JP2006117685A - Tumor-treating agent - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a radioactive diagnostic and therapeutic agent which contains an ingredient obtained by binding a radioactive nuclide to a found ligand that is bound to lectin existing on the surfaces of tumor cells to exhibit a high accumulation ability on tumors and is useful for diagnosing / treating the tumors. <P>SOLUTION: This tumor-treating agent contains a glycoprotein having a molecule specifically binding to lectin existing on the surfaces of tumor cells as an active ingredient. The tumor-treating agent preferably contains the glycoprotein wherein the molecule specifically binding to the lectin existing on the surfaces of the tumor cells preferably comprises N-acetylglucosamine or mannose. The tumor-diagnosing agent preferably comprises the glycoprotein radioactively labeled with In-111, Tc-99m, or the like. The tumor-treating agent preferably comprises the glycoprotein radioactively labeled with In-111, I-131, or the like. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明はヒト及び動物の腫瘍を診断・治療するための放射性医薬品に関する。 The present invention relates to a radiopharmaceutical for diagnosing and treating human and animal tumors.

ヒト及び動物体内に生じた腫瘍を診断するため、腫瘍に集積する物質と放射性核種を結合した医薬品の開発が進められている。放射性核種は細胞にとって有害であるため、正常部位へは集積せず、腫瘍細胞のみに結合してそのまま長時間集積する事が医薬品として望ましい。腹腔内腫瘍のために全身性の化学療法、腹腔内化学療法、外部からの粒子線治療、腔内への放射性コロイドの点滴注入などの処置がレーシーら（例えば、非特許文献１参照）により試みられてきたが十分な効果を示すアプローチではなかった。 In order to diagnose tumors occurring in humans and animals, development of pharmaceuticals that combine radionuclides with substances that accumulate in tumors has been underway. Since radionuclides are harmful to cells, it is desirable for pharmaceuticals not to accumulate in normal sites, but to bind only to tumor cells and accumulate as they are for a long time. For intraabdominal tumors, Lacy et al. (See, for example, Non-Patent Document 1) attempted systemic chemotherapy, intraperitoneal chemotherapy, external particle beam therapy, intracavitary instillation of radioactive colloid, and the like. However, this approach has not been fully effective.

放射性核種、化学治療剤や毒素を結合した抗腫瘍モノクロナル抗体を使った標的療法は腫瘍特異性が高く、正常細胞への毒性を抑え、腫瘍に対する毒性を強くすることができた。なかでも放射能標識した抗体を用いた腹腔内腫瘍の治療の試みが動物や患者に対して有効であった。しかしながら、血中放射能や正常組織での放射能標識物の非特異的取り込みが高かった為に、治療のための放射能投与には限界があった。 Targeted therapies using anti-tumor monoclonal antibodies conjugated with radionuclides, chemotherapeutic agents and toxins are highly tumor-specific, reducing toxicity to normal cells and increasing tumor toxicity. In particular, attempts to treat intraperitoneal tumors using radiolabeled antibodies were effective for animals and patients. However, there was a limit to the administration of radioactivity for treatment due to the high non-specific uptake of radiolabel in blood and normal tissues.

腫瘍細胞の表面にはレクチンが存在し、レクチンに結合したリガンドは細胞内に移行する事がロタン等（例えば、非特許文献２参照）により報告されている。レクチンは糖結合性蛋白であり、結合価が２価以上で動植物細胞を凝集し、多糖類や複合糖質を沈降させる。その結合特異性は単糖やオリゴ糖を用いた阻止試験で規定できるとされており、種々のレクチンが知られている。腫瘍表面のレクチンを特異的に認識する物質は腫瘍管理のために有望であると言えるが、十分にイメージングできるほど高い取り込みを示す効果的な物質は報告されていない。 It has been reported by Rotan et al. (See, for example, Non-Patent Document 2) that lectins are present on the surface of tumor cells and ligands bound to lectins migrate into the cells. A lectin is a sugar-binding protein, has a valence of 2 or more, aggregates animal and plant cells, and precipitates polysaccharides and complex carbohydrates. The binding specificity can be defined by a blocking test using monosaccharides or oligosaccharides, and various lectins are known. Although it can be said that substances that specifically recognize lectins on the tumor surface are promising for tumor management, no effective substances have been reported that show high uptake that can be sufficiently imaged.

Lacy et al;Management of malignant ascites, Surg.Gynecol.Obstet., 159:397-412頁、1984年Lacy et al; Management of malignant ascites, Surg.Gynecol.Obstet., 159: 397-412, 1984 R. Lotan; Lectins in Cancer cells, Annals NewYork Academy Science, 551:385-398 頁、1988年R. Lotan; Lectins in Cancer cells, Annals NewYork Academy Science, 551: 385-398, 1988

本発明は、腫瘍細胞表面に存在するレクチンと結合し、腫瘍表面から腫瘍細胞内部へ移行できるリガンドが腫瘍の診断・治療に有用なキャリアーとなることを期待されながらも、適当なリガンドが見いだされていなかった状況に鑑み、レクチンと結合して腫瘍への高い集積能を示すリガンドを見いだし、当該リガンドに放射性核種を結合する事により、腫瘍の診断・治療に有用な放射性診断剤及び治療剤を提供する事を目的とする。 In the present invention, a ligand capable of binding to a lectin present on the surface of a tumor cell and transferring from the tumor surface to the inside of the tumor cell is expected to be a useful carrier for tumor diagnosis and treatment, but an appropriate ligand has been found. In view of the situation that has not been achieved, by finding a ligand that binds to lectin and shows high ability to accumulate in the tumor, and by binding a radionuclide to the ligand, a radiodiagnostic agent and therapeutic agent useful for tumor diagnosis and treatment can be obtained. The purpose is to provide.

