JP2006129727A

JP2006129727A - Enzyme reaction reagent

Info

Publication number: JP2006129727A
Application number: JP2004319595A
Authority: JP
Inventors: Masayuki Nomura; 昌行野村
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 2004-11-02
Filing date: 2004-11-02
Publication date: 2006-05-25
Anticipated expiration: 2024-11-02
Also published as: JP4699008B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an enzyme reaction reagent capable of being stably stored at room temperature, to provide an enzyme reaction reagent kit given by using the same, and to provide a method for maintaining activity of an enzyme. <P>SOLUTION: This enzyme reaction reagent contains an enzyme, a buffer solution or its component, and ammonium sulfate, wherein the reagent is stored in such a state that the buffer solution or its component and the ammonium sulfate do not make contact with each other, nor make contact at high concentrations. Therefore, the reagent is stably stored at the room temperature. The enzyme reaction reagent kit and the method for maintaining the activity of the enzyme are each given by using the reagent. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、保存安定性に優れた酵素反応試薬、それを用いた酵素反応測定試薬キット、及び酵素の活性維持方法に関する。 The present invention relates to an enzyme reaction reagent excellent in storage stability, an enzyme reaction measurement reagent kit using the same, and an enzyme activity maintaining method.

酵素反応を利用した様々な測定技術が臨床診断や検査の分野で活用されている。酵素は一般に溶液状態、特に希釈条件で長時間放置すると失活する場合が多い。そのため近年、種々の方法により酵素や補酵素等の安定性を高めた調製不要の液状試薬が開発されている。しかし、これらは低温で１年程度品質を保持する設計であり、すべての酵素に適応できる汎用技術にはなっていない（特許文献１）。このためより長期間保存する場合、依然として多くの酵素が、高濃度条件にてグリセロールなどの安定化剤を添加した状態で、−２０℃で保存され、使用時に適宜、反応溶液で希釈して使用されるのが一般的である。また、保存安定性を高めるために酵素およびその他の不安定物質を凍結乾燥し、使用前に溶解液で溶解し使用することも行われる（特許文献２）。 Various measurement techniques using enzyme reactions are used in the fields of clinical diagnosis and testing. In general, enzymes are often inactivated when left in a solution state, particularly in a diluted condition for a long time. Therefore, in recent years, preparation-free liquid reagents with improved stability of enzymes and coenzymes have been developed by various methods. However, these are designed to maintain quality at a low temperature for about one year, and are not general-purpose technologies that can be applied to all enzymes (Patent Document 1). For this reason, when storing for a longer period, many enzymes are still stored at -20 ° C. with a stabilizer such as glycerol added under high concentration conditions, and diluted with a reaction solution as needed when used. It is common to be done. In addition, in order to enhance the storage stability, an enzyme and other unstable substances are freeze-dried and dissolved in a solution before use (Patent Document 2).

診断検査分野で用いられる酵素のうち、ポリメラーゼ・チェイン反応法（Polymerase Chain Reaction法）に代表される様々な核酸増幅方法で利用されているのが、配列特異的に核酸増幅を行うDNAポリメラーゼである。その利用により、遺伝子を用いた医療診断や微生物検査、各種分析が大きく伸展した（非特許文献１，２）。近年では、１回分ずつ分注されている酵素の凍結乾燥品が市販されており、室温にて保存ができ、溶液の融解や分注の必要がなく、すぐに反応が開始できるという利便性に優れたポリメラーゼ・チェイン反応試薬もある（非特許文献３，４）。 Among the enzymes used in the diagnostic test field, DNA polymerases that perform nucleic acid amplification in a sequence-specific manner are used in various nucleic acid amplification methods represented by the polymerase chain reaction method (Polymerase Chain Reaction method). . With this use, medical diagnosis, microbiological tests, and various analyzes using genes have been greatly expanded (Non-Patent Documents 1 and 2). In recent years, lyophilized products of enzymes that have been dispensed one by one have been marketed, and can be stored at room temperature, eliminating the need for thawing and dispensing solutions and allowing the reaction to start immediately. There is also an excellent polymerase chain reaction reagent (Non-patent Documents 3 and 4).

このようなDNAポリメラーゼの酵素反応を最適化するために硫酸アンモニウムを添加することが知られており（非特許文献５，６）、特に、DNA合成における配列の正確性を特徴とするTthPlus（登録商標） DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼなどの反応溶液には、収率向上のため、硫酸アンモニウムの添加が必要である（非特許文献７，８）。また、ポリメラーゼ・チェイン反応法（Polymerase Chain Reaction法）とは原理が異なる核酸増幅法であるLAMP法（loop-mediated isothermal amplification法）に用いられる鎖置換型DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼの反応溶液にも硫酸アンモニウムの添加が必要である（非特許文献９）。さらに、二本鎖DNA末端の標識や平滑化に利用するT4 DNAポリメラーゼの反応溶液にも硫酸アンモニウムを添加することが多い（非特許文献１０）。 In order to optimize the enzymatic reaction of such a DNA polymerase, it is known to add ammonium sulfate (Non-patent Documents 5 and 6), and in particular, TthPlus (registered trademark) characterized by sequence accuracy in DNA synthesis. ) Ammonium sulfate needs to be added to reaction solutions such as DNA polymerase, Tfl DNA polymerase, and Pfu DNA polymerase to improve the yield (Non-patent Documents 7 and 8). In addition, the strand displacement type DNA polymerase used in the LAMP method (loop-mediated isothermal amplification method), which is different in principle from the polymerase chain reaction method (Polymerase Chain Reaction method), and the Bst DNA polymerase reaction solution Addition of ammonium sulfate is necessary (Non-patent Document 9). Furthermore, ammonium sulfate is often added to a reaction solution of T4 DNA polymerase used for labeling or smoothing of double-stranded DNA ends (Non-patent Document 10).

ところが、これらの反応のために硫酸アンモニウムを含む酵素反応溶液を通常の方法で凍結乾燥した場合、たとえ乾燥直後であっても、再溶解した反応溶液の酵素活性は著しく低下する。このため、硫酸アンモニウムを用いる酵素の反応試薬においては、室温にて保存ができ、溶液の融解や分注の手間がかからず、すぐに反応が開始できるという利便性に優れた試薬がない。硫酸アンモニウムを含む酵素反応溶液系でも、依然として、酵素を高濃度条件にてグリセロールなどの安定化剤を添加した状態で、-20℃で保存し、使用時に適宜、反応溶液で希釈して使用しているのが現状である。
特開２００３−６６０４０号公報特許第３００６８８９号公報 Saiki,R.K.,et.al. Science, vol.230(1985),pp1350−1354 Saiki,R.K.,et.al. Science, vol.239(1988),pp487−491 「アマシャムバイオサイエンス総合製品カタログ２００４」、アマシャムバイオサイエンス株式会社、２００４年、p10-8 「RTS Amplfication Reagents パンフレット」＃2004-16-MB、インビトロジェン株式会社 Technical Bulletin ＃MO267(9/29/04),New England Biolabs,Inc. Kogan,S.C.,et.al. New England J Med, vol.317(1987),pp985-990 「ENZYME RESOURCE GUIDE,POYMERASE」＃BR075A(10/98)、Promega,c33 「GENECRAFT Catalog 2004」GeneCraft GmbH、p4 Notomi,T.,et.al. Nucleic Acids Research, vol.28(2000),e63 「CERTIFICATE OF ANALYSIS:T4 DNA Polymerase」＃EP0061 Fermentas Inc. However, when an enzyme reaction solution containing ammonium sulfate for these reactions is freeze-dried by a normal method, the enzyme activity of the redissolved reaction solution is significantly reduced even immediately after drying. For this reason, the enzyme reaction reagent using ammonium sulfate can be stored at room temperature, does not require the trouble of melting and dispensing the solution, and there is no convenient reagent that can start the reaction immediately. Even in an enzyme reaction solution system containing ammonium sulfate, the enzyme is still stored at −20 ° C. with a stabilizer such as glycerol added under high concentration conditions. The current situation is.
JP 2003-66040 A Japanese Patent No. 3006889 Saiki, RK, et.al.Science, vol.230 (1985), pp1350-1354 Saiki, RK, et.al.Science, vol.239 (1988), pp487-491 “Amersham Bioscience General Product Catalog 2004”, Amersham Biosciences, 2004, p10-8 “RTS Amplfication Reagents Brochure” # 2004-16-MB, Invitrogen Corporation Technical Bulletin # MO267 (9/29/04), New England Biolabs, Inc. Kogan, SC, et.al.New England J Med, vol. 317 (1987), pp985-990 "ENZYME RESOURCE GUIDE, POYMERASE"# BR075A (10/98), Promega, c33 "GENECRAFT Catalog 2004" GeneCraft GmbH, p4 Notomi, T., et.al.Nucleic Acids Research, vol.28 (2000), e63 “CERTIFICATE OF ANALYSIS: T4 DNA Polymerase” # EP0061 Fermentas Inc.

本発明の課題は、硫酸アンモニウムを用いる酵素の反応試薬における上記従来技術の問題点を解消し、室温にて安定に保存ができる、酵素反応試薬、それを用いた酵素反応試薬キット及び酵素の活性維持方法を提供することにある。 An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art in an enzyme reaction reagent using ammonium sulfate, and to stably store at room temperature, an enzyme reaction reagent, an enzyme reaction reagent kit using the same, and an enzyme activity maintenance To provide a method.

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムを混合した溶液を同一の試薬収容容器に収容することが酵素活性低下の主要因であることをつきとめ、緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムの接触を減ずること、すなわち酵素と緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムとが接触しない状態または高濃度に接触しない状態で保存することで酵素の活性を維持できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor is that the main factor of the decrease in enzyme activity is that the buffer solution or a solution obtained by mixing its components and ammonium sulfate is contained in the same reagent container. And reduce the contact of the buffer or its components with ammonium sulfate, that is, maintain the enzyme activity by storing it in a state where the enzyme is not in contact with the buffer or its component and ammonium sulfate or in a state where it is not in contact with high concentration. The headline and the present invention were completed.

