JP2006187203A - New vinyl group reductase associated with biosynthesis of chlorophyll and utilization of the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、クロロフィル生合成に関与する新規ビニル基還元酵素およびその利用に関し、具体的には、高等植物体内での３−ビニルクロロフィルの合成に関与する新規の３，８−ジビニルプロトクロロフィリドａ８−ビニル還元酵素（ＤＶＲ）、およびＤＶＲ変異植物に関する。 The present invention relates to a novel vinyl group reductase involved in chlorophyll biosynthesis and its use. Specifically, the novel 3,8-divinylprotochlorophyllide a8 involved in the synthesis of 3-vinylchlorophyll in higher plants. -It relates to vinyl reductase (DVR) and DVR mutant plants.
一般的に、クロロフィル分子は、光合成生物に存在しており、集光装置を用いて光エネルギーを収集する工程における主要部分を担うとともに、反応中心における電子転移を起こすことが知られている（非特許文献１）。光合成生物（即ち、酸素放出型生物）が有しているクロロフィルは、そのビニル側鎖の数によって、３，８−ジビニルクロロフィル（以下、これをジビニル型クロロフィルと称することがある）と、３−ビニルクロロフィル（以下、これをモノビニル型クロロフィルと称することがある）とに分類することができる。光合成生物のほとんどが、モノビニル型クロロフィルを含んでいるが（非特許文献２）、原核緑藻綱プロクロロン目（Prochlorococcus）や海洋性picophytoplanctonsのように、ジビニル型クロロフィルを光合成色素として含んでいるものもある（非特許文献３）。 In general, chlorophyll molecules are present in photosynthetic organisms and play a major part in the process of collecting light energy using a concentrator, and are known to cause electron transfer at the reaction center (non- Patent Document 1). Depending on the number of vinyl side chains, chlorophylls possessed by photosynthetic organisms (ie, oxygen-releasing organisms) can be 3,8-divinylchlorophyll (hereinafter sometimes referred to as divinyl-type chlorophyll), 3- It can be classified into vinyl chlorophyll (hereinafter sometimes referred to as monovinyl type chlorophyll). Most photosynthetic organisms contain monovinyl-type chlorophyll (Non-patent Document 2), but some of them contain divinyl-type chlorophyll as photosynthetic pigments, such as the prokaryotic green algae Prochlorococcus and marine picophytoplanctons. (Non-Patent Document 3).
クロロフィル生合成過程において、ジビニル型クロロフィルからモノビニル型クロロフィルが合成されることは周知であり、この合成を触媒する酵素として３，８−ジビニルプロトクロロフィリドａ８−ビニル還元酵素（ＤＶＲ）が関与していることも知られている。ＤＶＲとは、還元剤にＮＡＤＰＨを用い、テトラピロールの８−ビニル基を、エチル基に還元する酵素である（非特許文献４）。 It is well known that monovinyl chlorophyll is synthesized from divinyl chlorophyll in the chlorophyll biosynthesis process, and 3,8-divinylprotochlorophyllide a8-vinyl reductase (DVR) is involved as an enzyme that catalyzes this synthesis. It is also known that DVR is an enzyme that uses NADPH as a reducing agent and reduces the 8-vinyl group of tetrapyrrole to an ethyl group (Non-patent Document 4).
クロロフィル代謝（生合成）過程に関する研究は、生化学的（非特許文献５）、および遺伝学的（非特許文献６〜８）手法を用いて、様々な生物種で行われている。クロロフィルの生合成過程の初期に相当するグルタミルｔ−ＲＮＡからプロトポルフィリンＩＸ合成までの過程は、ヘム生合成過程と共有しているため、関連酵素の同定に関する主要データは、大腸菌のような非光合成生物種を用いた研究によって得られている（非特許文献９）。後期に相当する過程は、バクテリオクロロフィルａの生合成と同じ過程であり（非特許文献２）、バクテリオクロロフィル生合成に関与する遺伝子群は、光合成微生物Rhodobacter capsulatusを用いた直接的変異分析法によって同定されている（非特許文献６）。高等植物においては、このRhodobacter capsulatusにおける遺伝子群と相同性のある遺伝子群が同定されている（非特許文献１０）。 Studies on chlorophyll metabolism (biosynthesis) processes have been conducted in various biological species using biochemical (Non-patent Document 5) and genetic (Non-patent Documents 6 to 8) techniques. Since the process from glutamyl t-RNA corresponding to the early stage of chlorophyll biosynthesis to synthesis of protoporphyrin IX is shared with the heme biosynthesis process, the main data regarding the identification of related enzymes is non-photosynthesis such as E. coli. It is obtained by research using biological species (Non-patent Document 9). The process corresponding to the latter stage is the same as the biosynthesis of bacteriochlorophyll a (Non-patent Document 2), and the genes involved in bacteriochlorophyll biosynthesis are identified by direct mutation analysis using the photosynthetic microorganism Rhodobacter capsulatus. (Non-Patent Document 6). In higher plants, a gene group having homology with this Rhodobacter capsulatus gene group has been identified (Non-patent Document 10).
上記ＤＶＲと同一の活性を有するタンパク質（酵素）としては、光合成細菌において８−ビニル還元酵素をコードする遺伝子（bchJ）が同定されているが、高等植物では、bchJと相同性の高い遺伝子は同定されていない。 As a protein (enzyme) having the same activity as the DVR, a gene (bchJ) encoding 8-vinyl reductase has been identified in photosynthetic bacteria, but a gene having high homology with bchJ is identified in higher plants. It has not been.
高等植物では、テトラピロールの８−ビニル基をエチル基に還元するという活性自体は、キュウリから単離された色素体膜（非特許文献４）や、可溶性の粗抽出物（非特許文献１１）を用いて検出されている。しかしながら、その活性を有するタンパク質またはこれをコードする遺伝子は同定されていない。 In higher plants, the activity itself of reducing the 8-vinyl group of tetrapyrrole to an ethyl group is itself a plastid membrane isolated from cucumber (Non-patent Document 4) or a soluble crude extract (Non-patent Document 11). It is detected using. However, a protein having the activity or a gene encoding the same has not been identified.
即ち、高等植物体においては、クロロフィル生合成に関与する様々な遺伝子のうち、テトラピロールの８−ビニル基をエチル基に還元する機能を有するポリペプチド、具体的には、３，８−ジビニルプロトクロロフィリドａ８−ビニル還元酵素（ＤＶＲ）のみが未だ解明されていない。
上記のように、高等植物では、モノビニル型クロロフィルの合成を触媒する、即ち、モノビニル型クロロフィルの８−ビニル基を還元する酵素（ＤＶＲ）に関する遺伝子やタンパク質は未だ同定されていない。 As described above, in higher plants, genes and proteins relating to enzymes (DVR) that catalyze the synthesis of monovinyl chlorophyll, that is, reduce the 8-vinyl group of monovinyl chlorophyll, have not yet been identified.
この８−ビニル基の還元は、クロロフィル生合成過程におけるプロトクロロフィリド酸化還元酵素によるＤピロール環還元の前後何れの段階であっても起こすことができると提言されており、モノビニル型クロロフィルおよびジビニル型クロロフィルの生合成反応は、一般的な単一の一貫工程というよりは、並行的に行われると推測されている（非特許文献４）。 It has been proposed that this reduction of the 8-vinyl group can take place at any stage before or after D-pyrrole ring reduction by protochlorophyllide oxidoreductase in the chlorophyll biosynthesis process. Monovinyl type chlorophyll and divinyl type The biosynthesis reaction of chlorophyll is presumed to be performed in parallel rather than a general single consistent process (Non-Patent Document 4).
しかしながら、現時点では、その詳細についても解明されておらず、クロロフィル生合成反応における多種の中間体分子の８−ビニル基が、複数からなる酵素群によって還元されるのか、または単一の酵素によって還元されるのかについても明らかにされていない。 However, at present, the details have not been elucidated, and the 8-vinyl group of various intermediate molecules in the chlorophyll biosynthesis reaction is reduced by a group of enzymes or reduced by a single enzyme. It has not been clarified as to whether it is done.
ところで、ジビニル型クロロフィルを有するProchlorococcusは、そのソーレー帯の最大吸収帯が、モノビニル型クロロフィルと比較して、約１０ｎｍ長波長側にずれていることから、深層水中において豊富である青色光を効率的に吸収することが可能であるという利点を有している（Kirk, J.T.O. (1994). Light and Photosynthesis in Aquatic Ecosystems, pp. 509, Cambridge University Press）。 By the way, Prochlorococcus with divinyl-type chlorophyll has an efficient absorption of blue light that is abundant in deep-layer water because the maximum absorption band of the Soray band is shifted to the longer wavelength side by about 10 nm compared to monovinyl-type chlorophyll. (Kirk, JTO (1994). Light and Photosynthesis in Aquatic Ecosystems, pp. 509, Cambridge University Press).
そこで、高等植物におけるＤＶＲ遺伝子を機能解析することによって、クロロフィルの型（モノビニル型クロロフィルまたはジビニル型クロロフィル）の分岐に関する機構の解明し、さらに、ジビニル型クロロフィルを有する変異植物を作製することによって、従来の高等植物には見られない特異な効果を備えた植物を提供することができる。 Therefore, by analyzing the function of the DVR gene in higher plants, elucidation of the mechanism related to the branching of the chlorophyll type (monovinyl chlorophyll or divinyl chlorophyll), and by producing mutant plants having divinyl chlorophyll, It is possible to provide a plant having a unique effect that is not found in higher plants.
従って、本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、高等植物におけるクロロフィルの合成に関与する新規のビニル基還元酵素（３，８−ジビニルプロトクロロフィリドａ８−ビニル還元酵素（ＤＶＲ））、それをコードする遺伝子、およびそれらの利用方法を提供することにある。 Accordingly, the present invention has been made in view of the above problems, and its object is to provide a novel vinyl group reductase (3,8-divinylprotochlorophyllide a8-vinyl involved in the synthesis of chlorophyll in higher plants. It is to provide a reductase (DVR)), a gene encoding the same, and a method for using them.
本発明者らは、上記課題を解決するために、変異誘導したシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のスクリーニングを行い、ジビニル型クロロフィルを蓄積している個体を分離し、この変異の原因となる単一の遺伝子をシロイヌナズナゲノムから単離・同定した。さらに、この遺伝子がコードするタンパク質を大腸菌に発現させ、当該組換えタンパク質が３，８−ジビニルクロロフィルの８−ビニル基を還元させる機能（３，８−ジビニルプロトクロロフィリドａ８−ビニル還元酵素活性）を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors screened mutated Arabidopsis thaliana to isolate individuals accumulating divinyl-type chlorophyll, and a single gene responsible for this mutation Was isolated and identified from the Arabidopsis genome. Further, the protein encoded by this gene is expressed in E. coli, and the recombinant protein reduces the 8-vinyl group of 3,8-divinylchlorophyll (3,8-divinylprotochlorophyllide a8-vinyl reductase activity) As a result, the present invention has been completed.
即ち、本発明は、クロロフィル生合成に関与する新規ビニル基還元酵素およびその利用に関し、以下の発明を包含する。
（１） クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなるポリペプチド。
（２） （１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（３） クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（４） （２）または（３）に記載のポリヌクレオチドのフラグメント。
（５） （２）または（３）に記載のポリヌクレオチド、または（４）に記載のフラグメントを含むベクター。
（６） （４）に記載のベクターが導入されている形質転換体。
（７） （１）に記載のポリペプチドに結合する抗体。
（８） （２）または（３）に記載のポリヌクレオチドに変異を導入する工程を含むことを特徴とする、３，８−ジビニルクロロフィルを有する光合成生物の作製方法。
（９） （２）または（３）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または（４）に記載のフラグメントを細胞に導入する工程を含むことを特徴とする、３，８−ジビニルクロロフィルを有する光合成生物の作製方法。
（１０） （８）または（９）に記載の方法によって作製された光合成生物。
（１１） （１）に記載のポリペプチドの機能を阻害する阻害物質を同定するためのスクリーニング方法であって、試験化合物または試料と、（１）に記載のポリペプチドとを接触させる工程と、上記試験化合物または試料が当該ポリペプチドに与える影響を検出する工程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
That is, the present invention relates to a novel vinyl group reductase involved in chlorophyll biosynthesis and its use, and includes the following inventions.
(1) A polypeptide having a vinyl group reductase activity involved in the synthesis of chlorophyll,
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or (b) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added,
A polypeptide comprising:
(2) A polynucleotide encoding the polypeptide according to (1).
(3) A polynucleotide encoding a polypeptide involved in the synthesis of chlorophyll and having vinyl group reductase activity,
(C) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or (d) a polynucleotide which hybridizes with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions.
(4) A fragment of the polynucleotide according to (2) or (3).
(5) A vector comprising the polynucleotide according to (2) or (3) or the fragment according to (4).
(6) A transformant into which the vector according to (4) has been introduced.
(7) An antibody that binds to the polypeptide according to (1).
(8) A method for producing a photosynthetic organism having 3,8-divinylchlorophyll, comprising a step of introducing a mutation into the polynucleotide according to (2) or (3).
(9) A photosynthesis having 3,8-divinylchlorophyll, comprising the step of introducing the polynucleotide according to any one of (2) or (3) or the fragment according to (4) into a cell. Biological production method.
(10) A photosynthetic organism produced by the method according to (8) or (9).
(11) A screening method for identifying an inhibitor that inhibits the function of the polypeptide according to (1), comprising contacting a test compound or a sample with the polypeptide according to (1), And a step of detecting an effect of the test compound or sample on the polypeptide.
