JP2006117536A - Medicine for inducing hair cell of internal ear - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、内耳の有毛細胞を誘導するための医薬に関する。より詳しくは、Notchシグナル阻害物質を含む、内耳の有毛細胞を誘導するための医薬に関する。本発明はまた、内耳疾患または内耳機能障害の治療のための内耳培養物の製造方法に関する。 The present invention relates to a medicament for inducing hair cells in the inner ear. More specifically, the present invention relates to a medicament for inducing hair cells of the inner ear, which contains a Notch signal inhibitor. The present invention also relates to a method for producing an inner ear culture for the treatment of inner ear disease or inner ear dysfunction.
内耳の有毛細胞は機械的な音のシグナルを聴覚神経の電気刺激に変換する感覚上皮細胞である。内耳のコルチ器における有毛細胞は通常、内側の一層と外側の三層を形成するように配置されており、各有毛細胞は支持細胞によって囲まれている。これらの有毛細胞と支持細胞は共通の祖先細胞に由来する細胞である。
感覚神経による聴覚障害のほとんどのケースは有毛細胞の損失によるものであるが、有毛細胞は胎生期に***を終え、生後は増殖や再生を行うことができないため、聴覚障害などの内耳疾患の治療は困難であった。
The inner ear hair cells are sensory epithelial cells that convert mechanical sound signals into electrical stimulation of the auditory nerve. Hair cells in the inner ear's corti organ are usually arranged to form an inner layer and an outer three layers, each hair cell being surrounded by supporting cells. These hair cells and support cells are cells derived from a common ancestral cell.
Most cases of sensory nerve deafness are due to loss of hair cells, but hair cells divide during the embryonic period and cannot grow and regenerate after birth. It was difficult to treat.
Notchは発生過程で重要な役割を果たす細胞表面に存在する受容体タンパク質である。
Notchを介したシグナルは、以下のようなメカニズムで伝達されると考えられている。すなわち、Notchとそのリガンドが相互作用することにより、Notchの細胞内ドメインがγ−セクレターゼによって切断される（非特許文献１、２）。切断された細胞内ドメインは核に移行して転写因子であるRBP-Jに結合し、RBP-J がhes1などの標的遺伝子の転写を活性化する（非特許文献３，４）。Notchは4種類知られており、そのいずれもがRBP-Jに結合し、転写を活性化する。
通常の手法で作製されたNotchノックアウトマウスは胎生致死である。一方で、コンディショナルなノックアウトを用いた研究により、Notchシグナルが成体における器官の維持に重要な役割を果たしていることがわかった（非特許文献５，６）。
Notchシグナルの欠損は胎生期において、蝸牛有毛細胞の数を増加させることが知られている（非特許文献７，８）ものの、胎生期とは異なり生後は有毛細胞が増殖しないため、生後におけるNotchの役割は不明であった。
Signals via Notch are thought to be transmitted by the following mechanism. That is, Notch and its ligand interact, whereby the intracellular domain of Notch is cleaved by γ-secretase (Non-patent Documents 1 and 2). The cleaved intracellular domain moves to the nucleus and binds to RBP-J, which is a transcription factor, and RBP-J activates transcription of a target gene such as hes1 (Non-patent Documents 3 and 4). Four types of Notch are known, all of which bind to RBP-J and activate transcription.
Notch knockout mice created by conventional techniques are embryonic lethal. On the other hand, studies using conditional knockouts revealed that Notch signal plays an important role in organ maintenance in adults (Non-patent Documents 5 and 6).
Notch signal deficiency is known to increase the number of cochlear hair cells in the embryonic period (Non-patent Documents 7 and 8), but unlike the embryonic period, hair cells do not proliferate after birth, The role of Notch in is unknown.
本発明は、新規な作用機序を有する、内耳の有毛細胞を誘導するための医薬を提供することを課題とする。本発明はまた、内耳疾患または内耳機能障害の治療のための内耳培養物の製造方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a medicament for inducing hair cells of the inner ear having a novel mechanism of action. Another object of the present invention is to provide a method for producing an inner ear culture for the treatment of inner ear diseases or inner ear dysfunction.