かかる課題を達成するため、本発明者らは鋭意研究を行った結果、腫瘍表面のレクチンと結合できる分子を有する糖蛋白を見いだし、本発明を完成した。すなわち、本発明はレクチンと特異的に結合する分子を有する糖蛋白を有効成分として含有する腫瘍診断剤または治療剤である。本発明の他の態様は、レクチンと特異的に結合する分子がＮ−アセチルグルコサミンまたはマンノースである糖蛋白よりなり、さらに糖蛋白としてアビジンが好適に用いられる。本発明の他の態様はＩｎ−１１１、Ｔｃ−９９ｍまたはＩ−１２３より選ばれる１つで放射能標識された前記糖蛋白あるいはアビジンよりなる腫瘍診断剤またはＩｎ−１１１、Ｉ−１３１またはＩ−１２５より選ばれる１つで放射能標識された前記糖蛋白あるいはアビジンよりなる腫瘍治療剤である。 As a result of intensive studies, the present inventors have found a glycoprotein having a molecule capable of binding to a lectin on the surface of a tumor and completed the present invention. That is, the present invention is a tumor diagnostic agent or therapeutic agent containing, as an active ingredient, a glycoprotein having a molecule that specifically binds to a lectin. In another embodiment of the present invention, the molecule that specifically binds to the lectin is a glycoprotein whose molecule is N-acetylglucosamine or mannose, and avidin is preferably used as the glycoprotein. Another aspect of the present invention is a tumor diagnostic agent comprising the aforementioned glycoprotein or avidin radiolabeled with one selected from In-111, Tc-99m or I-123, or In-111, I-131 or I- A tumor therapeutic agent comprising the glycoprotein or avidin radiolabeled with one selected from 125.

腫瘍の治療は、腫瘍細胞だけでなく正常細胞にとっても有害な成分を使用するため、腫瘍に対し高い特異性を有する薬剤が求められていた。本発明のアビジンまたはアビジンのレクチン結合部位を有する物質は、腫瘍表面のレクチンとの特異性が高いので放射性物質を結合することで、腫瘍を標的とした治療を行うことが可能であり、また高い標的能力は腫瘍部分のイメージングに極めて有用である。 Since tumor treatment uses components that are harmful not only to tumor cells but also to normal cells, a drug having high specificity for tumors has been demanded. The avidin of the present invention or the substance having a lectin binding site of avidin has high specificity with the lectin on the surface of the tumor, so that it is possible to perform treatment targeting the tumor by binding a radioactive substance. Targeting ability is extremely useful for imaging tumor areas.

本発明の腫瘍診断剤または治療剤はレクチンと特異的に結合する分子を有する糖蛋白を有効成分としてなる。特に、レクチンと結合する分子は、好ましくは末端のＮ−アセチルグルコサミンまたはマンノースであり、糖蛋白としては前記の両社を併せ持つ、高度に糖化されたアビジンが好ましい。マウス腹腔内腫瘍によるアビジンおよびアビジンの誘導体の取り込みを糖鎖を有しないストレプトアビジン、炭水化物を有しないニュートラアビジンおよびＮ−アセチルグルコサミンとマンノースの両者を併せ持つアビジンをインビトロの実験で比較したところ、アビジンの取り込みが最も大きく、細胞数１０6 個において１８．２〜４７．２％であったのに対し、ストレプトアビジンでは４〜４．５％、ニュートラアビジンでは２．６〜４．８％であった。即ち、アビジンは腫瘍表面に発現するレクチンと最も強く結合すると考えられる。 The tumor diagnostic agent or therapeutic agent of the present invention comprises a glycoprotein having a molecule that specifically binds to a lectin as an active ingredient. In particular, the molecule that binds to the lectin is preferably terminal N-acetylglucosamine or mannose, and the glycoprotein is preferably a highly glycated avidin having both the above-mentioned companies. The uptake of avidin and avidin derivatives by mouse intraperitoneal tumors was compared in vitro experiments with streptavidin without sugar chains, neutravidin without carbohydrates and avidin with both N-acetylglucosamine and mannose in in vitro experiments. The largest uptake was 18.2 to 47.2% in 10 @ 6 cells, compared to 4 to 4.5% for streptavidin and 2.6 to 4.8% for neutravidin. That is, avidin is considered to bind most strongly to the lectin expressed on the tumor surface.

