JP2006199798A - Minute particle having reactive functional group - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、遺伝子診断、免疫診断、医薬品開発、環境試験等に使用される標識プローブを封入した微粒子に関する。 The present invention relates to a microparticle encapsulating a labeled probe used for genetic diagnosis, immunodiagnosis, drug development, environmental testing and the like.
免疫測定など、生体物質を分析する分野では、酵素または蛍光剤などのシグナル物質でプローブを標識とし、例えば抗原−抗体間の反応等を間接的に分析することが知られている。標識として使用されるシグナル物質は、疎水基が表層に露出しているものが多く、例えば蛍光ランタノイド錯体を利用することが知られている。また、プローブが高分子材料等に封入された微粒子を分析に利用することも知られている。 In the field of analyzing biological substances, such as immunoassay, it is known that a probe is labeled with a signal substance such as an enzyme or a fluorescent agent to indirectly analyze, for example, an antigen-antibody reaction. Many signal substances used as labels have a hydrophobic group exposed on the surface layer, and it is known to use, for example, a fluorescent lanthanoid complex. It is also known that fine particles in which a probe is enclosed in a polymer material or the like are used for analysis.
微粒子を製造する方法としては、例えば、シグナル物質をポリエチレングリコール（PEG）、リン脂質などの生体適合性物質で覆った微粒子を作製する手法が提案されている（特許文献１及び特許文献２参照）。これらの微粒子の製造方法は、予めマクロモノマーを作製し、末端の重合性官能基よりブロックコポリマーを作製し、凝集させ、シグナル物質を導入することで微粒子を製造する方法、シグナル物質を混合したポリマーに官能基を導入した微粒子を作製し、その官能基とPEGとを結合させることにより微粒子を製造する方法、である。この際、シグナル物質としては、例えば、蛍光ランタノイド錯体を用いられ、その微粒子は、時間分解測定法に利用される。
しかし、上記微粒子の製造方法では、微粒子を形成する前にシグナル物質を導入させることは難しい。また、作成された微粒子は、測定対象外の生体物質を疎水的相互作用によって吸着し、分析値のバックグラウンドを高めたり、バラツキを発生させる問題があった。 However, in the above method for producing fine particles, it is difficult to introduce a signal substance before forming the fine particles. In addition, the prepared fine particles have a problem in that biological substances that are not to be measured are adsorbed by hydrophobic interaction to increase the background of analysis values or cause variations.
界面活性剤を使用して微粒子を作成する場合は、界面活性剤の親水基の立体障害により、生体物質と反応性官能基との結合反応を阻害するという問題が生じる。一方、微粒子の最外殻に、界面活性剤由来の親水基が存在することから、生体物質の認識が不十分となる問題もある。 In the case of producing fine particles using a surfactant, there arises a problem that a binding reaction between a biological substance and a reactive functional group is inhibited due to steric hindrance of a hydrophilic group of the surfactant. On the other hand, since a hydrophilic group derived from a surfactant exists in the outermost shell of the fine particles, there is also a problem that recognition of biological substances becomes insufficient.
さらには、ランタノイドイオンは、元々生体中に含まれているため、生体物質を測定する際に使用される緩衝剤リン酸イオンとの相互作用により、その蛍光強度が時間とともに減少するという問題点があった。 Furthermore, since lanthanoid ions are originally contained in the living body, there is a problem in that the fluorescence intensity decreases with time due to the interaction with the buffer phosphate ions used when measuring biological substances. there were.
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、界面活性剤を用いて内部にシグナル物質の導入されたミセルを形成した微粒子を作製し、そのシグナル物質を封入した微粒子を標識として用いる際に、界面活性剤の親水基を結合サイトとして用いることで、本発明を完成するに到った。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventor produced fine particles in which a micelle into which a signal substance was introduced was formed using a surfactant, and the fine particles encapsulating the signal substance were used as a label. At this time, the present invention was completed by using the hydrophilic group of the surfactant as the binding site.
即ち、本発明は、コアシェル型ミセル構造体からなる微粒子であって、該微粒子のコアには水不溶性高分子及びシグナル発生物質を含有し、微粒子の外表面には、生体物質と反応性を有する親水性官能基が露呈している微粒子である。 That is, the present invention is a fine particle comprising a core-shell type micelle structure, the core of the fine particle contains a water-insoluble polymer and a signal generating substance, and the outer surface of the fine particle has reactivity with a biological substance. Fine particles with hydrophilic functional groups exposed.
