JP2006234472A - Biosensor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、バイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。 The present invention relates to a biosensor and a method for analyzing an interaction between biomolecules using the biosensor. In particular, the present invention relates to a biosensor for use in a surface plasmon resonance biosensor and a method for analyzing an interaction between biomolecules using the biosensor.
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。 Currently, many measurements using intermolecular interactions such as immune reactions are performed in clinical examinations, etc., but conventional methods require complicated operations and labeling substances, so measurement without the need for labeling substances Several techniques that can detect a change in the amount of a substance bound with high sensitivity are used. For example, surface plasmon resonance (SPR) measurement technology, quartz crystal microbalance (QCM) measurement technology, and measurement technology using functionalized surfaces from gold colloidal particles to ultrafine particles. SPR measurement technology detects adsorption and desorption near the surface by measuring the refractive index change in the vicinity of the organic functional film in contact with the metal film of the chip by measuring the peak shift of the reflected light wavelength or the change in the amount of reflected light at a fixed wavelength. It is a method to do. The QCM measurement technique is a technique that can detect the adsorption / desorption mass at the ng level from the change in the oscillation frequency of the oscillator due to the adsorption / desorption of a substance on the gold electrode (device) of the crystal oscillator. In addition, by functionalizing the surface of gold ultrafine particles (nm level), immobilizing a physiologically active substance on the surface, and performing a specific recognition reaction between the physiologically active substances, it is possible to obtain a living body from the sedimentation and arrangement of gold fine particles. Related substances can be detected.
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。 In any of the above techniques, the surface on which the physiologically active substance is immobilized is important. Hereinafter, the surface plasmon resonance (SPR) most used in this technical field will be described as an example.
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。 A commonly used measurement chip is composed of a transparent substrate (eg, glass), a deposited metal film, and a thin film having a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance thereon, and the metal surface is interposed through the functional group. Immobilize physiologically active substances. The interaction between biomolecules is analyzed by measuring a specific binding reaction between the physiologically active substance and the analyte substance.
生理活性物質を固定化可能な官能基を有する検出表面として、例えば特許文献１に、ヒドロゲルの製造法が詳細に開示されている。具体的には、16−メルカプトヘキサデカノールの層が金膜に結合することでバリアー層を形成する。この金膜上でバリアー層のヒドロキシル基はエピクロロヒドリンで処理することによりエポキシ活性化される。次の段階でデキストランをエーテル結合を介してバリアー層に付着させる。次にデキストランマトリックスに対してブロモ酢酸を反応させることで、カルボキシメチル基を導入する。 As a detection surface having a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance, for example, Patent Document 1 discloses a method for producing a hydrogel in detail. Specifically, a barrier layer is formed by bonding a 16-mercaptohexadecanol layer to a gold film. On this gold film, the hydroxyl group of the barrier layer is epoxy activated by treating with epichlorohydrin. In the next step, dextran is attached to the barrier layer via an ether linkage. Next, a carboxymethyl group is introduced by reacting the dextran matrix with bromoacetic acid.
この方法に基づき製造されたカルボキシメチル変性デキストラン表面にアミノ基を有する生理活性物質（例えばタンパク質やアミノ酸）を固定化するための手法としては、以下のような手法が開示されている。すなわち、カルボキシメチル変性デキストランにおけるカルボキシル基の一部を反応性エステル機能を生ずるように例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）及びＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド（EDC）塩酸の水溶液で処理することにより変性される。残留電荷すなわち未反応カルボキシル基は、生理活性物質の検出表面への濃縮の遂行に寄与するであろう。このような検出表面に対し、アミノ基を含む生理活性物質（タンパク質やアミノ酸）の水溶液を接触させることで、アミノ基を含む生理活性物質をデキストランマトリックスに共有結合により結合させることができる。 As a technique for immobilizing a physiologically active substance having an amino group (for example, a protein or amino acid) on the surface of a carboxymethyl-modified dextran produced based on this method, the following technique is disclosed. That is, for example, N-hydroxysuccinimide (NHS) and N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide (EDC) hydrochloric acid are used so that a part of the carboxyl group in the carboxymethyl-modified dextran generates a reactive ester function. Denatured by treatment with aqueous solution. Residual charges, i.e. unreacted carboxyl groups, will contribute to the concentration of the bioactive substance to the detection surface. By bringing an aqueous solution of a physiologically active substance (protein or amino acid) containing an amino group into contact with such a detection surface, the physiologically active substance containing an amino group can be covalently bound to the dextran matrix.
上記した方法により製造されたヒドロゲルは、アミノ基を含む生理活性物質を３次元的に固定化可能であるため、バイオセンサーの検出表面として優れた性能を示す。しかし、上記した方法によるヒドロゲルの製造法は煩雑であり、製造時間が長く、エピクロロヒドリンやブロモ酢酸といった化合物を用いることが必要であるため、安全性の面で問題があった。 The hydrogel produced by the method described above exhibits excellent performance as a detection surface of a biosensor because a physiologically active substance containing an amino group can be immobilized three-dimensionally. However, the hydrogel production method by the above-described method is complicated, has a long production time, and requires the use of a compound such as epichlorohydrin or bromoacetic acid.
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち本発明は、生理活性物質を固定化し得るヒドロゲルを、安全な原料を用いて簡便に製法することができるバイオセンサー及びその製造方法を提供することを解決すべき課題とした。 The present invention has been made to solve the above-described problems of the prior art. That is, an object of the present invention is to provide a biosensor capable of easily producing a hydrogel capable of immobilizing a physiologically active substance using a safe raw material and a method for producing the same.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ハロゲン化銀写真感光材料の製造用に開発された高分子硬膜剤を、生理活性物質の水酸基又はアミノ基と反応できる反応性官能基を有する親水性高分子として、バイオセンサーの検出表面用のヒドロゲルとして応用することにより、生理活性物質を固定化し得るヒドロゲルを簡便に製造可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors can react a polymer hardener developed for the production of a silver halide photographic light-sensitive material with a hydroxyl group or an amino group of a physiologically active substance. As a hydrophilic polymer having a reactive functional group, a hydrogel capable of immobilizing a physiologically active substance can be easily produced by applying it as a hydrogel for a detection surface of a biosensor, and the present invention is completed. It came to.
即ち、本発明によれば、表面に金属層を有し、該金属層に、直接又は中間層を介して、生理活性物質の水酸基又はアミノ基と反応できる反応性官能基を有する親水性高分子が結合している基板から成るバイオセンサーが提供される。 That is, according to the present invention, a hydrophilic polymer having a metal layer on the surface and having a reactive functional group capable of reacting with the hydroxyl group or amino group of a physiologically active substance directly or via an intermediate layer. A biosensor comprising a substrate to which is bound is provided.
好ましくは、親水性高分子の反応性官能基は、ビニルスルホン基又はその前駆体である。
好ましくは、親水性高分子の反応性官能基は、ジクロロトリアジン基である。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、末端に反応性基を有するアルカンチオール又はその酸化体であるジスルフィドを用いて金属表面に密な層を形成させた後、アルカンチオール末端の反応性基と、生理活性物質の水酸基又はアミノ基と反応できる反応性官能基を有する親水性高分子とを反応させることにより得られる。
好ましくは、親水性高分子の反応性官能基をアミノ酸と反応させることによりカルボン酸が導入されている。
Preferably, the reactive functional group of the hydrophilic polymer is a vinyl sulfone group or a precursor thereof.
Preferably, the reactive functional group of the hydrophilic polymer is a dichlorotriazine group.
Preferably, the biosensor of the present invention forms a dense layer on the metal surface using a disulfide that is an alkanethiol having a reactive group at the terminal or an oxidized form thereof, and then has a reactive group at the terminal of the alkanethiol; It can be obtained by reacting a hydrophilic polymer having a reactive functional group capable of reacting with a hydroxyl group or amino group of a physiologically active substance.
Preferably, the carboxylic acid is introduced by reacting the reactive functional group of the hydrophilic polymer with an amino acid.
好ましくは、中間層の膜厚は０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下である。
好ましくは、金属は金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは非電気化学的検出に使用され、さらに好ましくは表面プラズモン共鳴分析に使用される。
Preferably, the film thickness of the intermediate layer is not less than 0.1 nm and not more than 500 nm.
Preferably, the metal is any of gold, silver, copper, platinum or aluminum.
Preferably, the biosensor of the present invention is used for non-electrochemical detection, more preferably for surface plasmon resonance analysis.
本発明の別の側面によれば、表面に金属層を有する基板の表面に、直接又は中間層を介して、生理活性物質の水酸基又はアミノ基と反応できる反応性官能基を有する親水性高分子を化学的に結合する工程を含む、上記した本発明のバイオセンサーの製造方法が提供される。 According to another aspect of the present invention, a hydrophilic polymer having a reactive functional group capable of reacting with a hydroxyl group or an amino group of a physiologically active substance directly or via an intermediate layer on the surface of a substrate having a metal layer on the surface. There is provided a method for producing the biosensor of the present invention as described above, which comprises a step of chemically conjugating.
本発明のさらに別の側面によれば、親水性高分子あるいは反応性官能基をアミノ酸と反応させることにより導入されたカルボン酸の反応性官能基に生理活性物質が共有結合により結合している、本発明のバイオセンサーが提供される。 According to still another aspect of the present invention, a physiologically active substance is covalently bonded to a reactive functional group of a carboxylic acid introduced by reacting a hydrophilic polymer or a reactive functional group with an amino acid. The biosensor of the present invention is provided.
