JP2006137775A - COMPOSITION FOR ACTIVATING NKT CELL, COMPOSITION FOR PROMOTING IL-4 PRODUCTION, COMPOSITION FOR PROMOTING IFN-gamma PRODUCTION, COMPOSITION FOR ACTIVATING DENDRITIC CELL, COMPOSITION FOR PROMOTING IL-12 PRODUCTION, COMPOSITION FOR PROMOTING IL-10 PRODUCTION, COMPOSITION FOR ACTIVATING NK CELL, COMPOSITION FOR ANTITUMOR ACTION, COMPOSITION FOR ANTIALLERGIC ACTION, COMPOSITION FOR REINFORCING INFECTION RESISTANCE, COMPOSITION FOR ANTIVIRAL ACTION, COMPOSITION FOR PROMOTING IL-6 PRODUCTION, AND COMPOSITION FOR PROMOTING NO PRODUCTION - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain an effective composition for activating NKT cells, and the like. <P>SOLUTION: The composition for activating NKT cells is characterized by containing sphingoglycolipid having a structure represented by formula (1). In formula (1), R<SP>1</SP>is formula (1-1) (wherein R<SP>3</SP>is an alkyl or alkenyl; and R<SP>4</SP>is an alkyl) and R<SP>2</SP>is H or a group comprising a combination of α-galactose, α-glucose, α-mannose, and the like. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本願発明は、特定の構造からなるスフィンゴ糖脂質を含むＮＫＴ細胞活性化用組成物、ＩＬ−４産生促進用組成物、ＩＦＮ−γ産生促進用組成物、樹状細胞活性化用組成物、ＩＬ−１２産生促進用組成物、ＩＬ−１０産生促進用組成物、ＮＫ細胞活性化用組成物、抗腫瘍作用組成物、抗アレルギー作用組成物、感染抵抗性増強用組成物、抗ウイルス作用組成物、ＩＬ−６産生促進用組成物、ＮＯ産出促進用組成物に関する。  The present invention includes a composition for activating NKT cells comprising a glycosphingolipid having a specific structure, a composition for promoting IL-4 production, a composition for promoting IFN-γ production, a composition for activating dendritic cells, IL -12 production promoting composition, IL-10 production promoting composition, NK cell activation composition, antitumor composition, antiallergic composition, infection resistance enhancing composition, antiviral composition The present invention relates to a composition for promoting IL-6 production and a composition for promoting NO production.

従来から、スフィンゴ糖脂質は動物細胞等の表層に存在している物質であり、認識機構に関与するものと考えられている。一方、グラム陰性細菌はその細胞表層に、リポ多糖、蛋白質及びリン酸よりなる外膜を持っており、これを介して外界とのやりとりを行っている。従って、外膜の主要成分であるリポ多糖は全てのグラム陰性菌に共通に存在し、必須なものであると考えられてきた。ところが、近年になって、好気性グラム陰性菌であって、以前シュードモナス パウシモビリス（Pseudomonas paucimobilis）と呼ばれていたスフィンゴモナス パウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）は、リポ多糖を全く保有しないこと及びこの菌は菌体脂質としてスフィンゴ糖脂質を含有していることが知られてきた。
そこで、本願出願人は、上記スフィンゴモナス パウシモビリスの菌体から糖脂質を単離し、さらに、その化学構造を解析し、同定することに成功している（特許文献１）。そして、本願出願人は、上記スフィンゴ糖脂質が優れた保湿効果と肌荒れ防止効果を有しているため化粧品として広く採用しうることを開示している（特許文献２）。加えて、本願出願人は、上記スフィンゴ糖脂質が優れた乳化作用を有することも明らかにしている（特許文献３）。
加えて、本願出願人は、他のスフィンゴモナス科の菌株から得られたスフィンゴ糖脂質についても化粧組成物及び医薬組成物として優れていることを開示している（特許文献４）。 Conventionally, glycosphingolipids are substances present in the surface layer of animal cells and the like, and are considered to be involved in the recognition mechanism. On the other hand, Gram-negative bacteria have an outer membrane made of lipopolysaccharide, protein and phosphate on the cell surface, and exchange with the outside world through this. Therefore, lipopolysaccharide, which is a major component of the outer membrane, is common to all gram-negative bacteria and has been considered essential. However, in recent years, an aerobic gram-negative bacterium, formerly called Pseudomonas paucimobilis, does not possess any lipopolysaccharide and is not It has been known that glycosphingolipids are contained as lipids.
Accordingly, the applicant of the present application has succeeded in isolating glycolipids from the cells of Sphingomonas pausobibilis and analyzing and identifying the chemical structure (Patent Document 1). The applicant of the present application discloses that the glycosphingolipid can be widely used as a cosmetic because it has an excellent moisturizing effect and skin roughening preventing effect (Patent Document 2). In addition, the present applicant has also revealed that the glycosphingolipid has an excellent emulsifying action (Patent Document 3).
In addition, the applicant of the present application discloses that glycosphingolipids obtained from other strains of the family Sphingomonas are also excellent as cosmetic compositions and pharmaceutical compositions (Patent Document 4).

一方、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現するＮＫＴ細胞は、Ｌａｒｇｅ Ｇｒａｎｕｌａｒ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ（ＬＧＬ）様の形態を示すこと、ＩＬ−２Ｒ β鎖を常時表出すること、パーフォリンを有する点などでは、ＮＫ細胞と類縁の細胞であるが、ＴＣＲを有するという点でＮＫ細胞とは決定的に異なる細胞群であることが報告されている（非特許文献１）。
かかる状況のもと、非特許文献２、非特許文献３には、マウスではＩＬ−１２により活性化されたＴ細胞の中でもＮＫ１．１を発現しているＮＫＴ細胞が、腫瘍の肝臓や肺への血行性転移抑制の重要なエフェクター細胞であることが報告されている。
以上のように、このＮＫＴ細胞は、近年、新しい細胞群として非常に注目を集めている細胞群である。
さらに特許文献５は、特定の構造を有するα−グリコシルセラミドがＮＫＴ細胞活性剤として有効であると述べている。しかしながら、より効果的なＮＫＴ細胞活性化剤が求められている。 On the other hand, NKT cells expressing the T cell receptor (TCR) have a large-granular lymphocyte (LGL) -like form, constantly express the IL-2R β chain, and have perforin. Although it is a similar cell, it has been reported that it is a cell group that is decisively different from NK cells in that it has a TCR (Non-patent Document 1).
Under such circumstances, Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3 show that among T cells activated by IL-12 in mice, NKT cells expressing NK1.1 are transferred to tumor liver and lung. It has been reported to be an important effector cell for the suppression of hematogenous metastasis.
As described above, this NKT cell is a cell group that has attracted much attention in recent years as a new cell group.
Further, Patent Document 5 states that α-glycosylceramide having a specific structure is effective as an NKT cell activator. However, there is a need for more effective NKT cell activators.

国際公開９２／１２９８６号公報International Publication No. 92/12986 特開平１１−４３４３７号公報Japanese Patent Laid-Open No. 11-43437 特開２０００−５１６７６号公報JP 2000-51676 A 特開２００２−０１０７９７号公報Japanese Patent Laid-Open No. 2002-010797 国際公開９８／４４９２８号公報International Publication No. 98/44928 J．Immunol.，155，2972（1995）J. Immunol., 155, 2972 (1995) J．Immunol.，154，4333(1995)J. Immunol., 154, 4333 (1995) J. Immunol.，88，82(1996)J. Immunol., 88, 82 (1996)

本願発明の目的は、上記課題を解決することであって、より効果的なＮＫＴ細胞活性化用組成物を提供することを目的とする。さらに、スフィンゴ糖脂質を含むＩＬ−４産生促進用組成物、ＩＦＮ−γ産生促進用組成物、樹状細胞活性化用組成物、ＩＬ−１２産生促進用組成物、ＩＬ−１０産生促進用組成物、ＮＫ細胞活性化用組成物、抗腫瘍作用組成物、抗アレルギー作用組成物、感染抵抗性増強用組成物、抗ウイルス作用組成物、ＩＬ−６産生促進用組成物、ＮＯ産出促進用組成物を提供することを目的とする。   The object of the present invention is to solve the above-mentioned problems, and to provide a more effective composition for activating NKT cells. Furthermore, a composition for promoting IL-4 production, a composition for promoting IFN-γ production, a composition for activating dendritic cells, a composition for promoting IL-12 production, and a composition for promoting IL-10 production, comprising glycosphingolipids , NK cell activation composition, antitumor composition, antiallergic composition, infection resistance enhancing composition, antiviral composition, IL-6 production promoting composition, NO production promoting composition The purpose is to provide goods.

上記課題のもと、本願発明者は下記手段により上記課題を解決しうることを見出した。
（１）下記式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＮＫＴ細胞活性化用組成物。
式（１）

（式（１）中、Ｒ¹は、下記式（１−１）
式（１−１）

（式（１−１）中、Ｒ³は、アルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ⁴は、アルキル基である。）を表し、
Ｒ²は、水素原子または、α−ガラクトース基、α−グルコース基、α−マンノース基、α−グルコサミン基若しくはβ−グルコサミン基またはこれらの組み合わせからなる基である。）
（２）前記式（１）は、下記式（３）で表される、（１）に記載のＮＫＴ細胞活性化用組成物。
式（３）

（式（３）中、Ｒ⁵は、下記Ｒ⁵¹、Ｒ⁵²、Ｒ⁵³、Ｒ⁵⁴、Ｒ⁵⁵、Ｒ⁵⁶、Ｒ⁵⁷、Ｒ⁵⁸、Ｒ⁵⁹、Ｒ⁷⁰、Ｒ⁷¹、Ｒ⁷²、Ｒ⁷³、Ｒ⁷⁴、Ｒ⁷⁵、Ｒ⁷⁶、Ｒ⁷⁷又はＲ⁷⁸を表し、Ｒ⁶は、水素原子、Ｒ⁶²、Ｒ⁶³、Ｒ⁶⁴又はＲ⁶⁵を表す。）

Based on the above problems, the present inventors have found that the above problems can be solved by the following means.
(1) A composition for activating NKT cells, comprising a glycosphingolipid having a structure represented by the following formula (1).
Formula (1)

(In the formula (1), R ¹ represents the following formula (1-1)
Formula (1-1)

(In Formula (1-1), R ³ is an alkyl group or an alkenyl group, and R ⁴ is an alkyl group),
R ² is a hydrogen atom or an α-galactose group, an α-glucose group, an α-mannose group, an α-glucosamine group, a β-glucosamine group, or a combination thereof. )
(2) The composition for NKT cell activation according to (1), wherein the formula (1) is represented by the following formula (3).
Formula (3)

(In the formula (3), R ⁵ represents the following R ⁵¹ , R ⁵² , R ⁵³ , R ⁵⁴ , R ⁵⁵ , R ⁵⁶ , R ⁵⁷ , R ⁵⁸ , R ⁵⁹ , R ⁷⁰ , R ⁷¹ , R ⁷² , R ^73. R ⁷⁴ , R ⁷⁵ , R ⁷⁶ , R ⁷⁷ or R ⁷⁸ , and R ⁶ represents a hydrogen atom, R ⁶² , R ⁶³ , R ⁶⁴ or R ^65. )

