JP2006217845A

JP2006217845A - Method and apparatus for culturing adsorptive cell

Info

Publication number: JP2006217845A
Application number: JP2005033313A
Authority: JP
Inventors: Keisuke Shibuya; 啓介渋谷; Masaru Nanba; 勝難波; Ryoichi Haga; 良一芳賀; Takeyuki Kondo; 健之近藤
Original assignee: Hitachi Medical Corp
Current assignee: Hitachi Healthcare Manufacturing Ltd
Priority date: 2005-02-09
Filing date: 2005-02-09
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2025-02-09
Also published as: JP4649224B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for mass-culturing adsorptive animal cells in a simple operation for obtaining the aimed number of the cells while suppressing cell damage by omitting repeated subculture operations, and to provide a culture vessel and a culture apparatus each for the method. <P>SOLUTION: The method comprises the following procedure: The culture bed surface of the culture vessel is uniformly inoculated with adsorptive cells in such a low density as to be 1/10<SP>3</SP>part or less of the confluent cell density to conduct a culture to proliferate the cells to the confluent density by omitting the subculture operations, thus obtaining the aimed number of the cells. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は付着性動物細胞の培養増殖方法及び培養装置に係り、詳しくは、培養基材の表面で動物細胞を大量に増殖させる方法及び装置に関する。 The present invention relates to a method and apparatus for culturing and growing adherent animal cells, and more particularly to a method and apparatus for growing animal cells in large quantities on the surface of a culture substrate.

血球系の細胞やガン化した細胞を除き、正常な動物細胞は、一般的には固体表面に付着して伸展した後に増殖する、いわゆる付着性を示す。このような付着性を有する細胞を培養によって増殖させる場合、培養床表面の大半を細胞が単層で覆って細胞密度が過剰となったコンフルエントな状態になると、細胞同士が接触して増殖が抑制される。そこで、細胞を大量に増殖させるためには、コンフルエントな状態になった段階で一旦、細胞を回収し、複数の培養器、あるいは培養床の面積を拡大して播種することで細胞密度を減じる継代と呼ばれる操作を行う必要がある。通常、細胞を播種する密度はコンフルエントな状態の１／１０とされており、この密度より低いと細胞は増殖しないことが知られている。 Except for blood cells and cancerous cells, normal animal cells generally exhibit so-called adherence that grows after adhering to and spreading on a solid surface. When growing such adherent cells by culturing, if the cells are covered with a single layer over most of the culture bed surface and the cell density becomes excessive, the cells come into contact with each other and growth is suppressed. Is done. Therefore, in order to proliferate cells in large quantities, once the cells are in a confluent state, the cells are collected once, and the cells are reduced by increasing the area of multiple incubators or culture beds to reduce the cell density. It is necessary to perform a so-called operation. Usually, the density at which the cells are seeded is 1/10 of the confluent state, and it is known that the cells do not grow below this density.

従来の付着性細胞の継代操作は次のようである。培養用のフラスコやシャーレで細胞を培養し増殖させ、培養容器の培養面いっぱいに細胞が増殖したら、先ず、クリーンベンチ内で培地を除去した後、必要に応じて培養容器内を新しい培地で洗浄する。続いて、所定濃度のトリプシンやプロナーゼ等の蛋白分解酵素を作用させ、細胞が培養面から剥離して、浮遊化してきたらトリプシンインヒビター等の酵素阻害剤を添加するか、酵素反応の阻害効果を有する血清培地を加えて蛋白質の分解反応を停止させる。その後、ピペッティングにより細胞を培養面から十分に剥がし、培地中に細胞を分散させた後、この細胞浮遊液を回収する。このとき細胞浮遊液中にはトリプシン等の酵素がまだ含まれているため、これらの酵素を取り除く目的で、遠心により細胞を遠沈させ、上清の培地を除く。その後、新しい培地を加えて細胞を分散させ、この細胞浮遊液を適度に希釈し、新しい培養容器に分注して培養を行う。 The conventional passage of adherent cells is as follows. Cultivate the cells in a culture flask or petri dish, and when the cells grow to fill the culture surface of the culture vessel, first remove the medium in the clean bench, and then wash the culture container with a new medium if necessary. To do. Subsequently, a proteolytic enzyme such as trypsin or pronase at a predetermined concentration is allowed to act, and when cells are detached from the culture surface and become suspended, an enzyme inhibitor such as a trypsin inhibitor is added or the enzyme reaction is inhibited. Serum medium is added to stop the protein degradation reaction. Thereafter, the cells are sufficiently peeled off from the culture surface by pipetting, and the cells are dispersed in the medium, and then the cell suspension is recovered. At this time, enzymes such as trypsin are still contained in the cell suspension. For the purpose of removing these enzymes, the cells are spun down by centrifugation, and the supernatant medium is removed. Thereafter, a new medium is added to disperse the cells, and the cell suspension is appropriately diluted and dispensed into a new culture vessel for culturing.

このように、従来の継代操作では、細胞を剥離させる工程で用いるトリプシン等の蛋白質分解酵素による作用で細胞に対する損傷があり、生存率に大きく影響する。また、細胞を分解させる際のピペッティングも細胞へ与える影響が大きい。これらの細胞へのダメージは、継代後の細胞の生存率に影響するほか、細胞の増殖能の回復に要する時間に関して影響する。 Thus, in the conventional passage operation, there is damage to cells due to the action of a proteolytic enzyme such as trypsin used in the step of detaching the cells, which greatly affects the survival rate. In addition, pipetting when decomposing cells has a great influence on the cells. Damage to these cells affects the survival rate of the cells after passage, as well as the time required to restore the proliferative capacity of the cells.

特許文献１には、細胞を剥離させるための蛋白質分解酵素処理を無くし、遠心やピペッティング等の細胞にダメージを与える操作を行わない継代方法として、培養面となるゴム状の被覆部を設けた培養容器で細胞を培養した後、その被覆部を裁断して剥がし、剥がした被覆部を別に用意した新しい培養容器の被覆部に移して密着させて培養を継続する方法が記述されている。この場合、滅菌したナイフで切断した後、滅菌したピンセットで移し替えの操作を行うために人手を要する上、自動化によって省力化することは難しい。 In Patent Document 1, a rubber-like covering portion serving as a culture surface is provided as a subculture method that eliminates proteolytic enzyme treatment for detaching cells and does not perform operations that damage cells such as centrifugation and pipetting. A method is described in which after culturing cells in a culture vessel, the covering portion is cut and peeled off, and the peeled covering portion is transferred to a newly-prepared covering portion of a new culture container and brought into close contact to continue the culture. In this case, after cutting with a sterilized knife, manual operation is required to perform a transfer operation with sterilized tweezers, and it is difficult to save labor by automation.

特開平６−３３５３８６号公報JP-A-6-335386

以上述べたように、従来の付着性細胞の培養方法では、何らかの方法で細胞を培養床、あるいは培養担体から剥離させて回収した後、改めて新しい培養床、あるいは培養担体に播種する継代操作が必要であった。この場合、蛋白質分解酵素による酵素処理、あるいは機械的な処理による細胞へのダメージ、あるいは作業の煩雑さに加えて微生物による汚染の危険性が増加するという問題点があった。近年、再生医療の技術の進歩により、細胞を用いた治療が可能となり、安全かつ大量に細胞を培養する技術が要求され、上記問題点は解決されなければならない課題である。 As described above, in the conventional method for culturing adherent cells, after the cells are detached and collected from the culture bed or the culture support by some method, the subculture operation is performed by seeding again on a new culture bed or culture support. It was necessary. In this case, there is a problem that the risk of contamination by microorganisms is increased in addition to the damage to the cells due to the enzyme treatment with the proteolytic enzyme or the mechanical treatment, or the complicated work. In recent years, with the advancement of regenerative medicine technology, treatment using cells has become possible, and a technology for culturing cells safely and in large quantities is required, and the above-mentioned problems are problems to be solved.