すなわち、本発明は次のとおりの酵素反応試薬、酵素反応試薬キット及び酵素の活性維持方法（１）〜（１３）に関する。
（１）少なくとも緩衝液またはその成分、酵素、硫酸アンモニウムを含む試薬からなり、緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムとの接触が減じられていることを特徴とする酵素反応試薬。
（２）硫酸アンモニウムと接触する緩衝液またはその成分のモル数を、硫酸アンモニウムのモル数の1/12以下とする上記（１）に記載の酵素反応試薬。
（３）緩衝液またはその成分を含む乾燥試薬球（以下、第１乾燥試薬球）と、硫酸アンモニウムを含む乾燥試薬球（以下、第２乾燥試薬球）とからなり、第２乾燥試薬球中には、緩衝液またはその成分が含まれないか、あるいは、硫酸アンモニウムのモル数の1/12以下の緩衝液またはその成分が含まれることを特徴とする上記（１）または（２）のいずれかに記載の酵素反応試薬。
（４）隔膜によって緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムとの接触が減じられていることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の酵素反応試薬。
（５）酵素、緩衝液またはその成分、硫酸アンモニウムを含有する試薬キットであって、該試薬キットは、緩衝液またはその成分が収容される試薬収容容器（以下、第１容器）と、硫酸アンモニウムが収容される試薬収容容器（以下、第２容器）を含み、第２容器には、緩衝液またはその成分が含まれないか、あるいは、硫酸アンモニウムのモル数の1/12以下のモル数の緩衝液またはその成分が含まれ、酵素が少なくとも第１容器あるいは第２容器のいずれかに含まれることを特徴とする試薬キット。
（６）酵素が収容される試薬収容容器内の試薬群は乾燥し、酵素が収容されない試薬収容容器内の試薬群は液状であることを特徴とする上記（５）に記載の試薬キット。
（７）酵素が収容される試薬収容容器内の試薬群は、凍結乾燥により乾燥され、球状多孔体を形成していることを特徴とする上記（６）に記載の試薬キット。
（８）酵素が収容される試薬収容容器内に、安定化剤が含まれることを特徴とする上記（５）〜（７）のいずれかに記載の試薬キット。
（９）安定化剤が糖であることを特徴とする上記（８）記載の試薬キット。
（１０）酵素がDNAポリメラーゼであることを特徴とする上記（５）〜（９）のいずれかに記載の試薬キット。
（１１）酵素、緩衝液またはその成分、硫酸アンモニウムを含有する試薬キットであって、該試薬キットは緩衝液またはその成分を含有する乾燥試薬球（以下、第1乾燥試薬球）と、硫酸アンモニウムを含有する乾燥試薬球（以下、第2乾燥試薬球）を含み、第2乾燥試薬球中には、緩衝液またはその成分が含まれない、あるいは硫酸アンモニウムのモル数の1/12以下の緩衝液またはその成分が含まれ、酵素が少なくとも第1乾燥試薬球あるいは第2乾燥試薬球のいずれかに含まれることを特徴とする試薬キット。
（１２）酵素、緩衝液またはその成分、硫酸アンモニウムを含有する試薬キットの酵素活性を維持する方法であって、緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムの接触を減ずることを特徴とする酵素の活性維持方法。
（１３）硫酸アンモニウムに接触する緩衝液またはその成分のモル数が、硫酸アンモニウムのモル数の1/12以下であることを特徴とする上記（１２）に記載の酵素の活性維持方法。 That is, the present invention relates to the following enzyme reaction reagent, enzyme reaction reagent kit, and enzyme activity maintaining method (1) to (13).
(1) An enzyme reaction reagent comprising a reagent containing at least a buffer solution or a component thereof, an enzyme, and ammonium sulfate, wherein contact between the buffer solution or a component thereof and ammonium sulfate is reduced.
(2) The enzyme reaction reagent according to the above (1), wherein the number of moles of the buffer solution in contact with ammonium sulfate or the component thereof is 1/12 or less of the number of moles of ammonium sulfate.
(3) A dry reagent sphere containing a buffer solution or a component thereof (hereinafter referred to as a first dry reagent sphere) and a dry reagent sphere containing ammonium sulfate (hereinafter referred to as a second dry reagent sphere). Either of the above (1) or (2) is characterized in that it does not contain a buffer solution or its component, or contains a buffer solution or its component that is 1/12 or less of the number of moles of ammonium sulfate. The enzyme reaction reagent as described.
(4) The enzyme reaction reagent according to any one of (1) to (3) above, wherein the contact between the buffer solution or its component and ammonium sulfate is reduced by the diaphragm.
(5) A reagent kit containing an enzyme, a buffer solution or a component thereof, and ammonium sulfate, the reagent kit containing a reagent storage container (hereinafter referred to as a first container) in which the buffer solution or a component thereof is stored, and ammonium sulfate A reagent container (hereinafter referred to as a second container), and the second container does not contain a buffer solution or its component, or a buffer solution having a mole number of 1/12 or less of the number of moles of ammonium sulfate or A reagent kit comprising the component and an enzyme contained in at least one of the first container and the second container.
(6) The reagent kit according to (5) above, wherein the reagent group in the reagent storage container in which the enzyme is stored is dried, and the reagent group in the reagent storage container in which the enzyme is not stored is liquid.
(7) The reagent kit according to (6) above, wherein the reagent group in the reagent storage container in which the enzyme is stored is dried by lyophilization to form a spherical porous body.
(8) The reagent kit as described in any one of (5) to (7) above, wherein a stabilizer is contained in the reagent storage container in which the enzyme is stored.
(9) The reagent kit according to (8), wherein the stabilizer is a sugar.
(10) The reagent kit according to any one of (5) to (9) above, wherein the enzyme is a DNA polymerase.
(11) A reagent kit containing an enzyme, a buffer solution or a component thereof, and ammonium sulfate, the reagent kit containing a dry reagent ball (hereinafter referred to as a first dry reagent ball) containing the buffer solution or a component thereof, and ammonium sulfate A dry reagent sphere (hereinafter referred to as a second dry reagent sphere), and the second dry reagent sphere does not contain a buffer solution or its component, or a buffer solution or its buffer having a molar number of ammonium sulfate of 1/12 or less. A reagent kit comprising a component and an enzyme contained in at least one of the first dry reagent sphere and the second dry reagent sphere.
(12) A method for maintaining enzyme activity of a reagent kit containing an enzyme, a buffer solution or a component thereof, and ammonium sulfate, wherein contact between the buffer solution or its component and ammonium sulfate is reduced.
(13) The method for maintaining the activity of an enzyme according to (12) above, wherein the number of moles of the buffer solution in contact with ammonium sulfate or its component is 1/12 or less of the number of moles of ammonium sulfate.

本発明により、硫酸アンモニウムを用いる酵素の反応試薬において、室温にて安定に保存ができ、溶液の融解や分注の必要がなく、すぐに反応が開始できるという利便性に優れた酵素反応試薬を提供することができる。 According to the present invention, an enzyme reaction reagent that can be stably stored at room temperature in an enzyme reaction reagent using ammonium sulfate, and that does not require melting or dispensing of the solution and can be started immediately is provided. can do.

本発明の酵素反応試薬、それを用いた酵素反応試薬キット及び酵素の活性維持方法の提供にあたり、酵素反応における緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムとの接触を減ずることが望ましい。緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムは、同一の溶液中に含んでもよいが、緩衝液またはその成分のモル数を硫酸アンモニウムのモル数の１/12以下、好ましくは１/25以下、さらに好ましくは1/50以下、最も好ましくは完全に接触しない状態におくことが好ましい。 In providing the enzyme reaction reagent of the present invention, the enzyme reaction reagent kit using the same, and the method for maintaining the activity of the enzyme, it is desirable to reduce the contact between the buffer in the enzyme reaction or its components and ammonium sulfate. The buffer solution or its component and ammonium sulfate may be contained in the same solution, but the number of moles of the buffer solution or its component is 1/12 or less, preferably 1/25 or less, more preferably 1/25 of the number of moles of ammonium sulfate. It is preferable to keep it in a state of 50 or less, most preferably not completely in contact.

緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムとの接触を減ずる方法として、種々の手段を適用することができる。例えば、緩衝液またはその成分を含む乾燥試薬と硫酸アンモニウムを含む乾燥試薬とを別々に調製するほか、破壊できる、あるいは溶解できる隔膜で仕切っておき、使用時に隔膜を破り、あるいは溶かし、緩衝液またはその成分を含む試薬と硫酸アンモニウムを含む試薬が混合されるようにしてもよい。この場合、「破壊できる隔膜」とは、例えば針のような先端のとがったもので破るか、応力をかけて破ることができる膜であって、そのような外部応力をかけない限り破れない素材として、ポリエチレン、ポリプロピレンが挙げられ、一方、「溶けやすい隔膜」とは、例えば水溶性フィルムであって、ポリビニルアルコールを主成分とするフィルムやポリエチレングリコールを素材とするフィルムなどが挙げられる。さらに、他の手段として、同一のカートリッジ内に２つのチャンバーを設け、使用時に両者をつなぐ流路を介して混合するようにしてもよく、本発明ではこのような手段でも接触が減じることができる。 Various means can be applied as a method of reducing contact between the buffer solution or its component and ammonium sulfate. For example, a dry reagent containing a buffer solution or its components and a dry reagent containing ammonium sulfate are prepared separately, separated by a diaphragm that can be broken or dissolved, and the diaphragm is broken or dissolved during use. A reagent containing a component and a reagent containing ammonium sulfate may be mixed. In this case, the “breakable diaphragm” is a film that can be broken with a pointed tip such as a needle, or can be broken by applying stress, and it cannot be broken unless such external stress is applied. On the other hand, polyethylene and polypropylene can be mentioned, while the “easily soluble diaphragm” is, for example, a water-soluble film, such as a film mainly composed of polyvinyl alcohol or a film mainly composed of polyethylene glycol. Further, as another means, two chambers may be provided in the same cartridge, and the two cartridges may be mixed through a flow path connecting the two at the time of use. In the present invention, such means can reduce contact. .

