JP2006169336A - Transparent resin composition containing informative nucleic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、情報化核酸含有透明樹脂組成物に係り、更に詳細には、個別認証に利用できる情報化核酸を含有する透明樹脂組成物に関する。 The present invention relates to an information nucleic acid-containing transparent resin composition, and more particularly to a transparent resin composition containing an information nucleic acid that can be used for individual authentication.
従来から、個別認証には、ナンバープレート、紙幣などの透かし印刷、ＩＣチップ及びクレジットカードの写真などが利用されている。
しかし、これらの個別認証手段は、剥離、切断、消去などにより製品から除去することができるという欠点があった。このため、製品から取り除くことのできない、即ち消失しない認証情報の開発が期待されていた。
Conventionally, for individual authentication, a license plate, watermark printing such as banknotes, an IC chip and a photo of a credit card are used.
However, these individual authentication means have a drawback that they can be removed from the product by peeling, cutting, erasing or the like. For this reason, it has been expected to develop authentication information that cannot be removed from the product, that is, does not disappear.
一方、ＤＮＡは、元来全ての生物が保有し、それぞれの生物において、全ての遺伝情報を含む情報生体分子である。その多くは多数のタンパク質のアミノ酸配列に対応するものである。即ち、デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシシトシン（ｄＣ）及びデオキシチミン（ｄＴ）がリン酸エステル結合を介し一定の方向性をもって結合して成り、その塩基数をｎ個とすると、その長さのＤＮＡは４ｎ種類存在することになる。従って、例えばわずか１６種類の塩基数でも約４３億種類のそれぞれ区別できるＤＮＡが存在し得る。現在では、数十塩基配列を有するＤＮＡであれば、どのような配列のものでも任意に合成することができる。また、ＤＮＡは、ある程度以上の量があれば、自動配列読み取り装置（シーケンサー）で自動的にその配列を決定することができる。 On the other hand, DNA is an information biomolecule originally possessed by all living organisms and including all genetic information in each organism. Many of them correspond to the amino acid sequences of many proteins. That is, deoxyadenosine (dA), deoxyguanosine (dG), deoxycytosine (dC), and deoxythymine (dT) are bonded with a certain direction through a phosphate ester bond, and the number of bases is n. Thus, there are 4n types of DNA having that length. Thus, for example, there can be about 4.3 billion types of distinguishable DNAs with only 16 types of bases. At present, any DNA having a sequence of several tens of bases can be arbitrarily synthesized. In addition, if the amount of DNA exceeds a certain level, the sequence can be automatically determined by an automatic sequence reader (sequencer).
このような背景から、水不溶性媒体にＤＮＡを含ませた偽造防止ラベルを製品に用いることにより、該ＤＮＡの存在・不存在を手掛かりにして、その製品の真偽を明らかにすることが提案されている（特許文献１参照。）。
しかし、特許文献１に記載の技術は、基本的にはＤＮＡと水不溶媒体の混合方法に係るものであり、製品の真偽確認方法としては、ＰＣＲ法によるリボ核酸の増幅の有無を確認することにより、リボ核酸入りの対象製品を同定することが示されているに過ぎない。
また、ＤＮＡの存在・不存在を検定指標とする真偽確認データは元より、ＤＮＡの配列を検定指標とし、同種製品であっても個々の製品毎の認証を可能とする、個別認証に関するデータは開示されていない。
However, the technique described in
In addition, authenticity verification data that uses the presence / absence of DNA as a test index is data on individual authentication that enables authentication for each product even if it is the same type of product, using the DNA sequence as a test index. Is not disclosed.
一方、自動車事故において加害者が逃走したときなどには、事故現場に残された塗膜片やガラス片、プラスチック片などから対象車両を特定したいという要請がある。 On the other hand, when the perpetrator escapes in an automobile accident, there is a request to identify the target vehicle from a piece of paint film, glass piece, plastic piece, etc. left at the accident site.
本発明は、このような従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、どのような出所・履歴の製品であるかを個別具体的に特定できる情報化核酸を含有した透明樹脂組成物を提供することにある。 The present invention has been made in view of such problems of the prior art, and an object of the present invention is to provide an informatized nucleic acid capable of individually and specifically identifying the source / history product. It is in providing the contained transparent resin composition.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＤＮＡに代表される核酸を一つの認証情報としてとらえ、製品中の情報化核酸を後から検出することなどにより、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors regard nucleic acids typified by DNA as one piece of authentication information, and detect the information nucleic acids in products later. As a result, the present invention has been completed.
即ち、本発明の情報化核酸含有透明樹脂組成物は、任意且つ既知の塩基配列を有する部位を備える情報化核酸を含有する透明樹脂組成物である。 That is, the information nucleic acid-containing transparent resin composition of the present invention is a transparent resin composition containing an information nucleic acid having a site having an arbitrary and known base sequence.
本発明によれば、工業製品などの量産品であっても、微量に含まれる情報化核酸の塩基配列を決定することにより、対象となる製品を個別的に認証できる。 According to the present invention, even for mass-produced products such as industrial products, the target product can be individually authenticated by determining the base sequence of the information nucleic acid contained in a trace amount.
以下、本発明の情報化核酸含有透明樹脂組成物について詳細に説明する。なお、本明細書及び特許請求の範囲において、「％」は特記しない限り質量百分率を示す。また、「透明」とは、光線透過率が５０％以上であるものをいう。 Hereinafter, the information nucleic acid containing transparent resin composition of this invention is demonstrated in detail. In the present specification and claims, “%” indicates a mass percentage unless otherwise specified. “Transparent” means that the light transmittance is 50% or more.
