JP2006220551A - Microchip - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a microchip for continuously crushing, refining, and analyzing a cell for solving the problems, where too much time, cost, and labor are required for searching for optimum protein synthesis conditions by a conventional cell. <P>SOLUTION: The microchip has a microchannel for allowing fluid to flow, and a cell crushing section 1, a nickel chelate column 2, a dyeing section 3 by ALEXA488 of CAT protein, and a section 4 for detecting microchannel cataphoresis and protein at one portion of the microchannel. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本出願の発明は、細胞を用いてタンパク質を合成しようとする際、目的タンパク質の最適合成条件、合成効率、安定性などを迅速に判断することを可能にするマイクロチップに関するものである。   The invention of the present application relates to a microchip that makes it possible to quickly determine optimum synthesis conditions, synthesis efficiency, stability, and the like of a target protein when a protein is synthesized using cells.

我々の体を構成する細胞の中では数万というタンパク質がそれぞれ異なる機能を持って、お互いが影響しあいながらバランスを維持することで、体を健康に保っている。このように、タンパク質は細胞が生きるための全ての生命現象に関わっているため、医学や生命工学の分野においてタンパク質の機能を知り、それを応用した疾患の診断や治療法の研究が盛んに行われている。タンパク質の機能を調べる、あるいはそれを使った応用研究を行う方法としては、タンパク質が本来存在すべき場所、つまり細胞の中においたままで調べたいタンパク質を何らかの方法でラベリングして研究する方法（in vivo研究）とタンパク質を細胞の中から取り出して、精製した後、その性質を細胞の外から調べる方法（in vitro研究）がある。タンパク質をin vitroで研究するためには、対象となるタンパク質を他のタンパク質や細胞内在物質から分離し、精製する必要があり、細胞からいかに速く、効率よくタンパク質を合成し、精製できるかは、研究全体のスループットを左右する最重要要素の一つとなる。   In the cells that make up our bodies, tens of thousands of proteins have different functions and maintain their balance by maintaining balance while affecting each other. In this way, since proteins are involved in all life phenomena for the survival of cells, we know the function of proteins in the fields of medicine and biotechnology, and actively conduct research on disease diagnosis and treatment methods that apply them. It has been broken. As a method of investigating the function of a protein or conducting an applied research using it, a method of labeling and studying a protein to be examined in a place where the protein should originally exist, that is, in a cell (in vivo) Research) and protein are extracted from the cell, purified, and then examined from outside the cell (in vitro study). In order to study proteins in vitro, it is necessary to separate and purify the protein of interest from other proteins and cellular endogenous substances. How quickly and efficiently the protein can be synthesized and purified from the cell, This is one of the most important factors affecting the overall research throughput.

タンパク質の合成を行うための宿主細胞としては大腸菌や酵母など、タンパク質発現効率の良い細菌を使うことが最も一般的だが、発現させる目的タンパク質の性質によってはカイコ等の昆虫細胞や哺乳類の細胞を使う場合もある。また、近年は細胞の中からタンパク質を合成する因子のみを取りだしてタンパク質が合成できる無細胞タンパク質合成システムが考案され、タンパク質合成方法のバリエーションが増えている（非特許文献１〜３）。しかし、タンパク質の合成量と扱い安さ、そしてコストの安さから未だに大腸菌がタンパク質を大量に合成する際のファーストチョイスとなっている。   The most common host cells for protein synthesis are bacteria with high protein expression efficiency, such as Escherichia coli and yeast, but depending on the properties of the target protein to be expressed, insect cells such as silkworms and mammalian cells are used. In some cases. In recent years, cell-free protein synthesis systems capable of synthesizing proteins by extracting only factors that synthesize proteins from cells have been devised, and variations in protein synthesis methods are increasing (Non-Patent Documents 1 to 3). However, it is still the first choice when E. coli synthesizes a large amount of protein because of the amount of protein synthesis, ease of handling, and low cost.

一方、合成したタンパク質の精製は従来、タンパク質間の電気的性質や大きさの違いなどを利用してカラムなどで数週間を費やして行ってきたが、長い時間がかかる上に、種々の装置を使いこなせるだけの研究者のスキールと精製に伴うタンパク質の変性や収率の低下などが問題になっていた。そこで、遺伝子工学的な手法を駆使し、精製したいタンパク質の一部分にタグ(tag）といわれる、他のタンパク質と区別しやすい配列を予め挿入し、そのタグ配列を目印として数時間内に目的のタンパク質を細胞内から精製する技術が考案され、広く普及している（非特許文献４〜６）。   On the other hand, the purification of the synthesized protein has been performed by spending several weeks on a column using the electrical properties and size differences between proteins. Researchers who can use it well, such as squealing and protein denaturation and yield reduction, have become problems. Therefore, using genetic engineering techniques, insert a sequence called a tag, which is easily distinguishable from other proteins, into a part of the protein to be purified, and use the tag sequence as a marker within a few hours. Has been devised and widely used (Non-Patent Documents 4 to 6).

また、どの程度のタンパク質が細胞によって合成され、精製されてきたかを確認する方法としては、精製したタンパク質の一部を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、クマシー色素や蛍光試薬による染色（ＳＹＰＲＯ ｏｒａｎｇｅ、ＳＹＰＲＯ ｒｕｂｙ、ｃｙ、ＦＩＴＣなど）あるいは銀染色などでタンパク質を染色する方法があり、これによって精製したタンパク質が正しい大きさのものであるか、プロテアーゼなどによって分解はされていないかなどの情報が得られる（非特許文献７）。最近はこのＳＤＳ−ＰＡＧＥをマイクロ流路内（チップ上）で行うことで、染色や脱色にかかる時間を大幅に短縮することが可能となった（非特許文献８）。
スピリン（Ｓｐｉｒｉｎ、Ａ．）著、スプリンジャーベラーグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）、２００２年、ｐ１８３−１９６ 遠藤 弥重太、バイオインダストリー、２０００年、第１７巻、ｐ２０−２７ シミズら（Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ｙ．ｅｔ ａｌ．）、ネーチャバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）２００１年、第１９巻，ｐ７５１−７５５ ジャービックら（Ｊａｒｖｉｋ、Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．）、アニュアルレビュージェネティックス（Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）１９９８年、３２、６０１−６１８ イバンら（Ｅｖａｎ、Ｇ．ｅｔ ａｌ．）、モレキュラーセルラーバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９８５年、第５巻、ｐ３６１０−３６１６ ホップら（Ｈｏｐｐ、Ｔ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．）、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９８８年、第６巻，ｐ１２０５−１２１０ 大島ら、ポストシークエンスタンパク質実験法、東京化学同人、２００２年、第１巻、ｐ２−５ タブチら（Ｔａｂｕｃｈｉ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、アナリティカルケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００３年、第７５巻、ｐ３７９９−３８０５ As a method of confirming how much protein has been synthesized and purified by cells, a part of the purified protein is separated by electrophoresis (SDS-PAGE) and stained with Coomassie dye or fluorescent reagent (SYPRO). orange, SYPRO ruby, cy, FITC, etc.) or silver staining, etc., and there is a method of staining proteins, and information on whether the purified protein is of the correct size or has not been degraded by proteases, etc. Is obtained (Non-patent Document 7). Recently, by performing this SDS-PAGE in the microchannel (on the chip), it has become possible to significantly reduce the time required for staining and decolorization (Non-patent Document 8).
Spirin, A., Springer Verlag, 2002, p183-196. Yasuta Endo, Bioindustry, 2000, Vol. 17, p20-27 Shimizu et al., Nature Biotechnology 2001, Vol. 19, p751-755. Jarvik et al., Annual review of Genetics 1998, 32, 601-618. Ivan et al. (Evan, G. et al.), Molecular and Cellular Biology, 1985, Vol. 5, p3610-3616. Hopp, T.P. et al., Biotechnology, 1988, Vol. 6, p1205-1210. Oshima et al., Post Sequence Protein Experimental Method, Tokyo Chemical Doujin, 2002, Volume 1, p2-5 Tabuchi et al. (M. et al.), Analytical Chemistry, 2003, 75, p3799-3805.