（３）式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＩＬ−４産生促進用組成物。
（４）前記式（１）は、式（３）で表される、（３）に記載のＩＬ−４産生促進用組成物。
（５）式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＩＦＮ−γ産生促進用組成物。
（６）前記式（１）は、式（３）で表される、（５）に記載のＩＦＮ−γ産生促進用組成物。
（７）式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とする樹状細胞活性化用組成物。
（８）式（１）は、式（３）で表される、（７）に記載の樹状細胞活性化用組成物。
（９）式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＩＬ−１２産生促進用組成物。
（１０）式（１）は、式（３）で表される、（９）に記載のＩＬ−１２産生促進用組成物。
（１１）式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＩＬ−１０産生促進用組成物。
（１２）式（１）は、式（３）で表される、（１１）に記載のＩＬ−１０産生促進用組成物。
（１３）式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＮＫ細胞活性化用組成物。
（１４）式（１）は、式（３）で表される、（１３）に記載のＮＫ細胞活性化用組成物。
（１５）式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とする抗腫瘍作用組成物。
（１６）式（１）は、式（３）で表される、（１５）に記載の抗腫瘍作用組成物。
（１７）式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とする抗アレルギー作用組成物。
（１８）式（１）は、式（３）で表される、（１７）に記載の抗アレルギー作用組成物。
（１９）式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とする感染抵抗性増強用組成物。
（２０）式（１）は、式（３）で表される、（１９）に記載の感染抵抗性増強用組成物。
（２１）式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とする抗ウイルス作用組成物。
（２２）式（１）は、式（３）で表される、（２１）に記載の抗ウイルス作用組成物。
（２３）式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＩＬ−６産生促進用組成物。
（２４）式（１）は、式（３）で表される、（２３）に記載のＩＬ−６産生促進用組成物。
（２５）式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＮＯ産出促進用組成物。
（２６）式（１）は、式（３）で表される、（２５）に記載のＮＯ産出促進用組成物。 (3) A composition for promoting IL-4 production, comprising a glycosphingolipid having a structure represented by formula (1).
(4) The composition for promoting IL-4 production according to (3), wherein the formula (1) is represented by the formula (3).
(5) A composition for promoting IFN-γ production, comprising a glycosphingolipid having a structure represented by the formula (1).
(6) The composition for promoting IFN-γ production according to (5), wherein the formula (1) is represented by the formula (3).
(7) A composition for activating dendritic cells, comprising a glycosphingolipid having a structure represented by the formula (1).
(8) The composition for activating dendritic cells according to (7), wherein formula (1) is represented by formula (3).
(9) A composition for promoting IL-12 production, comprising a glycosphingolipid having a structure represented by formula (1).
(10) The composition for promoting IL-12 production according to (9), wherein formula (1) is represented by formula (3).
(11) A composition for promoting IL-10 production, comprising a glycosphingolipid having a structure represented by formula (1).
(12) The composition for promoting IL-10 production according to (11), wherein formula (1) is represented by formula (3).
(13) A composition for NK cell activation, comprising a glycosphingolipid having a structure represented by the formula (1).
(14) The composition for NK cell activation according to (13), wherein formula (1) is represented by formula (3).
(15) An antitumor composition comprising a glycosphingolipid having a structure represented by the formula (1).
(16) The antitumor composition according to (15), wherein formula (1) is represented by formula (3).
(17) An antiallergic composition comprising a glycosphingolipid having a structure represented by the formula (1).
(18) The antiallergic composition according to (17), wherein the formula (1) is represented by the formula (3).
(19) A composition for enhancing infection resistance, comprising a glycosphingolipid having a structure represented by formula (1).
(20) The composition for enhancing infection resistance according to (19), wherein the formula (1) is represented by the formula (3).
(21) An antiviral composition comprising a glycosphingolipid having a structure represented by formula (1).
(22) The antiviral composition according to (21), wherein the formula (1) is represented by the formula (3).
(23) A composition for promoting IL-6 production, comprising a glycosphingolipid having a structure represented by formula (1).
(24) The composition for promoting IL-6 production according to (23), wherein formula (1) is represented by formula (3).
(25) A composition for promoting NO production, comprising a glycosphingolipid having a structure represented by formula (1).
(26) The composition for promoting NO production according to (25), wherein formula (1) is represented by formula (3).

本願発明の組成物を採用することにより、より効果的なＮＫＴ細胞活性化用組成物が得られた。また、ＩＬ−４産生促進用組成物、ＩＦＮ−γ産生促進用組成物、樹状細胞活性化用組成物、ＩＬ−１２産生促進用組成物、ＩＬ−１０産生促進用組成物、ＮＫ細胞活性化用組成物、抗腫瘍作用組成物、抗アレルギー作用組成物、感染抵抗性増強用組成物、抗ウイルス作用組成物、ＩＬ−６産生促進用組成物、ＮＯ産出促進用組成物が得られた。特に、これらを併せ持つという点でも本願発明の組成物は有意である。
さらに、本願発明の組成物は、毒性が低く、エンドトキシントレランスが誘導されないため、副作用が低いという観点からも有用である。 By adopting the composition of the present invention, a more effective composition for activating NKT cells was obtained. Also, IL-4 production promoting composition, IFN-γ production promoting composition, dendritic cell activation composition, IL-12 production promoting composition, IL-10 production promoting composition, NK cell activity Composition, antitumor composition, antiallergic composition, infection resistance enhancing composition, antiviral composition, IL-6 production promoting composition, NO production promoting composition were obtained. . In particular, the composition of the present invention is significant in that it has both of these.
Furthermore, the composition of the present invention is useful from the viewpoint of low side effects because of low toxicity and no induction of endotoxin tolerance.

以下において、本願発明の内容について詳細に説明する。尚、本願明細書において「〜」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。また、本願明細書において、上記式（３）中、Ｒ⁵¹、Ｒ⁵²、Ｒ⁵³、Ｒ⁵⁴、Ｒ⁵⁵、Ｒ⁵⁶、Ｒ⁵⁷、Ｒ⁵⁸、Ｒ⁵⁹、Ｒ⁷⁰、Ｒ⁷¹、Ｒ⁷²、Ｒ⁷³、Ｒ⁷⁴、Ｒ⁷⁵、Ｒ⁷⁶、Ｒ⁷⁷、Ｒ⁷⁸を、「Ｒ⁵¹〜Ｒ⁷⁸」と示すことがある。
本願発明で採用するスフィンゴ糖脂質（以下、「ＧＳＬ」と呼ぶことがある）は、上記式（１）で表される構造を有するものである。ここで、式（１）のＲ¹に含まれるＲ³のアルキル基は、シクロアルキル基を有していてもよく、該シクロアルキル基は、Ｒ³のアルキル末端でもよいし、鎖の中に含まれていてもよい。好ましいシクロアルキル基としては、シクロプロパン基があげられる。Ｒ³のアルキル基の炭素数としては、好ましくは１３〜２３、より好ましくは１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１である。また、Ｒ³のアルキル基及びアルケニル基は、好ましくは置換または無置換の直鎖のものである。また、アルケニル基に含まれる２重結合は、いずれの位置にあってもよい。
一方、Ｒ⁴のアルキル基の炭素数は好ましくは１０〜２０、より好ましくは１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６であり、さらに好ましくは、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。さらに、Ｒ⁴のアルキル基は、置換または無置換の直鎖アルキル基であることが好ましい。 Hereinafter, the contents of the present invention will be described in detail. In the present specification, “to” is used to mean that the numerical values described before and after it are included as a lower limit value and an upper limit value. Moreover, in this-application specification, in said formula (3), ^R51 , ^R52 , ^R53 , ^R54 , ^R55 , ^R56 , ^R57 , ^R58 , ^R59 , ^R70 , ^R71 , ^R72 , R ⁷³ , R ⁷⁴ , R ⁷⁵ , R ⁷⁶ , R ⁷⁷ , R ⁷⁸ may be indicated as “R ^{51 to} R ⁷⁸ ”.
The glycosphingolipid (hereinafter sometimes referred to as “GSL”) employed in the present invention has a structure represented by the above formula (1). Here, the alkyl group of R ³ contained in R ¹ of the formula (1) may have a cycloalkyl group, and the cycloalkyl group may be the alkyl terminal of R ³ or in the chain. It may be included. A preferred cycloalkyl group is a cyclopropane group. The carbon number of the alkyl group of R ^3, preferably 13-23, more preferably 15,16,17,18,19,20 or 21. In addition, the alkyl group and alkenyl group of R ³ are preferably a substituted or unsubstituted linear group. The double bond contained in the alkenyl group may be in any position.
On the other hand, the number of carbon atoms of the alkyl group of R ⁴ is preferably 10 to 20, more preferably 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16, and further preferably 10, 11, 12, 13, 14 or 15. Furthermore, the alkyl group for R ⁴ is preferably a substituted or unsubstituted linear alkyl group.

さらに好ましくは、Ｒ¹が上記Ｒ⁵¹〜Ｒ⁷⁸のいずれかである。
また、式（１）のＲ¹は、下記式（１−２）の立体構造をとるものが好ましい。
式（１−２）

ここで、上記式（１−２）中のＲ³およびＲ⁴は、上記式（１−１）のＲ³およびＲ⁴と同義である。従って、上記Ｒ⁵¹〜Ｒ⁷⁸も上記立体構造をとるものがより好ましい。
また、上記式（１）は、好ましくは、式（２）、式（３）、式（４）又は式（５）で表されるものである。ここで、式（２）は、
式（２）

式（２）中、Ｒ¹は及びＲ²は式（１）と同義であり、好ましい範囲も同義である。
また、式（３）において、好ましくは、Ｒ⁵が、Ｒ⁵¹〜Ｒ⁷⁸のいずれかであって、Ｒ⁶が水素原子の場合（以下、構造Ａということがある）、Ｒ⁵が、Ｒ⁵¹〜Ｒ⁷⁸のいずれかであって、Ｒ⁶がＲ⁶²の場合（以下、構造Ｂということがある）、Ｒ⁵が、Ｒ⁵¹〜Ｒ⁷⁸のいずれかであって、Ｒ⁶がＲ⁶³の場合（以下、構造Ｃということがある）、Ｒ⁵が、Ｒ⁵¹〜Ｒ⁷⁸のいずれかであって、Ｒ⁶がＲ⁶⁴の場合（以下、構造Ｄということがある）、Ｒ⁵が、Ｒ⁵¹〜Ｒ⁷⁸のいずれかであって、Ｒ⁶がＲ⁶⁵の場合（以下、構造Ｅということがある）である。さらにまた、構造Ａの中でも、Ｒ⁵が、Ｒ⁵¹、Ｒ⁵²又はＲ⁵³のものをより好ましく採用できる。 More preferably, R ¹ is any one of R ^{51 to} R ⁷⁸ described above.
In addition, R ¹ in the formula (1) preferably has a three-dimensional structure represented by the following formula (1-2).
Formula (1-2)

Here, R ³ and R ⁴ in the above formula (1-2) are the same as R ³ and R ⁴ in the formula (1-1). Therefore, it is more preferable that R ^{51 to} R ⁷⁸ also have the above three-dimensional structure.
The above formula (1) is preferably represented by the formula (2), the formula (3), the formula (4) or the formula (5). Here, the equation (2) is
Formula (2)

In formula (2), R ¹ and R ² have the same meaning as in formula (1), and the preferred range is also the same.
In the formula (3), preferably, when R ⁵ is any one of R ^{51 to} R ⁷⁸ and R ⁶ is a hydrogen atom (hereinafter sometimes referred to as structure A), R ⁵ is R ⁵¹ be either to R ^78, when R ⁶ is R ⁶² (hereinafter sometimes referred to as structure B), R ⁵ is based on any one of R ⁵¹ to R ^78, R ⁶ is R ⁶³ for (hereinafter sometimes referred to as structure C), R ⁵ is based on any one of R ⁵¹ to R ^78, when R ⁶ is R ⁶⁴ (hereinafter sometimes referred to as structure D), it is R ⁵ , R ^{51 to} R ⁷⁸ , and R ⁶ is R ⁶⁵ (hereinafter sometimes referred to as structure E). Furthermore, among the structures A, those wherein R ⁵ is R ⁵¹ , R ⁵² or R ⁵³ can be more preferably employed.