このように作製した微粒子は、界面活性剤由来の親水基の立体障害により、非特異吸着を防ぎ、界面活性剤由来の親水基に生体物質と反応性を有する官能基が存在することで、効率的に生体物質等と結合し、生体物質等が標的を補足しやすくなったりするという利点がある。本発明にかかる微粒子は、一般的な免疫測定や免疫測定を用いた高感度分析、バイオイメージングによる生体分析、ウエスタンブロッド、イムノクロマト、DNA、RNAのハイブリダイゼーション、マイクロチップ使用時の標識剤、HPLCなどの分析に用いることができる。 The microparticles produced in this way are efficient because they prevent non-specific adsorption due to the steric hindrance of the hydrophilic group derived from the surfactant, and the functional group reactive with the biological substance exists in the hydrophilic group derived from the surfactant. In particular, there is an advantage that the biological material or the like is easily combined with the biological material or the like and the biological material or the like can easily capture the target. Fine particles according to the present invention include general immunoassay and high-sensitivity analysis using immunoassay, bioanalysis by bioimaging, Western blot, immunochromatography, DNA, RNA hybridization, labeling agent when using a microchip, HPLC, etc. It can be used for analysis.
本発明は、コアシェル型ミセル構造体からなる微粒子であって、該微粒子のコアには水不溶性高分子及びシグナル発生物質を含有し、微粒子の外表面には、生体物質と反応性を有する官能基を持った親水性官能基が露呈している微粒子、である。 The present invention is a fine particle comprising a core-shell micelle structure, the core of the fine particle contains a water-insoluble polymer and a signal generating substance, and a functional group having reactivity with a biological substance on the outer surface of the fine particle Fine particles having a hydrophilic functional group exposed to the surface.
コアシェル型ミセル構造体とは、界面活性剤がミセル形成する際に、水に溶解しにくい有機分子をミセル内部に取り込んだ構造体をいう。本発明のコアシェル型ミセル構造体からなる微粒子は、界面活性剤がミセル形成する際に、水に溶解しにくい重合性モノマーを内部に取り込み、次いで重合反応を実施することにより、コアが水不溶性高分子となっているものをいう。また、シグナル発生物質は、重合反応の際、重合性モノマー溶液に含有することにより、コア部に、シグナル発生物質を含有させることができる。 The core-shell micelle structure refers to a structure in which organic molecules that are difficult to dissolve in water are incorporated into the micelle when the surfactant forms micelles. The fine particles comprising the core-shell micelle structure of the present invention have a core that is highly water-insoluble by incorporating a polymerizable monomer that is difficult to dissolve in water into the inside when the surfactant forms micelles, and then carrying out a polymerization reaction. The one that is a molecule. Moreover, the signal generating substance can be contained in the core part by containing the signal generating substance in the polymerizable monomer solution during the polymerization reaction.
ここで、「水不溶性高分子」とは、重合性モノマーを重合することにより得られるものを指す。重合性モノマーとしては、スチレン系モノマー、（メタ）アクリレート類等が例示できる。好ましくは、（メタ）アクリレート類である。このような高分子のうち、シグナル物質との相性を判断してモノマーを選択することは重要である。（メタ）アクリレート類を使用した場合には、励起光として紫外域の波長光を用いるのに適する。また、４，４’−ビス（１”、１”、１”、２”、２”、３”、３”、−ヘプタフルオロ−４”、６”−ヘキサンジオニル−６”−）−クロロスルフォ−ｏ−テルフェニル（以下、ＢＨＨＴと称す）-Eu３+を用いるにあたっては、メチルメタクリレートを用いることで効率よく微粒子化ができる。 Here, the “water-insoluble polymer” refers to a polymer obtained by polymerizing a polymerizable monomer. Examples of the polymerizable monomer include styrene monomers and (meth) acrylates. Preferred are (meth) acrylates. Among such polymers, it is important to select a monomer by judging compatibility with a signal substance. When (meth) acrylates are used, it is suitable to use ultraviolet wavelength light as excitation light. In addition, 4,4′-bis (1 ″, 1 ″, 1 ″, 2 ″, 2 ″, 3 ″, 3 ″, -heptafluoro-4 ″, 6 ″ -hexanedionyl-6 ″-)-chlorosulfo When -o-terphenyl (hereinafter referred to as BHHT) -Eu 3+ is used, fine particles can be efficiently formed by using methyl methacrylate.
「シグナル発生物質」とは、蛍光剤、燐光剤、磁性体、放射性物質など、標識として用いることができる全ての物質を指す。さらに本発明によれば、シグナル発生物質は、ミセル構造の内部（疎水領域）に包含されるため、水中での安定性が低いものでも安定に存在させることできる。さらに、水不溶性シグナル物質については、界面活性剤由来の親水基によって包括されるため、水に易溶となることが利点として挙げられる。 The “signal generating substance” refers to all substances that can be used as a label, such as a fluorescent agent, a phosphorescent agent, a magnetic substance, and a radioactive substance. Furthermore, according to the present invention, since the signal generating substance is included in the inside (hydrophobic region) of the micelle structure, even a substance having low stability in water can be stably present. Furthermore, since the water-insoluble signal substance is covered by the hydrophilic group derived from the surfactant, it can be easily dissolved in water.
