JP2006158359A - Composite material of membrane protein and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、シリカ系メソ多孔体とタンパク質との複合材料、並びにその製造方法に関する。 The present invention relates to a composite material of a silica-based mesoporous material and a protein, and a method for producing the same.
近年、様々な物質を吸着、貯蔵等するための材料として、孔径１〜５０ｎｍ程度のメソサイズの細孔（メソ孔）が非常に規則的に配列したシリカ系メソ多孔体が注目されており、このようなシリカ系メソ多孔体の機能開発の研究が積極的に行われてきた。 In recent years, silica-based mesoporous materials in which meso-sized pores (mesopores) having a pore diameter of about 1 to 50 nm are regularly arranged have attracted attention as materials for adsorbing and storing various substances. Research on functional development of such silica-based mesoporous materials has been actively conducted.
一方、酵素は常温で触媒作用を発揮し、触媒作用の特異性が高く、副反応が少ない等の長所があり、このような酵素をシリカ系メソ多孔体等の構造ユニットに固定した超安定化酵素が特開２０００−１３９４５９号公報（特許文献１）に記載されている。 On the other hand, enzymes exhibit their catalytic effects at room temperature, have high catalytic specificity, and have few side reactions. Ultra-stabilized by fixing such enzymes to structural units such as silica-based mesoporous materials. An enzyme is described in JP 2000-139459 A (Patent Document 1).
しかしながら、上記特許文献１に記載されているように従来からシリカ系メソ多孔体等の担体に複合化することが検討されてきた酵素は、溶液に容易に溶解するいわゆる可溶性タンパク質のみであった。そのため、従来は、複合化して用いることができるタンパク質は実質的に可溶性タンパク質に制限されてしまい、機能性の付与に限界があるといった問題があった。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、従来はシリカ系メソ多孔体等の担体と複合化することはできないと考えられてきた膜タンパク質がその機能を阻害されることなくかつ安定的にシリカ系メソ多孔体に固定化されており、熱等に対する安定性が高くかつ膜タンパク質が有する機能を発現することが可能な膜タンパク質複合材料、並びにその製造方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and the function of a membrane protein, which has been conventionally considered to be unable to be complexed with a carrier such as a silica-based mesoporous material, is inhibited. Provided are a membrane protein composite material that is stably and stably immobilized on a silica-based mesoporous material, has high stability to heat, etc., and can exhibit the functions of a membrane protein, and a method for producing the same For the purpose.
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、従来はシリカ系メソ多孔体等の担体と複合化することはできないと考えられてきた膜タンパク質であっても、その機能が阻害されることなくかつ安定的にシリカ系メソ多孔体に固定化することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have been able to function even if it is a membrane protein that has conventionally been thought to be unable to be complexed with a carrier such as a silica-based mesoporous material. Has been found to be able to be stably immobilized on a silica-based mesoporous material without being inhibited, and the present invention has been completed.
すなわち、いわゆる膜タンパク質は、細胞膜に埋め込まれた状態で光合成のようなエネルギー変換系等の機能を発現するものであり、一般的に内部には親水性アミノ酸、外部には疎水性アミノ酸を有しており、可溶化が非常に困難なものである。そのため、このような膜タンパク質を可溶化するためには、界面活性剤を利用してその疎水性表面を覆うことによって細胞膜から分離する必要があった。そのため、このようにして分離された膜タンパク質の表面には多量の界面活性剤が吸着しており、その分子径は膜タンパク質のみの分子径に比べて遥かに大きく、シリカ系メソ多孔体の細孔内に固定化させることはできないと考えるのが当業者の通常の認識であった。しかしながら、本発明者らは、分離された膜タンパク質をシリカ系メソ多孔体に固定化させる際に、膜タンパク質が凝集しない範囲で界面活性剤の濃度が低濃度化された状態とすることにより、驚くべきことに膜タンパク質をその機能が阻害されることなくかつ安定的にシリカ系メソ多孔体に固定化することが可能となることを見出し、本発明を完成するに至ったのである。 That is, a so-called membrane protein expresses a function of an energy conversion system such as photosynthesis when embedded in a cell membrane, and generally has a hydrophilic amino acid inside and a hydrophobic amino acid outside. And solubilization is very difficult. Therefore, in order to solubilize such a membrane protein, it has been necessary to separate it from the cell membrane by covering the hydrophobic surface with a surfactant. For this reason, a large amount of surfactant is adsorbed on the surface of the membrane protein thus separated, and its molecular diameter is much larger than that of the membrane protein alone, and the silica-based mesoporous material has a fine particle size. It was the normal recognition of those skilled in the art that it could not be immobilized in the hole. However, when immobilizing the separated membrane protein on the silica-based mesoporous material, the present inventors set the surfactant concentration at a low level within a range where the membrane protein does not aggregate, Surprisingly, it has been found that membrane proteins can be stably immobilized on a silica-based mesoporous material without inhibiting the function thereof, and the present invention has been completed.
本発明の膜タンパク質複合材料は、シリカ系メソ多孔体と、該シリカ系メソ多孔体に固定化されている膜タンパク質とを備えることを特徴とするものである。 The membrane protein composite material of the present invention comprises a silica-based mesoporous material and a membrane protein immobilized on the silica-based mesoporous material.
前記本発明の膜タンパク質複合材料において複合化される前記膜タンパク質は、疎水性アミノ酸を外部に有する疎水性膜タンパク質であることが好ましく、このような膜タンパク質が前記シリカ系メソ多孔体の細孔内に吸着されていることが好ましい。 The membrane protein complexed in the membrane protein composite material of the present invention is preferably a hydrophobic membrane protein having a hydrophobic amino acid outside, and such membrane protein is a pore of the silica-based mesoporous material. It is preferably adsorbed inside.
また、本発明において担体として用いる前記シリカ系メソ多孔体は、細孔内表面にイオン性官能基を実質的に有さないものであることが好ましい。 In addition, the silica-based mesoporous material used as a carrier in the present invention preferably has substantially no ionic functional group on the pore inner surface.
本発明の膜タンパク質複合材料の製造方法は、
界面活性剤を含有する溶液に、膜タンパク質を溶解及び／又は分散させた溶液を調製する溶液調製工程と、
前記溶液にシリカ系メソ多孔体を懸濁させ、前記溶液中の前記膜タンパク質を前記シリカ系メソ多孔体に固定化せしめる固定化工程と、
を含むことを特徴とする方法である。
The method for producing the membrane protein composite material of the present invention comprises:
A solution preparation step of preparing a solution in which a membrane protein is dissolved and / or dispersed in a solution containing a surfactant;
An immobilization step of suspending the silica-based mesoporous material in the solution and immobilizing the membrane protein in the solution on the silica-based mesoporous material;
It is the method characterized by including.
前記本発明の方法は、前記固定化工程に先立って、前記膜タンパク質が凝集しない範囲で前記溶液中の界面活性剤の濃度を低濃度化する界面活性剤除去工程を更に含むことが好ましい。 Preferably, the method of the present invention further includes a surfactant removal step of reducing the concentration of the surfactant in the solution within a range in which the membrane protein does not aggregate prior to the immobilization step.
また、前記本発明の方法においては、前記固定化工程において、前記溶液が１０−５〜０．１質量％の濃度の界面活性剤を含有していることが好ましく、前記溶液が２５ｍＭ以上の濃度の塩を含有していることがより好ましい。 In the method of the present invention, in the immobilization step, the solution preferably contains a surfactant having a concentration of 10 −5 to 0.1% by mass, and the solution has a concentration of 25 mM or more. It is more preferable that the salt is contained.
さらに、本発明において担体として用いる前記シリカ系メソ多孔体は、細孔内表面にイオン性官能基を実質的に有さないものであることが好ましく、このようなシリカ系メソ多孔体を準備するための前処理工程、すなわち前記シリカ系メソ多孔体の細孔内表面に存在するイオン性官能基を非極性基に置換せしめる前処理工程、を前記本発明の方法が更に含んでいてもよい。 Furthermore, it is preferable that the silica-based mesoporous material used as a carrier in the present invention has substantially no ionic functional group on the pore inner surface, and such a silica-based mesoporous material is prepared. The method of the present invention may further include a pretreatment step for the above, that is, a pretreatment step of substituting an ionic functional group present on the pore inner surface of the silica-based mesoporous material with a nonpolar group.
なお、本発明によれば、熱等に対する安定性が高くかつ膜タンパク質が有する機能を発現することが可能な膜タンパク質複合材料が得られるようになる理由は必ずしも定かではないが、本発明者らは以下のように推察する。すなわち、本発明の膜タンパク質複合材料においては、疎水性の膜タンパク質がその基本的な構造は変化することなく疎水性的な表面を有するシリカ系メソ多孔体の細孔内に固定化されているため、膜タンパク質が細胞膜内に存在する状態と同様な環境が提供され、膜タンパク質が有する機能が阻害されることなく発現される。そして、膜タンパク質がシリカ系メソ多孔体の細孔内表面に固定化されているため、膜タンパク質の分子運動が抑制され、膜タンパク質が変性・失活する際に生じる不可逆的な構造変化が物理的に押さえ込まれ、それらの結果として熱等に対する安定性が非常に向上するものと本発明者らは推察する。 In addition, according to the present invention, the reason why a membrane protein composite material having high stability against heat and the like and capable of expressing the function of the membrane protein is not necessarily known, but the present inventors Guesses as follows. That is, in the membrane protein composite material of the present invention, the hydrophobic membrane protein is immobilized in the pores of a silica-based mesoporous material having a hydrophobic surface without changing its basic structure. Therefore, an environment similar to the state in which the membrane protein is present in the cell membrane is provided, and the function of the membrane protein is expressed without being inhibited. And since the membrane protein is immobilized on the inner surface of the pores of the silica-based mesoporous material, the molecular motion of the membrane protein is suppressed, and irreversible structural changes that occur when the membrane protein is denatured and deactivated are physically The present inventors speculate that the stability against heat and the like is greatly improved as a result.
本発明によれば、従来はシリカ系メソ多孔体等の担体と複合化することはできないと考えられてきた膜タンパク質がその機能を阻害されることなくかつ安定的にシリカ系メソ多孔体に固定化されており、熱等に対する安定性が高くかつ膜タンパク質が有する機能を発現することが可能な膜タンパク質複合材料を提供することが可能となる。また、本発明の製造方法によれば、上記本発明の膜タンパク質複合材料を効率良くかつ確実に製造することが可能となる。 According to the present invention, a membrane protein that has been thought to be unable to be complexed with a carrier such as a silica-based mesoporous material in the past is stably immobilized on the silica-based mesoporous material without inhibiting its function. Therefore, it is possible to provide a membrane protein composite material that is highly stable against heat and the like and that can express the function of the membrane protein. Moreover, according to the production method of the present invention, the membrane protein composite material of the present invention can be produced efficiently and reliably.
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to preferred embodiments thereof.
（シリカ系メソ多孔体）
先ず、本発明の膜タンパク質複合材料において用いられるシリカ系メソ多孔体について説明する。
(Silica-based mesoporous material)
First, the silica-based mesoporous material used in the membrane protein composite material of the present invention will be described.