式（４）

式（４）中、Ｒ¹は、上記式（１）のＲ¹と同義である。また、Ｒ¹の好ましい範囲も上記とＲ¹と同義である（式（４）で表される化合物の少なくとも一種を含むものを以下、構造ＡＡと呼ぶことがある）。
式（５）

式（５）中、Ｒ¹は、上記式（１）のＲ¹と同義である（以下、構造Ｆということがある）。また、Ｒ¹の好ましい範囲も上記Ｒ¹と同義である。 Formula (4)

In formula (4), R ¹ has the same meaning as R ¹ in the formula (1). Further, preferred ranges of R ¹ has the same definition as above and R ¹ (hereinafter those containing at least one compound represented by formula (4), may be referred to as a structure AA).
Formula (5)

In formula (5), R ¹ has the same meaning as R ¹ in the formula (1) (hereinafter sometimes referred to as structure F). Further, preferred ranges of R ¹ has the same definition as above R ^1.

さらに、本願発明のスフィンゴ糖脂質は１種類のみを採用しても良いし、２種類以上を採用しても良い。２種以上を組み合わせて含有させる場合の各成分の比率は特に制限されない。例えば、上記構造Ａに該当する３種類の化合物のうち１種類以上を含むもの、上記構造Ｂに該当する３種類の化合物のうち１種類以上を含むもの、上記構造Ｆに該当する化合物を少なくとも１種以上含むもの等を挙げることができる。この中でも好ましくは、Ｒ¹が、Ｒ⁵¹、Ｒ⁵²又はＲ⁵³のいずれかの場合である（以下、構造ＦＡと呼ぶことがある）。
本願発明で開示する組成物には、上記に加えて、上記式（１）において、式（１）中の式（１−１）が式（１−１−１）の立体構造で表されるものも含まれていてもよい。
式（１−１−１）

式（１−１−１）中、Ｒ³及びＲ⁴は、それぞれ、上記式（１−１）と同義であり、好ましい範囲も同義である。
式（１−１−１）は、さらに好ましくは、下記式（１−１−２）で表される立体構造のものである。
式（１−１−２）

式（１−１−２）中、Ｒ³及びＲ⁴は、それぞれ、上記式（１−１）と同義であり、好ましい範囲も同義である。 Furthermore, only one type of glycosphingolipid of the present invention may be employed, or two or more types may be employed. The ratio of each component in the case of containing 2 or more types in combination is not particularly limited. For example, at least one compound including one or more of the three types of compounds corresponding to the structure A, one including at least one of the three types of compounds corresponding to the structure B, and one corresponding to the structure F is included. The thing etc. which contain seed | species or more can be mentioned. Among these, R ¹ is preferably any one of R ⁵¹ , R ^{52 and} R ⁵³ (hereinafter sometimes referred to as structure FA).
In the composition disclosed in the present invention, in addition to the above, in the above formula (1), the formula (1-1) in the formula (1) is represented by the three-dimensional structure of the formula (1-1-1). Things may also be included.
Formula (1-1-1)

In formula (1-1-1), R ³ and R ⁴ have the same meaning as that of formula (1-1), respectively, and the preferred range is also the same.
Formula (1-1-1) is more preferably a three-dimensional structure represented by the following formula (1-1-2).
Formula (1-1-2)

In formula (1-1-2), R ³ and R ⁴ have the same meaning as that of formula (1-1), respectively, and the preferred range is also the same.

式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質は、スフィンゴ糖脂質を有する菌体から抽出することによって得ることができる。例えば、国際公開ＷＯ９２／１２９８６号パンフレットや特開２００２−１０７９７号公報に記載の方法を採用することができる。スフィンゴ糖脂質は、スフィンゴモナス科に属する菌体中に含まれていることから、スフィンゴモナス科に属する菌のいずれかを用いて抽出すれば式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質を得ることができる。ここで、スフィンゴモナス科に属する菌とは、従来から一般的に「スフィンゴモナス属」（Sphingomonas）に属する菌と言われているものの他、該菌と実質的に同じ科に属するものとして分類される菌を含む趣旨である。本願発明で採用できる菌株としては、例えば、Microbiol. Immunol.,2000,44,563-575に示されるいずれの菌株も採用することができる。  The glycosphingolipid represented by the formula (1) can be obtained by extracting from a bacterial cell having a glycosphingolipid. For example, the method described in International Publication WO92 / 12986 pamphlet or JP-A-2002-10797 can be employed. Glycosphingolipids are contained in cells belonging to the family Sphingomonas, so that if extracted using any of the bacteria belonging to the family Sphingomonas, a glycosphingolipid represented by the formula (1) is obtained. Can do. Here, the bacteria belonging to the family Sphingomonas are classified as those belonging to the same family as the bacteria other than those generally belonging to the genus "Sphingomonas". The purpose is to include bacteria. As a strain that can be employed in the present invention, for example, any strain shown in Microbiol. Immunol., 2000, 44, 563-575 can be employed.

式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質は、アセトンに対して不溶性であることから、抽出操作を行なう前に菌体をアセトンで洗浄しておくのが好ましい。式（１）のスフィンゴ糖脂質の抽出に用いる溶媒は、メタノールなどのアルコール系溶媒またはアルコール系溶媒とクロロホルムなどの極性溶媒の混合溶媒にするのが収率の点で好ましい。ただし、スフィンゴ糖脂質溶解性の溶媒であれば、これらの以外の溶媒を用いても構わない。
スフィンゴ糖脂質の混合物が得られた場合は、本技術分野で周知の方法にしたがって各成分を分離することができる。たとえば、クロマトグラフィー法によって、スフィンゴ糖脂質は完全に分離することができる。溶出液としてクロロホルム／メタノール混合溶液を用いた場合は、構造Ａ、構造Ｆ、構造Ｃ、構造Ｂあるいは構造Ｄあるいは構造Ｅの順に各スフィンゴ糖脂質が溶出し、構造Ｂ、Ｄ、Ｅは、一般的に異なる菌株が産生するため、極めて簡便に分離することができる。充填剤、溶出液、溶出速度、圧力、温度などのクロマトグラフィーの分離条件については、適宜調節することができる。また、スフィンゴ糖脂質の混合物に含まれる特定の物質のみに選択的に反応する試薬を作用させて該物質の誘導体を調製し、その誘導体の化学的性質または物理的性質を利用して分離を行なうこともできる。菌として、スフィンゴモナスパウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）を用いた場合には、一般に構造Ａのスフィンゴ糖脂質と構造Ｂのスフィンゴ糖脂質が得られる。また、スフィンゴモナスカプスラータ（Sphingomonas capsulata）（新名：Novosphingobium capsulatum）を用いた場合には、一般に構造Ａのスフィンゴ糖脂質と構造Ｃのスフィンゴ糖脂質が得られる。さらに、スフィンゴモナスアドハエシバ(Sphingomonas adhaesiva)を用いた場合には、一般に構造Ａのスフィンゴ糖脂質と構造Ｄのスフィンゴ糖脂質が得られる。加えて、スフィンゴモナススピーシーズＭＫ３４６(Sphingomonas sp. MK346)を用いた場合には、一般に構造Ａのスフィンゴ糖脂質と構造Ｅのスフィンゴ糖脂質が得られる。また、スフィンゴモナスウィッティチアィ（Sphingomonas wittichii）、スフィンゴモナスマクロゴルタビダス（Sphingomonas macrogoltabidus）（新名：Sphingopyxis macrogoltabida）、スフィンゴモナステラエ（Sphingomonas terrae）又はスフィンゴモナスヤノイクヤエ（Sphingomonas yanoikuyae）(新名：Sphingobium yanoikuyae)を用いた場合には、一般に構造ＡＡ（例えば、構造Ａ）のスフィンゴ糖脂質と構造Ｆ（例えば、構造ＦＡ）のスフィンゴ糖脂質が得られる。したがって、これらの情報に基づいて菌を選択すれば、目的とするスフィンゴ糖脂質を効率よく得ることができる。
式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質は、周知の合成法を組み合わせることによって合成することもできる。たとえば、糖とスフィンゴシン部分をあらかじめ合成するか、菌体から抽出しておき、アミド結合を形成することによって式（１）で表される各スフィンゴ糖脂質を調製することができる。 Since the glycosphingolipid represented by the formula (1) is insoluble in acetone, it is preferable to wash the cells with acetone before the extraction operation. The solvent used for extraction of the glycosphingolipid of formula (1) is preferably an alcohol solvent such as methanol or a mixed solvent of an alcohol solvent and a polar solvent such as chloroform from the viewpoint of yield. However, other solvents may be used as long as they are glycosphingolipid-soluble solvents.
When a mixture of glycosphingolipids is obtained, the components can be separated according to methods well known in the art. For example, glycosphingolipids can be completely separated by chromatographic methods. When a chloroform / methanol mixed solution is used as the eluent, each glycosphingolipid is eluted in the order of structure A, structure F, structure C, structure B, structure D or structure E. Structures B, D and E are generally Since different strains are produced, they can be separated very easily. The chromatographic separation conditions such as the filler, eluent, elution rate, pressure, and temperature can be appropriately adjusted. In addition, a reagent that selectively reacts only with a specific substance contained in a mixture of glycosphingolipids is allowed to act to prepare a derivative of the substance, and separation is performed using the chemical or physical properties of the derivative. You can also. When Sphingomonas paucimobilis is used as a bacterium, a glycosphingolipid of structure A and a glycosphingolipid of structure B are generally obtained. When Sphingomonas capsulata (new name: Novosphingobium capsulatum) is used, a glycosphingolipid of structure A and a glycosphingolipid of structure C are generally obtained. Further, when Sphingomonas adhaesiva is used, a glycosphingolipid of structure A and a glycosphingolipid of structure D are generally obtained. In addition, when Sphingomonas sp. MK346 is used, a glycosphingolipid of structure A and a glycosphingolipid of structure E are generally obtained. Also, Sphingomonas wittichii, Sphingomonas macrogoltabidus (new name: Sphingopyxis macrogoltabida), Sphingomonas terrae (Sphingomonas terrae) or Sikugomonas yano : Sphingobium yanoikuyae), a glycosphingolipid of structure AA (for example, structure A) and a glycosphingolipid of structure F (for example, structure FA) are generally obtained. Therefore, if a bacterium is selected based on these information, the intended glycosphingolipid can be obtained efficiently.
The glycosphingolipid represented by the formula (1) can also be synthesized by combining known synthesis methods. For example, each glycosphingolipid represented by the formula (1) can be prepared by synthesizing a sugar and a sphingosine moiety in advance or by extracting from a microbial cell and forming an amide bond.