上述の如く、本発明の情報化核酸含有透明樹脂組成物は、任意且つ既知の塩基配列を有する部位を備える情報化核酸を含有する透明樹脂組成物である。
ここで、透明樹脂としては、従来公知のものを使用することができ、具体的には、ポリカーボネート（ＰＣ）やポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルクロライド（ＰＶＣ）などを挙げることができる。また、若干の顔料を含むいわゆる有色透明樹脂組成物を用いることもできる。
このような透明樹脂組成物は、除去することが困難な情報化核酸を含有するため、個別具体的に認証することができる。
As above-mentioned, the information nucleic acid containing transparent resin composition of this invention is a transparent resin composition containing the information nucleic acid provided with the site | part which has arbitrary and known base sequences.
Here, as the transparent resin, conventionally known resins can be used, and specifically, polycarbonate (PC), polymethyl methacrylate (PMMA), polyvinyl chloride (PVC) and the like can be mentioned. Moreover, what is called a colored transparent resin composition containing some pigments can also be used.
Since such a transparent resin composition contains an information nucleic acid that is difficult to remove, it can be individually and specifically authenticated.
ここで、情報化核酸とは、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）及びこれらの誘導体をいい、天然型でも人工型でもよいが、使用環境が厳しい透明樹脂組成物中に含めることを考慮すると、構造的に安定している人工型を使用するのが好ましい。人工型においては天然型には存在しない配列を形成できる。
また、情報化核酸において、塩基配列部位が任意であるとは、検出可能な塩基配列である限り無作為に選択され得ることを示し、塩基配列部位が既知であるとは、個別認証に用いられる塩基配列が予め把握されていることを示す。
Here, information nucleic acid refers to DNA (deoxyribonucleic acid), RNA (ribonucleic acid), and derivatives thereof, which may be natural or artificial, but are considered to be included in transparent resin compositions where the usage environment is severe. Then, it is preferable to use an artificial mold that is structurally stable. In the artificial type, a sequence that does not exist in the natural type can be formed.
Moreover, in the information nucleic acid, that the base sequence site is arbitrary indicates that it can be randomly selected as long as it is a detectable base sequence, and that the base sequence site is known is used for individual authentication. It shows that the base sequence is known beforehand.
本発明において、用いられる情報化核酸は、特に限定されるものではないが、情報化核酸の含有量が、組成物１００ｇに対して、０．５〜５００μｇであることが好ましく、５０〜１００μｇであることがより好ましい。
０．５μｇより少ない場合には、透明樹脂組成物から情報化核酸を検出し、塩基配列を決定できない可能があり、５００μｇを超える場合には、水分が透明樹脂組成物に浸透したときに透明性が低下する可能性が高くなる。
In the present invention, the information nucleic acid used is not particularly limited, but the content of the information nucleic acid is preferably 0.5 to 500 μg, preferably 50 to 100 μg, relative to 100 g of the composition. More preferably.
When the amount is less than 0.5 μg, there is a possibility that the information nucleic acid is detected from the transparent resin composition and the base sequence cannot be determined. When the amount exceeds 500 μg, the transparency is obtained when water penetrates the transparent resin composition. Is likely to decrease.
また、本発明において、情報化核酸の大きさは、核酸全体における塩基数が２００以下であることが好ましい。２００を超えると合成の段階でごくわずかずつ未反応部位が生成し、塩基が欠けたものの含有量が増大し易い。より好ましくは１００塩基程度であることが良い。
更に、上記塩基配列においてチミン同士が隣接しないことが好ましい。これより、チミンがダイマー化するのを抑制できる。
In the present invention, the size of the information nucleic acid is preferably such that the number of bases in the whole nucleic acid is 200 or less. When it exceeds 200, unreacted sites are generated little by little at the stage of synthesis, and the content of those lacking a base tends to increase. More preferably, it is about 100 bases.
Furthermore, it is preferable that thymines are not adjacent to each other in the above base sequence. Thereby, it can suppress that thymine dimerizes.
また、本発明において、情報化核酸は、ＯＨ基と反応する化合物と併用する場合や厳しい環境下で使用される場合の安定性を向上させる観点から、保護基により誘導化されていることが好ましい。具体的には、５´位、３´位のいずれか一方又は双方にある水酸基を、リン酸エステル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、ベンジル基、置換ベンジル基及びアリル基などを用いて誘導化することができる。図１の（Ａ）に天然型ＤＮＡ、（Ｂ）に５´位を誘導化したＤＮＡを示す。
更に、単離や精製の利便性を高める観点から、５´位の水酸基をビオチン又は蛍光分子により誘導化することが好ましい。具体的には、ビチオンを用いるとアビジンというタンパク質を結合したカラムに選択的に吸着され易くなる。一方、フルオレセインなどの蛍光分子を用いると核酸自体が蛍光をもつようになるため、感度よく検出でき精製等が容易になる。このように、単離や精製の利便性を高めると、個別認証が極めて容易になる。
In the present invention, the information nucleic acid is preferably derivatized with a protecting group from the viewpoint of improving stability when used in combination with a compound that reacts with an OH group or when used in a severe environment. . Specifically, a hydroxyl group at one or both of the 5′-position and the 3′-position is derivatized with a phosphate ester group, an acyl group, an alkoxycarbonyl group, a benzyl group, a substituted benzyl group, an allyl group, or the like. can do. FIG. 1A shows natural DNA, and FIG. 1B shows DNA derivatized at the 5 ′ position.
Furthermore, from the viewpoint of enhancing the convenience of isolation and purification, it is preferable to derivatize the hydroxyl group at the 5 ′ position with biotin or a fluorescent molecule. Specifically, when vithion is used, it is easily adsorbed selectively on a column to which a protein called avidin is bound. On the other hand, when a fluorescent molecule such as fluorescein is used, the nucleic acid itself becomes fluorescent, so that it can be detected with high sensitivity and purification is facilitated. Thus, when the convenience of isolation and purification is increased, individual authentication becomes extremely easy.