本発明において、メソ多孔体とは、細孔のサイズがメソ孔である多孔体をいう。ここで、メソ孔とは、中心細孔直径が１〜５０ｎｍのものをいい、好ましくは中心細孔直径が２〜２０ｎｍのものである。中心細孔直径が前記下限未満の場合は膜タンパク質が細孔内に導入されにくくなり、他方、前記上限を超える場合は細孔内に導入された膜タンパク質の安定化効果が低くなる。なお、中心細孔直径とは、メソ多孔体の細孔容積（Ｖ）を細孔直径（Ｄ）で微分した値（ｄＶ／ｄＤ）を細孔直径（Ｄ）に対してプロットした曲線（細孔径分布曲線）の最大ピークにおける細孔直径を意味する。そして、細孔分布曲線は、メソ多孔体を液体窒素温度（−１９６℃）に冷却して窒素ガスを導入し、定容量法によりその吸着量を求め、次いで、導入する窒素ガスの圧力を徐々に増加させ、各平衡圧に対する窒素ガス吸着量をプロットして吸着等温線を得た後に、Ｃｒａｎｓｔｏｎ−Ｉｎｋｌａｙ法、Ｄｏｌｌｉｍｏｒｅ−Ｈｅａｌ法、ＢＪＨ法等を適用して求めることができる曲線である。 In the present invention, the mesoporous material refers to a porous material having a mesopore size. Here, the mesopore means one having a central pore diameter of 1 to 50 nm, and preferably one having a central pore diameter of 2 to 20 nm. When the central pore diameter is less than the lower limit, the membrane protein is difficult to be introduced into the pores, whereas when it exceeds the upper limit, the stabilization effect of the membrane protein introduced into the pores is reduced. The central pore diameter is a curve (thinness) obtained by plotting a value (dV / dD) obtained by differentiating the pore volume (V) of the mesoporous material with respect to the pore diameter (D) against the pore diameter (D). It means the pore diameter at the maximum peak of the pore diameter distribution curve. The pore distribution curve is obtained by cooling the mesoporous material to liquid nitrogen temperature (-196 ° C.), introducing nitrogen gas, obtaining the adsorption amount by a constant volume method, and then gradually increasing the pressure of the introduced nitrogen gas. It is a curve that can be obtained by applying a Cranston-Inklay method, a Dollimore-Heal method, a BJH method, etc. after plotting the nitrogen gas adsorption amount for each equilibrium pressure to obtain an adsorption isotherm.
本発明にかかるシリカ系メソ多孔体は、ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体である。このようなシリカ系メソ多孔体としては、０．１〜１．５ｍＬ／ｇの細孔容積を有するものが好ましく、また、２００〜１５００ｍ２／ｇのＢＥＴ比表面積を有するものが好ましい。そして、シリカ系メソ多孔体は、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上の多孔体であることが好ましい。 The silica-based mesoporous material according to the present invention is a porous material of a compound containing silicon atoms and oxygen atoms as essential components. As such a silica-based mesoporous material, those having a pore volume of 0.1 to 1.5 mL / g are preferable, and those having a BET specific surface area of 200 to 1500 m 2 / g are preferable. The silica-based mesoporous material is preferably a porous material in which the proportion of the total volume of pores having a diameter in the range of ± 40% of the central pore diameter in the total pore volume is 60% or more. .
ここで、「全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上」とは、例えば、中心細孔直径が３．００ｎｍである場合、この３．００ｎｍの±４０％、すなわち１．８０〜４．２０ｎｍの範囲にある細孔の容積の合計が、全細孔容積の６０％以上を占めていることを意味する。この条件を満たす多孔体は、細孔の直径が非常に均一であることを意味し、このような細孔配列構造を有するシリカ系メソ多孔体に膜タンパク質を固定化させることにより、膜タンパク質の熱等に対する安定性が向上する傾向にある。なお、細孔容積は、上述のようにシリカ系メソ多孔体を液体窒素温度に冷却して窒素ガスを導入する方法（窒素吸着法）により算出することができる。
Here, “the ratio of the total volume of pores having a diameter within the range of ± 40% of the center pore diameter in the total pore volume is 60% or more” means that the center pore diameter is 3. When it is 00 nm, it means that the total volume of pores in the range of ± 40% of 3.00 nm, that is, 1.80 to 4.20 nm,
また、本発明にかかるシリカ系メソ多孔体は、１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークを有するＸ線回折パターンを示す多孔体であることが好ましい。Ｘ線回折パターンでピークが現われる場合は、そのピーク角度に相当するｄ値の周期構造がシリカ系メソ多孔体中にあることを意味する。したがって、１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークがあることは、細孔が１ｎｍ以上の間隔で規則的に配列していることを意味する。このように非常に規則的な細孔配列構造を有するシリカ系メソ多孔体に膜タンパク質を固定化させることにより、膜タンパク質の熱等に対する安定性が向上する傾向にある。 The silica-based mesoporous material according to the present invention is preferably a porous material that exhibits an X-ray diffraction pattern having one or more peaks at a diffraction angle corresponding to a d value of 1 nm or more. When a peak appears in the X-ray diffraction pattern, it means that a periodic structure having a d value corresponding to the peak angle is present in the silica-based mesoporous material. Therefore, having one or more peaks at a diffraction angle corresponding to a d value of 1 nm or more means that the pores are regularly arranged at intervals of 1 nm or more. By immobilizing the membrane protein on the silica-based mesoporous material having a very regular pore arrangement structure as described above, the stability of the membrane protein to heat or the like tends to be improved.
上述のシリカ系メソ多孔体における、細孔の配列状態（細孔配列構造）は特に制限されず、例えば、２ｄ−ヘキサゴナルや３ｄ−ヘキサゴナル等のヘキサゴナルの細孔配列構造を有するものであっても、キュービックやディスオーダの細孔配列構造を有するものであってもよい。ここで、シリカ系メソ多孔体がヘキサゴナルの細孔配列構造を有するとは、シリカ系メソ多孔体の細孔の配置が六方構造であることを意味する（S.Inagaki et al.,J.Chem.Soc.,Chem.Commun.,680,1993; S.Inagaki et al.,Bull.Chem.Soc.Jpn.,69,1449,1996; Q.Huo et al.,Science,268,1324,1995参照）。 The pore arrangement state (pore arrangement structure) in the above-mentioned silica-based mesoporous material is not particularly limited. For example, even if it has a hexagonal pore arrangement structure such as 2d-hexagonal or 3d-hexagonal. Further, it may have a cubic or disordered pore arrangement structure. Here, the fact that the silica-based mesoporous material has a hexagonal pore arrangement structure means that the arrangement of the pores of the silica-based mesoporous material has a hexagonal structure (S. Inagaki et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 680, 1993; S. Inagaki et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 69, 1449, 1996; Q. Huo et al., Science, 268, 1324, 1995 ).
また、シリカ系メソ多孔体がキュービックの細孔配列構造を有するとは、シリカ系メソ多孔体中の細孔の配置が立方構造であることを意味する（J.C.Vartuli et al.,Chem.Mater.,6,2317,1994; Q.Huo et al.,Nature,368,317,1994参照）。そして、シリカ系メソ多孔体がディスオーダの細孔配列構造を有するとは、細孔の配置が不規則であることを意味する（P.T.Tanev et al.,Science,267,865,1995; S.A.Bagshaw et al.,Science,269,1242,1995; R.Ryoo et al.,J.Phys.Chem.,100,17718,1996参照）。 The silica-based mesoporous material has a cubic pore arrangement structure means that the arrangement of the pores in the silica-based mesoporous material is a cubic structure (JCVartuli et al., Chem. Mater. , 6, 2317, 1994; see Q. Huo et al., Nature, 368, 317, 1994). The silica-based mesoporous material having a disordered pore arrangement structure means that the arrangement of the pores is irregular (PTTanev et al., Science, 267,865, 1995; SABagshaw et al Science, 269, 1242, 1995; R. Ryoo et al., J. Phys. Chem., 100, 17718, 1996).
なお、シリカ系メソ多孔体が、ヘキサゴナルやキュービック等の規則的細孔配列構造を有する場合は、細孔の全てがこれらの規則的細孔配列構造である必要はない。すなわち、シリカ系メソ多孔体は、ヘキサゴナルやキュービック等の規則的細孔配列構造とディスオーダの不規則的細孔配列構造の両方を有していてもよい。しかしながら、全ての細孔のうち８０％以上はヘキサゴナルやキュービック等の規則的細孔配列構造となっていることが好ましい。 When the silica-based mesoporous material has a regular pore arrangement structure such as hexagonal or cubic, it is not necessary that all of the pores have these regular pore arrangement structures. That is, the silica-based mesoporous material may have both a regular pore arrangement structure such as hexagonal or cubic and a disordered irregular pore arrangement structure. However, 80% or more of all the pores preferably have a regular pore arrangement structure such as hexagonal or cubic.
また、シリカ系メソ多孔体は、有機基を有するシリカ系メソ多孔体（以下、場合により「有機化シリカ系メソ多孔体」という）であっても、有機基を有しないシリカ系メソ多孔体（以下、場合により「非有機化シリカ系メソ多孔体」という）であってもよい。なお、有機基の有無にかかわらず、いずれのシリカ系メソ多孔体の場合においても、ケイ素以外の金属元素（例えば、Ａｌ、Ｚｒ、Ｔｉ等）を更に含んでいてもよい。 The silica-based mesoporous material may be a silica-based mesoporous material having an organic group (hereinafter, sometimes referred to as “organized silica-based mesoporous material”). Hereinafter, it may be referred to as “non-organized silica-based mesoporous material”. Regardless of the presence or absence of an organic group, any silica-based mesoporous material may further contain a metal element other than silicon (for example, Al, Zr, Ti, etc.).
ここで、有機化シリカ系メソ多孔体とは、シリカ系メソ多孔体を構成するケイ素原子の少なくとも一部に、有機基が、炭素−ケイ素結合を形成することによって結合しているものをいう。有機基としては、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン、シクロアルカン等の炭化水素から１以上の水素がとれて生じる炭化水素基や、アミド基、アミノ基、イミノ基、メルカプト基、スルホン基、カルボキシル基、エーテル基、アシル基、ビニル基等が挙げられる。 Here, the organosilica mesoporous material means a material in which an organic group is bonded to at least a part of silicon atoms constituting the silica mesoporous material by forming a carbon-silicon bond. Examples of organic groups include hydrocarbon groups formed by removing one or more hydrogen from hydrocarbons such as alkanes, alkenes, alkynes, benzenes, cycloalkanes, amide groups, amino groups, imino groups, mercapto groups, sulfone groups, carboxyl groups. , Ether group, acyl group, vinyl group and the like.
上記非有機化シリカ系メソ多孔体を得る方法としては、例えば、(i)米国特許５０５７２９６号公報に記載されているように、アルコキシシラン、沈降性シリカ、水ガラス、ケイ酸ナトリウム等のシリカ原料を、界面活性剤（ポリエチレンオキサイド系非イオン性界面活性剤、アルキルトリメチルアンモニウム塩等）が溶解した水溶液に添加して反応させ、その後界面活性剤を除去する方法や、(ii)特開平８−６７５７８号公報及び特開平８−２７７１０５号公報に記載されているように、層間にイオンを有する層状ケイ酸塩を界面活性剤（アルキルトリメチルアンモニウム塩等）を用いてイオン交換した後に層間を架橋せしめ、その後界面活性剤を除去する方法等が挙げられる。また、上記有機化シリカ系メソ多孔体を得る方法としては、例えば、(iii)特開２００１−１１４７９０号公報に記載されているように、有機基とケイ素原子を含有し、有機基の１箇所以上で炭素−ケイ素結合を形成しているケイ素化合物を含むシリカ原料を、界面活性剤（ポリエチレンオキサイド系非イオン性界面活性剤、アルキルトリメチルアンモニウム塩等）と溶媒とを含む溶液中で反応させ、その後界面活性剤を除去する方法が挙げられる。 Examples of the method for obtaining the non-organized silica-based mesoporous material include (i) silica raw materials such as alkoxysilane, precipitated silica, water glass, sodium silicate and the like as described in US Pat. No. 5,057,296. Is added to an aqueous solution in which a surfactant (polyethylene oxide-based nonionic surfactant, alkyltrimethylammonium salt, etc.) is dissolved and reacted, and then (ii) JP-A-8- As described in JP-A-67578 and JP-A-8-277105, a layered silicate having ions between layers is ion-exchanged using a surfactant (such as an alkyltrimethylammonium salt) and then the layers are crosslinked. Thereafter, a method of removing the surfactant and the like can be mentioned. In addition, as a method for obtaining the organosilica mesoporous material, for example, as described in (iii) Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-114790, an organic group and a silicon atom are contained. The silica raw material containing a silicon compound forming a carbon-silicon bond is reacted in a solution containing a surfactant (polyethylene oxide nonionic surfactant, alkyltrimethylammonium salt, etc.) and a solvent, Thereafter, a method of removing the surfactant may be mentioned.