本発明の遺伝子およびタンパク質は、クロロフィル生合成に関与する遺伝子およびタンパク質であって、３，８−ジビニルプロトクロロフィリドａ８−ビニル還元酵素として、高等植物において初めて単離されたものである。それゆえ、高等植物におけるクロロフィルの型（モノビニル型クロロフィルまたはジビニル型クロロフィルの分岐）に関する機構の解明や、光合成の機構の解明に貢献できるという効果を奏する。 The genes and proteins of the present invention are genes and proteins involved in chlorophyll biosynthesis, and were first isolated in higher plants as 3,8-divinylprotochlorophyllide a8-vinyl reductase. Therefore, it has the effect of contributing to the elucidation of the mechanism relating to the type of chlorophyll (monovinyl chlorophyll or divinyl chlorophyll branching) in higher plants and the mechanism of photosynthesis.
また、本発明の遺伝子を変異させることにより、または、本発明の遺伝子の発現を阻害することにより、通常はモノビニル型クロロフィルを有する植物を、ジビニル型クロロフィルを有する植物に改変することができ、ジビニル型クロロフィルの特性を備えた植物を提供することができるという効果を奏する。 Further, by mutating the gene of the present invention or inhibiting the expression of the gene of the present invention, a plant having a monovinyl type chlorophyll can be usually changed to a plant having a divinyl type chlorophyll. There is an effect that a plant having the characteristics of a type chlorophyll can be provided.
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。 An embodiment of the present invention will be described as follows. Note that the present invention is not limited to this.
（１）ポリペプチド
本発明に係るポリペプチドは、クロロフィルの生合成過程においてビニル基の還元を行うポリペプチドであり、特に、図１に示すクロロフィル生合成の最終過程における、モノビニル型クロロフィリドａおよびモノビニル型プロトクロロフィリドａの合成に関与するポリペプチド（３，８−ジビニルプロトクロロフィリドａ８−ビニル還元酵素）である。高等植物では、この活性自体は検出されているものの、その活性を有するタンパク質およびこれをコードする遺伝子は同定されていない。
(1) Polypeptide A polypeptide according to the present invention is a polypeptide that reduces a vinyl group in the process of biosynthesis of chlorophyll. In particular, monovinyl chlorophyllide a and chlorophyllide a in the final process of chlorophyll biosynthesis shown in FIG. It is a polypeptide (3,8-divinylprotochlorophyllide a8-vinyl reductase) involved in the synthesis of monovinyl protochlorophyllide a. In higher plants, this activity itself has been detected, but the protein having the activity and the gene encoding it have not been identified.
そこで、本発明者らは、変異誘導したシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のスクリーニングを行い、ジビニル型クロロフィルを蓄積している個体を分離し、この個体（突然変異体）と野生株との交配によって得られるＦ２世代を用いてポジショナルクローニングを行い、この変異の原因遺伝子を同定した。また、この原因遺伝子（AT5G18660）を、上記の突然変異体に導入したところ、野生型と同様の、モノビニル型クロロフィルが蓄積することが示された。さらに、この原因遺伝子を大腸菌に導入して、大腸菌内で発現させ、ジビニル型クロロフィリドａと反応させたところ、モノビニル型クロロフィリドが生成された。 Therefore, the present inventors screened mutated Arabidopsis thaliana, isolate an individual accumulating divinyl chlorophyll, and obtain this by crossing this individual (mutant) with a wild strain. Positional cloning was performed using the F2 generation to identify the gene responsible for this mutation. In addition, when this causative gene (AT5G18660) was introduced into the above mutant, it was shown that monovinyl chlorophyll similar to the wild type was accumulated. Furthermore, when this causative gene was introduced into Escherichia coli, expressed in Escherichia coli, and reacted with divinyl type chlorophyllide a, monovinyl type chlorophyllide was produced.
これにより、本発明者らは、この原因遺伝子が、ＤＶＲ活性を有するポリペプチド（３，８−ジビニルプロトクロロフィリドａ８−ビニル還元酵素）をコードする遺伝子（ＤＶＲ遺伝子）であると同定した。 Thus, the present inventors have identified that the causative gene is a gene (DVR gene) encoding a polypeptide having DVR activity (3,8-divinylprotochlorophyllide a8-vinyl reductase).
本明細書中において、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。 In this specification, the term “polypeptide” is used interchangeably with “peptide” or “protein”. The polypeptides according to the invention may also be isolated from natural sources or chemically synthesized.
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。 The term “isolated” polypeptide or protein is intended to be a polypeptide or protein that has been removed from its natural environment. For example, recombinantly produced polypeptides and proteins expressed in a host cell can be isolated in the same manner as natural or recombinant polypeptides and proteins that have been substantially purified by any suitable technique. It is thought that there is.
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。 Polypeptides according to the present invention include natural purified products, products of chemical synthesis procedures, and prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells, and mammalian cells). ) From recombinantly produced products. Depending on the host used in the recombinant production procedure, the polypeptides according to the invention may be glycosylated or non-glycosylated. Furthermore, the polypeptides according to the invention may also contain an initiating modified methionine residue in some cases as a result of host-mediated processes.
本発明は、クロロフィル合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチド、特に、３，８−ジビニルクロロフィルの８−ビニル基を還元する機能（ＤＶＲ活性）を有するポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であり、かつ上述した機能を有するポリペプチドである。 The present invention provides a polypeptide involved in chlorophyll synthesis and having vinyl group reductase activity, particularly a polypeptide having a function of reducing the 8-vinyl group of 3,8-divinylchlorophyll (DVR activity). In one embodiment, the polypeptide according to the present invention is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a variant of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and having the above-described function. It is polypeptide which has.
変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。 Variants include deletions, insertions, inversions, repeats, and type substitutions (eg, replacement of a hydrophilic residue with another residue, but usually a strongly hydrophilic residue to a strongly hydrophobic residue Are not substituted). In particular, “neutral” amino acid substitutions in a polypeptide generally have little effect on the activity of the polypeptide.
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。 It is well known in the art that some amino acids in the amino acid sequence of a polypeptide can be easily modified without significantly affecting the structure or function of the polypeptide. Furthermore, it is also well known that there are variants that not only artificially modify, but also do not significantly alter the structure or function of the protein in the native protein.
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、作製した変異体がモノビニル型クロロフィルを合成する機能を有するか否かは、例えばKolossovとRebeizの方法（非特許文献１１）に従って、当該変異体とジビニル型クロロフィリドａとをＮＡＤＰＨ存在下で反応させ、モノビニル型クロロフィリドａが生成されるか否かを確認することにより、容易に決定し得る。 One skilled in the art can readily mutate one or several amino acids in the amino acid sequence of a polypeptide using well-known techniques. For example, according to a known point mutation introduction method, an arbitrary base of a polynucleotide encoding a polypeptide can be mutated. In addition, a deletion mutant or an addition mutant can be prepared by designing a primer corresponding to an arbitrary site of a polynucleotide encoding a polypeptide. Furthermore, whether or not the produced mutant has a function of synthesizing monovinyl type chlorophyll is determined by, for example, according to the method of Kolossov and Rebeiz (Non-Patent Document 11), the mutant and divinyl type chlorophyllide a in the presence of NADPH. The reaction can be easily determined by confirming whether or not monovinyl chlorophyllide a is produced.
なお、好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。 Preferred variants have conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions, or additions. Silent substitution, addition, and deletion are preferred, and conservative substitution is particularly preferred. These do not alter the polypeptide activity according to the invention.
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。 Typically seen as conservative substitutions are substitutions of one amino acid for another in the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu, and Ile, exchange of hydroxyl residues Ser and Thr, acidic residues Asp and Glu exchange, substitution between amide residues Asn and Gln, exchange of basic residues Lys and Arg, and substitution between aromatic residues Phe, Tyr.
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（即ち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Bowie, J.U.ら「Deciphering the Message in Protein Sequences：Tolerance to Amino Acid Substitutions」,Science 247:1306−1310 （1990）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。 As detailed above, further guidance on which amino acid changes are likely to be phenotypically silent (ie, not likely to have a significant adverse effect on function) can be found in Bowie, JU "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247: 1306-1310 (1990) (incorporated herein by reference).
本実施形態に係るポリペプチドは、クロロフィル合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドであって、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列、からなるポリペプチドであることが好ましい。 The polypeptide according to the present embodiment is a polypeptide that participates in chlorophyll synthesis and has vinyl group reductase activity, and is (a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; or (b) SEQ ID NO: 2 In the amino acid sequence shown in the above, a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added is preferable.
上記「１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。 The above “one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added” means substitution, deletion, insertion, or by a known mutant polypeptide production method such as site-directed mutagenesis. It means that as many amino acids as can be added (preferably 10 or less, more preferably 7 or less, most preferably 5 or less) are substituted, deleted, inserted or added. As described above, such a mutant polypeptide is not limited to a polypeptide having a mutation artificially introduced by a known mutant polypeptide production method, and a naturally occurring polypeptide is isolated and purified. It may be what you did.
なお、本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。 The polypeptide according to the present invention is not limited to this as long as it is a polypeptide in which amino acids are peptide-bonded, and may be a complex polypeptide containing a structure other than the polypeptide. As used herein, examples of the “structure other than the polypeptide” include sugar chains and isoprenoid groups, but are not particularly limited.
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。 The polypeptide according to the present invention may include an additional polypeptide. Examples of the additional polypeptide include epitope-tagged polypeptides such as His, Myc, and Flag.
また、本発明に係るポリペプチドは、後述する本発明に係るポリヌクレオチド（本発明に係るポリペプチドをコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された場合であってもよい。また、本発明に係るポリペプチドは、化学合成されたものであってもよい。 In addition, the polypeptide according to the present invention is a state in which a polynucleotide according to the present invention (a gene encoding the polypeptide according to the present invention) described later is introduced into a host cell and the polypeptide is expressed in the cell. It may also be a case where it is isolated and purified from cells, tissues or the like. The polypeptide according to the present invention may be chemically synthesized.
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。 In other embodiments, the polypeptides of the invention can be recombinantly expressed in a modified form such as a fusion protein. For example, additional amino acids, particularly charged amino acid regions, of the polypeptides according to the invention may be used in host cells to improve stability and persistence during purification or subsequent manipulation and storage. It can be added to the N-terminus of the polypeptide.
本実施形態に係るポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Qiagen, Inc.）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821−824（1989）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（HA）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Wilsonら、Cell 37:767（1984）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態に係るポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。 In the polypeptide according to this embodiment, for example, a tag label (tag sequence or marker sequence) that is a sequence encoding a peptide that facilitates purification of the fused polypeptide can be added to the N-terminus or C-terminus. Such sequences can be removed prior to final preparation of the polypeptide. In certain preferred embodiments of this aspect of the invention, the tag amino acid sequence is a hexa-histidine peptide (eg, a tag provided in a pQE vector (Qiagen, Inc.), among many others Are publicly and / or commercially available. For example, as described in Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989) (incorporated herein by reference), hexahistidine is a convenient fusion protein. Provide purification. The “HA” tag is another peptide useful for purification corresponding to an epitope derived from influenza hemagglutinin (HA) protein, which is described in Wilson et al., Cell 37: 767 (1984) (herein). Which is incorporated by reference). Other such fusion proteins include a polypeptide according to this embodiment or a fragment thereof fused to Fc at the N or C terminus.
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されても、化学合成されてもよい。 In another embodiment, the polypeptides according to the invention may be produced recombinantly or chemically synthesized as detailed below.
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行うことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行うことができる。 Recombinant production can be performed using methods well known in the art, for example using vectors and cells as detailed below.
合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Houghtenは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す10〜20ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している（Houghten, R. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131−5135（1985））。この「Simultaneous Multiple Peptide Synthesis（SMPS）」プロセスは、さらにHoughtenら（1986）の米国特許第4,631,211号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、500〜1000以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Houghtenら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。 Synthetic peptides can be synthesized using known methods of chemical synthesis. For example, Houghten for the synthesis of a large number of peptides such as 10-20 mg of 248 different 13-residue peptides showing a single amino acid variant of the HA1 polypeptide segment prepared and characterized in less than 4 weeks. A simple method is described (Houghten, R. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1985)). This “Simultaneous Multiple Peptide Synthesis (SMPS)” process is further described in US Pat. No. 4,631,211 of Houghten et al. (1986). In this procedure, individual resins for solid phase synthesis of various peptides are contained in separate solvent permeable packets, allowing optimal use of many identical iteration steps associated with solid phase methods. A complete manual procedure allows over 500-1000 syntheses to be performed simultaneously (Houghten et al., Supra, 5134). These documents are incorporated herein by reference.
このように、本発明に係るポリペプチドは、少なくとも、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでいればよいといえる。即ち、配列番号２に示されるアミノ酸配列と特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列および当該任意のアミノ酸配列は、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。 Thus, it can be said that the polypeptide according to the present invention only needs to contain at least the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. That is, it should be noted that the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and any amino acid sequence having a specific function (eg, tag) is also included in the present invention. Further, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the arbitrary amino acid sequence may be linked with an appropriate linker peptide so as not to inhibit the respective functions.
（２）ポリヌクレオチド
本発明は、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有する本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中において、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中において、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
(2) Polynucleotide The present invention provides a polynucleotide encoding the polypeptide according to the present invention which is involved in the synthesis of chlorophyll and has vinyl group reductase activity. As used herein, the term “polynucleotide” is used interchangeably with “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides. In this specification, the term “base sequence” is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence”, and is indicated as a sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated as A, G, C, and T).
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。 The polynucleotide according to the present invention may exist in the form of RNA (eg, mRNA) or in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA). DNA can be double-stranded or single-stranded. Single-stranded DNA or RNA can be the coding strand (also known as the sense strand) or it can be the non-coding strand (also known as the antisense strand).