更にまた、例えば５´位を硫黄に置換した場合には、水で抽出したものを更に金（Ａｕ）をコーティングした担体のカラムを通すことで容易に分離をすることができる。
なお、情報化核酸としてＲＮＡを用いるときは、安定性を向上させる観点から２´位の水酸基を上記保護基により誘導化することもできる。
Furthermore, for example, when the 5′-position is substituted with sulfur, it can be easily separated by passing the column extracted with water through a carrier column coated with gold (Au).
When RNA is used as the information nucleic acid, the 2′-position hydroxyl group can be derivatized with the above-described protecting group from the viewpoint of improving stability.
また、情報化核酸を抽出して個別認証をする場合において、少ない含有量でも効率良く検出されるようにする観点から、上記塩基配列部位が該情報化核酸の増幅に用いられる部位であることが好ましい。かかる情報化核酸の増幅方法としては、相乗的に増幅させることのできるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を適宜採用することができる。
上記ＰＣＲ法では、情報化核酸が極微量であっても極度に増幅することができ、例えば、ＤＮＡの末端数十塩基と相補的な塩基（プライマー）の存在下に温度制御を行いつつ、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを作用させると、元のＤＮＡを倍増させることができる。例えば、これを３０回繰り返せば、数億倍に増幅させることができる。
このような増幅によって微量のサンプルからでもその配列を決定するのに十分な量のＤＮＡを得ることができるようになり、延いては配列に対応する情報からそれが含まれていた製品の「身元」が判明することになる。
In addition, in the case of performing individual authentication by extracting an information nucleic acid, the base sequence portion may be a portion used for amplification of the information nucleic acid from the viewpoint of efficiently detecting even a small content. preferable. As a method for amplifying such information nucleic acid, polymerase chain reaction (PCR) that can be amplified synergistically can be appropriately employed.
In the PCR method, even if the amount of information nucleic acid is extremely small, it can be amplified extremely. For example, while controlling the temperature in the presence of a base (primer) complementary to several tens of bases of DNA, When the sex DNA polymerase is allowed to act, the original DNA can be doubled. For example, if this is repeated 30 times, it can be amplified several hundred million times.
Such amplification makes it possible to obtain a sufficient amount of DNA to determine its sequence even from a very small amount of sample. As a result, the “identity” of the product that contained it from the information corresponding to the sequence is obtained. Will be revealed.
また、このとき、上記増幅に用いられる部位として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に必要なプライマー対応部位を両端に有することが好ましい。即ち、情報化核酸としては、プライマー対応部位を備えていないものを使用することもできるが、プライマー対応部位を備えることによってより短時間で識別できるようになることによる。
このようなプライマー対応部位について、塩基数の下限値は５であることが好ましい。より好ましくは１０以上であることが良い。塩基数が５未満では、区別できる核酸の数が減少し、多くの製品の識別に時間がかかるようになる。一方、塩基数の上限値としては、１００であることが好ましい。これは、塩基数が１００を超えると、いずれかの位置の塩基を欠いた副生成物の比率が高くなり、精製に手間が掛かり、場合によっては困難となる傾向があることによる。
なお、情報化核酸としてＲＮＡを用いるときは、逆転写酵素を用いて配列の相補的なＤＮＡを得、このＤＮＡを用いてＰＣＲ法を行うことができる。
At this time, it is preferable that the sites used for the amplification have primer-corresponding sites necessary for polymerase chain reaction (PCR) at both ends. That is, as the information nucleic acid, a nucleic acid that does not have a primer-corresponding site can be used, but by providing the primer-corresponding site, it becomes possible to identify in a shorter time.
For such a primer corresponding site, the lower limit of the number of bases is preferably 5. More preferably, it is 10 or more. When the number of bases is less than 5, the number of distinguishable nucleic acids decreases, and it takes time to identify many products. On the other hand, the upper limit of the number of bases is preferably 100. This is because when the number of bases exceeds 100, the ratio of by-products lacking a base at any position becomes high, so that purification takes time and tends to be difficult in some cases.
In addition, when RNA is used as the information nucleic acid, DNA complementary to the sequence can be obtained using reverse transcriptase, and PCR can be performed using this DNA.
また、上記情報化核酸としては、上記塩基配列部位の他に更に認証情報部位を有することが好ましく、これによって、より詳細な情報設定により個別認証を実行できる。
例えば、図２に示すように、両端にプライマー対応部位を備えた情報化ＤＮＡであれば、中央にｍ個の塩基数の配列を置き（Ｂ１〜Ｂｍ）、この部分の配列情報を認証情報に対応させる。その両端には、それぞれｌ（エル）個、ｎ個のプライマーに相補的な配列（Ｘ１〜Ｘｌ，Ｐ１〜Ｐｎ）を連結する。この部分が存在することにより初めてＰＣＲ法の採用が可能となる。
情報化ＤＮＡはこの１本鎖のもの又はそれと相補的な配列のＤＮＡと複合体を形成した２本鎖のものを情報素子として用いることができる。このプライマー対応部位の配列は、できるだけ相補的配列の結合が安定になり且つＰＣＲ法による増幅が円滑に進行するように工夫することができる。
なお、図２において、Ｘ１〜Ｘｌ、Ｂ１〜Ｂｍ、Ｐ１〜Ｐｎ のそれぞれは、デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシシトシン（ｄＣ）又はデオキシチミン（ｄＴ）及びこれらの任意の組み合わせにより構成される。
Further, the information nucleic acid preferably further has an authentication information site in addition to the base sequence site, whereby individual authentication can be performed with more detailed information setting.
For example, as shown in FIG. 2, in the case of information-oriented DNA having primer-corresponding sites at both ends, a sequence with m bases is placed in the center (B 1 -B m ), and the sequence information of this part is authenticated. Correspond to information. At both ends, sequences (X 1 to X 1 , P 1 to P n ) complementary to l (el) and n primers, respectively, are linked. The presence of this part makes it possible to adopt the PCR method for the first time.