さらに、レクチンと結合したアビジンが腫瘍内部へ移行すれば放射性アイソトープ、薬物等の診断または治療用薬剤のキャリアーとして有望である。そこでアビジンと特異的に結合することが知られており、その解離定数が１０-15 Ｍと極めて低いことから、種々の生化学的研究に使用されている（ヒラーらY.Hiller et al; Biotin binding to avidin, Oligosaccharaido side chainnot required for ligand association; Biochem. J., 248:167-171 頁、1978年）ビオチンを用いて以下の実験を行った。 Furthermore, if avidin bound to lectin migrates into the tumor, it is promising as a carrier for diagnostic or therapeutic drugs such as radioactive isotopes and drugs. Therefore, it is known to specifically bind to avidin, and its dissociation constant is as low as 10-15 M, so it is used for various biochemical studies (Hiller et al. Y. Hiller et al; Biotin Binding to avidin, Oligosaccharaido side chain not required for ligand association; Biochem. J., 248: 167-171, 1978) The following experiment was performed using biotin.

インビボの実験において、アビジンを投与した後、ビオチンを投与する時、それらの投与間隔が短い内はアビジン−ビオチン結合物と同様の蓄積を示す。アビジンが腫瘍表面のレクチンと結合しているので後から投与したビオチンが腫瘍表面のアビジンと結合し、結果として同様の蓄積をもたらす。しかしながら、アビジンとビオチンの投与間隔が長くなるにつれてアビジン−ビオチン結合物を投与した場合のような蓄積は示さなくなる。これは、アビジンと結合したレクチンが時間の経過とともに腫瘍内へ移行するためであり、腫瘍内部に移行したアビジンはもはやビオチンと結合することができず、このために腫瘍への蓄積を示さなくなるためであると考えられる。このように、レクチンと結合し、腫瘍内部に移行することができるアビジンの性質は、腫瘍診断剤、腫瘍治療剤によって極めて有利である。 In in vivo experiments, when biotin is administered after administration of avidin, it shows the same accumulation as the avidin-biotin conjugate within a short interval between administrations. Since avidin is bound to the lectin on the tumor surface, biotin administered later binds to avidin on the tumor surface, resulting in similar accumulation. However, as the dose interval between avidin and biotin becomes longer, the accumulation as in the case of administering the avidin-biotin conjugate does not show. This is because the lectin bound to avidin migrates into the tumor over time, and avidin that has migrated inside the tumor can no longer bind to biotin, and therefore no longer shows accumulation in the tumor. It is thought that. Thus, the property of avidin that can bind to a lectin and migrate to the inside of a tumor is extremely advantageous depending on a tumor diagnostic agent or a tumor therapeutic agent.

アビジンと放射性核種との結合物は、キレート剤を介してアビジンに結合させるか、反応性の高い放射性核種含有化合物をアビジンに結合させるか、または放射性核種をキレート剤を介してビオチンと結合させたものにアビジンを結合させることによって得られる。診断剤として用いられる核種としては、Ｉｎ−１１１、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１２３好適であるが、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６７なども使用可能である。治療剤として用いられる核種としてはＩｎ−１１１、Ｉ−１３１、Ｉ−１２５が好適であるが、Ｈ−３、Ｃ−１４、Ｃｕ−６７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｙ−９０なども使用可能である。 Conjugates of avidin and radionuclide are bound to avidin via a chelating agent, a highly reactive radionuclide containing compound is bound to avidin, or the radionuclide is bound to biotin via a chelating agent. Obtained by binding avidin to the object. As a nuclide used as a diagnostic agent, In-111, Tc-99m, and In-123 are preferable, but Cu-64, Ga-67, and the like can be used. As the nuclide used as a therapeutic agent, In-111, I-131, and I-125 are preferable, but H-3, C-14, Cu-67, Re-186, Re-188, and Y-90 are also included. It can be used.

ビオチンをＩｎ−１１１で標識する場合は、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン５酢酸）−ビス（ビオシチンアミド）を緩衝液等に溶解し、Ｉｎ−１１１イオンを含む溶液を混合することで調製できる。ビオチンをＴｃ−９９ｍで標識する場合は、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン５酢酸）−ビス（ビオシチンアミド）を緩衝液等に溶解し、適当な酸化還元電位を有する塩化第一スズのごとき還元剤を加え、Ｔｃ−９９ｍイオンを含む過テクネチウム酸溶液を混合する常套の方法により調製できる。アビジンをＩ−１３１標識するには、例えば荒野ら(J. Med. Chem. 34:2609-2618 頁、1994年) の方法に従い、Ｎ−サクシニミジル３ー（トリ−ｎ−ブチルスタニル）ベンゾエートを合成し、これをザルツスキーら(M. R. Zalutsky et al;Appl Radiat. Isot., 38/12:1051-1055 頁、1987年) の方法を用いて、ハロゲン交換反応によりＩ−１３１を結合させた後、アビジンと結合させればよい。 When biotin is labeled with In-111, it can be prepared by dissolving DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid) -bis (biocytinamide) in a buffer or the like and mixing a solution containing In-111 ions. When labeling biotin with Tc-99m, DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid) -bis (biocytinamide) is dissolved in a buffer solution, and a reducing agent such as stannous chloride having an appropriate oxidation-reduction potential is added. It can be prepared by a conventional method of mixing a pertechnetate solution containing 99m ions. In order to label avidin with I-131, for example, N-succinimidyl 3- (tri-n-butylstannyl) benzoate is synthesized according to the method of Arano et al. (J. Med. Chem. 34: 2609-2618, 1994). This was performed using a method of Salzsky et al. (MR Zalutsky et al; Appl Radiat. Isot., 38/12: 1051-1055, 1987) to bind I-131 by a halogen exchange reaction, and then avidin. Can be combined.