本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントの長さは特に限定されないが、少なくとも１２、１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００ｎｔ（ヌクレオチド）であることが好ましい。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、例えば、配列番号１に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号１に示される塩基配列が提供されるので、当業者は、配列番号１に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。または、このようなフラグメントを、合成的に作製することも可能である。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Applied Biosystems Incorporated（ABI,850 Lincoln Center Dr.,Foster City,CA 94404）392型シンセサイザーなどによって合成される。 The length of the fragment of the polynucleotide according to the present invention is not particularly limited, but may be at least 12, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000 nt (nucleotide). preferable. By a fragment having a length of at least 20 nt, for example, a fragment comprising 20 or more consecutive bases from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is contemplated. By referring to the present specification, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is provided, so that those skilled in the art can easily prepare a DNA fragment based on SEQ ID NO: 1. For example, restriction endonuclease cleavage or ultrasonic shearing can be readily used to create fragments of various sizes. Alternatively, such fragments can be made synthetically. Appropriate fragments (oligonucleotides) are synthesized, for example, by Applied Biosystems Incorporated (ABI, 850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404) type 392 synthesizer.
また本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。 Further, the polynucleotide according to the present invention can be fused to the polynucleotide encoding the tag tag (tag sequence or marker sequence) described above on the 5 'side or 3' side.
本発明はさらに、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。 The present invention further relates to a variant of a polynucleotide encoding a polypeptide involved in the synthesis of chlorophyll and having vinyl group reductase activity. Variants can occur naturally, such as a natural allelic variant. By “allelic variant” is intended one of several interchangeable forms of a gene occupying a given locus on the chromosome of an organism. Non-naturally occurring variants can be generated, for example, using mutagenesis techniques well known in the art.
このような変異体としては、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１個または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。 Examples of such mutants include mutants in which one or several bases have been deleted, substituted, or added in the base sequence of a polynucleotide encoding a polypeptide involved in the synthesis of chlorophyll and having vinyl group reductase activity. Is mentioned. Variants can be mutated in coding or non-coding regions, or both. Mutations in the coding region can generate conservative or non-conservative amino acid deletions, substitutions, or additions.
本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。 The present invention further includes an isolated polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a polypeptide that participates in chlorophyll synthesis and has vinyl group reductase activity under a stringent hybridization condition, or a polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide. A polynucleotide is provided.
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチドであることが好ましい。また、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。 In one embodiment, the polynucleotide according to the present invention is preferably a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and that encodes a polypeptide that participates in chlorophyll synthesis and has vinyl group reductase activity It is preferable that
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、50℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning,a Laboratory Manual,3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(2001)に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。なお、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり、より相同性の高いポリヌクレオチドを単離できる。 The term “stringent conditions” means that hybridization occurs only when at least 90% identity, preferably at least 95% identity exists between sequences. For example, at 50 ° C. Means binding under 2 × SSC wash conditions. The hybridization, Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3 rd Ed., Can be carried out by a known method such as the method described in Cold Spring Harbor Laboratory (2001). Note that the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency and the more homologous polynucleotide can be isolated.
別の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドのフラグメントであることが好ましい。 In another embodiment, the polynucleotide according to the present invention is preferably a fragment of the polynucleotide.
本発明に係るポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。ＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（UTR）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。 The polynucleotide or fragment thereof according to the present invention includes not only double-stranded DNA but also single-stranded DNA and RNA such as sense strand and antisense strand constituting the same. DNA includes, for example, cDNA and genomic DNA obtained by cloning, chemical synthesis techniques, or a combination thereof. Furthermore, the polynucleotide or oligonucleotide according to the present invention may contain a sequence such as an untranslated region (UTR) sequence or a vector sequence (including an expression vector sequence).
本発明に係るポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉に用いるｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、リボザイムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。これらを用いた結果として、遺伝子産物の発現が抑制または阻害される。本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントを導入することによって、ＤＶＲ遺伝子産物（本発明に係るポリペプチド）の発現を阻害することにより、モノビニル型クロロフィルの代わりにジビニル型クロロフィルを植物体内に蓄積させることができる。 The polynucleotide or fragment thereof according to the present invention can be used as a tool for gene expression manipulation by antisense RNA, siRNA (small interfering RNA) used for RNA interference, or ribozyme. As a result of using them, the expression of the gene product is suppressed or inhibited. By introducing a fragment of the polynucleotide according to the present invention, by inhibiting the expression of the DVR gene product (polypeptide according to the present invention), divinyl chlorophyll can be accumulated in the plant instead of monovinyl chlorophyll. it can.
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。 Examples of a method for obtaining the polynucleotide according to the present invention include a method for isolating and cloning a DNA fragment containing the polynucleotide according to the present invention by a known technique. For example, a probe that specifically hybridizes with a part of the base sequence of the polynucleotide in the present invention may be prepared and a genomic DNA library or cDNA library may be screened. Such a probe may be of any sequence and / or length as long as it specifically hybridizes to at least part of the base sequence of the polynucleotide of the present invention or its complementary sequence. Good.
または、本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。 Alternatively, examples of the method for obtaining the polynucleotide according to the present invention include a method using amplification means such as PCR. For example, in the polynucleotide cDNA of the present invention, primers are prepared from the 5 ′ side and 3 ′ side sequences (or their complementary sequences), and genomic DNA (or cDNA) or the like is used as a template using these primers. By performing PCR or the like and amplifying the DNA region sandwiched between both primers, a large amount of DNA fragments containing the polynucleotide according to the present invention can be obtained.
本発明に係るポリヌクレオチドは、適当な光合成生物の組織や細胞を供給源として取得することができる。光合成生物としては特に限定されず、例えば、シロイヌナズナ、イネ、タバコ、トウモロコシ，クラミドモナス，海洋性シネココッカス、ヒメツリガネゴケ、光合成細菌ロドバクタースフェロイデスなどが挙げられる。 The polynucleotide according to the present invention can be obtained using a tissue or cell of an appropriate photosynthetic organism as a source. The photosynthetic organism is not particularly limited, and examples thereof include Arabidopsis thaliana, rice, tobacco, corn, Chlamydomonas, marine Synechococcus, Physcomitrella patens, and photosynthetic bacteria Rhodobacter ferroides.
（３）ベクター
本発明は、上述した本発明に係るポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含むベクターを提供する。
(3) Vector The present invention provides a vector comprising the polynucleotide according to the present invention described above or a fragment thereof.
一実施形態において、本発明に係るベクターはクロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドを生成するために使用されるベクターである。このようなベクターは、インビトロ翻訳（無細胞タンパク質合成）に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。 In one embodiment, the vector according to the present invention is a vector used to produce a polypeptide involved in the synthesis of chlorophyll and having vinyl group reductase activity. Such a vector may be a vector used for in vitro translation (cell-free protein synthesis) or a vector used for recombinant expression.
別の実施形態において、本発明に係るベクターは相同組換えに用いるターゲティングベクターである。さらに他の実施形態において、本発明に係るベクターは、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現させるために用いられるベクターである。 In another embodiment, the vector according to the present invention is a targeting vector used for homologous recombination. In yet another embodiment, the vector according to the present invention is a vector used to express antisense RNA or siRNA.
本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含むものであれば、特に限定されない。組換え発現ベクターの場合、例えば、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。 The vector according to the present invention is not particularly limited as long as it contains the above-described polynucleotide according to the present invention or a fragment thereof. In the case of a recombinant expression vector, for example, a recombinant expression vector into which cDNA of a polynucleotide encoding a polypeptide involved in the synthesis of chlorophyll and having vinyl group reductase activity is inserted. A method for producing a recombinant expression vector includes, but is not limited to, a method using a plasmid, phage, cosmid or the like.
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。即ち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。 The specific type of the vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in the host cell may be appropriately selected. That is, according to the type of the host cell, a promoter sequence is appropriately selected in order to reliably express the polynucleotide according to the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide according to the present invention are incorporated into various plasmids is used as an expression vector. Use it.
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびE.coliおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。 The expression vector preferably includes at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture and tetracycline resistance gene or ampicillin resistance gene for culture in E. coli and other bacteria.
上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。または、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein : GFP）をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。 By using the above selection marker, it can be confirmed whether or not the polynucleotide according to the present invention has been introduced into the host cell, and whether or not it is reliably expressed in the host cell. Alternatively, the polypeptide according to the present invention may be expressed as a fusion polypeptide. For example, a green fluorescent protein (GFP) derived from Aequorea jellyfish is used as a marker, and the polypeptide according to the present invention is used as a GFP fusion polypeptide. It may be expressed as
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、***酵母Schizosaccharomyces pombe）、線虫（Caenorhabditis elegans）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。 The host cell is not particularly limited, and various conventionally known cells can be suitably used. Specifically, for example, bacteria such as Escherichia coli, yeasts (budding yeast Saccharomyces cerevisiae, fission yeast Schizosaccharomyces pombe), nematodes (Caenorhabditis elegans), Xenopus laevis oocytes, etc. However, it is not particularly limited. Appropriate culture media and conditions for the above-described host cells are well known in the art.
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、即ち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。 A method for introducing the expression vector into a host cell, that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used. . In addition, for example, when the polypeptide according to the present invention is transferred and expressed in insects, an expression system using baculovirus may be used.
本発明のベクターを用いて本発明に係るポリペプチドを生産することができる。本発明に係るポリペプチドを生産する方法としては、無細胞タンパク質合成系を用いる方法、組換え発現系を用いる方法を挙げることができる。 The polypeptide of the present invention can be produced using the vector of the present invention. Examples of the method for producing the polypeptide according to the present invention include a method using a cell-free protein synthesis system and a method using a recombinant expression system.
無細胞タンパク質合成系を用いる場合、本発明のベクターを無細胞タンパク質合成系に適用すればよい。無細胞タンパク質合成には、種々の市販のキットを用いることができる。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。 When using a cell-free protein synthesis system, the vector of the present invention may be applied to the cell-free protein synthesis system. Various commercially available kits can be used for cell-free protein synthesis. When a recombinant expression system is used, the polynucleotide according to the present invention is incorporated into a recombinant expression vector, and then introduced into a host so that it can be expressed by a known method, and the polypeptide obtained by translation in the host is purified. Such a method can be adopted.
ポリペプチドを精製する方法としては、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、または培地や無細胞タンパク質合成液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製することができる。 As a method for purifying a polypeptide, a cell extract is prepared from cells or tissues by a well-known method (for example, a method in which cells or tissues are disrupted and then centrifuged to collect a soluble fraction), or a medium or Well-known methods from cell-free protein synthesis solutions (eg ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography) , And lectin chromatography).
相同組換えに用いるターゲティングベクターの場合は、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのゲノムＤＮＡと相同組換えが可能なフラグメントを含み、その一部を薬剤耐性遺伝子などのマーカーと結合させたものを挙げることができる。このようなターゲティングベクターにより、標的の遺伝子を破壊することができる。マーカーとして用いる遺伝子は特に限定されないが、例えばカナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが挙げられる。上記フラグメントは、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのゲノムＤＮＡと相同組換えを起こすことができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性が挙げられる。また、フラグメントは少なくとも５０ｎｔ以上の長さを有することが好ましく、より好ましくは１００ｎｔ以上である。 In the case of a targeting vector used for homologous recombination, it contains a fragment capable of homologous recombination with the genomic DNA of a polynucleotide encoding a polypeptide involved in the synthesis of chlorophyll and having vinyl group reductase activity. Examples include those combined with a marker such as a resistance gene. Such a targeting vector can destroy the target gene. The gene used as a marker is not particularly limited, and examples thereof include a kanamycin resistance gene and a chloramphenicol resistance gene. The fragment only needs to have a degree of homology capable of causing homologous recombination with the genomic DNA of a polynucleotide encoding a polypeptide involved in the synthesis of chlorophyll and having vinyl group reductase activity. Such homology is preferably 90% or more, more preferably 95% or more. The fragment preferably has a length of at least 50 nt, more preferably 100 nt or more.
アンチセンスＲＮＡを発現させるために用いられるベクターの場合は、例えば、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡまたはその一部をプロモーターの下流にアンチセンス方向に連結させたものを挙げることができる。このようなベクターを植物に導入することにより、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドの発現を抑制または阻害することができる。クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドの発現を抑制または阻害することができる限り、当該ポリペプチドをコードする遺伝子の転写産物に完全に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするものでなくてもよい。 In the case of a vector used to express antisense RNA, for example, a cDNA of a polynucleotide encoding a polypeptide involved in the synthesis of chlorophyll and having vinyl group reductase activity or a part thereof is placed downstream of the promoter. The thing connected to the direction can be mentioned. By introducing such a vector into a plant, the expression of a polypeptide involved in chlorophyll synthesis and having vinyl group reductase activity can be suppressed or inhibited. As long as it can suppress or inhibit the expression of a polypeptide involved in the synthesis of chlorophyll and having vinyl group reductase activity, it encodes an antisense RNA that is completely complementary to the transcript of the gene encoding the polypeptide. It does not have to be.
ｓｉＲＮＡを発現させるために用いられるベクターの場合は、例えば、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡの一部がプロモーターの下流にセンス方向に連結された部位と、プロモーターの下流に上記ｃＤＮＡの一部がアンチセンス方向に連結された部位とを有するものを挙げることができる。または、プロモーターの下流にセンス配列とアンチセンス配列とがループ配列を介してして連結される構造を有するベクターでもよい。このようなベクターを植物に導入することにより、細胞内で二本鎖のｓｉＲＮＡが生成し、ＲＮＡ干渉によりクロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有する本発明に係るポリペプチドの発現を抑制または阻害することができる。 In the case of a vector used for expressing siRNA, for example, a part of a cDNA of a polynucleotide encoding a polypeptide involved in chlorophyll synthesis and having vinyl group reductase activity is linked downstream of the promoter in the sense direction. And those having a part of the cDNA linked in the antisense direction downstream of the promoter. Alternatively, a vector having a structure in which a sense sequence and an antisense sequence are linked via a loop sequence downstream of the promoter may be used. By introducing such a vector into a plant, a double-stranded siRNA is generated in the cell, and the expression of the polypeptide according to the present invention having vinyl group reductase activity involved in chlorophyll synthesis by RNA interference is suppressed. Or can be inhibited.