本願発明のＮＫＴ細胞とは、例えば、ヒトＶα２４⁺ＮＫＴ細胞及びマウスＶα１４⁺ＮＫＴ細胞を含む趣旨である。また、ＮＫＴ細胞活性化とは細胞傷害活性の増強、サイトカイン産生増強及びＮＫＴ細胞の増殖促進を含む意図である。さらに、本願発明のＮＫＴ細胞活性化用組成物は、結果として、ＩＬ−４の産生及びＩＦＮ−γの産生を促進する。従って、ＩＬ−４又はＩＦＮ−γによって促進される各種機能の促進用組成物としても使用することができる。ＮＫＴ細胞活性化用組成物としては、本願発明で採用するＧＳＬのうち、ガラクツロン酸型のスフィンゴ糖脂質な構造を有するものが特に好ましい。
ＩＬ−４によって促進されるものの例としては、Ｔｈ２の誘導、抗体のクラススイッチの誘導が挙げられ、ＩＦＮ−γによって促進されるものの例としては、ＩＦＮ−γによって促進されるＴｈ１の誘導、マクロファージ活性化作用が挙げられる。
ここで、サイトカインの増強として、上記のほか、各種ＩＬ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシン、造血因子のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、エリスロポエチン、造血因子の上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）産生又は活性化促進作用組成物としても利用することができる。さらに、本願発明で開示した上記スフィンゴ糖脂質は、上記以外の免疫活性化組成物や、がん細胞のアポトーシス誘導化組成物、ＮＦ−ｋａｐｐａＢ活性化促進、ＩｋａｐｐａＢの分解、ｐ３８のリン酸化、Ａｋｔのリン酸化等を目的とした、産生又は活性化促進用組成物としても利用できる。
本願発明でいう、樹状細胞活性化とは、例えば、抗原提示能亢進を含む意図である。
本願発明のＧＳＬはＩＬ−１２の産生及びＩＬ−１０の産生を促進する。従って、ＩＬ−１２の産生及びＩＬ−１０の産生によって促進される各種機能の促進用組成物としても使用することができる。特に、本願発明のＩＬ−１２の産生及び／または
ＩＬ−１０の産生組成物としては、グルクロン酸型のスフィンゴ糖脂質を用いることが好ましい。 The NKT cell of the present invention is intended to include, for example, human Vα24 ⁺ NKT cells and mouse Vα14 ⁺ NKT cells. In addition, NKT cell activation is intended to include enhancement of cytotoxic activity, enhancement of cytokine production, and promotion of NKT cell proliferation. Further, the NKT cell activation composition of the present invention promotes IL-4 production and IFN-γ production as a result. Therefore, it can be used as a composition for promoting various functions promoted by IL-4 or IFN-γ. As the composition for activating NKT cells, among the GSLs employed in the present invention, those having a galacturonic acid type glycosphingolipid structure are particularly preferred.
Examples of those promoted by IL-4 include Th2 induction and induction of antibody class switching. Examples of those promoted by IFN-γ include Th1 induction promoted by IFN-γ, macrophages. An activation effect is mentioned.
Here, in addition to the above, as cytokine enhancement, various IL, IFN-α, IFN-β, tumor necrosis factor (TNF), lymphotoxin, colony stimulating factor of hematopoietic factor (CSF), erythropoietin, epidermal growth factor of hematopoietic factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF) production or activation promoting composition can also be used. Furthermore, the glycosphingolipids disclosed in the present invention include immunostimulating compositions other than those described above, cancer cell apoptosis-inducing compositions, NF-kappaB activation promotion, IkappaB degradation, p38 phosphorylation, Akt It can also be used as a composition for promoting production or activation for the purpose of phosphorylation.
The dendritic cell activation referred to in the present invention is intended to include, for example, enhancement of antigen presenting ability.
The GSL of the present invention promotes IL-12 production and IL-10 production. Therefore, it can be used as a composition for promoting various functions promoted by IL-12 production and IL-10 production. In particular, it is preferable to use a glucuronic acid-type glycosphingolipid as the IL-12 production and / or IL-10 production composition of the present invention.

本願発明でいう、ＮＫ細胞活性化とは、例えば、感染細胞傷害を含む意図である。ＮＫ細胞活性化用組成物としては、本願発明で採用するＧＳＬのうち、単糖型のスフィンゴ糖脂質であるものが特に好ましい。
本願発明でいう、抗腫瘍作用とは、例えば、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞活性化を含む意図である。抗腫瘍作用組成物としては、本願発明で採用するＧＳＬのうち、四糖型のスフィンゴ糖脂質であるものが特に好ましい。
本願発明でいう、抗アレルギー作用とは、例えば、好酸球浸潤抑制、肥満細胞抑制作用、ＩｇＥ産生抑制、化学伝達物質放出抑制を含む意図である。
さらに、本願発明の抗アレルギー作用組成物は、副作用が弱い傾向にあり、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎等への利用に特に有用である。
本願発明でいう、感染抵抗性増強作用とは、例えば、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞活性化を含む意図である。本願発明の感染抵抗性増強作用組成物は、サルモネラ感染症、結核への利用に特に有用である。感染抵抗性増強作用組成物としては、本願発明で採用するＧＳＬのうち、四糖型のスフィンゴ糖脂質であるものが特に好ましい。
本願発明でいう、抗ウイルス作用とは、例えば、Ｉ型インターフェロン産生増強、
ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞活性化を含む意図である。本願発明の抗ウイルス作用組成物は、サイトメガロウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染症などヘルペスウイルス科感染症への利用に特に有用である。 The NK cell activation referred to in the present invention is intended to include, for example, infected cell injury. As the composition for NK cell activation, among the GSLs employed in the present invention, those which are monosaccharide glycosphingolipids are particularly preferable.
The antitumor action as referred to in the present invention is intended to include, for example, activation of helper T cells and killer T cells. As the antitumor composition, among the GSLs employed in the present invention, those that are tetrasaccharide glycosphingolipids are particularly preferred.
The antiallergic effect referred to in the present invention is intended to include, for example, eosinophil infiltration suppression, mast cell suppression effect, IgE production suppression, and chemical transmitter release suppression.
Further, the antiallergic composition of the present invention tends to have weak side effects and is particularly useful for use in hay fever, bronchial asthma, atopic dermatitis and the like.
The infection resistance enhancing action referred to in the present invention is intended to include, for example, helper T cell activation and killer T cell activation. The composition for enhancing infection resistance of the present invention is particularly useful for use in Salmonella infection and tuberculosis. As the composition for enhancing infection resistance, among the GSLs employed in the present invention, those that are tetrasaccharide type glycosphingolipids are particularly preferred.
The antiviral action referred to in the present invention is, for example, enhanced production of type I interferon,
It is intended to include helper T cell and killer T cell activation. The antiviral composition of the present invention is particularly useful for use in herpesviridae infections such as cytomegalovirus infection and herpesvirus infection.

また、本願発明の組成物を医薬品若しくは医薬部外品やその有効成分として利用する場合、好ましくは、当業者に周知の方法によって製造可能な医薬組成物として投与することができる。医薬用組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等をあげることができる。上記の医薬組成物は、薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物を加えて製造することができる。薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物の例としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし崩壊補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等をあげることができる。上記の医薬組成物には、本願発明の趣旨を逸脱しない範囲内で、他の効能を有する成分を１種又は２種以上配合してもよい。本願発明の医薬の投与量は特に限定されず、有効成分の種類などに応じて適宜選択することができ、さらに患者の体重や年齢、疾患の種類や症状、投与経路など通常考慮すべき種々の要因に応じて、適宜増減することができる。一般的には、成人一日あたり、０．００１〜１００ｍｇ好ましくは０．０１〜１０ｍｇの範囲で用いることができる。また、投与方法も特に限定されず、注射剤、輸液剤等として、静脈注射により投与してもよいし、経口的に投与してもよい。   Moreover, when using the composition of this invention as a pharmaceutical or a quasi-drug, or its active ingredient, Preferably, it can administer as a pharmaceutical composition which can be manufactured by a method well-known to those skilled in the art. Examples of the pharmaceutical composition include tablets, capsules, powders, fine granules, granules, liquids, and syrups. Said pharmaceutical composition can be manufactured by adding a pharmacologically and pharmaceutically acceptable additive. Examples of pharmacologically and pharmaceutically acceptable additives include, for example, excipients, disintegrants or disintegration aids, binders, lubricants, coating agents, dyes, diluents, bases, and dissolution. Examples thereof include agents or disintegration aids, isotonic agents, pH adjusters, stabilizers, propellants, and pressure-sensitive adhesives. You may mix | blend 1 type (s) or 2 or more types of components which have another effect in the said pharmaceutical composition within the range which does not deviate from the meaning of this invention. The dosage of the medicament of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the type of active ingredient, and various other factors that should normally be taken into consideration, such as patient weight and age, type and symptom of disease, and administration route. Depending on the factor, it can be appropriately increased or decreased. Generally, it can be used in the range of 0.001 to 100 mg, preferably 0.01 to 10 mg per adult day. Also, the administration method is not particularly limited, and it may be administered by intravenous injection or orally as an injection, an infusion, or the like.

以下に実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本願発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。従って、本願発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。   The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. The materials, amounts used, ratios, processing details, processing procedures, and the like shown in the following examples can be changed as appropriate without departing from the spirit of the present invention. Therefore, the scope of the present invention is not limited to the specific examples shown below.