このような非層状のシリカ原料を用いる(i)や(iii)の方法においては、先ず、水に界面活性剤を添加することにより、界面活性剤は水中で規則的に配列したミセルを形成する。ミセルが形成された水溶液に対してシリカ原料が添加されると、界面活性剤の周囲にシリカ原料が集合し複合体（典型的にはハニカム状の複合体）が形成される。そして、界面活性剤の周囲において塩基性又は酸性条件下でシリカ原料が反応してケイ素酸化物に変化する。したがって、界面活性剤がミセルを形成していた部分にはケイ素酸化物が形成されないため反応生成物は多孔体となる。 In the method (i) or (iii) using such a non-layered silica raw material, first, by adding a surfactant to water, the surfactant forms micelles regularly arranged in water. . When the silica raw material is added to the aqueous solution in which micelles are formed, the silica raw material gathers around the surfactant to form a composite (typically a honeycomb-shaped composite). Then, the silica raw material reacts and changes into silicon oxide under basic or acidic conditions around the surfactant. Therefore, since the silicon oxide is not formed in the portion where the surfactant has formed micelles, the reaction product becomes a porous body.
また、層状のシリカ原料を用いる(ii)の方法においては、界面活性剤の水溶液に層状ケイ酸塩が添加されると、層状ケイ酸塩の層間に界面活性剤が入り込み複合体（典型的にはハニカム状の複合体）が形成される。このとき、隣接する層状ケイ酸塩の各層は結合しないが、塩基性又は酸性条件下で層状ケイ酸塩の反応が進行することにより隣接する層が結合する。これにより、界面活性剤が存在していた部分が孔となるようにして多孔体が形成される。 In the method (ii) using a layered silica raw material, when a layered silicate is added to an aqueous solution of a surfactant, the surfactant enters between the layers of the layered silicate and is typically a composite (typically Is formed as a honeycomb composite. At this time, each layer of the adjacent layered silicate is not bonded, but the adjacent layer is bonded by the reaction of the layered silicate under a basic or acidic condition. As a result, the porous body is formed so that the portion where the surfactant was present becomes pores.
なお、本発明にかかるシリカ系メソ多孔体を得る際に用いられる界面活性剤は、特に限定されるものではなく、陽イオン性、陰イオン性、非イオン性のうちのいずれであってもよく、具体的には、アルキルトリメチルアンモニウム｛ＣpＨ2p+1Ｎ（ＣＨ3）3｝、アルキルトリエチルアンモニウム、ジアルキルジメチルアンモニウム、ベンジルアンモニウム等の塩化物、臭化物、ヨウ化物又は水酸化物；ポリエチレンオキサイド系非イオン性界面活性剤｛（ＥＯ）x（ＰＯ）y（ＥＯ）xで表されるトリブロックコポリマー型ポリアルキレンオキサイド等｝；脂肪酸塩；アルキルスルホン酸塩；アルキルリン酸塩；一級アルキルアミン等が挙げられる。これらの界面活性剤は、単独で又は二種以上を混合して用いてもよいが、細孔内表面にイオン性官能基を実質的に有さないシリカ系メソ多孔体が得られるという観点から、ポリエチレンオキサイド系等の非イオン性界面活性剤が特に好ましい。 The surfactant used for obtaining the silica-based mesoporous material according to the present invention is not particularly limited, and may be any of cationic, anionic and nonionic. Specifically, alkyltrimethylammonium {C p H 2p + 1 N (CH 3) 3}, alkyl triethyl ammonium, dialkyl dimethyl ammonium chloride and benzyl ammonium bromide, iodide or hydroxide; polyethylene oxide Nonionic surfactant {Triblock copolymer type polyalkylene oxide represented by (EO) x (PO) y (EO) x , etc.}; fatty acid salt; alkyl sulfonate; alkyl phosphate; primary alkyl amine Etc. These surfactants may be used alone or in admixture of two or more, but from the viewpoint of obtaining a silica-based mesoporous material having substantially no ionic functional group on the pore inner surface. Particularly preferred are nonionic surfactants such as polyethylene oxide.
このように細孔内表面にイオン性官能基を実質的に有さないシリカ系メソ多孔体を用いると、細孔内に固定化される膜タンパク質の量が顕著に向上する傾向にある。なお、いわゆる可溶性タンパク質の場合は逆であり、細孔内表面にイオン性官能基を実質的に有さないシリカ系メソ多孔体を用いると、細孔内に固定化される可溶性タンパク質の量が顕著に減少する傾向にある。このように膜タンパク質と可溶性タンパク質とで現象が逆になる理由は必ずしも定かではないが、可溶性タンパク質は細孔内のイオン性官能基に結合するのに対して、膜タンパク質は全く別異のメカニズム（吸着・結合形態）によって細孔内に固定化されるものと本発明者らは推察する。 When a silica-based mesoporous material having substantially no ionic functional group on the pore inner surface is used, the amount of membrane protein immobilized in the pores tends to be remarkably improved. In the case of so-called soluble proteins, the reverse is true. When a silica-based mesoporous material having substantially no ionic functional group on the pore inner surface is used, the amount of soluble protein immobilized in the pores is reduced. It tends to decrease significantly. The reason why the phenomenon is reversed between membrane protein and soluble protein is not always clear, but soluble protein binds to ionic functional groups in the pores, whereas membrane protein has a completely different mechanism. The present inventors infer that they are immobilized in the pores by (adsorption / bonding form).
なお、シリカ系メソ多孔体の細孔内表面に存在し得るイオン性官能基としては、シラノール基（−ＳｉＯＨ基）、シラノール基の塩（−ＳｉＯＮａ基等）等が挙げられ、このようなイオン性官能基を細孔内表面に実質的に有さないとは、前記イオン性官能基を有さない結合、例えばシロキ酸結合（−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ−）で覆われている場合をいう。 Examples of the ionic functional group that can exist on the pore inner surface of the silica-based mesoporous material include silanol groups (—SiOH groups), salts of silanol groups (—SiONa groups, etc.), and such ions That the surface of the pores does not substantially have an ionic functional group means a case in which the surface is covered with a bond having no ionic functional group, for example, a siloxy acid bond (—Si—O—Si—). .
（膜タンパク質）
次に、本発明の膜タンパク質複合材料において用いられる膜タンパク質について説明する。
(Membrane protein)
Next, the membrane protein used in the membrane protein composite material of the present invention will be described.
本発明において用いる膜タンパク質（membrane protein）は、細胞膜（脂質二分子膜）に埋め込まれた状態で光合成のようなエネルギー変換系等の機能を発現するものであり、一般的に内部には親水性アミノ酸、外部には疎水性アミノ酸を有している。 The membrane protein used in the present invention expresses functions such as an energy conversion system such as photosynthesis when embedded in a cell membrane (lipid bilayer membrane), and is generally hydrophilic inside. It has an amino acid and a hydrophobic amino acid outside.
このような膜タンパク質の外部（表面及びその近傍）に存在する疎水性アミノ酸としては、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン等が挙げられる。 Examples of hydrophobic amino acids existing outside (on the surface and in the vicinity of) such membrane proteins include alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan, and cysteine.
また、本発明において用いることができる膜タンパク質は、特に限定されるものではなく、以下のような諸機能を有する各種の膜タンパク質：
・輸送機能を有するナトリウムポンプやプロトンポンプ、
・光エネルギー変換機能を有する光合成タンパク質複合体、
・電子伝達機能を有するNADH脱水素酵素複合体やシトクローム酸化酵素複合体、
・ATP合成酵素、
等が挙げられる。
The membrane protein that can be used in the present invention is not particularly limited, and various membrane proteins having the following functions:
・ Sodium pump or proton pump with transport function,
・ Photosynthetic protein complex having light energy conversion function,
・ NADH dehydrogenase complex and cytochrome oxidase complex with electron transfer function,
ATP synthase,
Etc.
このような膜タンパク質の具体的なものとしては、例えば、光合成タンパク質複合体として以下の反応中心及びアンテナタンパク質が挙げられる。すなわち、クロロフィル（Chl）、バクテリオクロロフィル（BChl）等の色素を含む光合成生物においては、光合成により光エネルギーが化学エネルギーに変換される。このような反応を行う分子装置が、色素や電子伝達物質を内部に含むタンパク質複合体、すなわち反応中心（RC）と呼ばれる膜タンパク質である。また、光合成における電子伝達反応は、光からエネルギーを獲得して反応中心のスペシャルペア（SP）が励起されることによって反応が開始されるが、効率的な反応を続けるために光の獲得・輸送に特化したタンパク複合体が存在する。このような光の獲得・輸送に特化したタンパク複合体が、アンテナタンパク質（光捕集系）と呼ばれる膜タンパク質である。このようなアンテナタンパク質で集められた光エネルギーが励起エネルギー移動により反応中心に運ばれ、反応中心で光エネルギーから電気化学エネルギーへと変換される。なお、このような過程は化学的には酸化還元反応として考えられる。 Specific examples of such membrane proteins include the following reaction centers and antenna proteins as photosynthetic protein complexes. That is, in photosynthesis organisms containing pigments such as chlorophyll (Chl) and bacteriochlorophyll (BChl), light energy is converted into chemical energy by photosynthesis. A molecular device that performs such a reaction is a protein complex containing a dye and an electron transfer substance inside, that is, a membrane protein called a reaction center (RC). In addition, the electron transfer reaction in photosynthesis starts when a special pair (SP) of the reaction center is excited by acquiring energy from light. In order to continue an efficient reaction, light is acquired and transported. There are specialized protein complexes. Such a protein complex specialized in the acquisition and transport of light is a membrane protein called an antenna protein (light collecting system). Light energy collected by such an antenna protein is transported to the reaction center by excitation energy transfer, and is converted from light energy to electrochemical energy at the reaction center. Such a process is chemically considered as an oxidation-reduction reaction.
（膜タンパク質複合材料）
次に、本発明の膜タンパク質複合材料について説明する。
(Membrane protein composite material)
Next, the membrane protein composite material of the present invention will be described.
本発明の膜タンパク質複合材料は、前記シリカ系メソ多孔体とそのシリカ系メソ多孔体に固定化されている前記膜タンパク質とを備えるものである。このような膜タンパク質複合材料において、膜タンパク質は、シリカ系メソ多孔体の表面、特に細孔内表面に固定化（好ましくは吸着）されており、それによって膜タンパク質の分子運動が抑制され、熱等に対する安定性の向上が達成される。 The membrane protein composite material of the present invention comprises the silica mesoporous material and the membrane protein immobilized on the silica mesoporous material. In such a membrane protein composite material, the membrane protein is immobilized (preferably adsorbed) on the surface of the silica-based mesoporous material, particularly the inner surface of the pore, thereby suppressing the molecular motion of the membrane protein, Improvement of stability against the above is achieved.
本発明の膜タンパク質複合材料においてシリカ系メソ多孔体に固定化されている膜タンパク質の量は特に制限されないが、膜タンパク質としての機能がより確実に達成されるようになるという観点から、シリカ系メソ多孔体１００質量部に対して固定化されている膜タンパク質の量が１〜１００質量部程度であることが好ましい。 The amount of the membrane protein immobilized on the silica-based mesoporous material in the membrane protein composite material of the present invention is not particularly limited, but from the viewpoint that the function as a membrane protein can be achieved more reliably, the silica-based material The amount of membrane protein immobilized on 100 parts by mass of the mesoporous material is preferably about 1 to 100 parts by mass.