シグナル発生物質の内、微粒子の形態を取って使いやすい蛍光剤としては、蛍光錯体が挙げられる。蛍光錯体は、水中に存在するイオン又はキレート物質によって錯体の形成が不安定化することから、本発明の微粒子に包含する好ましい例と言える。蛍光錯体として、好ましくは、蛍光性ランタノイド錯体が例示される。ランタノイド金属としては、ランタノイド金属は、Eu３+、Ce３+、Pr３+、Nd３+、Nd３+、Sm2+、Sm３+、Eu2+、Tb３+、Dy３+、Dy４+、Ho３+、Er３+、Tm2+、Tm３+、Yb2+、Yb３+などがあげられる。配位子としては、上記金属と安定な錯体構造を形成し、その錯体が十分な蛍光強度及び蛍光寿命を示すものであれば、特に制限はないが、一方にフッ素置換アルキル基、他方にビフェニル基を有するβ−ジケトン骨格を有する配位子が蛍光効率を高める点で好ましい。 Among the signal generating substances, fluorescent complexes that can be used in the form of fine particles include fluorescent complexes. The fluorescent complex can be said to be a preferable example included in the fine particles of the present invention because formation of the complex is destabilized by ions or chelating substances present in water. The fluorescent complex is preferably a fluorescent lanthanoid complex. As lanthanoid metals, lanthanoid metals are Eu 3+ , Ce 3+ , Pr 3+ , Nd 3+ , Nd 3+ , Sm 2+ , Sm3 +, Eu 2+ , Tb 3+ , Dy 3+ , Dy 4 + , Ho 3+ , Er 3+ , Tm 2+ , Tm 3+ , Yb 2+ , Yb 3+ and the like. The ligand is not particularly limited as long as it forms a stable complex structure with the above metal and the complex exhibits sufficient fluorescence intensity and fluorescence lifetime. However, one is a fluorine-substituted alkyl group and the other is biphenyl. A ligand having a β-diketone skeleton having a group is preferred from the viewpoint of enhancing the fluorescence efficiency.
そのような好ましい蛍光錯体の例としては、４，４’−ビス（１”、１”、１”、２”、２”、３”、３”、−ヘプタフルオロ−４”、６”−ヘキサンジオニル−６”−）−クロロスルフォ−ｏ−テルフェニル-Eu３+が挙げられる。 Examples of such preferred fluorescent complexes include 4,4′-bis (1 ″, 1 ″, 1 ″, 2 ″, 2 ″, 3 ″, 3 ″, -heptafluoro-4 ″, 6 ″ -hexane. And dionyl-6 "-)-chlorosulfo-o-terphenyl-Eu 3+ .
ミセル構造を形成するための界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレングリコール、アミノ酸、多糖類、核酸、リン脂質などを界面活性剤の親水基として用いられているものや、或いは親水性を示すものであればどのようなものでも想定でき、従って、イオン性の親水基としてはアニオン、ノニオン、カチオン全ての界面活性剤を用いることができる。疎水基については、一般的な炭化水素であれば、その形状は鎖状・環状にとらわれることはなく、例えば、アルカン、ベンゼン環など全ての疎水性を示すものを想定できる。さらには、重合性を示し、微粒子の核部分を形成するモノマーとランダムポリマーを形成するものを用いることも可能である。 As the surfactant for forming the micelle structure, for example, polyoxyethylene, polyoxypropylene glycol, amino acids, polysaccharides, nucleic acids, phospholipids and the like used as the hydrophilic group of the surfactant, or Any surfactant can be assumed as long as it exhibits hydrophilicity. Therefore, as an ionic hydrophilic group, all anionic, nonionic and cationic surfactants can be used. As for the hydrophobic group, if it is a general hydrocarbon, its shape is not limited to a chain or a ring, and for example, it can be assumed that all hydrophobic properties such as alkane and benzene ring are exhibited. Furthermore, it is also possible to use a monomer that exhibits polymerizability and forms a random polymer with a monomer that forms the core portion of the fine particles.
「親水性官能基」とは、微粒子に生体物質が結合可能なように準備された官能基をいう。生体物質としては、タンパク質、DNA、RNAなど生体に関わるあらゆる物質が想定でき、さらには細胞、組織、臓器なども挙げられる。その内のタンパク質としては、抗体、アビジン、BSＡ、無細胞によって作成されたタンパク質等が例示される。抗体として用いる場合、その形態に制限はなく、例えば、F(ab)’２、F(ab)、F(ab)’など抗体の一部も含まれる。さらには、ファージディスプレイ、細胞ディスプレイなどによって作成された抗体も想定される。 “Hydrophilic functional group” refers to a functional group prepared so that a biological substance can bind to fine particles. As biological materials, all materials related to living organisms such as proteins, DNA, and RNA can be assumed, and further, cells, tissues, organs, and the like are also included. Examples of the protein include antibodies, avidin, BSA, and a cell-free protein. When used as an antibody, its form is not limited, and includes, for example, a part of the antibody such as F (ab) '2, F (ab), F (ab)'. Furthermore, antibodies produced by phage display, cell display, etc. are also envisaged.