本実施例においては、ＧＳＬとして、スフィンゴモナスパウシモビリスから産生された構造Ａのもの（ＧＳＬ−１）、スフィンゴモナスパウシモビリスから産生された構造Ｂのもの（ＧＳＬ−２）、スフィンゴモナスカプスラータから産生された構造Ｃのもの（ＧＳＬ−３）、スフィンゴモナスアドハエシバから産生された構造Ｄのもの（ＧＳＬ−４）、スフィンゴモナススピーシーズＭＫ３４６から産生された構造Ｅのもの（ＧＳＬ−５）、スフィンゴモナスヤノイクヤエから産生された構造ＡＡのもの（ＧＳＬ−６）、スフィンゴモナスヤノイクヤエから産生された構造Ｆのもの（ＧＳＬ−７）、スフィンゴモナスウィッティチアィから産生された構造ＡＡのもの（ＧＳＬ−８）、スフィンゴモナスウィッティチアィから産生された構造Ｆのもの（ＧＳＬ−９）、スフィンゴモナスマクロゴルタビダスから産生された構造ＡＡのもの（ＧＳＬ−１０）、スフィンゴモナスマクロゴルタビダスから産生された構造Ｆのもの（ＧＳＬ−１１）、スフィンゴモナステラエから産生された構造ＡＡのもの（ＧＳＬ−１２）、スフィンゴモナステラエから産生された構造Ｆのもの（ＧＳＬ−１３）を採用した。これらは、国際公開ＷＯ９２／１２９８６号公報、特開２００２−０１０７９７号公報に記載の方法に従って分離した。   In this example, as GSL, those of structure A (GSL-1) produced from Sphingomonas sp. Mobilis, those of structure B (GSL-2) produced from Sphingomonas sp. Mobilis, Sphingomonas scapus Structure C produced from ratter (GSL-3), Structure D produced from Sphingomonas adhesica (GSL-4), Structure E produced from Sphingomonas species MK346 (GSL-5) ), Structure AA produced from Sphingomonas yanoikuya (GSL-6), structure F produced from Sphingomonas yaikuikue (GSL-7), structure produced from Sphingomonas witticia AA (GSL-8), structure produced from Sphingomonas wittychia (GSL-9), structure AA produced from Sphingomonas macrogortavidas (GSL-10), structure F produced from Sphingomonas macrogortavidas (GSL-11), sphingomonas The structure AA (GSL-12) produced from Terrae and the structure F (GSL-13) produced from Sphingomonas terrae were employed. These were separated according to the methods described in International Publication WO92 / 12986 and JP2002-010797.

実施例１ ＮＫＴ細胞活性化作用の測定
動物：
試験用マウスとして、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎマウス（以下、正常マウスという。）及びＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＣｒマウス（ＴＬＲ４欠損ＩＬ−１２Ｒβ２鎖変異マウス）（以下、ＴＬＲ４欠損マウスという。）（マックスプランク免疫生物学研究所、ドイツ、フライブルグ市）（７週齢、雌）を使用した。ＧＳＬ−１およびＧＳＬ−２はＴＬＲ４を介して正常マウスのマクロファージを活性化し、ＩＬ−１２産生を誘導する。ＴＬＲ４欠損マウスは、ＩＬ−１２受容体のβ鎖に変異があり、ＩＬ−１２が作用しないものである。ＩＬ−１２は免疫系を強力に活性化する物質であるが、本実施例のＴＬＲ４欠損マウスを用いると本願発明で採用するスフィンゴ糖脂質のＮＫＴ細胞に対する活性化促進をＩＬ−１２の作用を受けない状態で、より明確にすることができる。
サンプルの作成：
各ＧＳＬのいずれか１０μｇを、正常マウス及びＴＬＲ４欠損マウスに投与した。投与は、尾静脈内投与により行った。そして、対照として生理食塩水を投与したもの（コントロール）、投与後１日経過時（１日目）及び２日経過時（２日目）の血清及び肝臓を採取した。 Example 1 Measurement of NKT cell activation action Animals:
As test mice, C57BL / 10ScSn mice (hereinafter referred to as normal mice) and C57BL / 10ScCr mice (TLR4-deficient IL-12Rβ2 chain mutant mice) (hereinafter referred to as TLR4-deficient mice) (Max Planck Institute for Immunobiology, (Freiburg, Germany) (7 weeks old, female) was used. GSL-1 and GSL-2 activate normal mouse macrophages via TLR4 and induce IL-12 production. TLR4-deficient mice have a mutation in the β chain of IL-12 receptor and IL-12 does not act. IL-12 is a substance that strongly activates the immune system. However, when the TLR4-deficient mouse of this example is used, the activation of glycosphingolipids employed in the present invention for NKT cells is stimulated by IL-12. It can be clearer without it.
Sample creation:
Either 10 μg of each GSL was administered to normal mice and TLR4-deficient mice. Administration was performed by tail vein administration. As a control, serum and liver were collected after administration of physiological saline (control), and after the first day (day 1) and after the second day (day 2).

肝臓内白血球の分離：
採取した肝臓を２枚のスライドガラスを用いてつぶした。細胞浮遊液を５００ｒｐｍ、１分間遠心した。得られた上清を１２００ｒｐｍ（３００ｇ）、５分間遠心した。その沈渣を３０％のパーコール（ファルマシア社製）に懸濁し、さらに、これを、６７．５％ パーコールの上に重層して、２０℃、２０００ｒｐｍ（８００ｇ）、３０分間遠心し、３０％と６７．５％パーコールの境界に白血球を集積させ回収した。得られた細胞をハンクス液で３回洗浄して肝臓内白血球を得た。 Separation of leukocytes in the liver:
The collected liver was crushed using two glass slides. The cell suspension was centrifuged at 500 rpm for 1 minute. The obtained supernatant was centrifuged at 1200 rpm (300 g) for 5 minutes. The sediment was suspended in 30% Percoll (manufactured by Pharmacia), and this was layered on 67.5% Percoll, and centrifuged at 20 ° C. and 2000 rpm (800 g) for 30 minutes. Leukocytes were collected and collected at the boundary of 5% percoll. The obtained cells were washed 3 times with Hank's solution to obtain intrahepatic leukocytes.

フローサイトメトリー：
ＦｃＲを介した蛍光標識抗体の非特異的結合を防ぐため、抗ＦｃγＲ（２．４Ｇ２）を用いた。抗体は、ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体（日本ベクトン・ディッキソン（株）製、ＰＫ１３６）及びビオチン標識抗ＴＣＲαβ抗体（日本ベクトン・ディッキソン（株）製、Ｈ５７−５９７）を用いた。細胞に各抗体を添加した後、４℃、暗所で３０分反応させた。尚、ビオチン標識抗体を用いた細胞は、Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ結合ストレプトアビジン（日本ベクトン・ディッキソン株式会製、５５４０６２）を４℃、暗所で３０分反応させた。上記抗体、Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ結合ストレプトアビジンの染色及び細胞の洗浄には０．１％ＮａＮ₃含有１％血清アルブミンを用いた。細胞は染色後、１％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（-）で固定した。測定は HYPERLINK "http://cent-scorpio.asahikawa-med.ac.jp/central/image/biochemistry/fcm.html" 自動細胞解析分離装置（ベックマンコールター（株）、COULTER EPICS ELITE ESP)で行った。また、ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体を、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１１ａ抗体（日本ベクトン・ディッキソン株式会社製、Ｍ１７／４）に代えて同様に行った。
上記ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体（又はＣＤ１１ａ）を用いた方法によって得られたフローサイトメトリーの結果を図１〜図６に示した。ここで、図１〜図４は、それぞれ、正常マウスを用いた場合で、順に、ＧＳＬ−１、２、６、７を投与した場合を、図５及び図６は、それぞれ、ＴＬＲ４欠損マウスを用いた場合で、順に、ＧＳＬ−１、２を投与した場合を示した。
ここで、図中に示した数字は、ＮＫ１．１（又はＣＤ１１ａ）とＴＣＲαβの両方を発現した細胞の割合（％）を示している。尚、ＮＫ１．１（又はＣＤ１１ａ）とＴＣＲαβの両方を発現したものは、ＮＫＴ細胞である。
また、日を変えて、上記と同様に、ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体を用いた方法によって得られた正常マウスのフローサイトメトリーの結果（ＮＫＴ細胞の割合）を図７に示す。ここで、図中に示した数字は両方を発現した細胞の割合（％）を示し、図中の米印は、ｔ検定により統計的にコントロールと有意な差が認められたものである。 Flow cytometry:
Anti-FcγR (2.4G2) was used to prevent non-specific binding of fluorescently labeled antibodies via FcR. As the antibodies, PE-labeled anti-NK1.1 antibody (Nippon Becton Dickyson Co., Ltd., PK136) and biotin-labeled anti-TCRαβ antibody (Nippon Becton Dickson Co., Ltd., H57-597) were used. After each antibody was added to the cells, the reaction was performed at 4 ° C. in the dark for 30 minutes. The cells using the biotin-labeled antibody were reacted with Cy-chrome-conjugated streptavidin (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd., 554062) at 4 ° C. for 30 minutes in the dark. 1% serum albumin containing 0.1% NaN ₃ was used for staining of the antibody and Cy-chrome-conjugated streptavidin and washing of the cells. After staining, the cells were fixed with PBS (-) containing 1% paraformaldehyde. Measurement was performed with HYPERLINK "http://cent-scorpio.asahikawa-med.ac.jp/central/image/biochemistry/fcm.html" automatic cell analysis separation device (Beckman Coulter, COULTER EPICS ELITE ESP) . In addition, PE-labeled anti-NK1.1 antibody was used in the same manner in place of the FITC-labeled anti-CD11a antibody (M17 / 4, manufactured by Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.).
The results of flow cytometry obtained by the method using the PE-labeled anti-NK1.1 antibody (or CD11a) are shown in FIGS. Here, FIGS. 1 to 4 show cases where normal mice were used, respectively, in which GSL-1, 2, 6, and 7 were administered in order, and FIGS. 5 and 6 respectively show TLR4-deficient mice. The case where GSL-1 and 2 were administered in order was shown.
Here, the numbers shown in the figure indicate the percentage (%) of cells that expressed both NK1.1 (or CD11a) and TCRαβ. It should be noted that those expressing both NK1.1 (or CD11a) and TCRαβ are NKT cells.
In addition, FIG. 7 shows the results (flow rate of NKT cells) of normal mice obtained by a method using a PE-labeled anti-NK1.1 antibody in the same manner as described above by changing the day. Here, the numbers shown in the figure indicate the percentage (%) of cells that expressed both, and the rice marks in the figure are statistically significant differences from the control by t-test.