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、RBP-J遺伝子をコンディショナルにノックアウトすることあるいはγ−セクレターゼ活性阻害剤を用いることによってNotchシグナルを阻害することで、内耳の有毛細胞を生後においても誘導できることを見出
した。さらに、有毛細胞を再生させることによって内耳疾患、内耳機能障害を治療できることを見出し、本発明を完成するに至った。
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have determined that the RBP-J gene is conditionally knocked out or that the Notch signal is inhibited by using a γ-secretase activity inhibitor. It has been found that cells can be induced even after birth. Furthermore, it has been found that inner ear diseases and inner ear dysfunction can be treated by regenerating hair cells, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Notchシグナル阻害物質を含む、内耳の有毛細胞を誘導するための医薬。
（２）内耳疾患または内耳機能障害の治療薬である、（１）の医薬。
（３）Notchシグナル阻害物質がγ−セクレターゼ活性阻害剤である、（１）または（２）の医薬。
（４）Notchシグナル阻害物質がペプチドである、（１）または（２）の医薬。
（５）前記ペプチドがTATタンパク質に融合されたペプチドである、（４）の医薬。
（６）Notchシグナル阻害物質が核酸である、（１）または（２）の医薬。
（７）前記核酸がNotch遺伝子の部分配列を有する核酸である、（６）の医薬。
（８）前記核酸がRBP-J遺伝子の部分配列を有する核酸である、（６）の医薬。
（９）前記核酸がDNAである、（６）〜（８）のいずれかの医薬。
（１０）前記核酸がRNAである、（６）〜（８）のいずれかの医薬。
（１１）RNAがRNA干渉作用を有する二本鎖RNAである、（１０）の医薬。
（１２）前記核酸がベクター上に保持された、（６）〜（１１）のいずれかの医薬。
（１３）ベクターがウイルスベクターである、（１２）の医薬。
（１４）ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターである、（１３）の医薬。
（１５）ベクターが非ウイルスベクターである、（１２）の医薬。
（１６）リポソームまたはリポプレックスを含有し、該リポソームまたはリポプレックス中に前記核酸を含有する、（６）〜（１５）のいずれかの医薬。
（１７）単離された内耳の培養物にNotchシグナル阻害物質を投与して有毛細胞を誘導する工程を含む、内耳疾患または内耳機能障害の治療のための内耳培養物の製造方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) A medicament for inducing hair cells in the inner ear, which contains a Notch signal inhibitor.
(2) The medicament according to (1), which is a therapeutic drug for inner ear disease or inner ear dysfunction.
(3) The medicament of (1) or (2), wherein the Notch signal inhibitor is a γ-secretase activity inhibitor.
(4) The pharmaceutical of (1) or (2), wherein the Notch signal inhibitor is a peptide.
(5) The medicament according to (4), wherein the peptide is a peptide fused to a TAT protein.
(6) The medicament according to (1) or (2), wherein the Notch signal inhibitor is a nucleic acid.
(7) The medicament according to (6), wherein the nucleic acid is a nucleic acid having a partial sequence of a Notch gene.
(8) The medicament according to (6), wherein the nucleic acid is a nucleic acid having a partial sequence of the RBP-J gene.
(9) The medicament according to any one of (6) to (8), wherein the nucleic acid is DNA.
(10) The medicament according to any one of (6) to (8), wherein the nucleic acid is RNA.
(11) The medicament according to (10), wherein the RNA is a double-stranded RNA having an RNA interference action.
(12) The medicament according to any one of (6) to (11), wherein the nucleic acid is retained on a vector.
(13) The medicament according to (12), wherein the vector is a viral vector.
(14) The medicament according to (13), wherein the viral vector is a retroviral vector, an adenoviral vector, or an adeno-associated viral vector.
(15) The medicament according to (12), wherein the vector is a non-viral vector.
(16) The medicament according to any one of (6) to (15), comprising a liposome or lipoplex, wherein the nucleic acid is contained in the liposome or lipoplex.
(17) A method for producing an inner ear culture for the treatment of inner ear disease or inner ear dysfunction, comprising a step of inducing hair cells by administering a Notch signal inhibitor to the isolated inner ear culture.
本発明の医薬は内耳の有毛細胞を誘導することができ、聴覚障害などの内耳疾患および内耳機能障害の治療に有用である。また、本発明の内耳培養物の製造方法は、内耳疾患または内耳機能障害の治療に有用である。 The medicament of the present invention can induce hair cells in the inner ear and is useful for the treatment of inner ear diseases such as hearing impairment and inner ear dysfunction. The method for producing an inner ear culture of the present invention is useful for treating inner ear diseases or inner ear dysfunction.