The information DNA can be used as an information element of this single-stranded DNA or a double-stranded DNA complexed with a complementary sequence of DNA. The sequence of the primer corresponding site can be devised so that the binding of complementary sequences is as stable as possible and amplification by the PCR method proceeds smoothly.
In FIG. 2, each of X 1 to X 1 , B 1 to B m , and P 1 to P n is deoxyadenosine (dA), deoxyguanosine (dG), deoxycytosine (dC), or deoxythymine (dT). And any combination thereof.
上記ＰＣＲ法の好適例としては、透明樹脂組成物に含まれる情報化核酸の塩基配列を決定するに当たり、透明樹脂組成物から抽出された情報化核酸の溶液、ＰＣＲ緩衝液、滅菌蒸留水、少なくとも１種のプライマー、２，３−ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びポリメラーゼを混合し、（１）９２〜９５℃で２〜５分間加熱し、次いで、（２ａ）９２〜９５℃で３０〜６０秒間、（２ｂ）２０〜５０℃で３０〜６０秒間、（２ｃ）７０〜８０℃で３０〜１２０秒間、の加熱サイクルを２０〜５０回繰り返し、しかる後、（３）７０〜８０℃で１〜１０分間加熱処理することが好ましい。なお、情報化核酸の塩基配列の任意性を高めるという観点からは２種のプライマーを用いることが好ましい。 As a preferred example of the PCR method, in determining the base sequence of the information nucleic acid contained in the transparent resin composition, a solution of the information nucleic acid extracted from the transparent resin composition, a PCR buffer, sterile distilled water, at least Mix one primer, 2,3-dideoxynucleoside triphosphate (dNTP) and polymerase, (1) heat at 92-95 ° C. for 2-5 minutes, then (2a) 30-92 at 92-95 ° C. The heating cycle of (2b) at 20 to 50 ° C. for 30 to 60 seconds, (2c) at 70 to 80 ° C. for 30 to 120 seconds is repeated 20 to 50 times, and then (3) at 70 to 80 ° C. It is preferable to heat-process for 1 to 10 minutes. In addition, it is preferable to use two types of primers from the viewpoint of increasing the arbitraryness of the base sequence of the information nucleic acid.
（１）において、９４℃で５分が特に好ましい。９２℃で２分より短いとＤＮＡの２本差への分離が困難になり、９５℃で５分より長いと、酵素が失活するからである。なお、製品に含まれる情報化核酸が１本鎖である場合には不要である。
また、（２ａ）において９４℃で３０秒が特に好ましい。９２℃で３０秒より短いと増幅率が低下し、９５℃で６０秒より長いと、酵素が失活するからである。
更に、（２ｂ）において４０℃で３０秒が特に好ましい。２０℃で３０秒より短いとプライマーとＤＮＡの結合が困難になり、５０℃で６０秒より長いと、酵素が失活するからである。
また、（２ｃ）において７２℃で３０秒が特に好ましい。７０℃で３０秒より短いと伸長が不十分になり、８０℃で１２０秒より長いと酵素が失活するからである。
更に、（３）において７２℃で７分が特に好ましい。７０℃で１分より短いと伸長が不十分になり、８０℃で１０分より長いと時間の無駄になるからである。
更にまた、加熱サイクル（２ａ）〜（２ｃ）の繰り返しは、３０回が特に好ましく、２０回より少ないと増幅率が低下し、５０回より多いと時間の無駄になるからである。
In (1), 5 minutes at 94 ° C. is particularly preferable. If it is shorter than 2 minutes at 92 ° C., it will be difficult to separate the DNA into two differences, and if it is longer than 5 minutes at 95 ° C., the enzyme will be inactivated. Note that this is not necessary when the information nucleic acid contained in the product is a single strand.
Further, in (2a), 30 seconds at 94 ° C. is particularly preferable. This is because the amplification factor decreases when the temperature is shorter than 30 seconds at 92 ° C. and the enzyme is deactivated when the temperature is longer than 60 seconds at 95 ° C.
Further, in (2b), 30 seconds at 40 ° C. is particularly preferable. This is because, when it is shorter than 30 seconds at 20 ° C., it becomes difficult to bind the primer and DNA, and when it is longer than 60 seconds at 50 ° C., the enzyme is deactivated.
Further, in (2c), 30 seconds at 72 ° C. is particularly preferable. This is because the elongation becomes insufficient when the temperature is shorter than 30 seconds at 70 ° C., and the enzyme is deactivated when the temperature is longer than 120 seconds at 80 ° C.
Further, in (3), 7 minutes at 72 ° C. is particularly preferable. This is because if the temperature is shorter than 1 minute at 70 ° C., the elongation becomes insufficient, and if it is longer than 10 minutes at 80 ° C., time is wasted.
Furthermore, the repetition of the heating cycles (2a) to (2c) is particularly preferably 30 times, and if it is less than 20 times, the amplification factor decreases, and if it is more than 50 times, time is wasted.
図３に、情報化核酸含有透明樹脂組成物に含まれる情報化核酸の検出方法の一実施形態のフロー図を示す。
同図に示すように、Ｓ１において、透明樹脂組成物から情報化ＤＮＡを抽出する。Ｓ２において、凍結乾燥により濃縮する。Ｓ３において、２種類のプライマーとポリメラーゼを加える。Ｓ４において、ＰＣＲを繰り返すことによりＤＮＡを増幅する。Ｓ５において、残った余分なプライマーを一本鎖ＤＮＡ開裂酵素により分解する。Ｓ６において、二本鎖である情報化ＤＮＡをゲル濾過で精製する。Ｓ７において、シーケンサーにより配列決定を行う。
FIG. 3 shows a flowchart of an embodiment of a method for detecting an information nucleic acid contained in an information nucleic acid-containing transparent resin composition.
As shown in the figure, in S1, information DNA is extracted from the transparent resin composition. In S2, it is concentrated by lyophilization. In S3, two kinds of primers and a polymerase are added. In S4, DNA is amplified by repeating PCR. In S5, the remaining excess primer is degraded with a single-stranded DNA cleavage enzyme. In S6, the double-stranded information DNA is purified by gel filtration. In S7, sequencing is performed by a sequencer.