ＩＦＮ−γの存在の確認：
ＧＳＬ−１又はＧＳＬ−２を添加した場合の血中のＩＦＮ−γ量について検討した。正常マウス及びＴＬＲ４欠損マウスに、ＧＳＬ−１又はＧＳＬ−２を上記と同様の方法により投与し、血清中に含まれるＩＦＮ−γを解析した。
ＩＦＮ−γは、捕捉抗体として精製抗ＩＦＮ−γ抗体（Ｒ４−６Ａ２）（日本ベクトン・ディッキソン株式会製）と、検出抗体としてビオチン結合抗ＩＦＮ−γ抗体（ＡＮ−１８）（日本ベクトン・ディッキソン株式会製）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法で行った。ビオチン結合抗体に続く反応でアルカリ性フォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ製、４３−４８２２）を結合させ、パラニトロフェニルリン酸塩（ＳＩＧＭＡ製、Ｎ−４６４５）を基質として発色させた。マイクロプレートリーダー（日本バイオラドラボラトリーズ株式会社、Ｍｏｄｅｌ５５０）で４０５ｎｍと対照として５４０ｎｍの波長の吸光度を観察した。この結果、正常マウスにおいて、図８に示すように、ＩＦＮ−γの産生が促進されていることが認められた。尚、ＴＬＲ４欠損マウスの場合、ＩＬ−１２に反応しないため、ＧＳＬ−１又はＧＳＬ−２を投与してもＩＦＮ−γは検出されなかった。 Confirmation of the presence of IFN-γ:
The amount of IFN-γ in the blood when GSL-1 or GSL-2 was added was examined. GSL-1 or GSL-2 was administered to normal mice and TLR4-deficient mice in the same manner as described above, and IFN-γ contained in the serum was analyzed.
IFN-γ is a purified anti-IFN-γ antibody (R4-6A2) (manufactured by Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) as a capture antibody and a biotin-conjugated anti-IFN-γ antibody (AN-18) (Nippon Becton Dickinson) as a detection antibody. This was performed by a sandwich ELISA method using a stock company). In the reaction following the biotin-conjugated antibody, alkaline phosphatase-labeled streptavidin (ZYMED, 43-4822) was bound, and color was developed using paranitrophenyl phosphate (SIGMA, N-4645) as a substrate. Absorbance at a wavelength of 540 nm was observed as a control with a microplate reader (Nippon Bio-Rad Laboratories, Model 550) as a control. As a result, it was confirmed that the production of IFN-γ was promoted in normal mice as shown in FIG. In the case of a TLR4-deficient mouse, IFN-γ was not detected even when GSL-1 or GSL-2 was administered because it did not respond to IL-12.

ＩＦＮ−γ産生ＮＫＴ細胞のフローサイトメトリー：
ＧＳＬ−１又はＧＳＬ−２を投与した場合の正常マウスについて、上記と同様の方法でフローサイトメトリーを行い、（ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体、ビオチン標識抗ＴＣＲαβ抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮ−γ抗体（日本ベクトンディッキンソン株式会社製、５５４４１０）にて染色して、ＩＦＮ−γ産生ＮＫＴ細胞の割合を測定した。その結果を図９に示す。ここで、図中の数字は、ＮＫ１．１とＴＣＲαβの両方を発現した、ＩＦＮ−γ産生ＮＫＴ細胞の割合に相当する。 Flow cytometry of IFN-γ producing NKT cells:
For normal mice administered with GSL-1 or GSL-2, flow cytometry was performed in the same manner as described above (PE-labeled anti-NK1.1 antibody, biotin-labeled anti-TCRαβ antibody, FITC-labeled anti-IFN-γ antibody) (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd., 554410) and the ratio of IFN-γ producing NKT cells was measured, and the results are shown in Fig. 9. The numbers in the figure are NK1.1 and TCRαβ. This corresponds to the proportion of IFN-γ producing NKT cells that expressed both.

ＩＬ−４の量の測定：
ＧＳＬ−１又はＧＳＬ−２を添加した場合の血中のＩＬ−４の量が増加するかについて検討した。上記正常マウス及びＴＬＲ４欠損マウスに、ＧＳＬ−１又はＧＳＬ−２を上記と同様の方法により投与し、血清中に含まれるＩＬ−４を解析した。
ＩＬ−４の測定は、マウスＩＬ−４ ＢＤ Ｏｐｔｉ ＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（日本ベクトン・ディッキソン株式会社製、５５５２３２）を用いて該マニュアルに従って測定した。結果、いずれのマウスについても、ＩＬ−４の増加が認められた。特に、図１０に示すとおり、ＴＬＲ４欠損マウスにおいて、ＩＬ−４の顕著な産生促進が認められた。
ＧＳＬ−１又はＧＳＬ−２を添加した場合、上記フローサイトメトリーにおいて、ＮＫ１．１とＴＣＲαβの両方に発現したものの割合の増加が認められたこと、及び、これらの増加が大きいものについては、ＩＦＮ−γとＩＬ−４の両方が産生されていることが確認できたことから、ＧＳＬ−１又はＧＳＬ−２がＮＫＴ細胞の活性化に有効であることが認められた。 Measurement of the amount of IL-4:
It was examined whether the amount of IL-4 in the blood increased when GSL-1 or GSL-2 was added. GSL-1 or GSL-2 was administered to the normal mice and TLR4-deficient mice in the same manner as described above, and IL-4 contained in the serum was analyzed.
IL-4 was measured according to the manual using a mouse IL-4 BD Opti EIA ELISA Set (manufactured by Nippon Becton Dickinson Co., Ltd., 555232). As a result, an increase in IL-4 was observed for all mice. In particular, as shown in FIG. 10, significant IL-4 production was promoted in TLR4-deficient mice.
When GSL-1 or GSL-2 was added, an increase in the ratio of those expressed in both NK1.1 and TCRαβ was observed in the above flow cytometry, and for those having a large increase, IFN Since it was confirmed that both γ and IL-4 were produced, it was confirmed that GSL-1 or GSL-2 was effective in activating NKT cells.

実施例２ ＩＦＮ−γ産生促進作用
試験用マウスとして、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いた。各ＧＳＬは、各ＧＳＬは、２０％ ペンタジオールで最終濃度が１０ ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した後、生理食塩水で希釈した溶液（以下、「Ｐ」と示すことがある。）、または、０．５％ペンタンジオール、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン、９．８％ショ糖溶液で最終濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した後、生理食塩水で希釈した溶液（以下、「Ｐ＋Ｓ」と示すことがある。）を用いた。各ＧＳＬは、マウス尾静脈から投与した（投与量は１００μｇ）。対照として溶媒のみを投与した（コントロール）。投与１６時間後に摘出した肝臓から細胞浮遊液を調製し、４５％パーコールと６７．５％パーコールを用いた比重遠心法により肝臓内白血球を得た。白血球は、抗ＦｃγＲ抗体 (２．４Ｇ２)で処理した後、ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮ−γ抗体、ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体、ビオチン標識抗ＴＣＲαβ抗体を用いて処理した。白血球に抗体を添加した後、４℃、暗所で３０分間反応させた。ビオチン標識抗体を用いた白血球は、Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ結合ストレプトアビジンを４ ℃、暗所で３０分反応させた。抗体およびＣＹ−ｃｈｒｏｍｅ結合ストレプトアビジンの染色および細胞の洗浄には、０．１％ ＮａＮ₃含有１％血清アルブミンを用いた。細胞は染色後、１％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝生理食塩（ＰＢＳ（−））で固定した。測定は、上記に記載のＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ ＥＳＰで行った。その結果を、表１に示した。ここで、表１は、ＩＦＮ-γ産生ＮＫＴ細胞の割合（％）を示している。なお、本実験は、実験１、２、３の３回に分けて行なった。 Example 2 IFN-γ Production Promoting Action C57BL / 6 mice were used as test mice. Each GSL is dissolved in 20% pentadiol so that the final concentration is 10 mg / ml and then diluted with physiological saline (hereinafter may be referred to as “P”), or , 0.5% pentanediol, 0.5% N-lauroyl sarcosine, 9.8% sucrose solution to a final concentration of 5 mg / ml, and then diluted with physiological saline (hereinafter, “ May be referred to as “P + S”). Each GSL was administered from the mouse tail vein (dosage 100 μg). As a control, only the solvent was administered (control). A cell suspension was prepared from the liver extracted 16 hours after administration, and intrahepatic leukocytes were obtained by specific gravity centrifugation using 45% percoll and 67.5% percoll. Leukocytes were treated with anti-FcγR antibody (2.4G2) and then treated with FITC-labeled anti-IFN-γ antibody, PE-labeled anti-NK1.1 antibody, and biotin-labeled anti-TCRαβ antibody. After the antibody was added to the leukocytes, the reaction was performed at 4 ° C. in the dark for 30 minutes. Leukocytes using a biotin-labeled antibody were reacted with Cy-chrome-conjugated streptavidin for 30 minutes at 4 ° C. in the dark. 1% serum albumin containing 0.1% NaN ₃ was used for staining of antibodies and CY-chrome-conjugated streptavidin and washing of cells. After staining, the cells were fixed with phosphate buffered saline (PBS (−)) containing 1% paraformaldehyde. The measurement was performed with the EPICS ELITE ESP described above. The results are shown in Table 1. Here, Table 1 shows the ratio (%) of IFN-γ producing NKT cells. In addition, this experiment was performed in three times, Experiment 1, 2, and 3.

表１から明らかなとおり、ＩＦＮ-γ産生促進作用が認められた。特に、ＧＳＬ−１、２、４、６〜１１および１３についてより効果的であり、ＧＳＬ−６〜９、１１、１３についてさらに効果的であり、ＧＳＬ−７について顕著に効果的であった。  As is clear from Table 1, an effect of promoting IFN-γ production was observed. In particular, it was more effective for GSL-1, 2, 4, 6-11, and 13, more effective for GSL-6-9, 11, 13, and significantly more effective for GSL-7.

実施例３ 樹状細胞活性化作用
樹状細胞活性化作用について確認した。マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週令、メス）を用いた。各ＧＳＬは、上記実施例２と同様の方法で溶解した。各試料は、マウス尾静脈から投与した（投与量は１００μｇ）。投与１２時間後に摘出した脾臓から細胞浮遊液を調製した。白血球は、抗ＦｃγＲ抗体 (２．４Ｇ２)で処理した後、ＰＥ標識抗ＣＤ１１ｃ抗体（日本ベクトンディッキンソン株式会社製）、ビオチン標識抗ＣＤ４０（日本ベクトンディッキンソン株式会社製）、ビオチン標識抗ＣＤ８０抗体（日本ベクトンディッキンソン株式会社製）、ビオチン標識抗ＣＤ８６抗体（日本ベクトンディッキンソン株式会社製）を用いた。細胞に抗体を添加した後、４℃、暗所で３０分間反応させた。ビオチン標識抗体を用いた細胞は、Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ結合ストレプトアビジンを４℃、暗所で３０分反応させた。抗体またはＣｙ−ｃｈｒｏｍｅ結合ストレプトアビジンの染色および細胞の洗浄には０．１％ ＮａＮ₃含有１％血清アルブミンを用いた。細胞は染色後、１％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ (−)で固定した。測定はＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ ＥＳＰで行った。ＣＤ１１ｃ陽性細胞中のＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６陽性細胞の割合（％）を表２に示した。 Example 3 Dendritic Cell Activation Action The dendritic cell activation action was confirmed. As the mouse, C57BL / 6 mouse (7 weeks old, female) was used. Each GSL was dissolved in the same manner as in Example 2 above. Each sample was administered from the mouse tail vein (dosage 100 μg). A cell suspension was prepared from the spleen removed 12 hours after administration. Leukocytes were treated with an anti-FcγR antibody (2.4G2), then PE-labeled anti-CD11c antibody (manufactured by Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.), biotin-labeled anti-CD40 (manufactured by Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.), biotin-labeled anti-CD80 antibody (Japan) Becton Dickinson) and biotin-labeled anti-CD86 antibody (Nippon Becton Dickinson) were used. After the antibody was added to the cells, the reaction was performed at 4 ° C. in the dark for 30 minutes. Cells using a biotin-labeled antibody were reacted with Cy-chrome-conjugated streptavidin at 4 ° C. in the dark for 30 minutes. 1% serum albumin containing 0.1% NaN ₃ was used for staining of antibody or Cy-chrome-conjugated streptavidin and washing of cells. After staining, the cells were fixed with PBS (-) containing 1% paraformaldehyde. The measurement was performed by EPICS ELITE ESP. Table 2 shows the percentage (%) of CD40, CD80 and CD86 positive cells in CD11c positive cells.