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法が提供される。 According to still another aspect of the present invention, the biosensor includes a step of bringing the biosensor of the present invention into contact with the physiologically active substance and binding the physiologically active substance to the surface of the biosensor. A method of immobilization is provided.
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している本発明のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定し、さらに好ましくは生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
According to still another aspect of the present invention, a substance that interacts with a physiologically active substance, comprising the step of bringing the biosensor of the present invention in which the physiologically active substance is covalently bonded to the surface with the test substance. A method of detecting or measuring is provided.
Preferably, the substance that interacts with the physiologically active substance is detected or measured by a non-electrochemical method, and more preferably, the substance that interacts with the physiologically active substance is detected or measured by surface plasmon resonance analysis.
本発明によれば、生理活性物質を固定化し得るヒドロゲルを、安全な原料を用いて簡便に製法することができるバイオセンサー及びその製造方法を提供することが可能になった。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it became possible to provide the biosensor which can manufacture a hydrogel which can fix | immobilize a physiologically active substance simply using a safe raw material, and its manufacturing method.
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明のバイオセンサーは、表面に金属層を有し、該金属層に、直接又は中間層を介して、生理活性物質の水酸基又はアミノ基と反応できる反応性官能基を有する親水性高分子が結合している基板から成ることを特徴とする。
Embodiments of the present invention will be described below.
The biosensor of the present invention has a metal layer on the surface, and a hydrophilic polymer having a reactive functional group capable of reacting with a hydroxyl group or an amino group of a physiologically active substance directly or via an intermediate layer. It consists of the board | substrate which has couple | bonded.
本発明で用いる生理活性物質の水酸基又はアミノ基と反応できる反応性官能基を有する親水性高分子としては、ハロゲン化銀写真用の高分子硬膜剤を用いることができる。以下、本発明で用いることができる高分子硬膜剤について説明する。高分子硬膜剤とは、ゼラチン等の親水性コロイドと結合反応する反応性官能基を分子内に複数有している高分子化合物であり、特開昭５６−６６８４１号公報、英国特許１，３２２，９７１号公報、米国特許３，６７１，２５６号公報，特開平７−６４２２６号公報，特開平７−１４０５９６号公報， 特開平１０−１１１５４５号公報， 特開２０００−６２６２９号公報，特開２００４−２０９１９号公報等の特許文献、及びジェームズ著ザ・セオリー・オブ・ザ・フォトグラフィック・プロセス（Ｊａｍｅｓ， Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ）第４版、８４頁（１９７７、マクミラン社）、キャンプベル他著ポリメリック・アミン・アンド・アンモニウム・ソルツ（Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｔａｌ；Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ａｍｉｎｅ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓａｌｔｓ）３２１〜３３２頁（１９７９、パーガモンプレス社）などの成書に記載されている。 As the hydrophilic polymer having a reactive functional group capable of reacting with the hydroxyl group or amino group of the physiologically active substance used in the present invention, a polymer hardener for silver halide photography can be used. The polymer hardener that can be used in the present invention will be described below. The polymer hardener is a polymer compound having a plurality of reactive functional groups in the molecule that bind and react with a hydrophilic colloid such as gelatin. JP-A-56-66841, British Patent 1, No. 322,971, US Pat. No. 3,671,256, JP-A-7-64226, JP-A-7-140596, JP-A-10-111545, JP-A-2000-62629, JP Patent Literature such as 2004-20919, and The Theory of the Photographic Process by James (James, The Theory of the Photographic Process), 4th edition, page 84 (1977, Macmillan), Campbell Other authors Polymeric Amine and Ammonium Salts (Campbelleta) ; Polymeric Amine and Ammonium Salts), pp 321-332 (1979, are described in textbooks par Gammon Press, Inc.) and the like.
本発明に用いられる高分子硬膜剤は、バイオセンサー表面の官能基と結合可能な反応性官能基を有する高分子化合物であり、好ましくは下記の式（１）〜式（９）で表される反応性官能基を有する高分子化合物である。
式（１）： −ＳＯ2ＣＨ＝ＣＨ2
式（２）： −ＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2Ｘ
式（２）中、Ｘは、式（２）で表される官能基が求核試薬あるいは塩基と反応する際、置換反応あるいは脱離反応によって離脱する基（例えば、−Ｃｌ、−ＯＳＯ2ＣＨ3、−ＯＳＯ2Ｃ6Ｈ4ＣＨ3、−ＯＣＯＣＨ3、−ＯＳＯ3 - 、ピリジニウム等）である。
式（３）
The polymer hardener used in the present invention is a polymer compound having a reactive functional group capable of binding to a functional group on the biosensor surface, and is preferably represented by the following formulas (1) to (9). It is a polymer compound having a reactive functional group.
Equation (1): -SO 2 CH = CH 2
Equation (2): -SO 2 CH 2 CH 2 X
In the formula (2), X represents a group (for example, —Cl, —OSO 2 CH, etc.) which is removed by a substitution reaction or elimination reaction when the functional group represented by the formula (2) reacts with a nucleophile or a base. 3, -OSO 2 C 6 H 4 CH 3, -OCOCH 3, -OSO 3 -, a pyridinium).
Formula (3)
式（３）中、Ｘは単結合、−Ｏ−、−ＮＲ−を表し、Ｒは水素原子、アルキル基、アラルキル基を表す。Ｙ、Ｚはハロゲン原子（例えば塩素原子、臭素原子）、アルコキシ基（例えばメトキシ）、水酸基及びその塩、置換されていてもよいアミノ基を表し、Ｙ，Ｚの少なくとも１つはハロゲン原子である。 In formula (3), X represents a single bond, —O—, or —NR—, and R represents a hydrogen atom, an alkyl group, or an aralkyl group. Y and Z represent a halogen atom (for example, chlorine atom, bromine atom), an alkoxy group (for example, methoxy), a hydroxyl group and a salt thereof, and an optionally substituted amino group, and at least one of Y and Z is a halogen atom. .
式（４）： −ＣＨＯ
式（５）：
Formula (4): -CHO
Formula (5):
式（６）： −ＮＣＯ
式（７）： −ＮＨＣＯＮＨＣＯＣＨ＝ＣＨ2
式（８）： −ＮＨＣＯＮＨＣＯＣＨ2ＣＨ2Ｘ
式中、Ｘは式（２）のＸと同義である。
式（９）： −ＣＯＸ
式中、Ｘは、式（９）で表される官能基がアミノ基と反応した際に容易に脱離する基（例えば、
Formula (6): -NCO
Formula (7): —NHCONHCOCH═CH 2
Formula (8): —NHCONHCOCH 2 CH 2 X
In formula, X is synonymous with X of Formula (2).
Formula (9): -COX
In the formula, X is a group (for example, easily leaving when the functional group represented by the formula (9) reacts with an amino group)
であり、式（９）は一般的に活性エステル基あるいは混合酸無水物として知られているものを表す。 And formula (9) represents what is commonly known as an active ester group or mixed acid anhydride.
本発明に用いられる高分子硬膜剤を製造するに当たり、重合方法については特に制約はないが、例えば縮重合法によって製造されていてもよく、またエチレン性不飽和結合を有する化合物を用いてラジカル重合、アニオン重合等の方法によって製造されていてもよい。さらには天然高分子（例えば、デンプン、デキストラン、ゼラチン等）に前記の反応性官能基を導入することによって製造されていてもよい。本発明に用いられる親水性コロイドと反応可能な官能基（上記式（１）〜式（９）で表される官能基、以後反応性官能基と称する）の導入方法についても特に制約はなく、反応性官能基を有するモノマーを用いて重合反応を行って重合体を製造してもよいし、予め重合体を製造した後にいわゆる高分子反応により、前記の反応性官能基を導入してもよい。さらには反応性官能基の前駆体を有するモノマー化合物を用いて重合反応を行い、その後に適切な方法によって反応性官能基を生成させる方法も有効である。 In producing the polymer hardener used in the present invention, the polymerization method is not particularly limited. For example, the polymer hardener may be produced by a condensation polymerization method, and may be a radical using a compound having an ethylenically unsaturated bond. It may be produced by a method such as polymerization or anionic polymerization. Furthermore, it may be produced by introducing the reactive functional group into a natural polymer (for example, starch, dextran, gelatin, etc.). There is no particular restriction on the method of introducing the functional group capable of reacting with the hydrophilic colloid used in the present invention (the functional group represented by the above formula (1) to formula (9), hereinafter referred to as the reactive functional group). A polymer may be produced by carrying out a polymerization reaction using a monomer having a reactive functional group, or the reactive functional group may be introduced by a so-called polymer reaction after the polymer has been produced in advance. . It is also effective to perform a polymerization reaction using a monomer compound having a precursor of a reactive functional group and then generate a reactive functional group by an appropriate method.
本発明に用いられる高分子硬膜剤は、前記の反応性官能基（またはその前駆体）とエチレン性不飽和結合を同一分子内に有するモノマーをラジカル重合することによって製造されても良い。反応性官能基を持つモノマーとしては以下に示す化合物が代表的な例である。 The polymer hardener used in the present invention may be produced by radical polymerization of a monomer having the reactive functional group (or its precursor) and an ethylenically unsaturated bond in the same molecule. The following compounds are typical examples of the monomer having a reactive functional group.