タンパク質を細胞より合成する、また合成したタンパク質を細胞の中から取り出して精製する、精製したタンパク質がどの程度の量で、純度であるかを評価する手段は、それぞれ飛躍的に発展してきた。しかし、細胞の中で今まさに起こっているタンパク質合成の効率をリアルタイムで確認するには、合成タンパク質を細胞から取りだし、それを精製して、合成量や純度を評価する一連の連続した操作を短時間内に行う必要があり、これを満たす手段は未だに存在しない。   Means for evaluating the amount and purity of a purified protein that synthesizes a protein from a cell and that extracts and purifies the synthesized protein from the cell have been dramatically developed. However, to confirm in real time the efficiency of protein synthesis that is currently taking place in the cell, a series of sequential operations to remove the synthesized protein from the cell, purify it, and evaluate the amount and purity of the synthesis is short. There is still no way to meet this need.

生きた細胞の中で、人為的に合成されるタンパク質は時に細胞内の全タンパク質の数〜数十％を占めることもあり、細胞からしてみれば単なる異物である。そのため、タンパク質の合成効率は細胞固体によってまちまちであり、タンパク質合成に際しては、常に目的のタンパク質を最も効率よく合成する細胞固体を選別する必要がある。特に、大腸菌を用いたタンパク質合成においては同一種の大腸菌の中でも個体によって目的タンパク質の合成量が数倍も違うこともあるため、タンパク質の合成に最適な個体を選び出すことは非常に重要である。しかもこれは目的のタンパク質の種類や実験の諸条件よっても変化するため、実験を行う度に最適な固体を選別することが望ましい。また、大量の細胞を培養して多くのタンパク質を合成・精製しようとする際は、菌を培養する最中に目的タンパク質の合成程度を見極め、最もタンパク質合成の効率が良いタイミング（最高合成ポイント）を見計らって細胞を破砕、精製する必要がある。ここで「最高合成ポイント」とは、単なるタンパク質の合成量だけでなく、タンパク質が分解酵素などによって分解を受けない条件や最も高い比活性を保つ条件などもこれに含まれる。しかし、現状ではこれらの最適細胞固体の選別や最高合成ポイントの見極めは困難である。その理由としては、細胞内におけるタンパク質の合成量を確認するためには、その細胞を破砕し、目的タンパク質の精製を行った後に、電気泳動などを行う必要があり、そのためにはタンパク質の破砕に数時間、精製（タグを使った最短時間での精製としても）に数十分、電気泳動に１〜２時間、電気泳動後のタンパク質の可視化に数時間など、少なくとも半日〜数日間という時間がかかるためである。しかも、この方法では一度にハンドリング可能な試料の数はせいぜい数検体と、限界があり、そのスループットは非常に悪い。   Proteins that are artificially synthesized in living cells sometimes occupy several to several tens of percent of the total protein in the cell, and are just foreign matter from the viewpoint of the cell. For this reason, the protein synthesis efficiency varies depending on the cell solid. In protein synthesis, it is always necessary to select a cell solid that synthesizes the target protein most efficiently. In particular, in protein synthesis using E. coli, it is very important to select an optimal individual for protein synthesis because the synthesis amount of the target protein may vary several times among individuals of the same species of E. coli. In addition, since this varies depending on the type of target protein and various experimental conditions, it is desirable to select an optimal solid every time an experiment is performed. Also, when trying to synthesize and purify many proteins by culturing a large number of cells, determine the degree of synthesis of the target protein while culturing the fungus, and the best timing for protein synthesis (maximum synthesis point) It is necessary to crush and purify the cells. Here, the “maximum synthesis point” includes not only a simple protein synthesis amount but also a condition in which the protein is not degraded by a degrading enzyme or the like and a condition in which the highest specific activity is maintained. However, at present, selection of these optimal cell solids and determination of the highest synthesis point are difficult. The reason for this is that in order to confirm the amount of protein synthesized in the cell, it is necessary to crush the cell and purify the target protein, and then perform electrophoresis, etc. Times of at least half a day to several days, such as several hours, several tens of minutes for purification (even as the shortest time using a tag), 1-2 hours for electrophoresis, and several hours for visualization of proteins after electrophoresis This is because of this. Moreover, in this method, the number of samples that can be handled at one time is limited to several samples at most, and the throughput is very poor.

例え、最適細胞固体の選別はこの方法を用いて（時間をかけることで）できたとしても、最高合成ポイントの見極めはこの方法では到底無理（細胞の状態は刻々と変化していくため）であり、現状では見切りを付けて適当なタイミングで細胞を回収し、精製を行ってからその収率を確認するしかない状況にある。もし、目的のタンパク質を合成している最中に細胞内におけるタンパク質の合成量や純度を知ることができれば、タンパク質合成の効率を最適化することができるため、研究のスループットを向上させることが可能になる。また、細胞を用いたタンパク質の合成効率は培養温度、ｐＨ、培養時間、タンパク質合成誘導剤の添加時期や濃度、または誘導温度などによって大幅に変化するため、それらの条件を最適化することができれば、より多くの目的タンパク質を得ることができる。しかし、これらは現状では時間とコスト、労働力がかかりすぎるため、研究の大きなボトルネックとなっている。そこで、この出願の発明は、かかる現状を鑑みてなされたものであり、従来の細胞による最適なタンパク質合成条件探索の問題点（時間とコスト、そして労働力がかかりすぎる等）を解消できる、細胞の破砕と精製、そして分析を連続的に行うマイクロチップを提供することを課題としている。   Even if the optimal cell solids can be selected using this method (by taking time), it is impossible to determine the highest synthesis point (because the state of the cell changes every moment). At present, there is no choice but to confirm the yield after giving up and collecting the cells at an appropriate timing and purifying them. If the amount of protein synthesis and purity in the cell can be known while the target protein is being synthesized, the efficiency of protein synthesis can be optimized, thus improving research throughput. become. In addition, the efficiency of protein synthesis using cells varies greatly depending on the culture temperature, pH, culture time, addition timing and concentration of protein synthesis inducer, induction temperature, etc. If these conditions can be optimized, More target proteins can be obtained. However, these are currently the bottleneck of research because they take too much time, cost and labor. Therefore, the invention of this application has been made in view of such a current situation, and can solve the problems of searching for optimal protein synthesis conditions by conventional cells (such as time and cost, and excessive labor). It is an object to provide a microchip for continuously crushing, refining, and analyzing.

この出願の発明は、上記の課題を解決するため、まず第１に、液体を流すためのマイクロ流路が設けられ、その一部に細胞の破砕部とタンパク質精製部および精製タンパク質の分析部をそれぞれ有することを特徴とするマイクロチップを提供する。第２に、この出願の発明は、タンパク質精製部にアフィニティカラムを含み、精製タンパク質の分析部がマイクロ流路内での電気泳動装置であることを特徴とする請求項１記載のマイクロチップを提供する。第３に、この出願の発明は、該アフィニティカラムが金属のキレートカラムであること、第４に、該アフィニティカラムがＧＳＴカラムであること、第５に、該アフィニティカラムが抗体カラムであることを特徴とする請求項２記載のマイクロチップを提供する。   In order to solve the above problems, the invention of this application is firstly provided with a microchannel for flowing a liquid, and a cell crushing part, a protein purification part, and a purified protein analysis part are provided in a part thereof. Provided is a microchip characterized by having each of them. Second, the invention of this application provides the microchip according to claim 1, wherein the protein purification section includes an affinity column, and the analysis section of the purified protein is an electrophoresis apparatus in the microchannel. To do. Third, the invention of this application is that the affinity column is a metal chelate column, fourth, the affinity column is a GST column, and fifth, the affinity column is an antibody column. A microchip according to claim 2 is provided.