また、本発明において用いる膜タンパク質とシリカ系メソ多孔体との組み合わせは特に制限されないが、膜タンパク質の大きさ（最大直径、φ１）の１．０倍〜１．５倍程度の大きさの中心細孔直径（φ２）を有するシリカ系メソ多孔体を用いることが好ましい。（φ２／φ１）の値が前記下限未満の場合は膜タンパク質が細孔内に導入されにくくなる傾向にあり、他方、前記上限を超える場合は細孔内に導入されても膜タンパク質の安定化効果が現れなくなる傾向にある。 In addition, the combination of the membrane protein and the silica-based mesoporous material used in the present invention is not particularly limited, but the size is about 1.0 to 1.5 times the size of the membrane protein (maximum diameter, φ 1 ). It is preferable to use a silica-based mesoporous material having a central pore diameter (φ 2 ). When the value of (φ 2 / φ 1 ) is less than the lower limit, the membrane protein tends to be difficult to be introduced into the pores. On the other hand, when the value exceeds the upper limit, the membrane protein may be introduced into the pores. There is a tendency that the stabilizing effect does not appear.
（膜タンパク質複合材料の製造方法）
本発明の膜タンパク質複合材料の製造方法は、
(i)界面活性剤を含有する溶液に、前述の膜タンパク質を溶解及び／又は分散させた溶液を調製する溶液調製工程と、
(ii)前記溶液に前述のシリカ系メソ多孔体を懸濁させ、前記溶液中の前記膜タンパク質を前記シリカ系メソ多孔体に固定化せしめる固定化工程と、
を含むことを特徴とする方法である。
(Method for producing membrane protein composite material)
The method for producing the membrane protein composite material of the present invention comprises:
(i) a solution preparation step of preparing a solution in which the aforementioned membrane protein is dissolved and / or dispersed in a solution containing a surfactant;
(ii) an immobilization step of suspending the silica-based mesoporous material in the solution and immobilizing the membrane protein in the solution on the silica-based mesoporous material;
It is the method characterized by including.
本発明にかかる膜タンパク質は、前述の通り、可溶化が非常に困難なものである。そのため、先ずはこのような膜タンパク質を可溶化するために、界面活性剤を利用してその疎水性表面を覆うことによって細胞膜から分離（抽出）せしめ、膜タンパク質を溶解及び／又は分散させた溶液を調製する（溶液調製工程）。 As described above, the membrane protein according to the present invention is very difficult to solubilize. Therefore, first, in order to solubilize such membrane proteins, a solution in which membrane proteins are dissolved and / or dispersed by separating (extracting) them from the cell membrane by covering the hydrophobic surface with a surfactant. (Solution preparation step).
ここで使用する界面活性剤としては、特に制限されないが、以下の陰イオン性、陽イオン性、両性、及び非イオン性の界面活性剤が挙げられる。
・陰イオン性：Sodium Dodecylsulfate［SDS］、Lithium Dodecyl Sulfate［LDS］、Sodium Cholate、N−Lauroylsarcosine
・陽イオン性：Cetyltrimethylammonium Bromide［CTAB］、Guanidine Thiocyanate
・両性：3−［（3−Cholamidopropyl）dimethylammonio］−1−propanesulfonate［CHAPS］
・非イオン性：Polyoxyethylene（10）Octylphenyl Ether［Triton X−100］、n−Dodecyl−β−D−maltopyranoside[DM]、Lauryldimethylamine oxide[LDAO]、Polyoxyethylene（23）Lauryl Ether［Brij35］、Decanoyl−N−methylglucamide［MEGA−10］。
Although it does not restrict | limit especially as surfactant used here, The following anionic, cationic, amphoteric, and a nonionic surfactant are mentioned.
・ Anionicity: Sodium Dodecylsulfate [SDS], Lithium Dodecyl Sulfate [LDS], Sodium Cholate, N-Lauroylsarcosine
・ Cationicity: Cetyltrimethylammonium Bromide [CTAB], Guanidine Thiocyanate
-Amphoteric: 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate [CHAPS]
Nonionic: Polyoxyethylene (10) Octylphenyl Ether [Triton X-100], n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside [DM], Lauryldimethylamine oxide [LDAO], Polyoxyethylene (23) Lauryl Ether [Brij35], Decanoyl-N -Methylglucamide [MEGA-10].
これらの界面活性剤は、単独で又は二種以上を混合して用いてもよいが、膜タンパク質を構造を保持したまま活性型で溶出するという観点から、非イオン性界面活性剤が特に好ましい。 These surfactants may be used alone or in admixture of two or more, but nonionic surfactants are particularly preferred from the viewpoint of eluting membrane proteins in an active form while retaining the structure.
また、膜タンパク質を可溶化する際に用いる溶液中の界面活性剤の濃度は、０．００１〜１質量％であることが好ましく、０．０１〜０．５質量％であることが特に好ましい。この溶液中の界面活性剤の濃度が上記下限未満では膜タンパク質が可溶化されにくくなる傾向にあり、他方、上記上限を超えると膜タンパク質の変性が生じる傾向にある。 The concentration of the surfactant in the solution used when solubilizing the membrane protein is preferably 0.001 to 1% by mass, and particularly preferably 0.01 to 0.5% by mass. When the concentration of the surfactant in the solution is less than the above lower limit, the membrane protein tends to be hardly solubilized, and when it exceeds the upper limit, the membrane protein tends to be denatured.
さらに、膜タンパク質を可溶化する際に用いる溶媒は、可溶化された膜タンパク質を前記界面活性剤と共に溶解及び／又は分散させることが可能なものであればよく、特に制限されないが、ｐＨを５〜９程度に調整した緩衝液が好適に用いられる。 Furthermore, the solvent used for solubilizing the membrane protein is not particularly limited as long as it can dissolve and / or disperse the solubilized membrane protein together with the surfactant. A buffer adjusted to about ˜9 is preferably used.
上記溶液調製工程において膜タンパク質を細胞膜から分離（抽出）させる具体的な方法や条件等も特に制限されず、例えば、前記溶液中で超音波処理によって細胞膜を破壊し、遠心分離により得た上澄み液中の膜タンパク質を超遠心分離により回収した後、前記溶液中で膜タンパク質を０〜６０℃程度で１０分〜数時間程度撹拌することによって可溶化させることができる。 The specific method and conditions for separating (extracting) the membrane protein from the cell membrane in the solution preparation step are not particularly limited. For example, the cell membrane is disrupted by sonication in the solution and the supernatant obtained by centrifugation After recovering the membrane protein by ultracentrifugation, the membrane protein can be solubilized in the solution by stirring at about 0 to 60 ° C. for about 10 minutes to several hours.
次に、本発明の膜タンパク質複合材料の製造方法においては、前記溶液調製工程において得られた溶液に前述のシリカ系メソ多孔体を懸濁させ、前記溶液中の前記膜タンパク質を前記シリカ系メソ多孔体に固定化せしめる（固定化工程）。 Next, in the method for producing a membrane protein composite material of the present invention, the silica mesoporous material is suspended in the solution obtained in the solution preparation step, and the membrane protein in the solution is suspended in the silica mesoporous material. Immobilize the porous body (immobilization step).
本発明においては、かかる固定化工程において膜タンパク質をシリカ系メソ多孔体に固定化させる際に、膜タンパク質が凝集しない範囲で界面活性剤の濃度が低濃度であることが大切であり、このような溶液中の界面活性剤の濃度は、１０−５〜０．１質量％であることが好ましく、１０−５〜１０−３質量％であることが特に好ましい。この溶液中の界面活性剤の濃度が上記下限未満では膜タンパク質が凝集してシリカ系メソ多孔体の細孔内に固定化されにくくなる傾向にあり、他方、上記上限を超えると膜タンパク質の表面に多量の界面活性剤が吸着してシリカ系メソ多孔体の細孔内に固定化されにくくなる傾向にある。 In the present invention, when the membrane protein is immobilized on the silica-based mesoporous material in the immobilization step, it is important that the concentration of the surfactant is low so long as the membrane protein does not aggregate. the concentration of surfactant in such solutions is preferably from 10 -5 to 0.1 mass%, particularly preferably 10 -5 to 10 -3% by weight. If the concentration of the surfactant in the solution is less than the above lower limit, the membrane protein tends to aggregate and become difficult to be immobilized in the pores of the silica-based mesoporous material. A large amount of the surfactant is adsorbed on the silica mesoporous material so that it is difficult to be fixed in the pores of the silica mesoporous material.
なお、前述の溶液調製工程において用いた溶液中の界面活性剤の濃度が低濃度であればそのまま固定化工程に用いてもよいが、固定化工程に先立って、膜タンパク質が凝集しない範囲で前記溶液中の界面活性剤の濃度を低濃度化せしめることが好ましい（界面活性剤除去工程）。このように界面活性剤を除去する具体的な方法としては、特に制限されないが、透析や希釈により界面活性剤濃度を低下させる方法が適宜用いられる。 In addition, as long as the concentration of the surfactant in the solution used in the above-described solution preparation step is low, it may be used as it is in the immobilization step. It is preferable to reduce the concentration of the surfactant in the solution (surfactant removal step). A specific method for removing the surfactant is not particularly limited, but a method for reducing the surfactant concentration by dialysis or dilution is appropriately used.
かかる固定化工程において用いる溶媒は、特に制限されないが、前述の溶液調製工程において用いた溶媒と同様のものでよく、ｐＨを５〜９程度に調整した緩衝液が好適に用いられる。 The solvent used in the immobilization step is not particularly limited, but may be the same as the solvent used in the solution preparation step described above, and a buffer solution having a pH adjusted to about 5 to 9 is preferably used.
また、上記溶液における膜タンパク質の濃度は特に制限されないが、０．１〜１０ｎＭ程度とすることが好ましい。さらに、固定化工程における具体的な方法や条件等は特に制限はなく、例えば、前記溶液中にシリカ系メソ多孔体を投入し、０〜１０℃程度で０．５〜５時間程度撹拌することによって膜タンパク質をシリカ系メソ多孔体に固定化せしめることができる。 The concentration of the membrane protein in the solution is not particularly limited, but is preferably about 0.1 to 10 nM. Furthermore, the specific method and conditions in the immobilization step are not particularly limited. For example, a silica-based mesoporous material is put into the solution and stirred at about 0 to 10 ° C. for about 0.5 to 5 hours. By this, the membrane protein can be immobilized on the silica-based mesoporous material.
なお、固定化工程において用いるシリカ系メソ多孔体としては、前述の通り、細孔内表面にイオン性官能基を実質的に有さないものが好ましいが、細孔内表面にイオン性官能基を有するものを用いた場合であっても、前記溶液中の塩濃度を２５ｍＭ以上（より好ましくは５０〜２００ｍＭ）とすることによって固定化される膜タンパク質の量をより向上させることが可能である。その理由は必ずしも定かではないが、シリカ系メソ多孔体の細孔内表面に存在する電荷と膜タンパク質表面に存在する電荷との間のクーロン力が塩濃度を上げることにより抑制されることによると本発明者らは推察する。このような塩としては、特に制限されないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等が挙げられる。 As described above, the silica-based mesoporous material used in the immobilization step is preferably substantially free of ionic functional groups on the pore inner surface as described above, but has an ionic functional group on the pore inner surface. Even in the case of using the one having, it is possible to further improve the amount of the membrane protein immobilized by setting the salt concentration in the solution to 25 mM or more (more preferably 50 to 200 mM). The reason is not necessarily clear, but the Coulomb force between the charge existing on the pore inner surface of the silica-based mesoporous material and the charge existing on the membrane protein surface is suppressed by increasing the salt concentration. The present inventors speculate. Such a salt is not particularly limited, and examples thereof include NaCl and KCl.
また、本発明の膜タンパク質複合材料の製造方法においては、用いるシリカ系メソ多孔体の細孔内表面に存在するイオン性官能基を予め非極性基に置換せしめておいてもよい（前処理工程）。このようにイオン性官能基を非極性基に置換する方法も特に制限されないが、例えば、シリカ系メソ多孔体の細孔内表面をトリメチルメトキシシラン等のシランカップリング剤によって処理するといった方法が適宜用いられる。 In the method for producing a membrane protein composite material of the present invention, the ionic functional group present on the pore inner surface of the silica-based mesoporous material to be used may be previously substituted with a nonpolar group (pretreatment step). ). The method of substituting the ionic functional group with a nonpolar group is not particularly limited. For example, a method of treating the inner surface of the pores of the silica-based mesoporous material with a silane coupling agent such as trimethylmethoxysilane is appropriately used. Used.