本発明に用いられる重合体は反応性官能基を持つモノマーの単独重合体であってもよく、また他の１種あるいは２種以上のモノマーとの共重合体であってもよい。共重合体の場合、反応性官能基を持つモノマーの割合は１質量％以上であり、５質量％以上が好ましい。ラジカル共重合をする場合、他のモノマーはラジカル重合が可能であれば特に制限はないが、以下のモノマーを具体例として挙げることができる。また、他のモノマーが反応可能な官能基を有する場合、前記式（１）〜（９）で表される官能基と共重合時に反応を起こさない範囲内で、適宜モノマーの組合わせを選択することが好ましい。 The polymer used in the present invention may be a homopolymer of a monomer having a reactive functional group, or may be a copolymer with one or more other monomers. In the case of a copolymer, the proportion of the monomer having a reactive functional group is 1% by mass or more, and preferably 5% by mass or more. In the case of radical copolymerization, other monomers are not particularly limited as long as radical polymerization is possible, but the following monomers can be given as specific examples. In addition, when other monomers have a functional group capable of reacting, a combination of monomers is appropriately selected within a range in which no reaction occurs with the functional groups represented by the above formulas (1) to (9). It is preferable.
アクリル酸、メタクリル酸およびそのエステル類：例えば、アクリル酸、メチルアクリレート、ブチルアクリレート、ベンジルアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＲ（Ｒは、水素原子、アルキル基、ｎは１以上の整数）、メタクリル酸、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ベンジルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、２−メトキシエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、２−スルホエチルメタクリレート等、
エチレン性不飽和カルボン酸のアミド類：アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（もしくはその塩）等、
芳香族単量体：スチレン、ビニルトルエン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ビニル安息香酸、ビニルナフタレン等、
その他のビニル単量体：エチレン、プロピレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、トリフロロエチレン、トリフロロクロロエチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ビニルアルコール、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルアセトアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等。
Acrylic acid, methacrylic acid and esters thereof: for example, acrylic acid, methyl acrylate, butyl acrylate, benzyl acrylate, hydroxyethyl acrylate, CH 2 ═CHCOO (CH 2 CH 2 O) n R (R is a hydrogen atom, an alkyl group , N is an integer of 1 or more), methacrylic acid, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, benzyl methacrylate, hydroxyethyl methacrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, 2-methoxyethyl methacrylate, N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, 2-sulfoethyl methacrylate etc,
Amides of ethylenically unsaturated carboxylic acids: acrylamide, methacrylamide, N-acryloylmorpholine, N, N-dimethylacrylamide, 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid (or a salt thereof), etc.
Aromatic monomers: styrene, vinyl toluene, pt-butyl styrene, p-vinyl benzoic acid, vinyl naphthalene, etc.
Other vinyl monomers: ethylene, propylene, vinyl chloride, vinylidene chloride, trifluoroethylene, trifluorochloroethylene, vinyl acetate, vinyl propionate, vinyl alcohol, N-vinyl pyrrolidone, N-vinyl acetamide, acrylonitrile, methacrylo Nitrile etc.
以下に本発明に用いられる高分子硬膜剤の具体例を示すが、本発明がこれらに限定されるものではない。それぞれの化合物の共重合比率は質量百分率比を表す。 Specific examples of the polymer hardener used in the present invention are shown below, but the present invention is not limited thereto. The copolymerization ratio of each compound represents a mass percentage ratio.
Ｐ−１：Ｍ−１／２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体（１０／９０）
Ｐ−２：Ｍ−１／２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体（３０／７０）
Ｐ−３：Ｍ−１／２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体（５０／５０）
Ｐ−４：Ｍ−１／メチルメタクリレート共重合体（２０／８０）
Ｐ−５：Ｍ−２／アクリル酸ソーダ共重合体（３０／７０）
Ｐ−６：Ｍ−２／２−ヒドロキシエチルメタクリレート共重合体（２０／８０）
Ｐ−７：Ｍ−３／ブチルアクリレート共重合体（６０／４０）
Ｐ−８：Ｍ−４／２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体（３０／７０）
Ｐ−９：Ｍ−６／エチルアクリレート共重合体（６０／４０）
Ｐ−１０：Ｍ−７／Ｎ−ビニルピロリドン共重合体（２０／８０）
P-1: M-1 / 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid soda copolymer (10/90)
P-2: M-1 / 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid soda copolymer (30/70)
P-3: M-1 / 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid soda copolymer (50/50)
P-4: M-1 / methyl methacrylate copolymer (20/80)
P-5: M-2 / sodium acrylate copolymer (30/70)
P-6: M-2 / 2-hydroxyethyl methacrylate copolymer (20/80)
P-7: M-3 / butyl acrylate copolymer (60/40)
P-8: M-4 / 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid soda copolymer (30/70)
P-9: M-6 / ethyl acrylate copolymer (60/40)
P-10: M-7 / N-vinylpyrrolidone copolymer (20/80)
Ｐ−１１：Ｍ−７／ジアセトンアクリルアミド共重合体（１０／９０）
Ｐ−１２：Ｍ−１０／メタクリル酸ソーダ共重合体（１５／８５）
Ｐ−１３：Ｍ−１０／メチルアクリレート／メチルメタクリレート共重合体（２０／４０／４０）
Ｐ−１４：Ｍ−１２／エチルメタクリレート共重合体（３３／６７）
Ｐ−１５：Ｍ−１２／２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体（１５／８５）
Ｐ−１６：Ｍ−１３／メチルメタクリレート共重合体（３３／６７）
Ｐ−１７：Ｍ−１３／２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体（２０／８０）
Ｐ−１８：Ｍ−１３／Ｎ−アクリロイルモルホリン共重合体（２０／８０）
Ｐ−１９：Ｍ−１３／メトキシポリエチレングリコール（２３量体）モノメタクリレート共重合体（５０／５０）
Ｐ−２０：Ｍ−１８／Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド共重合体（５／９５）
P-11: M-7 / diacetone acrylamide copolymer (10/90)
P-12: M-10 / sodium methacrylate copolymer (15/85)
P-13: M-10 / methyl acrylate / methyl methacrylate copolymer (20/40/40)
P-14: M-12 / ethyl methacrylate copolymer (33/67)
P-15: M-12 / 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid soda copolymer (15/85)
P-16: M-13 / methyl methacrylate copolymer (33/67)
P-17: M-13 / 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid soda copolymer (20/80)
P-18: M-13 / N-acryloylmorpholine copolymer (20/80)
P-19: M-13 / methoxy polyethylene glycol (23-mer) monomethacrylate copolymer (50/50)
P-20: M-18 / N, N-dimethylacrylamide copolymer (5/95)
Ｐ−２１：Ｍ−１８／ブチルメタクリレート共重合体（３０／７０）
Ｐ−２２：Ｍ−１８／スチレン／ブチルアクリレート共重合体（２０／３０／５０）
Ｐ−２３：Ｍ−１９／２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体（２０／８０）
Ｐ−２４：Ｍ−２３／メチルアクリレート共重合体（２０／８０）
Ｐ−２５：Ｍ−２４／エチルアクリレート／スチレン共重合体（２０／５０／３０）
Ｐ−２６：Ｍ−２６／アクリルアミド共重合体（２５／７５）
Ｐ−２７：Ｍ−２６／Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（３０／７０）
P-21: M-18 / butyl methacrylate copolymer (30/70)
P-22: M-18 / styrene / butyl acrylate copolymer (20/30/50)
P-23: M-19 / 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid soda copolymer (20/80)
P-24: M-23 / methyl acrylate copolymer (20/80)
P-25: M-24 / ethyl acrylate / styrene copolymer (20/50/30)
P-26: M-26 / acrylamide copolymer (25/75)
P-27: M-26 / N, N-dimethylaminoethyl methacrylate copolymer (30/70)
本発明に用いられる高分子硬膜剤の反応性官能基としては、好ましくは、活性オレフィン型高分子硬膜剤、ｓ−トリアジン型高分子硬膜剤、活性ハロゲン型高分子硬膜剤、アルデヒド型高分子硬膜剤、グリシジル型高分子硬膜剤等が用いられ、さらに好ましくは活性オレフィン型高分子硬膜剤あるいはその前駆体、ｓ−トリアジン型高分子硬膜剤、グリシジル型高分子硬膜剤が用いられ、ビニルスルホン型高分子硬膜剤あるいはその前駆体、ジクロロトリアジン型高分子硬膜剤が特に好ましい。 The reactive functional group of the polymer hardener used in the present invention is preferably an active olefin polymer hardener, s-triazine polymer hardener, active halogen polymer hardener, aldehyde. Type polymer hardeners, glycidyl type polymer hardeners, etc. are used, more preferably active olefin type polymer hardeners or precursors thereof, s-triazine type polymer hardeners, glycidyl type polymer hardeners. Filming agents are used, and vinylsulfone type polymer hardening agents or precursors thereof, and dichlorotriazine type polymer hardening agents are particularly preferred.