上記の生体物質と結合可能な官能基としては、生体物質の種類により適宜選択できる。例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、メルカプト基、マレイミド基、ビニルスルホン基、メタンスルホニル基、ヒドロキシサクシニイミド基、ヒドラジド基や更にはアリルアジド基などが挙げられる。今後の展開において、生体物質を基材に結合する際、もしくは生体物質同士を結合する際に用いられる反応官能基が新たに開発された場合においても、そのような官能基を微粒子の界面活性剤の親水基側に修飾することは基本的に可能である。 The functional group capable of binding to the biological material can be appropriately selected depending on the type of the biological material. For example, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, a mercapto group, a maleimide group, a vinyl sulfone group, a methanesulfonyl group, a hydroxysuccinimide group, a hydrazide group, and further an allyl azide group. In the future development, even when a reactive functional group used to bind biological materials to a base material or to bind biological materials to each other is developed, such functional groups are converted into fine particle surfactants. It is basically possible to modify the hydrophilic group side.
上述の構成を有する微粒子の応用を考えると、２０〜１００nmの平均粒径を持つ微粒子であることが好ましい。 Considering the application of fine particles having the above-described configuration, fine particles having an average particle diameter of 20 to 100 nm are preferable.
本発明の微粒子は、乳化重合により製造することができる。具体的には、重合性モノマー及びシグナル発生物質を含む溶液を準備し、それを窒素気流下で界面活性剤溶液に添加する。次に、好ましくは超音波を照射し、分散を促進させた状態で重合反応を開始する。 The fine particles of the present invention can be produced by emulsion polymerization. Specifically, a solution containing a polymerizable monomer and a signal generating substance is prepared and added to the surfactant solution under a nitrogen stream. Next, the polymerization reaction is preferably started in a state where the ultrasonic wave is preferably irradiated to promote dispersion.
重合温度は、開始剤の種類により任意に設定できるが、通常のアゾ系開始剤、あるいはレドックス開始剤を使用する場合には温度は５０℃から１００℃、シグナル物質の安定性を考えると７５℃〜８０℃であることが好ましい。モノマーとシグナル物質の混合比率はシグナル物質の溶解度が許す範囲内であれば任意に設定できるが、シグナル物質の効率を考えると1:1である比率が好ましい。しかし、メタクリル酸メチルを用いた場合では、シグナル物質の混合比率は全体の１０％であると良い発光効率を得られる。界面活性剤の使用量は、目標とする微粒子の粒径に依存するが、50nm程度の粒径の微粒子を作成する場合には界面活性剤の使用量は対モノマーで１０％、または重合性界面活性剤を使用する場合には２０％とするのが良い。さらに、開始剤の使用量は開始剤の種類に因るが、対モノマー比で０．０１％から１％の間で任意に設定できるが、微粒子を構成するポリマーの分子量や重合時間などを考慮すると０．０５％から０．３％の間で設定することがより好ましい。 The polymerization temperature can be arbitrarily set depending on the type of the initiator. However, when a normal azo initiator or redox initiator is used, the temperature is 50 ° C. to 100 ° C., and the stability of the signal substance is 75 ° C. It is preferable that it is -80 degreeC. The mixing ratio of the monomer and the signal substance can be arbitrarily set as long as the solubility of the signal substance allows, but a ratio of 1: 1 is preferable in view of the efficiency of the signal substance. However, when methyl methacrylate is used, good luminous efficiency can be obtained when the mixing ratio of the signal substance is 10% of the whole. The amount of the surfactant used depends on the particle size of the target fine particles. However, when producing fine particles having a particle size of about 50 nm, the amount of the surfactant used is 10% with respect to the monomer, or the polymerizable interface. When using an activator, 20% is preferable. Furthermore, although the amount of initiator used depends on the type of initiator, it can be arbitrarily set between 0.01% and 1% in terms of the monomer ratio, but the molecular weight of the polymer constituting the fine particles and the polymerization time are taken into consideration. Then, it is more preferable to set between 0.05% and 0.3%.
このような反応を実施することにより、重合性モノマーがポリマー化し、そのポリマーが核となっているコアシェル型ミセル構造体の微粒子を製造することができる。 By carrying out such a reaction, fine particles of a core-shell type micelle structure in which a polymerizable monomer is polymerized and the polymer serves as a nucleus can be produced.
ここで、界面活性剤として、重合性官能基を有する界面活性剤を使用すれば、上記重合性モノマーのミセルを形成した後にランダムポリマーを形成することができる。 Here, if a surfactant having a polymerizable functional group is used as the surfactant, a random polymer can be formed after the micelle of the polymerizable monomer is formed.
重合性界面活性剤を用いて作成した微粒子では、生体物質との結合時に、有機溶剤（ジメチルホルムアミドやジメチルスルホキシドなど。）を用いても、界面活性剤の脱落するのを防ぐことができる。 Fine particles prepared using a polymerizable surfactant can prevent the surfactant from falling off even when an organic solvent (such as dimethylformamide or dimethyl sulfoxide) is used at the time of binding with a biological substance.