その他の放射性核種とアビジンまたはビオチンとの結合はそれぞれに適した交換反応やキレート形成性化合物を選択して用いることにより、適宜得ることが可能である。放射性核種標識結合物を放射性診断剤または放射性治療剤として供する場合は、上述した方法によって調製される標識物をさらにＨＰＬＣ法による精製に付して不純物および未反応のインジウムイオン、沃素イオン、過テクネチウム酸イオンを取り除いた後に使用してもよい。 The bond between other radionuclide and avidin or biotin can be appropriately obtained by selecting and using a suitable exchange reaction or chelate-forming compound. When the radionuclide-labeled conjugate is used as a radiodiagnostic agent or radiotherapeutic agent, the label prepared by the above-described method is further subjected to purification by HPLC, so that impurities and unreacted indium ions, iodine ions, pertechnetium are obtained. You may use after removing an acid ion.

放射能標識ビオチンとアビジンの結合物を腫瘍移植マウスの腹腔に注射し、ガンマカメラで撮像すると、腫瘍における取り込みは２時間から２４時間において観察された。腫瘍臓器を取り出してガンマカメラで撮像すると腫瘍での高い放射能レベルが観察され、生体分布データと矛盾しない結果となった。腫瘍細胞をマウス腹腔に移植し、放射能標識アビジンを投与したグループと放射能標識しないアビジンを投与したグループに分けて腫瘍細胞の重量と白血球数の変化を調べたところ、放射能標識したアビジンを用いたマウスのグループは放射能標識していないグループと比較して腫瘍重量は明らかに減少したが、白血球数はどちらのグループにも有意な減少は見られなかった。したがって、本発明の治療剤は白血球の不要な破壊なしに腫瘍を治療することができる。 When the conjugate of radiolabeled biotin and avidin was injected into the peritoneal cavity of a tumor-implanted mouse and imaged with a gamma camera, uptake in the tumor was observed between 2 and 24 hours. When the tumor organ was taken out and imaged with a gamma camera, a high level of radioactivity in the tumor was observed, which was consistent with the biodistribution data. The tumor cells were transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and the changes in the weight of the tumor cells and the number of white blood cells were examined by dividing the group into which the radiolabeled avidin was administered and the group administered with the non-radiolabeled avidin. The group of mice used clearly decreased the tumor weight compared to the non-radiolabeled group, but the leukocyte count did not significantly decrease in either group. Therefore, the therapeutic agent of the present invention can treat a tumor without unnecessary destruction of leukocytes.

放射性核種結合物は薬学的に許容される担体と混合することにより、放射性診断剤または放射性治療剤に調製することができる。かかる担体としては、薬学的に許容されるアスコルビン酸、ｐ−アミノ安息香酸などの安定化剤、水性緩衝液等のｐＨ調製剤、Ｄ−マンニトールなどの賦型剤、および放射化学的純度を改良するのに役立つクエン酸、酒石酸、マロン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコヘプトン酸ナトリウムなどが挙げられる。また、これらの担体と共に用事調製用キットの形態でも本発明の放射性診断剤、放射性治療剤は提供が可能である。本発明の糖蛋白、望ましくはアビジンまたはその誘導体の放射性核種との結合物を含有してなる放射性診断剤または放射性治療剤は腹腔内投与、胸腔内投与、皮下（局所）注射、動脈注射のほか、静脈注射等の一般的に用いられる非経口的手段により投与される。その投与量は患者の体重、年齢、適当な放射性イメージング装置および対象疾患状態等の諸条件を考慮し、イメージングおよび治療が可能と考えられる放射能が決定される。 The radionuclide conjugate can be prepared as a radiodiagnostic agent or radiotherapeutic agent by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier. Such carriers include pharmaceutically acceptable stabilizers such as ascorbic acid and p-aminobenzoic acid, pH adjusters such as aqueous buffers, excipients such as D-mannitol, and improved radiochemical purity. Citric acid, tartaric acid, malonic acid, sodium gluconate, sodium glucoheptonate, etc. useful for In addition, the radiodiagnostic agent and radiotherapeutic agent of the present invention can be provided in the form of a business preparation kit with these carriers. A radiodiagnostic agent or radiotherapeutic agent comprising a glycoprotein of the present invention, preferably avidin or a derivative thereof combined with a radionuclide, is administered intraperitoneally, intrathoracic, subcutaneous (local) injection, arterial injection, etc. It is administered by generally used parenteral means such as intravenous injection. The dose is determined in consideration of various conditions such as the patient's weight, age, appropriate radiographic imaging device and target disease state, and the radioactivity considered to be capable of imaging and treatment is determined.

ヒトを対象とする場合、Ｔｃ−９９ｍで標識した結合物を用いた診断剤の投与量はＴｃ−９９ｍの放射能として３７ＭＢｑ〜１１１０ＭＢｑの範囲であり、好ましくは１８５ＭＢｑ〜１１１０ＭＢｑである。Ｉ−１２３、Ｉｎ−１１１の場合、も同様の範囲で使用可能である。また、Ｉ−１３１で標識した化合物を用いた治療剤の場合は、Ｉ−１３１の放射能として３７ＭＢｑ〜３７００ＭＢｑの範囲であり、好ましくは１１１０ＭＢｑ〜３７００ＭＢｑの範囲である。 When targeting humans, the dosage of the diagnostic agent using the conjugate labeled with Tc-99m is in the range of 37 MBq to 1110 MBq, preferably 185 MBq to 1110 MBq, as the radioactivity of Tc-99m. In the case of I-123 and In-111, the same range can be used. In the case of a therapeutic agent using a compound labeled with I-131, the radioactivity of I-131 is in the range of 37 MBq to 3700 MBq, preferably in the range of 1110 MBq to 3700 MBq.