本発明において高分子硬膜剤は、バイオセンサー表面に固定化されヒドロゲルを形成することを目的とする。それゆえ、反応性官能基以外に親水性基を有することが望ましい。親水性基として具体的には、水酸基・エチレングリコール基がごときノニオン性基、スルホン酸基・カルボン酸・リン酸基がごときアニオン性基、４級アンモニウム基・ピリジニウム基がごときカチオン性基、ホスホリルコリン基がごとき両性イオン基が挙げられる。 In the present invention, the polymer hardener is intended to be immobilized on the biosensor surface to form a hydrogel. Therefore, it is desirable to have a hydrophilic group in addition to the reactive functional group. Specific examples of hydrophilic groups include nonionic groups such as hydroxyl groups and ethylene glycol groups, anionic groups such as sulfonic acid groups, carboxylic acids, and phosphoric acid groups, and cationic groups such as quaternary ammonium groups and pyridinium groups. Examples include zwitterionic groups such as groups.
本発明において、親水性基を有するモノマー単位として、以下のようなモノマーが挙げられる。
ノニオン性基を有するモノマー：２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシ−３−クロロプロピルアクリレート、β−ヒドロキシエチル−β′−アクリロイルオキシエチルフタレート、１，４−ブチレングリコールモノアクリレート、ヒドロキシスチレン、アリルアルコール、メタアリルアルコール、イソプロペニルアルコール、１−ブテニルアルコール等。
アニオン性基を有するモノマー：ビニルスルホン酸、メタリルスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、スルホエチルメタクリレート、スチレンスルホン酸、アクリル酸、メタクリル酸、２−（ホスホノエチルオキシ）エチルメタクリレート等。
カチオン性基を有するモノマー：[２-(アクリロイルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウムクロリド、 [２−(メタクリロイルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウムクロリド等、
両性イオン基を有するモノマー： [２−(メタクリロイルオキシ)エチル] ジメチル−（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド 、［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ホスホリルコリン等。
In the present invention, examples of the monomer unit having a hydrophilic group include the following monomers.
Monomers having a nonionic group: 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, hydroxypropyl acrylate, hydroxypropyl methacrylate, 2-hydroxy-3-chloropropyl acrylate, β-hydroxyethyl-β′-acryloyloxyethyl phthalate, 1,4-butylene glycol monoacrylate, hydroxystyrene, allyl alcohol, methallyl alcohol, isopropenyl alcohol, 1-butenyl alcohol and the like.
Monomers having an anionic group: vinyl sulfonic acid, methallyl sulfonic acid, 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid, sulfoethyl methacrylate, styrene sulfonic acid, acrylic acid, methacrylic acid, 2- (phosphonoethyloxy) ethyl Methacrylate etc.
Monomers having a cationic group: [2- (acryloyloxy) ethyl] trimethylammonium chloride, [2- (methacryloyloxy) ethyl] trimethylammonium chloride, etc.
Monomers having zwitterionic groups: [2- (methacryloyloxy) ethyl] dimethyl- (3-sulfopropyl) ammonium hydroxide, [2- (methacryloyloxy) ethyl] phosphorylcholine and the like.
高分子硬膜剤にカチオン性基あるいはアニオン性基を導入することにより、静電相互作用を用いて、反対電荷を有する生理活性物質を検出表面へと濃縮することが可能となる。例えば、等電点より高いｐＨの緩衝液に溶解されたタンパク質の場合、カチオン性基を有する高分子硬膜剤が結合したヒドロゲル表面に静電的に濃縮されるため、効率的に反応性官能基と結合させることが可能となる。一方、等電点より低いｐＨの緩衝液に溶解されたタンパク質の場合、アニオン性基を有する高分子硬膜剤が結合したヒドロゲル表面に静電的に濃縮されるため、効率的に反応性官能基と結合させることが可能となる。 By introducing a cationic group or an anionic group into the polymer hardener, it is possible to concentrate a physiologically active substance having an opposite charge to the detection surface using electrostatic interaction. For example, in the case of a protein dissolved in a buffer solution having a pH higher than the isoelectric point, since the polymer hardener having a cationic group is electrostatically concentrated on the bonded hydrogel surface, the reactive functional It becomes possible to combine with a group. On the other hand, in the case of a protein dissolved in a buffer solution having a pH lower than the isoelectric point, it is electrostatically concentrated on the surface of the hydrogel to which a polymer hardener having an anionic group is bonded, so that the reactive functional group can be efficiently used. It becomes possible to combine with a group.
本発明において、バインディングマトリックスである高分子硬膜剤と金属表面との結合法については、公知の手法を用いることが可能である。本明細書中に以下に説明するような疎水性ポリマーを介してバインディングマトリックスを金属表面に結合する方法（特開２００４−２７１５１４号公報、特願２００４−２２５１３０号を参照））、特許文献１に開示されている、Ｘ−Ｒ−Ｙ（Ｘは金属に結合し、Ｙはバインディングマトリックスと結合する）の密に詰め込まれた単層を介してバインディングマトリックスを金属表面に結合する方法、などを適用することができる。好ましくは、末端に反応性基を有するアルカンチオール（あるいはその酸化体であるジスルフィド）を用いて金属表面に密な層を形成させた後、アルカンチオール末端の反応性基と高分子硬膜剤を反応させる結合法である。 In the present invention, a known method can be used as a method for bonding the polymer hardener as a binding matrix and the metal surface. Patent Document 1 discloses a method of binding a binding matrix to a metal surface via a hydrophobic polymer as described below in this specification (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-271514 and Japanese Patent Application No. 2004-225130). Application of the disclosed method of binding the binding matrix to the metal surface via a tightly packed monolayer of X-R-Y (where X is bound to the metal and Y is bound to the binding matrix) can do. Preferably, after forming a dense layer on the metal surface using alkanethiol having a reactive group at the terminal (or disulfide which is an oxidant thereof), the reactive group at the terminal of alkanethiol and the polymer hardener are used. It is a binding method to react.
本発明におけるバイオセンサー表面に対し生理活性物質を接触させることにより、高分子硬膜剤の反応性官能基と生理活性物質が共有結合するため、バイオセンサーに生理活性物質を固定化することが可能となる。また、バイオセンサー表面に対しアミノ酸溶液を接触させることにより、高分子硬膜剤の反応性官能基とアミノ酸のアミノ基が反応するため、結果的に反応性官能基がカルボン酸に変換される。カルボン酸を有するバイオセンサー表面は、公知の方法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化され、アミノ基を有する生理活性物質を固定化することが可能となる。カルボン酸を活性化する手法としては、特願２００４−２３８３９６号に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いて活性化することによりカルボン酸アミド基を形成する方法）、並びに特願２００４−２７５０１２号に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物でエステルとした後に、アミンと反応させることによりカルボン酸アミド基を形成する方法）を好ましく用いることもできる。 By bringing the bioactive substance into contact with the biosensor surface in the present invention, the reactive functional group of the polymer hardener and the bioactive substance are covalently bonded, so that the bioactive substance can be immobilized on the biosensor. It becomes. Further, when the amino acid solution is brought into contact with the biosensor surface, the reactive functional group of the polymer hardener and the amino group of the amino acid react with each other, and as a result, the reactive functional group is converted to carboxylic acid. The surface of a biosensor having a carboxylic acid is activated by a known method, for example, 1- (3-Dimethylaminopropyl) -3 ethylcarbodiimide (EDC) and N-Hydroxysuccinimide (NHS) which are water-soluble carbodiimides. The active substance can be immobilized. As a method for activating carboxylic acid, the method described in Japanese Patent Application No. 2004-238396 (that is, any of uronium salt, phosphonium salt, or triazine derivative having a specific structure for the carboxyl group present on the surface of the substrate) A method of forming a carboxylic acid amide group by activating with a compound) and a method described in Japanese Patent Application No. 2004-275012 (that is, a carboxyl group present on the surface of a substrate is activated with a carbodiimide derivative or a salt thereof) And then esterifying with a nitrogen-containing heteroaromatic compound having a hydroxyl group, a phenol derivative having an electron-withdrawing group or an aromatic compound having a thiol group, and then reacting with an amine to form a carboxylic acid amide group. The method of forming) can also be preferably used.
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。 The biosensor in the present invention is interpreted in the broadest sense, and means a sensor that measures and detects a target substance by converting an interaction between biomolecules into a signal such as an electrical signal. A normal biosensor is composed of a receptor site for recognizing a chemical substance to be detected and a transducer site for converting a physical change or chemical change generated therein into an electrical signal. In the living body, there are enzymes / substrates, enzymes / coenzymes, antigens / antibodies, hormones / receptors and the like as substances having affinity for each other. Biosensors use the principle that one of these substances having affinity with each other is immobilized on a substrate and used as a molecular recognition substance, thereby selectively measuring the other substance to be matched.
本発明のバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。 In the biosensor of the present invention, a metal surface or a metal film can be used as a substrate. The metal constituting the metal surface or metal film is not particularly limited as long as surface plasmon resonance can occur when, for example, a surface plasmon resonance biosensor is considered. Preferred examples include free electron metals such as gold, silver, copper, aluminum, and platinum, with gold being particularly preferred. These metals can be used alone or in combination. In consideration of adhesion to the substrate, an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal.
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。 Although the thickness of the metal film is arbitrary, for example, when considering use for a surface plasmon resonance biosensor, the thickness is preferably 0.1 nm to 500 nm, particularly preferably 1 nm to 200 nm. If it exceeds 500 nm, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. Moreover, when providing the intervening layer which consists of chromium etc., it is preferable that the thickness of the intervening layer is 0.1 to 10 nm.