このように作製した微粒子では、例えばＰＥＧ末端を有するので、末端に水酸基が存在する状態になっている。水酸基は、メタンスルホニルクロリド等を用いてメシル化後アンモニアと反応させると、アミノ基などに変換できる。また、イソシアネート基のような水酸基と結合する官能基を持つクロスリンカー等を使用すれば、微粒子に生体物質と結合性を持つ官能基の導入は可能である。 The fine particles produced in this way have, for example, a PEG end, so that a hydroxyl group exists at the end. A hydroxyl group can be converted to an amino group or the like by reacting with ammonia after mesylation using methanesulfonyl chloride or the like. In addition, if a crosslinker having a functional group that binds to a hydroxyl group such as an isocyanate group is used, it is possible to introduce a functional group having a binding property with a biological substance into the fine particles.
生体物質と結合しうる官能基を導入した微粒子は、抗体などの生体物質と結合させて、シグナルによって分析することで、免疫測定などの微量分析や、細胞等の染色、チップのハイブリダイゼーション検出などに応用できる。例えば、時間分解蛍光検出法を使用し、遺伝子解析等を行うことができる。 Microparticles introduced with functional groups capable of binding to biological materials are bound to biological materials such as antibodies and analyzed by signals, so that microanalysis such as immunoassay, staining of cells, etc., hybridization detection of chips, etc. It can be applied to. For example, gene analysis or the like can be performed using a time-resolved fluorescence detection method.
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
＜参考例１＞ 蛍光錯体の合成
蛍光錯体の一つとして、BHHT錯体の合成法を例示する。実施例には、下記の方法で作製した蛍光錯体を使用した。
Reference Example 1 Synthesis of Fluorescent Complex As an example of a fluorescent complex, a method for synthesizing a BHHT complex is illustrated. In the examples, fluorescent complexes prepared by the following method were used.
４，４’−ジアセチル−ｏ−テルフェニルの合成
０℃において、攪拌下の２００ｍｌのCH2Cl2 と、２８ｇのAlCl3 と、１６．１ｇのCH3COClの溶液に、１００ｍｌのCH2Cl2 と２３ｇのｏ−テルフェニルの溶液を徐々に滴下した。０℃で３０分間攪拌した後、室温で２４時間攪拌した。さらに２時間還流した後、反応溶液を氷＋塩酸（濃）中に注ぎ、充分攪拌した後、減圧蒸留によってCH2Cl2 を除去した。沈澱を濾別し、水でよく洗浄した。約２５０ｍｌの２−ブタノンで生成物を再結晶し、生成した針状結晶を濾別し、真空乾燥した。収量は１８．０ｇであり、収率は５７．０％であった。
Synthesis of 4,4′-diacetyl-o-terphenyl At 0 ° C., a solution of 200 ml of CH 2 Cl 2 with stirring, 28 g of AlCl 3 and 16.1 g of CH 3 COCl was added to 100 ml of CH 2 Cl 2. A solution of 2 and 23 g of o-terphenyl was slowly added dropwise. After stirring at 0 ° C. for 30 minutes, the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. After further refluxing for 2 hours, the reaction solution was poured into ice + hydrochloric acid (concentrated), stirred well, and then CH 2 Cl 2 was removed by distillation under reduced pressure. The precipitate was filtered off and washed well with water. The product was recrystallized with about 250 ml of 2-butanone, and the generated needle crystals were filtered off and dried in vacuum. The yield was 18.0 g, and the yield was 57.0%.
BHHT合成
ジメチルホルムアミド５００ｍＬ中に６４．３ｇのNaOCH3 、１８．０ｇの４，４’−ジアセチル−ｏ−テルフェニルを４５℃で攪拌し、溶解した。３０ｇのC3F7COOC2H5 を滴下し、密封し、４５℃で４時間攪拌した。水５００ｇに５８ｇの硫酸を溶解し、滴下して生成物を中和した。ＭＴＢＥにより、抽出を行い、飽和NaCl水溶液でよく洗浄し、MgSO4を加え、MTBEを減圧し留去した。エタノール９００ｍＬを加え、８０℃に加熱し、熱時ろ過した後、室温にて１２時間静置した。析出物をろ過し、除去した後、さらにエタノールを減圧留去し、ヘプタンを結晶が出るまで添加して、再結晶により精製を行った。
BHHT synthetic <br/> dimethylformamide 500mL of 64.3g in NaOCH 3, and stirred at 45 ° C. of 4,4'-diacetyl -o- terphenyl of 18.0 g, and dissolved. 30 g of C 3 F 7 COOC 2 H 5 was added dropwise, sealed and stirred at 45 ° C. for 4 hours. 58 g of sulfuric acid was dissolved in 500 g of water and added dropwise to neutralize the product. Extraction was performed by MTBE, and the mixture was washed well with a saturated aqueous solution of NaCl, MgSO 4 was added, and MTBE was distilled off under reduced pressure. 900 mL of ethanol was added, heated to 80 ° C., filtered while hot, and then allowed to stand at room temperature for 12 hours. After the precipitate was filtered and removed, ethanol was further distilled off under reduced pressure, and heptane was added until crystals appeared, and purification was performed by recrystallization.