また、本発明の膜タンパク質複合材料の製造方法は、上記固定化工程の後に、更に、遠心分離等を行って膜タンパク質複合材料を溶液と分離して取り出す工程を有していてもよく、さらに、乾燥等を行って液体成分を除去した状態の膜タンパク質複合材料を得る工程を有していてもよい。 In addition, the method for producing a membrane protein composite material of the present invention may further include a step of separating the membrane protein composite material from the solution by performing centrifugation or the like after the immobilization step. The step of obtaining a membrane protein composite material in a state where the liquid component is removed by drying or the like may be provided.
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated more concretely based on an Example, this invention is not limited to a following example.
（シリカ系メソ多孔体Ａの合成）
乾燥水ガラス（ＳｉＯ2／Ｎａ2Ｏ＝２．００）を７００℃で６時間、空気中で焼成し、ジケイ酸ソーダ（δ−Ｎａ2Ｓｉ2Ｏ5）に結晶化させた。この結晶２５ｇを５００ｍＬの水に分散させ、１．５時間攪拌した。その後、濾過して固形分を回収してカネマイトを得た。こうして得られたカネマイト５．０ｇを５０ｍｌの水に分散させ、得られた分散液を５５℃に保温した。また、ドコサトリメチルアンモニウムクロライド４．０ｇを５０ｍｌの水に溶解せしめ、そこに３．０ｇのトリイソプロピルベンゼンを加えて激しく攪拌した。次に、得られた溶液と前記分散液とを混合し、攪拌しながら８０℃に昇温してそのまま８０℃で３時間攪拌しながら加熱した。加熱初期の分散液のｐＨは１２．３であった。その後８０℃で加熱、攪拌しながら２Ｎの塩酸を添加して、分散液のｐＨを８．５に下げた。そして更に８０℃で３時間加熱した後、室温まで放冷した。固形生成物を一旦濾過し、再び１０００ｍＬのイオン交換水に分散させ攪拌した。この濾過・分散攪拌を５回繰り返してから風乾した。風乾して得られた試料を、窒素中４５０℃で３時間加熱した後、空気中５５０℃で６時間焼成することにより、中心細孔直径が約８．５ｎｍのシリカ系メソ多孔体Ａを得た。
(Synthesis of silica-based mesoporous material A)
Dry water glass (SiO 2 / Na 2 O = 2.00) was calcined in air at 700 ° C. for 6 hours and crystallized into sodium disilicate (δ-Na 2 Si 2 O 5 ). 25 g of this crystal was dispersed in 500 mL of water and stirred for 1.5 hours. Thereafter, the solid content was collected by filtration to obtain kanemite. The thus obtained kanemite (5.0 g) was dispersed in 50 ml of water, and the obtained dispersion was kept at 55 ° C. In addition, 4.0 g of docosatrimethylammonium chloride was dissolved in 50 ml of water, and 3.0 g of triisopropylbenzene was added thereto and vigorously stirred. Next, the obtained solution and the dispersion were mixed, heated to 80 ° C. with stirring, and heated while stirring at 80 ° C. for 3 hours. The pH of the dispersion at the initial stage of heating was 12.3. Thereafter, 2N hydrochloric acid was added with stirring and heating at 80 ° C. to lower the pH of the dispersion to 8.5. And after heating at 80 degreeC for 3 hours, it stood to cool to room temperature. The solid product was once filtered, dispersed again in 1000 mL of ion exchange water, and stirred. This filtration and dispersion stirring was repeated 5 times and then air-dried. A sample obtained by air drying was heated at 450 ° C. in nitrogen for 3 hours and then calcined in air at 550 ° C. for 6 hours to obtain a silica-based mesoporous material A having a central pore diameter of about 8.5 nm. It was.
（シリカ系メソ多孔体Ｂの合成）
トリイソプロピルベンゼンの添加量を４．０ｇとした以外はシリカ系メソ多孔体Ａの合成と同様にして、中心細孔直径が約１０．１ｎｍのシリカ系メソ多孔体Ｂを得た。
(Synthesis of silica-based mesoporous material B)
A silica-based mesoporous material B having a central pore diameter of about 10.1 nm was obtained in the same manner as the synthesis of the silica-based mesoporous material A except that the amount of triisopropylbenzene added was 4.0 g.
（シリカ系メソ多孔体Ｃの合成）
先ず、テフロン容器中にPluronicＰ−１２３ブロック共重合体｛ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２０（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）７０（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２０Ｈ｝２．０ｇを入れ、そこに水１５ｍｌと２Ｎ ＨＣｌ ６０ｍｌとを加えて溶解した。更にそこにメシチレン１．０ｇを添加し、次いでテトラエチルオルソシリケート（ＴＥＯＳ）４．２５ｇを加えて室温で５分間攪拌した後、３０℃で２４時間攪拌し、更に８０℃の恒温槽に移して静置した。このようにして得られた固形生成物をろ過し、イオン交換水で洗浄した後、空気中において５５０℃で６時間焼成することにより、中心細孔直径が約１８．０ｎｍのシリカ系メソ多孔体Ｃを得た。なお、得られたシリカ系メソ多孔体Ｃの細孔内表面には、イオン性官能基は実質的に存在していなかった。
(Synthesis of silica-based mesoporous material C)
First, PluronicP-123 block copolymer in a Teflon vessel {HO (CH 2 CH 2 O ) 20 (
（膜タンパク質溶液の準備）
以下の表１に示す４種類の膜タンパク質を含有する溶液を準備した。なお、D1D2 cytB559は、ホウレンソウの光化学系II(PS II)のコアタンパク質である。また、Rodobactor(Rb.)sphaeroides及びThermochromatium(T.)tepidumはそれぞれ酸素非発生型光合成生物の一種である紅色光合成細菌であり、RC(Rb.sphaeroides）は前者の反応中心、RC(T.tepidum）は後者の反応中心、LHII(T.tepidum）は後者のアンテナタンパク質である。
(Preparation of membrane protein solution)
Solutions containing four types of membrane proteins shown in Table 1 below were prepared. D1D2 cytB559 is a core protein of spinach photosystem II (PS II). In addition, Rodobactor (Rb.) Sphaeroides and Thermochromatium (T.) tepidum are each a red photosynthetic bacterium that is a kind of non-oxygen-producing photosynthetic organism, and RC (Rb. Sphaeroides) is the former reaction center, RC (T. tepidum ) Is the latter reaction center, and LHII (T. tepidum) is the latter antenna protein.
RC(T.tepidum）及びLHII(T.tepidum）を含有する溶液は、それぞれ以下のようにして抽出及び精製することによって調製した。すなわち、先ず、T.tepidum cell 6mlに、20mMのTris-HCl及び0.05質量%のLDAOを含有する緩衝液(pH8.5)30mlを加えて懸濁せしめ、氷中で超音波処理（1.5min照射＋1.5min休止を8サイクル）を施した後、遠心分離（13000rpm、15min、4℃）により上澄み液を残りの沈殿物から分離した。次に、得られた上澄み液を超遠心分離（32000rpm、90min、4℃）にかけ、沈殿物を残りの上澄み液から分離した。続いて、得られた沈殿物に、LH吸収の吸光度の高い方が約50％となるように前記緩衝液（約40ml）を加えて懸濁せしめ、体積の0.25%のLDAOを更に加えて40℃で40分間攪拌し、前段の可溶化処理を施した後、超遠心分離（32000rpm、90min、4℃）によりLHII(T.tepidum）を含有する上澄み液（sup(1)）と残りの沈殿物とを分離した。さらに、得られた沈殿物に、LH吸収の吸光度の高い方が約50％となるように前記緩衝液（約30ml）を加えて懸濁せしめ、体積の0.25%のLDAOを更に加えて40℃で30分間攪拌し、後段の可溶化処理を施した後、超遠心分離（32000rpm、90min、4℃）によりRC(T.tepidum）を含有する上澄み液（sup(2)）と残りの沈殿物とを分離した。そして、得られた上澄み液（sup(1)）及び上澄み液（sup(2)）をそれぞれ陰イオン交換カラム（DEAE）にかけて精製することにより、LHII(T.tepidum）を含有する溶液及びRC(T.tepidum）を含有する溶液を得た。 Solutions containing RC (T. tepidum) and LHII (T. tepidum) were prepared by extraction and purification as follows. Specifically, first, 30 ml of a buffer solution (pH 8.5) containing 20 mM Tris-HCl and 0.05% by mass of LDAO was added to 6 ml of T. tepidum cell and suspended, followed by ultrasonication (1.5 min irradiation). After 8 cycles of a pause of +1.5 min), the supernatant was separated from the remaining precipitate by centrifugation (13000 rpm, 15 min, 4 ° C.). Next, the obtained supernatant was subjected to ultracentrifugation (32000 rpm, 90 min, 4 ° C.), and the precipitate was separated from the remaining supernatant. Subsequently, the above-mentioned buffer solution (about 40 ml) was added to the obtained precipitate so that the higher absorbance of LH absorption was about 50% and suspended, and LDAO of a volume of 0.25% was further added to add 40%. After stirring at 40 ° C for 40 minutes and applying the solubilization treatment in the previous stage, the supernatant liquid containing LHII (T.tepidum) (sup (1)) and the remaining precipitates were obtained by ultracentrifugation (32000rpm, 90min, 4 ° C). The thing was separated. Furthermore, the above-mentioned buffer solution (about 30 ml) was added to the obtained precipitate so that the higher absorbance of LH absorption was about 50%, and then suspended, and 0.25% of LDAO by volume was further added, and 40 ° C was added. After stirring for 30 minutes and solubilizing the latter stage, the supernatant (sup (2)) containing RC (T.tepidum) and the remaining precipitates by ultracentrifugation (32000rpm, 90min, 4 ℃) And separated. Then, the obtained supernatant (sup (1)) and supernatant (sup (2)) are purified through an anion exchange column (DEAE) to obtain a solution containing LHII (T. tepidum) and RC ( A solution containing T. tepidum) was obtained.
また、RC(Rb.sphaeroides）を含有する溶液は、15mMのTris-HCl及び0.06質量%のLDAOを含有する緩衝液(pH8.0)を用いるようにしたこと以外は上記と同様にして調製した。 A solution containing RC (Rb. Sphaeroides) was prepared in the same manner as described above except that a buffer solution (pH 8.0) containing 15 mM Tris-HCl and 0.06% by mass of LDAO was used. .
さらに、D1D2 cytB559を含有する溶液は、15mMのMES及び0.1質量%のDMを含有する緩衝液(pH6.5)を用いるようにしたこと以外は上記と同様にして調製した。 Further, a solution containing D1D2 cytB559 was prepared in the same manner as described above except that a buffer solution (pH 6.5) containing 15 mM MES and 0.1% by mass DM was used.
（実施例１〜２：D1D2 cytB559のシリカ系メソ多孔体への吸着試験）
15mMのMES、0.1質量%のDM、20mMのNaCl及び1mMのCaCl2を含有する緩衝液(pH6.5)を用いて得たD1D2 cytB559溶液（膜タンパク質濃度：0.1mg／ml）1mlに、1mgのシリカ系メソ多孔体Ａ（実施例１）又は1mgのシリカ系メソ多孔体Ｂ（実施例２）を加え、５℃で所定時間攪拌した。
(Examples 1-2: Adsorption test of D1D2 cytB559 on silica-based mesoporous material)
1 mg of D1D2 cytB559 solution (membrane protein concentration: 0.1 mg / ml) obtained using a buffer solution (pH 6.5) containing 15 mM MES, 0.1% by weight DM, 20 mM NaCl, and 1 mM CaCl 2 Of silica-based mesoporous material A (Example 1) or 1 mg of silica-based mesoporous material B (Example 2) was added and stirred at 5 ° C. for a predetermined time.