また本発明において、２種以上の試薬を含んでなる酵素反応試薬キットを提供する場合は、緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムをそれぞれ別個の試薬に分離して含有させることができる。例えば少なくとも酵素、基質、硫酸アンモニウム、安定化剤を含む乾燥試薬が、緩衝液またはその成分を含まないか、あるいは緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムを含む試薬であって、その緩衝液またはその成分が硫酸アンモニウムのモル数の１２分の１以下に調整されている試薬と、緩衝液またはその成分を含む試薬とを組み合わせることで、保存性の高い、利便性に優れた形態の酵素反応試薬キットを提供することができる。このキットは、酵素を含む試薬は乾燥されていることが好ましいが、酵素を含まない試薬については、液体試薬または乾燥試薬のいずれでもよい。 In the present invention, when an enzyme reaction reagent kit comprising two or more kinds of reagents is provided, the buffer solution or its component and ammonium sulfate can be separately contained in separate reagents. For example, the dry reagent containing at least an enzyme, a substrate, ammonium sulfate, and a stabilizer does not contain a buffer solution or its component, or is a reagent containing a buffer solution or its component and ammonium sulfate, and the buffer solution or its component is ammonium sulfate. By providing a reagent adjusted to 1/12 or less of the number of moles of the reagent and a reagent containing a buffer solution or a component thereof, an enzyme reaction reagent kit having a highly storable and convenient form is provided. be able to. In this kit, the reagent containing the enzyme is preferably dried, but the reagent not containing the enzyme may be either a liquid reagent or a dry reagent.

本発明において、緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムとの接触を減ずるように保存することで、酵素の活性維持方法、酵素反応試薬および酵素反応試薬キットを提供することができる。 In the present invention, an enzyme activity maintaining method, an enzyme reaction reagent, and an enzyme reaction reagent kit can be provided by storing the buffer solution or its component so as to reduce contact with ammonium sulfate.

本発明で用いられる酵素は、その酵素活性を増加させるに際し硫酸アンモニウムを添加する酵素であれば特に限定されない。例えば、Bst DNAポリメラーゼ、ラージフラグメント（Bst DNA Polymerase, Large Fragment）は、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来DNAポリメラーゼ蛋白の一部であり、5'→3'ポリメラーゼ活性を持ち、5'→3'ヌクレアーゼドメインを欠く酵素であるが、ＧＣ含量の多いDNAのシークエンシングやナノグラム（ng）量のDNAテンプレートの迅速なシークエンシングなどに活用することができる。また、LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法に用いられる鎖置換型DNAポリメラーゼも用いることができる。 The enzyme used in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme to which ammonium sulfate is added in increasing the enzyme activity. For example, Bst DNA polymerase, large fragment (Bst DNA Polymerase, Large Fragment) is part of a DNA polymerase protein derived from Bacillus stearothermophilus and has 5 ′ → 3 ′ polymerase activity. Although it is an enzyme lacking a '→ 3' nuclease domain, it can be used for sequencing a DNA with a high GC content or rapid sequencing of a nanogram (ng) amount of a DNA template. Moreover, the strand displacement type DNA polymerase used for LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) method can also be used.

上記Ｂｓｔ DNAポリメラーゼの一般的な反応溶液条件は、20mM Tris-HCl (pH8.8 25℃で)、10mM KCl、10mM (NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄、0.1% Triton X-100である。本発明によって提供される酵素反応試薬、酵素反応試薬キットおよび酵素の活性維持方法には、この他にも、Pfu DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼなどを使用することができる。これらの酵素では、通常、正確性を重視した反応条件において、10mM〜20mM程度の硫酸アンモニウムを添加する。 The general reaction solution conditions for the above Bst DNA polymerase are 20 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C.), 10 mM KCl, 10 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 2 mM MgSO ₄ , 0.1% Triton X-100. . Other enzyme reaction reagents, enzyme reaction reagent kits, and enzyme activity maintaining methods provided by the present invention use Pfu DNA polymerase, Tth DNA polymerase, Tfl DNA polymerase, T4 DNA polymerase, Taq DNA polymerase, etc. can do. In these enzymes, ammonium sulfate of about 10 mM to 20 mM is usually added under reaction conditions that place importance on accuracy.

本発明で用いられる緩衝液またはその成分としては、Tris-HCl、Tris-acetateなどの他、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液なども用いることができる。その他酵素反応を行うにあたり必要な成分として、無機塩、界面活性剤があり、それぞれの酵素に適したものを利用することが望ましい。例えば、無機塩としては、KCl、MgSO₄、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム等が用いられ、界面活性剤としては、Triton X-100、Tween20、Betaineが挙げられる。 As a buffer solution or a component thereof used in the present invention, a phosphate buffer solution, a citrate buffer solution, a borate buffer solution, a GOOD buffer solution, etc. can be used in addition to Tris-HCl, Tris-acetate, and the like. Other components necessary for carrying out the enzyme reaction include inorganic salts and surfactants, and it is desirable to use those suitable for each enzyme. For example, KCl, MgSO ₄ , potassium acetate, magnesium acetate or the like is used as the inorganic salt, and examples of the surfactant include Triton X-100, Tween 20, and Betaine.

本発明で用いられる安定化剤としては、単糖類六単糖のグルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、単糖類五単糖のキシロース、アラビノース、二糖類のスクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、三糖類のマルトトリオース、ラフィノース、多糖類のデキストラン、牛血清アルブミン、キレート剤などを用いることができる。このうち、凍結乾燥において実績のあるトレハロース、ラフィノース、マルトース、マルトトリオース、ラクトース、デキストラン、およびスクロースなどが特に望ましい。安定化剤の添加量は、乾燥直前の溶液状態での添加量として、1〜20w/v%、好ましくは、5〜10w/v%である。これは、最終反応溶液中の濃度で表すと、0.25〜5w/v%、好ましくは、1.26〜2.52w/v%相当となる。本発明で用いられる酵素は、乾燥後の溶解性や形状の観点から、その保存溶液にグリセロールを含まないことが望ましく、グリセロールを含んだ場合でも、溶解後の最終反応溶液中に0.01%以下、好ましくは0.005%程度になるように調整することが望ましい。通常、高濃度の酵素溶液を50%グリセロール溶液で保存し、使用時に十分希釈することでこれを実現する。 Stabilizers used in the present invention include monosaccharide hexasaccharide, glucose, fructose, galactose, mannose, monosaccharide pentasaccharide xylose, arabinose, disaccharide sucrose, trehalose, maltose, lactose, trisaccharide malto Triose, raffinose, polysaccharide dextran, bovine serum albumin, chelating agents and the like can be used. Of these, trehalose, raffinose, maltose, maltotriose, lactose, dextran, sucrose and the like that have been proven in lyophilization are particularly desirable. The addition amount of the stabilizer is 1 to 20 w / v%, preferably 5 to 10 w / v% as the addition amount in a solution state immediately before drying. This is equivalent to 0.25 to 5 w / v%, preferably 1.26 to 2.52 w / v% when expressed in terms of concentration in the final reaction solution. The enzyme used in the present invention preferably contains no glycerol in the storage solution from the viewpoint of solubility and shape after drying, and even when glycerol is contained, 0.01% or less in the final reaction solution after dissolution, It is desirable to adjust so that it is preferably about 0.005%. This is usually achieved by storing a highly concentrated enzyme solution in a 50% glycerol solution and diluting it well at the time of use.

本発明で用いられる試薬は乾燥して用いることができる。試薬の乾燥方法としては、凍結乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、流動層造粒乾燥などがあるが、好ましくは凍結乾燥である。凍結乾燥は、真空中で氷晶点以下の温度に保持しながら乾燥する方法であり、含水物中の水分が固体から気体へ気化する昇華による乾燥である。凍結乾燥で用いられる真空領域は107Paから1Paであり、このときの水の沸点はそれぞれ-20℃から-60℃である。噴霧乾燥は、高温気流中に液を噴霧させ蒸発表面積を拡大して瞬時に乾燥する方法である。熱風中で有効に熱交換が行われるため粒子は気化熱によりそれほど高い温度にならず、噴霧条件を適切に設定することにより熱変性も問題にならない。ドラム乾燥は、加熱された回転ドラムの表面に対象物をフィルム上に塗布し、蒸発面積を拡大して迅速に連続的に乾燥させる方法である。流動層造粒乾燥は、下方から熱風を送り込んで粉末を激しく流動させてその中に結着液を噴霧しながら粒体を造粒、乾燥する方法である。
特に、凍結乾燥させた試薬は多孔質構造体となるので、短時間に少量の液体に溶解させることができ、酵素反応試薬として優れており、25μlの液体に30秒以内に溶解させることも可能である。 The reagent used in the present invention can be used after drying. Examples of the method for drying the reagent include freeze drying, spray drying, drum drying, fluidized bed granulation drying, and the like, preferably freeze drying. Freeze-drying is a method of drying while maintaining a temperature below the ice crystal point in a vacuum, and is drying by sublimation in which water in the hydrated product is vaporized from a solid to a gas. The vacuum region used for freeze-drying is 107 Pa to 1 Pa, and the boiling point of water at this time is -20 ° C to -60 ° C, respectively. Spray drying is a method in which a liquid is sprayed in a high-temperature air stream to enlarge the evaporation surface area and dry instantaneously. Since heat exchange is effectively performed in hot air, the particles do not reach a very high temperature due to the heat of vaporization, and heat denaturation does not become a problem by appropriately setting the spraying conditions. Drum drying is a method in which an object is coated on the surface of a heated rotating drum on a film, and the evaporation area is enlarged and dried rapidly and continuously. Fluidized bed granulation drying is a method in which hot air is sent from below to vigorously flow the powder and granulate and dry the particles while spraying the binding liquid therein.
In particular, since the freeze-dried reagent has a porous structure, it can be dissolved in a small amount of liquid in a short time, and is excellent as an enzyme reaction reagent, and can be dissolved in 25 μl of liquid within 30 seconds. It is.