ここで、Ｓ１においては、例えば透明樹脂組成物を粉末にして少量の水と混ぜればよいが、例えば情報化ＤＮＡを微粒子に担持させる際に化学的結合させた場合には、加水分解などすることにより効率良く抽出することができる。また、Ｓ２においては、例えば遠心エバポレーターを用いて濃縮してもよい。更に、Ｓ５においては、一本鎖ＤＮＡ切断酵素として、例えばＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｂｃａ ＢＥＳＴポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなどを使用できる。また、Ｓ６とＳ７との間に、更にＳ３及び４と同様の操作を繰り返して、目的のＤＮＡを増幅させてもよい。Ｓ７においては、質量分析装置によって配列決定を行ってもよく、シーケンサーによる配列決定と組み合わせてもよい。 Here, in S1, for example, the transparent resin composition may be powdered and mixed with a small amount of water. For example, when the information DNA is chemically bonded to the fine particles, hydrolysis may be performed. Can be extracted more efficiently. Moreover, in S2, you may concentrate using a centrifugal evaporator, for example. Further, in S5, for example, Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase, Tfl DNA polymerase, Vent polymerase, Pfu polymerase, Bca BEST polymerase, KOD DNA polymerase and the like can be used as the single-stranded DNA cleaving enzyme. Further, the target DNA may be amplified between S6 and S7 by repeating the same operations as in S3 and S4. In S7, sequencing may be performed by a mass spectrometer, or may be combined with sequencing by a sequencer.
また、塩基配列を決定するに当たり、製品から抽出される該情報化核酸のデータと、該情報化核酸のデータを少なくとも含む情報化核酸データベースとを対比することが望ましい。予め把握された情報化核酸のデータベースと比較することにより製品認証にかかる時間を大幅に減らすことが可能となるからである。
かかるデータベースに蓄えられるデータとしては、例えば電気泳動時間やゲル濾過した際の移動距離（これは、情報化核酸自体をコントロールレーンに流せば足りる）などを挙げることができる。
Further, in determining the base sequence, it is desirable to compare the information nucleic acid data extracted from the product with the information nucleic acid database including at least the information nucleic acid data. This is because the time required for product authentication can be significantly reduced by comparing with a database of information nucleic acids obtained in advance.
Examples of data stored in such a database include electrophoresis time and movement distance when gel filtration is performed (this is sufficient if the information nucleic acid itself is allowed to flow in the control lane).
また、本発明において、含有する情報化核酸は微粒子に担持されていることが望ましい。
ここで、本発明において「担持」とは、情報化核酸が上記微粒子の表面に乗せられた状態で微粒子と共に移動できる程度に密着していることを意味し、情報化核酸が上記微粒子の表面に強固に固着していても、微粒子表面やその凹部内に使用に耐える程度の強度で付着していてもよい。
核酸は、水溶性であることから、製品に組込んだとしても製品から水と共に流出する可能性がないとは言えず、微粒子に担持させることによって、長期間にわたって製品内に保持されやすくなる。
In the present invention, the contained information nucleic acid is preferably carried on fine particles.
Here, “supported” in the present invention means that the information nucleic acid is in close contact with the fine particles so as to be able to move together with the fine particles, and the information nucleic acid is attached to the surfaces of the fine particles. Even if it is firmly fixed, it may be adhered to the surface of the fine particles or in the recesses with a strength sufficient to withstand use.
Since the nucleic acid is water-soluble, it cannot be said that there is no possibility that it will flow out of the product together with water even if it is incorporated in the product.
上記微粒子としては、情報化核酸を担持することができれば特に限定されるものではないが、シリカや酸化亜鉛の他、酸化チタンや酸化モリブデン、酸化タングステン、チタン酸バリウムなどを好適に用いることができる。なお、表面をシリカコートすることによって、樹脂組成物に混合した場合の分散性を向上させることができる。 The fine particles are not particularly limited as long as they can carry an information nucleic acid. In addition to silica and zinc oxide, titanium oxide, molybdenum oxide, tungsten oxide, barium titanate, and the like can be suitably used. . In addition, the dispersibility at the time of mixing with a resin composition can be improved by silica-coating the surface.
また、本発明において、当該微粒子の含有量としては、組成物に対して０．５〜５０％であることが好ましく、０．５〜２％であることがより好ましい。
微粒子の含有量が０．５％未満である場合には、サンプリングされた透明樹脂組成物中の微粒子の量が少ない場合があり、検出の精度が低下する可能性がある。また、５０％を超える場合には、透明性が低下する場合がある。
In the present invention, the content of the fine particles is preferably 0.5 to 50%, more preferably 0.5 to 2% with respect to the composition.
When the content of fine particles is less than 0.5%, the amount of fine particles in the sampled transparent resin composition may be small, and the detection accuracy may be reduced. Moreover, when it exceeds 50%, transparency may fall.
更に、当該微粒子のサイズとしては、平均粒径が０．０１〜１μｍであることが好ましく、０．０２〜１μｍであることがより好ましい。
微粒子の平均粒径が０．０１μｍ未満である場合には、情報化核酸の検出精度が低下し、６０μｍを超える場合には、滅菌蒸留水やアルコールなどの溶媒に対する分散性が低下する傾向があるためである。
Furthermore, the size of the fine particles is preferably 0.01 to 1 μm, more preferably 0.02 to 1 μm.
When the average particle size of the fine particles is less than 0.01 μm, the detection accuracy of the information nucleic acid decreases, and when it exceeds 60 μm, the dispersibility in a solvent such as sterilized distilled water or alcohol tends to decrease. Because.