シリカ系メソ多孔体を添加する前のD1D2 cytB559溶液、並びにシリカ系メソ多孔体を加えて所定時間攪拌した後の上澄み液（各時間において遠心により分離）の吸収スペクトルを測定し、D1D2 cytB559の吸収スペクトルである672nmのピーク高さの経時変化を測定した。得られた結果を、シリカ系メソ多孔体を添加する前の溶液のピーク高さを１．０として吸光量（OD）を規格化し、図１に示す。 Measure the absorption spectrum of the D1D2 cytB559 solution before adding the silica-based mesoporous material and the supernatant (separated by centrifugation at each time) after adding the silica-based mesoporous material and stirring for a predetermined time, and then absorb the D1D2 cytB559. The time-dependent change in the peak height of 672 nm as a spectrum was measured. The obtained results are shown in FIG. 1, with the light absorption (OD) normalized by setting the peak height of the solution before adding the silica-based mesoporous material to 1.0.
図１に示した結果から明らかなように、D1D2 cytB559はシリカ系メソ多孔体Ａ及びシリカ系メソ多孔体Ｂのいずれにも吸着したが、中心細孔直径が約８．５nmであるシリカ系メソ多孔体Ａにより多くのD1D2 cytB559が吸着することが確認された。 As is clear from the results shown in FIG. 1, D1D2 cytB559 adsorbed to both the silica-based mesoporous material A and the silica-based mesoporous material B, but the silica-based meso having a central pore diameter of about 8.5 nm. It was confirmed that a large amount of D1D2 cytB559 was adsorbed by the porous body A.
次に、前記と同様にしてD1D2 cytB559溶液にシリカ系メソ多孔体を加え、３０時間攪拌した後のシリカ系メソ多孔体及び上澄み液の蛍光スペクトル（励起波長：430nm）を、F4500 fluorescence spectrometer(HITACHI社製)を用いて測定した。なお、シリカ系メソ多孔体の蛍光スペクトルを測定する際にはナノファインダーを使用した。得られた結果を、シリカ系メソ多孔体を添加せずに測定した前記溶液の蛍光スペクトル（コントロール）と共に図２に示す。また、図２に示した各蛍光スペクトルのピーク高さを１．０として規格化した結果を図３に示す。 Next, the silica-based mesoporous material was added to the D1D2 cytB559 solution in the same manner as described above, and the fluorescence spectrum (excitation wavelength: 430 nm) of the silica-based mesoporous material and the supernatant after stirring for 30 hours was measured using the F4500 fluorescence spectrometer (HITACHI ). A nano finder was used when measuring the fluorescence spectrum of the silica-based mesoporous material. The obtained results are shown in FIG. 2 together with the fluorescence spectrum (control) of the solution measured without adding the silica-based mesoporous material. In addition, FIG. 3 shows the result of normalization assuming that the peak height of each fluorescence spectrum shown in FIG. 2 is 1.0.
さらに、前記と同様にしてD1D2 cytB559溶液にシリカ系メソ多孔体を加え、３０時間攪拌した後のシリカ系メソ多孔体及び上澄み液の励起スペクトル（波長：680nm）を、F4500 fluorescence spectrometer(HITACHI社製)を用いて測定した。なお、シリカ系メソ多孔体の励起スペクトルを測定する際にはナノファインダーを使用した。得られた結果を図４に示す。また、図４に示した各励起スペクトルの436nmにおけるピーク高さを１．０として規格化した結果を図５に示す。 Further, the silica-based mesoporous material was added to the D1D2 cytB559 solution in the same manner as described above, and the excitation spectrum (wavelength: 680 nm) of the silica-based mesoporous material and the supernatant after stirring for 30 hours was measured using F4500 fluorescence spectrometer (manufactured by HITACHI). ). A nanofinder was used when measuring the excitation spectrum of the silica-based mesoporous material. The obtained results are shown in FIG. In addition, FIG. 5 shows the result of normalization assuming that the peak height at 436 nm of each excitation spectrum shown in FIG. 4 is 1.0.
図２〜３に示した結果から明らかなように、蛍光スペクトルの形は溶液中とシリカ系メソ多孔体中とでほとんど違いが見られないことから、D1D2 cytB559がシリカ系メソ多孔体に吸着しても、タンパク質がほどけたり、クロロフィルが抜けたりすることなく、D1D2 cytB559の構造は維持されていることが確認された。また、図４〜５に示した結果から明らかなように、励起スペクトルにおいては長波長側で強度に若干の違いが見られたものの、励起スペクトルの形も溶液中とシリカ系メソ多孔体中とでほぼ同じであることが確認された。 As is apparent from the results shown in FIGS. 2 and 3, since there is almost no difference in the shape of the fluorescence spectrum between the solution and the silica-based mesoporous material, D1D2 cytB559 adsorbs on the silica-based mesoporous material. However, it was confirmed that the structure of D1D2 cytB559 was maintained without unwinding the protein or removing chlorophyll. As is apparent from the results shown in FIGS. 4 to 5, although the excitation spectrum shows a slight difference in intensity on the long wavelength side, the shape of the excitation spectrum is also different between the solution and the silica-based mesoporous material. It was confirmed that they were almost the same.
（実施例３〜６：RC(Rb.sphaeroides）のシリカ系メソ多孔体への吸着試験）
実施例３〜４においては、15mMのTris-HCl、0.06質量%のLDAO（透析前）及び300mMのNaClを含有する緩衝液(pH8.0)を用いて得たRC(Rb.sphaeroides）溶液（膜タンパク質濃度：0.1mg／ml）0.7mlに、1mgのシリカ系メソ多孔体Ａ（実施例３）又は1mgのシリカ系メソ多孔体Ｂ（実施例４）を加え、５℃で所定時間攪拌した。
(Examples 3 to 6: Adsorption test of RC (Rb. Sphaeroides) on silica-based mesoporous material)
In Examples 3 to 4, RC (Rb. Sphaeroides) solution (pH 8.0) obtained using a buffer (pH 8.0) containing 15 mM Tris-HCl, 0.06% by mass of LDAO (before dialysis) and 300 mM NaCl. 1 mg of silica-based mesoporous material A (Example 3) or 1 mg of silica-based mesoporous material B (Example 4) was added to 0.7 ml of membrane protein concentration (0.1 mg / ml) and stirred at 5 ° C. for a predetermined time. .
また、実施例５〜６においては、15mMのTris-HCl、6×10−５質量%のLDAO（透析後）及び300mMのNaClを含有する緩衝液(pH8.0)を用いて得たRC(Rb.sphaeroides）溶液（膜タンパク質濃度：0.1mg／ml）0.7mlに、1mgのシリカ系メソ多孔体Ａ（実施例５）又は1mgのシリカ系メソ多孔体Ｂ（実施例６）を加え、５℃で所定時間攪拌した。 In Examples 5 to 6, RC (pH 8.0) obtained using a buffer (pH 8.0) containing 15 mM Tris-HCl, 6 × 10 −5 mass% LDAO (after dialysis) and 300 mM NaCl. 1 mg of silica-based mesoporous material A (Example 5) or 1 mg of silica-based mesoporous material B (Example 6) is added to 0.7 ml of Rb.sphaeroides) solution (membrane protein concentration: 0.1 mg / ml). The mixture was stirred for a predetermined time at ° C.
シリカ系メソ多孔体を添加する前のRC(Rb.sphaeroides）溶液、並びにシリカ系メソ多孔体を加えて所定時間攪拌した後の上澄み液（各時間において遠心により分離）の吸収スペクトルを測定し、RC(Rb.sphaeroides）の吸収スペクトルである800nmのピーク高さの経時変化を測定した。得られた結果を、シリカ系メソ多孔体を添加する前の溶液のピーク高さを１．０として吸光量（OD）を規格化し、図６及び図７に示す。 Before adding the silica-based mesoporous material, measure the absorption spectrum of the RC (Rb. Sphaeroides) solution, and the supernatant after adding the silica-based mesoporous material and stirring for a predetermined time (separated by centrifugation at each time), The time course of 800 nm peak height, which is the absorption spectrum of RC (Rb. Sphaeroides), was measured. The obtained results are shown in FIG. 6 and FIG. 7 by normalizing the light absorption (OD) with the peak height of the solution before adding the silica-based mesoporous material being 1.0.
図６〜７に示した結果から明らかなように、界面活性剤であるLDAOの濃度を透析によって下げると、RC(Rb.sphaeroides）の吸着量が上がることが確認された。また、RC(Rb.sphaeroides）もシリカ系メソ多孔体Ａ及びシリカ系メソ多孔体Ｂのいずれにも吸着したが、界面活性剤濃度が低い場合には中心細孔直径が約８．５nmであるシリカ系メソ多孔体Ａにより多くのRC(Rb.sphaeroides）が吸着することが確認された。 As is apparent from the results shown in FIGS. 6 to 7, it was confirmed that the amount of RC (Rb. Sphaeroides) adsorbed increased when the concentration of LDAO, which is a surfactant, was decreased by dialysis. RC (Rb. Sphaeroides) was also adsorbed to both silica-based mesoporous material A and silica-based mesoporous material B, but the center pore diameter was about 8.5 nm when the surfactant concentration was low. It was confirmed that a large amount of RC (Rb. Sphaeroides) was adsorbed by the silica-based mesoporous material A.
（実施例７：RC(T.tepidum）のシリカ系メソ多孔体への吸着試験）
20mMのTris-HCl、0.05質量%のLDAO及び200mMのNaClを含有する緩衝液(pH8.5)を用いて得たRC(T.tepidum）溶液（膜タンパク質濃度：0.1mg／ml）1mlに、1mgのシリカ系メソ多孔体Ａを加え、常温で所定時間攪拌した。
(Example 7: Adsorption test of RC (T. tepidum) on silica-based mesoporous material)
To 1 ml of RC (T. tepidum) solution (membrane protein concentration: 0.1 mg / ml) obtained using a buffer (pH 8.5) containing 20 mM Tris-HCl, 0.05 mass% LDAO and 200 mM NaCl, 1 mg of silica-based mesoporous material A was added and stirred at room temperature for a predetermined time.
シリカ系メソ多孔体を添加する前のRC(T.tepidum）溶液、並びにシリカ系メソ多孔体を加えて所定時間攪拌した後の上澄み液（各時間において遠心により分離）の吸収スペクトルを測定し、RC(T.tepidum）の吸収スペクトルである800nmのピーク高さの経時変化を測定した。得られた結果を、シリカ系メソ多孔体を添加する前の溶液のピーク高さを１．０として吸光量（OD）を規格化し、図８に示す。図８に示した結果から明らかなように、RC(T.tepidum）もシリカ系メソ多孔体Ａに吸着することが確認された。 Measure the absorption spectrum of the RC (T.tepidum) solution before adding the silica-based mesoporous material, and the supernatant (separated by centrifugation at each time) after adding the silica-based mesoporous material and stirring for a predetermined time, The time course of the peak height at 800 nm, which is the absorption spectrum of RC (T. tepidum), was measured. The obtained results are shown in FIG. 8 with normalized light absorption (OD), assuming that the peak height of the solution before adding the silica-based mesoporous material is 1.0. As is clear from the results shown in FIG. 8, it was confirmed that RC (T. tepidum) was also adsorbed on the silica-based mesoporous material A.
次に、前記と同様にしてRC(T.tepidum）溶液にシリカ系メソ多孔体を加え、更に酸化剤としてフェリシアノイドを10nM、還元剤としてアスコルビン酸を10nM添加し、数分間攪拌した後の上澄み液及びシリカ系メソ多孔体の酸化還元スペクトルを測定した。なお、シリカ系メソ多孔体の酸化還元スペクトルを測定する際にはナノファインダーを使用した。得られた結果を、酸化剤及び還元剤を添加せずに測定した酸化還元スペクトル（コントロール）と共に図９（上澄み液）及び図１０（シリカ系メソ多孔体）に示す。 Next, add the silica-based mesoporous material to the RC (T. tepidum) solution in the same manner as described above, add 10 nM ferricyanoid as the oxidizing agent and 10 nM ascorbic acid as the reducing agent, and stir the supernatant for several minutes. The redox spectra of the liquid and the silica-based mesoporous material were measured. A nanofinder was used when measuring the redox spectrum of the silica-based mesoporous material. The obtained results are shown in FIG. 9 (supernatant liquid) and FIG. 10 (silica mesoporous material) together with a redox spectrum (control) measured without adding an oxidizing agent and a reducing agent.