表２から明らかなとおり、樹状細胞活性化作用が認められた。特に、ＧＳＬ−１、２、４、６〜１３についてより効果的であり、ＧＳＬ−７〜９、１１、１３について顕著に効果的であった。  As is clear from Table 2, dendritic cell activation was observed. In particular, it was more effective for GSL-1, 2, 4, 6-13, and was significantly more effective for GSL-7-9, 11, 13.

実施例４ ＩＬ−１２の誘導およびＩＬ−１０の誘導
実施例１で採用した正常マウスの骨髄細胞を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で８日間培養し、骨髄由来の樹状細胞を得た。下記表に示した各ＧＳＬは、エタノール：ドデカン（９８:２）で０．５ ｍｇ／ｍｌで溶後し、９６穴プレートに２０μｌずつ分注し、溶媒を揮発させ各ＧＳＬをプレートに固相化した。対照群としてエタノール：ドデカン（９８:２）のみを分注し揮発させた。ＧＳＬを固相化したプレートに骨髄由来の樹状細胞を加え、２４時間後の培養上清を回収した。培養上清は、ＥＬＩＳＡ法によりＩＬ−１２ｐ７０の量およびＩＬ−１０の量を ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ Ｋｉｔを用いて測定した。ＩＬ−１２ｐ７０の量の測定結果を表３に、ＩＬ−１０の量の測定結果を表４に示した。 Example 4 IL-12 induction and IL-10 induction Normal mouse bone marrow cells employed in Example 1 were cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 for 8 days to obtain bone marrow-derived dendritic cells. It was. Each GSL shown in the table below is dissolved in ethanol: dodecane (98: 2) at 0.5 mg / ml, dispensed in a volume of 20 μl into a 96-well plate, the solvent is evaporated, and each GSL is solid-phased on the plate. Turned into. As a control group, only ethanol: dodecane (98: 2) was dispensed and volatilized. Bone marrow-derived dendritic cells were added to the plate on which GSL was immobilized, and the culture supernatant after 24 hours was collected. The culture supernatant was measured by ELISA for the amount of IL-12p70 and the amount of IL-10 using BD OptEIA Kit. The measurement results of the amount of IL-12p70 are shown in Table 3, and the measurement results of the amount of IL-10 are shown in Table 4.

上記表から明らかなとおり、ＩＬ−１２ｐ７０の誘導およびＩＬ−１０の誘導が認められた。特に、ＩＬ−１２ｐ７０の誘導については、ＧＳＬ−２、４、６、８、１０、１２についてさらに効果的であり、ＧＳＬ−６、８、１０、１２について顕著に効果的であった。また、ＩＬ−１０の誘導については、ＧＳＬ−１０および１２について顕著に効果的であった。  As is apparent from the above table, induction of IL-12p70 and induction of IL-10 were observed. In particular, the induction of IL-12p70 was more effective for GSL-2, 4, 6, 8, 10, 12 and significantly more effective for GSL-6, 8, 10, 12. In addition, regarding the induction of IL-10, GSL-10 and 12 were remarkably effective.

実施例５ ＮＫ細胞活性化作用
マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週令、メス）を用いた。各ＧＳＬは上記実施例２と同様の方法で溶解した。各試料は、マウス尾静脈から投与した（投与量は１００μｇ）。対照として溶媒のみを投与した（コントロール）投与１６時間後に摘出した脾臓から細胞浮遊液を調製した。脾臓細胞と⁵¹Ｃｒ標識ＹＡＣ−１細胞を５０:１の比率で混合し、４時間培養した。４時間後の培養上清中の⁵¹Ｃｒ量を、γカウンター（ＷＡＬＬＡＣ製）を用いて測定した。結果を表５に示す。なお、本実験は、実験１、２、３の３回に分けて行なった。 Example 5 NK cell activation effect C57BL / 6 mice (7 weeks old, female) were used as mice. Each GSL was dissolved in the same manner as in Example 2 above. Each sample was administered from the mouse tail vein (dosage 100 μg). As a control, a cell suspension was prepared from the spleen removed 16 hours after administration of the solvent alone (control). Spleen cells and ⁵¹ Cr-labeled YAC-1 cells were mixed at a ratio of 50: 1 and cultured for 4 hours. The amount of ⁵¹ Cr in the culture supernatant after 4 hours was measured using a γ counter (manufactured by WALLAC). The results are shown in Table 5. In addition, this experiment was performed in three times, Experiment 1, 2, and 3.

ここで、表５から明らかなとおり、ＧＳＬ−１、５、６〜９及び１３についてより効果的であり、ＧＳＬ−１、７、８について顕著に効果的であった。   Here, as is clear from Table 5, it was more effective for GSL-1, 5, 6-9 and 13, and was significantly more effective for GSL-1, 7, 8.

実施例６ 抗腫瘍作用
マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週令、メス）を用いた。腫瘍細胞Ｂ１６−Ｆ１０（北海道大学遺伝子病制御研究所）（２ｘ１０⁵個）を尾静脈から移植した。各ＧＳＬは、上記実施例２と同様の方法で溶解した。ＧＳＬの投与量は、１００μｇとし、腫瘍細胞移植後１日、５日、９日目に腹腔内投与した。移植１４日目に解剖し、肺の転移巣数を測定した。結果を表６に示す。 Example 6 Antitumor effect C57BL / 6 mice (7 weeks old, female) were used as mice. Tumor cells B16-F10 (Hokkaido University Institute for Genetic Control) (2 × 10 ⁵ cells) were transplanted from the tail vein. Each GSL was dissolved in the same manner as in Example 2 above. The dose of GSL was 100 μg, and was intraperitoneally administered on the 1st, 5th, and 9th days after tumor cell transplantation. The animals were dissected on the 14th day after transplantation, and the number of lung metastases was measured. The results are shown in Table 6.

表６から明らかなとおり、上記いずれのＧＳＬにおいても効果的に肺の転移を抑制した。特に、ＧＳＬ−２はその効果が顕著であった。   As is apparent from Table 6, lung metastasis was effectively suppressed in any of the above GSLs. In particular, the effect of GSL-2 was remarkable.

実施例７ 抗アレルギー作用
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、それぞれ、卵白アルブミン（ＯＶＡ）１００μｇと水酸化アルミニウムゲル１．６ ｍｇを混合した抗原を０日および７日に皮下接種した。１４、１５、１６日目にＯＶＡ１０μｇを生理食塩水に溶解し、点鼻接種３日後（初回接種から１８日目）に解剖した。各ＧＳＬは、０．５％ペンタンジオール、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン、９．８％ショ糖溶液で最終濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した後、生理食塩水で希釈した。生理食塩水で希釈した各ＧＳＬ溶液は、１日、５日、９日、１３日目に腹腔内投与した。肺胞洗浄液中の全細胞数および好酸球数を計測した。全細胞数はチュルク液（和光純薬工業製）で、好酸球数はギムザ染色液（メルク株式会社製）で染色し計測した。抗ＯＶＡ抗体価（ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）はＯＶＡをコーティングした９６穴プレートに段階希釈した血清を添加した。検出抗体には、アルカリホスファターゼ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＺＹＭＥＤ社製）、抗マウスＩｇＧ１抗体（ＩＣＮ社製）、抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（ＺＹＭＥＤ社製）を用いた。パラニトロフェニルリン酸塩を基質として発色させ、３ＮのＮａＯＨで反応停止後、マイクロプレートレーダーで４０５ｎｍの吸光度を測定した。抗ＯＶＡ ＩｇＥ抗体価は、抗マウスＩｇＥ抗体（日本ベクトンディッキンソン株式会社製）をコーティングした９６穴プレートに段階希釈した血清を添加した。次いで、各穴にビオチン標識したＯＶＡを添加後、パーオキシダーゼ標識ストレプトアジビンを用い、ＳｕｒｅＢｌｕｅ（フナコシ株式会社製）を基質として発色させた。２Ｎ Ｈ₂ＰＯ₄で反応停止後、マイクロプレートレーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。
また、コントロールは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＧＳＬを投与しないで同時に行ったものである。
白血球数に関する測定結果を表７に示す。好酸球数を表８に示す。 Example 7 Antiallergic Action BALB / c mice were inoculated subcutaneously on days 0 and 7 with an antigen mixed with 100 μg of ovalbumin (OVA) and 1.6 mg of aluminum hydroxide gel, respectively. On the 14th, 15th and 16th days, 10 μg of OVA was dissolved in physiological saline and dissected 3 days after nasal inoculation (18 days after the first inoculation). Each GSL was dissolved in 0.5% pentanediol, 0.5% N-lauroyl sarcosine, 9.8% sucrose solution to a final concentration of 5 mg / ml, and then diluted with physiological saline. Each GSL solution diluted with physiological saline was intraperitoneally administered on the 1st, 5th, 9th, and 13th days. The total number of cells and the number of eosinophils in the alveolar lavage fluid were counted. The total number of cells was measured by staining with Turku's solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and the number of eosinophils by staining with Giemsa staining solution (manufactured by Merck). For anti-OVA antibody titers (IgG, IgG1, IgG2a), serially diluted serum was added to a 96-well plate coated with OVA. As detection antibodies, alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG antibody (manufactured by ZYMED), anti-mouse IgG1 antibody (manufactured by ICN), and anti-mouse IgG2a antibody (manufactured by ZYMED) were used. Color was developed using paranitrophenyl phosphate as a substrate, the reaction was stopped with 3N NaOH, and the absorbance at 405 nm was measured with a microplate radar. For anti-OVA IgE antibody titer, serially diluted serum was added to a 96-well plate coated with anti-mouse IgE antibody (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.). Next, after biotin-labeled OVA was added to each hole, color was developed using SureBlue (Funakoshi Co., Ltd.) as a substrate using peroxidase-labeled streptazibine. After stopping the reaction with 2N H ₂ PO ₄ , the absorbance at 450 nm was measured with a microplate radar.
In addition, control was performed simultaneously without administering GSL to BALB / c mice.
Table 7 shows the measurement results regarding the white blood cell count. Table 8 shows the number of eosinophils.

表７および表８から明らかなとおり、肺胞洗浄液中の白血球数および好酸球数は顕著に減少した。   As is clear from Tables 7 and 8, the number of leukocytes and eosinophils in the alveolar lavage fluid was significantly reduced.