（実施例１） 腫瘍モデルの確立
ＳＨＩＮ３（卵巣ガン細胞系）、ＬＳ１８０、ＬｏＶｏ（結腸ガン細胞系）、およびＡＯＩ（肺ガン細胞系）の細胞を、１０％の胎児牛血清、０．０３％Ｌ−グルタミン酸とともにＲＰＭＩ１６４０培養液中で培養した。対数増殖期細胞(subconfluent)はカルシウム、マグネシウムの無い０．０２％ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液を使って収穫した。メスのＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに、０．２ｍｌの燐酸緩衝液に入れた３×１０6 のＬＳ１８０、ＬｏＶｏ、１×１０7 のＳＨＩＮ３，ＡＯＩを注射したところ、１１から２５日後に腫瘍が発現した。腫瘍重量は０．１から０．５ｍｇであった。 Example 1 Establishment of Tumor Model SHIN3 (ovarian cancer cell line), LS180, LoVo (colon cancer cell line), and AOI (lung cancer cell line) cells were treated with 10% fetal bovine serum, 0.03% Cultured in RPMI 1640 medium with L-glutamic acid. Logarithmic growing cells (subconfluent) were harvested using phosphate buffer containing 0.02% EDTA without calcium and magnesium. Female BALB / C nu / nu mice were injected with 3 × 10 6 LS180, LoVo, 1 × 10 7 SHIN3, AOI in 0.2 ml phosphate buffer, and tumors developed 11-25 days later . Tumor weight was 0.1 to 0.5 mg.

（実施例２）
（１）ビオチンのＩｎ−１１１標識
３μｇのＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン５酢酸）−ビス（ビオシチンアミド）を０．３Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０に溶解し、１８．５ＭＢｑのＩｎ−１１１とともに室温で３０分間インキュベートした。放射能の９９％以上が固定化アビジンゲルに結合したため、Ｉｎ−１１１標識アビジンは精製なしに用いた。 (Example 2)
(1) In-111 labeling of biotin 3 μg of DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid) -bis (biocytinamide) was dissolved in 0.3 M Tris-HCl buffer pH 7.0, and incubated with 18.5 MBq of In-111 at room temperature for 30 minutes. did. Since more than 99% of the radioactivity was bound to the immobilized avidin gel, In-111 labeled avidin was used without purification.

（２）アビジンのＩ−１３１直接標識
荒野ら(J. Med. Chem., 34:2609-2618頁、1994年) の方法に従い、Ｎ−サクシニミジル３ー（トリ−ｎ−ブチルスタニル）ベンゾエートを合成し、これをザルツスキーら(M. R. Zalutsky et al;Appl Radiat.Isot., 38/12:1051-1055頁、1987年) の方法を用いて、ハロゲン交換反応によりＩ−１３１を結合させた後、アビジンと結合させて得た。 (2) I-131 direct labeling of avidin According to the method of Wilder et al. (J. Med. Chem., 34: 2609-2618, 1994), N-succinimidyl 3- (tri-n-butylstannyl) benzoate was synthesized. Using this method, Salvinsky et al. (MR Zalutsky et al; Appl Radiat.Isot., 38/12: 1051-1055, 1987) was used to bind I-131 by halogen exchange reaction, and then avidin. Obtained by combining with.

アビジンのビオチンを介した放射能標識アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンを放射能標識したビオチンと分子量比３−１０：１で混合し、３０分間放置して結合した。結合しなかった放射能標識ビオチンはファルマシア社製ＰＤ１０カラムによるクロマトグラフィーで除去した。 Radiolabeled avidin, streptavidin and neutravidin via biotin of avidin were mixed with radiolabeled biotin at a molecular weight ratio of 3-10: 1 and allowed to bind for 30 minutes. Unbound radiolabeled biotin was removed by chromatography on a Pharmacia PD10 column.

（実施例３） インビトロでの反応性
実施例１で確立したＳＨＩＮ３、ＬＳ１８０、ＬｏＶｏ細胞とアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンとの反応性を調べた。放射能標識したアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンは５．７×４６ｍｍの微小遠心管中で１００μｌの燐酸緩衝液になん通りかの腫瘍細胞数とともに１時間インキュベートし、１０，０００×ｇで遠心した後、上澄を吸引除去した。細胞に結合した放射能の割合はオートウエルガンマカウンタ（アロカ製ＡＲＣ３００）で測定した。その結果を図１に示す。図１によると、アビジンはストレプトアビジン、ニュートラアビジンよりも腫瘍に対する結合性が明らかに高い。 (Example 3) In vitro reactivity The reactivity of SHIN3, LS180, LoVo cells established in Example 1 with avidin, streptavidin, and neutravidin was examined. Radiolabeled avidin, streptavidin and neutravidin were incubated in a 5.7 x 46 mm microcentrifuge tube in 100 μl phosphate buffer for 1 hour with some tumor cell number and centrifuged at 10,000 x g. Thereafter, the supernatant was removed by suction. The ratio of radioactivity bound to the cells was measured with an autowell gamma counter (ARC300 manufactured by Aroka). The result is shown in FIG. According to FIG. 1, avidin clearly has a higher binding ability to tumors than streptavidin and neutravidin.