この発明の液体を流すためのマイクロ流路が設けられ、その一部に細胞破砕部とタンパク質の精製部および分析部をそれぞれ有するマイクロチップは、今まで別々に行われていた細胞の破砕や精製、分析といった各ステップを一枚のチップ上に集約することで、細胞によって合成されたタンパク質の量や純度をほぼリアルタイムで判ることが可能になる。マイクロ流路は空間を取らないため、１枚のチップ上に多数のマイクロ流路を設けることで、同時に多検体の解析が可能となり、タンパク質の合成に最適な細胞個体を選び出すためのスクリーニングが可能になる。また、細胞を集めてからその合成量を確認するまでの時間が１０〜２０分と非常に短いため、合成途中の様子をリアルタイムで判定し、最高合成ポイントにおける細胞の回収と精製が可能になる。これらの効果は、従来の細胞を用いたタンパク質合成に置いては大変な時間と手間がかかる、あるいは確認が不可能だったボトルネックを一気に広げるものであり、タンパク質研究のスループットを大幅に向上させるツールとなる。また、該マイクロチップを用いた解析は、使用する試薬や廃液の量を従来の技術に比べて遙かに減らせることで環境にも優しい解析法になることは言うまでもない。   The microchip provided with a microchannel for flowing the liquid of the present invention and having a cell crushing part, a protein purification part, and an analysis part in a part thereof, has been performed separately until now. By collecting each step such as analysis on a single chip, the amount and purity of the protein synthesized by the cells can be determined almost in real time. Since microchannels do not take up space, a large number of microchannels can be provided on a single chip, allowing simultaneous analysis of multiple specimens and screening to select the optimum individual cells for protein synthesis. become. In addition, since the time from collecting cells to confirming the amount of synthesis is as short as 10 to 20 minutes, it is possible to determine the state of synthesis in real time and to collect and purify cells at the highest synthesis point. . These effects greatly increase the throughput of protein research, as it expands the bottleneck, which takes a lot of time and effort, or could not be confirmed in protein synthesis using conventional cells. Become a tool. Moreover, it goes without saying that the analysis using the microchip becomes an environmentally friendly analysis method by greatly reducing the amount of reagent and waste liquid used compared to the conventional technology.

本発明は、好ましくは、タンパク質精製の方法としてタンパク質と精製媒体間の特異的なアフィニティを利用することで、一回の精製ステップによりクルードな細胞破砕物の中から目的のタンパク質のみを精製することができるようになると共に、マイクロ流路内で精製したタンパク質を電気泳動することにより、その量や分子量、分解の有無などを瞬時に判断できる効果を持つ。   The present invention preferably uses only specific affinity between the protein and the purification medium as a protein purification method to purify only the protein of interest from crude cell debris in a single purification step. In addition, it is possible to instantaneously determine the amount, molecular weight, presence / absence of degradation, etc. by electrophoresis of the purified protein in the microchannel.

本発明は、より好ましくは、アフィニティカラムの中でも特にヒスチジンタグと金属の間のキレートカラムや請求項３のＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）とグルタチオン間の特異的結合を利用したＧＳＴカラム、および／または、抗原−抗体結合を利用した抗体かラムなどを用いることで、非常に特異的に目的のタンパク質のみを精製することが可能になる。   More preferably, among the affinity columns, the present invention is particularly preferably a chelate column between a histidine tag and a metal, a GST column using the specific binding between GST (glutathione-S-transferase) and glutathione of claim 3, and / or Alternatively, it is possible to purify only the target protein very specifically by using an antibody or ram using antigen-antibody binding.

以上のように、該マイクロチップは細胞を用いたタンパク質の合成において、その合成条件を最適化させ、リアルタイムでのタンパク質の合成量や効率を判断できると共に、目的のタンパク質の合成に最も適した細胞固体を選別するツールとして用いることができるため、タンパク質を常に生産しその性質を調べる研究や産業用の目的でタンパク質を大量に生産する必要のある場合のタンパク質生産の再現性確保の必要性を満たすツールとして、その利用性が高い。   As described above, the microchip optimizes the synthesis conditions in protein synthesis using cells, can determine the amount and efficiency of protein synthesis in real time, and is most suitable for the synthesis of the target protein. Since it can be used as a tool for sorting solids, it meets the need to ensure the reproducibility of protein production when it is necessary to constantly produce proteins and study their properties or to produce large quantities of proteins for industrial purposes. As a tool, its utility is high.

本発明は、液体を流すためのマイクロ流路が設けられ、該マイクロ流路の一部に細胞破砕部とタンパク質精製部および精製タンパク質の分析部をそれぞれ有することを特徴とするマイクロチップである。   The present invention is a microchip characterized in that a microchannel for flowing a liquid is provided, and a cell crushing section, a protein purification section, and a purified protein analysis section are provided in part of the microchannel.

本発明における「マイクロチップ」の基材は特に限定されないが、例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰまたはＴＰＸ（登録商標））、ポリスチレン（ＰＳｔ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＡＢＳ樹脂、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、シリコン等の樹脂、それらの高分子化合物を含む共重合体あるいは複合体、石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、ソーダガラス、ホウ酸ガラス、ケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス類およびその複合体、表面を絶縁材料で被覆した金属およびその複合体、セラミックスおよびその複合体等が好ましく用いられる。本発明の「マイクロチップ」は「精製タンパク質の分析部」において、蛍光や吸光、発光等の光学的手段により分析をおこなうため、基板の透明度の高さや自家蛍光の低さ等が重要なポイントとなる場合があることから、中でも、基板にはＰＭＭＡ、ＰＣ、ＰＭＰ、ＰＤＭＳ、石英ガラスが特に好ましく用いられる。また、試料間のクロスコンタミネーションを防ぐ意味からは、チップは使い捨てが望ましいことから、安価に大量生産可能な樹脂製の基板が好ましく、従ってＰＭＭＡ、ＰＣ、ＰＭＰ等がさらに好ましく使用される。   The substrate of the “microchip” in the present invention is not particularly limited. For example, polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate (PC), polypropylene (PP), polyethylene (PE), polymethylpentene (PMP or TPX (registered trademark) )), Polystyrene (PSt), polytetrafluoroethylene (PTFE), ABS resin, polydimethylsiloxane (PDMS), a resin such as silicon, a copolymer or composite containing such a polymer, quartz glass, pyrex ( (Registered trademark) glass, soda glass, borate glass, silicate glass, borosilicate glass and the like and composites thereof, metal coated with an insulating material on the surface and composites thereof, ceramics and composites thereof are preferably used It is done. Since the “microchip” of the present invention performs analysis by optical means such as fluorescence, absorbance, and luminescence in the “purified protein analysis section”, the high transparency of the substrate and the low autofluorescence are important points. Among them, PMMA, PC, PMP, PDMS, and quartz glass are particularly preferably used for the substrate. Further, in order to prevent cross-contamination between samples, since the chip is desirably disposable, a resin substrate that can be mass-produced at low cost is preferable. Therefore, PMMA, PC, PMP, and the like are more preferably used.

また、本発明のマイクロチップの大きさは特に限定されないが、既存のマイクロチップ用の検出器、例えば日立製コスモアイ等の装置で、精製したタンパク質の蛍光強度、吸光度等が測定できる大きさであることが好ましい。また、作製したマイクロチップの大きさに合わせて検出器を設計することも可能である。   Further, the size of the microchip of the present invention is not particularly limited, but it is a size capable of measuring the fluorescence intensity, absorbance, etc. of the purified protein with an existing microchip detector, such as Hitachi Cosmo Eye. It is preferable. It is also possible to design a detector in accordance with the size of the manufactured microchip.

本発明のマイクロチップの製造方法は特に限定されず、上記の基材からなるチップ上に「試料解析チャンネル」が１個ないし複数設けられているものであれば良い。ここで「試料解析チャンネル」とは、液体を流すためのマイクロ流路が設けられ、該マイクロ流路の一部に細胞破砕部とタンパク質精製部および精製タンパク質の分析部をそれぞれ有することを特徴とするマイクロチップにおいて、「３つの機能部位」、即ち、「細胞破砕部」、「タンパク質精製部」、「精製タンパク質の分析部」がマイクロ流路によって繋がっている状態のものを意味する。本発明の「マイクロチップ」は目的のタンパク質を発現している細胞をチップ上で破砕して目的のタンパク質を細胞から分離し、その中から目的のタンパク質のみを連続的に精製、分析することを目的とするものである。従って、「試料解析チャンネル」における「３つの機能部位」は「細胞破砕部」、「タンパク質精製部」、「精製タンパク質の分析部」の順に試料が流れるように配置されている。本発明のマイクロチップの最も典型的で単純な形を図１に示す。   The manufacturing method of the microchip of the present invention is not particularly limited as long as one or more “sample analysis channels” are provided on the chip made of the above-described base material. Here, the “sample analysis channel” is characterized in that a micro flow channel for flowing a liquid is provided, and a cell disruption unit, a protein purification unit, and a purified protein analysis unit are respectively provided in a part of the micro flow channel. In the microchip, “three functional sites”, that is, “cell crushing section”, “protein purification section”, and “purified protein analysis section” are connected by a microchannel. The “microchip” of the present invention is to crush cells expressing the target protein on the chip to separate the target protein from the cells, and continuously purify and analyze only the target protein from the cell. It is the purpose. Accordingly, the “three functional sites” in the “sample analysis channel” are arranged so that the sample flows in the order of “cell disruption unit”, “protein purification unit”, and “purified protein analysis unit”. The most typical and simple form of the microchip of the present invention is shown in FIG.