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。 The metal film may be formed by a conventional method, for example, sputtering, vapor deposition, ion plating, electroplating, electroless plating, or the like.
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。 The metal film is preferably disposed on the substrate. Here, “arranged on the substrate” means that the metal film is arranged so as to be in direct contact with the substrate, and that the metal film is not directly in contact with the substrate, but through other layers. This also includes the case where they are arranged. As a substrate that can be used in the present invention, for example, when considering use for a surface plasmon resonance biosensor, generally, optical glass such as BK7, or synthetic resin, specifically, polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, polycarbonate A material made of a material transparent to laser light such as a cycloolefin polymer can be used. Such a substrate is preferably made of a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarized light and has excellent processability.
本発明において、生理活性物質の水酸基又はアミノ基と反応できる反応性官能基を有する親水性高分子は、金属層に、直接又は中間層を介して結合している。中間層としては、疎水性高分子化合物又は自己組織化膜から成る層などを使用することができる。以下、疎水性高分子化合物、及び自己組織化膜について説明する。 In the present invention, the hydrophilic polymer having a reactive functional group capable of reacting with a hydroxyl group or amino group of a physiologically active substance is bonded to the metal layer directly or via an intermediate layer. As the intermediate layer, a layer made of a hydrophobic polymer compound or a self-assembled film can be used. Hereinafter, the hydrophobic polymer compound and the self-assembled film will be described.
本発明で用いる疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。 The hydrophobic polymer compound used in the present invention is a polymer compound having no water absorption, and its solubility in water (25 ° C.) is 10% or less, more preferably 1% or less, most preferably 0.1% or less. It is.
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。 Hydrophobic monomers that form hydrophobic polymer compounds include vinyl esters, acrylic acid esters, methacrylic acid esters, olefins, styrenes, crotonic acid esters, itaconic acid diesters, and maleic acid diesters. , Fumaric acid diesters, allyl compounds, vinyl ethers, vinyl ketones and the like. The hydrophobic polymer compound may be a homopolymer composed of one type of monomer or a copolymer composed of two or more types of monomers.
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。 Examples of the hydrophobic polymer compound preferably used in the present invention include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, polymethyl methacrylate, polyester, and nylon.
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。 Coating of the hydrophobic polymer compound on the substrate can be performed by a conventional method, for example, spin coating, air knife coating, bar coating, blade coating, slide coating, curtain coating, spraying, vapor deposition, casting, It can be performed by an immersion method or the like.
浸漬法は、基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させた後に、前記疎水性高分子化合物溶液を含まない液に接触させる方法でコーティングを行う。好ましくは、疎水性高分子化合物溶液の溶剤と疎水性高分子化合物を含まない液の溶剤とは、同一の溶剤である。 In the dipping method, coating is performed by bringing the substrate into contact with a hydrophobic polymer solution and then bringing the substrate into contact with a liquid not containing the hydrophobic polymer solution. Preferably, the solvent of the hydrophobic polymer compound solution and the solvent of the liquid not containing the hydrophobic polymer compound are the same solvent.
浸漬法では、疎水性高分子化合物のコーティング用溶剤を適切に選択することで、基板の凹凸、曲率、形状などに依らず基板表面に均一なコーティング厚みの疎水性高分子化合物層が得られる。 In the dipping method, a hydrophobic polymer compound layer having a uniform coating thickness can be obtained on the surface of the substrate by appropriately selecting a solvent for coating the hydrophobic polymer compound, regardless of the unevenness, curvature, and shape of the substrate.
浸漬法のコーティング用溶剤は特に限定されず、疎水性高分子化合物の一部を溶解すれものであれば任意の溶剤を用いることができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のホルムアミド系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、フェノキシエタノール等のアルコール系溶剤、２−ブタノン等のケトン系溶剤、トルエン等のベンゼン系溶剤などを使用することができるが、これらに限定されない。 The coating solvent for the dipping method is not particularly limited, and any solvent can be used as long as it dissolves a part of the hydrophobic polymer compound. For example, a formamide solvent such as N, N-dimethylformamide, a nitrile solvent such as acetonitrile, an alcohol solvent such as phenoxyethanol, a ketone solvent such as 2-butanone, and a benzene solvent such as toluene can be used. However, it is not limited to these.
基板に接触させる疎水性高分子化合物の溶液は、疎水性高分子化合物が完全に溶解しても、疎水性高分子化合物の不溶解成分を含む懸濁液でもよい。液温は、疎水性高分子化合物の一部が溶解する液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を疎水性高分子化合物の溶液に接触させている間に液温を変動させても良い。溶液の疎水性高分子化合物濃度に特に制限はないが、好ましくは０．０１％以上３０％以下、さらに好ましくは０．１％以上１０％以下である。 The solution of the hydrophobic polymer compound to be brought into contact with the substrate may be either a completely dissolved hydrophobic polymer compound or a suspension containing an insoluble component of the hydrophobic polymer compound. The liquid temperature is not particularly limited as long as a part of the hydrophobic polymer compound is dissolved, but is preferably −20 ° C. or higher and 100 ° C. or lower. The liquid temperature may be varied while the substrate is in contact with the hydrophobic polymer compound solution. Although there is no restriction | limiting in particular in the hydrophobic polymer compound density | concentration of a solution, Preferably it is 0.01% or more and 30% or less, More preferably, it is 0.1% or more and 10% or less.
固体基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。 The time for bringing the solid substrate into contact with the hydrophobic polymer solution is not particularly limited, but is preferably 1 second to 24 hours, more preferably 3 seconds to 1 hour.
疎水性高分子化合物を含まない液としては、溶剤自身のＳＰ値（単位：(Ｊ／ｃｍ3)1/2）と疎水性高分子化合物のＳＰ値との差が、１以上２０以下であることが好ましく、３以上１５以下であることがさらに好ましい。ＳＰ値は、分子間の凝集エネルギー密度の平方根で表され、溶解度パラメーターとも呼ばれる。本発明では、ＳＰ値δは下記式で算出した。各官能基の凝集エネルギーＥｃｏｈとモル容積Ｖは、Ｆｅｄｏｒｓが規定した値を使用した（Ｒ．Ｆ．Ｆｅｄｏｒｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．、１４（２）、Ｐ１４７、Ｐ４７２（１９７４））。
δ＝（ΣＥｃｏｈ／ΣＶ）1/2
例として、疎水性高分子化合物および溶剤のＳＰ値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（１：１）：２１.０に対する溶剤２−フェノキシエタノール：２５.３、ポリメチルメタクリレート：２０.３に対する溶剤アセトニトリル：２２.９、ポリスチレン：２１.６に対する溶剤トルエン：１８.７である。
As the liquid not containing the hydrophobic polymer compound, the difference between the SP value of the solvent itself (unit: (J / cm 3 ) 1/2 ) and the SP value of the hydrophobic polymer compound is 1 or more and 20 or less. Preferably, it is 3 or more and 15 or less. The SP value is represented by the square root of the cohesive energy density between molecules and is also called a solubility parameter. In the present invention, the SP value δ is calculated by the following formula. As the cohesive energy Ecoh and the molar volume V of each functional group, values defined by Fedors were used (R. F. Fedors, Polym. Eng. Sci., 14 (2), P147, P472 (1974)).
δ = (ΣEcoh / ΣV) 1/2
By way of example, the SP values of hydrophobic polymer compounds and solvents are as follows: Polymethylmethacrylate-polystyrene copolymer (1: 1): for 21.0 Solvent 2-phenoxyethanol: 25.3, for Polymethylmethacrylate: 20.3 Solvent acetonitrile: 22.9, polystyrene: 21.6 with respect to polystyrene: 21.6.
基板を、疎水性高分子化合物を含まない液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。液温は、溶剤が液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を溶剤に接触させている間に液温を変動させてもよい。揮発させにくい溶剤を使用する場合、溶剤を除去する目的で、該溶媒に接触させた後、互いに溶解する揮発性溶剤で置換してもよい。 The time for contacting the substrate with the liquid not containing the hydrophobic polymer compound is not particularly limited, but is preferably 1 second or longer and 24 hours or shorter, more preferably 3 seconds or longer and 1 hour or shorter. The liquid temperature is not particularly limited as long as the solvent is in a liquid state, but is preferably −20 ° C. or higher and 100 ° C. or lower. The liquid temperature may be varied while the substrate is in contact with the solvent. When using a solvent that is difficult to volatilize, for the purpose of removing the solvent, the solvent may be replaced with a volatile solvent that dissolves each other after contacting the solvent.
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。 The coating thickness of the hydrophobic polymer compound is not particularly limited, but is preferably 0.1 nm to 500 nm, particularly preferably 1 nm to 300 nm.
次に、自己組織化膜について説明する。チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。本発明では、例えば、自己組織化化合物として、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。 Next, the self-assembled film will be described. Sulfur compounds such as thiols and disulfides spontaneously adsorb on a noble metal substrate such as gold to give an ultra-thin film of single molecular size. The aggregate is called a self-assembled film because it shows an arrangement depending on the crystal lattice of the substrate and the molecular structure of adsorbed molecules. In the present invention, for example, as a self-assembling compound, 7-carboxy-1-heptanethiol, 10-carboxy-1-decanethiol, 4,4′-dithiodibutylic acid, 11-hydroxy-1-undecanethiol, 11 -Amino-1-undecanethiol and the like can be used.