さらに、前記と同様にしてRC(T.tepidum）溶液にシリカ系メソ多孔体を加え、３０時間攪拌した後の上澄み液及びシリカ系メソ多孔体の光誘発スペクトルを、以下の条件下で測定した。なお、シリカ系メソ多孔体の光誘発スペクトルを測定する際にはナノファインダーを使用した。得られた結果を図１１（上澄み液）及び図１２（シリカ系メソ多孔体）に示す。
励起光：YAGレーザー（5.2mW）、
プローブ光：フラッシュランプ、
常温、メナキノン再構築済み。
Furthermore, the silica-based mesoporous material was added to the RC (T. tepidum) solution in the same manner as described above, and the light-induced spectra of the supernatant and the silica-based mesoporous material after stirring for 30 hours were measured under the following conditions. . A nano finder was used when measuring the light-induced spectrum of the silica-based mesoporous material. The obtained results are shown in FIG. 11 (supernatant liquid) and FIG. 12 (silica-based mesoporous material).
Excitation light: YAG laser (5.2mW),
Probe light: flash lamp,
Reconstructed menaquinone at room temperature.
図１１〜１２に示した結果から明らかなように、酸化還元スペクトル及び光誘発スペクトルの形はいずれも、溶液中とシリカ系メソ多孔体中とでほとんど違いが見られないことから、シリカ系メソ多孔体に吸着してもRC(T.tepidum）はその機能を損なわず、吸着後にも外部からの薬品や光によって反応を起こすことが確認された。 As apparent from the results shown in FIGS. 11 to 12, since the redox spectrum and the photo-induced spectrum have almost no difference between the solution and the silica mesoporous material, the silica meso It was confirmed that RC (T. tepidum) does not impair its function even if adsorbed on a porous material, and that it reacts with external chemicals and light after adsorption.
（実施例８〜９：LHII(T.tepidum）のシリカ系メソ多孔体への吸着試験１）
20mMのTris-HCl、0.05質量%のLDAO及び200mMのNaClを含有する緩衝液(pH8.5)を用いて得たLHII(T.tepidum）溶液（膜タンパク質濃度：0.1mg／ml）1mlに、1mgのシリカ系メソ多孔体A（実施例８）又は1mgのシリカ系メソ多孔体C（実施例９）を加え、５℃で所定時間攪拌した。
(Examples 8 to 9: LHII (T. tepidum) adsorption test 1 on silica-based mesoporous material)
To 1 ml of LHII (T.tepidum) solution (membrane protein concentration: 0.1 mg / ml) obtained using a buffer solution (pH 8.5) containing 20 mM Tris-HCl, 0.05 mass% LDAO and 200 mM NaCl, 1 mg of silica-based mesoporous material A (Example 8) or 1 mg of silica-based mesoporous material C (Example 9) was added and stirred at 5 ° C. for a predetermined time.
実施例８においては、シリカ系メソ多孔体を添加する前のLHII(T.tepidum）溶液、並びにシリカ系メソ多孔体を加えて所定時間攪拌した後の上澄み液（各時間において遠心により分離）の吸収スペクトルを測定し、LHII(T.tepidum）の吸収スペクトルである800nmのピーク高さの経時変化を測定した。得られた結果を図１３に示す。 In Example 8, the LHII (T. tepidum) solution before the addition of the silica-based mesoporous material and the supernatant liquid (separated by centrifugation at each time) after adding the silica-based mesoporous material and stirring for a predetermined time. The absorption spectrum was measured, and the change over time in the peak height of 800 nm, which is the absorption spectrum of LHII (T. tepidum), was measured. The obtained result is shown in FIG.
また、実施例９においては、シリカ系メソ多孔体を添加する前のLHII(T.tepidum）溶液、並びにシリカ系メソ多孔体を加えて２時間攪拌した後の上澄み液の吸収スペクトルを測定し、得られた結果を図１４に示す。 In Example 9, the absorption spectrum of the supernatant liquid after adding the LHII (T. tepidum) solution before adding the silica-based mesoporous material and stirring the silica-based mesoporous material for 2 hours was measured. The obtained result is shown in FIG.
図１３〜１４に示した結果から明らかなように、LHII(T.tepidum）はシリカ系メソ多孔体A及びシリカ系メソ多孔体Cのいずれにも吸着したが、細孔内表面にイオン性官能基が実質的に存在しないシリカ系メソ多孔体Cに対しては非常に吸着性が高いことが確認された。 As is apparent from the results shown in FIGS. 13 to 14, LHII (T. tepidum) was adsorbed on both the silica-based mesoporous material A and the silica-based mesoporous material C, but the ionic functional group was present on the pore inner surface. It was confirmed that the adsorptivity to the silica-based mesoporous material C substantially free of groups was very high.
（実施例１０：LHII(T.tepidum）のシリカ系メソ多孔体への吸着試験２）
20mMのTris-HCl、0.05質量%のLDAO及び0〜200mMのNaClを含有する緩衝液(pH8.5)を複数準備し、それらを用いて得た各LHII(T.tepidum）溶液（膜タンパク質濃度：0.1mg／ml）1mlに、1mgのシリカ系メソ多孔体Aをそれぞれ加え、常温で２時間攪拌した。
(Example 10:
Prepare multiple buffers (pH8.5) containing 20 mM Tris-HCl, 0.05 mass% LDAO and 0-200 mM NaCl, and use each of these to obtain each LHII (T.tepidum) solution (membrane protein concentration). : 0.1 mg / ml) 1 mg of silica-based mesoporous material A was added to each 1 ml and stirred at room temperature for 2 hours.
各塩濃度の緩衝液を用いた場合について、シリカ系メソ多孔体を添加する前のLHII(T.tepidum）溶液とシリカ系メソ多孔体を加えて２時間攪拌した後の上澄み液の吸収スペクトルを測定し、LHII(T.tepidum）の吸収スペクトルである800nmのピーク高さの減少量を測定した。得られた結果を、塩濃度が200mMの場合におけるピーク高さの減少量を１．０として吸光量（OD）を規格化し、図１５に示す。図１５に示した結果から明らかなように、溶液中の塩濃度が高い方がより多くのLHII(T.tepidum）がシリカ系メソ多孔体Aに吸着することが確認された。 The absorption spectrum of the supernatant after adding the LHII (T.tepidum) solution and the silica-based mesoporous material before adding the silica-based mesoporous material and stirring for 2 hours for each salt concentration buffer solution. The amount of decrease in peak height at 800 nm, which is an absorption spectrum of LHII (T. tepidum), was measured. The obtained results are shown in FIG. 15, with the amount of decrease in peak height when the salt concentration is 200 mM being 1.0 and the amount of light absorption (OD) normalized. As is clear from the results shown in FIG. 15, it was confirmed that more LHII (T. tepidum) was adsorbed on the silica-based mesoporous material A when the salt concentration in the solution was higher.
（実施例１１〜１２及び比較例１：LHII(T.tepidum）のシリカ系メソ多孔体への吸着試験３）
20mMのTris-HCl、0.05質量%のLDAO及び200mMのNaClを含有する緩衝液(pH8.5)を用いて、LHII(T.tepidum）を2mg含有する溶液（実施例１１）、LHII(T.tepidum）を20mg含有する溶液（実施例１２）、及びLHII(T.tepidum）を含有しない溶液（比較例１）を得た。次に、各溶液10mlに、20mgのシリカ系メソ多孔体Aをそれぞれ加え、常温で２時間攪拌した。
(Examples 11 to 12 and Comparative Example 1:
Using a buffer solution (pH 8.5) containing 20 mM Tris-HCl, 0.05 mass% LDAO and 200 mM NaCl, a solution containing 2 mg of LHII (T. tepidum) (Example 11), LHII (T. A solution containing 20 mg of tepidum (Example 12) and a solution not containing LHII (T. tepidum) (Comparative Example 1) were obtained. Next, 20 mg of silica-based mesoporous material A was added to 10 ml of each solution and stirred at room temperature for 2 hours.
次いで、得られたシリカ系メソ多孔体を遠心分離により沈殿させ、上澄み液を除いてシリカ系メソ多孔体のみにし、その表面に吸着している膜タンパク質を除くために純水で洗った後、シリカ系メソ多孔体を乾燥させた。そして、得られたシリカ系メソ多孔体を液体窒素温度（−１９６℃）に冷却して窒素ガスを導入し、定容量法によりその吸着量を求め、次いで、導入する窒素ガスの圧力を徐々に増加させ、各平衡圧に対する窒素ガス吸着量をプロットして窒素吸着等温線を得た。得られた結果を図１６に示す。 Next, the obtained silica-based mesoporous material is precipitated by centrifugation, and only the silica-based mesoporous material is removed by removing the supernatant, and after washing with pure water to remove the membrane protein adsorbed on the surface, The silica-based mesoporous material was dried. Then, the obtained silica-based mesoporous material is cooled to a liquid nitrogen temperature (−196 ° C.), nitrogen gas is introduced, the adsorption amount is determined by a constant volume method, and then the pressure of the introduced nitrogen gas is gradually increased. The nitrogen adsorption isotherm was obtained by plotting the nitrogen gas adsorption amount against each equilibrium pressure. The obtained results are shown in FIG.
図１６に示した結果から明らかなように、シリカ系メソ多孔体に吸着させる膜タンパク質の量を変えた際に窒素吸着量も変化したことから、次の二つの可能性が考えられた。すなわち、その一つはシリカ系メソ多孔体の細孔に膜タンパク質が蓋をする形で吸着した可能性であり、もう一つはシリカ系メソ多孔体の細孔内に膜タンパク質が吸着した可能性である。しかし、これらの実施例で用いた膜タンパク質の量とシリカ系メソ多孔体の表面積を考慮すると、前者のように細孔に蓋をする形で吸着したのでは吸着しきれないことから、後者のように膜タンパク質は細孔内に吸着していることが確認された。 As is clear from the results shown in FIG. 16, the amount of nitrogen adsorbed changed when the amount of membrane protein adsorbed on the silica-based mesoporous material was changed, so the following two possibilities were considered. That is, one is the possibility that the membrane protein is adsorbed on the pores of the silica-based mesoporous material, and the other is the possibility that the membrane protein is adsorbed inside the pores of the silica-based mesoporous material. It is sex. However, considering the amount of membrane protein used in these examples and the surface area of the silica-based mesoporous material, the latter cannot be adsorbed by adsorbing the pores as in the former, so the latter Thus, it was confirmed that the membrane protein was adsorbed in the pores.
（実施例１３：LHII(T.tepidum）のシリカ系メソ多孔体への吸着試験４）
20mMのTris-HCl、0.05質量%のLDAO及び200mMのNaClを含有する緩衝液(pH8.5)を用いて得たLHII(T.tepidum）溶液（膜タンパク質濃度：0.2mg／ml）1mlに、1mgのシリカ系メソ多孔体Aを加え、常温で所定時間攪拌した。
(Example 13: Adsorption test 4 of LHII (T. tepidum) on silica-based mesoporous material)
To 1 ml of LHII (T. tepidum) solution (membrane protein concentration: 0.2 mg / ml) obtained using a buffer solution (pH 8.5) containing 20 mM Tris-HCl, 0.05 mass% LDAO and 200 mM NaCl, 1 mg of silica-based mesoporous material A was added and stirred at room temperature for a predetermined time.