実施例８ 感染抵抗性増強作用
マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週令、メス）を用いた。各ＧＳＬは、実施例２の「Ｐ」と同様の方法で溶解した。溶解したものを、Salmonella typhimurium ΔＳＬ７２０７aroA株（スタンフォード大学医学部、米国）に感染させる１時間前に腹腔内投与接種した。感染３日目に解剖し、腹腔内生菌数を測定した。腹腔内生菌数の結果を表９に示した。
内生菌数を測定した。腹腔内生菌数の結果を表９に示した。 Example 8 Infection resistance enhancing action C57BL / 6 mice (7 weeks old, female) were used as mice. Each GSL was dissolved in the same manner as “P” in Example 2. The lysed product was inoculated intraperitoneally 1 hour before infection with Salmonella typhimurium ΔSL7207aroA strain (Stanford University School of Medicine, USA). The animals were dissected on the third day of infection, and the number of viable bacteria in the peritoneal cavity was measured. The results of the number of viable intraperitoneal bacteria are shown in Table 9.
The number of endophytic bacteria was measured. The results of the number of viable intraperitoneal bacteria are shown in Table 9.

表９中、cfuは、コロニー形成単位の略で生菌数を意味する。表９から明らかなとおり、ＧＳＬの投与により、感染抵抗性の増強作用が認められた。   In Table 9, cfu is an abbreviation for colony forming unit and means the number of viable bacteria. As is apparent from Table 9, the administration of GSL was found to enhance infection resistance.

実施例９ 抗ウイルス作用
マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週令、メス）を用いた。各ＧＳＬは、実施例２と同様の方法で溶解した。溶解したものを、マウスに静脈投与した。投与１時間後に、マウスに、マウスサイトメガロウイルス（Ｓｍｉｔｈ株）１ｘ１０⁴ｐｆｕ（ｐｆｕ：プラーク形成単位の略で生菌数を意味すである）を腹腔内接種した。感染３日目に解剖し、肝臓および脾臓内ウイルス価を測定した。その結果を、表１０に示した。また、脾臓の３日後のＮＫ活性および血清中ＩＦＮ−γを測定した。その結果を表１１（ＮＫ活性）および表１２（ＩＦＮ−γ）を示す。 Example 9 Antiviral action As a mouse, a C57BL / 6 mouse (7 weeks old, female) was used. Each GSL was dissolved in the same manner as in Example 2. The dissolved product was intravenously administered to mice. One hour after administration, mice were inoculated intraperitoneally with mouse cytomegalovirus (Smith strain) 1 × 10 ⁴ pfu (pfu: an abbreviation of plaque-forming unit, meaning viable cell count). The animals were dissected on the third day of infection, and the liver and spleen virus titers were measured. The results are shown in Table 10. In addition, NK activity and serum IFN-γ were measured 3 days after the spleen. The results are shown in Table 11 (NK activity) and Table 12 (IFN-γ).

その結果、表１０に示すとおり、ＧＳＬを前投与することにより、感染抵抗性の増強作用が認められた。また、表１１に示すとおり、ＮＫ活性は顕著に増強し、ＩＦＮ−γレベルはコントロール群と比較して増強した。特に、ＧＳＬ−６についてその効果が顕著であることが認められた。   As a result, as shown in Table 10, by pre-administering GSL, an effect of enhancing infection resistance was recognized. Further, as shown in Table 11, NK activity was remarkably enhanced, and IFN-γ levels were enhanced as compared with the control group. In particular, it was confirmed that the effect was remarkable for GSL-6.

実施例１０ ＩＬ−６産生促進作用およびＮＯ産出促進
実施例１で用いた正常マウスに４％のチオグルコール酸３ｍｌを腹腔内投与し、４日後に腹腔滲出細胞を採取し実験に用いた。マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４細胞（理化学研究所）も実験に用いた。各ＧＳＬは、エタノール：ドデカン（９８:２）溶媒で濃度が０．５ｍｇ／ｍｌとなるように溶後し、９６穴プレートに２０μｌずつ分注し、溶媒を揮発させてＧＳＬをプレートに固相化した。ＧＳＬを固相化したプレートにマクロファージを加え、２４時間後の培養上清を回収した。この培養上清については、ＥＬＩＳＡ法によりＩＬ−６を、グリース試薬を用いて一酸化窒素（ＮＯ）も測定した。ＩＬ−６の測定結果を、表１３に、一酸化窒素の測定結果を、表１４に示した。 Example 10 IL-6 Production Promoting Action and NO Production Promoting Normal mice used in Example 1 were administered 3 ml of 4% thioglycolic acid intraperitoneally, and peritoneal exudate cells were collected 4 days later and used for experiments. Macrophage cell line RAW264 cells (RIKEN) were also used for the experiment. Each GSL was dissolved in ethanol: dodecane (98: 2) solvent to a concentration of 0.5 mg / ml, dispensed 20 μl each into a 96-well plate, the solvent was volatilized, and GSL was immobilized on the plate. Turned into. Macrophages were added to the plate on which GSL had been immobilized, and the culture supernatant after 24 hours was collected. For this culture supernatant, IL-6 was measured by ELISA, and nitric oxide (NO) was also measured using a grease reagent. The measurement results of IL-6 are shown in Table 13, and the measurement results of nitric oxide are shown in Table 14.

表１３から明らかなとおり、ＩＬ−６誘導作用が認められた。特に、ＧＳＬ−５〜１３についてより効果的であり、ＧＳＬ−６〜１３についてさらに効果的であり、ＧＳＬ−７〜１３について顕著に効果的であった。
また、表１４から明らかなとおり、ＮＯ産出促進作用が認められた。特に、ＧＳＬ−２、５、９〜１３についてより効果的であり、ＧＳＬ−１１についてさらに効果的であった。 As is clear from Table 13, an IL-6 inducing action was observed. In particular, it was more effective for GSL-5 to 13, more effective for GSL-6 to 13, and remarkably effective for GSL-7 to 13.
Further, as apparent from Table 14, the NO production promoting action was recognized. In particular, GSL-2, 5, and 9 to 13 were more effective, and GSL-11 was more effective.

実施例１１
本願発明のＧＳＬ組成物についての毒性について確認した。マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週令、メス）を用いた。２０ｍｇのガラクトサミンを腹腔内投与直後に、リポ多糖（以下、「ＬＰＳ」と示すことがある）（Salmonella abortus equi由来、マックスプランク免疫生物学研究所、ドイツ、フライブルグ市）（溶媒は生理食塩水）、または、下記表１５に示したＧＳＬ（溶媒は「Ｐ＋Ｓ」）の下記表１５に示した量を、マウス尾静脈から投与した。投与２４時間後、マウスの生死を観察した。その結果を表１５に示した。 Example 11
The toxicity of the GSL composition of the present invention was confirmed. As the mouse, C57BL / 6 mouse (7 weeks old, female) was used. Immediately after intraperitoneal administration of 20 mg of galactosamine, lipopolysaccharide (hereinafter sometimes referred to as “LPS”) (derived from Salmonella abortus equi, Max Planck Institute for Immunobiology, Freiburg, Germany) (solvent is saline) Alternatively, the amount of GSL shown in Table 15 below (solvent is “P + S”) shown in Table 15 below was administered from the mouse tail vein. Mice were observed for life and death 24 hours after administration. The results are shown in Table 15.

ＬＰＳを添加した場合、１０ｎｇの添加でもすべてのマウスが死亡した。一方、ＧＳＬでは１００μｇ添加してもすべてのマウスが生存していた。このように本願発明の組成物はきわめて毒性が低いことが認められた。   When LPS was added, all mice died even with the addition of 10 ng. On the other hand, in GSL, all mice survived even when 100 μg was added. Thus, it was recognized that the composition of the present invention has extremely low toxicity.

実施例１０
エンドトキシントレランスが誘導されるか否かについて確認した。マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週令、メス）を用いた。ＬＰＳ（溶媒は生理食塩水）または各ＧＳＬの下記表１６に示す量をマウス尾静脈から投与した。投与後２４時間に、ガラクトサミン（２０ｍｇ）およびＬＰＳ（１００ｎｇ、溶媒は生理食塩水）を腹腔内投与し、マウスの生死を観察した。その結果を、表１６に示す。 Example 10
It was confirmed whether endotoxin tolerance was induced. As the mouse, C57BL / 6 mouse (7 weeks old, female) was used. LPS (solvent is physiological saline) or the amount of each GSL shown in Table 16 below was administered from the tail vein of the mouse. Twenty-four hours after administration, galactosamine (20 mg) and LPS (100 ng, solvent is physiological saline) were intraperitoneally administered, and the survival of the mice was observed. The results are shown in Table 16.

表１６から明らかなとおり、ＧＳＬ−１、ＧＳＬ−２、ＧＳＬ−６およびＧＳＬ−７を１００μｇ添加してもエンドトキシントレランスは誘導されず、すべてのマウスが死亡した。一方、ＬＰＳは１００ｎｇの添加でもエンドトキシントレランスが誘導された。   As apparent from Table 16, addition of 100 μg of GSL-1, GSL-2, GSL-6, and GSL-7 did not induce endotoxin tolerance, and all mice died. On the other hand, with LPS, endotoxin tolerance was induced even when 100 ng was added.

正常マウスにＧＳＬ−１を投与した場合のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。The analysis result by flow cytometry at the time of administering GSL-1 to a normal mouse is shown. 正常マウスにＧＳＬ−２を投与した場合のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。The analysis result by flow cytometry at the time of administering GSL-2 to a normal mouse is shown. 正常マウスにＧＳＬ−６を投与した場合のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。The analysis result by the flow cytometry at the time of administering GSL-6 to a normal mouse is shown. 正常マウスにＧＳＬ−７を投与した場合のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。The analysis result by the flow cytometry at the time of administering GSL-7 to a normal mouse is shown. ＴＬＲ４欠損マウスにＧＳＬ−１を投与した場合のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。The analysis result by flow cytometry at the time of administering GSL-1 to a TLR4 deficient mouse is shown. ＴＬＲ４欠損マウスにＧＳＬ−２を投与した場合のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。The analysis result by flow cytometry at the time of administering GSL-2 to a TLR4-deficient mouse is shown. 正常マウスに各種ＧＳＬ−１、２、６、７を投与した場合のＮＴＫ細胞の変化を示す。The change of the NTK cell when various GSL-1, 2, 6, and 7 are administered to a normal mouse is shown. 正常マウスにおけるＧＳＬ−１又はＧＳＬ−２投与後のＩＦＮ−γの濃度を示す。The density | concentration of IFN-gamma after GSL-1 or GSL-2 administration in a normal mouse is shown. 正常マウスにおけるＧＳＬ−１又はＧＳＬ−２を投与した場合のＩＮＦ−γ産生ＮＴＫ細胞の変化を示す。The change of the INF-gamma production NTK cell at the time of administering GSL-1 or GSL-2 in a normal mouse is shown. ＴＬＲ４欠損マウスにおけるＧＳＬ−１又はＧＳＬ−２投与後のＩＬ−４の濃度を示す。The concentration of IL-4 after GSL-1 or GSL-2 administration in TLR4-deficient mice is shown.

Claims (1)

スフィンゴモナスパウシモビリスから産生されたスフィンゴ糖脂質を含む食品。


A food containing glycosphingolipid produced from Sphingomonas sp. Mobilis.

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