JP2006211994A - 非小細胞肺癌に対する抗癌剤の抗癌特性決定方法 - Google Patents
非小細胞肺癌に対する抗癌剤の抗癌特性決定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006211994A JP2006211994A JP2005030296A JP2005030296A JP2006211994A JP 2006211994 A JP2006211994 A JP 2006211994A JP 2005030296 A JP2005030296 A JP 2005030296A JP 2005030296 A JP2005030296 A JP 2005030296A JP 2006211994 A JP2006211994 A JP 2006211994A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- expression level
- anticancer agent
- anticancer
- lung cancer
- small cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【解決手段】 非小細胞肺癌細胞のガングリオシドGM3合成酵素遺伝子(SAT-I)の発現量と抗癌剤の抗癌効果との相関関係を求めることを含む抗癌剤の特性決定方法を提供する。
【選択図】なし
Description
これは各がん種においてGM3発現レベルと薬剤耐性との相関関係に差があることを示唆しており、各がん種について検討を行わなければならないと云える。この報告ではヒト非小細胞肺癌での検討は行われていない。
腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌等の非小細胞肺がんは小細胞肺がんに比べ、化学療法や放射線療法に対する感受性が低く、治療法も大きく異なる。
すなわち本発明は、非小細胞肺癌細胞のガングリオシドGM3合成酵素遺伝子(SAT−I)の発現量と抗癌剤の抗癌効果との相関関係を求めることを含む抗癌剤の特性決定方法を要旨とする。
SAT−I遺伝子の発現量は癌細胞の該遺伝子から発現されるSAT−ImRNAまたはSAT−Iタンパク質を測定することによって行うことができる。検出方法はSAT−IのmRNAあるいはタンパク質を検出、および抗癌剤感受性・耐性細胞間での発現量の比較が可能であれば特に限定されるものではない。
mRNAなどのRNA分子をノ−ザンブロット法で検出する場合には、その検出用プロ−ブは1本鎖である必要がある。1本鎖DNAプロ−ブの作製にはオリゴヌクレオチドの使用、ランダムPCRなどがあるが、一本鎖プロ−ブとしては、RNAプロ−ブを利用する方法が感度が高く好ましい。RNAプロ−ブはT7やSp6等のRNAポリメラーゼのプロモ−タ−配列の上流にクロ−ニングしてあるDNA配列を鋳型として、アンチセンスRNAを合成する。この時、標識されたヌクレオチドを基質とすることで、標識されたRNAプロ−ブを作製することが出来る。
10cmディッシュに細胞をコンフルエントになるまで培養し、PBS(リン酸緩衝食塩水(phosphate-buffered saline))で3回洗浄する。Trizol(RNA抽出用フェノール性試薬、ギゾゴ社製)を1mlを加え、室温で2分間静置した後、スクレイプして1.5mlのチューブに回収する。ピペッティングにより細胞を完全に溶解した後、室温で10分間インキュベートする。クロロホルムを200μl加え30秒間懸濁した後、2分間静置し、4℃、12,000rpmで、15分間遠心し、相分離を行う。上層を新しい1.5mlチューブに移し、等量(500μl)の冷イソプロパノールを加えて10秒間懸濁した後、10分間静置し、4℃、12,000rpmで、10分間遠心してRNAを析出させる。上清をデカントして70%エタノール−DEPC(ジエチルピロカーボネート)処理水を1ml加え、軽く懸濁して洗浄し、4℃、12,000rpmで、5分間遠心した後、デカントして塩を取り除く。このチューブをデシケーターで乾燥させ、完全に水分を除去した後、DEPC処理水20μlでRNAを溶解する。保存は−80℃で行う。
R1は、CH30,または
R2は水素、またはフルオロを表す)
で表される化合物である。
実施例
・細胞培養
以下の各種非小胞癌細胞を用いた。
ヒト肺腺癌由来細胞株 (PC3、LCSC#1、LCSC#2、NCI-H23、ABC-1)
ヒト肺扁平上皮癌由来細胞株 (NCI-H226、LK-2、EBC-1)
ヒト肺大細胞癌由来細胞株 (OBA-LK1、Lu99、Lu99B、Lu65)
を10% ウシ胎児血清 (FBS)、
これら細胞を100 units/mLペニシリン、100ng/mLストレプトマイシンを含むRPMI1640培地中(以下培地は特に記載がないもの以外、この培地を指すこととする)で培養した。
PC3、NCI−H23、NCI−H226、ABC−1は北海道大学井上勝一助教授の御好意により供与を受け、その他は東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより入手した。
10cmディッシュに各細胞をコンフルエントになるまで培養し、生理食塩水で洗浄後、Trizol(RNA抽出用フェノール試薬 Gibco社)を1mL加え、室温で2分間静置したのち、スクレイプして1.5mLチューブに回収した。ピペッティングにより細胞を完全に溶解した後、室温で10分間インキュベートした。クロロホルムを200μL加え30秒間懸濁した後、2分間静置し4℃ 12,000rpmで15分間遠心し、相分離をおこなった。上層を新しい1.5mLチューブに移し、500μLの冷イソプロパノールを加えて10秒間懸濁した後、10分間静置し、4℃ 12,000rpmで10分間遠心してRNAを沈殿させた。上清を捨て70%エタノール−DEPC(ジエチルピロカーボネート)処理水を1mL加え、軽く懸濁して洗浄し、4℃ 12,000rpmで5分間遠心した後、上清を除去し塩をとりのぞいた。このチューブをデシケーターで乾燥させ、完全にエタノールを除去した後、DEPC処理水20μLでRNAを溶解した。
1st Strand cDNA Synthesis kit for RT-PCR(AMV)を使用した。