上記ベクターの植物細胞への導入方法等についての詳細は後述する。 Details of the method for introducing the vector into plant cells will be described later.
（４）形質転換体
本発明は、上述したクロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含むベクターが導入されている形質転換体を提供する。ここで「形質転換体」には、細胞、組織、器官、生物個体が含まれる。
(4) Transformant The present invention provides a transformant into which a vector containing a polynucleotide encoding a polypeptide involved in the above-described chlorophyll synthesis and having vinyl group reductase activity or a fragment thereof is introduced. Here, “transformants” include cells, tissues, organs, and individual organisms.
形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物を挙げることができる。 A method for producing a transformant (production method) is not particularly limited, and examples thereof include a method for transformation by introducing the above-described recombinant vector into a host. In addition, the organism to be transformed is not particularly limited, and examples thereof include various microorganisms, plants and animals exemplified in the host cell.
本発明に係る形質転換体は、光合成生物の形質転換体であることが好ましく、なかでも植物の形質転換体(形質転換植物）であることが特に好ましい。形質転換植物は、上述の本発明に係るベクターを、当該ベクターに挿入された遺伝子またはその一部が発現し得るように植物中に導入することにより得ることができる。 The transformant according to the present invention is preferably a transformant of a photosynthetic organism, and particularly preferably a plant transformant (transformed plant). A transformed plant can be obtained by introducing the above-described vector according to the present invention into a plant so that the gene inserted into the vector or a part thereof can be expressed.
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター、または外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。 When a recombinant expression vector is used, the recombinant expression vector used for transformation of the plant body is not particularly limited as long as it is a vector capable of expressing the polynucleotide according to the present invention in the plant. Examples of such a vector include a vector having a promoter that constitutively expresses a polynucleotide in a plant cell (eg, cauliflower mosaic virus 35S promoter), or a promoter that is inducibly activated by an external stimulus. The vector which has is mentioned.
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、または種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。 Plants to be transformed in the present invention include whole plants, plant organs (eg leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.), plant tissues (eg epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, A palisade tissue, a spongy tissue, or the like) or plant culture cells, or various forms of plant cells (eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus, and the like. The plant used for transformation is not particularly limited, and may be any plant belonging to the monocotyledonous plant class or the dicotyledonous plant class.
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著，植物遺伝子操作マニュアル，1990,27−31pp，講談社サイエンティフィック，東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Nagelらの方法（Micribiol.Lett.、67、325（1990））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをPlantMolecular Biology Manual（S.b.Gelvinら、Academic Press Publishers）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（pBI121またはpPZP202など）を使用することができる。 For the introduction of genes into plants, transformation methods known to those skilled in the art (for example, Agrobacterium method, gene gun, PEG method, electroporation method, etc.) are used. For example, a method using Agrobacterium and a method for directly introducing it into plant cells are well known. When the Agrobacterium method is used, the constructed plant expression vector is introduced into an appropriate Agrobacterium (eg, Agrobacterium tumefaciens), and this strain is introduced by the leaf disk method (Hirofumi Uchimiya, Plant According to the gene manipulation manual, 1990, 27-31 pp, Kodansha Scientific, Tokyo), etc., a sterile cultured leaf piece can be infected to obtain a transformed plant. The method of Nagel et al. (Micribiol. Lett., 67, 325 (1990)) can also be used. In this method, for example, an expression vector is first introduced into Agrobacterium, and then transformed Agrobacterium is introduced into plant cells or plant tissues by the method described in the Plant Molecular Biology Manual (SbGelvin et al., Academic Press Publishers). It is a method to introduce. Here, “plant tissue” includes callus obtained by culturing plant cells. When transformation is performed using the Agrobacterium method, a binary vector (such as pBI121 or pPZP202) can be used.
また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばPDS−1000（BIO−RAD社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は450〜2000ｐｓｉ程度の圧力、4〜12ｃｍ程度の距離で行う。 Electroporation and gene gun methods are known as methods for directly introducing genes into plant cells or plant tissues. When using a gene gun, a plant body, a plant organ, and a plant tissue itself may be used as they are, or may be used after preparing a section, or a protoplast may be prepared and used. The sample thus prepared can be processed using a gene introduction apparatus (for example, PDS-1000 (BIO-RAD) or the like). Treatment conditions vary depending on the plant or sample, but are usually performed at a pressure of about 450 to 2000 psi and a distance of about 4 to 12 cm.
遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性マーカーで選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。 A cell or plant tissue into which a gene has been introduced is first selected with a drug resistance marker such as hygromycin resistance, and then regenerated into a plant body by a conventional method. Regeneration of a plant body from a transformed cell can be performed by a method known to those skilled in the art depending on the type of plant cell.
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。 When plant cultured cells are used as a host, transformation is carried out by introducing a recombinant vector into the cultured cells using a gene gun, electroporation method or the like. Callus, shoots, hairy roots, etc. obtained as a result of transformation can be used as they are for cell culture, tissue culture or organ culture, and can be used at a suitable concentration using conventionally known plant tissue culture methods. It can be regenerated into plants by administration of plant hormones (auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.).
遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、SYBR Green液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。 Whether or not a gene has been introduced into a plant can be confirmed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, or the like. For example, DNA is prepared from a transformed plant, PCR is performed by designing a DNA-specific primer. PCR can be performed under the same conditions as those used for preparing the plasmid. Thereafter, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis or capillary electrophoresis, stained with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and the amplified product is detected as a single band, It can be confirmed that it has been transformed. Moreover, PCR can be performed using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like to detect an amplification product. Furthermore, it is possible to employ a method in which the amplification product is bound to a solid phase such as a microplate and the amplification product is confirmed by fluorescence or enzymatic reaction.
本発明に係るポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体がいったん得られれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、またはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。 Once a transformed plant in which the polynucleotide of the present invention is integrated into the genome is obtained, progeny can be obtained by sexual or asexual reproduction of the plant. In addition, for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc. can be obtained from the plant or its progeny, or clones thereof, and the plant can be mass-produced based on them. it can. Therefore, the present invention also includes a plant body into which the polynucleotide according to the present invention is introduced so that it can be expressed, or a progeny of the plant body having the same properties as the plant body, or a tissue derived therefrom.
（５）抗体
本発明は、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に係る抗体は、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドを発現する生物材料の選択に有用であり得る。
(5) Antibody The present invention provides an antibody that specifically binds to a polypeptide involved in the synthesis of chlorophyll and having vinyl group reductase activity. As used herein, the term “antibody” refers to immunoglobulins (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM and their Fab fragments, F (ab ′) 2 fragments, Fc fragments), eg Examples include, but are not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, single chain antibodies, anti-idiotype antibodies, and humanized antibodies. The antibody according to the present invention may be useful for selecting a biological material that expresses a polypeptide involved in the synthesis of chlorophyll and having vinyl group reductase activity.
「抗体」は、種々の公知の方法（例えば、HarLowら、「Antibodies:a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York（1988）」、岩崎ら、「単クローン抗体 ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（1991）」）に従えば作製することができる。 “Antibodies” can be prepared by various known methods (for example, HarLow et al., “Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)”, Iwasaki et al., “Monoclonal antibody hybridoma and ELISA, Kodansha (1991) ") Can be produced.
ペプチド抗体は、当該分野に周知の方法によって作製される。例えば、Chow, M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910−914;及びBittle, F. J.ら、J.Gen.Virol.66: 2347-2354(1985)（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る。しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約100μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびFreundのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。 Peptide antibodies are produced by methods well known in the art. For example, Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914; and Bittle, FJ et al., J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985) (referenced herein). See incorporated by reference). In general, animals can be immunized with free peptides. However, anti-peptide antibody titers can be boosted by coupling the peptide to a macromolecular carrier such as keyhole limpet hemocyanin (KLH) or tetanus toxoid. For example, peptides containing cysteine can be coupled to a carrier using a linker such as m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), while other peptides can be coupled more like glutaraldehyde. Common linking agents can be used to couple to the carrier. Animals such as rabbits, rats, and mice can be injected either intraperitoneally and / or intradermally with either free or carrier-coupled peptides, eg, emulsions containing about 100 μg of peptide or carrier protein and Freund's adjuvant. Immunized. To provide useful titers of anti-peptide antibodies that can be detected by an ELISA assay using, for example, free peptide adsorbed on a solid surface, for example, at intervals of about 2 weeks May be needed. The titer of anti-peptide antibodies in serum from immunized animals is increased by selection of anti-peptide antibodies, for example, adsorption to peptides on solid supports and elution of selected antibodies by methods well known in the art. obtain.
本明細書中において、用語「クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体」は、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチド抗原に特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Wahlら、J. Nucl. Med. 24:316−325（1983）（本明細書中に参考として援用される））。従って、これらのフラグメントが好ましい。 In the present specification, the term “an antibody that specifically binds to a polypeptide that is involved in the synthesis of chlorophyll and has vinyl group reductase activity” refers to a polypeptide antigen that is involved in the synthesis of chlorophyll and has a vinyl group reductase activity. It is meant to include complete antibody molecules and antibody fragments (eg, Fab and F (ab ′) 2 fragments) that can specifically bind. Fab and F (ab ′) 2 fragments lack the Fc portion of the complete antibody, are removed more rapidly by circulation, and have little nonspecific tissue binding of the complete antibody (Wahl et al., J Nucl. Med. 24: 316-325 (1983) (incorporated herein by reference)). These fragments are therefore preferred.
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。または、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチド結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。 It is clear that Fab and F (ab ′) 2 and other fragments of the antibodies according to the invention can be used according to the methods disclosed herein. Such fragments are typically produced by proteolytic cleavage using enzymes such as papain (resulting in Fab fragments) or pepsin (resulting in F (ab ′) 2 fragments). Alternatively, polypeptide binding fragments that participate in the synthesis of chlorophyll and have vinyl group reductase activity can be produced by the application of recombinant DNA technology or synthetic chemistry.
このように、本発明に係る抗体は、少なくとも、本発明に係るクロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドを認識する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよいといえる。即ち、本発明に係るクロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドを認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。 Thus, the antibody according to the present invention comprises at least an antibody fragment that recognizes a polypeptide having vinyl group reductase activity involved in the synthesis of the chlorophyll according to the present invention (for example, Fab and F (ab ′) 2 fragment). It can be said that it is sufficient to have. That is, it should be noted that an immunoglobulin comprising an antibody fragment that recognizes a polypeptide that participates in the synthesis of chlorophyll according to the present invention and has vinyl group reductase activity and an Fc fragment of a different antibody molecule is also included in the present invention. It is.
（６）ジビニル型クロロフィルを有する光合成生物の作製方法
本発明は、ジビニル型クロロフィルを有する光合成生物の作製方法を提供する。上記光合成生物は特に限定されるものではないが、植物であることが好ましい。
(6) Method for producing photosynthetic organism having divinyl chlorophyll The present invention provides a method for producing a photosynthetic organism having divinyl chlorophyll. The photosynthetic organism is not particularly limited, but is preferably a plant.
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドに変異を導入する工程を含むことを特徴とする。 In one embodiment, the method includes introducing a mutation into the polynucleotide according to the present invention.
本発明者らは、変異処理を施したシロイヌナズナのスクリーニングにより見出したジビニル型クロロフィルを蓄積するｄｖｒ突然変異体は、野生型ＤＶＲ遺伝子のオープンリーディングフレームの第９９８番目のシトシン（配列番号１に示される塩基配列の１１０１位）がチミンに置換されており、その結果、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３３３位のプロリンがロイシンに変異していることを確認した（実施例１）。すなわち、本発明に係るポリヌクレオチドに変異を導入することにより、ジビニル型クロロフィルを蓄積する光合成生物を作製することが可能であることを見出した。 The present inventors found that a dvr mutant accumulating divinyl-type chlorophyll found by screening Arabidopsis thaliana subjected to mutation treatment was cytosine at position 998 in the open reading frame of the wild-type DVR gene (shown in SEQ ID NO: 1). As a result, it was confirmed that the proline at position 333 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 was mutated to leucine (Example 110). That is, it has been found that a photosynthetic organism that accumulates divinyl chlorophyll can be produced by introducing a mutation into the polynucleotide of the present invention.
変異を導入する工程において利用できる手法としては、例えばＴ−ＤＮＡ挿入法、トランスポゾン挿入法、ジーンターゲティング法などを挙げることができるが、これらに限定されない。 Examples of techniques that can be used in the step of introducing mutations include, but are not limited to, a T-DNA insertion method, a transposon insertion method, and a gene targeting method.