本発明のバイオセンサーにおいては、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味であり、さらに具体的には、「基板上にコーティングした化合物中の基板から最も遠い側」という意味である。 The biosensor of the present invention preferably has a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance on the outermost surface of the substrate. The “outermost surface of the substrate” herein means “the side farthest from the substrate”, and more specifically, “the side farthest from the substrate in the compound coated on the substrate”.
上記のようにして得られたセンサー用基板は、上記の一般式（A）中の官能基であるＹを介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。 The sensor substrate obtained as described above has a physiologically active substance bonded to the metal surface or metal film by covalently bonding the physiologically active substance via Y which is a functional group in the general formula (A). Can be immobilized.
本発明のセンサー用基板に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。 The physiologically active substance immobilized on the sensor substrate of the present invention is not particularly limited as long as it interacts with the measurement object. For example, immune proteins, enzymes, microorganisms, nucleic acids, low molecular organic compounds, non-immune proteins And immunoglobulin binding proteins, sugar binding proteins, sugar chains that recognize sugars, fatty acids or fatty acid esters, polypeptides or oligopeptides having ligand binding ability, and the like.
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。 Examples of immunity proteins include antibodies and haptens that use the measurement target as an antigen. As the antibody, various immunoglobulins, that is, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD can be used. Specifically, when the measurement target is human serum albumin, an anti-human serum albumin antibody can be used as the antibody. In addition, when using pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, ***e, heroin, cracks, etc. as antigens, for example, anti-atrazine antibodies, anti-kanamycin antibodies, anti-methamphetamine antibodies, or pathogenic E. coli Among them, antibodies against O antigens 26, 86, 55, 111, 157 and the like can be used.
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。 The enzyme is not particularly limited as long as it shows activity against the measurement object or a substance metabolized from the measurement object, and various enzymes such as oxidoreductase, hydrolase, isomerase , A desorbing enzyme, a synthesizing enzyme, etc. Specifically, if the measurement object is glucose, glucose oxidase can be used, and if the measurement object is cholesterol, cholesterol oxidase can be used. In addition, when pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, ***e, heroin, cracks, etc. are used as measurement objects, they exhibit specific reactions with substances metabolized from them, such as acetylcholinesterase. Enzymes such as catecholamine esterase, noradrenaline esterase and dopamine esterase can be used.
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
The microorganism is not particularly limited, and various microorganisms including Escherichia coli can be used.
As the nucleic acid, one that hybridizes complementarily with the nucleic acid to be measured can be used. As the nucleic acid, either DNA (including cDNA) or RNA can be used. The type of DNA is not particularly limited, and may be any of naturally derived DNA, recombinant DNA prepared by gene recombination technology, or chemically synthesized DNA.
Examples of the low-molecular organic compound include any compound that can be synthesized by an ordinary organic chemical synthesis method.
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
The non-immune protein is not particularly limited, and for example, avidin (streptavidin), biotin or a receptor can be used.
As the immunoglobulin-binding protein, for example, protein A or protein G, rheumatoid factor (RF) and the like can be used.
Examples of sugar-binding proteins include lectins.
Examples of the fatty acid or fatty acid ester include stearic acid, arachidic acid, behenic acid, ethyl stearate, ethyl arachidate, and ethyl behenate.
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。 The biosensor on which a physiologically active substance is immobilized as described above can be used for detection and / or measurement of a substance that interacts with the physiologically active substance.
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。 In the present invention, it is preferable to detect and / or measure the interaction between the physiologically active substance immobilized on the sensor substrate and the test substance by a non-electrochemical method. Non-electrochemical methods include surface plasmon resonance (SPR) measurement technology, quartz crystal microbalance (QCM) measurement technology, measurement technology using functionalized surfaces from gold colloidal particles to ultrafine particles.
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。 According to a preferred aspect of the present invention, the biosensor of the present invention can be used as a surface plasmon resonance biosensor characterized by including a metal film disposed on a transparent substrate, for example.
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。 The surface plasmon resonance biosensor is a biosensor used in the surface plasmon resonance biosensor, and includes a part that transmits and reflects light emitted from the sensor, and a part that fixes a physiologically active substance. And may be fixed to the main body of the sensor or may be removable.
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。 The phenomenon of surface plasmon resonance is due to the fact that the intensity of monochromatic light reflected from the boundary between an optically transparent substance such as glass and the metal thin film layer depends on the refractive index of the sample on the metal exit side. Yes, so the sample can be analyzed by measuring the intensity of the reflected monochromatic light.
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。 As a surface plasmon measuring device for analyzing the characteristics of a substance to be measured using a phenomenon in which surface plasmons are excited by light waves, an apparatus using a system called Kretschmann arrangement can be cited (for example, Japanese Patent Laid-Open No. 6-167443). See the official gazette). A surface plasmon measuring apparatus using the above system basically includes a dielectric block formed in a prism shape, for example, and a metal film formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with a substance to be measured such as a sample liquid. A light source that generates a light beam; an optical system that causes the light beam to enter the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at an interface between the dielectric block and the metal film; and It comprises light detecting means for detecting the surface plasmon resonance state, that is, the state of total reflection attenuation by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。 In order to obtain various incident angles as described above, a relatively thin light beam may be incident on the interface by changing the incident angle, or a component incident on the light beam at various angles is included. As described above, a relatively thick light beam may be incident on the interface in a convergent light state or a divergent light state. In the former case, a light beam whose reflection angle changes according to the change in the incident angle of the incident light beam is detected by a small photodetector that moves in synchronization with the change in the reflection angle, or the direction in which the reflection angle changes Can be detected by an area sensor extending along the line. On the other hand, in the latter case, it can be detected by an area sensor extending in a direction in which each light beam reflected at various reflection angles can be received.
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。 In the surface plasmon measuring apparatus having the above configuration, when a light beam is incident on a metal film at a specific incident angle that is greater than the total reflection angle, an evanescent wave having an electric field distribution is generated in the substance to be measured in contact with the metal film. The evanescent wave excites surface plasmons at the interface between the metal film and the substance to be measured. When the wave number vector of the evanescent light is equal to the wave number of the surface plasmon and the wave number matching is established, both are in a resonance state, and the light energy is transferred to the surface plasmon. The intensity of the reflected light decreases sharply. This decrease in light intensity is generally detected as a dark line by the light detection means. The resonance described above occurs only when the incident beam is p-polarized light. Therefore, it is necessary to set in advance so that the light beam is incident as p-polarized light.
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。 If the wave number of the surface plasmon is known from the incident angle at which this total reflection attenuation (ATR) occurs, that is, the total reflection attenuation angle (θSP), the dielectric constant of the substance to be measured can be obtained. In this type of surface plasmon measurement apparatus, as shown in Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-326194, in order to measure the total reflection attenuation angle (θSP) with high accuracy and a large dynamic range, It is considered to use detection means. This light detection means is provided with a plurality of light receiving elements arranged in a predetermined direction, and arranged so that different light receiving elements receive light beam components totally reflected at various reflection angles at the interface. Is.
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。 In that case, there is provided differential means for differentiating the light detection signals output from the light receiving elements of the arrayed light detection means with respect to the arrangement direction of the light receiving elements, and based on the differential value output by the differential means. In many cases, the total reflection attenuation angle (θSP) is specified to obtain a characteristic related to the refractive index of the substance to be measured.
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。 Moreover, as a similar measuring device using total reflection attenuation (ATR), for example, “Spectroscopic Research” Vol. 47, No. 1, (1998), pages 21 to 23 and pages 26 to 27 are described. Devices are also known. This leakage mode measuring device is basically a dielectric block formed in a prism shape, for example, a clad layer formed on one surface of the dielectric block, and formed on the clad layer to be in contact with the sample liquid. Optical waveguide layer to be generated, a light source for generating a light beam, and the light beam to the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at the interface between the dielectric block and the cladding layer. The optical system includes an incident optical system and light detection means for detecting the excitation state of the waveguide mode, that is, the total reflection attenuation state by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。 In the leakage mode measuring apparatus having the above-described configuration, when a light beam is incident on the cladding layer through the dielectric block at an incident angle greater than the total reflection angle, the light waveguide layer transmits a specific wave number after passing through the cladding layer. Only light having a specific incident angle having a wave length propagates in the waveguide mode. When the waveguide mode is excited in this way, most of the incident light is taken into the optical waveguide layer, resulting in total reflection attenuation in which the intensity of light totally reflected at the interface is sharply reduced. Since the wave number of guided light depends on the refractive index of the substance to be measured on the optical waveguide layer, knowing the specific incident angle at which total reflection attenuation occurs, the refractive index of the substance to be measured and the measurement object related thereto The properties of the substance can be analyzed.
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。 In this leakage mode measuring apparatus, the above-mentioned array-shaped light detecting means can be used to detect the position of the dark line generated in the reflected light due to the total reflection attenuation, and the above-described differentiating means is applied in conjunction therewith. Often done.
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。 In addition, the surface plasmon measurement device and the leakage mode measurement device described above may be used for random screening to find a specific substance that binds to a desired sensing substance in the field of drug discovery research. In this case, the thin film layer A sensing substance is fixed on the sensing substance on the sensing substance (a metal film in the case of a surface plasmon measuring apparatus, a clad layer and an optical waveguide layer in the case of a leakage mode measuring apparatus), and various analytes are placed on the sensing substance. A sample solution dissolved in a solvent is added, and the total reflection attenuation angle (θSP) is measured every time a predetermined time elapses.