本発明の医薬は、Notchシグナル阻害物質を有効成分として含む、内耳の有毛細胞を誘導するための医薬である。好ましくは、内耳の有毛細胞を誘導することによって内耳疾患、または内耳機能障害を治療するための医薬である。
本明細書において、「内耳疾患、内耳機能障害」とは、内耳の蝸牛又は前庭における疾患や機能障害をいい、組織的には有毛細胞の脱落や変性、内リンパ液の循環異常による水腫などが認められ、聴力障害（聴力低下、難聴）、眩暈、耳鳴や耳閉塞感、平衡感覚喪失などの症状を呈する。本明細書において、「内耳疾患、内耳機能障害」は上記の組織学的所見、症状にあてはまる限りその発症原因について限定はされないが、特には音響暴露、聴器毒薬物、老化等によるものが挙げられる。
The medicament of the present invention is a medicament for inducing hair cells of the inner ear containing a Notch signal inhibitory substance as an active ingredient. Preferably, it is a medicament for treating inner ear diseases or inner ear dysfunction by inducing hair cells of the inner ear.
In the present specification, “inner ear disease, inner ear dysfunction” refers to a disease or dysfunction in the cochlea or vestibule of the inner ear, and structurally includes hair cell loss or degeneration, edema due to abnormal circulation of the inner lymph fluid, etc. Symptoms such as hearing loss (decreased hearing, hearing loss), dizziness, tinnitus and ear obstruction, and loss of balance are observed. In the present specification, “inner ear disease, inner ear dysfunction” is not limited as long as it is applicable to the above histological findings and symptoms, but particularly includes those caused by acoustic exposure, ototoxic drugs, aging, etc. .
Notchは細胞表面受容体タンパク質であり、Delta、Serrateなど膜蛋白型リガンドの刺激を受け取る。リガンドの刺激を受け取ったNotchは細胞内ドメインがγ−セクレターゼによって切断される。切断された細胞内ドメインは核に移行して転写因子であるRBP-Jに結合し、hes1などの標的遺伝子の転写を活性化し、それによって細胞の分化などが誘導される（Genes Cells 1996, vol. 1: p1-9）。
本発明においてNotchシグナルとは、このようなリガンド→Notch→RBP-J→標的遺伝子という経路を意味する。Notchシグナルが阻害されたかどうかの評価は、例えば、hes1（
例えば、GenBank Accession No. NM_005524）などの標的遺伝子の転写活性化試験やmRNAの定量等によって評価することができる。
Notch is a cell surface receptor protein that receives stimuli from membrane protein ligands such as Delta and Serrate. In Notch that has received ligand stimulation, the intracellular domain is cleaved by γ-secretase. The cleaved intracellular domain moves to the nucleus and binds to RBP-J, which is a transcription factor, and activates transcription of target genes such as hes1, thereby inducing cell differentiation (Genes Cells 1996, vol. 1: p1-9).
In the present invention, the Notch signal means such a route of ligand → Notch → RBP-J → target gene. Evaluation of whether the Notch signal is inhibited is, for example, hes1 (
For example, it can be evaluated by a transcription activation test of a target gene such as GenBank Accession No. NM_005524) or quantification of mRNA.
Notchは哺乳類では４種類のバリアントが知られており、例えば、ヒトの各Notchバリアントのアミノ酸配列及びそれらをコードする遺伝子の塩基配列は、Notch1（GenBank Accession No.NM_017617.2）、Notch2（GenBank Accession No.NM_024408.2）、Notch3（GenBank Accession No.NM_000435.1）、Notch4（GenBank Accession No.NM_004557.2）に開示されている。また、マウスの各Notchバリアントのアミノ酸配列及びそれらをコードする遺伝子の塩基配列は、Notch1（GenBank Accession No.NM_008714.2）、Notch2（GenBank Accession No.NM_010928.1）、Notch3（GenBank Accession No.NM_008716.1）、Notch4（GenBank Accession No.NM_010929.1）に開示されている。
本発明の医薬に含まれるNotchシグナル阻害物質はNotch１〜４のいずれかによるシグナルを阻害すればよいが、Notch１〜４によるシグナルを全て阻害する物質であることが好ましい。
There are four types of Notch known in mammals. For example, the amino acid sequence of each human Notch variant and the base sequence of the gene encoding them are Notch1 (GenBank Accession No. NM_017617.2), Notch2 (GenBank Accession No. NM_024408.2), Notch3 (GenBank Accession No. NM_000435.1), Notch4 (GenBank Accession No. NM_004557.2). In addition, the amino acid sequence of each mouse Notch variant and the base sequence of the gene encoding them are Notch1 (GenBank Accession No. NM_008714.2), Notch2 (GenBank Accession No. NM_010928.1), Notch3 (GenBank Accession No. NM_008716). .1), Notch4 (GenBank Accession No. NM_010929.1).
