ではほぼすべての細胞のＴ／ＣＲが１．０未満であるが、正常では２〜５までに広く分布する。
癌細胞のＴ／ＣＲの分布のピーク値は０．５程度で１．０をこえることはないが、正常では１．０程度である。
The pattern of T / CR distribution is different between cancer cells and normal cells, and in cancer, T / CR of almost all cells is less than 1.0, but in normal cases, it is widely distributed from 2 to 5.
The peak value of the T / CR distribution of cancer cells is about 0.5 and does not exceed 1.0, but is normally about 1.0.
Ｔ／ＣＲの平均値は、癌細胞では１以下であることがほとんどであるが、正常では２以上である。（添付図参照）
次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に何等限定されるものではない。
The average value of T / CR is mostly 1 or less in cancer cells, but 2 or more in normal cases. (See attached diagram)
EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention further in detail, the scope of the present invention is not limited to these Examples at all.
１．検体の作成
通常の病理検査と同様に、生検、手術による組織材料を固定後、パラフィンブロックを作製し、ミクロトームにより３−６ミクロンに薄切し、スライドグラスに貼り付ける。この後、通常の病理検査ではヘマトキシリンエオシン染色を行い、細胞自体の形や大きさ（正常とのへだたりから）を観察し癌細胞と非癌細胞は判定するが、本方法では以下を行う。
２．組織ＦＩＳＨ（プローブ、ハイブリダイズ）
テロメアのプローブは、Cy3で標識したtelo-Cy3 (（TTAGGG）に相補的な、5'末端−CCTAAA−3'末端の6塩基配列の3回繰り返し）にラベルされたＰＮＡプローブを用いた。セントロメアプローブはFITCで標識したcenp1にラベルされたＰＮＡプローブを用いた。
３． スライドグラスの観察と撮影
高感度CCDカメラにより癌か非癌細胞かを知りたい細胞群の蛍光染色像を撮影する。
４．画像の解析
図１は食道粘膜の各構成細胞（上皮の基底細胞、棘細胞、間質線維芽細胞）、扁平上皮癌細胞のＴ／ＣＲの分布のパターンを示している。癌と正常各細胞の鑑別は可能である。また、Ｔ／ＣＲのピーク値でも、癌では０．５、非癌細胞では１．０程度であり鑑別可能である。
1. Preparation of Specimen Similar to normal pathological examination, after fixing tissue material by biopsy and surgery, a paraffin block is prepared, sliced into 3-6 microns with a microtome, and attached to a slide glass. After this, in normal pathological examination, hematoxylin and eosin staining is performed, and the shape and size of the cell itself (from the normal sag) are determined to determine cancer cells and non-cancer cells. In this method, the following is performed. .
2. Tissue FISH (probe, hybridize)
As the telomeric probe, a PNA probe labeled with telo-Cy3 labeled with Cy3 (complementing (TTAGGG), 5 'end-CCTAAA-3'
3. Observation and photography of a slide glass A high-sensitivity CCD camera is used to take a fluorescent stained image of a group of cells whose cancer or non-cancerous cells you want to know.
4). Image Analysis FIG. 1 shows the T / CR distribution pattern of each constituent cell (epithelial basal cell, spine cell, stromal fibroblast) of the esophageal mucosa, and squamous cell carcinoma cell. Differentiation between cancer and normal cells is possible. Also, the T / CR peak value is about 0.5 for cancer and about 1.0 for non-cancer cells, and can be distinguished.
図２に示すＴ／ＣＲの平均値でも、非癌細胞は明らかに癌よりも大きく、両者の鑑別が可能である（３−１０倍）。また、癌細胞のＴ／ＣＲは、ほぼ１までの範囲に収まるが、非癌細胞では分布が異なり、２以上の範囲に多くの細胞が存在するので、この点でも鑑別可能である。 Even in the average value of T / CR shown in FIG. 2, the non-cancerous cells are clearly larger than the cancer, and both can be distinguished (3-10 times). In addition, the T / CR of cancer cells falls within the range of approximately 1, but the distribution is different in non-cancer cells, and there are many cells in the range of 2 or more.
本発明の方法により、通常の病理切片を用いて、特別な訓練を受けた病理医を必要とせずに簡便に正常組織と癌組織を鑑別できる。また、本発明の方法にはこれまでに蓄積したサンプルが使用可能であり、他の臨床医学的なデータ、免疫組織学的染色、in situハイブリダイゼーション法によるｈＴＥＲＴ（ヒトテロメレース）発現の有無などのデータと照合する等これまでの情報を活用し、悪性度の判定や予後の推測についても総合的に判断することができる。 According to the method of the present invention, normal tissue and cancer tissue can be easily distinguished from each other using a normal pathological section without requiring a specially trained pathologist. In addition, samples accumulated so far can be used in the method of the present invention, and other clinical medical data, immunohistological staining, presence or absence of hTERT (human telomerase) expression by in situ hybridization method, etc. It is possible to comprehensively judge malignancy determination and prognosis estimation by utilizing information so far such as collation with data.