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。 If the analyte in the sample liquid binds to the sensing substance, the refractive index of the sensing substance changes with time due to this binding. Therefore, by measuring the total reflection attenuation angle (θSP) every predetermined time and measuring whether or not the total reflection attenuation angle (θSP) has changed, the binding state of the analyte and the sensing substance is determined. It is possible to determine whether or not the analyte is a specific substance that binds to the sensing substance based on the result. Examples of the combination of the specific substance and the sensing substance include an antigen and an antibody, or an antibody and an antibody. Specifically, a rabbit anti-human IgG antibody can be immobilized on the surface of the thin film layer as a sensing substance, and a human IgG antibody can be used as the specific substance.
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。 Note that, in order to measure the binding state between the subject and the sensing substance, it is not always necessary to detect the angle of total reflection attenuation (θSP) itself. For example, a sample solution can be added to the sensing substance, and the amount of change in the total reflection attenuation angle (θSP) thereafter can be measured, and the binding state can be measured based on the magnitude of the amount of change in angle. If the above-described arrayed light detecting means and differentiating means are applied to a measuring apparatus using total reflection attenuation, the change amount of the differential value reflects the angle change amount of the total reflection attenuation angle (θSP). Therefore, the binding state between the sensing substance and the analyte can be measured based on the amount of change in the differential value (see Japanese Patent Application No. 2000-398309 by the present applicant). In such a measurement method and apparatus using total reflection attenuation, a sample liquid consisting of a solvent and an analyte is placed on a cup-shaped or petri-shaped measuring chip in which a sensing substance is fixed on a thin film layer formed in advance on the bottom surface. The amount of change in angle of the total reflection attenuation angle (θSP) described above is measured.
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。 Furthermore, a measuring apparatus using total reflection attenuation capable of measuring a large number of samples in a short time by sequentially measuring a plurality of measuring chips mounted on a turntable or the like is disclosed in JP-A-2001-2001. No. 330560.
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
When the biosensor of the present invention is used for surface plasmon resonance analysis, it can be applied as a part of various surface plasmon measurement devices as described above.
The following examples further illustrate the present invention, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
実施例１：
本実施例は、生理活性物質の水酸基又はアミノ基と反応できる反応性官能基を有する親水性高分子（高分子硬膜剤）を用いたセンサーチップの製造方法である。
（１）金表面基板の作製
縦８ｍｍ×横８０ｍｍ×厚さ０.５ｍｍのガラス基板に、平行平板型６インチ用スパッタ装置（アルバック（株）社製ＳＨ−５５０）を用いて基板上にクロムの厚さが１ｎｍ、
さらにクロム上に金の厚さが５０ｎｍになるようにスパッタ製膜を行った。この基板をModel-208UV-オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で３０分処理し、金表面基板を作製した。
Example 1:
The present example is a method for producing a sensor chip using a hydrophilic polymer (polymer hardener) having a reactive functional group capable of reacting with a hydroxyl group or amino group of a physiologically active substance.
(1) Production of Gold Surface Substrate Chrome on a substrate using a parallel plate type 6-inch sputtering apparatus (SH-550 manufactured by ULVAC, Inc.) on a glass substrate having a length of 8 mm, a width of 80 mm, and a thickness of 0.5 mm. The thickness of 1 nm,
Further, a sputter film was formed on chromium so that the thickness of gold was 50 nm. This substrate was treated with Model-208UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC.) For 30 minutes to produce a gold surface substrate.
（２）試料１（比較例）の作成
特許文献１に記載の方法を応用して、金表面にヒドロゲルを作成した。（１）で作成した金表面基板をペトリ皿（内径1６cm）中に置いた。5.0mMの11−ヒドロキシウンデカンチオール（同仁化学製）を溶解したエタノール／水（80/20）を表面に注いだ。ペトリ皿を40℃の振盪インキュベーターで20分間インキュベートした。表面を５×50mlの水、50mlのエタノール／水（80/20）、及び５×50mlの水で洗浄した。さらに、20mlの0.4M水酸化ナトリウム及び20mlのジエチレングリコールジメチルエーテル中2.0mlのエピクロロヒドリンの溶液に接触させた。25℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。表面を２×50mlのエタノール及び５×50mlの水で洗浄した。40.5mlの水に13.5gのデキストラン（T500,Pharmacia）を溶解し、4.5mlの1M水酸化ナトリウムを添加した溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に注いだ。次に25℃の振盪インキュベーターで20時間インキュベートした後、表面を15×50mlの50℃の水で洗浄した。ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解し、デキストラン処理表面に注ぎ、28℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした後、水洗した。さらにもう一度、上記のブロモ酢酸溶液による反応・28℃16時間インキュベート・水洗を繰り返すことで、試料１を得た。
(2) Preparation of Sample 1 (Comparative Example) A hydrogel was prepared on the gold surface by applying the method described in Patent Document 1. The gold surface substrate prepared in (1) was placed in a Petri dish (inner diameter 16 cm). Ethanol / water (80/20) in which 5.0 mM 11-hydroxyundecanthiol (manufactured by Dojin Chemical) was dissolved was poured onto the surface. The Petri dish was incubated for 20 minutes in a 40 ° C. shaking incubator. The surface was washed with 5 × 50 ml water, 50 ml ethanol / water (80/20), and 5 × 50 ml water. In addition, contact was made with a solution of 2.0 ml epichlorohydrin in 20 ml 0.4 M sodium hydroxide and 20 ml diethylene glycol dimethyl ether. The reaction was allowed to proceed for 4 hours in a shaking incubator at 25 ° C. The surface was washed with 2 × 50 ml ethanol and 5 × 50 ml water. 13.5 g dextran (T500, Pharmacia) was dissolved in 40.5 ml water and a solution with 4.5 ml 1 M sodium hydroxide added was poured onto the epichlorohydrin treated surface. Then, after incubation for 20 hours in a shaking incubator at 25 ° C., the surface was washed with 15 × 50 ml of 50 ° C. water. 3.5 g of bromoacetic acid was dissolved in 27 g of 2M sodium hydroxide solution, poured onto a dextran-treated surface, incubated for 16 hours in a shaking incubator at 28 ° C., and then washed with water. Sample 1 was obtained by repeating the reaction with the bromoacetic acid solution, incubation at 28 ° C. for 16 hours, and washing with water again.
（３）試料２の作成
（１）で作成した金表面基板をペトリ皿（内径16cm）中に置いた。4.0mMの8−ヒドロキシオクタンチオール（同仁化学製）および1.0mMの11−アミノウンデカンチオール（同仁化学製）を溶解したエタノール／水（80/20）を表面に注ぎ、ペトリ皿を40℃の振盪インキュベーターで20分間インキュベートした。表面を５×50mlの水、50mlのエタノール／水（80/20）、及び５×50mlの水で洗浄した。高分子硬膜剤P-6を１０質量％溶解したアルカリ溶液（pH１０．０、NaOHにより調整）を表面に注ぎ、ペトリ皿を６０℃の振盪インキュベーターで１６時間インキュベートした。表面を５×50mlの水で洗浄することで、試料２を得た。
(3) Preparation of Sample 2 The gold surface substrate prepared in (1) was placed in a Petri dish (inner diameter 16 cm). Pour ethanol / water (80/20) containing 4.0 mM 8-hydroxyoctanethiol (Dojindo) and 1.0 mM 11-aminoundecanethiol (Dojindo) on the surface and shake the Petri dish at 40 ° C. Incubated for 20 minutes in incubator. The surface was washed with 5 × 50 ml water, 50 ml ethanol / water (80/20), and 5 × 50 ml water. An alkaline solution (pH 10.0, adjusted with NaOH) in which 10% by mass of the polymer hardener P-6 was dissolved was poured onto the surface, and the Petri dish was incubated in a shaking incubator at 60 ° C. for 16 hours. Sample 2 was obtained by washing the surface with 5 × 50 ml of water.
（４）試料３の作成
試料２の高分子硬膜剤P-6を高分子硬膜剤P-10に変更した以外は同様の操作を行うことで、試料３を得た。
(4) Preparation of sample 3 Sample 3 was obtained by performing the same operation except that the polymer hardener P-6 of sample 2 was changed to the polymer hardener P-10.
（５）試料４の作成
１Mのグリシン水溶液（ｐH８．５、NaOHによりｐH調整）を、試料２と同様の操作で得られた表面に注ぎ、ペトリ皿を６０℃の振盪インキュベーターで１６時間インキュベートした。表面を５×50mlの水で洗浄することで、試料４を得た。
(5) Preparation of sample 4 1M glycine aqueous solution (pH 8.5, pH adjusted with NaOH) was poured onto the surface obtained by the same operation as sample 2, and the Petri dish was incubated for 16 hours in a shaking incubator at 60 ° C. . Sample 4 was obtained by washing the surface with 5 × 50 ml of water.
（６）試料５の作成
１Mのグリシン水溶液（ｐH８．５、NaOHによりｐH調整）を、試料３と同様の操作で得られた表面に注ぎ、ペトリ皿を６０℃の振盪インキュベーターで１６時間インキュベートした。表面を５×50mlの水で洗浄することで、試料５を得た。
(6) Preparation of Sample 5 A 1M aqueous glycine solution (pH 8.5, pH adjusted with NaOH) was poured onto the surface obtained in the same manner as Sample 3, and the Petri dish was incubated for 16 hours in a 60 ° C. shaking incubator. . Sample 5 was obtained by washing the surface with 5 × 50 ml of water.
