JP2006241070A - ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の測定法 - Google Patents
ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の測定法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼのN末端から86番目〜108番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ抗体と、ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼのN末端から454番目〜474番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ抗体とを組み合わせて使用する、ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の測定法。
【選択図】なし
Description
Br.J.Cancer.,2003,Oct,20;89(8):1486−92.
また、本発明は、ヒトOPRTのN末端から454番目〜474番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗ヒトOPRT抗体を提供するものである。
また、本発明は、ヒトOPRTのN末端から86番目〜108番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗ヒトOPRT抗体と、ヒトOPRTのN末端から454番目〜474番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗ヒトOPRT抗体とを含有する、ヒトOPRTタンパク質測定用キットを提供するものである。
更に本発明は、ヒトOPRTのN末端から86番目〜108番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗ヒトOPRT抗体と、ヒトOPRTのN末端から454番目〜474番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗OPRT抗体とを組み合わせて使用する、ヒトOPRTタンパク質の測定法を提供するものである。
なお、ヒトOPRTタンパク質のアミノ酸配列は、Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America,vol.85,No.6,1988,1754-1758 に記載のものに従った。
上記抗原を用いて抗ヒトOPRTポリクローナル抗体を作製する場合、以下の通り作製できる。抗ヒトOPRTポリクローナル抗体を含む抗血清は、常法にしたがって、上記抗原をウサギ、ラット、マウス、ヤギ等各種の動物に必要回数免疫し、採取することにより得られる。好ましくは、上記合成ペプチドにKLHを結合させたものを抗原として3週間に2度の割合でウサギに免疫する。抗血清から抗OPRT抗体を精製するには、抗体精製の常法にしたがい、アフィニティークロマトグラフィー、硫安塩析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩カラムクロマトグラフィー(ゲル濾過)、プロテインAカラムクロマトグラフィー等を行えばよい。また、抗体の純度を高める目的で、これらの精製手段を組み合わせたり、繰り返したりしてもよい。
アフィニティークロマトグラフィー(抗原固定化カラム)を行う場合、上記合成ペプチドをカラムに固定し、抗血清を充填して抗OPRT抗体をカラムに吸着させた後、溶出液を用いて抗OPRT抗体を外し、これを回収することにより、高純度の抗OPRT抗体を得ることができる。
(1)抗原作成
抗原としては、大腸菌を培養して得られた組み換えヒトOPRT(rhOPRT)を利用した。その製法は次のとおりである。PCRにてヒトOPRTの全長cDNAをクローニングし、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)とrhOPRTとの融合タンパク質を発現するように作成されたプラスミドを導入した大腸菌BL21を、100 μg/mLのアンピシリン存在下、100mLのLB培地(和光純薬工業社製)中で37℃にて一晩振盪培養した。その培養液10mLを1LのLB培地の入った三角フラスコに移し、37℃で更に4時間培養した。遠心による集菌後、100mLの集菌バッファー(50mM Tris、 8M Urea、 1mM PMSF、 5mM EDTA、 5mM DTT pH7.4)に菌体を懸濁後、4℃で30分間緩やかに攪拌した。懸濁液を4℃で超音波破砕後、15000xg、4℃で30分間の遠心処理を行った。その後、上清中の尿素の濃度を透析処理により徐々に1Mまで落とし、リフォールディング処理を行い、2mLのグルタチオン(GSH)−セファロース(シグマ社製)を充填したカラムに通し、洗浄液(20mM Tris、 1M Urea、 5mM EDTA pH7.4)10mLにて洗浄した。溶出用バッファー(50mM GSH, 50mM Tris, pH 9.6)にてGST-rhOPRTを溶出し、rhOPRT溶液を得た。
GST-rhOPRTを免疫原とし、更にフロイント(Freund)の完全アジュバント(FCA)又はフロイントの不完全アジュバント(FIA)を用いて、ウサギ(white日本白色種)を以下により免疫した。
1回目:GST-rhOPRT 0.2mg+FCA S.C.
2〜8回目:GST-rhOPRT 0.5mg+FIA S.C.