２．微粒子の作製
乳化重合による微粒子作製
丸底になっているガラス容器内に、水１２．５mL入れ、界面活性剤ポリオキシエチレンラウリルエーテル２．５ｍｇを水に溶解させ、添加した。次にメチルメタクリレートにBHHT-Eu3+錯体を溶解させ、を界面活性剤にゆっくりと添加した。ガラス容器内部を窒素置換し、さらに超音波を２０分程度照射した。このガラス溶液に還流菅を取り付け、攪拌子にて攪拌しながらゆっくりと０．１％過流酸カリウム溶液２．５ｍＬ添加した。ゆっくりと攪拌を続け、７５℃まで昇温し、５時間保持した。得られた溶液からサンプルを採取し、残ったメチルメタクリレートを、以下の条件でガスクロにて分析した結果、検出圏外となり、全てのメチルメタクリレートが重合しているということが判明した。さらに、得られた微粒子溶液を粒径測定装置（粒径測定装置（光散乱）：大塚電子DLS-７００）にて分析した結果、平均４０nm程度の粒径をもつ微粒子であるということが判明した。
2. Fine particle production
Preparation of fine particles by emulsion polymerization In a glass container having a round bottom, 12.5 mL of water was placed, and 2.5 mg of surfactant polyoxyethylene lauryl ether was dissolved in water and added. Next, the BHHT-Eu 3+ complex was dissolved in methyl methacrylate and was slowly added to the surfactant. The inside of the glass container was replaced with nitrogen, and further irradiated with ultrasonic waves for about 20 minutes. A reflux tank was attached to this glass solution, and 2.5 mL of a 0.1% potassium persulfate solution was slowly added while stirring with a stirrer. Stirring was continued slowly, the temperature was raised to 75 ° C. and held for 5 hours. A sample was collected from the obtained solution, and the remaining methyl methacrylate was analyzed by gas chromatography under the following conditions. As a result, it was found out of the detection range and all methyl methacrylate was polymerized. Furthermore, as a result of analyzing the obtained fine particle solution with a particle size measuring device (particle size measuring device (light scattering): Otsuka Electronics DLS-700), it was found that the particles had an average particle size of about 40 nm. .
＜ガスクロマトグラフィー分析条件＞
GC Hewlett Packard 5890Aを使用。
GC Hewlett Packard 5890A is used.
＜実施例２＞
重合性界面活性剤による微粒子作製
先と同様に、丸底になっているガラス容器に水１１．５mL入れ、８０％重合性界面活性剤アデカリアソープ６ｍｌを水に溶解させ、添加した。次にメチルメタクリレートにBHHT-Eu錯体を溶解させ、を界面活性剤にゆっくりと添加した。ガラス容器内部を窒素置換し、さらに超音波を２０分程度照射した。このガラス溶液に還流菅を取り付け、攪拌子にて攪拌しながらゆっくりと０．１％過流酸カリウム溶液２．５ｍＬ添加した。ゆっくりと攪拌を続け、７５℃まで昇温し、５時間保持した。得られた溶液からサンプルを採取し、残ったメチルメタクリレートをガスクロにて分析した結果、検出圏外となり、全てのメチルメタクリレートが重合しているということが判明した。さらに得られた微粒子溶液を粒径測定装置にて分析した結果、平均１７０．０５ｎｍの粒径を持つ微粒子であるということが判明した。
<Example 2>
In the same manner as in the preparation of the fine particles by the polymerizable surfactant, 11.5 mL of water was placed in a glass container having a round bottom, and 6 ml of 80% polymerizable surfactant Adekari Soap was dissolved in water and added. Next, the BHHT-Eu complex was dissolved in methyl methacrylate, and was slowly added to the surfactant. The inside of the glass container was replaced with nitrogen, and further irradiated with ultrasonic waves for about 20 minutes. A reflux tank was attached to this glass solution, and 2.5 mL of a 0.1% potassium persulfate solution was slowly added while stirring with a stirrer. Stirring was continued slowly, the temperature was raised to 75 ° C. and held for 5 hours. A sample was taken from the resulting solution, and the remaining methyl methacrylate was analyzed by gas chromatography. As a result, it was found out of the detection range and all methyl methacrylate was polymerized. Furthermore, as a result of analyzing the obtained fine particle solution with a particle size measuring device, it was found that the particles had an average particle size of 170.05 nm.
反応性官能基の作製
前述微粒子を４ｍｇ／ｍＬの濃度で０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．５）溶解し、１ｍＬにした。これに、１０ｍｇ／ｍＬのＰＭＰＩ（ＰＩＲＣＥ社製）ジメチルスルホキシド溶液を１０μＬ添加し、３０分静置した。これをＭＷＣＯ３０００００の透析膜を用い、０．０５Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で透析を行った。こうして、マレイミドを末端に持つ微粒子を作製した。
Preparation of reactive functional group The fine particles were dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 8.5) at a concentration of 4 mg / mL to make 1 mL. To this, 10 μL of 10 mg / mL PMPI (Pirce) dimethyl sulfoxide solution was added and allowed to stand for 30 minutes. This was dialyzed with 0.05 M phosphate buffer (pH 7.0) using a dialysis membrane of MWCO 300000. Thus, fine particles having maleimide as a terminal were prepared.