抽出・精製した全RNA 2.5μg分をRNaseを含まない水で希釈し23.2μlにした。これに10×反応緩衝液5μl、25mM MgCl2 10μl、デオキシヌクレオチドMix5μl、ランダムプライマー5μlを加え、よく撹拌し、スピンダウンした後65℃で5分間インキュベートした。RNase阻害剤1μlとAMV逆転写酵素0.8μlを加え、室温で10分間、次に42℃で60分間、つづいて95℃で5分間インキュベートし、cDNAを合成した。リアルタイムPCR
合成したcDNAを鋳型として、SAT−Iならびに内在性コントロール(RPLP0;ribosomal protein Large P0)に対する特異的なプローブ・プライマーセットを用いてリアルタイムPCRを行った。検出、定量には7500 リアルタイム PCR システム (ABI PRISM)を使用した。内在性コントロールにより実験手技等によるぶれを補正し、SAT−IのmRNA発現量を定量した。
使用したプローブ・プライマーは以下の通りである。
ヒト SAT-I
hSAT-I プローブ 5’-FAM-gaaaccctgccattctgggtacgac-MGB-3’(FAMはフルオレセインカルボキシアミドを表し、MGBとはminor groove binder(Tm enhancer)を表す)
hSAT-I 前進プライマー 5’-gcgcaccactgtctgacctt-3’
hSAT-I 逆プライマー 5'-ttctgccacctgcttccaa-3'
ヒト RPLP0 とは Pre-Developed TaqMan(登録商標) Assay Reagents Human RPLP0 (Applied Biosystems)を表す。
96穴プレートに細胞を、増殖の非常に遅いPC3は1×104ずつ、その他の細胞は5×103ずつ播種し培地中で24時間予備培養した。薬液の調製は、シスプラチンはDMSO(ジメチルスルホキシド)で300mMに溶解、カルボプラチンは培地で3mMに溶解、AG1478はDMSOで10mMに溶解した。これらを原液とし、各溶媒で適宜希釈した。これらの薬液を培地に添加し、シスプラチンは終濃度1nM〜3mM、カルボプラチンは終濃度1nM〜3mM、AG1478では終濃度0.1nM〜100μMとなるよう薬液入り培地を調製した。この時予備培養した細胞の培地を、これらの薬液入り培地及び、薬品を希釈した溶媒のみを含む培地(薬物未接触)100μLで置き換え、70時間培養した。70時間後に細胞毒性測定用試薬 Cell Counting Kit-8を各穴10μLずつ加え、2時間後培地の450nMにおける吸光度を測定した。この吸光度の値から
阻害率 (%)=(1−薬物接触群/薬物未接触群)×100
上の式にしたがって阻害率 (%)を算出し、解析ソフトOriginを使用し、阻害率(%)をY軸に、濃度の対数をX軸にとり、濃度−阻害効果曲線を作成した。さらに以下の式 (シグモイド曲線)にフィッティングさせIC50を算出した。
Claims (12)
- 非小細胞肺癌細胞のガングリオシドGM3合成酵素遺伝子(SAT−I)の発現量と抗癌剤の抗癌効果との相関関係を求めることを含む抗癌剤の特性決定方法。
- 非小細胞癌が腺癌(adenocarcinoma)、扁平上皮癌(squamous cell carcinoma)、または大細胞癌(large cell carcinoma)である請求項1に記載の方法。
- ガングリオシドGM3合成酵素遺伝子(SAT−I)の発現量を該遺伝子から発現されるmRNA量を測定する請求項1または2に記載の方法。
- mRNA発現量をノ−ザンブロット法で測定する請求項3に記載の方法。
- 請求項3または4に記載のmRNA発現量を測定するために用いる、配列番号1のヌクレオチド配列を有するDNA若しくはその断片、またはそれらに対応するDNAよりなるプロ−ブ。
- ガングリオシドGM3合成酵素遺伝子の発現量を、該遺伝子からなる発現されるタンパク質を測定する請求項1〜2のいずれかに記載の方法。
- タンパク発現量をウエスタンブロット法で測定する請求項6に記載の方法。
- 請求項6〜8に記載のタンパク質発現量を測定するために用いる、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片に対する抗体。
- 抗癌剤がプラチナ製剤である請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- プラチナ製剤がシスプラチン(Cisplatin)またはカルボプラチン(Carboplatin)である請求項9に記載の方法。
- 抗癌剤がEGFR(上皮細胞成長因子受容体)チロシンキナ−ゼ阻害剤である1〜7のいずれかに記載の方法。
- EGFR(上皮細胞成長因子受容体)チロシンキナ−ゼ阻害剤がAG1478(4−(3−クロロアニリノ)−6,7−ジメトキシキナゾリン)またはその誘導体である請求項11の記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005030296A JP2006211994A (ja) | 2005-02-07 | 2005-02-07 | 非小細胞肺癌に対する抗癌剤の抗癌特性決定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005030296A JP2006211994A (ja) | 2005-02-07 | 2005-02-07 | 非小細胞肺癌に対する抗癌剤の抗癌特性決定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006211994A true JP2006211994A (ja) | 2006-08-17 |
Family
ID=36975707
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005030296A Pending JP2006211994A (ja) | 2005-02-07 | 2005-02-07 | 非小細胞肺癌に対する抗癌剤の抗癌特性決定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2006211994A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016536001A (ja) * | 2013-09-09 | 2016-11-24 | アルマック・ダイアグノスティクス・リミテッドAlmac Diagnostics Limited | 肺がんのための分子診断試験 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004099407A1 (ja) * | 2003-05-09 | 2004-11-18 | Chemical Biology Institute | 抗癌剤感受性試験方法 |