更にまた、微粒子への情報化核酸の担持量としては、微粒子１００ｇに対して０．５〜５００μｇとすることが好ましく、１０〜１００μｇとすることがより好ましい。上記情報化核酸の担持量が微粒子１００ｇ当たり０．５μｇ未満である場合には、情報化核酸を透明樹脂組成物中に安定に添加することができなくなって検出精度が低下する一方、５００μｇを超える場合には、情報化核酸を微粒子に安定に担持することができなくなって、フリーの情報化核酸が生じ、分散しにくくなる傾向があるためである。 Furthermore, the amount of the information nucleic acid supported on the fine particles is preferably 0.5 to 500 μg, more preferably 10 to 100 μg, based on 100 g of the fine particles. When the loading amount of the information nucleic acid is less than 0.5 μg per 100 g of the fine particles, the information nucleic acid cannot be stably added to the transparent resin composition, and the detection accuracy is lowered, while it exceeds 500 μg. In some cases, the information nucleic acid cannot be stably supported on the microparticles, and a free information nucleic acid tends to be generated and difficult to disperse.
かかる情報化核酸担持微粒子は、例えば微粒子に滅菌蒸留水を加えて成る懸濁液に、情報化核酸をそのまま、あるいは情報化核酸の一部又は全部を滅菌蒸留水に溶解して成る溶液として加え、望ましくはさらに特定の溶媒を添加して、乾燥させることによって得ることができる。
シリカや亜鉛華などの微粒子の懸濁液に、任意且つ既知の塩基配列を有する部位を備えた情報化核酸を直接、あるいは情報化核酸の一部又は全部を滅菌蒸留水に溶解させた溶液の状態で加えたのち、乾燥させることによって、微粒子の表面に情報化核酸を確実に担持することができ、このような情報化核酸担持微粒子を用いて、情報化核酸を微粒子に担持させた状態で透明樹脂組成物中に導入することによって、情報化核酸単独の状態で導入した場合に較べて、情報化核酸を透明樹脂組成物中に確実に添加し、安定に分散させることができるようになり、しかも情報化核酸の水分による流出を防止することができ、情報化核酸の塩基配列を検出指標とする製品の出所・経歴の個別認証が長期にわたって可能なものになるという極めて優れた効果がもたらされる。
Such information-containing nucleic acid-carrying fine particles are added, for example, to a suspension obtained by adding sterilized distilled water to fine particles, or as a solution obtained by dissolving a part or all of the information nucleic acid in sterilized distilled water as it is. Desirably, a specific solvent can be added and dried.
A solution in which an information nucleic acid having a site having an arbitrary and known base sequence is dissolved directly in a suspension of fine particles such as silica and zinc oxide, or a part or all of the information nucleic acid is dissolved in sterilized distilled water. After being added in the state, the information nucleic acid can be reliably supported on the surface of the fine particles by drying, and the information nucleic acid is supported on the fine particles by using such information nucleic acid-supported fine particles. By introducing into the transparent resin composition, the information nucleic acid can be reliably added to the transparent resin composition and stably dispersed as compared with the case of introducing the information nucleic acid alone. In addition, it is possible to prevent the outflow of information nucleic acid due to moisture, and it is extremely effective that individual authentication of the origin and history of products that use the base sequence of information nucleic acid as a detection index will be possible over a long period of time. It is brought about.
また、懸濁液には、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノールなど）、エステル（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸プロピルなど）、ケトン（例えば、アセトン、ジメチルケトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトンなど）及び芳香族溶剤（トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、キシレンなど）の溶媒をさらに添加することが望ましく、これによって微粒子の懸濁液中における分散性が向上すると共に、情報化核酸が添加された後の水分及び溶剤分の揮発が促進されることになる。
なお、これら溶媒は１種のみに限定されず、２種以上の溶媒を併用することも可能である。また、これら溶媒は、情報化核酸と同時、あるいは情報化核酸を加えた後に添加しても、特に差し支えはない。
In addition, the suspension includes alcohol (eg, methanol, ethanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, etc.), ester (eg, ethyl acetate, butyl acetate, propyl acetate, etc.), ketone ( For example, acetone, dimethyl ketone, methyl ethyl ketone, diethyl ketone, etc.) and aromatic solvents (toluene, hexane, cyclohexane, xylene, etc.) are preferably added, which improves dispersibility of fine particles in suspension. At the same time, volatilization of moisture and solvent after the addition of the information nucleic acid is promoted.
In addition, these solvents are not limited to only 1 type, It is also possible to use 2 or more types of solvents together. These solvents may be added at the same time as the information nucleic acid or after the information nucleic acid is added.
更に、溶媒の添加量としては、アルコールの場合には、滅菌蒸留水／アルコールの容量比を１〜９９の範囲とすることが好ましく、アルコール以外の溶媒の場合、即ちエステル、ケトン、芳香族溶剤の場合には、滅菌蒸留水／溶媒の容量比を１〜７５の範囲とすることが好ましい。
即ち、溶媒の添加量が少な過ぎると、溶媒添加による上記効果が十分に得られず、逆に多過ぎても、水との相溶性低下によって水が揮発せずに残り易くなり、上記効果が十分に得られないようになる傾向がある。
Further, as the amount of the solvent added, in the case of alcohol, the volume ratio of sterilized distilled water / alcohol is preferably in the range of 1 to 99. In the case of a solvent other than alcohol, that is, ester, ketone, aromatic solvent In this case, the volume ratio of sterile distilled water / solvent is preferably in the range of 1 to 75.
That is, if the addition amount of the solvent is too small, the above-mentioned effect due to the addition of the solvent cannot be obtained sufficiently, and conversely, even if it is too much, the water tends to remain without volatilization due to a decrease in compatibility with water. There is a tendency to become insufficient.