Ｔ−ＤＮＡ挿入法による変異導入は、Ｔ−ＤＮＡをゲノム中にランダムに挿入させ、ＰＣＲを用いて標的遺伝子破壊株を見出す方法である。Ｔ−ＤＮＡの挿入はアグロバクテリウムを介した減圧湿潤法（島本功、岡田清孝監修「新版モデル植物の実験プロトコール」（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ１５）秀潤社、2001年4月2日発行、「４−７減圧浸潤法による形質転換」109−113pp）などの公知の方法により行うことができる。即ち、アグロバクテリウムの懸濁液に植物体の全体を浸漬し、減圧下でアグロバクテリウムを浸潤させることによりＴ−ＤＮＡを植物体に導入する。Ｔ−ＤＮＡを導入した植物から得られた種子を、選択マーカーとして用いた薬剤（例えばカナマイシン等）を含む培地で生育させ、形質転換された個体を選抜し、ＰＣＲ等によりＴ−ＤＮＡが標的遺伝子（ＤＶＲ遺伝子）内部に挿入されているか否かを確認することにより、ジビニル型クロロフィルを有する植物を作製することができる。 Mutagenesis by the T-DNA insertion method is a method in which T-DNA is randomly inserted into a genome and a target gene disruption strain is found using PCR. Insertion of T-DNA by Agrobacterium-mediated decompression-humidification method (Issue Shimamoto and Kiyotaka Okada "Experimental protocol for new model plants" (cell engineering separate volume, plant cell engineering series 15) Shujunsha, April 2, 2001 Published in Japan, “4-7 Transformation by vacuum infiltration method” 109-113 pp). That is, T-DNA is introduced into a plant body by immersing the whole plant body in an Agrobacterium suspension and infiltrating Agrobacterium under reduced pressure. Seeds obtained from a plant into which T-DNA has been introduced are grown in a medium containing a drug (eg, kanamycin) used as a selection marker, transformed individuals are selected, and T-DNA is converted into a target gene by PCR or the like. (DVR gene) A plant having divinyl chlorophyll can be produced by confirming whether or not it is inserted inside.
トランスポゾン挿入法は、トランスポゾンをゲノム中にランダムに挿入させ、ＰＣＲを用いて標的遺伝子破壊株を見出す方法である。使用するトランスポゾンについては、特に限定されず、例えばＡｃ／ＤＳ等のＤＮＡ型トランスポゾンやレトロトランスポゾンを使用することができる。トランスポゾンの挿入はエレクトロポレーション法などの公知の方法（佐々木卓治、田畑哲之、島本功監修「植物のゲノム研究プロトコール」（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ１４）秀潤社、2001年2月5日発行、「２−４遺伝子破壊法」）により行うことができる。 The transposon insertion method is a method in which a transposon is randomly inserted into a genome and a target gene-disrupted strain is found using PCR. The transposon to be used is not particularly limited, and for example, a DNA transposon such as Ac / DS or a retrotransposon can be used. Transposon insertion is a well-known method such as electroporation (Takuharu Sasaki, Tetsuyuki Tabata, Isao Shimamoto “Plant Genome Research Protocol” (Cell Engineering Separate Volume, Plant Cell Engineering Series 14) Shujunsha, February 5, 2001 Published in Japan, “2-4 gene disruption method”).
ジーンターゲティング法による変異導入は、相同組換えにより本発明に係るポリヌクレオチドの内部に薬剤耐性遺伝子等の他のポリヌクレオチドを挿入することにより行うことができる。その結果、標的遺伝子は破壊（ノックアウト）され、標的遺伝子が変異した植物細胞を得ることができる。または、相同組換えにより、例えば、野生型ＤＶＲ遺伝子のオープンリーディングフレームの第９９８番目のシトシンに相当する塩基をチミンに置換してもよい。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドのゲノムＤＮＡのエクソン内に薬剤耐性遺伝子などを挿入したターゲティングベクターを構築し、これを植物細胞内に導入することによって、相同組換えを起こさせることができる。相同組換えが起こったか否かについては、ＰＣＲやサザンハイブリダイゼーションにより確認することができる。なお、本方法に用いるターゲティングベクターは、上述の本発明に係るベクターに含まれる。 Mutation can be introduced by the gene targeting method by inserting another polynucleotide such as a drug resistance gene into the polynucleotide according to the present invention by homologous recombination. As a result, the target gene is destroyed (knocked out), and a plant cell in which the target gene is mutated can be obtained. Alternatively, for example, a base corresponding to the 998th cytosine in the open reading frame of the wild-type DVR gene may be substituted with thymine by homologous recombination. For example, homologous recombination can be caused by constructing a targeting vector in which a drug resistance gene or the like is inserted into an exon of the genomic DNA of the polynucleotide of the present invention and introducing it into a plant cell. Whether or not homologous recombination has occurred can be confirmed by PCR or Southern hybridization. In addition, the targeting vector used for this method is contained in the vector which concerns on the above-mentioned this invention.
一旦、本発明に係るポリヌクレオチドであるゲノムＤＮＡに変異が導入され植物が得られれば、当該植物から有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、またはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、上述の本発明に係るジビニル型クロロフィルを有する植物の作製方法により作製された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。 Once a mutation is introduced into genomic DNA, which is a polynucleotide according to the present invention, and a plant is obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. In addition, for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc. can be obtained from the plant or its progeny, or clones thereof, and the plant can be mass-produced based on them. it can. Therefore, the present invention includes a plant produced by the above-described method for producing a plant having a divinyl chlorophyll according to the present invention, or a progeny of the plant having the same properties as the plant, or derived therefrom. Organizations are also included.
他の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを細胞に導入する工程を含むことを特徴としている。本発明に係るポリヌクレオチドまたはそのフラグメントとしては、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして機能するポリヌクレオチドまたはそのフラグメントが好ましい。これらを細胞に導入することにより、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するポリペプチドの発現を阻害し、ジビニル型クロロフィルを有する植物を作製することができる。 In another embodiment, the method includes a step of introducing a polynucleotide according to the present invention or a fragment thereof into a cell. The polynucleotide or fragment thereof according to the present invention is preferably a polynucleotide that functions as antisense RNA or siRNA or a fragment thereof. By introducing these into cells, the expression of a polypeptide involved in chlorophyll synthesis and having vinyl group reductase activity can be inhibited, and a plant having divinyl chlorophyll can be produced.
アンチセンスＲＮＡは、正常な転写産物（ｍＲＮＡ）に相補的なＲＮＡを用いて遺伝子発現を特異的に阻害する方法である。例えば、プラスミドベクターのプロモーターに逆向きにｃＤＮＡを挿入して宿主細胞に導入し、細胞内でアンチセンスＲＮＡを発現させれば遺伝子の発現（タンパク質の翻訳）を阻害できる。 Antisense RNA is a method of specifically inhibiting gene expression using RNA complementary to a normal transcript (mRNA). For example, gene expression (protein translation) can be inhibited by inserting cDNA reversely into the promoter of a plasmid vector, introducing the cDNA into a host cell, and expressing antisense RNA in the cell.
ＲＮＡ干渉は、２本鎖のＲＮＡを細胞の中に入れると、その配列に相同なｍＲＮＡが分解され、遺伝子発現を阻害する現象である。ＲＮＡ干渉を起こすことができる短い２本鎖ＲＮＡはｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）と称される。ｓｉＲＮＡが、遺伝子特異的にその発現を抑制することは、既に多くの研究で確立されており、当業者において技術常識である。ｓｉＲＮＡの設計の指針については既に多数の文献や成書において公表されており、これらの指針にしたがって遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを設計することができる。細胞内でｓｉＲＮＡが発現するように構築したベクター（ｓｉＲＮＡ発現ベクター）を宿主細胞に導入し、細胞内でｓｉＲＮＡを発現させればポリペプチドの発現を阻害できる。 RNA interference is a phenomenon in which when a double-stranded RNA is introduced into a cell, mRNA homologous to the sequence is degraded and gene expression is inhibited. A short double-stranded RNA capable of causing RNA interference is called siRNA (small interfering RNA). It has already been established in many studies that siRNA suppresses its expression in a gene-specific manner, and it is common knowledge in the art. SiRNA design guidelines have already been published in many literatures and books, and gene-specific siRNAs can be designed according to these guidelines. Polypeptide expression can be inhibited by introducing a vector (siRNA expression vector) constructed so that siRNA is expressed in the cell into the host cell and expressing the siRNA in the cell.
なお、アンチセンスＲＮＡ法（アンチセンス法）およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は当業者に周知であり、例えば「ＲＮＡｉ」グレゴリー・ハノン編、中村義一訳 ISBN4895923827に記載の方法を用いて行うことができる。 The antisense RNA method (antisense method) and RNA interference (RNAi) are well known to those skilled in the art, and can be performed, for example, using the method described in “RNAi” edited by Gregory Hannon, Yoshikazu Nakamura ISBN4895923827.
恒常的にアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを過剰発現できるベクターを構築し、植物細胞に導入して染色体に組み込まれた形質転換細胞を得れば、当該植物細胞を再生すれば本発明に係るポリペプチドの発現が恒常的に阻害される植物を作製することができる。 If a vector capable of constitutively overexpressing antisense RNA or siRNA is constructed, and transformed cells are introduced into plant cells and integrated into the chromosome, the plant cells can be regenerated to regenerate the polypeptide of the present invention. Plants whose expression is constitutively inhibited can be produced.
一旦このような本発明に係るポリペプチドの発現が恒常的に阻害される植物を得ることができれば、当該植物から有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、またはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、上述の本発明に係るジビニル型クロロフィルを有する植物の作製方法により作製された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。 Once a plant in which the expression of the polypeptide according to the present invention is constantly inhibited can be obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. In addition, for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc. can be obtained from the plant or its progeny, or clones thereof, and the plant can be mass-produced based on them. it can. Therefore, the present invention includes a plant produced by the above-described method for producing a plant having a divinyl chlorophyll according to the present invention, or a progeny of the plant having the same properties as the plant, or derived therefrom. Organizations are also included.
以上のように、本発明に係るポリヌクレオチドを破壊することによって、クロロフィル生合成過程で最終的に合成されるクロロフィルは、通常のモノビニル型クロロフィルではなく、ジビニル型クロロフィルとなる。上述したように、ジビニル型クロロフィルは、モノビニル型クロロフィルに比べて短波長域の吸収が１０ｎｍ長波長側にずれている。そのため、このような植物は、モノビニル型クロロフィルでは効率的に吸収できない光を捕捉し、光合成に利用することができる。 As described above, by destroying the polynucleotide according to the present invention, the chlorophyll finally synthesized in the chlorophyll biosynthesis process is not a normal monovinyl chlorophyll but a divinyl chlorophyll. As described above, the absorption of the short wavelength region of the divinyl chlorophyll is shifted to the 10 nm long wavelength side compared to the monovinyl chlorophyll. Therefore, such plants can capture light that cannot be efficiently absorbed by monovinyl chlorophyll and can be used for photosynthesis.
従って、通常の植物では捕捉が不可能な光を光合成に利用できることによって、光源に近い位置に通常の植物を置き、その位置よりも光源から離れた位置に、このような植物を配置すれば、単位面積あたりの光合成生産の増加が期待される。 Therefore, by using light that cannot be captured by normal plants for photosynthesis, if a normal plant is placed at a position closer to the light source and such a plant is placed at a position farther from the light source than that position, An increase in photosynthetic production per unit area is expected.
また、深海（100〜200ｍｍ）に届く光は、ジビニル型クロロフィルによって効率的に捕捉され光合成に利用されることが知られている。したがって、上記のような植物を、栄養塩に富むこの領域での農業生産に利用できる可能性がある。 In addition, it is known that light reaching the deep sea (100 to 200 mm) is efficiently captured by divinyl chlorophyll and used for photosynthesis. Therefore, there is a possibility that such plants can be used for agricultural production in this region rich in nutrient salts.
さらに、本発明に係るポリヌクレオチドの完成を部分的に抑制させることによって、モノビニル型クロロフィルとジビニル型クロロフィル両方を備えた植物を作成することができる。これにより、通常の植物より、より広い範囲の光を利用できる植物が作成され、農業生産の効率が期待される。ポリヌクレオチドの完成を部分的に抑制させる方法としては、例えば上述したアンチセンスＲＮＡを用いることによって達成できることが知られている。（例えば、Tanaka, R., Hirashima, M., Satoh, S., Tanaka, A (2003) The Arabidopsis-accelerated cell death gene ACD1is involved in oxygenation of pheophorbide a: Inhibition of the pheophorbide aoxygenase activity does not lead to the "stay-green" phenotype in Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 44: 1266-1274.を参照のこと）
（７）スクリーニング方法
本発明者らは、ｄｖｒ変異体、即ちジビニル型クロロフィルを蓄積する植物が高照度下において短時間（約１日）で枯死してしまうことを見出した。このことは、ＤＶＲタンパク質が植物を枯死させる除草剤の標的酵素として大変有効であることを示している。
Furthermore, the plant provided with both the monovinyl type chlorophyll and the divinyl type chlorophyll can be created by partially suppressing the completion of the polynucleotide according to the present invention. Thereby, a plant that can use a wider range of light than a normal plant is created, and the efficiency of agricultural production is expected. As a method for partially suppressing the completion of the polynucleotide, it is known that it can be achieved, for example, by using the above-described antisense RNA. (For example, Tanaka, R., Hirashima, M., Satoh, S., Tanaka, A (2003) The Arabidopsis-accelerated cell death gene ACD1is involved in oxygenation of pheophorbide a: Inhibition of the pheophorbide aoxygenase activity does not lead to the (See "stay-green" phenotype in Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 44: 1266-1274.)
(7) Screening method The present inventors have found that dvr mutants, that is, plants that accumulate divinyl-type chlorophyll, die in a short time (about 1 day) under high illuminance. This indicates that the DVR protein is very effective as a target enzyme for herbicides that kill plants.