本発明は上記のとおりであるが、さらに本発明の酵素反応試薬とは、次の（１）〜（１１）のように例示することができる。
（１）硫酸アンモニウムを必要とする酵素の反応試薬であって、少なくとも緩衝液またはその成分、無機塩を含む第一試薬と、少なくとも酵素、基質、硫酸アンモニウム、安定化剤を含む第二試薬とからなり、第一試薬がpH7.5乃至9.0であることを特徴とする液状試薬であり、第二試薬が緩衝液またはその成分を含まないか、あるいは硫酸アンモニウムのモル数の１２分の１以下に調整した乾燥試薬であって、使用直前に第一試薬にて溶解することを特徴とする酵素反応試薬である。
（２）望ましくは、第二試薬が凍結乾燥された球状多孔性構造体からなる上記（１）の酵素反応試薬。
（３）さらに望ましくは、第二試薬が30秒で25μlの第一試薬に完全に溶解することが出来る上記（１）または（２）の酵素反応試薬。 Although the present invention is as described above, the enzyme reaction reagent of the present invention can be exemplified as the following (1) to (11).
(1) A reaction reagent for an enzyme that requires ammonium sulfate, comprising at least a buffer solution or a component thereof, a first reagent containing an inorganic salt, and a second reagent containing at least an enzyme, a substrate, ammonium sulfate, and a stabilizer. The liquid reagent is characterized in that the first reagent has a pH of 7.5 to 9.0, and the second reagent does not contain a buffer solution or its component, or is adjusted to 1/12 or less of the number of moles of ammonium sulfate. It is a dry reagent, which is an enzyme reaction reagent that is dissolved in a first reagent immediately before use.
(2) Preferably, the enzyme reaction reagent according to (1) above, wherein the second reagent comprises a spherical porous structure obtained by freeze-drying.
(3) More preferably, the enzyme reaction reagent according to (1) or (2) above, wherein the second reagent can be completely dissolved in 25 μl of the first reagent in 30 seconds.

（４）また、上記（２）の球状多孔構造体が、一体性を有する酵素反応試薬。
（５）あるいは、上記（２）の球状多孔構造体が構造的に２つに分離されている酵素反応試薬。
（６）上記（２）の球状多孔性構造体である第二試薬は、10%未満の含水量を有することが望ましい。
（７）室温保存で安定である上記（１）または（２）の第一試薬及び第二試薬。
（８）上記（１）または（２）の第二試薬に含まれる安定化剤は糖であることが望ましい。
（９）さらに、上記糖が、トレハロース、ラフィノース、マルトース、マルトトリオース、ラクトース、デキストラン、およびスクロースからなる群から選択されることが望ましい。
（１０）またさらに、上記（１）、（２）、（７）、（８）のいずれかの第二試薬に含まれる酵素としてDNAポリメラーゼが例示される。
（１１）望ましくは、上記DNAポリメラーゼとしてBst DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼからなる群から選択される少なくとも１つのDNAポリメラーゼが例示される。 (4) An enzyme reaction reagent in which the spherical porous structure of (2) has integrity.
(5) Alternatively, the enzyme reaction reagent in which the spherical porous structure of (2) is structurally separated into two.
(6) The second reagent which is the spherical porous structure of (2) preferably has a water content of less than 10%.
(7) The first reagent and the second reagent of (1) or (2), which are stable at room temperature storage.
(8) The stabilizer contained in the second reagent of (1) or (2) is preferably a sugar.
(9) Furthermore, it is desirable that the sugar is selected from the group consisting of trehalose, raffinose, maltose, maltotriose, lactose, dextran, and sucrose.
(10) Still further, a DNA polymerase is exemplified as the enzyme contained in the second reagent of any one of (1), (2), (7), and (8).
(11) Desirably, the DNA polymerase is preferably at least one DNA polymerase selected from the group consisting of Bst DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, Tth DNA polymerase, Tfl DNA polymerase, T4 DNA polymerase, and Taq DNA polymerase.

本発明は上記のとおりであるが、さらに本発明の酵素反応試薬キットとは、次の（１２）のように例示することができる。
（１２）上記（１）、（２）、（７）、（８）、（１０）のいずれかの酵素反応試薬を用い、第二試薬を予め反応容器に所定の容量を入れた状態で室温もしくは冷蔵にて保管し、室温もしくは冷蔵にて保管した第一試薬を所定量注入して酵素反応を測定する酵素反応試薬キット。 The present invention is as described above. Further, the enzyme reaction reagent kit of the present invention can be exemplified as shown in the following (12).
(12) Using the enzyme reaction reagent of any one of (1), (2), (7), (8), and (10) above, the second reagent is room temperature in a state where a predetermined volume is previously placed in a reaction vessel Alternatively, an enzyme reaction reagent kit that is stored in a refrigerator and injects a predetermined amount of a first reagent stored at room temperature or in a refrigerator to measure an enzyme reaction.

本発明は上記のとおりであるが、さらに本発明の酵素の活性維持方法とは、次の（１３）のように例示することができる。
（１３）上記（１）、（２）、（７）、（８）、（１０）のいずれかに記載の酵素反応試薬を用いる酵素反応測定方法。 Although the present invention is as described above, the method for maintaining the activity of the enzyme of the present invention can be further exemplified by the following (13).
(13) An enzyme reaction measurement method using the enzyme reaction reagent according to any one of (1), (2), (7), (8), and (10).

また、本発明は上記のとおりであるが、さらに本発明の酵素試薬または酵素反応キットの製造方法として、次の（１４）〜（１８）の方法を例示することができる。
（１４）（ａ）酵素、基質、硫酸アンモニウム、安定化剤を含む第二試薬の水溶液を用意し、（ｂ）比重１．０未満の不活性な溶媒を準備し、（ｃ）均一にした第二試薬を上記溶媒中に分注して液滴を球状に形成させ、（ｄ）上記溶媒及び液滴を冷却して液滴を凍結させ、そして（ｅ）球体形状を保つのに適当な条件下で上記液滴を乾燥して酵素反応試薬球体を形成させる各工程を含んでなる酵素反応試薬球体を製造し、これを使用直前に緩衝液またはその成分、無機塩を含む第一試薬にて溶解することを特徴とする酵素反応試薬球体を製造する方法。
（１５）望ましくは、第一試薬がpH7.5乃至9.0である液状試薬であり、第二試薬が緩衝液またはその成分を含まないか、もしくは第一試薬に含まれる緩衝液またはその成分の１２分の１以下の濃度で調製した乾燥試薬球体となるように製造する上記（１４）の方法。
（１６）あるいは、酵素反応試薬球体が約10%未満の水分を含むように減圧乾燥を続ける、上記（１４）の方法。
（１７）もしくは、酵素反応試薬球体が、約1mm〜約5mmの直径を有する、上記（１４）の方法。
（１８）さらに、第二試薬に含まれる酵素がDNAポリメラーゼであり、安定化剤が糖である上記（１４）の方法。 Moreover, although this invention is as above-mentioned, the following methods (14)-(18) can be illustrated as a manufacturing method of the enzyme reagent or enzyme-reaction kit of this invention further.
(14) (a) preparing an aqueous solution of a second reagent containing an enzyme, a substrate, ammonium sulfate, and a stabilizer; (b) preparing an inert solvent having a specific gravity of less than 1.0; Appropriate conditions for dispensing the two reagents into the solvent to form droplets, (d) cooling the solvent and droplets to freeze the droplets, and (e) keeping the sphere shape An enzyme reaction reagent sphere comprising the steps of forming the enzyme reaction reagent sphere by drying the above-mentioned droplets is manufactured under the first reagent containing a buffer solution or a component thereof and an inorganic salt immediately before use. A method for producing an enzyme reaction reagent sphere characterized by dissolving.
(15) Preferably, the first reagent is a liquid reagent having a pH of 7.5 to 9.0, and the second reagent does not contain a buffer solution or its component, or the buffer solution or its component contained in the first reagent is 12 The method according to (14) above, wherein the dry reagent spheres are prepared to have a concentration of 1 / min or less.
(16) Alternatively, the method of (14) above, wherein drying under reduced pressure is continued so that the enzyme reaction reagent sphere contains less than about 10% of water.
(17) Alternatively, the method of (14) above, wherein the enzyme reaction reagent sphere has a diameter of about 1 mm to about 5 mm.
(18) The method according to (14), wherein the enzyme contained in the second reagent is a DNA polymerase and the stabilizer is a sugar.