免疫したウサギの全血を回収し、これを1500xg、4℃で5分間遠心して血清を分離した。得られた抗血清20mLをPBS(-)にて2倍希釈し40mLとした。この抗血清希釈液をGST蛋白の固定化カラムに添加し、GST反応性の抗体を吸着させた後、素通り溶液をプロテインA固定化カラムに通して、抗体(IgG)を結合させ、PBS(-)を用いて、280nmの吸光度がなくなるまでよく洗浄した。その後0.2M Glycine-HCl pH2.5をカラムに通して抗原に吸着した抗体を溶出させた。なお、この際にpHを中和するために、溶出した抗体を受ける試験管に1M Trisを予め添加しておき、回収した抗体の変質を防いだ。得られた抗体画分をPBS(-)で4℃にて一晩透析し、精製抗体とした。
抗rhOPRT抗体を0.1mM炭酸緩衝液pH9.6で5.0μg/mLに調製して96穴のELISA用プレートに0.1mL分注し、シールをして4℃のインキュベーター内で一晩コーティングを行い、抗体固定化担体を得た。96穴プレートを0.05%ツイーン20含有PBS(-)で2回洗浄後、0.1%BSA含有PBS(-)を0.1mL加え非特異吸着のブロッキングを行った。洗浄液で2回洗浄した後、3、9、27倍に希釈したヒト胃癌由来細胞TMK1細胞のホモジネート(5x106の細胞より0.2mLの蛋白抽出液を調製した)を0.1mL添加し室温で1時間反応させた。洗浄液で5回洗浄した後、0.5μg/mLに希釈液にて希釈したパーオキシダーゼ標識抗rhOPRT抗体を0.1mLづつ分注し、室温で30分間反応させた。洗浄液で7回洗浄後、1.3mg/mLのオルトフェニレンジアミンと0.01%の過酸化水素水、1mM EDTAを含む0.1Mのリン酸−クエン酸緩衝液pH5.1(発色液)を0.1mL加え、室温暗所にて30分酵素反応を行った。最後に、0.1M硫酸0.1mLを加えて反応を停止し、492nmの吸光度の測定を行った。この結果を表1に示す。
次の操作により、抗OPRTポリクローナル抗体を得た。
(1)ペプチド合成
ヒトOPRTのN末端から86番目〜108番目のアミノ酸配列を有するペプチド、ヒトOPRTのN末端から428番目〜446番目のアミノ酸配列を有するペプチド、及びヒトOPRTのN末から454番目〜474番目のアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、以下のペプチド配列からなる人工ペプチドを得た。
Cys-Ser-Thr-Asn-Gln-Ile-Pro-Met-Leu-Ile-Arg-Arg-Lys-Glu-Thr-Lys-Asp-Tyr-Gly-Thr-Lys-Arg-Leu(配列番号1)
Cys-Leu-Gly-Gln-Gln-Tyr-Asn-Ser-Pro-Gln-Glu-Val-Ile-Gly-Lys-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile(配列番号2)
Cys-Ile-Ser-Ala-Ala-Asp-Arg-Leu-Glu-Ala-Ala-Glu-Met-Tyr-Arg-Lys-Ala-Ala-Trp-Glu-Ala-Tyr(配列番号3)
上記によって得た人工ペプチド4mgとマレイミド活性化KLH(Pierce)2mgを用いてペプチド-KLH結合物(conjugate)をそれぞれのペプチドについて作成した。
人工ペプチド-KLHを免疫原とし、更にフロイント(Freund)の完全アジュバント(FCA)又はフロイントの不完全アジュバント(FIA)を用いて、ウサギ(white日本白色種)を以下により免疫した。
1回目:Peptide-KLH 0.5mg+FCA S.C.
2〜8回目:Peptide-KLH 0.5mg+FIA S.C.
免疫したウサギの全血を回収し、これを1600xg、4℃で5分間遠心して血清を分離した。得られた抗血清20mLをPBS(-)にて2倍希釈し40mLとした。この抗血清希釈液を抗原ペプチドカラムに添加し、抗体(IgG)を結合させ、PBS(-)を用いて、280nmの吸光度がなくなるまでよく洗浄した。その後0.2M Glycine-HCl pH2.5をカラムに通して抗原に吸着した抗体を溶出させた。なお、この際にpHを中和するために、溶出した抗体を受ける試験管に1M Trisを予め添加しておき、回収した抗体の変質を防いだ。得られた抗体画分をPBS(-)で4℃にて一晩透析し、精製抗体とした。
ヒト肺癌由来細胞LC-11細胞のホモジネート(タンパク濃度20mg/mL)に電気泳動用試料調製液(4%SDS、10%beta-メルカプトエタノール、20%グリセロール、125mM Tris、 pH 6.8)を等量混合し、2分間煮沸処理を行い、10μLを電気泳動に使用した。試料は10%ポリアクリルアミドを用いて泳動した後、PVDFフィルターに電気的に転写し、ブロックエース(ブロッキング剤、大日本製薬社製)に浸してブロッキングを行った。20mM PBS(-)で1.2μg/mLに調製した各ポリクローナル抗体を一次抗体に用い1時間の反応を行い、500mM塩化ナトリウム及び0.5%ツイーン20を含む20mM Tris pH 7.0(洗浄液)でフィルターを洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識デキストランポリマー結合抗ウサギポリクローナル抗体(Dako Cytomation)を二次抗体として1時間反応した。ついで洗浄液でフィルターを洗浄し、化学発光試薬(CDP-star、 Tropix)を使用して酵素反応を行いOPRTの検出を行った。その結果、図1に示すように、本発明の抗ヒトOPRT抗体はいずれもOPRTのみを特異的に認識することが確認された。