それゆえ、本発明に係るポリペプチドは、クロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するを阻害する阻害物質を同定するためのアッセイ方法における使用に適している。従って、本発明は、本発明に係るポリペプチドの機能を阻害する阻害物質のスクリーニング方法を提供する。本明細書において、「ポリペプチドの機能の阻害」または「モノビニル型クロロフィルの合成を触媒する活性の阻害」には、ポリペプチドの正常な活性発現に直接的又は間接的に影響を与えることが含まれる。本明細書において、用語「阻害物質」は、正常な活性発現に直接的又は間接的に影響を与える化合物、アンタゴニスト、リガンド、基質、および酵素を意味する。 Therefore, the polypeptides according to the present invention are suitable for use in assay methods to identify inhibitors that are involved in the synthesis of chlorophyll and inhibit vinyl group reductase activity. Therefore, the present invention provides a screening method for an inhibitor that inhibits the function of the polypeptide of the present invention. As used herein, “inhibition of polypeptide function” or “inhibition of activity that catalyzes the synthesis of monovinyl-type chlorophyll” includes directly or indirectly affecting the normal activity expression of a polypeptide. It is. As used herein, the term “inhibitor” means compounds, antagonists, ligands, substrates, and enzymes that directly or indirectly affect the expression of normal activity.
本発明に係るポリペプチドは、阻害物質を同定するためのアッセイ方法で使用するための天然および組換え材料の両方から得ることができる。一般に、阻害物質を同定するためのアッセイ方法は、本発明のポリペプチド(または、このポリペプチドを担持する細胞又は膜)と、阻害物質を含有することが予想される試験化合物または試料とを接触させる工程と、上記の試験化合物または試料が当該ポリペプチドに与える影響を検出する工程とを含むことができる。試験化合物または試料を、例えば、精製ポリペプチド、ポリペプチド製造細胞の細胞画分、および／またはポリペプチド発現細胞の全体について、直接、試験することができる。試験化合物または試料を、公知の標識又は非標識ポリペプチドリガンドの存在又は不在下で、ポリペプチドに添加することができる。更に、これらのスクリーニング方法は、試験化合物又は試料の阻害活性は、例えば、試験化合物または試料と、請求項１に記載のポリペプチドとを接触させた後に、ビニル基還元酵素活性（即ち、ジビニル型クロロフィリドａをモノビニル型クロロフィリドａ変換する活性：ＤＶＲ活性）を維持しているか否かを分析することによって決定することができる。 The polypeptides according to the invention can be obtained from both natural and recombinant materials for use in assay methods for identifying inhibitors. In general, an assay method for identifying an inhibitor comprises contacting a polypeptide of the invention (or a cell or membrane carrying the polypeptide) with a test compound or sample that is expected to contain the inhibitor. And a step of detecting the influence of the test compound or sample on the polypeptide. A test compound or sample can be tested directly, eg, on a purified polypeptide, a cellular fraction of polypeptide-producing cells, and / or the entire polypeptide-expressing cell. A test compound or sample can be added to the polypeptide in the presence or absence of a known labeled or unlabeled polypeptide ligand. Further, in these screening methods, the inhibitory activity of the test compound or sample is determined by, for example, contacting the test compound or sample with the polypeptide of claim 1 and then the vinyl group reductase activity (ie, divinyl type). It can be determined by analyzing whether or not the activity of converting chlorophyllide a to monovinyl chlorophyllide a: DVR activity) is maintained.
以上のようなスクリーニング方法は、例えば、阻害物質を同定するためのスクリーニングキットの使用によって実施可能である。このキットは、（ａ）本発明のポリペプチド；（ｂ）本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞；又は（ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞膜を含む。また、このキットに用いることのできる任意の公知材料または成分を、キットに加えることができる。 The screening method as described above can be performed, for example, by using a screening kit for identifying an inhibitory substance. The kit includes (a) a polypeptide of the invention; (b) a recombinant cell that expresses the polypeptide of the invention; or (c) a cell membrane that expresses a polypeptide of the invention. Also, any known material or component that can be used in the kit can be added to the kit.
以上のようなスクリーニング方法によってスクリーニングされた阻害物質を用いれば、モノビニル型クロロフィルを合成する通常（野生型）の植物は、ジビニル型クロロフィルを蓄積する植物に転換される。転換された植物は、高照度下において短時間（約１日）で枯死してしまう。したがって、スクリーニングによって得られた阻害物質は、植物を高照度下にさらして枯死させる特性を有する除草剤として有用である。 If an inhibitor screened by the above screening method is used, a normal (wild type) plant that synthesizes monovinyl chlorophyll is converted to a plant that accumulates divinyl chlorophyll. The converted plant will die in a short time (about 1 day) under high illumination. Therefore, the inhibitory substance obtained by screening is useful as a herbicide having the property of causing plants to die by exposure to high illumination.
また、このようなＤＶＲタンパク質を標的とした除草剤に対する耐性遺伝子（例えば、当該除草剤の標的とならず、かつクロロフィルの合成に関与しビニル基還元酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子）を導入した形質転換植物と組み合わせれば、今までにない有効な除草剤開発の可能性がある。 Also introduced a herbicide resistance gene targeting such DVR protein (for example, a gene encoding a protein that is not a target of the herbicide and is involved in chlorophyll synthesis and has vinyl group reductase activity) When combined with the transformed plants, there is a possibility of developing an effective herbicide that has never existed.
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made within the scope of the claims, and the embodiments can be obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments. The form is also included in the technical scope of the present invention.
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail using an Example, this invention is not limited to these Examples.
〔実施例１：ジビニル型クロロフィルを蓄積する突然変異株の単離および突然変異株の解析〕
ジビニル型クロロフィルを蓄積する突然変異株を取得するために、野生型シロイヌナズナ（エコタイプColumbia）の種子をエチルメタンスルホン酸（ethylmethanesulphonate：EMS）で変異処理した後、発芽させ、幼苗の葉から色素を抽出し、その組成を解析した。
[Example 1: Isolation of mutant strain accumulating divinyl-type chlorophyll and analysis of mutant strain]
In order to obtain mutant strains that accumulate divinyl-type chlorophyll, wild-type Arabidopsis (ecotype Columbia) seeds were mutated with ethylmethanesulphonate (EMS), germinated, and pigments were seeded from seedling leaves. Extracted and analyzed its composition.
具体的には、EMS処理は、ethyl methanesulfonate 0.1%エチルメタンスルホン酸水溶液に、シロイヌナズナ種子を混ぜ、すぐに、遠心分離し、上記のEMS水溶液を除き、その後、滅菌水で何度も洗浄する（新版 モデル植物の実験プロトコール 監修 島本功 岡田清孝 秀潤社 ISBN 4-87962-234-6を参照のこと）。この種（M1種子）をポットに播いて、植物（M1植物）を育て、自家受粉した種（M2種子）を回収する。この種子をさらに、ポットに播き、植物（M2植物）を育て、スクリーニングに使用した。なお本実施例においては、上記のM2種子を、Lehle seeds（http://www.arabidopsis.com/）から購入した。M2種子は、バーミキュライトに播種し、３週間70-90μモル／ｍ２ｓの低照度下で育てた後、上から数えて４番目の葉を一つの植物体から１枚刈り取り、液体窒素下で凍結させた。この葉から１００％アセトンを用いて抽出した色素を、Zapataらの論文（Zapata, M., Rodriguez, F. and Garrido, J.L. (2000). Separation of chlorophylls and carotenoids from marine phytoplankton: a new HPLC method using a reversed phase C8 column and pyridine containing mobile phases. Mar Ecol Prog Ser 195, 29-45.）に記載の方法に従い、Symmetry C8カラム（長さ150 mm、直径4.6 mm、Waters Co.）を用いたＨＰＬＣにより解析した。 Specifically, in EMS treatment, ethyl methanesulfonate 0.1% ethyl methanesulfonic acid aqueous solution is mixed with Arabidopsis seeds, immediately centrifuged, and the above EMS aqueous solution is removed, and then washed many times with sterilized water ( New edition Experimental protocol for model plants Supervised by Isao Shimamoto Kiyotaka Okada Hidejunsha ISBN 4-87962-234-6). This seed (M1 seed) is sown in a pot to grow a plant (M1 plant) and collect self-pollinated seed (M2 seed). This seed was further sown in a pot to grow a plant (M2 plant) and used for screening. In this example, the above M2 seeds were purchased from Lehle seeds (http://www.arabidopsis.com/). M2 seeds are sown in vermiculite and grown under low illuminance of 70-90 μmol / m 2 s for 3 weeks. Then, the fourth leaf counted from the top is cut from one plant body, and then under liquid nitrogen. Frozen. A pigment extracted from this leaf with 100% acetone was used in a paper by Zapata et al. (Zapata, M., Rodriguez, F. and Garrido, JL (2000). Separation of chlorophylls and carotenoids from marine phytoplankton: a new HPLC method using a reversed phase C8 column and pyridine containing mobile phases. According to the method described in Mar Ecol Prog Ser 195, 29-45.) by HPLC using a Symmetry C8 column (length 150 mm, diameter 4.6 mm, Waters Co.) Analyzed.
EMS変異処理した種子から生育した３０００株の幼苗をスクリーニングした結果、上記ＨＰＬＣ解析においてモノビニル型クロロフィルの保持時間と異なる保持時間にピークを有する変異株１個体を見出した（以下、ｄｖｒ変異株と呼ぶ）。 As a result of screening 3000 seedlings grown from seeds subjected to EMS mutation treatment, one mutant having a peak at a retention time different from the retention time of monovinyl chlorophyll was found in the HPLC analysis (hereinafter referred to as a dvr mutant). ).
図２（ａ）に、野生型シロイヌナズナ（野生株）およびｄｖｒ変異株からそれぞれ抽出した色素中のクロロフィル組成の解析結果（ＨＰＬＣクロマトグラム）を示した。図中のＷＴは野生型シロイヌナズナを表し、ｄｖｒはｄｖｒ変異株を表している。図２（ａ）から明らかなように、ｄｖｒ変異株では野生型よりＨＰＬＣの保持時間が短くなっていることがわかる。なお、ｄｖｒ変異株の保持時間は、上記Zapataらの文献に記載されているジビニルクロロフィルａおよびｂの保持時間と一致していた。 FIG. 2 (a) shows the analysis results (HPLC chromatogram) of the chlorophyll composition in the pigments extracted from the wild type Arabidopsis thaliana (wild type strain) and the dvr mutant strain, respectively. In the figure, WT represents wild-type Arabidopsis thaliana and dvr represents a dvr mutant. As is clear from FIG. 2 (a), it can be seen that the dvr mutant strain has a shorter HPLC retention time than the wild type. In addition, the retention time of the dvr mutant was consistent with the retention time of divinylchlorophyll a and b described in Zapata et al.
次に、ｄｖｒ変異株からアセトンにより抽出した色素をLC カラム Shim-Pack PRE-ODS(長さ250 mm、直径20mm、SIMAZU Co.)を用いて100％メタノールによって溶出した。スクリーニングに用いたＨＰＬＣの系においてモノビニル型クロロフィルａの保持時間より１２秒短い保持時間で溶出される分画と、モノビニル型クロロフィルｂの保持時間とほぼ同じ保持時間で溶出される分画とを上記の系において分取し、ヘキサンを用いて色素を濃縮し、乾燥した。得られた色素を80％アセトンに再懸濁し、その吸収スペクトルを解析した。なお、対照として野生株から抽出したクロロフィルａおよびクロロフィルｂの吸収スペクトルも同時に解析した。 Next, the dye extracted from the dvr mutant with acetone was eluted with 100% methanol using an LC column Shim-Pack PRE-ODS (length 250 mm, diameter 20 mm, SIMAZU Co.). In the HPLC system used for screening, the fraction eluted with a retention time shorter than the retention time of monovinyl chlorophyll a by 12 seconds and the fraction eluted with a retention time substantially the same as the retention time of monovinyl chlorophyll b are described above. In this system, the dye was collected, concentrated with hexane, and dried. The resulting dye was resuspended in 80% acetone and the absorption spectrum was analyzed. As a control, the absorption spectra of chlorophyll a and chlorophyll b extracted from the wild strain were also analyzed simultaneously.
結果を図２（ｂ）に示した。上段には、上記モノビニル型クロロフィルａの保持時間より１２秒短い保持時間で溶出される分画の吸収スペクトルを示した。この分画の色素は波長６６４ｎｍおよび４３８ｎｍにおいて吸収極大を示した。また、ソーレー帯ピークは、モノビニル型クロロフィルａと比較して長波長（赤色）側に１０ｎｍずれていた。 The results are shown in FIG. The upper part shows the absorption spectrum of the fraction eluted with a retention time shorter by 12 seconds than the retention time of the monovinyl chlorophyll a. The dye of this fraction showed absorption maxima at wavelengths of 664 nm and 438 nm. Further, the Soray band peak was shifted by 10 nm toward the long wavelength (red) side as compared with the monovinyl type chlorophyll a.
下段には、上記モノビニル型クロロフィルｂの保持時間とほぼ同じ保持時間で溶出される分画の吸収スペクトルを示した。この分画の色素は、ソーレー帯が僅かに長波長側にずれている以外は、モノビニル型クロロフィルｂの吸収スペクトルと一致していた。 The lower part shows the absorption spectrum of the fraction eluted with approximately the same retention time as that of the monovinyl chlorophyll b. The pigment of this fraction coincided with the absorption spectrum of monovinyl chlorophyll b except that the Soray band was slightly shifted to the longer wavelength side.
上記ｄｖｒ変異株から抽出した２種類の色素の吸収スペクトルは、それぞれShedbalkarとRebeizの論文（Shedbalkar, V.P. and Rebeiz C.A. (1992). Chloroplast biogenesis: determination of the molar extinction coefficients of divinyl chlorophyll a and b and their pheophytins. Anal. Biochem. 207, 261-266.）において報告されたジビニル型クロロフィルａおよびジビニル型クロロフィルｂの吸収スペクトルとほぼ一致していた。 The absorption spectra of the two dyes extracted from the above dvr mutants are shown in the papers of Shedbalkar and Rebeiz (Shedbalkar, VP and Rebeiz CA (1992). Chloroplast biogenesis: determination of the molar extinction coefficients of divinyl chlorophyll a and b and their, respectively. pheophytins. Anal. Biochem. 207, 261-266.), the absorption spectra of divinyl-type chlorophyll a and divinyl-type chlorophyll b were almost identical.