本発明は、上記のような従来技術に存在する問題点を解決するために、付着性の動物細胞を大量に培養して目標細胞数を得るに際し、継代操作の繰り返しを省いて細胞への損傷を抑えると共に、操作を簡便にする培養方法、培養容器及び培養装置を提供する事を目的とする。 In order to solve the problems existing in the prior art as described above, the present invention eliminates the repetition of the subculture operation when culturing a large amount of adherent animal cells to obtain the target cell number. An object of the present invention is to provide a culture method, a culture container, and a culture apparatus that suppress damage and simplify operations.

上記課題を解決するために、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を研究した結果、我々はｈＭＳＣが従来の播種密度よりはるかに低い播種密度からでも培養させることが可能であることを見出した。本発明は、この性質を利用し、付着性細胞を培養面に低密度、かつ均一に播種して培養することで、継代操作を省いてコンフルエントな細胞密度まで単層で増殖させて目標細胞数を得ることを特徴とする。 As a result of studying human mesenchymal stem cells (hMSCs) to solve the above problems, we have found that hMSCs can be cultured even at seeding densities much lower than conventional seeding densities. The present invention utilizes this property, and adherent cells are seeded on the culture surface at a low density and uniformly so as to be cultured, so that the subculture operation is omitted and the target cells are allowed to proliferate to a confluent cell density. Characterized by obtaining a number.

本発明により、付着性の動物細胞を培養して目標の細胞数まで増殖させる際に、細胞に対する損傷と微生物汚染の危険性がある従来の継代操作を繰り返す必要が無くなり、操作を簡便にできる。 According to the present invention, when an adherent animal cell is cultured and proliferated to a target number of cells, it is not necessary to repeat the conventional passaging operation with the risk of damage to the cell and microbial contamination, thereby simplifying the operation. .

細胞同士の接触阻害による増殖の非効率さの改善を、低密度均一播種を行うことにより実現した。また、継代作業による細胞の損傷の改善を、無継代もしくは少ない継代回数で増殖させることを可能にすることにより実現した。 The improvement of the inefficiency of proliferation by the inhibition of contact between cells was realized by carrying out low density uniform seeding. In addition, the improvement of cell damage by the passage work was realized by allowing the cells to grow without passage or with a small number of passages.

細胞活性を損なうことなく、連続的に増殖させる方法及び装置について説明する。具体的には、次のとおりである。 A method and apparatus for continuous growth without impairing cell activity will be described. Specifically, it is as follows.

（１）付着性細胞を、培養容器の培養床表面にコンフルエントな細胞密度の１／１０^３以下となる低密度で播種し、培養によってコンフルエントな細胞密度まで増殖させることを特徴とする付着性細胞の培養方法。 (1) Adherent cells are seeded on a culture bed surface of a culture vessel at a low density of 1/10 ³ or less of confluent cell density, and grown to confluent cell density by culture Culture method.

（２）付着性細胞をコンフルエントになるまで接触阻害の影響が出ない略等距離の間隔で播種し、培養によってコンフルエントな細胞密度まで増殖させることを特徴とする付着性細胞の培養方法。 (2) A method for culturing adherent cells, wherein adherent cells are seeded at substantially equidistant intervals that do not affect contact inhibition until they become confluent, and are grown to a confluent cell density by culture.

（３）付着性細胞を浮遊化して懸濁した培地に、細胞に凝集活性を有しない高分子の比重調整剤を添加し、細胞が培養床まで沈降するまでに培養溶液中に均一に拡散するような沈降速度となるように培地の比重を調整する付着性細胞の培養方法。 (3) A polymer specific gravity regulator that does not have aggregation activity is added to the culture medium in which adherent cells are suspended and suspended, and the cells diffuse uniformly into the culture solution until they settle down to the culture bed. A method for culturing adherent cells, wherein the specific gravity of the medium is adjusted so as to achieve a sedimentation rate.

（４）比重調整剤がパーコール、ポリビニルピロリドンから成る付着性細胞の培養方法。 (4) A method for culturing adherent cells, wherein the specific gravity adjusting agent is Percoll or polyvinylpyrrolidone.

（５）付着性細胞の大きさと実質的に同じ大きさを持ち、コンフルエントな細胞密度の１／１０^３以下となる低密度で縦及び横方向に等間隔に配列された細胞接着性領域に付着性細胞を接着させる培養方法。 (5) Adhering to cell adhesion regions that are substantially the same size as adherent cells and are arranged at equal intervals in the vertical and horizontal directions at a low density of 1/10 ³ or less of confluent cell density. A culture method for adhering sex cells.

（６）培養容器の培養床表面に、浮遊化した付着性細胞が通過可能でコンフルエントな細胞密度の１／１０^３以下となる密度の貫通孔を配列した多孔シートを、培養床表面から分離可能な状態で密着させ、前記細胞を培養容器の上方向または一方の壁面側から注入して前記細胞を播種し、該細胞が培養床表面に付着した後に、該多孔シートと培養床表面とを分離して培養することを特徴とする付着性細胞の培養方法。 (6) A porous sheet in which through-holes with a density of 1/10 ³ or less of the confluent cell density can be separated from the culture bed surface can be separated from the culture bed surface of the culture vessel. The porous sheet and the culture bed surface are separated after the cells adhere to the culture bed surface by injecting the cells from the upper side of the culture vessel or from one wall surface side. And culturing the adherent cells.

（７）多孔シートを培養面から分離する培養法。 (7) A culture method for separating the porous sheet from the culture surface.

（８）培養面を多孔シートから分離する培養法。 (8) A culture method for separating the culture surface from the porous sheet.

（９）多孔シートの貫通孔に、超音波装置とフローセルによって個々の細胞を分別して注入し、該細胞が培養床表面に付着した後に、該多孔シートを培養床表面から剥離して培養する付着性細胞の培養方法。 (9) Individual cells are injected into the through holes of the porous sheet by an ultrasonic device and a flow cell, and after the cells adhere to the culture bed surface, the porous sheet is detached from the culture bed surface and cultured. A method for culturing sex cells.

（１０）細胞付着性材質からなる培養床表面と液体の流入口及び流出口を有し、比重調整剤を用いることで比重調整された溶液で細胞を分散させる培養装置。 (10) A culture apparatus having a culture bed surface made of a cell-adhesive material, a liquid inlet and outlet, and dispersing cells with a solution whose specific gravity is adjusted by using a specific gravity adjusting agent.

（１１）比重調整剤がパーコール又はポリビニルピロリドンから成る付着性細胞の培養装置。 (11) An apparatus for culturing adherent cells, wherein the specific gravity adjusting agent comprises Percoll or polyvinylpyrrolidone.

（１２）光透過性を有し、細胞を培養する為の容器底面と液体の流入口及び流出口を有し、前記底面に付着性細胞の大きさと実質的に同じ大きさを持ち、コンフルエントな細胞密度の１／１０^３以下となる低密度で縦及び横方向に等間隔に配列された細胞接着性領域を有する付着性細胞の培養容器。 (12) It has light permeability, has a container bottom surface for culturing cells, a liquid inlet and outlet, and has a size substantially the same as the size of adherent cells on the bottom surface, and is confluent. A culture vessel for adherent cells having cell adhesion regions arranged at equal intervals in the vertical and horizontal directions at a low density of 1/10 ³ or less of the cell density.

（１３）前記細胞接着性領域が細胞接着性蛋白質膜からなる付着性細胞の培養容器。 (13) A culture vessel for adherent cells, wherein the cell adhesive region comprises a cell adhesive protein film.

（１４）光透過性を有し、細胞を培養する為の容器底面と液体の流入口及び流出口を有し、コンフルエントな細胞密度の１／１０^３以下となる密度の貫通孔を配列した多孔シートを有する培養容器。 (14) Perforation having light transmissivity, a container bottom surface for culturing cells, a liquid inlet and outlet, and through-holes with a density of 1/10 ³ or less of confluent cell density A culture vessel having a sheet.

（１５）細胞分離のための超音波発生装置とフローセルを有する培養装置。 (15) An ultrasonic generator for cell separation and a culture apparatus having a flow cell.