さらに、本発明の酵素試薬または酵素反応キットの製造にあたり、酵素反応試薬球体を製造する方法およびその酵素反応試薬球体について、次の（１９）〜（３７）を例示することができる。
（１９）そして、上記（１４）の方法に従って製造される酵素反応試薬球体。
（２０）また、（ａ）酵素、基質、安定化剤を含む水溶液、及び硫酸アンモニウムを単独で含む水溶液を用意し、（ｂ）比重1.0未満の不活性な溶媒を準備し、（ｃ）均一にした２種の水溶液をそれぞれ、上記溶媒中に分注して液滴を球状に形成させ、（ｄ）上記溶媒及び液滴を冷却して液滴を凍結させ、そして（ｅ）球体形状を保つのに適当な条件下で上記液滴を乾燥して酵素反応試薬球体を形成させる各工程を含んでなり、この２種類の酵素反応試薬球体をあわせて第二試薬とし、使用直前に緩衝液またはその成分、無機塩を含む第一試薬にて溶解することを特徴とする酵素反応試薬球体を製造する方法。
（２１）望ましくは、第一試薬がpH7.5乃至9.0であり、硫酸アンモニウムを含まないことを特徴とする液状試薬である、上記（２０）の方法。
（２２）あるいは、酵素反応試薬球体が約１０％未満の水分を含むように減圧乾燥を続ける、上記（２０）の方法。
（２３）もしくは、酵素反応試薬球体が、それぞれ約1mm〜約5mmの直径を有する、上記（２０）の方法。
（２４）さらに、第二試薬に含まれる酵素がDNAポリメラーゼであり、安定化剤が糖であることを特徴とする、上記（２０）の方法。
（２５）そして、（２０）の方法に従って製造される酵素反応試薬球体。 Further, in the production of the enzyme reagent or enzyme reaction kit of the present invention, the following (19) to (37) can be exemplified for the method for producing the enzyme reaction reagent sphere and the enzyme reaction reagent sphere.
(19) An enzyme reaction reagent sphere produced according to the method of (14) above.
(20) In addition, (a) prepare an aqueous solution containing an enzyme, a substrate and a stabilizer, and an aqueous solution containing ammonium sulfate alone, (b) prepare an inert solvent having a specific gravity of less than 1.0, and (c) uniformly Each of the two aqueous solutions was dispensed into the solvent to form droplets, (d) the solvent and the droplets were cooled to freeze the droplets, and (e) the spherical shape was maintained. Each step of drying the droplets under conditions suitable for forming an enzyme reaction reagent sphere, and combining the two types of enzyme reaction reagent spheres as a second reagent. A method for producing an enzyme reaction reagent sphere, which comprises dissolving the component with a first reagent containing an inorganic salt.
(21) The method according to (20), wherein the first reagent is preferably a liquid reagent having a pH of 7.5 to 9.0 and containing no ammonium sulfate.
(22) Alternatively, the method of (20) above, wherein drying under reduced pressure is continued so that the enzyme reaction reagent sphere contains less than about 10% of water.
(23) Alternatively, the method of (20) above, wherein each of the enzyme reaction reagent spheres has a diameter of about 1 mm to about 5 mm.
(24) The method according to (20) above, wherein the enzyme contained in the second reagent is a DNA polymerase, and the stabilizer is a sugar.
(25) An enzyme reaction reagent sphere produced according to the method of (20).

（２６）また、（ａ）酵素、基質、硫酸アンモニウム、安定化剤を含む第二試薬の水溶液を用意し、（ｂ）撥水性容器を準備し、（ｃ）均一にした第二試薬を上記撥水性容器中に分注して液滴を球状に形成させ、（ｄ）上記容器及び液滴を冷却して液滴を凍結させ、そして（ｅ）球体形状を保つのに適当な条件下で上記液滴を乾燥して酵素反応試薬球体を形成させる各工程を含んでなり、使用直前に緩衝液またはその成分、無機塩を含む第一試薬にて溶解することを特徴とする酵素反応試薬球体を製造する方法。
（２７）望ましくは、第一試薬がpH7.5乃至9.0であることを特徴とする液状試薬であり、第二試薬が緩衝液またはその成分を含まないか、もしくは第一試薬に含まれる緩衝液またはその成分の１２分の１以下の濃度で調製した乾燥試薬球体となるように製造する上記（２６）に記載の方法。
（２８）あるいは、酵素反応試薬球体が約10%未満の水分を含むように減圧乾燥を続ける、上記（２６）の方法。
（２９）もしくは、酵素反応試薬球体が、約1mm〜約5mmの直径を有する、上記（２６）の方法。
（３０）さらに、第二試薬に含まれる酵素がDNAポリメラーゼであり、安定化剤が糖であることを特徴とする、上記（２６）の方法。
（３１）そして、上記（２６）の方法に従って製造される酵素反応試薬球体。 (26) In addition, (a) an aqueous solution of a second reagent containing an enzyme, a substrate, ammonium sulfate, and a stabilizer is prepared, (b) a water-repellent container is prepared, and (c) the uniform second reagent is repelled. Dispensing into an aqueous container to form droplets, (d) cooling the container and droplets to freeze the droplets, and (e) under conditions suitable to maintain a spherical shape An enzyme reaction reagent sphere comprising steps of drying a droplet to form an enzyme reaction reagent sphere, which is dissolved in a first reagent containing a buffer solution or a component thereof and an inorganic salt immediately before use. How to manufacture.
(27) Preferably, the liquid reagent is characterized in that the first reagent has a pH of 7.5 to 9.0, and the second reagent does not contain a buffer solution or a component thereof, or a buffer solution contained in the first reagent. Or the method as described in said (26) manufactured so that it may become the dry reagent sphere prepared with the density | concentration of 1/12 or less of the component.
(28) Alternatively, the method of (26) above, wherein drying under reduced pressure is continued so that the enzyme reaction reagent sphere contains less than about 10% of water.
(29) Alternatively, the method of (26) above, wherein the enzyme reaction reagent sphere has a diameter of about 1 mm to about 5 mm.
(30) The method according to (26) above, wherein the enzyme contained in the second reagent is a DNA polymerase, and the stabilizer is a sugar.
(31) An enzyme reaction reagent sphere produced according to the method of (26) above.

（３２）また、（ａ）酵素、基質、安定化剤を含む水溶液、及び硫酸アンモニウムを単独で含む水溶液を用意し、（ｂ）撥水性容器を準備し、（ｃ）均一にした２種の水溶液をそれぞれ、上記撥水性容器中に分注して液滴を球状に形成させ、（ｄ）上記容器及び液滴を冷却して液滴を凍結させ、そして（ｅ）球体形状を保つのに適当な条件下で上記液滴を乾燥して酵素反応試薬球体を形成させる各工程を含んでなり、この２種類の酵素反応試薬球体をあわせて第二試薬とし、使用直前に緩衝液またはその成分、無機塩を含む第一試薬にて溶解することを特徴とする酵素反応試薬球体を製造する方法。
（３３）望ましくは、第一試薬がpH7.5乃至9.0であり、硫酸アンモニウムを含まないことを特徴とする液状試薬である、上記（３２）の方法。
（３４）あるいは、酵素反応試薬球体が約10%未満の水分を含むように減圧乾燥を続ける、上記（３２）の方法。
（３５）もしくは、酵素反応試薬球体が、それぞれ約1mm〜約5mmの直径を有する、（３２）の方法。
（３６）さらに、第二試薬に含まれる酵素がDNAポリメラーゼであり、安定化剤が糖であることを特徴とする、上記（３２）の方法。
（３７）そして、上記（３２）の方法に従って製造される酵素反応試薬球体。
以下、参考例、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 (32) Also, (a) an aqueous solution containing an enzyme, a substrate and a stabilizer, and an aqueous solution containing ammonium sulfate alone are prepared, (b) a water-repellent container is prepared, and (c) two uniform aqueous solutions. Are dispensed into the water-repellent container to form droplets in a spherical shape, (d) the container and droplets are cooled to freeze the droplets, and (e) suitable to maintain a spherical shape Each step of drying the droplets under various conditions to form enzyme reaction reagent spheres, and combining the two types of enzyme reaction reagent spheres as a second reagent, A method for producing an enzyme reaction reagent sphere, which comprises dissolving with a first reagent containing an inorganic salt.
(33) The method according to (32) above, which is preferably a liquid reagent characterized in that the first reagent has a pH of 7.5 to 9.0 and does not contain ammonium sulfate.
(34) Alternatively, the method of (32) above, wherein drying under reduced pressure is continued so that the enzyme reaction reagent sphere contains less than about 10% of water.
(35) Alternatively, the enzyme reaction reagent spheres each have a diameter of about 1 mm to about 5 mm.
(36) The method according to (32) above, wherein the enzyme contained in the second reagent is a DNA polymerase, and the stabilizer is a sugar.
(37) An enzyme reaction reagent sphere produced according to the method of (32) above.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference examples and examples, but the present invention is not limited thereto.

［参考例１］
鎖置換型DNAポリメラーゼであるBst DNAポリメラーゼを用いたLAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法での例を示す。LAMP法の実際の手順については、例えば（非特許文献９）に詳しく、開示されている。結核菌M.tuberculosis（H37Ra）のゲノムDNA検出系をモデルケースとして説明する。 [Reference Example 1]
An example of LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) method using Bst DNA polymerase, which is a strand displacement type DNA polymerase, is shown. The actual procedure of the LAMP method is disclosed in detail in, for example, (Non-Patent Document 9). A genomic DNA detection system for M. tuberculosis (H37Ra) will be described as a model case.