本発明のマイクロチップ上で一度に処理できる試料の数は特に限定されないが、１〜５０検体が好ましく、５〜２０検体がより好ましい。従って、１枚のチップ上に「試料解析チャンネル」を複数設け、各チャンネルで異なる細胞やタンパク質の合成条件を同時に検討することにより、簡便かつ迅速に最適な合成条件を決定することができる。   The number of samples that can be processed at once on the microchip of the present invention is not particularly limited, but is preferably 1 to 50 samples, and more preferably 5 to 20 samples. Accordingly, by providing a plurality of “sample analysis channels” on one chip and simultaneously examining the synthesis conditions of different cells and proteins in each channel, the optimum synthesis conditions can be determined easily and rapidly.

本発明における「マイクロ流路」は、一般的なマイクロフルイディクス型チップを作製する方法で作成できるが、一般的なマイクロフルイディクス型チップは凹部を形成した板状の基材を別基材と接合して作製される。あるいは貫通したスリット形状を有する薄膜とこれを挟み込む少なくとも２つの基材によっても作製可能である。ここで「接合」とは、複数の基材を重ね合わせ、必要であればマイクロ流路から流体の漏れを起こさないようにする手法を指す。より具体的には、単純な重ね合わせ、プラズマ処理などによる表面活性化、加熱を伴う方法、圧力を印加する方法、電場を印加する方法、接着剤を用いる方法、溶剤を用いる方法、およびこれらの組み合わせがある。不可逆に接合するだけでなく、使用時に治具により押さえつける加圧方式によって接合を行うこともできる。ここで凹部の形成方法は基材としてガラス類を使用する場合はフォトファブリケーション技術により形成される。ここでフォトファブリケーション技術とは、フォトマスクのパターンを転写して複製を作成する技術のことをいう。一般的には、フォトレジストと呼ばれる感光性材料をメタルマスクを介して基板表面に塗布した後、光でパターンを転写し、転写した平面的パターンからエッチングなどにより立体的な形に加工する。エッチングの方法は、ウェットエッチングが好ましい。この時用いられるエッチャントは特に限定されないが、フッ酸系の溶液が一般的に使用される。また、樹脂を使用する場合は、金型を用いた一般的な成形方法が好適に利用され、例えば射出成形、押出成形、ブロー成形、真空成形が挙げられる。また、ホットプレスにより樹脂平板に金型のパターンを形成する方法も好適に用いられる。本発明の「マイクロ流路」は、試料を下流に運搬するための空間であり、各機能部位（細胞破砕部、タンパク質精製部、タンパク質分析部）間、あるいはチップと外部とを結ぶ細管である。好ましくは基材面上に加工された幅１０〜２００μｍ、深さは１〜１、０００μｍであるか、基材を貫通するように加工された直径１０μｍ以上、１ｍｍ以下の管形状であることが望ましいが、これに限定されるものではない。   The “microchannel” in the present invention can be created by a method of producing a general microfluidic chip, but a general microfluidic chip is a plate-like substrate in which a concave portion is formed as another substrate. It is made by bonding. Or it is producible also by the thin film which has the slit shape which penetrated, and at least 2 base material which pinches | interposes this. Here, “joining” refers to a technique in which a plurality of substrates are overlapped so that fluid leakage does not occur from the microchannel if necessary. More specifically, simple superposition, surface activation by plasma treatment, a method involving heating, a method of applying pressure, a method of applying an electric field, a method of using an adhesive, a method of using a solvent, and these There are combinations. In addition to irreversible bonding, bonding can also be performed by a pressurization method in which a jig is pressed during use. Here, the concave portion is formed by a photofabrication technique when glass is used as the substrate. Here, the photofabrication technique refers to a technique for transferring a photomask pattern to create a replica. In general, a photosensitive material called a photoresist is applied to a substrate surface through a metal mask, and then a pattern is transferred with light, and the transferred planar pattern is processed into a three-dimensional shape by etching or the like. The etching method is preferably wet etching. The etchant used at this time is not particularly limited, but a hydrofluoric acid-based solution is generally used. Moreover, when using resin, the general shaping | molding method using a metal mold | die is utilized suitably, for example, injection molding, extrusion molding, blow molding, and vacuum molding are mentioned. A method of forming a mold pattern on a resin flat plate by hot pressing is also preferably used. The “microchannel” of the present invention is a space for transporting a sample downstream, and is a thin tube connecting each functional part (cell crushing part, protein purification part, protein analysis part) or between the chip and the outside. . Preferably, the width is 10 to 200 μm and the depth is 1 to 1,000 μm processed on the substrate surface, or the tube shape is 10 μm or more and 1 mm or less processed to penetrate the substrate. Although desirable, it is not limited to this.

本マイクロチップにおける送液方法には、圧力、濃度、電場、磁場の差、あるいは勾配を利用する方法、表面力を利用する方法、慣性力を利用する方法およびこれらの組み合わせがあるがこれに限定されるものではない。圧力では加圧と減圧があり、ポンプやガスボンベ、加圧器、減圧器、落差などを組み合わせて流体を移動させることができる。電場には直流電場、交流電場、あるいは任意波形の電場を用いることができる。直流電場では電気浸透流、電気泳動を、交流電場では誘電泳動などの原理によって流体、あるいは流体の成分を移動させることができ、任意波形ではこれらの現象の組み合わせにより移動させることができる。磁場、あるいは電場によって流体にけん濁させた粒子を移動させ、その結果として流体を移動させることができる。表面力には毛管現象がある。流体と接する面を改質、加工するなどで表面力の差、あるいは勾配を形成し、流体の移動を制御することができる。慣性力を利用する場合には、チップ全体を遠心器に配置して利用する方法や、チップに一時的な加速度を与える方法がある。これらの組み合わせには、複数の手法を同時に行うものと、機能部位ごとにそれぞれ個別の移動方法を行うことができる。   The liquid feeding method in this microchip includes, but is not limited to, a method using pressure, concentration, electric field, magnetic field difference or gradient, a method using surface force, a method using inertial force, and a combination thereof. Is not to be done. The pressure includes pressurization and decompression, and the fluid can be moved by combining a pump, a gas cylinder, a pressurizer, a decompressor, a head, and the like. As the electric field, a DC electric field, an AC electric field, or an electric field having an arbitrary waveform can be used. In a DC electric field, an electroosmotic flow and electrophoresis can be moved by a principle such as dielectrophoresis in an AC electric field, and in an arbitrary waveform, it can be moved by a combination of these phenomena. Particles suspended in a fluid by a magnetic field or an electric field can be moved, and as a result, the fluid can be moved. There is a capillary phenomenon in the surface force. A surface force difference or gradient can be formed by modifying or processing the surface in contact with the fluid to control the movement of the fluid. When using the inertial force, there are a method of using the entire chip in a centrifuge, and a method of applying a temporary acceleration to the chip. For these combinations, a plurality of methods can be performed simultaneously, and an individual movement method can be performed for each functional part.