（１６）多孔シートの厚みが、浮遊化した付着性細胞の平均細胞径の０．５から１．５倍である付着性細胞の培養方法。 (16) The method for culturing adherent cells, wherein the thickness of the porous sheet is 0.5 to 1.5 times the average cell diameter of the suspended adherent cells.

（１７）多孔シートの表面材質が細胞への付着性が難付着性である親水性材質であり、培養床表面の材質が細胞への付着性が易付着性である疎水性材質である付着性細胞の培養方法。 (17) Adhesiveness in which the surface material of the porous sheet is a hydrophilic material that is difficult to adhere to cells, and the material of the culture bed surface is a hydrophobic material that is easily adherent to cells. Cell culture method.

自動化を可能とする方法を提供することで、省力化が図れると共に、微生物等による汚染の危険性を低減して、安全性の高い細胞を得ることが可能となる。また、少ない細胞数から効率的に増殖させることができると共に、得られた細胞自身の活性が損なわれることが無く、再生医療などに適用することが可能となる。以下、本発明を、実施例を挙げて、より具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 By providing a method that enables automation, it is possible to save labor, reduce the risk of contamination by microorganisms, and obtain highly safe cells. In addition, the cell can be efficiently proliferated from a small number of cells, and the activity of the obtained cell itself is not impaired, and can be applied to regenerative medicine. EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated more concretely, this invention is not limited to a following example.

細胞が付着するよう表面加工された培養フラスコ１（ＦＡＬＣＯＮ）に付着性細胞２である１．２×１０^５個のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を図１（ａ）のようにフラスコ全面に播いた場合（均一播種）と、径２ｃｍ内に播いた場合（局所播種，図１（ｂ））とで細胞の増殖速度を比較した。用いる細胞はＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞等接着性細胞であればよく、ヒト間葉系幹細胞に限定されるものではない。以下の実施例も同様である。細胞を培養するのに用いた培地はウシ胎児血清を含んだＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）を用いた。また、培養は５％ＣＯ_２，３７℃，９０％以上湿度の条件下で培養を行った。なお、各操作は無菌的に行っている。 1 × 10 ⁵ human mesenchymal stem cells (hMSC), which are adherent cells 2, are attached to the entire flask surface as shown in FIG. 1 (a). The cell growth rate was compared between seeding (uniform seeding) and seeding within a diameter of 2 cm (local seeding, FIG. 1 (b)). The cells to be used may be adhesive cells such as COS cells and HeLa cells, and are not limited to human mesenchymal stem cells. The same applies to the following embodiments. The medium used for culturing cells was MSCGM medium (Cambrex) containing fetal calf serum. In addition, the culture was performed under conditions of 5% CO ₂ , 37 ° C. and 90% or higher humidity. Each operation is performed aseptically.

播種後３日間でのｈＭＳＣの比増殖速度を図２に示す。細胞を全面に播いた場合の方が、局所的に播いた場合より増殖速度が速いことがわかる。比増殖速度とは下の式で定義された細胞の増殖速度を示す指標である。
Ｎ＝Ｎ_０ｅ^μｔ（μ：比増殖速度，Ｎ：細胞数，Ｎ_０：初期細胞数，ｔ：培養時間） The specific growth rate of hMSC in 3 days after sowing is shown in FIG. It can be seen that the growth rate is faster when the cells are seeded on the entire surface than when the cells are seeded locally. The specific growth rate is an index indicating the cell growth rate defined by the following formula.
N = N ₀ e ^μt (μ: specific growth rate, N: number of cells, N ₀ : initial number of cells, t: culture time)

培養フラスコ１にそれぞれ０．４，５，５０，５００，５０００，１５０００個／ｃｍ^２の播種密度でｈＭＳＣを播種し、５％ＣＯ_２、３７℃、９０％以上湿度で培養を行った。培地はＭＳＣＧＭ培地を用いた。 The culture flask 1 was seeded with hMSC at a seeding density of 0.4, 5, 50, 500, 5000, and 15000 cells / cm ² , respectively, and cultured at 5% CO ₂ , 37 ° C., and 90% or higher humidity. As the medium, MSCGM medium was used.

播種後の細胞増殖の様子を示したのが図３である。標準播種密度とされる５０００個／ｃｍ^２以下の密度でもｈＭＳＣは増殖可能であることがわかる。細胞を１０万倍に増殖させたいときには、０．４個／ｃｍ^２で播種することにより、継代を行うことなく増殖させることが可能であり、また０．４個／ｃｍ^２以下の播種密度でも培養は可能である。 FIG. 3 shows the state of cell proliferation after seeding. It can be seen that hMSCs can grow even at a density of 5000 cells / cm ² or less, which is the standard seeding density. When it is desired to multiply the cells by 100,000 times, seeding at 0.4 cells / cm ² allows the cells to grow without subculture, and the seeding density is 0.4 cells / cm ² or less. But culture is possible.

実施例１乃至２により、細胞を低密度に且つ細胞間の距離がなるべく等距離になるようにすると無継代もしくは少ない継代回数で効率的に細胞を増殖させることが可能である。以下では、これを実現するための播種方法及び装置についての実施例を挙げる。 According to Examples 1 and 2, when cells are made to have a low density and the distance between the cells is as equal as possible, the cells can be efficiently proliferated with no passage or a small number of passages. Below, the Example about the seeding method and apparatus for implement | achieving this is given.

培養フラスコにｈＭＳＣを入れた。ＭＳＣＧＭ培地には比重調整のため、パーコールを（細胞の比重）：（培地の比重）＝１．０５：１となるように加えた。この比重の比は、細胞が均一に分布するのに必要な沈降速度によって決まり、この値に限定されるものではない。培地よりわずかに比重の大きい細胞は、拡散しながらゆっくりと沈降していき、培養容器底面に達する。細胞が培養床に付着したところで、培地交換を行った。このときの細胞の分布を観測すると比重調整を行った培養フラスコの培養床では細胞がほぼ均一に配列したのに対し、比重調整を行わなかった培養フラスコでは、培養床の中心付近に細胞が密に寄り集まった状態で培養底面に付着した（図４）。 HMSC was placed in the culture flask. In order to adjust the specific gravity, Percoll was added to the MSCGM medium so that (cell specific gravity) :( medium specific gravity) = 1.05: 1. This specific gravity ratio is determined by the sedimentation rate required for the cells to be uniformly distributed, and is not limited to this value. Cells having a specific gravity slightly larger than that of the medium slowly settle while spreading and reach the bottom of the culture vessel. When the cells adhered to the culture bed, the medium was changed. When the cell distribution at this time was observed, the cells were arranged almost uniformly on the culture bed of the culture flask adjusted for specific gravity, whereas in the culture flask not adjusted for specific gravity, the cells were dense near the center of the culture bed. It adhered to the bottom of the culture in a state of being gathered close to (Fig. 4).

３日に１度培地交換を行い、培養を続けたところ、比重調整を行った培養では培養床表面の大半を細胞が単層で覆って細胞密度が過剰となったコンフルエントな状態まで達したのに対し、比重調整を行わなかった培養では細胞がフラスコの真ん中に凝集しコンフルエントまで達しなかった。これに用いる比重調整剤としては、パーコールの他、ポリビニルピロリドン等も適用できる。 The culture medium was changed once every three days and the culture was continued. In the culture with the specific gravity adjusted, the cells reached a confluent state where the cell surface was covered with a monolayer and the cell density was excessive. On the other hand, in the culture without adjusting the specific gravity, the cells aggregated in the middle of the flask and did not reach confluence. As the specific gravity adjusting agent used for this, in addition to Percoll, polyvinylpyrrolidone and the like can also be applied.