The Notch signal inhibitory substance contained in the medicament of the present invention may be any substance that inhibits any signal from Notch1-4, but is preferably a substance that inhibits all signals from Notch1-4.
Notchシグナル阻害物質としては、例えば、γ−セクレターゼ活性の阻害剤が挙げられる。γ−セクレターゼ活性阻害剤としては、γ−セクレターゼによるNotchの切断を阻害する物質である限り特に制限されないが、MDL28170（例えば、S igma-Aldrich Inc.から入手可）、DAPT（N-S-phenyl-glycine-t-butyl ester）、DFK167（ICN Pharmaceuticalsより入手可）などが挙げられ、その中ではMDL28170が特に好ましい。これらの化合物は市販のものを用いてもよいし、化学合成したものを用いてもよい。また、γ−セクレターゼ活性阻害剤は、化合物ライブラリーからγ−セクレターゼ活性を阻害する活性を指標としたスクリーニングによって得られる化合物であってもよい。なお、γ−セクレターゼ活性は、例えば、J Biol Chem. 2004, vol. 279(29):p30771-80に記載されている方法によって測定することができる。 Examples of the Notch signal inhibitor include inhibitors of γ-secretase activity. The γ-secretase activity inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits cleavage of Notch by γ-secretase, but MDL28170 (for example, available from Sigma-Aldrich Inc.), DAPT (NS-phenyl-glycine) -t-butyl ester) and DFK167 (available from ICN Pharmaceuticals), among which MDL28170 is particularly preferred. These compounds may be commercially available or chemically synthesized. Further, the γ-secretase activity inhibitor may be a compound obtained by screening from a compound library using the activity of inhibiting γ-secretase activity as an index. The γ-secretase activity can be measured, for example, by the method described in J Biol Chem. 2004, vol. 279 (29): p30771-80.
以下、本発明の医薬の一例として、γ−セクレターゼ活性阻害剤を含む医薬について説明する。ただし、本発明の医薬はこれに限定されず、他のNotchシグナルを阻害する化合物を含む医薬も同様にして製造することができる。 Hereinafter, as an example of the medicament of the present invention, a medicament containing a γ-secretase activity inhibitor will be described. However, the medicament of the present invention is not limited thereto, and medicaments containing other compounds that inhibit Notch signal can be produced in the same manner.
上記γ−セクレターゼ活性阻害剤若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物をそのまま投与してもよいが、有効成分であるγ−セクレターゼ活性阻害剤と薬理学的及び製剤学的に許容される担体を含む医薬組成物を調製して投与することが好ましい。 The above-mentioned γ-secretase activity inhibitor or a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate or solvate thereof may be administered as it is, but the active ingredient γ-secretase activity inhibitor and pharmacology And a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier is preferably prepared and administered.
薬理学的及び製剤学的に許容しうる担体としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。
例えば、賦形剤としてはブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン等；崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース、デンプン等；結合剤としてはヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン等；滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウム、タルク等；コーティング剤としてはヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール等；基剤としてはワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン等を用いることができる。また、溶解剤としては、蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等；等張化剤としてはブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等；ｐＨ調節剤としては無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等を用いることができる。
Examples of pharmacologically and pharmaceutically acceptable carriers include excipients, disintegrants, binders, lubricants, coating agents, dyes, diluents, bases, solubilizers, isotonic agents, A pH adjuster, a stabilizer, a propellant, an adhesive, and the like can be used.
For example, glucose, lactose, D-mannitol, starch, etc. as excipients; carboxymethylcellulose, starch, etc. as disintegrants; hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, gelatin etc. as binders; magnesium stearate as lubricants , Talc, etc .; hydroxypropylmethylcellulose, sucrose, polyethylene glycol, etc. as coating agents; petrolatum, liquid paraffin, polyethylene glycol, gelatin, kaolin, glycerin, etc. can be used as bases. In addition, as a solubilizer, distilled water, physiological saline, propylene glycol and the like; as an isotonic agent, glucose, sodium chloride, D-mannitol, glycerin and the like; as a pH regulator, an inorganic acid, an organic acid, an inorganic base or An organic base or the like can be used.