LAMP反応用プライマーとして配列番号１から配列番号６に記載のオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。すなわち、インナープライマーとしてFIPプライマー（配列番号１）およびBIPプライマー（配列番号２）、アウタープライマーとしてF3プライマー（配列番号３）およびB3プライマー（配列番号４）、ループプライマーとしてFLプライマー（配列番号５）およびBLプライマー（配列番号６）を準備した。次に、25μl中に、20mM Tris-HCl(pH8.8)、10mM KCl、8mM MgSO₄、10mM (NH₄)₂SO₄、0.1% Tween20、0.8M Betaine、2.8mM dGTP、2.8mM dCTP、2.8mM dATP、2.8mM dTTP、40pmol(1.6μM) FIPプライマー（配列番号１）、40pmol(1.6μM) BIPプライマー（配列番号２）、5pmol(0.2μM) F3プライマー（配列番号３）、5pmol(0.2μM) B3プライマー（配列番号４）、40pmol(1.6μM) FLプライマー（配列番号５）、40pmol(1.6μM) BLプライマー（配列番号６）、8units Bst DNA Polymerase Large Fragment(NEW ENGLAND BioLabs製）、及び10pg 結核菌M.tuberculosisゲノムDNAとなるように添加し、これを陽性標準とした（表１）。一方、陽性標準の成分のうち、10pg 結核菌M.tuberculosisゲノムDNAのみを除いたものを陰性標準とした（表１）。また、陰性標準液をそのまま凍結乾燥し、凍結乾燥終了後、直ちに10pg 結核菌M.tuberculosisゲノムDNAのみを含む25μlの蒸留水で溶解したものを乾燥試薬１とした（表１）。
凍結乾燥は、溶液を独立バイアル脱着型96穴プレートのポリプロピレン製バイヤル（株式会社ハイペップ研究所製）に溶液を入れ、容器ごとヘキサン−ドライアイスにて冷却し溶液を凍結させた後、凍結乾燥機（FD-1000型、東京理化器械株式会社製）にて16時間乾燥させた。 Oligonucleotides described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 were chemically synthesized as LAMP reaction primers. That is, FIP primer (SEQ ID NO: 1) and BIP primer (SEQ ID NO: 2) as inner primers, F3 primer (SEQ ID NO: 3) and B3 primer (SEQ ID NO: 4) as outer primers, FL primer (SEQ ID NO: 5) as loop primers And a BL primer (SEQ ID NO: 6) was prepared. Next, in 25 μl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 8 mM MgSO ₄ , 10 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0.1% Tween 20, 0.8 M Betaine, 2.8 mM dGTP, 2.8 mM dCTP, 2.8 mM dATP, 2.8 mM dTTP, 40 pmol (1.6 μM) FIP primer (SEQ ID NO: 1), 40 pmol (1.6 μM) BIP primer (SEQ ID NO: 2), 5 pmol (0.2 μM) F3 primer (SEQ ID NO: 3), 5 pmol (0.2 μM) ) B3 primer (SEQ ID NO: 4), 40 pmol (1.6 μM) FL primer (SEQ ID NO: 5), 40 pmol (1.6 μM) BL primer (SEQ ID NO: 6), 8 units Bst DNA Polymerase Large Fragment (manufactured by NEW ENGLAND BioLabs), and 10 pg It added so that it might become M. tuberculosis genomic DNA, and this was made into the positive standard (Table 1). On the other hand, among the components of the positive standard, 10 pg of Mycobacterium tuberculosis M. tuberculosis genomic DNA was excluded as a negative standard (Table 1). Further, the negative standard solution was lyophilized as it was, and immediately after completion of lyophilization, it was immediately dissolved in 25 μl of distilled water containing only 10 pg of M. tuberculosis genomic DNA as dry reagent 1 (Table 1).
In lyophilization, the solution is placed in a polypropylene vial (manufactured by Hypep Laboratories) with an independent vial removable 96-well plate, cooled with hexane-dry ice together with the container, and then freeze-dried. (FD-1000 type, manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) for 16 hours.

これらサンプルをLAMP反応用0.2mlマイクロチューブ（栄研化学株式会社製）に入れ、速やかにLAMP反応専用リアルタイム濁度測定装置LA―200（テラメックス株式会社製）にセットし、64℃にて60分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定し、酵素活性を評価した。
図１にリアルタイム濁度測定の結果を示す。乾燥試薬１の測定値は陰性標準と重なっている。また、各サンプルのLAMP反応の濁度が0.1に達した時間を表２にまとめた。このように、Tris-HClと硫酸アンモニウムを同時に含む酵素反応溶液を通常の方法で凍結乾燥すると、たとえ乾燥直後であっても、再溶解した反応溶液の酵素活性は認められなかった。 Place these samples in a 0.2 ml microtube for LAMP reaction (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), immediately set it in the LAMP reaction dedicated real-time turbidity measurement device LA-200 (manufactured by Teramex Co., Ltd.) for 60 minutes at 64 ° C The turbidity during the amplification reaction was measured and the enzyme activity was evaluated.
FIG. 1 shows the results of real-time turbidity measurement. The measured value of dry reagent 1 overlaps with the negative standard. Table 2 summarizes the time when the turbidity of the LAMP reaction of each sample reached 0.1. Thus, when the enzyme reaction solution containing Tris-HCl and ammonium sulfate at the same time was freeze-dried by a usual method, the enzyme activity of the redissolved reaction solution was not recognized even immediately after drying.

［参考例２］
最終25μl中に、20mM Tris-HCl(pH8.8)、10mM KCl、8mM MgSO₄、8mM (NH₄)₂SO₄、0.1% Tween20、0.8M Betaine、1.4mM dGTP、1.4mM dCTP、1.4mM dATP、1.4mM dTTPとなるように、22μlの第一試薬を準備した。これを溶液のまま45℃の条件で保管し、保管１日後の第一試薬と保管７日後及び２８日後の第一試薬を作製した。これら保管後第一試薬に対し、参考例１と同様に準備したLAMP反応用プライマーを、40pmol(1.6μM) FIPプライマー（配列番号１）、40pmol(1.6μM) BIPプライマー（配列番号２）、5pmol(0.2μM) F3プライマー（配列番号３）、5pmol(0.2μM) B3プライマー（配列番号４）、40pmol(1.6μM) FLプライマー（配列番号５）、40pmol(1.6μM) BLプライマー（配列番号６）、8units Bst DNA Polymerase Large Fragment(NEW ENGLAND BioLabs製）、及び10pg 結核菌M.tuberculosisゲノムDNAとなるように添加し、25μlとした。
これらサンプルをLAMP反応用0.2mlマイクロチューブ（栄研化学株式会社製）に入れ、速やかにLAMP反応専用リアルタイム濁度測定装置LA―200（テラメックス株式会社製）にセットし、64℃にて60分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した。
各サンプルのLAMP反応の濁度が0.1に達した時間を表３にまとめた。保存安定性加速試験において、45℃の条件で７日保管は、おおよそ室温(25℃)保存の２週間、もしくは4℃保存の１ヶ月程度に相当することが知られている（Shelf Life of Medical Devices; FDA, 1991）。このように、緩衝液であるTris-HCと硫酸アンモニウムを同時に含む液状第一試薬は、酵素活性の点から保存安定性が著しく悪い。 [Reference Example 2]
In a final 25 μl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 8 mM MgSO ₄ , 8 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0.1% Tween 20, 0.8 M Betaine, 1.4 mM dGTP, 1.4 mM dCTP, 1.4 mM dATP 22 μl of the first reagent was prepared so as to be 1.4 mM dTTP. This was stored in a solution at 45 ° C. to prepare a first reagent 1 day after storage and a first reagent 7 days and 28 days after storage. For these first reagents after storage, the primers for LAMP reaction prepared in the same manner as in Reference Example 1 were 40 pmol (1.6 μM) FIP primer (SEQ ID NO: 1), 40 pmol (1.6 μM) BIP primer (SEQ ID NO: 2), 5 pmol. (0.2 μM) F3 primer (SEQ ID NO: 3), 5 pmol (0.2 μM) B3 primer (SEQ ID NO: 4), 40 pmol (1.6 μM) FL primer (SEQ ID NO: 5), 40 pmol (1.6 μM) BL primer (SEQ ID NO: 6) 8 units Bst DNA Polymerase Large Fragment (manufactured by NEW ENGLAND BioLabs) and 10 pg of M. tuberculosis genomic DNA were added to make 25 μl.
Place these samples in a 0.2 ml microtube for LAMP reaction (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), immediately set it in the LAMP reaction dedicated real-time turbidity measurement device LA-200 (manufactured by Teramex Co., Ltd.) for 60 minutes at 64 ° C The reaction was carried out, and the turbidity during the amplification reaction was measured.
The time when the turbidity of the LAMP reaction of each sample reached 0.1 is summarized in Table 3. In the accelerated storage stability test, storage for 7 days at 45 ° C is known to correspond to approximately 2 weeks of storage at room temperature (25 ° C) or 1 month of storage at 4 ° C (Shelf Life of Medical Devices; FDA, 1991). As described above, the liquid first reagent containing Tris-HC and ammonium sulfate, which are buffer solutions, has extremely poor storage stability in terms of enzyme activity.

参考例１と同様に、LAMP反応用プライマーとして配列番号１から配列番号６に記載のオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。次に、第二試薬２〜４を、それぞれ表４に示す成分を含むように作製した。試薬の乾燥は凍結乾燥にて行った。凍結乾燥は、溶液を独立バイアル脱着型96穴プレートのポリプロピレン製バイヤル（株式会社ハイペップ研究所製）に溶液を入れ、容器ごとヘキサン−ドライアイスにて冷却し溶液を凍結させた後、凍結乾燥機（FD-1000型、東京理化器械株式会社製）にて16時間乾燥させた。乾燥後、10pg 結核菌M. tuberculosisゲノムDNAを含む第一試薬溶液２〜４を用意し（表５）、それぞれ２５μｌを第二試薬２〜４に加えて溶解したものを乾燥試薬２〜４と名付けた。溶解したサンプルをLAMP反応用0.2mlマイクロチューブ（栄研化学株式会社製）に入れ、速やかにLAMP反応専用リアルタイム濁度測定装置LA―200（テラメックス株式会社製）にセットし、64℃にて60分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した。 As in Reference Example 1, the oligonucleotides described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 were chemically synthesized as primers for the LAMP reaction. Next, the 2nd reagents 2-4 were produced so that the component shown in Table 4 might be included, respectively. The reagent was dried by lyophilization. In lyophilization, the solution is placed in a polypropylene vial (manufactured by Hypep Laboratories) with an independent vial removable 96-well plate, cooled with hexane-dry ice together with the container, and then freeze-dried. (FD-1000 type, manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) for 16 hours. After drying, first reagent solutions 2 to 4 containing 10 pg of M. tuberculosis genomic DNA were prepared (Table 5), and 25 μl of each was added to the second reagents 2 to 4 to dissolve them. Named. The dissolved sample is placed in a 0.2 ml microtube for LAMP reaction (Eiken Chemical Co., Ltd.), and immediately set in the LAMP reaction dedicated real-time turbidity measurement device LA-200 (Tramex Co., Ltd.). The reaction was carried out for 1 minute, and the turbidity during the amplification reaction was measured.