培養プレートの表面に各付着性蛋白（フィブロネクチン、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、ラミニン）をコートした培養プレート上にｈＭＳＣを５０００個／ｃｍ^２の密度で播種した。ＩＢＬＭｅｄｉａＩ培地を用いてｈＭＳＣを培養すると各付着性蛋白を表面コートした培養プレートでの付着率は図５のようになった。ｈＭＳＣをＩＢＬＭｅｄｉａＩで培養すると付着性蛋白の有無に関わらず、ｈＭＳＣは培養プレート上に付着することがわかる。同様にしてＱＢＳＦ−６０培地を用いたｈＭＳＣの培養を行った結果、付着率は図６のようになった。ｈＭＳＣをＱＢＳＦ−６０で培養すると付着性蛋白が培養皿にコートされている場合にはｈＭＳＣは培養床に付着し、付着性蛋白が培養皿にコートされていない場合にはｈＭＳＣは培養床に付着しないことを示している。 HMSCs were seeded at a density of 5000 cells / cm ² on a culture plate in which the adhesion protein (fibronectin, collagen type I, collagen type IV, laminin) was coated on the surface of the culture plate. When hMSCs were cultured using IBL Media I medium, the adhesion rate on the culture plate surface-coated with each adhesive protein was as shown in FIG. It can be seen that when hMSCs are cultured in IBL Media I, hMSCs adhere to the culture plate regardless of the presence or absence of adhesive proteins. Similarly, as a result of culturing hMSC using QBSF-60 medium, the adhesion rate was as shown in FIG. When hMSC is cultured with QBSF-60, if the adherent protein is coated on the culture dish, hMSC adheres to the culture bed. If the adherent protein is not coated on the culture dish, hMSC adheres to the culture bed. Indicates that no.

上記に示したＩＢＬＭｅｄｉａＩとＱＢＳＦ−６０の性質を用いて、次のような播種法を実施した。用いる培地は上記の性質をもった培地であればよく、ＩＢＬＭｅｄｉａＩとＱＢＳＦ−６０に限定されるものではない。細胞接着性領域は、細胞を接着させる為に細胞付着に接着性物質が必要な培地を用い、細胞を増殖させる培地には、細胞付着に接着性物質が不必要な培地を用いる。
（構成の説明）
図９に示すように、培養容器内底面８を培養床とした四角箱状に形成された培養容器６で、培養床表面は細胞非接着性の親水性ポリマーを材質とした表面８に図７に示すように付着性細胞の大きさと実質的に同じ大きさ（ｄ）を持つ細胞接着性物質７がコートされた領域４が、数密度が０．１個／ｃｍ^２となるように、縦方向及び横方向に等間隔に配列されている。この数密度は、増殖させる倍数によって規定されるもので、この値に限定されるものではない。接着因子としてフィブロネクチンを用いている。他にコラーゲン、ラミニン等の細胞接着性蛋白乃至物質を用いてもよい。培養容器の側面には液体の流入口１２と流出口１０を設け、更にＣＯ_２ガスの通気口１１、排気口９が設けてある。この培養装置を用いて細胞を培養する際の動作を次に説明する。
（動作の説明）
上記培養容器に流入口１２を通してＱＢＳＦ−６０培地を加え、細胞の生育温度（例えば３７℃）を保つように培養容器外部の熱源を通して制御する。送液口１２からＱＢＳＦ−６０培地中に細胞を懸濁させた溶液を入れ、図１２（ｂ）に示すように培養容器を傾け、培地排出用チューブより徐々に培地を取り除き、細胞を細胞接着性領域７に付着させる。この傾斜させた液を取り除く作業は、細胞を均一に培養底面に行き渡らせるためであり、この操作がないと培養容器の隅の壁面に細胞が集中するためである。図１０のように細胞の付着後、培地をＩＢＬＭｅｄｉａＩに換え、培養容器を水平に静置した状態で培養を続ける（図１１）。培地交換は、適時、送液口１２と廃液口１０を通して行う。細胞がコンフルエントになるまで培養する。細胞の回収は、送液口１２を通して、洗浄液やトリプシン溶液等の酵素を培養容器内に送液し、細胞を培養床から剥離し、培養側面の排出口１０から細胞懸濁液として回収する。
（実験例）
細胞接着領域パターンが付与された培養皿上にＱＢＳＦ−６０培地を用いてｈＭＳＣを播種した。ＱＢＳＦ−６０培地を用いて培養すると図８のように細胞接着領域のスポット上に細胞２が接着し、細胞非接着領域には細胞は接着しなかった。十分細胞が接着した播種後４時間後に培養皿上にあるＱＢＳＦ−６０培地を図１２に示すように培養容器を傾けることで完全に培地を取り除き、ＰＢＳで３回洗った後に、ＩＢＬＭｅｄｉａＩ培地を加え、３日に１度の培地交換を行い、そのまま培養を続けた。ＩＢＬＭｅｄｉａＩ培地に換えてからは、ｈＭＳＣは細胞非接着領域にも付着し、そのまま細胞は増殖し、コンフルエントな状態となった。５が増殖した細胞である。 The following seeding method was implemented using the properties of IBL Media I and QBSF-60 shown above. The medium to be used is not limited to IBL Media I and QBSF-60, as long as it has the above properties. In the cell adhesion region, a medium that requires an adhesive substance for cell attachment is used in order to adhere cells, and a medium that does not require an adhesive substance for cell attachment is used as a medium for cell growth.
(Description of configuration)
As shown in FIG. 9, the culture vessel 6 is formed in a square box shape with the culture vessel inner bottom surface 8 as a culture bed, and the culture bed surface is a surface 8 made of a non-cell-adhesive hydrophilic polymer. As shown in FIG. 5, the region 4 coated with the cell adhesive substance 7 having substantially the same size (d) as the size of the adherent cells is longitudinally adjusted so that the number density is 0.1 / cm ^2. It is arranged at equal intervals in the direction and the horizontal direction. This number density is defined by the multiplication factor, and is not limited to this value. Fibronectin is used as an adhesion factor. In addition, cell adhesion proteins or substances such as collagen and laminin may be used. A liquid inflow port 12 and an outflow port 10 are provided on the side surface of the culture vessel, and a CO ₂ gas vent port 11 and an exhaust port 9 are further provided. Next, the operation when culturing cells using this culture apparatus will be described.
(Description of operation)
A QBSF-60 medium is added to the culture vessel through the inlet 12 and controlled through a heat source outside the culture vessel so as to maintain the cell growth temperature (eg, 37 ° C.). A solution in which the cells are suspended in the QBSF-60 medium is introduced from the liquid feeding port 12, and the culture container is tilted as shown in FIG. 12 (b), and the medium is gradually removed from the medium discharge tube to attach the cells to the cell. It adheres to the sex region 7. The operation of removing the inclined liquid is to uniformly distribute the cells to the bottom surface of the culture, and if this operation is not performed, the cells concentrate on the wall surface at the corner of the culture vessel. After cell attachment as shown in FIG. 10, the medium is changed to IBL Media I, and the culture is continued in a state where the culture vessel is left still horizontally (FIG. 11). The medium is exchanged through the liquid feeding port 12 and the waste liquid port 10 at an appropriate time. Incubate until cells are confluent. For cell collection, an enzyme such as a washing solution or a trypsin solution is fed into the culture vessel through the solution feeding port 12, and the cells are detached from the culture bed and collected as a cell suspension from the discharge port 10 on the culture side.
(Experimental example)
HMSC was seeded on a culture dish provided with a cell adhesion region pattern using QBSF-60 medium. When cultured using the QBSF-60 medium, the cells 2 adhered to the spots of the cell adhesion region as shown in FIG. 8, and the cells did not adhere to the non-cell adhesion region. The QBSF-60 medium on the culture dish was removed 4 hours after seeding when the cells were sufficiently adhered, and the medium was completely removed by tilting the culture container as shown in FIG. The medium was changed once every three days, and the culture was continued as it was. After changing to the IBL Media I medium, hMSC adhered to the cell non-adherent region, and the cells proliferated and became confluent. 5 is a proliferated cell.