本発明において「細胞」とは目的のタンパク質を発現している状態であれば生死を問わない。細胞の種類は細胞壁がないか容易に破砕が可能な大腸菌や昆虫細胞または動物細胞が特に好ましいが、これに限定されるものではなく、例えば、酵母や植物細胞、ウイルスなど用いることも可能である。本発明における「細胞破砕部」とは目的のタンパク質を発現している細胞を破砕する部位であり、本発明における細胞の「破砕」とは細胞の表面である細胞壁や細胞膜のいずれまたは両方を溶解、変性、物理的摩擦などによって無くすか、表面に穴を開けることで細胞内在性のタンパク質を細胞外に放出させられるものを意味する。細胞の破砕には「細胞破砕剤」を用いるが、本発明において「細胞破砕剤」とはタンパク質、糖、脂質の分解酵素や超音波、界面活性剤、タンパク質変成剤、ガラスやセラミックからなるビーズなどが上げられるが、これに限定されるものではない。分解酵素には例えば、リゾチム、グルスラーゼ、グルカナーゼ、キナーゼ、リパーゼなどがあるが、これに限定されるものではない。界面活性剤としてはアニオン系としてデオキシコール酸、ドデシル硫酸（ＳＤＳ）、カチオン系として臭化セチルトリメチルアンモニウム、非イオン系としてＴｗｅｅｎ、ＢＲＩＪ、ＴＲＩＴＯＮ、ＭＥＧＡ、双性イオン系としてＣＨＡＳＯ、ＣＨＡＰＳ、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴなどが例挙できるが、これに限定されるものではない。タンパク質変成剤としては尿素、グアニジン、塩、熱、圧力、凍結などが挙げられるが、これに限定されるものではない。   In the present invention, the “cell” may be life or death as long as the target protein is expressed. The cell type is particularly preferably Escherichia coli, insect cells, or animal cells that have no cell wall or can be easily disrupted, but are not limited thereto, and for example, yeast, plant cells, viruses, etc. can also be used. . The “cell crushing part” in the present invention is a part that crushes cells expressing the target protein, and the “crushing” of the cell in the present invention dissolves either or both of the cell wall and the cell membrane on the surface of the cell. It means a substance that can be eliminated by denaturation, physical friction or the like, or can release intracellular endogenous protein by puncturing the surface. A “cell disrupting agent” is used for disrupting cells. In the present invention, “cell disrupting agent” means a protein, sugar, lipid-degrading enzyme, ultrasound, surfactant, protein denaturing agent, glass or ceramic beads. However, it is not limited to this. Examples of the degrading enzyme include, but are not limited to, lysozyme, gululase, glucanase, kinase, lipase and the like. As surfactants, anionic deoxycholic acid, dodecyl sulfate (SDS), cationic cetyltrimethylammonium bromide, nonionic Tween, BRIJ, TRITON, MEGA, zwitterionic CHASO, CHAPS, ZWITTERGENT, etc. Can be cited, but is not limited to this. Examples of protein denaturing agents include, but are not limited to, urea, guanidine, salt, heat, pressure, freezing and the like.

本発明の細胞の破砕は、上記に列挙した破砕剤の内１つないし複数を併用することで細胞を好ましくは１０分以内、更に好ましくは５分以内、更に好ましくは２分以内に６０％以上破砕できるものを意味する。本発明における「細胞破砕部」は空間体積として０．１〜１００μＬであることが好ましく、０．５〜５０μＬであることがより好ましい。０．１μＬ以下だと体積が小さすぎるため、破砕した細胞から得られる目的タンパク質の量が少なく、細胞破砕から精製タンパク質の検出部までの途中経路における目的タンパク質の吸着などからタンパク質の検出が困難となるため、また、１００μＬ以上だと目的タンパク質の量と共に副産物としての細胞の残骸の量も増え、下流の「タンパク質の精製部」における速やかなタンパク質精製を妨害やマイクロ流路の詰まりが起こりやすくなるため、それぞれ好ましくない。   The disruption of the cell of the present invention is preferably performed within 10 minutes, more preferably within 5 minutes, and even more preferably within 60 minutes within 60 minutes by using one or more of the above-mentioned disrupting agents in combination. It means something that can be crushed. The “cell disruption part” in the present invention is preferably 0.1 to 100 μL, more preferably 0.5 to 50 μL in terms of space volume. If the volume is less than 0.1 μL, the volume is too small, so the amount of target protein obtained from the disrupted cells is small, and it is difficult to detect the protein due to adsorption of the target protein on the way from cell disruption to the purified protein detection part. Therefore, if the amount is 100 μL or more, the amount of cell debris as a by-product increases with the amount of the target protein, and prompt protein purification in the downstream “protein purification section” is likely to be disturbed and the microchannel is likely to be clogged. Therefore, it is not preferable respectively.

本発明において「タンパク質精製部」は細胞を細胞破砕剤によって破砕して得た細胞抽出物から目的のタンパク質を「精製」する機能部位であり、本発明における「精製」とは目的タンパク質の濃度を質量比（目的タンパク質の質量：目的タンパク質以外のタンパク質の質量）で少なくとも７０％以上にすることを指す。   In the present invention, the “protein purification part” is a functional site that “purifies” a target protein from a cell extract obtained by disrupting cells with a cell disrupting agent. In the present invention, “purification” refers to the concentration of the target protein. The mass ratio (mass of target protein: mass of protein other than the target protein) means at least 70% or more.

本発明のマイクロチップは、好ましくは、タンパク質精製部にアフィニティカラムを含む。   The microchip of the present invention preferably includes an affinity column in the protein purification section.

本発明のマイクロチップにおいて、好ましく用いられる「アフィニティカラム」について説明する。「アフィニティカラム」とは、金属イオンや、抗原、抗体、ヘパリン、ストレプトアビジン、ビオチン、ベンザミジン、グルタチオン、アルギニン、カルモジュリン、ゼラチン、リジン、マンノース、ＤＮＡ、２’５’アデノシン２リン酸、核酸、酵素基質、酵素阻害剤などのアフィニティ活性を持つ物質をガラス、アガロース、シリカ、アクリルアミドなどからなるビーズやＰＶＤＦ膜、セルロース膜、磁性を持つビーズやフィルムなどの「担体」に固相化したものを意味する。   The “affinity column” that is preferably used in the microchip of the present invention will be described. “Affinity column” means metal ion, antigen, antibody, heparin, streptavidin, biotin, benzamidine, glutathione, arginine, calmodulin, gelatin, lysine, mannose, DNA, 2′5 ′ adenosine diphosphate, nucleic acid, enzyme Means substances that have affinity activity, such as substrates and enzyme inhibitors, immobilized on beads such as glass, agarose, silica, acrylamide, etc., PVDF membranes, cellulose membranes, magnetic beads and films. To do.

本発明におけるアフィニティカラムの「担体」はもちろん上記に限るものではなく、上記のアフィニティ活性を持つ物質を物理的、あるいは共有結合によって表面に保持できるものであればよい。担体の形状もビーズや膜あるいはフィルム状に限るものではなく、例えば、スポンジ形状や繊維形状を形成する材料によっても成し遂げられる。繊維形状を形成する担体の材料としては例えば、ナイロン、シルク、アミロイド繊維などが挙げられるが、これに限るものではない。本発明におけるアフィニティカラムによる目的タンパク質の精製原理は、目的タンパク質の種類によって異なるが、例えば、金属とのキレート作用や抗原−抗体反応、糖鎖−レクチン結合、酵素とその酵素の阻害剤間の特異結合反応、核酸とタンパク質間の特異的結合反応、ＧＳＴ−グルタチオン結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合など、目的タンパク質が持つ特異的な性質を利用して目的タンパク質をアフィニティカラムに結合させることで、目的タンパク質以外を除去することで行う。もちろん、目的タンパク質と精製媒体間のアフィニティの種類は上記に限定されるものではない。本発明のマイクロチップでは、特に、該アフィニティカラムが金属のキレートカラム、ＧＳＴカラム、または、抗体カラムであることが好ましい。   Of course, the “carrier” of the affinity column in the present invention is not limited to the above, and any substance can be used as long as the substance having the affinity activity can be physically or covalently held on the surface. The shape of the carrier is not limited to a bead, membrane, or film, and can be achieved by, for example, a material that forms a sponge shape or a fiber shape. Examples of the material for the carrier that forms the fiber shape include nylon, silk, amyloid fiber, and the like, but are not limited thereto. The purification principle of the target protein using the affinity column in the present invention varies depending on the type of the target protein. For example, chelation with a metal, antigen-antibody reaction, sugar chain-lectin bond, and specificity between an enzyme and an inhibitor of the enzyme. By binding the target protein to the affinity column using specific properties of the target protein such as binding reaction, specific binding reaction between nucleic acid and protein, GST-glutathione bond, biotin-streptavidin bond, etc. This is done by removing the other items. Of course, the type of affinity between the target protein and the purification medium is not limited to the above. In the microchip of the present invention, it is particularly preferable that the affinity column is a metal chelate column, a GST column, or an antibody column.