各サンプルのLAMP反応の濁度が0.1に達した時間を表６にまとめた。このように、硫酸アンモニウムを含む酵素反応溶液を乾燥することで起こる反応溶液の活性低下の主要因は、硫酸アンモニウムと緩衝液であるTris-HCl(pH8.8)を混合した溶液状態であり、例えば、乾燥試薬２のように、緩衝液またはその成分とTween20を含まない場合、使用上問題がないレベルの活性が保持される。この場合対応する第一試薬２には、LAMP反応増幅の目的対象物であるDNA以外に、緩衝液またはその成分とTween20のみが含まれていればよい。 Table 6 summarizes the time when the turbidity of the LAMP reaction of each sample reached 0.1. Thus, the main factor of the activity reduction of the reaction solution that occurs by drying the enzyme reaction solution containing ammonium sulfate is a solution state in which ammonium sulfate and buffer solution Tris-HCl (pH 8.8) are mixed, for example, When the buffer or its component and Tween 20 are not included as in the case of the dry reagent 2, a level of activity that does not cause a problem in use is retained. In this case, the corresponding first reagent 2 only needs to contain only the buffer solution or its component and Tween 20 in addition to the DNA that is the target of amplification of the LAMP reaction.

参考例１と同様に、LAMP反応用プライマーとして配列番号１から配列番号６に記載のオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。次に、第二試薬５〜６を、それぞれ表７に示す成分を含むように作製した。試薬の乾燥は凍結乾燥にて行った。凍結乾燥は、溶液を独立バイアル脱着型96穴プレートのポリプロピレン製バイヤル（株式会社ハイペップ研究所製）に溶液を入れ、容器ごとヘキサン−ドライアイスにて冷却し溶液を凍結させた後、凍結乾燥機（FD-1000型、東京理化器械株式会社製）にて16時間乾燥させた。
乾燥後、第二試薬５は球状の乾燥試薬となった。これをそのままLAMP反応用0.2mlマイクロチューブ（栄研化学株式会社製）に入れた。
第二試薬６は、表７に示すように２種の独立した第二試薬６−１及び第二試薬６−２で構成され、それぞれが球状の乾燥試薬となった。これら２種の球状乾燥試薬を同一LAMP反応用0.2mlマイクロチューブ（栄研化学株式会社製）に入れた。
次に表８に従い、10pg 結核菌M. tuberculosisゲノムDNAを含む第一試薬溶液５〜６を作製し、それぞれ２５μｌを第二試薬５〜６に加えて乾燥第二試薬が溶解する時間を計測した。その結果、第二試薬５及び６は共に３０秒以内に溶解した。 As in Reference Example 1, the oligonucleotides described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 were chemically synthesized as primers for the LAMP reaction. Next, the 2nd reagents 5-6 were produced so that the component shown in Table 7 might be included, respectively. The reagent was dried by lyophilization. In lyophilization, the solution is placed in a polypropylene vial (manufactured by Hypep Laboratories) with an independent vial removable 96-well plate, cooled with hexane-dry ice together with the container, and then freeze-dried. (FD-1000 type, manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) for 16 hours.
After drying, the second reagent 5 became a spherical dry reagent. This was directly put into a 0.2 ml microtube (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) for LAMP reaction.
As shown in Table 7, the second reagent 6 was composed of two independent second reagents 6-1 and 6-2, each of which became a spherical dry reagent. These two kinds of spherical dry reagents were placed in the same LAMP reaction 0.2 ml microtube (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.).
Next, according to Table 8, the 1st reagent solution 5-6 containing 10pg M. tuberculosis genomic DNA was produced, and 25 microliters was added to the 2nd reagent 5-6, respectively, and the time for the dry 2nd reagent to melt | dissolve was measured. . As a result, both the second reagents 5 and 6 were dissolved within 30 seconds.

参考例１と同様に、LAMP反応用プライマーとして配列番号１から配列番号６に記載のオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。次に、第二試薬７を、表９に示す成分を含むように作製した。試薬の乾燥は凍結乾燥にて行った。凍結乾燥は、溶液を独立バイアル脱着型96穴プレートのポリプロピレン製バイヤル（株式会社ハイペップ研究所製）にヘキサンを50μlずつ分注しておき、その中に２種の水溶液をそれぞれ入れて液滴を球状に形成させ、容器全体をヘキサン−ドライアイスにて冷却し溶液を凍結させた。このとき、ヘキサンの比重は1.0未満であり、水と混ざらないためにヘキサン中に水溶液の液滴が形成され、さらにヘキサンは凍結しないため、液滴のみが球状に凍結する。その後、凍結乾燥機（FD-1000型、東京理化器械株式会社製）にて16時間乾燥させた。
乾燥後、第二試薬７は球状の乾燥試薬となった。これをそのままLAMP反応用0.2mlマイクロチューブ（栄研化学株式会社製）に入れた。次に表１０に従い、10pg 結核菌M. tuberculosisゲノムDNAを含む第一試薬溶液７を作製し、25μlを第二試薬７に加えて乾燥第二試薬が溶解する時間を計測した。その結果、第二試薬７は３０秒以内に溶解した。 As in Reference Example 1, the oligonucleotides described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 were chemically synthesized as primers for the LAMP reaction. Next, the 2nd reagent 7 was produced so that the component shown in Table 9 might be included. The reagent was dried by lyophilization. In lyophilization, 50 μl of hexane was dispensed into a polypropylene vial (manufactured by Hypep Laboratories) in a 96-well plate with an independent vial. The whole container was cooled with hexane-dry ice to freeze the solution. At this time, since the specific gravity of hexane is less than 1.0 and does not mix with water, droplets of an aqueous solution are formed in hexane, and since hexane does not freeze, only the droplets freeze in a spherical shape. Then, it was dried for 16 hours with a freeze dryer (FD-1000 type, manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.).
After drying, the second reagent 7 became a spherical dry reagent. This was directly put into a 0.2 ml microtube (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) for LAMP reaction. Next, according to Table 10, the 1st reagent solution 7 containing 10pg Mycobacterium tuberculosis M. tuberculosis genomic DNA was produced, 25 microliters was added to the 2nd reagent 7, and the time for a dry 2nd reagent to melt | dissolve was measured. As a result, the second reagent 7 was dissolved within 30 seconds.

実施例２及び実施例３にて作製した、凍結乾燥した第二試薬６〜７をLAMP反応用0.2mlマイクロチューブ（栄研化学株式会社製）に入れた状態でシールし、45℃の条件で45日保管した。その後、10pg 結核菌M. tuberculosisゲノムDNAを含む第一試薬溶液６〜７を準備してそれぞれ25μlずつ第二試薬６〜７に加えて溶解したものを乾燥試薬６〜７と名付けた。乾燥試薬６〜７を速やかにLAMP反応専用リアルタイム濁度測定装置LA―200（テラメックス株式会社製）にセットし、64℃にて60分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した。
各サンプルのLAMP反応の濁度が0.1に達した時間を表１１にまとめた。保存安定性加速試験において、45℃の条件で45日保管は、おおよそ室温(25℃)保存の６ヶ月、もしくは４℃保存の１年に相当することが知られている（Shelf Life of Medical Devices; FDA, 1991）。すなわち、第二試薬６〜７は、室温保存で安定であることを示している。 The lyophilized second reagents 6 to 7 prepared in Example 2 and Example 3 were sealed in a 0.2 ml microtube for LAMP reaction (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), and the condition was 45 ° C. Stored for 45 days. Thereafter, first reagent solutions 6 to 7 containing 10 pg of M. tuberculosis genomic DNA were prepared, and 25 μl of each was added to the second reagent 6 to 7 and dissolved, and the dried reagents 6 to 7 were named. The dry reagents 6 to 7 were immediately set in a LAMP reaction-dedicated real-time turbidity measurement apparatus LA-200 (manufactured by Terramex Corporation), reacted at 64 ° C. for 60 minutes, and turbidity during the amplification reaction was measured.
The time when the turbidity of the LAMP reaction of each sample reached 0.1 is summarized in Table 11. In the accelerated storage stability test, storage for 45 days at 45 ° C is known to correspond to approximately 6 months of storage at room temperature (25 ° C) or 1 year of storage at 4 ° C (Shelf Life of Medical Devices FDA, 1991). That is, the second reagents 6 to 7 are stable at room temperature storage.