（構成の説明）
図１３に、多孔シートを培養床表面から分離可能な状態で密着させた方法を実現するための培養装置の１例を示す。培養容器内部の底面８には細胞の接着が可能なように表面が疎水性加工された材質を用い、その上に径５０μｍ（細胞１個通る大きさ）の貫通口１９が等間隔に並んでいる細胞非付着性の親水性ポリマー加工シート１８（厚さ５０μｍ）をかぶせる。シートの厚みは、厚すぎると細胞が一つの貫通口に２つ以上入り、薄すぎると細胞が貫通口から出易くなるため、細胞の大きさの０．５から１．５倍が望ましい。培養容器の側面には、培地の送液口１２、廃液口１０、ＣＯ_２ガス用の通気口１１、排気口９を取り付けている。多孔シートの材質は、親水性ポリマー加工シートの他、細胞への付着性が難付着性である親水性材質を用いることができる。培養床表面の材質は、表面が疎水性加工された材質の他、細胞への付着性が易付着性である疎水性材質を用いることができる。
（動作の説明）
培地の送液口１２から培地に細胞を懸濁させた溶液を入れ、振とう器を用いてゆっくりと振とうし、細胞を貫通孔内の培養容器底面８に付着させる。その後、培地を、廃液口１０を通して捨て、親水性ポリマー加工シート１８を取り外し、新たに培地を加える。そのまま、適時培地交換を繰り返しながら細胞を培養し、コンフルエントな状態まで増殖させる。細胞の回収は、送液口１２を通して、洗浄液やトリプシン溶液等の酵素を培養容器内に送液し、細胞を培養床から剥離し、培養側面の排出口１０から細胞懸濁液として回収する。
（実験例）
ｈＭＳＣを、上記培養装置を用いて培養を行った。あらかじめ培養容器に培地を入れておき、３７℃に保温した。培地はＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社）を用いた。ｈＭＳＣを培養装置に送液し、２４時間ゆっくりと振とうし、細胞を貫通孔のある培養底面に付着させた。親水性ポリマー加工シートを取り外し、そのまま培養を続けた。その結果、細胞はほぼコンフルエントまで増殖した。 (Description of configuration)
FIG. 13 shows an example of a culture apparatus for realizing a method in which a porous sheet is brought into close contact with the culture bed surface in a separable state. The bottom surface 8 inside the culture vessel is made of a material having a hydrophobic surface so that cells can be attached, and through holes 19 having a diameter of 50 μm (size to pass one cell) are arranged at equal intervals. Cover the non-cell-adherent hydrophilic polymer processed sheet 18 (thickness 50 μm). When the thickness of the sheet is too thick, two or more cells enter one through-hole, and when the thickness is too thin, the cells easily come out of the through-hole. On the side surface of the culture vessel, a medium feeding port 12, a waste solution port 10, a CO ₂ gas vent port 11, and an exhaust port 9 are attached. As the material for the porous sheet, in addition to the hydrophilic polymer processed sheet, a hydrophilic material that is difficult to adhere to cells can be used. As the material for the surface of the culture bed, a hydrophobic material that can be easily attached to cells can be used in addition to a material whose surface is hydrophobically processed.
(Description of operation)
A solution in which cells are suspended in the medium is introduced from the medium feeding port 12 and is slowly shaken using a shaker to attach the cells to the bottom surface 8 of the culture container in the through hole. Thereafter, the medium is discarded through the waste liquid port 10, the hydrophilic polymer processed sheet 18 is removed, and a new medium is added. As it is, the cells are cultured while repeating medium exchange as appropriate, and are grown to a confluent state. For cell collection, an enzyme such as a washing solution or a trypsin solution is fed into the culture vessel through the solution feed port 12, and the cells are detached from the culture bed and collected as a cell suspension from the discharge port 10 on the culture side.
(Experimental example)
hMSC was cultured using the culture apparatus. A culture medium was previously placed in a culture container and kept at 37 ° C. As the medium, MSCGM medium (Cambrex) was used. hMSC was fed to the culture apparatus and shaken slowly for 24 hours to allow the cells to adhere to the bottom of the culture with through-holes. The hydrophilic polymer processed sheet was removed, and the culture was continued as it was. As a result, the cells grew to almost confluence.

（構成の説明）
図１４に示すように、培養容器内の底面は細胞の接着可能な表面疎水性加工材質であり、その上方に径５０μｍ（細胞１個通る大きさ）の貫通口１９が等間隔に並んだ細胞非付着性の親水性ポリマー加工シート１８（厚さ５０μｍ）が設けてある。貫通口の径、親水性ポリマー加工シートの厚さは細胞の大きさによって規定されるものであり、この値に限定されない。培養容器の側面には、親水性ポリマー加工シート１８上部に培地を入れるための送液口３５が、親水性ポリマー加工シート１８の下部かつ培養床上部にはＣＯ_２ガス用の通気口３７と試薬等を入れるための試薬送液口３６が設けてある。また、廃液用に、親水性ポリマー加工シート１８上部に１箇所（上部排出口３３）、親水性ポリマー加工シート１８下部かつ培養床８上部に１箇所孔（下部排出口３４）を取り付けた。培養容器底面には通気口３８が設けてある。図１４において、２０は培地、３９は培地タンク、４０は試薬タンク、４１は送液ポンプ、４２はガスボンベである。
（動作の説明）
通気口３７からガスを通気し、培養床８を親水性ポリマー加工シート１８に密着させる。この状態で、送液口３５から培地と細胞懸濁液を注入する。振とう器でゆっくり培養容器を振とうし、細胞を親水性ポリマー加工シートの貫通口１９に落とす。細胞が培養床上に接着したところで、通気口３８からガスを排気し、培養床を親水性ポリマー加工シートから引き離す。廃棄口３４を通して、培地を廃棄し、送液口３６を通して、培地を注入する。適時培地交換を行いながら、そのまま細胞を培養する。培地交換は送液口３６と廃液口３４を用いて行う。細胞はコンフルエントになったら送液口３６から細胞洗浄液を注入し、廃液口３４から洗浄液を廃液する。これを数回繰り返し、細胞を洗浄する。送液口３６からトリプシン等の酵素を送液する。細胞が培養床表面から剥がれたら、振とう器を作動し、細胞を懸濁させる。廃液口３４から細胞懸濁液を回収する。
（実験例）
培養容器底面の通気口からＣＯ_２ガスを通気し、図１４（ａ）に示すように、培養床シートを膨張させ、親水性ポリマー加工シートと密着させた。この状態で、培地で懸濁したｈＭＳＣを親水性ポリマー加工シート上部の送液口から注入し、親水性ポリマー加工シート上に拡散させた。細胞が親水性ポリマー加工シートの貫通口に入り、培養床上に付着するように３時間静置した。その後、培養床シート下部のＣＯ_２ガスを脱気し、培養床を親水性ポリマー加工シートから離し、水平に保った。培養床上に親水性ポリマー加工シート下部の口から培地を加え、培養床上を浸す。余分な培地は廃棄口から排出した。通気口からＣＯ_２ガスを通気し、３７℃で細胞を培養した。 (Description of configuration)
As shown in FIG. 14, the bottom surface in the culture vessel is a surface hydrophobic processing material to which cells can be adhered, and cells having through-holes 19 with a diameter of 50 μm (size of passing one cell) arranged at equal intervals above them. A non-adhesive hydrophilic polymer processed sheet 18 (thickness 50 μm) is provided. The diameter of the through hole and the thickness of the hydrophilic polymer processed sheet are defined by the size of the cells, and are not limited to these values. On the side of the culture vessel, there is a liquid feeding port 35 for putting a medium in the upper part of the hydrophilic polymer processed sheet 18, and a lower part of the hydrophilic polymer processed sheet 18 and an upper part of the culture bed are a CO ₂ gas vent 37 and a reagent. A reagent feed port 36 is provided for containing the like. Further, for the waste liquid, one place (upper discharge port 33) was attached to the upper part of the hydrophilic polymer processed sheet 18, and one hole (lower discharge port 34) was attached to the lower part of the hydrophilic polymer processed sheet 18 and the upper part of the culture bed 8. A vent 38 is provided on the bottom of the culture vessel. In FIG. 14, 20 is a culture medium, 39 is a culture tank, 40 is a reagent tank, 41 is a liquid feed pump, and 42 is a gas cylinder.
(Description of operation)
Gas is vented from the vent 37 to bring the culture bed 8 into close contact with the hydrophilic polymer processed sheet 18. In this state, the medium and the cell suspension are injected from the liquid feeding port 35. The culture container is shaken slowly with a shaker, and the cells are dropped into the through hole 19 of the hydrophilic polymer processed sheet. When the cells adhere to the culture bed, the gas is exhausted from the vent 38 and the culture bed is pulled away from the hydrophilic polymer processed sheet. The medium is discarded through the disposal port 34 and the medium is injected through the liquid feeding port 36. The cells are cultured as they are while changing the medium as needed. The medium exchange is performed using the liquid feeding port 36 and the waste liquid port 34. When the cells become confluent, the cell washing liquid is injected from the liquid feeding port 36, and the washing liquid is drained from the waste liquid port 34. This is repeated several times to wash the cells. An enzyme such as trypsin is fed from the liquid feed port 36. When the cells are detached from the culture bed surface, the shaker is activated to suspend the cells. The cell suspension is recovered from the waste liquid port 34.
(Experimental example)
Aerated with CO ₂ gas from the vent of the culture vessel bottom, as shown in FIG. 14 (a), the culture bed sheet is expanded and brought into close contact with the hydrophilic polymer-processed sheet. In this state, hMSC suspended in the culture medium was injected from the liquid feeding port at the top of the hydrophilic polymer processed sheet and diffused on the hydrophilic polymer processed sheet. The cells were allowed to stand for 3 hours so that the cells entered the through hole of the hydrophilic polymer processed sheet and adhered on the culture bed. Thereafter, the CO ₂ gas at the bottom of the culture bed sheet was degassed, and the culture bed was separated from the hydrophilic polymer processed sheet and kept horizontal. A culture medium is added to the culture bed from the lower mouth of the hydrophilic polymer processed sheet, and the culture bed is immersed. Excess medium was discharged from the waste outlet. The cells were cultured at 37 ° C. by aeration of CO ₂ gas from the vent.