Claims (7)
（ａ）ある組織から採取した癌が疑われる検体、及び同じ組織から採取した非癌検体を、蛍光色素で標識したテロメアとセントロメアのそれぞれに対するＰＮＡプローブでハイブリダイズする工程、
（ｂ）癌が疑われる検体及び非癌検体を蛍光顕微鏡下で撮影する工程、
（ｃ）撮影された画像を解析し、癌が疑われる検体及び非癌検体の各検体中の細胞ごとのテロメアとセントロメアの蛍光標識シグナルの相対的光量（Ｔ／ＣＲ）を測定し、各検体におけるＴ／ＣＲの分布のパターン、Ｔ／ＣＲのピーク値、及びＴ／ＣＲの平均値を求める工程
（ｄ）癌が疑われる検体及び非癌検体の各検体におけるＴ／ＣＲの分布のパターン、Ｔ／ＣＲのピーク値、及びＴ／ＣＲの平均値を比較解析する工程
（ｅ）前記比較解析した結果から、正常組織と癌組織とを鑑別する工程
を含む、前記方法。 A method for distinguishing between normal tissue and cancer tissue using tissue FISH method,
(A) a step of hybridizing a specimen suspected of cancer collected from a tissue and a non-cancer specimen collected from the same tissue with a PNA probe for each of telomere and centromere labeled with a fluorescent dye;
(B) a step of photographing a specimen suspected of cancer and a non-cancer specimen under a fluorescence microscope;
(C) Analyzing the captured image, measuring the relative light quantity (T / CR) of the telomere and centromere fluorescently labeled signals for each cell in each of the specimens suspected of cancer and non-cancer specimens. A step of obtaining a T / CR distribution pattern, a T / CR peak value, and an average value of T / CR in (d) a T / CR distribution pattern in each specimen of a specimen suspected of cancer and a non-cancer specimen, The method of comparing and analyzing the peak value of T / CR and the average value of T / CR (e) The method of distinguishing normal tissue from cancer tissue from the result of the comparative analysis.
（ａ）ある組織から採取した癌が疑われる検体を、蛍光色素で標識したテロメアとセントロメアに対するそれぞれのＰＮＡプローブでハイブリダイズする工程、
（ｂ）検体を蛍光顕微鏡下で撮影する工程、
（ｃ）撮影された画像を解析し、検体中の細胞ごとのテロメアとセントロメアの蛍光標識シグナルの相対的光量（Ｔ／ＣＲ）を測定し、検体におけるＴ／ＣＲの分布のパターンを求め、検体の９０％以上細胞のＴ／ＣＲが１．０未満であるときに癌であるとする、前記方法。 A method for detecting cancer using a tissue FISH method, wherein (a) a specimen suspected of cancer collected from a certain tissue is hybridized with respective PNA probes for telomere and centromere labeled with a fluorescent dye,
(B) a step of photographing the specimen under a fluorescence microscope;
(C) Analyzing the photographed image, measuring the relative light quantity (T / CR) of the telomere and centromere fluorescently labeled signals for each cell in the specimen, obtaining the T / CR distribution pattern in the specimen, 90% or more of the above, wherein the T / CR of cells is less than 1.0, the method is said to be cancerous.
（ａ）ある組織から採取した癌が疑われる検体を、蛍光色素で標識したテロメアとセントロメアに対するそれぞれのＰＮＡプローブでハイブリダイズする工程、
（ｂ）検体を蛍光顕微鏡下で撮影する工程、
（ｃ）撮影された画像を解析し、検体中の細胞ごとのテロメアとセントロメアの蛍光標識シグナルの相対的光量（Ｔ／ＣＲ）を測定し、検体におけるＴ／ＣＲのピーク値を求め、Ｔ／ＣＲのピーク値が１．０未満であるときに癌であるとする、前記方法。 A method for detecting cancer using a tissue FISH method, wherein (a) a specimen suspected of cancer collected from a certain tissue is hybridized with respective PNA probes for telomere and centromere labeled with a fluorescent dye,
(B) a step of photographing the specimen under a fluorescence microscope;
(C) Analyzing the captured image, measuring the relative light quantity (T / CR) of the telomere and centromere fluorescently labeled signals for each cell in the specimen, obtaining the T / CR peak value in the specimen, The method as described above, wherein the cancer is found when the peak value of CR is less than 1.0.
（ａ）ある組織から採取した癌が疑われる検体を、蛍光色素で標識したテロメアとセントロメアに対するそれぞれのＰＮＡプローブでハイブリダイズする工程、
（ｂ）検体を蛍光顕微鏡下で撮影する工程、
（ｃ）撮影された画像を解析し、検体中の細胞ごとのテロメアとセントロメアの蛍光標識シグナルの相対的光量（Ｔ／ＣＲ）を測定し、検体におけるＴ／ＣＲの平均値を求め、Ｔ／ＣＲの平均値が１．０未満であるときに癌であるとする、前記方法。 A method for detecting cancer using a tissue FISH method,
(A) a step of hybridizing a specimen suspected of cancer collected from a tissue with respective PNA probes for telomere and centromere labeled with a fluorescent dye;
(B) a step of photographing the specimen under a fluorescence microscope;
(C) Analyzing the photographed image, measuring the relative light quantity (T / CR) of the telomere and centromere fluorescently labeled signals for each cell in the specimen, obtaining the average value of T / CR in the specimen, The method as described above, wherein the cancer is found when the average value of CR is less than 1.0.
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