参考例１と同様に、LAMP反応用プライマーとして配列番号１から配列番号６に記載のオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。次に、第二試薬８を、実施例２における第二試薬６−１及び第二試薬６−２と同じ組成（[表７]参照）、同じ
方法により２種の独立した球状の乾燥試薬を得、これを第二試薬８−１及び第二試薬８−２とした。
これら２種の球状乾燥試薬を同一LAMP反応用0.2mlマイクロチューブ（栄研化学株式会社製）に入れた。この状態でチューブをシールし、４５℃の条件で１００日保管した。 As in Reference Example 1, the oligonucleotides described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 were chemically synthesized as primers for the LAMP reaction. Next, the 2nd reagent 8 is made into the same composition (refer to [Table 7]) as the 2nd reagent 6-1 and the 2nd reagent 6-2 in Example 2, and two independent spherical dry reagents by the same method. This was designated as second reagent 8-1 and second reagent 8-2.
These two kinds of spherical dry reagents were placed in the same LAMP reaction 0.2 ml microtube (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.). In this state, the tube was sealed and stored at 45 ° C. for 100 days.

一方、第一試薬８を表１３に示したように調製した後、ポリプロピレン容器に入れてこちらもシールし、45℃の条件で100日保管した。 On the other hand, after the first reagent 8 was prepared as shown in Table 13, it was also sealed in a polypropylene container and stored for 100 days at 45 ° C.

100日保管後、第一試薬８の25μlに、10pg 結核菌M. tuberculosisゲノムDNAを添加し、100日保管後の第二試薬８に加えて溶解したものを乾燥試薬８と名付けた。乾燥試薬８を速やかにLAMP反応専用リアルタイム濁度測定装置LA―200（テラメックス株式会社製）にセットし、64℃にて60分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した。
乾燥試薬８のLAMP反応の濁度が0.1に達した時間を表１４に示した。保存安定性加速試験において、45℃の条件で100日保管は、おおよそ室温(25℃)保存の１年以上、もしくは４℃保存の４年以上に相当することが知られている（Shelf Life of Medical Devices; FDA, 1991）。すなわち、第一試薬８及び第二試薬８は、室温保存で安定であることを示している。 After storage for 100 days, 10 pg of Mycobacterium tuberculosis M. tuberculosis genomic DNA was added to 25 μl of the first reagent 8, and the dissolved product added to the second reagent 8 after storage for 100 days was named dry reagent 8. The dry reagent 8 was quickly set in the LAMP reaction-dedicated real-time turbidity measurement apparatus LA-200 (manufactured by Terramex Corporation), reacted at 64 ° C. for 60 minutes, and the turbidity during the amplification reaction was measured.
Table 14 shows times when the turbidity of the LAMP reaction of the dry reagent 8 reached 0.1. In the accelerated storage stability test, storage for 100 days at 45 ° C is known to correspond to approximately one year of storage at room temperature (25 ° C) or four years of storage at 4 ° C (Shelf Life of Medical Devices; FDA, 1991). That is, the first reagent 8 and the second reagent 8 are stable when stored at room temperature.

本発明を利用することにより、硫酸アンモニウムを必要とする酵素の反応試薬において、室温にて長期的に保存ができ、溶液の融解や分注の必要がなく、すぐに反応が開始できるという利便性に優れた酵素反応試薬を提供することが可能となり、臨床診断や検査の分野で好適に利用できる。 By utilizing the present invention, an enzyme reaction reagent that requires ammonium sulfate can be stored for a long time at room temperature, and there is no need for melting or dispensing of the solution, so that the reaction can be started immediately. An excellent enzyme reaction reagent can be provided and can be suitably used in the fields of clinical diagnosis and testing.

参考例１のLAMP反応で得られた、リアルタイム濁度測定結果。縦軸は、650nmでの吸光度を濁度として表してある。横軸は、64℃における反応時間を表している。Real-time turbidity measurement results obtained by the LAMP reaction in Reference Example 1. The vertical axis represents the absorbance at 650 nm as turbidity. The horizontal axis represents the reaction time at 64 ° C.

Claims

少なくとも緩衝液またはその成分、酵素、硫酸アンモニウムを含む試薬からなり、緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムとの接触が減じられていることを特徴とする酵素反応試薬。 An enzyme reaction reagent comprising a reagent containing at least a buffer solution or a component thereof, an enzyme, and ammonium sulfate, wherein contact between the buffer solution or a component thereof and ammonium sulfate is reduced.

硫酸アンモニウムと接触する緩衝液またはその成分のモル数を、硫酸アンモニウムのモル数の１／１２以下とする請求項１に記載の酵素反応試薬。 The enzyme reaction reagent according to claim 1, wherein the number of moles of a buffer solution or a component thereof in contact with ammonium sulfate is 1/12 or less of the number of moles of ammonium sulfate.

緩衝液またはその成分を含む乾燥試薬球（以下、第１乾燥試薬球）と、硫酸アンモニウムを含む乾燥試薬球（以下、第２乾燥試薬球）とからなり、第２乾燥試薬球中には、緩衝液またはその成分が含まれないか、あるいは、硫酸アンモニウムのモル数の１／１２以下の緩衝液またはその成分が含まれることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の酵素反応試薬。 It consists of a dry reagent sphere (hereinafter referred to as a first dry reagent sphere) containing a buffer solution or a component thereof, and a dry reagent sphere containing ammonium sulfate (hereinafter referred to as a second dry reagent sphere). 3. The enzyme reaction reagent according to claim 1, wherein the enzyme reaction reagent does not contain a solution or its component, or contains a buffer solution or its component that is 1/12 or less of the number of moles of ammonium sulfate.

隔膜によって緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムとの接触が減じられていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の酵素反応試薬。 The enzyme reaction reagent according to any one of claims 1 to 3, wherein contact between the buffer solution or a component thereof and ammonium sulfate is reduced by the diaphragm.

酵素、緩衝液またはその成分、硫酸アンモニウムを含有する試薬キットであって、該試薬キットは、緩衝液またはその成分が収容される試薬収容容器（以下、第１容器）と、硫酸アンモニウムが収容される試薬収容容器（以下、第２容器）を含み、第２容器には、緩衝液またはその成分が含まれないか、あるいは、硫酸アンモニウムのモル数の１／１２以下のモル数の緩衝液またはその成分が含まれ、酵素が少なくとも第１容器あるいは第２容器のいずれかに含まれることを特徴とする試薬キット。 A reagent kit containing an enzyme, a buffer solution or a component thereof, and ammonium sulfate, the reagent kit comprising a reagent storage container (hereinafter referred to as a first container) in which a buffer solution or a component thereof is stored, and a reagent in which ammonium sulfate is stored Containing a container (hereinafter referred to as a second container), and the second container does not contain a buffer solution or its component, or contains a buffer solution or its component in a mole number of 1/12 or less of the number of moles of ammonium sulfate. A reagent kit comprising: an enzyme contained in at least one of the first container and the second container.

酵素が収容される試薬収容容器内の試薬群は乾燥し、酵素が収容されない試薬収容容器内の試薬群は液状であることを特徴とする請求項５に記載の試薬キット。 6. The reagent kit according to claim 5, wherein the reagent group in the reagent storage container in which the enzyme is stored is dried, and the reagent group in the reagent storage container in which the enzyme is not stored is liquid.

酵素が収容される試薬収容容器内の試薬群は、凍結乾燥により乾燥され、球状多孔体を形成していることを特徴とする請求項６に記載の試薬キット。 The reagent group according to claim 6, wherein the reagent group in the reagent storage container in which the enzyme is stored is dried by lyophilization to form a spherical porous body.

酵素が収容される試薬収容容器内に、安定化剤が含まれることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の試薬キット。 The reagent kit according to any one of claims 5 to 7, wherein a stabilizer is contained in the reagent storage container in which the enzyme is stored.

安定化剤が糖であることを特徴とする請求項８記載の試薬キット。 The reagent kit according to claim 8, wherein the stabilizer is a sugar.

酵素がＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項５〜９のいずれかに記載の試薬キット。 The reagent kit according to any one of claims 5 to 9, wherein the enzyme is a DNA polymerase.

酵素、緩衝液またはその成分、硫酸アンモニウムを含有する試薬キットであって、該試薬キットは緩衝液またはその成分を含有する乾燥試薬球（以下、第1乾燥試薬球）と、硫酸アンモニウムを含有する乾燥試薬球（以下、第2乾燥試薬球）を含み、第2乾燥試薬球中には、緩衝液またはその成分が含まれない、あるいは硫酸アンモニウムのモル数の１／１２以下の緩衝液またはその成分が含まれ、酵素が少なくとも第1乾燥試薬球あるいは第2乾燥試薬球のいずれかに含まれることを特徴とする試薬キット。 A reagent kit containing an enzyme, a buffer solution or a component thereof, and ammonium sulfate, the reagent kit comprising a dry reagent ball (hereinafter referred to as a first dry reagent ball) containing a buffer solution or a component thereof, and a dry reagent containing ammonium sulfate Sphere (hereinafter referred to as second dry reagent sphere), and the second dry reagent sphere does not contain a buffer solution or its component, or contains a buffer solution or its component that is 1/12 or less of the number of moles of ammonium sulfate. A reagent kit, wherein the enzyme is contained in at least either the first dry reagent sphere or the second dry reagent sphere.

酵素、緩衝液またはその成分、硫酸アンモニウムを含有する試薬キットの酵素活性を維持する方法であって、緩衝液またはその成分と硫酸アンモニウムの接触を減ずることを特徴とする酵素の活性維持方法。 A method for maintaining enzyme activity of a reagent kit containing an enzyme, a buffer solution or a component thereof, and ammonium sulfate, wherein contact between the buffer solution or a component thereof and ammonium sulfate is reduced.

硫酸アンモニウムに接触する緩衝液またはその成分のモル数が、硫酸アンモニウムのモル数の１／１２以下であることを特徴とする請求項１２記載の酵素の活性維持方法。 13. The method for maintaining the activity of an enzyme according to claim 12, wherein the number of moles of the buffer solution contacting the ammonium sulfate or its component is 1/12 or less of the number of moles of ammonium sulfate.