本発明の「タンパク質精製部」は、例えば、０．０１〜１０mｇの目的タンパク質が結合できるアフィニティカラムをチップ上の「細胞破砕部」と「精製タンパク質の分析部」の間に設けることで作製できる。形状はどのようなものでも良いが、目的タンパク質の結合が効率よく行われることが望ましいことから試料が流れる同方向にある程度の長さを持つことが望ましい。しかし、長すぎると試料の流れが悪くなり、流圧を上げる原因になるため、本発明における「タンパク質精製部」の形状や長さはこれらの要素を考慮して適宣選択する必要がある。例えば、平均粒径３０mｍの磁性を持つビーズ上にニッケルを保持したアフィニティカラムの場合、カラムの形状が直線形状であれば、少なくともその幅と深さはビーズの平均粒径である３０mｍ以上であることが好ましく、試料が流れる際の流圧を考慮すると６０mｍ以上が望ましい。しかし、カラムの幅と深さがあまり広いと、目的タンパク質（この場合はヒスチジンタグ融合タンパク質）がカラム上のニッケル金属と触れ合う（結合する）時間が短くなるため、精製の効率が低下するおそれがあるので３００mｍ以下に設定することが望ましい。   The “protein purification part” of the present invention can be produced, for example, by providing an affinity column capable of binding 0.01 to 10 mg of the target protein between the “cell disruption part” and the “purified protein analysis part” on the chip. . Any shape may be used, but it is desirable that the target protein has a certain length in the same direction in which the sample flows because it is desirable that the target protein be bound efficiently. However, if the length is too long, the flow of the sample is deteriorated and the flow pressure is increased. Therefore, the shape and length of the “protein purification section” in the present invention must be appropriately selected in consideration of these factors. For example, in the case of an affinity column holding nickel on magnetic beads with an average particle size of 30 mm, if the column shape is a linear shape, at least the width and depth are 30 mm or more, which is the average particle size of the beads. In consideration of the flow pressure when the sample flows, it is preferably 60 mm or more. However, if the width and depth of the column are too wide, the time required for the target protein (in this case, the histidine tag fusion protein) to contact (bond) with the nickel metal on the column will be shortened, which may reduce the efficiency of purification. Therefore, it is desirable to set it to 300 mm or less.

「タンパク質精製部」を設ける際は、アフィニティカラムの精製媒体が下流に流れないようせき止める構造が好ましい。このせき止め構造は、精製媒体がビーズである場合は「タンパク質精製部」から「精製タンパク質の分析部」に抜ける出口の構造をビーズの平均球形より狭くすることで成し遂げられる。また、磁性を持つビーズを利用する際はチップの外部から磁石によってビーズをタンパク質精製部の中に滞在させる方法も考えられる。   When providing a “protein purification part”, a structure that prevents the purification medium of the affinity column from flowing downstream is preferable. When the purification medium is a bead, this damming structure can be achieved by making the structure of the exit from the “protein purification part” to the “purified protein analysis part” narrower than the average spherical shape of the beads. In addition, when using magnetic beads, a method of allowing the beads to stay in the protein purification unit with a magnet from the outside of the chip is also conceivable.

本発明におけるマイクロチップでは、好ましくは、アフィニティカラムは、金属のキレートカラムである。
In the microchip of the present invention, the affinity column is preferably a metal chelate column.

本発明において好ましく用いられる「金属のキレートカラム」とは、精製媒体としてニッケル、亜鉛、銅、コバルト、バナジウムなどの２価以上の金属イオンを担体に固定化したものを意味し、これによって精製可能なタンパク質としては「ヒスチジンタグ」を有するタンパク質やリン酸の修飾を受けたタンパク質など、金属と特異的に結合するタンパク質が挙げられる。ここで「ヒスチジンタグ」は、産物であるタンパク質の一部の配列に少なくとも６個以上のヒスチジン残基が一次配列上で連続するあるいは３次構造的に集合しているものを指し、その作製は遺伝子レベルで目的タンパク質を発現する遺伝子の一部に上記のヒスチジンをコードする配列を融合して発現することより成し遂げられる。「ＧＳＴカラム」とは精製媒体上にグルタチオンが固定化されているもの、また「抗体かラム」とは精製媒体上に抗体の全長またはその一部または抗体類似体として生体から作られる抗体以外でも抗原となる物質を特異的に認識できる生体由来または人工的な化合物を指し、例えば、抗体の抗原認識部位だけを遺伝子組み替えによって改変して得られる単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）やアフィボディー（ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））などが挙げられる。この抗体類似体の取得方法としては遺伝子組み替えによって抗体類似体を発現するプラスミドを作製し、大腸菌や酵母、昆虫、動物、植物等の細胞、または細胞を用いない無細胞タンパク質合成系を用いて生産し、精製する方法や抗体をタンパク質分解酵素等で切断し、その一部を精製して使う方法、また抗体類似体がタンパク質で無い場合は化学合成による合成等が考えられる。   The “metal chelate column” preferably used in the present invention means a column in which a divalent or higher metal ion such as nickel, zinc, copper, cobalt, vanadium, etc., is immobilized on a carrier as a purification medium. Examples of such proteins include proteins that specifically bind to metals, such as proteins having a “histidine tag” and proteins modified with phosphate. Here, the “histidine tag” refers to a sequence in which at least 6 or more histidine residues are continuous on the primary sequence or are tertiary-structured in a partial sequence of the product protein. This is accomplished by fusing and expressing the above-mentioned sequence encoding histidine to a part of the gene that expresses the target protein at the gene level. “GST column” means that glutathione is immobilized on a purification medium, and “antibody or ram” means other than an antibody produced from a living body as a full length or a part of an antibody or an antibody analog on a purification medium. This refers to a biologically derived or artificial compound that can specifically recognize a substance that becomes an antigen. For example, a single chain antibody or affibody obtained by modifying only the antigen recognition site of an antibody by genetic recombination. (Registered trademark)). As a method for obtaining this antibody analog, a plasmid that expresses the antibody analog is prepared by gene recombination and produced using cells such as Escherichia coli, yeast, insects, animals, plants, or a cell-free protein synthesis system that does not use cells. Then, a purification method, a method in which the antibody is cleaved with a proteolytic enzyme and a part thereof is purified and used, and if the antibody analog is not a protein, synthesis by chemical synthesis or the like can be considered.

本発明における「精製タンパク質の分析部」とは「タンパク質精製部」より精製した目的タンパク質を検出し、定量することで、目的タンパク質の量や精製度、または細胞内における分解度などを判定する機能部位である。分析の手法は目的タンパク質の定量が可能なものであれば良く、全タンパク質の定量が可能なＢｒａｄｆｏｒｄ法やＬｏｗｒｙ法、抗体を用いたＥＬＩＳＡなどの免疫染色、質量分析による精製タンパク質の質量解析、電気泳動法などが挙げられるが、これに限るものではない。   The “purified protein analysis section” in the present invention is a function for detecting the target protein purified from the “protein purification section” and quantifying it, thereby determining the amount and the degree of purification of the target protein or the degree of degradation in the cell. It is a part. The analysis method is not limited as long as the target protein can be quantified. The Bradford method and Lowry method, which can quantitate the total protein, immunostaining such as ELISA using antibodies, mass analysis of purified protein by mass spectrometry, electricity Examples include, but are not limited to, electrophoresis.