（７）試料６の作成
１Mの５−アミノ吉草酸水溶液（ｐH８．５、NaOHによりｐH調整）を、試料２と同様の操作で得られた表面に注ぎ、ペトリ皿を６０℃の振盪インキュベーターで１６時間インキュベートした。表面を５×50mlの水で洗浄することで、試料６を得た。
(7) Preparation of Sample 6 1M 5-aminovaleric acid aqueous solution (pH 8.5, pH adjusted with NaOH) was poured onto the surface obtained in the same manner as Sample 2, and the Petri dish was shaken at 60 ° C. in a shaker incubator. Incubated for 16 hours. Sample 6 was obtained by washing the surface with 5 × 50 ml of water.
（８）試料７の作成
１Mの５−アミノ吉草酸水溶液（ｐH８．５、NaOHによりｐH調整）を、試料３と同様の操作で得られた表面に注ぎ、ペトリ皿を６０℃の振盪インキュベーターで１６時間インキュベートした。表面を５×50mlの水で洗浄することで、試料７を得た。
(8) Preparation of Sample 7 1M 5-aminovaleric acid aqueous solution (pH 8.5, pH adjusted with NaOH) was poured onto the surface obtained in the same manner as Sample 3, and the Petri dish was shaken at 60 ° C. in a shaker incubator. Incubated for 16 hours. Sample 7 was obtained by washing the surface with 5 × 50 ml of water.
実施例２
本実施例は、実施例１で得られたセンサーチップに対するニュートラルアビジン（PIERCE製）の固定化に関するものである。
実施例１で製造されたセンサーチップ１、４〜７に対し、0.4MのEDC（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide）および0.1MのNHS （N-Hydroxysuccinimide）を含む水溶液を３０分接触させ、次にHBS-Nバッファー（ビアコア社製、pH7.4）で洗浄した。なお、HBS-Nバッファーの組成は、ＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic Acid）0.01mol/l（ｐＨ7.4）、ＮａＣｌ 0.15mol/lである。次にセンサーチップ１〜７を本発明の表面プラズモン共鳴装置に設置した。センサーチップをセットする位置は、レーザー光の当たる中心位置が縦方向は中央に、横方向は端部から４０ｍｍの位置にセットした。チップ上にはポリプロピレン製の部材を被せることにより、幅（縦方向）１ｍｍ、長さ（横方法）７.５ｍｍ、深さ１ｍｍのセルを作成した。セル内をニュートラルアビジン溶液（１００μｇ／ｍｌ、HBS-Nバッファー）に置換し、３０分静置後、HBS-Nバッファーに置換した。以上の操作により、N-アビジンをセンサーチップ表面に共有結合で固定化した。NHSエステル化されたセンサーチップ１について、ニュートラルアビジンの添加前と添加後HBS-Nバッファー置換終了から３分後の共鳴シグナル（RU値）変化量を結合量の基準として、センサーチップ２〜７のニュートラルアビジンの添加前と添加後HBS-Nバッファー置換終了から３分後の共鳴シグナル（RU値）変化量（すなわちニュートラルアビジンの結合量）を、相対値で評価した。得られた結果を表１に示す。
Example 2
This example relates to the immobilization of neutral avidin (manufactured by PIERCE) to the sensor chip obtained in Example 1.
The sensor chips 1 and 4 to 7 manufactured in Example 1 were contacted with an aqueous solution containing 0.4 M EDC (1- (3-Dimethylaminopropyl) -3 ethylcarbodiimide) and 0.1 M NHS (N-Hydroxysuccinimide) for 30 minutes. And then washed with HBS-N buffer (Biacore, pH 7.4). The composition of the HBS-N buffer is HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid) 0.01 mol / l (pH 7.4) and NaCl 0.15 mol / l. Next, the sensor chips 1 to 7 were installed in the surface plasmon resonance apparatus of the present invention. The sensor chip was set at a center position where the laser light hits in the center in the vertical direction and 40 mm from the end in the horizontal direction. By covering the chip with a polypropylene member, a cell having a width (vertical direction) of 1 mm, a length (horizontal method) of 7.5 mm, and a depth of 1 mm was produced. The inside of the cell was replaced with a neutral avidin solution (100 μg / ml, HBS-N buffer), allowed to stand for 30 minutes, and then replaced with HBS-N buffer. Through the above operation, N-avidin was immobilized on the sensor chip surface by covalent bond. For NHS esterified sensor chip 1, before and after the addition of neutral avidin, the amount of change in resonance signal (RU value) 3 minutes after the end of HBS-N buffer replacement was used as a reference for the binding amount of sensor chips 2-7. The amount of change in the resonance signal (RU value) before and after the addition of neutral avidin and 3 minutes after the completion of HBS-N buffer substitution (ie, the binding amount of neutral avidin) was evaluated as a relative value. The obtained results are shown in Table 1.
実施例３
本実施例は、実施例２で得られたニュートラルアビジンが固定化されたセンサーチップ１〜７と、D-ビオチン（ナカライテスク製）との相互作用測定に関するものである。
実施例２の測定後、セル内をエタノールアミン・HCl溶液（１M、ｐH8.5）に置換し、ニュートラルアビジンと反応せずに残存した、活性化されたＣＯＯＨ基をブロックした。次に、セル内をD-ビオチン（１μｇ／ｍｌ、HBS-Nバッファー）に置換し、１０分間静置後、HBS-Nバッファーに置換した。
Example 3
This example relates to an interaction measurement between the sensor chips 1 to 7 on which neutral avidin obtained in Example 2 is immobilized and D-biotin (manufactured by Nacalai Tesque).
After the measurement in Example 2, the inside of the cell was replaced with an ethanolamine / HCl solution (1M, pH 8.5) to block activated COOH groups remaining without reacting with neutral avidin. Next, the inside of the cell was replaced with D-biotin (1 μg / ml, HBS-N buffer), allowed to stand for 10 minutes, and then replaced with HBS-N buffer.
センサーチップ１について、D-ビオチンの添加前と洗浄実施の３分後の共鳴シグナル（RU値）変化量を結合量の基準として、センサーチップ２〜７のD-ビオチンの添加前と洗浄実施の３分後の共鳴シグナル（RU値）変化量（すなわちD-ビオチンの結合量）を、相対値で評価した。得られた結果を表１に示す。 For sensor chip 1, the amount of change in resonance signal (RU value) before addition of D-biotin and 3 minutes after washing was used as a reference for the amount of binding, and before addition of D-biotin of sensor chip 2-7 and washing The amount of change in the resonance signal (RU value) after 3 minutes (that is, the amount of D-biotin bound) was evaluated as a relative value. The obtained results are shown in Table 1.
本実施例により、末端にアミノ基を有するアルカンチオールと末端に水酸基を有するアルカンチオールを用いて金属表面に密な層を形成させた後、アミノ基と高分子硬膜剤とを反応させるという極めて簡便、かつ、安全性に不安のあるエピクロロヒドリンやブロモ酢酸を用いることなく、N-アビジンを固定化可能なセンサーチップ２，３が得られることが証明された。さらに本センサーチップ表面の反応性官能基とアミノ酸を反応させ、EDC/NHSにより活性化することで、N-アビジンの固定量を増加させうることが証明された（センサーチップ４〜７）。アミノ酸としてグリシンを用いた場合（センサーチップ４，５）よりも、アミノ酸として5-アミノ吉草酸を用いた場合（センサーチップ６，７）を用いた方が、N-アビジンの固定量を増加効果が高く、比較例１（センサーチップ１）よりも多くのN-アビジンを固定化可能であることが証明された。 According to this example, after forming a dense layer on the metal surface using an alkanethiol having an amino group at the terminal and an alkanethiol having a hydroxyl group at the terminal, the amino group and the polymer hardener are reacted. It was proved that sensor chips 2 and 3 capable of immobilizing N-avidin could be obtained without using epichlorohydrin and bromoacetic acid, which are simple and uneasy about safety. Furthermore, it was proved that the amount of N-avidin immobilized can be increased by reacting the reactive functional group on the surface of the sensor chip with an amino acid and activating with EDC / NHS (sensor chips 4 to 7). When using glycine as the amino acid (sensor chips 4 and 5), using 5-aminovaleric acid as the amino acid (sensor chips 6 and 7) increases the amount of N-avidin immobilized. It was proved that more N-avidin could be immobilized than Comparative Example 1 (sensor chip 1).
これらの、N-アビジンを固定化したセンサーチップに対するD-ビオチンの結合量は、N-アビジンの固定量とほぼ比例したものであることから、本発明で得られたセンサーチップに固定化されたタンパク質は、低分子化合物に対する結合能を維持していることが証明された。
Since the amount of D-biotin bound to the sensor chip on which N-avidin is immobilized is substantially proportional to the amount of N-avidin immobilized, it was immobilized on the sensor chip obtained in the present invention. It has been demonstrated that the protein maintains its ability to bind low molecular weight compounds.
Claims (15)
The method according to claim 13 or 14, wherein a substance that interacts with a physiologically active substance is detected or measured by surface plasmon resonance analysis.
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