この時点で培養床を顕微鏡で観察したところ細胞は、親水性ポリマー加工シートの貫通口と同じ配置で付着していた。培地交換は培養容器側面の口を通して、図１４（ｂ）に示すように、培地の注入、排気口からの排出より行った。培地交換を２、３日に１度行い、細胞がコンフルエントまで増殖し、この時点で、細胞を回収した。細胞の回収は、まず、培地を廃棄口から排出し、注入口からＰＢＳを加えて、排気口から排出することで洗浄を行い、洗浄後、トリプシン溶液を加え、細胞が剥離するまで静置した。細胞が剥離した時点で、培地を加え、培養容器を揺することで溶液を混合し、この混合された細胞懸濁液を排水口から回収した。 At this time, when the culture bed was observed with a microscope, the cells were attached in the same arrangement as the through holes of the hydrophilic polymer processed sheet. As shown in FIG. 14B, the medium was exchanged by injecting the medium and discharging it from the exhaust port through the mouth on the side of the culture container. The medium was changed once every two or three days, and the cells grew to confluence. At this point, the cells were collected. The cells were collected by first draining the medium from the waste outlet, adding PBS from the inlet, and draining from the exhaust outlet. After washing, a trypsin solution was added and the cells were allowed to stand until they detached. . When the cells were detached, the medium was added, the solution was mixed by shaking the culture vessel, and the mixed cell suspension was recovered from the drain.

（構成の説明）
図１５は、本発明装置の実施例の縦断側面図であり、図１６はその上面図である。細胞懸濁液２１（サンプル液）はサンプルライン２２を通り、ピエゾ振動板（超音波発生装置）に取り付けてあるフローセルボディ２３に送り込まれる。クォーツガラスで作成され、断面が正方形の細長い中空チャンバーであるフローセルがフローセルボディの下端に取り付けてある（図１７）。フローセルは細胞を注入する細胞注入手段としての一例である。シース液３０とサンプル液２１がフローセルに注入され、圧によって送り出されたシース液は、フローセル内を上方から下方に向かって流れる。 (Description of configuration)
FIG. 15 is a longitudinal side view of an embodiment of the device of the present invention, and FIG. 16 is a top view thereof. The cell suspension 21 (sample solution) passes through the sample line 22 and is sent to the flow cell body 23 attached to the piezo diaphragm (ultrasonic generator). A flow cell, which is an elongated hollow chamber made of quartz glass and having a square cross section, is attached to the lower end of the flow cell body (FIG. 17). A flow cell is an example of a cell injection means for injecting cells. The sheath liquid 30 and the sample liquid 21 are injected into the flow cell, and the sheath liquid sent out by pressure flows from the top to the bottom in the flow cell.

フローセル内におけるシース液の流れの途中で、サンプル流と合流する。圧のかかった層流状態のシース流が、サンプル流の回りを混ざり合うこと無く取り囲む状態が出来る。これにより細胞がフローセル中を１列に１個ずつ通過することが可能となる。また、流体力学に基づく絞り込みを行うことにより、いつも一定の流路で細胞が１個ずつフローセル中央を通過する。そのため、測定精度を上げている。そして、レーザー光２４をフローセルの中央に焦点が位置するように照射する。フローセル内を細胞が流れるとレーザー光により強い前方散乱光を発する。 In the middle of the flow of the sheath liquid in the flow cell, it merges with the sample flow. A sheath flow in a laminar flow state under pressure can be surrounded without mixing around the sample flow. This allows the cells to pass through the flow cell one by one in a row. Further, by narrowing down based on fluid dynamics, cells always pass through the center of the flow cell one by one in a constant flow path. Therefore, the measurement accuracy is increased. Then, the laser beam 24 is irradiated so that the focal point is located at the center of the flow cell. When cells flow in the flow cell, the laser beam emits strong forward scattered light.

レーザー光の直進方向には、図１８に示す集光レンズ３１が設置されており、前方散乱光を集光する。散乱せずにフローセルを通り直進してきたレーザー光は遮蔽板３２によって遮断される。前方散乱光の検出にはフォトダイオード２５（感光性半導体素子）を用いる。細胞によって発せられた前方散乱光は電圧パルス信号として処理される。 A condensing lens 31 shown in FIG. 18 is installed in the straight direction of the laser light, and condenses forward scattered light. Laser light that has traveled straight through the flow cell without being scattered is blocked by the shielding plate 32. A photodiode 25 (photosensitive semiconductor element) is used for detecting the forward scattered light. The forward scattered light emitted by the cell is processed as a voltage pulse signal.

ピエゾ振動板によりフローセルボディを上下に振動させると、細胞の含まれた流束は次第に下方で液滴２６になる。液滴化された液滴には、１個以下の細胞が含まれている。 When the flow cell body is vibrated up and down by the piezo diaphragm, the flux containing the cells gradually becomes droplets 26 downward. A droplet formed into droplets contains one or less cells.

フローセルの下方には２つの分離可能な培養皿Ａ２８、培養皿Ｂ２９が図１５に示すように組み合わさって置かれている。培養皿Ａ２８には等間隔に並んだ穴２７が空いており、穴の径は下部にいくに従って小さくなっており、最下点の径は播種する細胞の大きさより大きく作ってある。これらの穴の表面は細胞が付着しないように親水性加工している。また、培養皿Ｂ２９の表面上には細胞が付着するように加工している。 Below the flow cell, two separable culture dishes A28 and B29 are placed in combination as shown in FIG. The culture dish A28 has holes 27 arranged at equal intervals, the diameter of the holes decreases toward the lower part, and the diameter of the lowest point is made larger than the size of the cells to be seeded. The surface of these holes is hydrophilic so that cells do not adhere. Moreover, it is processed so that cells adhere on the surface of the culture dish B29.

培養皿（Ａ、Ｂ）は検出器（フォトダイオード）による細胞による前方散乱光の検出に同期して位置を変更できるようになっている。
（動作の説明）
細胞懸濁液を圧によって送りだし、フローセルから流す。ピエゾ振動板によって液滴化され、そのまま下方の培養皿上の穴に落ちる。フローセルは測定中常時レーザー光２４が照射されており、細胞による前方散乱光が検出されると、電圧パルス信号として制御装置に読取られ、細胞が通過したことを確認する。 The position of the culture dish (A, B) can be changed in synchronization with the detection of forward scattered light by the cells by the detector (photodiode).
(Description of operation)
The cell suspension is pumped out by pressure and flowed from the flow cell. It is formed into droplets by the piezo diaphragm and falls into the hole on the lower culture dish. The flow cell is always irradiated with laser light 24 during measurement, and when forward scattered light by the cell is detected, it is read by the control device as a voltage pulse signal to confirm that the cell has passed.