本発明のマイクロチップは、好ましくは、精製タンパク質の分析部がマイクロ流路内での電気泳動装置である。本発明における「マイクロ流路内での電気泳動」とは「タンパク質精製部」で精製した目的のタンパク質を大きさやその電気的性質の違いによって分離できればどのような形態のものでも良く、具体的な方法としては、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、検出部分のマイクロ流路をキャピラリーとして用いたキャピラリー電気泳動、等電点電気泳動などが挙げられる。マイクロ流路内での電気泳動を行うための媒体は固体状、ゲル状、ゾル状、溶液状のいずれかの形状であり、アクリルアミドやポリエチレングリコールなどのポリマーやｐＨを振った緩衝液などが考えられるが、これに限るものではない。ＰＡＧＥは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥやＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを使用することができる。本発明で特に好ましく用いられるのはＳＤＳ−ＰＡＧＥである。具体的な方法としては、タンパク質合成槽からマイクロ流路を通り搬送されてきたタンパク質溶液に、尿素、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、２−メルカプトエタノールなどを加えてタンパク質を変性させ、さらにマイクロ流路でＰＡＧＥを行うことで達成される。なお、タンパク検出部分に充填するゲルの組成は、一般的なＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いられるゲル組成であれば問題ない。ただし、合成ターゲットとなるタンパク質の分子量に合わせてアクリルアミド濃度を変えることが好ましい。具体的には、アクリルアミド濃度をタンパク質の分子量が５万〜１０万のときは７．５％程度、３万〜７万の時は１０％程度、１万〜４万の時は１５％程度にすることが好ましい。また、このゲルに低濃度のメチルセルロースを加えることも好ましい。   The microchip of the present invention is preferably an electrophoresis apparatus in which the purified protein analysis section is in a microchannel. In the present invention, “electrophoresis in a microchannel” may be of any form as long as the target protein purified by the “protein purification unit” can be separated according to the difference in size and electrical properties. Examples of the method include agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), capillary electrophoresis using a detection portion microchannel as a capillary, and isoelectric focusing. The medium for electrophoresis in the microchannel can be any of solid, gel, sol, and solution, such as polymers such as acrylamide and polyethylene glycol, and buffered solutions with varying pH. However, it is not limited to this. PAGE can use SDS-PAGE and Native-PAGE. Particularly preferably used in the present invention is SDS-PAGE. Specifically, the protein is denatured by adding urea, SDS (sodium dodecyl sulfate), 2-mercaptoethanol, etc. to the protein solution transported from the protein synthesis tank through the microchannel, and further the microchannel. This is achieved by performing PAGE. In addition, if the composition of the gel with which a protein detection part is filled is a gel composition used for general SDS-PAGE, there is no problem. However, it is preferable to change the acrylamide concentration according to the molecular weight of the protein to be synthesized. Specifically, the acrylamide concentration is about 7.5% when the molecular weight of the protein is 50,000 to 100,000, about 10% when the molecular weight is 30,000 to 70,000, and about 15% when the molecular weight is 10,000 to 40,000. It is preferable to do. It is also preferable to add a low concentration of methylcellulose to this gel.

マイクロ流路内での電気泳動によって目的タンパク質を検出するためにはタンパク質を電気泳動する前に予め染色しておく必要がある。この精製したタンパク質の染色とは、後の検出操作での感度を向上させることを目的として、信号を増幅させる染色物質により精製したタンパク質を標識することを指す。このタンパク質の標識は、タンパク質精製部で精製したタンパク質を染色のために特別に設けた染色槽で染色する方法やタンパク質の精製部において目的タンパク質がアフィニティカラムに結合している状態で染色を行う方法、または細胞破砕部において細胞を破砕した直後に全てのタンパク質を染色してから精製を行う方法などが考えられる。タンパク質を染色する染色試薬としては、後の検出部でタンパク質を認識できるものであればよく、例えば蛍光標識試薬、放射同位元素標識試薬、発光標識試薬等が好適に用いられる。簡便に標識可能で、取り扱いも容易であり、さらには種類が豊富であることから、蛍光標識試薬が好ましく用いられる。蛍光染色に用いる蛍光色素としては、タンパク質への蛍光標識が可能なもの、すなわちタンパク質のアミノ基（−ＮＨ_２）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、あるいはスルフヒドリル基（−ＳＨ）を標識できる試薬が好ましい。アミノ基を標識する試薬としては、イソチオシアネート基、ニトロアリールハライド基、酸クロリド、活性エステルなどを反応活性基とする蛍光物質が、カルボキシル基を標識する試薬としては、ブロモメチル基を反応活性基とする蛍光物質が、スルフヒドリル基を標識する試薬としては、マレイミド基、アリールハライド基などを反応活性基とする蛍光物質がそれぞれ好適に用いられる。本発明においては、タンパク質溶液と混合するだけで短時間で蛍光ラベルできるという簡便さが必要とされることから、例えばＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｔａｎｇｅｒｉｎｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）、ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等が特に好適に用いられる。特に、目的のタンパク質がタグを有する場合はそのタグを標識することで、より特異的に目的タンパク質のみを検出することができる。例えば、ヒスチジンタグを有するタンパク質の標識にはＰｒｏ−Ｑ（登録商標）ｓａｐｐｈｉｒｅを用いることができる。なお、溶液中に存在するタンパク質すべてを蛍光標識するには、過剰量の蛍光色素を反応させる必要があり、この場合未反応の蛍光色素が残存することが考えられるが、蛍光色素の分子量はタンパク質と比較して概して小さいため、後の検出操作により標識されたタンパク質と容易に区別できる。なお、例えばＧｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）のような、蛍光を有するタンパク質が目的タンパク質である場合は、ここで示した標識操作を省略することができる。 In order to detect a target protein by electrophoresis in a microchannel, it is necessary to stain the protein in advance before electrophoresis. The purification of the purified protein refers to labeling the purified protein with a staining substance that amplifies a signal for the purpose of improving sensitivity in a subsequent detection operation. This protein labeling is performed by staining the protein purified by the protein purification section in a staining tank specially provided for staining, or by staining the target protein bound to the affinity column in the protein purification section. Alternatively, a method of performing purification after staining all proteins immediately after crushing cells in a cell crushing part can be considered. The staining reagent for staining the protein is not particularly limited as long as it can recognize the protein in the subsequent detection unit, and for example, a fluorescent labeling reagent, a radioisotope labeling reagent, a luminescent labeling reagent and the like are preferably used. Fluorescent labeling reagents are preferably used because they can be easily labeled, are easy to handle, and are rich in variety. As a fluorescent dye used for fluorescent staining, a reagent capable of labeling a protein, that is, a reagent capable of labeling an amino group (—NH ₂ ), a carboxyl group (—COOH), or a sulfhydryl group (—SH) of a protein is preferable. . As a reagent for labeling an amino group, a fluorescent substance having a reactive group such as an isothiocyanate group, a nitroaryl halide group, an acid chloride, or an active ester is used. As a reagent for labeling a carboxyl group, a bromomethyl group is used as a reactive group. As the reagent for labeling the sulfhydryl group, a fluorescent material having a maleimide group, an aryl halide group or the like as a reactive group is preferably used. In the present invention, since it is necessary to be able to fluorescently label in a short time just by mixing with a protein solution, for example, SYPRO (registered trademark) Orange (Molecular Probe), SYPRO (registered trademark) Red (Molecular) Probe), SYPRO (registered trademark) Ruby (Molecular Probe), SYPRO (registered trademark) Tangerine (Molecular Probe), NanoOrange (registered trademark) (Molecular Probe), Cy2, Cy3, Cy3, Cyin, Cylose, Cine, Fleet And the like are particularly preferably used. In particular, when the target protein has a tag, only the target protein can be detected more specifically by labeling the tag. For example, Pro-Q (registered trademark) sapphire can be used to label a protein having a histidine tag. In order to fluorescently label all proteins present in the solution, it is necessary to react with an excessive amount of fluorescent dye. In this case, unreacted fluorescent dye may remain, but the molecular weight of the fluorescent dye is the protein. Since it is generally small compared to the labeled protein, it can be easily distinguished from the labeled protein by a subsequent detection procedure. In addition, for example, when a protein having fluorescence, such as Green fluorescent protein (GFP), is the target protein, the labeling operation shown here can be omitted.