シリカ系メソ多孔体を添加する前のLHII(T.tepidum）溶液、並びにシリカ系メソ多孔体を加えて所定時間攪拌した後の上澄み液及びシリカ系メソ多孔体の吸収スペクトルを測定した。なお、上澄み液の吸収スペクトルを測定する際にはMilton roy、シリカ系メソ多孔体の吸収スペクトルを測定する際にはナノファインダーを使用した。得られた結果を図１７（上澄み液）及び図１８（シリカ系メソ多孔体）に示す。 The absorption spectra of the LHII (T. tepidum) solution before addition of the silica-based mesoporous material and the supernatant after adding the silica-based mesoporous material and stirring for a predetermined time and the silica-based mesoporous material were measured. Note that Milton roy was used when measuring the absorption spectrum of the supernatant, and a nanofinder was used when measuring the absorption spectrum of the silica-based mesoporous material. The obtained results are shown in FIG. 17 (supernatant liquid) and FIG. 18 (silica-based mesoporous material).
図１７〜１８に示した結果から明らかなように、吸収スペクトルの形は溶液中とシリカ系メソ多孔体中とでほとんど違いが見られず、いずれにも800〜850nmのスペクトルのピークが確認されることから、LHII(T.tepidum）がシリカ系メソ多孔体に吸着しても、LHII特有のリング構造は保持されており、吸着による大きな構造変化はなかったことが確認された。 As apparent from the results shown in FIGS. 17 to 18, the shape of the absorption spectrum shows almost no difference between the solution and the silica-based mesoporous material, and a spectrum peak of 800 to 850 nm is confirmed in both cases. Therefore, it was confirmed that even when LHII (T. tepidum) was adsorbed on the silica-based mesoporous material, the ring structure peculiar to LHII was retained and there was no significant structural change due to adsorption.
さらに、シリカ系メソ多孔体を加えて２時間攪拌した後の上澄み液及びシリカ系メソ多孔体の蛍光スペクトルを測定した。なお、励起波長は488nm、測定装置はストリークカメラを使用した。得られた結果を図１９（上澄み液）及び図２０（シリカ系メソ多孔体）に示す。 Furthermore, the fluorescence spectrum of the supernatant after adding the silica-based mesoporous material and stirring for 2 hours and the silica-based mesoporous material were measured. The excitation wavelength was 488 nm, and a streak camera was used as the measurement apparatus. The obtained results are shown in FIG. 19 (supernatant liquid) and FIG. 20 (silica-based mesoporous material).
図１９〜２０に示した結果から明らかなように、シリカ系メソ多孔体に吸着するとLHII(T.tepidum）のピーク波長が若干長波長側にシフトしており、770nm付近のスペクトルの形も異なっていた。図２１に示すように、溶液中のLHII(T.tepidum）のピーク波長が低温になるほど長波長側にシフトすることは既に確認されており、770nm付近のスペクトルの形も低温になると同様に変化することが知られている。このことから、LHII(T.tepidum）はシリカ系メソ多孔体に吸着されることによってかなり強く束縛され、分子運動が制限されている可能性が高いことが確認された。 As is apparent from the results shown in FIGS. 19 to 20, the peak wavelength of LHII (T. tepidum) is slightly shifted to the longer wavelength side when adsorbed on the silica-based mesoporous material, and the spectrum shape near 770 nm is also different. It was. As shown in FIG. 21, it has already been confirmed that the peak wavelength of LHII (T. tepidum) in the solution shifts to the longer wavelength side as the temperature decreases, and the shape of the spectrum near 770 nm changes in the same way as the temperature decreases. It is known to do. From this, it was confirmed that LHII (T. tepidum) is quite strongly bound by being adsorbed on the silica-based mesoporous material, and the molecular motion is likely to be restricted.
（実施例１４：LHII(T.tepidum）のシリカ系メソ多孔体への吸着試験５）
20mMのTris-HCl、0.05質量%のLDAO及び200mMのNaClを含有する緩衝液(pH8.5)を用いて得たLHII(T.tepidum）溶液（膜タンパク質濃度：0.2mg／ml）1mlに、1mgのシリカ系メソ多孔体Aを加え、５℃で２時間攪拌した。
(Example 14: Adsorption test 5 of LHII (T. tepidum) on silica-based mesoporous material)
To 1 ml of LHII (T. tepidum) solution (membrane protein concentration: 0.2 mg / ml) obtained using a buffer solution (pH 8.5) containing 20 mM Tris-HCl, 0.05 mass% LDAO and 200 mM NaCl, 1 mg of silica-based mesoporous material A was added and stirred at 5 ° C. for 2 hours.
次に、シリカ系メソ多孔体を加えて所定時間攪拌した後の上澄み液及びシリカ系メソ多孔体をそれぞれ所定の温度に加熱し、１０分保持した後、１０℃まで温度を下げてそれらの吸収スペクトルを測定した。なお、上澄み液の吸収スペクトルを測定する際にはMilton roy、シリカ系メソ多孔体の吸収スペクトルを測定する際にはナノファインダーを使用した。得られた結果を図２２（上澄み液）及び図２３（シリカ系メソ多孔体）に示す。また、図２２〜２３に示した吸収スペクトルにおける855nmのピーク高さを、１０℃の時のピーク高さを１．０として吸光量（OD）を規格化した結果を図２４に示す。 Next, after adding the silica-based mesoporous material and stirring for a predetermined time, the supernatant and the silica-based mesoporous material are each heated to a predetermined temperature and held for 10 minutes, and then the temperature is lowered to 10 ° C. to absorb them. The spectrum was measured. Note that Milton roy was used when measuring the absorption spectrum of the supernatant, and a nanofinder was used when measuring the absorption spectrum of the silica-based mesoporous material. The obtained results are shown in FIG. 22 (supernatant liquid) and FIG. 23 (silica-based mesoporous material). In addition, FIG. 24 shows the result of normalizing the light absorption (OD) with the peak height at 855 nm in the absorption spectra shown in FIGS.
LHII(T.tepidum）では855nmの長波長バンドの消失が膜タンパク質が壊れたことを示すことから、図２２〜２４に示した結果から明らかなように、LHII(T.tepidum）は溶液中においては50℃を過ぎたあたりから急激に吸収が減少してタンパク質が破壊されている。それに対して、シリカ系メソ多孔体に吸着されているLHII(T.tepidum）においては、70℃においても約80％のタンパク質が保持されており、LHII(T.tepidum）はシリカ系メソ多孔体に吸着されることによって熱に対する安定性が非常に高くなったことが確認された。 In LHII (T. tepidum), the disappearance of the long wavelength band of 855 nm indicates that the membrane protein was broken. Therefore, as is clear from the results shown in FIGS. The protein has been destroyed due to a sudden decrease in absorption from around 50 ° C. In contrast, LHII (T. tepidum) adsorbed on silica-based mesoporous material retains about 80% of the protein even at 70 ° C, and LHII (T.tepidum) is silica-based mesoporous material. It was confirmed that the stability to heat became very high by being adsorbed on the surface.
（実施例１５：LHII(T.tepidum）のシリカ系メソ多孔体への吸着試験６）
20mMのTris-HCl、0.05質量%のLDAO及び200mMのNaClを含有する緩衝液(pH8.5)を用いて得たLHII(T.tepidum）溶液（膜タンパク質濃度：0.2mg／ml）1mlに、1mgのシリカ系メソ多孔体Aを加え、５℃で２時間攪拌した。
(Example 15: Adsorption test of LHII (T. tepidum) on silica-based mesoporous material 6)
To 1 ml of LHII (T. tepidum) solution (membrane protein concentration: 0.2 mg / ml) obtained using a buffer solution (pH 8.5) containing 20 mM Tris-HCl, 0.05 mass% LDAO and 200 mM NaCl, 1 mg of silica-based mesoporous material A was added and stirred at 5 ° C. for 2 hours.
次に、シリカ系メソ多孔体を加えて所定時間攪拌した後の上澄み液及びシリカ系メソ多孔体をそれぞれ所定の温度に加熱し、１０分保持した後、その温度でそれらの吸収スペクトルを測定した。なお、上澄み液の吸収スペクトルを測定する際にはMilton roy、シリカ系メソ多孔体の吸収スペクトルを測定する際にはナノファインダーを使用した。得られた結果を図２５（上澄み液）及び図２６（シリカ系メソ多孔体）に示す。また、図２５〜２６に示した吸収スペクトルにおいて１０℃では855nmにあるピークバンドの温度上昇に伴うバンドシフトを測定し、得られた結果を図２７に示す。なお、バンドシフトの測定の際には、吸収スペクトルをそれぞれガウシアンフィッティングして求めた。 Next, after adding the silica-based mesoporous material and stirring for a predetermined time, the supernatant and the silica-based mesoporous material were each heated to a predetermined temperature and held for 10 minutes, and then their absorption spectra were measured at that temperature. . Note that Milton roy was used when measuring the absorption spectrum of the supernatant, and a nanofinder was used when measuring the absorption spectrum of the silica-based mesoporous material. The obtained results are shown in FIG. 25 (supernatant liquid) and FIG. 26 (silica-based mesoporous material). In addition, in the absorption spectra shown in FIGS. 25 to 26, the band shift accompanying the temperature increase of the peak band at 855 nm at 10 ° C. was measured, and the obtained results are shown in FIG. When measuring the band shift, each absorption spectrum was obtained by Gaussian fitting.
図２５〜２７に示した結果から明らかなように、LHII(T.tepidum）の吸収スペクトルは温度の上昇に伴って長波長バンドが短波長側にシフトすることが確認されたが、溶液中の場合とシリカ系メソ多孔体に吸着されている場合とではバンドシフトの仕方が異なることが確認された。すなわち、一般にLHIIの800〜850と呼ばれるリング構造において、850nm側は励起子状態がリング全体に広がっていることから現れるバンドだと考えられており、温度上昇によりリングを構成するBChl-BChl間のエネルギー順位が熱揺らぎのため等しくなくなり、励起子状態が局在化するために起こると考えられている。したがって、上記のようにバンドシフトの仕方が異なることからも、シリカ系メソ多孔体への吸着によりLHII(T.tepidum）の分子運動が抑制されている可能性が高いことが確認された。 As is clear from the results shown in FIGS. 25 to 27, the absorption spectrum of LHII (T. tepidum) was confirmed to shift the long wavelength band to the short wavelength side as the temperature increased. It was confirmed that the method of band shift differs between the case and the case where it is adsorbed on the silica-based mesoporous material. That is, in the ring structure generally called LHII 800-850, the 850 nm side is considered to be a band that appears from the fact that the exciton state spreads throughout the ring, and between BChl-BChl constituting the ring due to temperature rise It is thought that this occurs because the energy order becomes unequal due to thermal fluctuation and the exciton state is localized. Therefore, it was confirmed that the molecular motion of LHII (T. tepidum) is highly likely to be suppressed by the adsorption to the silica-based mesoporous material because the band shift method is different as described above.
以上説明したように、本発明によれば、従来はシリカ系メソ多孔体等の担体と複合化することはできないと考えられてきた膜タンパク質がその機能を阻害されることなくかつ安定的にシリカ系メソ多孔体に固定化されており、熱等に対する安定性が高くかつ膜タンパク質が有する機能を発現することが可能な膜タンパク質複合材料を提供することが可能となる。したがって、本発明の膜タンパク質複合材料は、膜タンパク質が有する機能を利用した各種の機能性材料として非常に有用である。 As described above, according to the present invention, a membrane protein, which has been considered to be unable to be complexed with a carrier such as a silica-based mesoporous material, can be stably and stably prevented from inhibiting its function. It is possible to provide a membrane protein composite material that is immobilized on a porous mesoporous material, has high stability to heat and the like, and can express the function of the membrane protein. Therefore, the membrane protein composite material of the present invention is very useful as various functional materials utilizing the functions of the membrane protein.
Claims (9)
前記溶液にシリカ系メソ多孔体を懸濁させ、前記溶液中の前記膜タンパク質を前記シリカ系メソ多孔体に固定化せしめる固定化工程と、
を含むことを特徴とする膜タンパク質複合材料の製造方法。 A solution preparation step of preparing a solution in which a membrane protein is dissolved and / or dispersed in a solution containing a surfactant;
An immobilization step of suspending the silica-based mesoporous material in the solution and immobilizing the membrane protein in the solution on the silica-based mesoporous material;
A method for producing a membrane protein composite material, comprising:
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