(1)Standardとしては、大腸菌を培養して得られたrhOPRTを利用した。その製法は次のとおりである。PCRにてヒトOPRTの全長cDNAをクローニングし、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)とrhOPRTとの融合タンパク質を発現するように作成されたプラスミドを導入した大腸菌BL21を、100 μg/mLのアンピシリン存在下、100mLのLB培地(和光純薬工業社製)中で37℃にて一晩振盪培養した。その培養液10mLを1LのLB培地の入った三角フラスコに移し、37℃で更に4時間培養した。遠心による集菌後、100mLの集菌バッファー(50mM Tris、 8M Urea、 1mM PMSF、 5mM EDTA、 5mM DTT pH7.4)に菌体を懸濁後、4℃で30分間緩やかに攪拌した。懸濁液を4℃で超音波破砕後、15000xg、4℃で30分間の遠心処理を行った。その後、上清中の尿素の濃度を透析処理により徐々に1Mまで落とし、リフォールディング処理を行い、2mLのグルタチオン(GSH)−セファロース(シグマ社製)を充填したカラムに通し、洗浄液(20mM Tris、 1M Urea、 5mM EDTA pH7.4)10mLにて洗浄した。この融合タンパクが結合したグルタチオン(GSH)−セファロースに600Uのthrombinを加え、2.5mM塩化カルシウム存在下に4℃で一晩反応させ、GST-OPRT融合タンパクの結合部位を切断した。thrombinとrhOPRTの混合物はBenzamidine-Sepharoseカラムを通すことで、目的のrhOPRT溶液を得た。ブラッドフォード法によるタンパク定量の結果、20μg/mLの濃度のrhOPRTが14mL得られた。
抗OPRT-A抗体、抗OPRT-B抗体及び抗OPRT-C抗体を0.1mM炭酸緩衝液pH9.6で5.0μg/mLに調製して96穴のELISA用プレートに0.1mL分注し、シールをして4℃のインキュベーター内で一晩コーティングを行い、抗体固定化担体を得た。96穴プレートを0.05%ツイーン20含有PBS(-)で2回洗浄後、0.1%BSA含有PBS(-)を0.1mL加え非特異吸着のブロッキングを行った。洗浄液で2回洗浄した後、1.88ng/mLの濃度のrhOPRT溶液を0.1mL添加し、室温で1時間反応させた。洗浄液で5回洗浄した後、希釈液(0.1%BSA, 0.05% ツイーン20含有PBS(-))にて0.5μg/mLに希釈した抗OPRT-A抗体、抗OPRT-B抗体及び抗OPRT-C抗体のパーオキシダーゼ標識抗体を0.1mLづつ分注し、室温で30分間反応させた。洗浄液で7回洗浄後、1.3mg/mLのオルトフェニレンジアミンと0.01%の過酸化水素水、1mM EDTAを含む0.1Mのリン酸−クエン酸緩衝液pH5.1(発色液)を0.1mL加え、室温暗所にて30分酵素反応を行った。最後に、0.1M硫酸0.1mLを加えて反応を停止し、492nmの吸光度の測定を行った。この結果を図2に示す。
抗OPRT-C抗体を0.1mM炭酸緩衝液pH9.6で5.0μg/mLに調製して96穴のELISA用プレートに0.1mL分注し、シールをして4℃のインキュベーター内で一晩コーティングを行い、抗体固定化担体を得た。96穴プレートを0.05%ツイーン20含有PBS(-)で2回洗浄後、0.1%BSA含有PBS(-)を0.1mL加え非特異吸着のブロッキングを行った。洗浄液で2回洗浄した後、0.47、0.94、1.88、3.75、7.5ng/mLの濃度に調製したrhOPRT溶液を0.1mL添加し室温で1時間反応させた。洗浄液で5回洗浄した後、0.5μg/mLに希釈液にて希釈したパーオキシダーゼ標識抗OPRT-A抗体を0.1mLづつ分注し、室温で30分間反応させた。洗浄液で7回洗浄後、1.3mg/mLのオルトフェニレンジアミンと0.01%の過酸化水素水、1mM EDTAを含む0.1Mのリン酸−クエン酸緩衝液pH5.1(発色液)を0.1mL加え、室温暗所にて5分酵素反応を行った。最後に、0.1M硫酸0.1mLを加えて反応を停止し、492nmの吸光度の測定を行った。この結果を図3に示す。
Claims (6)
- ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼのN末端から86番目〜108番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ抗体。
- ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼのN末端から454番目〜474番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ抗体。
- ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼのN末端から86番目〜108番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ抗体と、ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼのN末端から454番目〜474番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ抗体とを含有する、ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質測定用キット。
- 測定手段がサンドイッチELISAである請求項3記載の測定用キット。
- ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼのN末端から86番目〜108番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ抗体と、ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼのN末端から454番目〜474番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ抗体とを組み合わせて使用する、ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の測定法。
- 測定手段がサンドイッチELISAである請求項5記載の測定法。
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