以上の結果から、本発明者らはこのｄｖｒ変異株はモノビニル型クロロフィルではなくジビニル型クロロフィルを蓄積する株であると判断し、以下、当該ｄｖｒ変異株の特徴を解析した。 Based on the above results, the present inventors determined that this dvr mutant is a strain that accumulates divinyl chlorophyll, not monovinyl chlorophyll, and analyzed the characteristics of the dvr mutant.
図２（ｃ）に、播種後７週の野生株（図中、ＷＴ）およびｄｖｒ変異株（図中、ｄｖｒ）の表現型を示した。植物体の生育は明期を16時間、明るさを70-90μモル／ｍ２ｓ、温度を23℃の条件で行った。ｄｖｒ変異株は野生株と比較して体色が薄く、黄緑色で、成長も１週間程度の遅れが見られた。 FIG. 2 (c) shows the phenotypes of the wild strain (WT in the figure) and the dvr mutant (dvr in the figure) 7 weeks after sowing. Plants were grown under conditions of 16 hours light period, 70-90 μmol / m 2 s brightness, and 23 ° C. temperature. The dvr mutant strain was lighter in color than the wild strain, yellowish green, and the growth was delayed by about one week.
また、野生株およびｄｖｒ変異株のクロロフィルａ／ｂ比を測定した。測定はそれぞれの植物体の葉から100％アセトンで色素を抽出し、80％アセトンに希釈した後、その抽出液の吸光度を測定することで行った。算出方法は、Porraらの論文（Porra, R.J., Thompson, W.A. and Kriedemann, P.E. (1989). Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents:verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta 975, 384-94.）に従った。ｄｖｒ変異株のクロロフィルａ／ｂは、成長段階および生育条件により異なるが、６〜１０の範囲であった。一方、野生株のクロロフィルａ／ｂ比は３〜３．８の範囲であった。 Moreover, the chlorophyll a / b ratio of the wild strain and the dvr mutant strain was measured. The measurement was performed by extracting the pigment from each plant leaf with 100% acetone, diluting to 80% acetone, and measuring the absorbance of the extract. The calculation method is described in Porra et al. (Porra, RJ, Thompson, WA and Kriedemann, PE (1989). Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll. standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta 975, 384-94.). The chlorophyll a / b of the dvr mutant was in the range of 6 to 10, although it varied depending on the growth stage and growth conditions. On the other hand, the chlorophyll a / b ratio of the wild strain was in the range of 3 to 3.8.
さらに、利用する光合成色素が異なることによって、強光下での適応能力に違いが見られるかを、低照度条件下（７０〜９０μモル／ｍ２ｓ）で26日間生育させた野生株および33日間生育させたｄｖｒ変異株を、高照度条件下（１０００μモル／ｍ２ｓ）に１日間置いた前後の状態を比較観察することによって確かめた。dvr変異株の生育速度が野生株と比較して１週間遅いことから、それぞれの植物体の生育をそろえるために、生育期間が異なるものを使用した。 Furthermore, the difference in the ability to adapt under strong light depending on the different photosynthetic pigments used was determined based on whether wild strains grown for 26 days under low light conditions (70-90 μmol / m 2 s) and 33 The dvr mutant grown for one day was confirmed by comparative observation of the state before and after being placed under high illumination conditions (1000 μmol / m 2 s) for one day. Since the growth rate of the dvr mutant strain was one week slower than that of the wild strain, those having different growth periods were used in order to align the growth of each plant.
結果を図２（ｄ）に示した。図２（ｄ）から明らかなように、ｄｖｒ変異株（図中、ｄｖｒ）は、低照度条件下において光合成を行い、成長することができるが、高照度条件下に置くと急速に枯死することがわかった。一方、野生株は低照度条件下から高照度条件下に照度条件を変化させても、変化は認められなかった。 The results are shown in FIG. As is apparent from FIG. 2 (d), the dvr mutant strain (dvr in the figure) can synthesize and grow under low-light conditions, but rapidly died when placed under high-light conditions. I understood. On the other hand, no change was observed in the wild strain even when the illuminance conditions were changed from low illuminance conditions to high illuminance conditions.
〔実施例２：ポジショナルクローニング〕
エチルメタンスルホン酸(EMS)処理によって得られたホモ接合性ｄｖｒ変異株と野生株（エコタイプ：Lansberg erecta）とを交配し、Ｆ２世代から、ジビニル型クロロフィルを蓄積する植物体を９６０株選抜した。
[Example 2: Positional cloning]
A homozygous dvr mutant obtained by treatment with ethylmethanesulfonic acid (EMS) was crossed with a wild strain (ecotype: Lansberg erecta), and 960 plants were selected from the F2 generation to accumulate divinyl chlorophyll. .
ラフマッピングには、ＴＡＩＲ（The Arabidopsis Information Resource、www.arabidopsis.org）より入手した、５本の染色体に一様に配置されているSSLP (simple sequence length polymorphism)およびCAPS(cleaved amplified polymorphism sequence)マーカーを用いた。選抜した各個体からゲノムＤＮＡ抽出して、これを鋳型としたＰＣＲにより、各染色体の組み換え価を算出した。その結果、ｄｖｒ変異株の原因遺伝子が５番染色体のｎｇａ１０６とＣＩＷ８との間にマップされることが明らかとなった。
For rough mapping, SSLP (simple sequence length polymorphism) and CAPS (cleaved amplified polymorphism sequence) markers uniformly distributed on five chromosomes obtained from TAIR (The Arabidopsis Information Resource, www.arabidopsis.org) Was used. Genomic DNA was extracted from each selected individual, and the recombination value of each chromosome was calculated by PCR using this as a template. As a result, it became clear that the causal gene of the dvr mutant is mapped between nga106 of
ｎｇａ１０６とＣＩＷ８との間に組換えを起こした３８株を同定し、これらを用いてファインマッピングを行った。また、ファインマッピングには、Monsantoウェブサイト(https://www.ncgr.org/cgi-bin/cereon/cereon_login.pl)から得られる挿入／欠失情報に基づいて、全長26Mbの5番染色体の5.5Mbから6.5Mbの間のBACクローンK10A8、F20L16、F17K4、T24G5上に存在する一塩基多型（SNP）を一つずつ用いた。 38 strains that caused recombination between nga106 and CIW8 were identified, and these were used for fine mapping. Fine mapping is based on the insertion / deletion information obtained from the Monsanto website (https://www.ncgr.org/cgi-bin/cereon/cereon_login.pl). Single nucleotide polymorphisms (SNPs) present on BAC clones K10A8, F20L16, F17K4, and T24G5 between 5.5 Mb and 6.5 Mb were used one by one.
得られた組み換え価から、dvr変異株の原因遺伝子はBACクローンのF20L16とF17K4の近くに存在していると予想した。これらのBACクローンF20L16とF17K4と、これらに近接するBACクローンのなかから、葉緑体移行配列を持ち、未だ機能が決定されておらず、しかも還元酵素と類似配列を持つ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を原因遺伝子の候補として4つ選択した。変異株において、これらの遺伝子の塩基配列を決定し、野生型の配列と比較した結果、図３（ａ）に示すＢＡＣクローン領域上にあるAT5G18660に変異を有していることを見出した。 From the obtained recombination values, it was predicted that the causative gene of the dvr mutant was present near the BAC clones F20L16 and F17K4. Among these BAC clones F20L16 and F17K4, and the BAC clones close to them, open reading frames of genes that have chloroplast translocation sequences, whose functions have not yet been determined, and that have similar sequences to reductase ( Four ORFs were selected as causal gene candidates. In the mutant strains, the base sequences of these genes were determined and compared with the wild type sequence, and as a result, it was found that AT5G18660 in the BAC clone region shown in FIG.
すなわち、ｄｖｒ変異株は、AT5G18660のＯＲＦの第９９８番目ヌクレオチド（配列番号１に示される塩基配列の１１０１位）がシトシンからチミンに変異しており、その結果、第３３３番目のアミノ酸がプロリンからロイシンに変異していた。 That is, in the dvr mutant, the 998th nucleotide (position 1101 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1) of the ORF of AT5G18660 is mutated from cytosine to thymine, and as a result, the 333rd amino acid is changed from proline to leucine. It was mutated.
AT5G18660（以下「ＤＶＲ遺伝子」と呼ぶ）は、１２５１塩基対のＯＲＦからなり、４１７アミノ酸残基のタンパク質をコードしている。ターゲットＰ（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）を用いたコンピューター分析では、ＤＶＲタンパク質は、４９アミノ酸残基の葉緑体移行配列（chloroplast transit sequence）を有することが予想された。これは、クロロフィル生合成に関わる全ての酵素が、その配列中に移行ペプチドを有し、かつ葉緑体内で機能するという事実と一致するものであった。この移行ペプチドが除かれた成熟タンパク質のサイズは、３６８アミノ酸残基であると推定された。ＢＬＡＳＴによって全長のＤＶＲのアミノ酸配列を分析した結果、Ｃ−Ｃ二重結合の還元を触媒するイソフラボン還元酵素と高いホモロジーがあることが示された。ＳＯＳＵＩプログラム（http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html）では、ＤＶＲタンパク質は、１つの推定膜貫通αヘリックスを有していると推定された。これは、膜上にＤＶＲタンパク質（酵素）が位置していることを示すものであった。ここから、膜分画にＤＶＲ活性があるという従来の報告に矛盾がなかったことがわかる。 AT5G18660 (hereinafter referred to as “DVR gene”) consists of a 1251 base pair ORF and encodes a protein of 417 amino acid residues. According to computer analysis using target P (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/), the DVR protein may have a chloroplast transit sequence with 49 amino acid residues. Expected. This was consistent with the fact that all enzymes involved in chlorophyll biosynthesis have a transit peptide in their sequence and function in the chloroplast. The size of the mature protein from which this transition peptide was removed was estimated to be 368 amino acid residues. As a result of analyzing the amino acid sequence of full-length DVR by BLAST, it was shown to have high homology with isoflavone reductase that catalyzes the reduction of CC double bond. In the SOSUI program (http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html), it was estimated that the DVR protein has one putative transmembrane α-helix. This indicated that the DVR protein (enzyme) was located on the membrane. From this, it can be seen that there was no contradiction in the conventional report that the membrane fraction has DVR activity.
図３（ａ）にファインマッピングの概略を示した。図３（ａ）の上段は５番染色体を表し、上部の数値はゲノムの長さを示している。中段はＢＡＣクローンを示し、クローン名の下の線は当該クローンに挿入されているゲノム領域を示している。矢印はこの領域内のSSPLマーカーまたはCAPSマーカーの位置を示し、矢印の下の数値は当該マーカーにおける組換え数を示している。
FIG. 3A shows an outline of fine mapping. The upper part of FIG. 3A represents
図３（ｂ）にＤＶＲ遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。矢尻より前の４９アミノ酸が推定の葉緑体移行配列である。下線はＳＯＳＵＩプログラム（http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html）において予想された推定膜貫通領域を示している。また、星印はｄｖｒ変異株の一塩基変異に対応するアミノ酸の位置を示している。 FIG. 3 (b) shows the amino acid sequence encoded by the DVR gene. The 49 amino acids before the arrowhead are a putative chloroplast translocation sequence. The underline indicates the predicted transmembrane region predicted in the SOSUI program (http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html). The asterisk indicates the position of the amino acid corresponding to the single base mutation of the dvr mutant.
なお、本発明者らが単離したｄｖｒ変異株は、色素のＨＰＬＣ解析により、僅かながらモノビニル型クロロフィルが含まれていることが示され、当該ｄｖｒ変異株におけるプロリンからロイシンへの１アミノ酸置換はこのタンパク質の機能を完全に失活させるものではなかった。 It should be noted that the dvr mutant strain isolated by the present inventors showed a slight amount of monovinyl chlorophyll by HPLC analysis of the dye. One amino acid substitution from proline to leucine in the dvr mutant strain was The function of this protein was not completely inactivated.
〔実施例３：相補性試験〕
野生型（Columbia）由来のゲノムＤＮＡを用いてAT5G18660遺伝子を含む1.2kbの断片をＰＣＲで増幅した。DNA断片の増幅にはTAIRの情報を元に、プライマー18660SalI-f(5’-caagtcgacagaatgtcactttgctcttcc-3’：配列番号３)、1866NotI-r(5’- agcggccgcctagaagaactgttcaccgag-3’：配列番号４)を作成し、遺伝子増幅に使用した。増幅したＤＮＡ断片はpGreenII-0029プラスミド（Hellens, R.P., Edwards, E.A., Leylamd, N.R., Bean, S. and Mullineaux, P.M. (2000). pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 42, 819-832.）を制限酵素SalI、NotIで処理したものにサブクローニングした。また、導入遺伝子を効率的に過剰発現させるために、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)３５Ｓプロモーターとタバコモザイクウイルスオメガ配列とをこのベクター（pGreenII-0029プラスミド）に導入した。上記発現ベクターを導入したアグロバクテリウム・ツメファシエンス株C58(GV2260)で、ホモ接合性ｄｖｒ変異株を形質転換した。M1形質転換体は、１／２Murashige-Skoog（１／２ＭＳ培地）培地と、０．７％アガロースと、５０μｇ／ｍＬカナマイシンとを含むプレート上で選抜し、土に植え替えて、２３℃、１６時間照明条件下で生育させた。
[Example 3: Complementarity test]
A 1.2 kb fragment containing the AT5G18660 gene was amplified by PCR using genomic DNA derived from the wild type (Columbia). For amplification of DNA fragments, primers 18660SalI-f (5'-caagtcgacagaatgtcactttgctcttcc-3 ': SEQ ID NO: 3) and 1866NotI-r (5'-agcggccgcctagaagaactgttcaccgag-3': SEQ ID NO: 4) are prepared based on TAIR information. Used for gene amplification. The amplified DNA fragment is pGreenII-0029 plasmid (Hellens, RP, Edwards, EA, Leylamd, NR, Bean, S. and Mullineaux, PM (2000). PGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 42, 819-832.) Was subcloned into those treated with restriction enzymes SalI and NotI. In order to efficiently overexpress the transgene, a cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and a tobacco mosaic virus omega sequence were introduced into this vector (pGreenII-0029 plasmid). A homozygous dvr mutant was transformed with Agrobacterium tumefaciens strain C58 (GV2260) into which the expression vector was introduced. M1 transformants were selected on a plate containing 1/2 Murashige-Skoog (1/2 MS medium) medium, 0.7% agarose, and 50 μg / mL kanamycin, replanted in soil, 23 ° C., 16 Grow under time illumination conditions.