本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。   The invention is illustrated in more detail by the following examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

以下の実施例においては、本発明のマイクロチップとして図１に示すようなＰＭＭＡ基板のものを使用した。実施例１はヒスチジンタグ付きのＣＡＴタンパク質（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を合成した大腸菌をマイクロチップ上で破砕し、連続して金属キレートカラムで精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってその合成量を確認したものである。使用したチップ上で溶液を流すマイクロ流路は特に言及がある場合を除いて、流路は幅１００mｍ、深さ６０mｍのものを使用した。   In the following examples, a PMMA substrate as shown in FIG. 1 was used as the microchip of the present invention. In Example 1, E. coli synthesized with a histidine-tagged CAT protein (chlorphenicol acetyltransferase) was crushed on a microchip, continuously purified on a metal chelate column, and the synthesis amount was confirmed by SDS-PAGE. Unless otherwise specified, the micro flow channel for flowing the solution on the chip used was a flow channel having a width of 100 mm and a depth of 60 mm.

（実施例１）
（大腸菌で合成したＣＡＴタンパク質の分析）
Ｃ−末端に６個のヒスチジンを融合させたＣＡＴタンパク質は、発現ベクターによって大腸菌ＢＬ２１内で合成させた。ＬＢプレート上で３７℃、１６時間培養したシングルコロニーを滅菌した爪楊枝で取り、チップ上に予め入っていた３mｌのＢ−ＰＡＲ（ＰＩＥＲＣＥ社）＋８Ｍグアニジン塩酸の溶液に懸濁し、４０℃、１分間加熱した。この処理により、大腸菌は完全に破砕（溶解）され、大腸菌懸濁液は濁りがなく、澄んだ溶液となった。この溶液は５０mｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）＋１０ｍＭイミダゾール溶液が入っている注射器によって下流に追い出され、大腸菌破砕物中のＣＡＴタンパク質をニッケルキレートカラムに結合させた。この際、ニッケルキレートカラムはタンパク質破砕部の下流にあり、幅２００mｍ、深さ６０mｍの流路内に平均球形３８mｍのニッケルアガロースビーズが５ｍｍ積まれたものである。５０mｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）＋１０ｍＭイミダゾール溶液を打ち終わった後、更に５０mｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）＋１０ｍＭイミダゾール溶液で洗浄を行った。ニッケルキレートカラムからのＣＡＴタンパク質の抽出は２０mｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）＋２０ｍＭＥＤＴＡ溶液で行い、抽出したＣＡＴタンパク質はＡＬＥＸＡ４８８（インビトロジェン社）で６分間ラベリングし、０．１％ＳＤＳが入っている５０ｍＭのホウ酸緩衝液、ｐＨ９．３で１分間させた後、同一チップ上の下流に設けてあるマイクロ流路内での電気泳動によって定量した。電気泳動はポリアクリルアミド（平均分子量７０万〜１００万）を用いて、陰極側に変性・ラベリングしたＣＡＴタンパク質導入し陽極側に３秒間電気泳動させた。この際の電力は陰極側を１００Ｖ、陽極側を５００Ｖに設定して行った。泳動中のＣＡＴタンパク質の定量は蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１）を用いて検出（励起波長４８０、蛍光波長５１０ｎｍ）した信号をキャプチャーソフト（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ、ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社）で定量した。定量は標品のＣＡＴタンパク質を電気泳動し、試料導入量が１ｎｌとして計算した。電気泳動の結果、精製したＣＡＴタンパク質はシングルバンドを形成し、その濃度を逆算すると、本実施例で大腸菌によって合成したＣＡＴタンパク質は２．２ｍｇ／１ｇ菌体であることが判った。本実施例によって、大腸菌の破砕から金属キレートカラムによる精製、電気泳動までを１枚のチップ上で、１０分以内に行うことに成功した。 Example 1
(Analysis of CAT protein synthesized in E. coli)
CAT protein fused with 6 histidines at the C-terminus was synthesized in E. coli BL21 by an expression vector. A single colony cultured at 37 ° C. for 16 hours on an LB plate was taken with a sterilized toothpick and suspended in a solution of 3 ml of B-PAR (PIERCE) + 8M guanidine hydrochloride previously contained on the chip, at 40 ° C. for 1 minute. Heated. By this treatment, Escherichia coli was completely crushed (dissolved), and the E. coli suspension was not turbid and became a clear solution. This solution was driven downstream by a syringe containing 50 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) +10 mM imidazole solution to bind the CAT protein in the E. coli disruption to the nickel chelate column. At this time, the nickel chelate column is located downstream of the protein crushing section, and 5 mm of average aspherical 38 mm nickel agarose beads are stacked in a channel having a width of 200 mm and a depth of 60 mm. After finishing 50 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) +10 mM imidazole solution, washing was further performed with 50 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) +10 mM imidazole solution. The extraction of the CAT protein from the nickel chelate column was performed with 20 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) +20 mM EDTA solution, and the extracted CAT protein was labeled with ALEXA488 (Invitrogen) for 6 minutes and contained 0.1% SDS. The sample was allowed to flow for 1 minute with a 50 mM borate buffer solution, pH 9.3, and then quantified by electrophoresis in a microchannel provided downstream on the same chip. For electrophoresis, polyacrylamide (average molecular weight: 700,000 to 1,000,000) was used, CAT protein denatured and labeled on the cathode side was introduced, and electrophoresed on the anode side for 3 seconds. The power at this time was set at 100V on the cathode side and 500V on the anode side. CAT protein during electrophoresis was quantified with capture software (Image-Pro Plus, MediaCybernetics) using a fluorescence microscope (Olympus IX71) to detect (excitation wavelength 480, fluorescence wavelength 510 nm). The quantification was carried out by electrophoresis of a standard CAT protein and a sample introduction amount of 1 nl. As a result of electrophoresis, the purified CAT protein formed a single band, and when the concentration was calculated backward, it was found that the CAT protein synthesized by E. coli in this example was 2.2 mg / 1 g cells. According to this example, the process from disruption of E. coli to purification with a metal chelate column and electrophoresis was successfully performed on a single chip within 10 minutes.

この発明の実施例におけるマイクロチップの概略摸式図である。１〜４は、各部位の働きを示している。It is a schematic model diagram of the microchip in the Example of this invention. 1-4 have shown the function of each site | part. この発明の実施例におけるＣＡＴタンパク質のマイクロ流路電気泳動の結果をキャプチャーソフト表したものである。The result of the microchannel electrophoresis of CAT protein in the Example of this invention is represented by capture software.

符号の説明Explanation of symbols

１ 細胞の破砕部
２ ニッケルキレートカラム
３ ＣＡＴタンパク質のＡＬＥＸＡ４８８による染色部
４ マイクロ流路電気泳動とタンパク質検出部 1 Cell disruption section 2 Nickel chelate column 3 CAT protein staining section with ALEXA488 4 Microchannel electrophoresis and protein detection section

Claims (5)

液体を流すためのマイクロ流路が設けられ、該マイクロ流路の一部に細胞破砕部とタンパク質精製部および精製タンパク質の分析部をそれぞれ有することを特徴とするマイクロチップ。 A microchip comprising a microchannel for flowing a liquid and having a cell crushing unit, a protein purification unit, and a purified protein analysis unit in a part of the microchannel. タンパク質精製部にアフィニティカラムを含み、精製タンパク質の分析部がマイクロ流路内での電気泳動装置であることを特徴とする請求項１記載のマイクロチップ。 2. The microchip according to claim 1, wherein the protein purification unit includes an affinity column, and the analysis unit of the purified protein is an electrophoresis apparatus in a microchannel. 該アフィニティカラムが金属のキレートカラムであることを特徴とする請求項２記載のマイクロチップ。 3. The microchip according to claim 2, wherein the affinity column is a metal chelate column. 該アフィニティカラムがＧＳＴカラムであることを特徴とする請求項２記載のマイクロチップ。 The microchip according to claim 2, wherein the affinity column is a GST column. 該アフィニティカラムが抗体カラムであることを特徴とする請求項２記載のマイクロチップ。 The microchip according to claim 2, wherein the affinity column is an antibody column.