（実施例４） 生体分布
生体分布の実験は、ビオチンを介して放射能標識したアビジンを投与した場合（１ステップ法）と、アビジンを投与した後、放射能標識したビオチンを投与した場合（２ステップ法）の２通りを行った。 (Example 4) Biodistribution Experiments on biodistribution include the case where radiolabeled avidin is administered via biotin (one-step method), and the case where radiolabeled biotin is administered after administering avidin (2 Two steps of step method) were performed.

（１ステップ法）
ビオチンを介してＩｎ−１１１標識したアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンを、実施例１で得た腫瘍移植マウスに注射した。放射能の分布はグループあたり４から５匹のマウスについて２−２４時間後に測定した。アビジンによる結果を表１に示す。表１ではアビジンは腫瘍に効果的に蓄積し、非腫瘍組織からは速やかに消失している。比較のためＬＳ１８０を用いた腫瘍移植マウスに放射能標識ビオチンを結合させたアビジン、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジンを投与し、２時間後の放射能分布を調べた結果を表２に示す。 (One-step method)
Avidin, streptavidin, and neutravidin labeled with In-111 were injected into the tumor-transplanted mouse obtained in Example 1 via biotin. Radioactivity distribution was measured after 2-24 hours for 4 to 5 mice per group. The results with avidin are shown in Table 1. In Table 1, avidin effectively accumulates in the tumor and disappears rapidly from the non-tumor tissue. For comparison, Table 2 shows the results of administration of avidin, streptavidin and neutravidin conjugated with radiolabeled biotin to tumor-transplanted mice using LS180, and examining the radioactivity distribution after 2 hours.

（表１） 腹腔内腫瘍移植マウスへの放射能標識アビジンの生体分布 (Table 1) Biodistribution of radiolabeled avidin to mice transplanted with intraperitoneal tumors

（各々、４〜５匹のマウスでの臓器１ｇ当たりの放射能量又は比の平均値土標準
偏差）

(The average soil standard deviation of the amount of radioactivity or the ratio per gram of organ in each of 4 to 5 mice)

（表２） 腹腔内腫瘍（ＬＳ１８０）移植マウスへの放射能標識アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンの生体分布（投与２時間後） (Table 2) Biodistribution of radiolabeled avidin, streptavidin, neutravidin to mice transplanted with intraperitoneal tumor (LS180) (2 hours after administration)

（各々、４〜５匹のマウスでの臓器１ｇ当たりの放射能量又は比の平均値土標準
偏差）

(The average soil standard deviation of the amount of radioactivity or the ratio per gram of organ in each of 4 to 5 mice)

（２ステップ法）
ＬＳ１８０の腫瘍移植マウスに標識していないアビジン３００μｇを注射し、１−２４時間後にＩｎ−１１１標識ビオチン０．３μｇを注射した。ＬＳ１８０腫瘍移植マウスの１群については、アビジンを注射せず、Ｉｎ−１１１標識ビオチンのみを注射した。ビオチンを注射して２時間後グループあたり４ー５匹のマウスを殺して放射能分布を測定したところ結果を表３に示す。正常組織、腫瘍組織ともにアビジンを注射してから放射能標識ビオチンを投与するまでの時間が長くなるに従って、腫瘍での放射能は減少した。次に示すように内因性ビオチンの影響は僅かである。アビジンが腫瘍に対して特異的に結合しているにも拘らずアビジン注射後２４時間に投与されたビオチンの分布がアビジンを投与していない場合のビオチンの分布と類似しているのは、アビジンが腫瘍に内部移行した可能性が高い。 (2-step method)
300 μg of unlabeled avidin was injected into LS180 tumor-implanted mice, and 0.3 μg of In-111-labeled biotin was injected 1-24 hours later. One group of LS180 tumor-transplanted mice was not injected with avidin, but only with In-111 labeled biotin. Two hours after the injection of biotin, 4-5 mice per group were killed and the radioactivity distribution was measured. The results are shown in Table 3. As the time from the injection of avidin to the administration of radiolabeled biotin in both normal and tumor tissues increased, the radioactivity in the tumor decreased. As shown below, the influence of endogenous biotin is slight. The distribution of biotin administered 24 hours after avidin injection despite the specific binding of avidin to the tumor is similar to the distribution of biotin when no avidin is administered. Is likely to be internalized into the tumor.