＜実施例３＞
抗体結合
抗体は、ＲＯＣＫＬＡＮＤ社のＦ（ａｂ）’２ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｆ（ｃ）［Ｇｏａｔ］（カタログ番号７１１−１１０３）を用いた。２−メルカプトエチルアミン１１．３６ｍｇを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）に溶解した。Ｆ（ａｂ）’２溶液２ｍＬに２−メルカプトエチルアミン溶液を５０μＬ添加し、脱塩カラムで精製しＦ（ａｂ）’とした。実施例２で作製したマレイミド微粒子とこのＦ（ａｂ）’を混合し、４℃で７２時間静置した。次に１０ｍｇ／ｍＬで水に溶解した２−メルカプトエチルアミンをさらに溶解し、室温で１時間静置した。この後、ＭＷＣＯ３０００００の透析膜を用いてＰＢＳで透析を行い、Ｆ（ａｂ）’微粒子を作製した。
<Example 3>
As the antibody-binding antibody, F (ab) '2 fragment of affinity purified anti-Rabbit IgG F (c) [Goat] (catalog number 711-1103) manufactured by ROCKLAND was used. 2-mercaptoethylamine 11.36 mg was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0). 50 μL of 2-mercaptoethylamine solution was added to 2 mL of F (ab) ′ 2 solution and purified with a desalting column to obtain F (ab) ′. The maleimide fine particles prepared in Example 2 and this F (ab) ′ were mixed and allowed to stand at 4 ° C. for 72 hours. Next, 2-mercaptoethylamine dissolved in water at 10 mg / mL was further dissolved and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, dialysis was performed with PBS using a dialysis membrane of MWCO 300000 to prepare F (ab) ′ microparticles.
抗ＩｇＧ−微粒子を用いたＩＬ−６サンドイッチイムノアッセイ
抗ＩＬ−６（マウスＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ：ＢＡＦ２０６、モノクロナール）を２μｇ／ｍＬ調整したものを９６穴マイクロタイタープレートに、１ウェルに１００μＬずつ分注し、室温で一晩静置した。ＴＢＳを用いて３回洗浄後、１％ＢＳＡ、０．９％ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３を含む、０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファを１ウェルに２００μＬずつ分注し、室温で１時間静置した。ＩＬ−６をＴＢＳに溶解し、１０００〜０．１ｐｇ／ｍＬの濃度を用意し、それぞれの濃度を８ウェルずつ１ウェルに対し１００μＬ分注し、室温で２時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５Ｍ トリス（ｐＨ７．８）溶液用いて３回洗浄した。次に抗ＩＬ−６（ラビットＩｇＧ、ＲＯＣＫＬＡＮＤ、ポリクロナール）を１０ｎｇ／ｍＬ用意し、分注し、室温で２時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５Ｍ トリス（ｐＨ７．８）溶液用いて３回洗浄した。前述したＦ（ａｂ）’微粒子を乾燥重量で０．００１％分含む溶液を１ウェルに対し１００μＬずつ分注し、室温で２時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５Ｍ トリス（ｐＨ７．８）溶液用いて３回洗浄した。次に、プレートリーダー（パーキンエルマーWallc １４２０ ARVOsxマルチラベルプリンタ）を用いて、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長６１５ｎｍにて、時間分解法により分析を行った。ＩＬ−６濃度が高くなるに従い、カウント数も高くなる良好な結果を表２に示した。
＜実施例４＞
次に抗体に抗ＩＬ−６（マウスＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ、モノクロナール）を利用した分析を行った。
<Example 4>
Next, analysis using anti-IL-6 (mouse IgG, R & D, monoclonal) as an antibody was performed.
Ｆ（ａｂ）’２の作製
精製には、ＰＩＲＥＣＥ社製のＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号４４８８８）を用いて作製・精製した。抗ＩＬ−６（マウスＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ：ＭＡＢ２０６、モノクロナール）２ｍｇを２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．５）に懸濁した。次に、２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．５）にて平衡化したペプシンと混合し、４時間３７℃で静置した。これを付属ＩｇＧバインディングバッファで平衡化した後、付属のセパレーターを用いて回収し、予め、バインディングバッファにて平衡化してあったプロテインＡカラムにＦｃ領域を吸着させた。濾液を回収しＦ（ａｂ）’２溶液とした。
F (ab) ′ 2 was produced and purified using ImmunoPure F (ab ′) 2 Preparation Kit (catalog number 44888) manufactured by PIRECE. 2 mg of anti-IL-6 (mouse IgG, R & D: MAB206, monoclonal) was suspended in 20 mM sodium acetate buffer (pH 4.5). Next, it was mixed with pepsin equilibrated with 20 mM sodium acetate buffer (pH 4.5) and allowed to stand at 37 ° C. for 4 hours. This was equilibrated with the attached IgG binding buffer, recovered using the attached separator, and the Fc region was adsorbed onto a protein A column that had been equilibrated in advance with the binding buffer. The filtrate was collected to obtain an F (ab) ′ 2 solution.