以下、本発明をいくつかの実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to some examples, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）
［情報化核酸担持微粒子の作製］
配列番号１で表される情報化ＤＮＡ（配列番号２で表される可認証ＤＮＡを含む）を、ホスホアミダイト法にてヌクレオシドを逐次結合させることによって合成した。
以下、実施例１〜２２において、情報化核酸としては、配列番号１で表される情報化ＤＮＡを用いた。
担体用の微粒子として、シリカコートを施した平均粒径０．０２μｍの酸化亜鉛（昭和電工（株）製ＺＳ−０３２）を使用し、当該酸化亜鉛４ｇに、容量比で３０％のエタノールを含有する滅菌蒸留水１５ｍＬを加えて撹拌し、酸化亜鉛の懸濁液を得た。
情報化ＤＮＡ１０ｎｍｏｌ（１６４μｇ）を滅菌蒸留水１５ｍＬに溶解し、得られた情報化ＤＮＡ水溶液を実施懸濁液に加えて良く撹拌し、さらに４ｍＬのエタノールを加えて撹拌した。
情報化ＤＮＡを加えた懸濁液をプラスチック製の円形皿に注ぎ、その上部を通気性の良い紙あるいは布で覆った状態で、２日間自然乾燥した。更に、ほぼ乾燥したものをデシケータに入れ、４０℃の加熱下で減圧乾燥し、十分に乾燥させた。
十分に乾燥された塊状の微粉末を乳鉢に入れて砕き、もとの微粉末状として、情報化核酸担持微粒子を得た。
Example 1
[Preparation of fine particles carrying information nucleic acid]
The information DNA represented by SEQ ID NO: 1 (including the authenticable DNA represented by SEQ ID NO: 2) was synthesized by sequentially binding nucleosides by the phosphoramidite method.
Hereinafter, in Examples 1 to 22, the information DNA represented by SEQ ID NO: 1 was used as the information nucleic acid.
Zinc oxide (ZS-032 manufactured by Showa Denko KK) with an average particle size of 0.02 μm coated with silica was used as fine particles for the carrier, and 4 g of the zinc oxide contained 30% ethanol by volume. Then, 15 mL of sterilized distilled water was added and stirred to obtain a zinc oxide suspension.
10 nmol (164 μg) of information DNA was dissolved in 15 mL of sterilized distilled water, and the obtained information DNA aqueous solution was added to the suspension and stirred well, and further 4 mL of ethanol was added and stirred.
The suspension to which the information DNA was added was poured into a plastic circular dish, and the top was covered with air-permeable paper or cloth and allowed to air dry for 2 days. Further, the almost dried product was put in a desiccator, dried under reduced pressure under heating at 40 ° C., and sufficiently dried.
The fully dried bulk fine powder was put in a mortar and crushed to obtain the information nucleic acid-carrying fine particles as the original fine powder.
［情報化核酸含有透明樹脂組成物の作製］
１０ｇの情報化核酸担持微粒子と１０００ｇのＰＭＭＡ（三菱レイヨン製、アクリペット）を混合し、１７０℃に加温して、ペレットを得た。
得られたペレットを金型温度３０〜４０℃、シリンダ温度２１０℃とし、４０〜９０秒間で射出成形して、本例の情報化核酸含有透明樹脂組成物（ＰＭＭＡ板：縦１５０ｍｍ、横７０ｍｍ、厚さ５ｍｍ）を作製した。
以下、実施例１〜２２において、得られた情報化核酸含有透明樹脂組成物の寸法は同一である。
[Preparation of transparent nucleic acid-containing resin composition]
10 g of information nucleic acid-carrying fine particles and 1000 g of PMMA (manufactured by Mitsubishi Rayon, Acrypet) were mixed and heated to 170 ° C. to obtain pellets.
The obtained pellet was molded at a mold temperature of 30 to 40 ° C. and a cylinder temperature of 210 ° C., and injection molded in 40 to 90 seconds, and the information nucleic acid-containing transparent resin composition of this example (PMMA plate: 150 mm long, 70 mm wide, A thickness of 5 mm) was produced.
Hereinafter, in Examples 1-22, the size of the obtained information nucleic acid containing transparent resin composition is the same.
（実施例２〜２２）
担体用の微粒子として、シリカコートを施した平均粒径０．０２μｍの酸化亜鉛（昭和電工（株）製ＺＳ−０３２）、平均粒径１μｍのシリカ（鈴木油脂工業（株）製Ｅ−２Ｃ）若しくは平均粒径４μｍのシリカ（鈴木油脂工業（株）製Ｅ−１６Ｃ）を用いて、微粒子に担持する情報化核酸の含有量を調整し、又は情報化核酸担持微粒子の含有量を調整して、本例の情報化核酸含有透明樹脂組成物を作製した。上記各例の情報化核酸含有透明樹脂組成物の仕様を表１及び表２に示す。
(Examples 2 to 22)
As fine particles for the carrier, silica-coated zinc oxide with an average particle size of 0.02 μm (ZS-032 manufactured by Showa Denko KK), silica with an average particle size of 1 μm (E-2C manufactured by Suzuki Yushi Kogyo Co., Ltd.) Alternatively, by using silica having an average particle size of 4 μm (E-16C, manufactured by Suzuki Oil & Fat Co., Ltd.), the content of the information nucleic acid supported on the fine particles is adjusted, or the content of the information nucleic acid-supported fine particles is adjusted. The information nucleic acid containing transparent resin composition of this example was produced. Tables 1 and 2 show the specifications of the information-containing nucleic acid-containing transparent resin composition in each of the above examples.