その後、制御装置により次の細胞がまだ入っていない培養皿上の穴がフローセルの直下に来るように培養皿を移動させる。上記の繰り返しにより、最終的に培養皿の各穴に１つずつ細胞が入る。よって、培養する前の細胞数が少ない場合に適している。 Thereafter, the culture dish is moved by the control device so that the hole on the culture dish in which the next cell has not yet entered is immediately below the flow cell. By repeating the above, one cell finally enters each hole of the culture dish. Therefore, it is suitable when the number of cells before culturing is small.

このまま重力によって細胞を培養皿Ｂ２９の表面上にまで沈降させ、細胞が培養皿Ｂ２９の表面上に付着するまで待つ。各細胞が十分に培養皿Ｂ２９の表面上に付着したところで、培養皿Ａ２８を脱離する。脱離後、新たな培地を培養皿Ｂ２９上に供給する。 In this state, the cells are allowed to settle to the surface of the culture dish B29 by gravity and wait until the cells adhere to the surface of the culture dish B29. When each cell has sufficiently adhered to the surface of the culture dish B29, the culture dish A28 is detached. After desorption, a new medium is supplied onto the culture dish B29.

培地を適度に交換することで、無継代で目的の細胞数まで培養を続ける。
（実験例）
ｈＭＳＣを、フローセルを通して、径３０ｃｍ^２の培養皿Ｂ上に等間隔に播種した。６時間培養し、細胞が培養皿底面に付着したところで培養皿Ａを取り外した。その後、３日に１度培地交換を行いながら、培養を続け、細胞はコンフルエントな状態まで増殖した。 By appropriately changing the medium, the culture is continued to the desired number of cells without passage.
(Experimental example)
hMSCs were seeded at regular intervals on a culture dish B having a diameter of 30 cm ² through a flow cell. After culturing for 6 hours, the culture dish A was removed when the cells adhered to the bottom of the culture dish. Thereafter, the culture was continued while changing the medium once every three days, and the cells grew to a confluent state.

均一播種と局所播種を示す平面図である。It is a top view which shows uniform sowing and local sowing. 均一播種と局所播種でそれぞれ培養した際の細胞の比増殖速度を示す図である。It is a figure which shows the specific growth rate of the cell at the time of culture | cultivating by uniform seeding and local seeding, respectively. 各播種密度でのｈＭＳＣの増殖曲線である。FIG. 6 is a growth curve of hMSC at each seeding density. 培地の密度調整を行って振とう培養行ったときと、密度調整を行わずに振とう培養を行ったときの細胞の状態を示した図である。It is the figure which showed the state of the cell when carrying out the shaking culture without adjusting the density of a culture medium, and when carrying out the shaking culture without adjusting the density. ＩＢＬＭｅｄｉａＩを用い各細胞接着性領域上でｈＭＳＣを培養した際の細胞接着性領域への細胞への接着率を示した図である。It is the figure which showed the adhesion rate to the cell adhesion area | region when hMSC was cultured on each cell adhesion area | region using IBL Media I. ＱＢＳＦ−６０を用い各細胞接着性領域上でｈＭＳＣを培養した際の細胞接着性領域への細胞への接着率を示した図である。It is the figure which showed the adhesion rate to the cell adhesion area | region when hMSC was cultured on each cell adhesion area | region using QBSF-60. 基板上の細胞接着性領域パターンを示す図である。It is a figure which shows the cell adhesive region pattern on a board | substrate. 基板上の細胞接着性領域パターンにおける培養細胞の接着状態を示す図である。It is a figure which shows the adhesion state of the cultured cell in the cell adhesive region pattern on a board | substrate. 培養床表面に細胞接着性領域を縦方向及び横方向に等間隔に配列した付着性細胞の培養容器を有する培養装置を示す図である。It is a figure which shows the culture apparatus which has the culture container of the adherent cell which arranged the cell-adhesive area | region in the vertical direction and the horizontal direction at equal intervals on the culture floor surface. 細胞付着に接着性物質を必要とする培養で培養する培養装置を示す図である。It is a figure which shows the culture apparatus which culture | cultivates by culture | cultivation which requires an adhesive substance for cell adhesion. 細胞付着に接着性物質を必要としない培養で培養する培養装置を示す図である。It is a figure which shows the culture apparatus which culture | cultivates by culture | cultivation which does not require an adhesive substance for cell adhesion. 培養容器を傾斜させることで培地の交換を行うことを示す図である。It is a figure which shows exchanging a culture medium by inclining a culture container. 取り外し可能に密着させた多孔シートを、細胞が培養床表面に付着した後に、多孔シートを培養床表面から剥離して培養することを特徴とする付着性細胞の培養装置を示した図である。It is the figure which showed the culture | cultivation apparatus of the adhesive cell characterized by peeling and cultivating the porous sheet from the culture bed surface, after the cell adhered to the culture bed surface, the porous sheet closely_contact | adhered so that removal was possible. 多孔平板と密着、あるいは剥離することが可能な形態で固定したことを特徴とする付着性細胞の培養容器を示す図である。It is a figure which shows the culture | cultivation container of the adherent cell characterized by fixing in the form which can be closely_contact | adhered or peeled with a porous flat plate. 均一播種装置の縦断測面図である。It is a longitudinal section of the uniform seeding device. 上記均一播種装置の上面図である。It is a top view of the said uniform sowing apparatus. フローセルの構造を示す略図である。1 is a schematic diagram showing the structure of a flow cell. 前方散乱光の検出法を説明した図である。It is a figure explaining the detection method of forward scattered light.

符号の説明Explanation of symbols

１…培養フラスコ、２…付着性細胞、３…局所播種の範囲、４… 細胞接着性物質がコートされた領域、５…増殖した細胞、６…培養容器、７…接着性物質、８…培養床、９…排気口、１０…廃液口、１１…通気口、１２…送液口、１３…細胞付着に接着性物質が必要な培地の容器、１４…細胞付着に接着性物質が必要ない培地の容器、１５…細胞付着に接着性物質が必要な培地、１６…細胞付着に接着性物質が必要ない培地、１７…培地排出用チューブ、１８…親水性ポリマー加工シート、１９…貫通口、２０…培地、２１…細胞懸濁液、２２…サンプルライン、２３…フローセルボディ、２４…レーザー光、２５…フォトダイオード、２６…液滴、２７…穴、２８…培養皿Ａ、２９…培養皿Ｂ、３０…シース液、３１…集光レンズ、３２…遮蔽版、３３…上部廃液口、３４…下部廃液口、３５…上部送液口、３６…下部送液口、３７…側面通気口、３８…底面通気口、３９…培地タンク、４０…試薬タンク、４１…送液ポンプ、４２…ガスボンベ。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Culture flask, 2 ... Adherent cell, 3 ... Range of local seeding, 4 ... Area coated with cell adhesive substance, 5 ... Proliferated cell, 6 ... Culture container, 7 ... Adhesive substance, 8 ... Culture Floor, 9 ... exhaust port, 10 ... waste liquid port, 11 ... vent, 12 ... liquid supply port, 13 ... container of medium that requires an adhesive substance for cell attachment, 14 ... medium that does not require an adhesive substance for cell attachment 15... Medium that requires an adhesive substance for cell attachment, 16... Medium that does not require an adhesive substance for cell attachment, 17... Tube for medium discharge, 18. ... medium, 21 ... cell suspension, 22 ... sample line, 23 ... flow cell body, 24 ... laser light, 25 ... photodiode, 26 ... droplet, 27 ... hole, 28 ... culture dish A, 29 ... culture dish B 30 ... sheath liquid, 31 ... condensing lens 32 ... Shielding plate, 33 ... Upper waste liquid port, 34 ... Lower waste liquid port, 35 ... Upper liquid feed port, 36 ... Lower liquid feed port, 37 ... Side vent, 38 ... Bottom vent, 39 ... Medium tank, 40 ... Reagent tank, 41 ... liquid feed pump, 42 ... gas cylinder.