抗体結合
Ｆ（ａｂ）’２溶液を、カラムを、用いて濃縮を行い、およそ１ｍＬの溶液とした。Ｆ（ａｂ）’２溶液に２−メルカプトエチルアミン溶液を５０μＬ添加し、脱塩カラムで精製しＦ（ａｂ）’とした。実施例２で作製したマレイミド微粒子とこのＦ（ａｂ）’を混合し、４℃で７２時間静置した。次に１０ｍｇ／ｍＬで水に溶解した２−メルカプトエチルアミンをさらに溶解し、室温で１時間静置した。この後、ＭＷＣＯ３０００００の透析膜を用いてＰＢＳで透析を行い、Ｆ（ａｂ）’微粒子を作製した。
The antibody-bound F (ab) ′ 2 solution was concentrated using a column to obtain an approximately 1 mL solution. 50 μL of a 2-mercaptoethylamine solution was added to the F (ab) ′ 2 solution and purified by a desalting column to obtain F (ab) ′. The maleimide fine particles prepared in Example 2 and this F (ab) ′ were mixed and allowed to stand at 4 ° C. for 72 hours. Next, 2-mercaptoethylamine dissolved in water at 10 mg / mL was further dissolved and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, dialysis was performed with PBS using a dialysis membrane of MWCO 300000 to prepare F (ab) ′ microparticles.
抗ＩｇＧ−微粒子を用いたＩＬ−６サンドイッチイムノアッセイ
抗ＩＬ−６（マウスＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ：ＢＡＦ２０６、モノクロナール）を２μｇ／ｍＬ調整したものを９６穴マイクロタイタープレートに、１ウェルに１００μＬずつ分注し、室温で一晩静置した。ＰＢＳを用いて３回洗浄後、１％ＢＳＡ、０．９％ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３を含む、０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファを１ウェルに２００μＬずつ分注し、室温で１時間静置した。ＩＬ−６をＰＢＳに溶解し、１０００〜０．１ｐｇ／ｍＬの濃度を用意し、それぞれの濃度を８ウェルずつ１ウェルに対し１００μＬ分注し、室温で２時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５Ｍ トリス（ｐＨ７．８）溶液用いて３回洗浄した。前述した抗ＩＬ−６Ｆ（ａｂ）’微粒子を乾燥重量で０．００１％分含む溶液を１ウェルに対し１００μＬずつ分注し、室温で２時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５Ｍ トリス（ｐＨ７．８）溶液用いて３回洗浄した。次に、プレートリーダー（パーキンエルマーWallc １４２０ ARVOsxマルチラベルプリンタ）を用いて、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長６１５ｎｍにて、時間分解法により分析を行った。ＩＬ−６濃度が高くなるに従い、カウント数も高くなる良好な結果を示した。
IL-6 sandwich immunoassay using anti-IgG fine particles Anti-IL-6 (mouse IgG, R & D: BAF206, monoclonal) adjusted to 2 μg / mL was dispensed into a 96-well microtiter plate at 100 μL per well. And left at room temperature overnight. After washing 3 times with PBS, 200 μL of 0.1 M sodium carbonate buffer containing 1% BSA, 0.9% NaCl, 0.05% NaN3 was dispensed into each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. . IL-6 was dissolved in PBS, and concentrations of 1000 to 0.1 pg / mL were prepared. 100 μL of each concentration was dispensed into 8 wells and allowed to stand at room temperature for 2 hours. Washed 3 times with 0.05% Tween20, 0.05M Tris (pH 7.8) solution. A solution containing 0.001% of the above-mentioned anti-IL-6F (ab) ′ microparticles in dry weight was dispensed at 100 μL per well and allowed to stand at room temperature for 2 hours. Washed 3 times with 0.05% Tween20, 0.05M Tris (pH 7.8) solution. Next, using a plate reader (Perkin Elmer Wallc 1420 ARVOsx multi-label printer), analysis was performed by a time-resolved method at an excitation wavelength of 340 nm and a fluorescence wavelength of 615 nm. As the IL-6 concentration increased, the count number also increased.
Claims (10)
A time-resolved fluorescence detection method using any one of claims 1-5.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008074892A (en) * | 2006-09-19 | 2008-04-03 | Fujifilm Corp | Fluorescent polymer fine particle set, complex set for detecting fluorescence, fluorescent polymer fine particle composition and method for detecting fluoroscence |
| JP2019164143A (en) * | 2013-03-07 | 2019-09-26 | ラピッド パトゲン スクリーニング，インク． | Method and device for combined detection of viral and bacterial infections |
| KR20200122369A (en) | 2018-02-20 | 2020-10-27 | 가부시키가이샤 큐럭스 | Method for producing luminescent particles, luminescent particles and bio-imaging materials |
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2005
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