［評価試験］
（情報化核酸の識別）
（１）上記各例の情報化核酸含有透明樹脂組成物から試験片（縦１５０ｍｍ、横７０ｍｍ、厚さ５ｍｍ）を切り出し、５０℃に保持した温水中に１０００時間浸漬したのち、それぞれの試験片をカッターを用いて、細かく裁断した。
（２）得られた透明樹脂組成物細片に滅菌蒸留水５ｍＬを加え、マグネチックスターラーにより攪拌して、ＤＮＡを水層に抽出した。
（３）遠心分離機を用いて、透明樹脂組成物細片と水層を分離し、水層を遠心エバポレータを用いて濃縮した。
（４）溶出回収したＤＮＡ溶液（５μＬ）に、ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（５μＬ）、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（０．２５μＬ）、滅菌蒸留水（２４．７５μＬ）、配列番号３で表される５μＭのプライマー１（５μＬ）、配列番号４で表される５μＭのプライマー２（５μＬ）、及び２ｍＭのｄＮＴＰ（５μＬ）を混合した。
（５）９４℃で５分間加熱後、［９４℃で３０秒間加熱→４０℃で３０秒間加熱→７２℃で３０秒間加熱］のサイクルを３０回繰り返した。
（６）７２℃で７分間加熱処理した後、４℃で保存した。
（７）１本鎖ＤＮＡ開裂酵素（Ｓ１ヌクレアーゼ（一本鎖ＤＮＡに特異的に反応））を用いて、余分なプライマーを分解し、目的の２本鎖情報化ＤＮＡをゲル濾過で精製した。
（８）精製した情報化ＤＮＡに１種類のプライマー（配列番号３で表されるプライマー１）及び蛍光標識した２，３−ジデオキシヌクレオシド三リン酸を混合した。
（９）上記工程（５）と同様の操作を行った。
（１０）ゲル濾過精製後、自動シーケンサーに供し、配列決定を行った。
[Evaluation test]
(Identification of information nucleic acid)
(1) A test piece (150 mm long, 70 mm wide, 5 mm thick) is cut out from the information-containing nucleic acid-containing transparent resin composition of each of the above examples, and immersed in warm water maintained at 50 ° C. for 1000 hours, and then each test piece. Was cut into small pieces using a cutter.
(2) 5 mL of sterilized distilled water was added to the obtained transparent resin composition strip and stirred with a magnetic stirrer to extract DNA into the aqueous layer.
(3) The transparent resin composition strip and the aqueous layer were separated using a centrifuge, and the aqueous layer was concentrated using a centrifugal evaporator.
(4) PCR buffer (5 μL), Taq polymerase (0.25 μL), sterilized distilled water (24.75 μL), 5 μM primer 1 (5 μL) represented by SEQ ID NO: 3 was added to the DNA solution (5 μL) eluted and recovered. 5 μM primer 2 (5 μL) represented by SEQ ID NO: 4 and 2 mM dNTP (5 μL) were mixed.
(5) After heating at 94 ° C. for 5 minutes, the cycle of [heating at 94 ° C. for 30 seconds → heating at 40 ° C. for 30 seconds → heating at 72 ° C. for 30 seconds] was repeated 30 times.
(6) After heat treatment at 72 ° C. for 7 minutes, it was stored at 4 ° C.
(7) Using a single-strand DNA cleavage enzyme (S1 nuclease (reacts specifically with single-strand DNA)), the excess primer was decomposed and the target double-strand information DNA was purified by gel filtration.
(8) One kind of primer (
(9) The same operation as in the above step (5) was performed.
(10) After gel filtration purification, it was subjected to sequencing by using an automatic sequencer.
得られた結果を表１及び表２に併記する。表中「情報化ＤＮＡの識別」において、「○」は上記情報化核酸の検出方法により識別することが可能であったもの、「△」は更にＰＣＲ処理の追加を必要とした以外は、上記情報化核酸の検出方法と同様の操作により識別することが可能であったものを示す。 The obtained results are also shown in Tables 1 and 2. In “Identification of Informational DNA” in the table, “◯” indicates that it was possible to identify by the above-described detection method of informational nucleic acid, and “Δ” indicates that the PCR process needs to be further added. It shows what could be identified by the same operation as the method for detecting information nucleic acid.
（透明性評価）
上記各例の情報化核酸含有透明樹脂組成物を５０℃、相対湿度９５％の雰囲気中に５００時間放置した後、変色度合いを目視評価した。得られた結果を表１及び表２に併記する。なお、表中「透明性評価」において「○」は「かなり透明」、「△」は「若干白濁」、「×」は「白濁」していることを示す。
(Transparency evaluation)
The information-containing nucleic acid-containing transparent resin composition of each of the above examples was left in an atmosphere of 50 ° C. and a relative humidity of 95% for 500 hours, and then the degree of discoloration was visually evaluated. The obtained results are also shown in Tables 1 and 2. In the table of “Transparency Evaluation”, “◯” indicates “pretty transparent”, “Δ” indicates “slightly cloudy”, and “x” indicates “cloudy”.
表１及び表２より、本発明の情報化核酸含有透明樹脂組成物は、情報化核酸の識別をすることができ、特に、実施例１〜１２及び実施例１８〜２２の情報化核酸含有透明樹脂組成物は、実施例１３〜１７の情報化核酸含有透明樹脂組成物と比較して、より少ない回数のＰＣＲ処理で情報化核酸の識別をすることができることが分かる。
また、本発明の情報化核酸含有透明樹脂組成物は、透明性を有するが、特に実施例１〜１５及び実施例１７は、変色することなく透明性を保持することができる。
更に、本発明の情報化核酸含有透明樹脂組成物は、特に厳密に規定された狭い成形条件に限定されることなく、従来と同様の成形方法で作製することができる。
From Table 1 and Table 2, the information nucleic acid-containing transparent resin composition of the present invention can identify the information nucleic acid, and in particular, the information nucleic acid-containing transparent of Examples 1-12 and Examples 18-22. It can be seen that the resin composition can identify the information nucleic acid with a smaller number of PCR treatments than the information nucleic acid-containing transparent resin compositions of Examples 13 to 17.
Moreover, although the information-ized nucleic acid containing transparent resin composition of this invention has transparency, especially Examples 1-15 and Example 17 can maintain transparency, without discoloring.
Furthermore, the information-containing nucleic acid-containing transparent resin composition of the present invention can be produced by a molding method similar to the conventional one without being limited to narrow molding conditions that are strictly defined.
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