（表３）
腹腔内腫瘍（ＬＳ１８０）移植マウスへアビジンを予備標的した後、放射能標識したビオチンを投与した場合の、ビオチン投与後２時間の放射能分布 (Table 3)
Radioactivity distribution 2 hours after biotin administration when pre-targeting avidin to mice transplanted with intraperitoneal tumor (LS180) and then administering radiolabeled biotin

（各々、４〜５匹のマウスでの臓器１ｇ当たりの放射能量又は比の平均値土標準
偏差）

(The average soil standard deviation of the amount of radioactivity or the ratio per gram of organ in each of 4 to 5 mice)

（参考例） 内因性ビオチンの影響
抗ヒト結腸癌モノクロナル抗体ＭＬＳ１２８の５ｍｇ／ｍｌの濃度でリン酸緩衝液に溶解し、９μｇのＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ピアス社製）と共に４℃で２時間インキュベートして、ビオチン化抗体を得た。結合しなかったビオチンはファルマシア社製ＰＤ１０カラムにて除去した。３００μｇのビオチン化抗体を腫瘍移植マウス腹腔内に予備投与した後、５０μｇのストレプトアビジンを腹腔内に投与し、その２４時間後に放射能標識したビオチン抗体を投与した場合でも、ビオチンは腫瘍に結合した。これは内因性ビオチンの影響が僅かであることを示している。 (Reference Example) Effect of Endogenous Biotin Dissolved in phosphate buffer at a concentration of 5 mg / ml of anti-human colon cancer monoclonal antibody MLS128 and together with 9 μg NHS-LC-biotin (Pierce) at 4 ° C. for 2 hours Incubation yielded a biotinylated antibody. Biotin that did not bind was removed using a Pharmacia PD10 column. Even when 300 μg of biotinylated antibody was pre-administered into the abdominal cavity of a tumor-transplanted mouse, 50 μg of streptavidin was intraperitoneally administered, and radiolabeled biotin antibody was administered 24 hours later, biotin bound to the tumor. . This indicates that the influence of endogenous biotin is slight.

（実施例５） シンチグラム
画像解析のため、３．７μｇの放射能標識アビジンをＳＨＩＮ３腫瘍移植マウス腹腔に注射した。ピンホールコリメータを装着したサール社製ガンマカメラ（Ｓｅａｒｌｅ Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃｓ Ｉｎｃ；ＰＨＯ／ＧＡＮＭＡ ＬＦＯＢ）を用い、アビジン投与の２時間後と２４時間後にマウスを麻酔して得た画像を図２および図３に示した。また図４には臓器を取り出して並べた状態のシンチグラムを示す。２時間後、２４時間後とも良好な腫瘍蓄積が観察された。また、腫瘍での放射能蓄積は臓器を取り出して観察した場合にいっそう明かとなり、生体分布との一致が見られた。 Example 5 For scintigram image analysis, 3.7 μg of radiolabeled avidin was injected into the abdominal cavity of SHIN3 tumor-implanted mice. 2 and 3 show images obtained by anesthetizing mice 2 hours and 24 hours after administration of avidin using a Sarle gamma camera (Searle Radiographics Inc; PHO / GANMA LFOB) equipped with a pinhole collimator. It was. FIG. 4 shows a scintigram in which the organs are taken out and arranged. Good tumor accumulation was observed after 2 and 24 hours. In addition, the accumulation of radioactivity in the tumor became clearer when the organ was taken out and observed, and was consistent with the biodistribution.

（実施例６） 治療効果１
ＳＨＩＮ３腫瘍細胞１×１０7 個をヌードマウスの腹腔に投与し、２日後および４日後に１１．１ＭＢｑ，９．２５ＭＢｑのＩｎ−１１１標識アビジン（１００μｇ）を注射した。細胞移植の１３日後および１８日後にマウスを殺し、腫瘍重量と白血球数を測定した。放射能標識していないアビジンを同量注射したマウスを比較のために使用した。結果を表４に示す。検定はｔテストを用いた。放射能標識していないアビジンよりも、放射能標識したアビジンを用いた方が明らかに腫瘍重量を減らした（危険率０．０２％）。一方、白血球数には違いがなく、不要な破壊は起こしていない（危険率０．３％）。 Example 6 Therapeutic effect 1
1 × 10 7 SHIN3 tumor cells were administered into the abdominal cavity of nude mice, and injected with 11.1 MBq and 9.25 MBq of In-111 labeled avidin (100 μg) after 2 and 4 days. Mice were killed 13 and 18 days after cell transplantation, and tumor weight and white blood cell count were measured. Mice injected with the same amount of unlabeled avidin were used for comparison. The results are shown in Table 4. The t-test was used for the test. Obviously, the use of radiolabeled avidin reduced the tumor weight (risk rate 0.02%) compared to non-radiolabeled avidin. On the other hand, there is no difference in the white blood cell count, and no unnecessary destruction has occurred (risk rate 0.3%).

（表４）
Ｉｎ−１１１−アビジン投与による腫瘍の重量と白血球数 (Table 4)
Tumor weight and white blood cell count by administration of In-111-avidin

（実施例７） 治療効果２
ＳＨＩＮ３腫瘍細胞１×１０7 をヌードマウスの腹腔に投与し、２日後および７日後に１１．１ＭＢｑのＩ−１３１標識アビジン（１００μｇ）を注射した。腫瘍と血液での放射能取り込みは、３０分後それぞれ４５．８、０．７１％ＩＤ／ｇ、２４時間後では１５．２，０．０５％ＩＤ／ｇであった。細胞移植の１８日後マウスを殺し、腫瘍重量を測定した。放射能標識していないアビジンを同量注射したマウスを比較のために使用した。結果を表５に示す。検定はｔテストを用いた。放射能標識していないアビジンよりも、放射能標識したアビジンを用いた方が明らかに腫瘍重量を減らした（危険率３％）。 (Example 7) Therapeutic effect 2
SHIN3 tumor cells 1 × 10 7 were administered into the peritoneal cavity of nude mice and injected with 11.1 MBq of I-131 labeled avidin (100 μg) after 2 and 7 days. The uptake of radioactivity in the tumor and blood was 45.8 and 0.71% ID / g after 30 minutes and 15.2 and 0.05% ID / g after 24 hours, respectively. Mice were killed 18 days after cell transplantation and tumor weights were measured. Mice injected with the same amount of unlabeled avidin were used for comparison. The results are shown in Table 5. The t-test was used for the test. Obviously, the use of radiolabeled avidin reduced the tumor weight (risk rate 3%) over the non-radiolabeled avidin.