Claims

付着性細胞を、培養容器の培養床表面にコンフルエントな細胞密度の１／１０^３以下となる低密度で播種し、培養によってコンフルエントな細胞密度まで増殖させることを特徴とする付着性細胞の培養方法。 A method for culturing adherent cells, characterized in that adherent cells are seeded on a culture bed surface of a culture vessel at a low density of 1/10 ³ or less of confluent cell density, and grown to confluent cell density by culture. .

請求項１に記載の付着性細胞の培養方法において、播種する際には、接触阻害の影響が出ない略等距離の間隔で播種することを特徴とする付着性細胞の培養方法。 2. The method for culturing adherent cells according to claim 1, wherein, when seeding, seeding is performed at substantially equidistant intervals that do not affect the contact.

請求項１に記載の付着性細胞の培養方法において、付着性細胞を浮遊化して懸濁した培地に、細胞に凝集活性を有しない高分子の比重調整剤を添加し、細胞が培養床まで沈降するまでに培養溶液中に均一に拡散するような沈降速度となるように培地の比重を調整することを特徴とする付着性細胞の培養方法。 2. The method for culturing adherent cells according to claim 1, wherein a polymer specific gravity adjusting agent that does not have an aggregating activity is added to a culture medium in which adherent cells are suspended and suspended, and the cells settle to the culture bed. A method for culturing adherent cells, characterized in that the specific gravity of the medium is adjusted so that the sedimentation rate is such that it uniformly diffuses into the culture solution by the time.

請求項３に記載の付着性細胞の培養方法において、前記比重調整剤がパーコール又はポリビニルピロリドンであることを特徴とする付着性細胞の培養方法。 The method for culturing adherent cells according to claim 3, wherein the specific gravity adjusting agent is Percoll or polyvinylpyrrolidone.

請求項１に記載の付着性細胞の培養方法において、付着性細胞の大きさと実質的に同じ大きさを持ち、コンフルエントな細胞密度の１／１０^３以下となる低密度で縦及び横方向に等間隔に配列された細胞接着性領域に付着性細胞を接着させることを特徴とする付着性細胞の培養方法。 2. The method for culturing adherent cells according to claim 1, wherein the adherent cells have substantially the same size as the adherent cells, and have a low density such as 1/10 ³ or less of the confluent cell density in the longitudinal and lateral directions. A method for culturing adherent cells, comprising adhering adherent cells to cell adhesive regions arranged at intervals.

請求項１に記載の付着性細胞の培養方法において、播種する際には、培地に浮遊化した前記付着性細胞が通過可能で、コンフルエントな細胞密度の１／１０^３以下となる密度の貫通孔を配列した多孔シートを、前記培養床表面から分離可能な状態で密着させ、前記細胞を培養容器の上方向または一方の壁面側から注入して前記細胞を播種し、該細胞が培養床表面に付着した後に、該多孔シートと前記培養床表面とを分離して培養することを特徴とする付着性細胞の培養方法。 2. The method for culturing adherent cells according to claim 1, wherein when seeded, the adherent cells suspended in the medium can pass through, and the through-hole has a density that is 1/10 ³ or less of the confluent cell density. The cells are in close contact with the culture bed surface in a separable state, the cells are injected from above or on one wall side of the culture vessel, and seeded with the cells. After adhering, the method for culturing adherent cells, wherein the porous sheet and the culture bed surface are separated and cultured.

請求項６に記載の付着性細胞の培養方法において、多孔シートを培養面から分離することを特徴とする付着性細胞の培養方法。 The method for culturing adherent cells according to claim 6, wherein the porous sheet is separated from the culture surface.

請求項６に記載の付着性細胞の培養方法において、培養面を多孔シートから分離することを特徴とする付着性細胞の培養方法。 7. The method for culturing adherent cells according to claim 6, wherein the culture surface is separated from the porous sheet.

請求項６に記載の付着性細胞の培養方法において、前記注入は、多孔シートの貫通孔に、超音波装置を有する細胞注入手段によって個々の細胞を分別して注入することを特徴とする付着性細胞の培養方法。 7. The method for culturing adherent cells according to claim 6, wherein the injection is performed by separating and injecting individual cells into a through-hole of a porous sheet by a cell injection means having an ultrasonic device. Culture method.

細胞付着性材質からなる培養床表面と、液体の流入口及び流出口と、比重調整剤を用いることにより細胞が培養床まで沈降するまでに培養溶液中に均一に拡散するような沈降速度となるように比重調製された溶液を収容する容器とを有することを特徴とする付着性細胞の培養装置。 By using a culture bed surface made of a cell-adhesive material, a liquid inlet / outlet and a specific gravity adjusting agent, the sedimentation rate is such that the cells diffuse uniformly into the culture solution before they settle down to the culture bed. And a container for storing a solution having a specific gravity adjusted as described above.

請求項１０に記載の付着性細胞の培養装置において、前記比重調整された溶液に用いる比重調整剤がパーコール又はポリビニルピロリドンであることを特徴とする付着性細胞の培養装置。 11. The apparatus for culturing adherent cells according to claim 10, wherein the specific gravity adjusting agent used in the solution having the adjusted specific gravity is Percoll or polyvinylpyrrolidone.

光透過性を有し、細胞を培養する為の容器底面と、液体の流入口及び流出口と、前記底面に付着性細胞の大きさと実質的に同じ大きさを持ち、コンフルエントな細胞密度の１／１０^３以下となる低密度で縦及び横方向に等間隔に配列された細胞接着性領域を有することを特徴とする付着性細胞の培養装置。 It is light transmissive, has a bottom surface for culturing cells, a liquid inlet and outlet, and a size substantially the same as the size of adherent cells on the bottom surface, and has a confluent cell density of 1 An apparatus for culturing adherent cells, comprising cell adhesion regions arranged at equal intervals in the vertical and horizontal directions at a low density of / 10 ³ or less.

請求項１２に記載の付着性細胞の培養装置において、前記細胞接着性領域が細胞接着性蛋白質膜からなることを特徴とする付着性細胞の培養装置。 13. The apparatus for culturing adherent cells according to claim 12, wherein the cell adhesive region comprises a cell adhesive protein film.

光透過性を有し、細胞を培養する為の容器底面と、液体の流入口及び流出口と、コンフルエントな細胞密度の１／１０^３以下となる密度の貫通孔を配列した多孔シートを有することを特徴とする付着性細胞の培養装置。 It has a light-transmitting perforated sheet in which a vessel bottom for culturing cells, a liquid inlet / outlet, and a through-hole having a density of 1/10 ³ or less of confluent cell density are arranged. An apparatus for culturing adherent cells characterized by the above.

請求項１４に記載の付着性細胞の培養装置において、細胞分離のための超音波発生装置と、細胞を注入する細胞注入手段を有することを特徴とする付着性細胞の培養装置。 15. The apparatus for culturing adherent cells according to claim 14, comprising an ultrasonic generator for cell separation and a cell injection means for injecting cells.

請求項１４に記載の付着性細胞の培養装置において、前記多孔シートの厚みが、浮遊化した付着性細胞の平均細胞径の０．５から１．５倍であることを特徴とする付着性細胞の培養装置。 The adherent cell culture apparatus according to claim 14, wherein the thickness of the porous sheet is 0.5 to 1.5 times the average cell diameter of the suspended adherent cells. Culture equipment.

請求項１４に記載の付着性細胞の培養装置において、前記多孔シートの表面材質が、細胞への付着性について難付着性である親水性材質であり、培養床の表面材質が、細胞への付着性について易付着性である疎水性材質であることを特徴とする付着性細胞の培養装置。 The apparatus for culturing adherent cells according to claim 14, wherein the surface material of the porous sheet is a hydrophilic material that is difficult to adhere to the cells, and the surface material of the culture bed is attached to the cells. A device for culturing adherent cells, characterized in that it is a hydrophobic material that is easily adherent.