結果を図４に示した。図中、ＷＴは野生株を、ｄｖｒはｄｖｒ変異株を、ｄｖｒ／ＤＶＲは形質転換株を示す。図４（ａ）は、播種後４週間目の各個体の写真である。すべての形質転換体で、ｄｖｒ変異株の体色が薄い（黄緑色の）表現型が回復した。また、形質転換体の成長速度は、野生型植物体の成長速度とほぼ同じであった。さらに、形質転換体から上記と同様の方法によって抽出した色素のＨＰＬＣ分析および吸収スペクトルの測定を行った。図４（ｂ）に吸収スペクトルの結果を示した。図４（ｂ）から明らかなように、形質転換体（図中、ｄｖｒ／ＤＶＲ）は、野生型と同じ吸収スペクトルを示し、モノビニル型クロロフィルを蓄積していた。 The results are shown in FIG. In the figure, WT indicates a wild strain, dvr indicates a dvr mutant strain, and dvr / DVR indicates a transformed strain. FIG. 4 (a) is a photograph of each individual 4 weeks after sowing. All transformants restored the pale (yellowish green) phenotype of the dvr mutant. The growth rate of the transformant was almost the same as the growth rate of the wild type plant. Furthermore, HPLC analysis and absorption spectrum measurement of the dye extracted from the transformant by the same method as described above were performed. FIG. 4B shows the result of the absorption spectrum. As is clear from FIG. 4 (b), the transformant (dvr / DVR in the figure) showed the same absorption spectrum as the wild type and accumulated monovinyl type chlorophyll.
〔実施例４：酵素活性分析〕
シロイヌナズナ（A. thaliana）のＤＶＲタンパク質を大腸菌（E. coli）内にて発現させ、その組換えタンパク質がＤＶＲ活性を有するか否かについて調査した。
[Example 4: Enzyme activity analysis]
An Arabidopsis thaliana DVR protein was expressed in E. coli, and it was investigated whether the recombinant protein had DVR activity.
ＤＶＲ活性を測定する基質として、ジビニル型クロロフィリドａを用いた。dvr変異株から精製したジビニル型クロロフィルａと、大腸菌で発現させたクロロフィラーゼ粗抽出液をリン酸バッファー中（pH 7, 常温）で１時間反応させてジビニルクロロフィルａをジビニルクロロフィリドａに転換した。ここで用いたクロロフィラーゼによるクロロフィリドの合成法は、Tsuchiyaらの論文（Tsuchiya, T., Suzuki, T., Yamada, T., Shimada, H., Masuda, T., Ohta, H. and Tkamiya, K. (2003). Chlorophyllase as a serine hydrolase: identification of a putative catalytic triad. Plant Cell Physiol. 44, 96-101.）に記載の方法に基づいて行った。合成されたジビニルクロロフィリドａはジエチルエーテルで抽出し、乾燥させた。乾燥したジビニルクロロフィリドａは更に８０％アセトンで溶かしＤＶＲ組換えタンパク質との反応に利用したＤＶＲ組換えタンパク質の生産のため、pET30プラスミド(Novagen Inc. WI)のBamHIサイトとNotIサイトの間に、AT5G18660遺伝子をサブクローニングした。TAIRから得られた情報によると、AT5G18660遺伝子は内部にイントロンを含んでいないと予想されたため、サブクローニングに用いたPCR断片は、TAIRのゲノム情報を元に作成したプライマーAT5G18660BamHI-f(5’-agaggatccatgtcactttgctcttcc-3’：配列番号５)、AT5G18669NotI-r(5’-agcggccgcctagaagaactgttcaccgag-3’：配列番号６)を用いて、野生株のゲノムを鋳型にして増幅した。定法に従い、AT5G18660遺伝子が挿入されたpET30プラスミドまたはAT5G18660遺伝子が挿入されていないpET30プラスミドのみ（ネガティブコントロール）を大腸菌(E. coli)BL21 DE株に導入した。これらの形質転換菌を、50 μg／mlカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ培地で一夜培養し、これを、50 μg／mlカナマイシンを含む50 ml LB培地に植菌した。タンパク質生産を最大にするために、３０℃での培養開始後３０分の時点で、終濃度０．５ｍＭとなるようにイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG）を添加した。７時間培養した後、集菌し、6.7μｇ／ｍＬのリゾチーム、3.3μｇ／ｍＬのDNaseIを含む50ｍＭ Tris-HCl（pH 8.0）溶液（2.4ｍＬ）に再懸濁し、溶解させた。菌溶解物（細胞抽出液）は、使用されるまで−20℃に保存した。 Divinyl type chlorophyllide a was used as a substrate for measuring DVR activity. Divinyl chlorophyll a purified from dvr mutant and chlorophyllase crude extract expressed in E. coli were reacted in phosphate buffer (pH 7, room temperature) for 1 hour to convert divinyl chlorophyll a to divinyl chlorophyllide a. . The synthesis method of chlorophyllide by chlorophyllase used here is the paper by Tsuchiya et al. (Tsuchiya, T., Suzuki, T., Yamada, T., Shimada, H., Masuda, T., Ohta, H. and Tkamiya , K. (2003). Chlorophyllase as a serine hydrolase: identification of a putative catalytic triad. Plant Cell Physiol. 44, 96-101.). The synthesized divinylchlorophyllide a was extracted with diethyl ether and dried. The dried divinylchlorophyllide a was further dissolved in 80% acetone and used for the reaction with the DVR recombinant protein to produce the DVR recombinant protein. Between the BamHI and NotI sites of the pET30 plasmid (Novagen Inc. WI), The AT5G18660 gene was subcloned. According to the information obtained from TAIR, the AT5G18660 gene was predicted not to contain introns inside. -3 ′: SEQ ID NO: 5) and AT5G18669NotI-r (5′-agcggccgcctagaagaactgttcaccgag-3 ′: SEQ ID NO: 6) were used to amplify the wild type genome as a template. According to a conventional method, only the pET30 plasmid into which the AT5G18660 gene was inserted or the pET30 plasmid into which the AT5G18660 gene was not inserted (negative control) was introduced into E. coli BL21 DE strain. These transformed bacteria were cultured overnight in 2 mL of LB medium containing 50 μg / ml kanamycin and inoculated into 50 ml LB medium containing 50 μg / ml kanamycin. In order to maximize protein production, isopropyl 1-thio-β-D-galactoside (IPTG) was added to a final concentration of 0.5 mM at 30 minutes after the start of culture at 30 ° C. After culturing for 7 hours, the cells were collected and resuspended and dissolved in a 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) solution (2.4 mL) containing 6.7 μg / mL lysozyme and 3.3 μg / mL DNaseI. The bacterial lysate (cell extract) was stored at −20 ° C. until used.
非特許文献１１に記載の方法に従って、上記の細胞抽出液と、ジビニル型クロロフィリドａとをＮＡＤＰＨ存在下で反応させた。反応開始１０分後、反応溶液中のクロロフィル分子の組成を上記Zapataらの論文に記載のＨＰＬＣ解析方法に従い、Symmetry C8カラム（長さ150 mm、直径4.6 mm、Waters Co.）を用いて解析した。 According to the method described in Non-Patent Document 11, the cell extract was reacted with divinyl chlorophyllide a in the presence of NADPH. Ten minutes after the start of the reaction, the composition of chlorophyll molecules in the reaction solution was analyzed using a Symmetry C8 column (length 150 mm, diameter 4.6 mm, Waters Co.) according to the HPLC analysis method described in the above-mentioned Zapata et al. .
結果を図５に示した。上段はジビニル型クロロフィリドａ（基質）のクロマトグラムを示し、中段（pET30）はＤＶＲ遺伝子が挿入されていないpET30が導入された大腸菌の細胞溶解液を用いて上記反応を行った反応液のクロマトグラムを示し、下段（pET30-DVR）はＤＶＲ遺伝子が挿入されたpET30が導入された大腸菌の細胞溶解液を用いて上記反応を行った反応液のクロマトグラムを示している。図５中のpET30-DVRに示すように、反応溶液中のほとんど全てのジビニル型クロロフィリドａが、モノビニル型クロロフィリドａに転換されていた。 The results are shown in FIG. The upper row shows the chromatogram of divinyl-type chlorophyllide a (substrate), and the middle row (pET30) shows the chromatogram of the reaction solution in which the above reaction was performed using a cell lysate of E. coli into which pET30 into which the DVR gene was not inserted was introduced. The lower part (pET30-DVR) shows a chromatogram of a reaction solution obtained by performing the above reaction using a cell lysate of Escherichia coli into which pET30 into which the DVR gene is inserted is introduced. As shown by pET30-DVR in FIG. 5, almost all divinyl chlorophyllide a in the reaction solution was converted to monovinyl chlorophyllide a.
これらの結果から、ＤＶＲ遺伝子（AT5G18660）が３，８−ジビニルプロトクロロフィリドａ８−ビニル還元酵素をコードしていることを明確に示すことができた。 From these results, it was possible to clearly show that the DVR gene (AT5G18660) encodes 3,8-divinylprotochlorophyllide a8-vinyl reductase.
本発明者らは、ここにＤＶＲの同定を成功させ、高等植物におけるクロロフィル生合成に関わる全ての遺伝子の同定を完了させるに至った。表１にクロロフィル生合成に関わる全ての遺伝子およびその酵素名（タンパク質名）を列挙する。シロイヌナズナ（A. thaliana）では、グルタミル−ｔＲＮＡｇｌｕからクロロフィルｂに至るまでのクロロフィル生合成に必要な酵素が１５種類、遺伝子が２７遺伝子存在する。これらの中で、ヒドロキシメチルシラン、Ｍｇ−プロトポルフィリンＩＸ、モノメチルエステルシクラーゼ、ゲラニルゲラニル還元酵素、クロロフィリドａ酸素添加酵素が、多様な反応形態を起こす。Ｍｇキレーターゼのみが３つのタンパク質からなるオリゴマー酵素であり、残りは全てモノマー酵素である。９つのタンパク質が単一コピー遺伝子群によってコードされ、残りは２〜３つの遺伝子からなる遺伝子ファミリーによってコードされている。 The present inventors have succeeded in the identification of DVR, and have completed the identification of all genes involved in chlorophyll biosynthesis in higher plants. Table 1 lists all genes involved in chlorophyll biosynthesis and their enzyme names (protein names). In Arabidopsis (A. thaliana), 15 types of enzymes and 27 genes exist for chlorophyll biosynthesis from glutamyl-tRNA glu to chlorophyll b. Among these, hydroxymethylsilane, Mg-protoporphyrin IX, monomethyl ester cyclase, geranylgeranyl reductase, and chlorophyllide a oxygenase cause various reaction forms. Only Mg chelatorase is an oligomeric enzyme consisting of three proteins, and the rest are monomeric enzymes. Nine proteins are encoded by a single copy gene cluster and the rest are encoded by a gene family consisting of 2-3 genes.
以上のように、本発明に係るポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、３−ビニルクロロフィルの合成を触媒する機能を有している。それゆえ、本発明に係るポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利用して、単位面積あたりの光合成生産を増加させた植物を作製することが可能になる。また、栄養塩に富むこの領域での農業生産に利用できる可能性もある。したがって、本発明は、農業分野において非常に利用価値が高いものである。 As described above, the polypeptides and polynucleotides according to the present invention have a function of catalyzing the synthesis of 3-vinylchlorophyll. Therefore, it becomes possible to produce a plant having increased photosynthesis production per unit area using the polypeptide and polynucleotide according to the present invention. It may also be used for agricultural production in this region rich in nutrients. Therefore, the present invention has very high utility value in the agricultural field.
Claims (11)
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなるポリペプチド。 A polypeptide involved in the synthesis of chlorophyll and having vinyl group reductase activity,
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or (b) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added,
A polypeptide comprising:
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。 A polynucleotide encoding a polypeptide involved in the synthesis of chlorophyll and having vinyl group reductase activity,
(C) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (d) a polynucleotide which hybridizes with the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions.
試験化合物または試料と、請求項１に記載のポリペプチドとを接触させる工程と、
上記の試験化合物または試料が当該ポリペプチドに与える影響を検出する工程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。 A screening method for identifying an inhibitor that inhibits the function of the polypeptide of claim 1, comprising:
Contacting the test compound or sample with the polypeptide of claim 1;
And a step of detecting an effect of the test compound or sample on the polypeptide.
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2004
- 2004-12-28 JP JP2004381466A patent/JP2006187203A/en active Pending
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