-
2005
- 2005-02-07 JP JP2005030296A patent/JP2006211994A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004099407A1 (ja) * | 2003-05-09 | 2004-11-18 | Chemical Biology Institute | 抗癌剤感受性試験方法 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016536001A (ja) * | 2013-09-09 | 2016-11-24 | アルマック・ダイアグノスティクス・リミテッドAlmac Diagnostics Limited | 肺がんのための分子診断試験 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111961725B (zh) | 胰腺癌的检测试剂盒或装置以及检测方法 | |
JP5951603B2 (ja) | 乳がんの診断および治療 | |
JP6216470B2 (ja) | 甲状腺腫瘍の分類におけるmiRNA発現シグネチャー | |
JP2019528081A (ja) | 子宮内膜症についてのバイオマーカーとしてのマイクロrna | |
Nakamura et al. | Krüppel‐like factor 12 plays a significant role in poorly differentiated gastric cancer progression | |
CN111826444B (zh) | 一种与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA标志物、探针及其应用 | |
CN107488726B (zh) | 一种肾癌预后评估生物标志物及其检测试剂和应用 | |
JP7235508B2 (ja) | Pd-1免疫チェックポイント阻害剤による治療に対するがんの感受性を予測する方法 | |
KR20120132592A (ko) | 실시간 중합반응을 이용한 암의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 암 진단용 키트 | |
Rao et al. | Identification of plasma exosomes long non-coding RNA HAGLR and circulating tumor cells as potential prognosis biomarkers in non-small cell lung cancer | |
JP2014020930A (ja) | 膵癌診断及び治療効果予測判定バイオマーカー | |
Meckawy et al. | Natural killer NKG2A and NKG2D in patients with colorectal cancer | |
WO2015137406A1 (ja) | 肺扁平上皮癌と肺腺癌の鑑別評価方法 | |
Ryozawa et al. | GENETIC DIAGNOSIS OF PANCREATIC CANCER USING SPECIMENS OBTAINED BY EUS‐FNA | |
JP2007082433A (ja) | 悪性脳腫瘍マーカー遺伝子およびその用途 | |
JP2006211994A (ja) | 非小細胞肺癌に対する抗癌剤の抗癌特性決定方法 | |
EP2930248B1 (en) | Method for predicting sensitivity of osteosarcoma patient to anticancer agent | |
CN101671728B (zh) | 一种检测癌胚抗原mRNA表达量的方法及专用试剂盒 | |
CN111534587A (zh) | 分子标志物5-tRF-His、乳腺癌检测试剂盒及其应用 | |
EP3930729A1 (en) | Diagnosis and treatment of medulloblastoma | |
CN109642257B (zh) | 药物疗法对癌的效果的预测方法 | |
JP5312024B2 (ja) | ヒトがん細胞の不死化に関わる遺伝子およびその利用 | |
JP2013085542A (ja) | 胃癌の検出方法、胃癌の血液マーカーおよびその使用 | |
KR102216943B1 (ko) | 간암 진단을 위한 바이오마커 조성물 | |
CN115125304B (zh) | 一种用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的ceRNA调控网络及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Effective date: 20070807 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 |
|
A521 | Written amendment |
Effective date: 20070807 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 |
|
A621 | Written request for application examination |
Effective date: 20080128 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20090917 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20100330 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100720 |