（表５）
マウス腹腔への腫瘍細胞移植後、Ｉ−１３１−アビジン処置までの日数による腫瘍重量の変化 (Table 5)
Change in tumor weight depending on the number of days from tumor cell transplantation to mouse abdominal cavity until I-131-avidin treatment

腫瘍の治療は、腫瘍細胞だけでなく正常細胞にとっても有害な成分を使用するため、腫瘍に対し高い特異性を有する薬剤が求められていた。本発明のアビジンまたはアビジンのレクチン結合部位を有する物質は、腫瘍表面のレクチンとの特異性が高いので放射性物質を結合することで、腫瘍を標的とした治療を行うことが可能であり、また高い標的能力は腫瘍部分のイメージングに極めて有用である。 Since tumor treatment uses components that are harmful not only to tumor cells but also to normal cells, a drug having high specificity for tumors has been demanded. The avidin of the present invention or the substance having a lectin binding site of avidin has high specificity with the lectin on the surface of the tumor, so that it is possible to perform treatment targeting the tumor by binding a radioactive substance. Targeting ability is extremely useful for imaging tumor areas.

アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンと腫瘍細胞ＳＨＩＮ３、ＬＳ１８０、ＬｏＶｏの腫瘍細胞数を変化させた場合の結合率を示す図である。It is a figure which shows the binding rate at the time of changing the tumor cell number of avidin, streptavidin, neutravidin, and tumor cells SHIN3, LS180, and LoVo.

ＳＨＩＮ３腫瘍移植マウスに、Ｉｎ−１１１を標識したビオチンを結合したアビジンを投与後、２時間の全身シンチグラムを示す写真（生物の形態）である。It is a photograph (form of organism) showing a whole body scintigram for 2 hours after administration of avidin conjugated with biotin labeled with In-111 to a SHIN3 tumor-transplanted mouse.

ＳＨＩＮ３腫瘍移植マウスに、Ｉｎ−１１１を標識したビオチンを結合したアビジンを投与後、２４時間の全身シンチグラムを示す写真（生物の形態）である。It is a photograph (form of organism) showing a whole body scintigram for 24 hours after administration of avidin bound to biotin labeled with In-111 to a SHIN3 tumor-transplanted mouse.

ＳＨＩＮ３腫瘍移植マウスに、Ｉｎ−１１１を標識したビオチンを結合したアビジンを投与後、２４時間の腫瘍臓器をとりだしたシンチグラムを示す写真（生物の形態）である。It is a photograph (morphological form) showing a scintigram of taking out a tumor organ for 24 hours after administering avidin conjugated with biotin labeled with In-111 to SHIN3 tumor-transplanted mice.

符号の説明Explanation of symbols

ＳＰ−−−脾臓
Ｉ−−−−腸間
Ｌ−−−−肝臓
ＳＴ−−−胃
Ｋ−−−−腎臓
Ｔ−−−−腫瘍 SP --- Spleen I --- Intestinal L --- Liver ST --- Gastric K ---- Kidney T ---- Tumor

Claims (7)

レクチンと特異的に結合する分子を有する糖蛋白を有効成分として含有する腫瘍治療剤。   A tumor therapeutic agent comprising, as an active ingredient, a glycoprotein having a molecule that specifically binds to a lectin. レクチンと特異的に結合する部分がＮ−アセチルグルコサミンまたはマンノースである糖蛋白質よりなる請求項１記載の腫瘍治療剤。   The tumor therapeutic agent according to claim 1, wherein the moiety specifically binding to lectin comprises a glycoprotein which is N-acetylglucosamine or mannose. 糖蛋白がアビジンである請求項１または２記載の腫瘍治療剤。   The tumor therapeutic agent according to claim 1 or 2, wherein the glycoprotein is avidin. 放射能標識された請求項１から３のいずれかに記載の腫瘍治療剤。   The tumor therapeutic agent according to any one of claims 1 to 3, which is radiolabeled. 放射能標識されたビオチンに、アビジンを結合した請求項３の腫瘍治療剤。   The tumor therapeutic agent according to claim 3, wherein avidin is bound to radiolabeled biotin. Ｉｎ−１１１、Ｉ−１３１またはＩ−１２５より選ばれる１つで放射能標識された請求項４または５のいずれかに記載の腫瘍治療剤。   The tumor therapeutic agent according to any one of claims 4 and 5, which is radiolabeled with one selected from In-111, I-131 and I-125. 請求項１ないし６記載の糖蛋白の腫瘍治療剤としての使用。
Use of the glycoprotein according to claim 1 as a tumor therapeutic agent.

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