本発明の医薬の形態は特に限定されず、当業者に利用可能な種々の形態をとることができる。例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、硬ゼラチンカプセル剤、坐剤、トローチ剤、注射剤
、点滴剤、吸入剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などを調製することができる。
The form of the medicament of the present invention is not particularly limited, and can take various forms that can be used by those skilled in the art. For example, tablets, powders, granules, hard gelatin capsules, suppositories, troches, injections, drops, inhalants, suppositories, transdermal absorption agents, transmucosal absorption agents, and the like can be prepared.
本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、経口的または非経口的に投与することができる。また、全身投与であってもよいが、副作用を減らして治療効果を高めるためには局所投与がより好ましい。
局所投与の場合、本発明の医薬を、内耳へ直接、または外耳道及び中耳を経由して投与することができる。また、内リンパ嚢／内リンパ管及び耳嚢を通して投与してもよい。局所投与は、注射またはカテーテルを介して行うことが好ましい。また、局所投与は米国特許第5,476,446号明細書や米国特許第5,350,580号明細書に記載されているような装置を用いて行ってもよい。
The administration route of the medicament of the present invention is not particularly limited, and can be administered orally or parenterally. Moreover, systemic administration may be used, but local administration is more preferable in order to reduce side effects and enhance the therapeutic effect.
For topical administration, the medicament of the present invention can be administered directly to the inner ear or via the ear canal and middle ear. It may also be administered through the endolymphatic sac / endolymphatic duct and the ear sac. Local administration is preferably performed via injection or catheter. Local administration may also be performed using devices such as those described in US Pat. No. 5,476,446 and US Pat. No. 5,350,580.
本発明の医薬の投与量は特に限定されないが、通常は、有効成分である式（Ｉ）で示される化合物の重量として一般に経口投与の場合には一日あたり０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは一日あたり０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、であり、非経口投与の場合には一日あたり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。上記投与量は１日１回又は２〜３回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減してもよい。投与対象は哺乳類が好ましく、ヒトがより好ましい。 The dose of the medicament of the present invention is not particularly limited, but usually 0.1 to 1000 mg / kg body weight per day in the case of oral administration generally as the weight of the compound represented by formula (I) as an active ingredient, The daily dose is preferably 0.5 to 50 mg / kg body weight, and in the case of parenteral administration, the daily dose is 0.01 to 100 mg / kg body weight, preferably 0.1 to 10 mg / kg body weight. The above dose is preferably administered once a day or divided into 2 to 3 times a day, and may be appropriately increased or decreased depending on age, disease state, and symptoms. The subject of administration is preferably a mammal, more preferably a human.
本発明の医薬に含まれるNotchシグナル阻害物質はNotchシグナルを阻害するペプチドであってもよい。Notchシグナル阻害ペプチドは、Notchタンパク質やRBP-Jタンパク質の部分ペプチドであってもよい。このような部分ペプチドとしては、内因性Notchタンパク質やRBP-Jタンパク質の機能を阻害する限り特に制限されないが、ドミナントネガティブな作用をするもの、例えば、リガンド結合部位のみを有するNotchの部分ペプチドや転写活性化部位を欠いたRBP-Jの部分ペプチドなどが挙げられる。部分ペプチドの長さは特に制限されないが、アミノ酸１００〜４００個からなるペプチドが好ましい。
なお、RBP-Jはヒトでは４種類のバリアントが知られており、例えば、各バリアントのアミノ酸配列及びそれらをコードする遺伝子の塩基配列は、GenBank Accession No. NM_005349、NM_015874、NM_203283、NM_203284に開示されている。また、マウスのRBP-Jのアミノ酸配列及びそれらをコードする遺伝子の塩基配列は、GenBank Accession No. NM_009035に開示されている。RBP-Jの部分ペプチドはこれらのいずれの部分ペプチドであってもよい。
The Notch signal inhibitory substance contained in the medicament of the present invention may be a peptide that inhibits Notch signal. The Notch signal inhibitory peptide may be a partial peptide of Notch protein or RBP-J protein. Such a partial peptide is not particularly limited as long as it inhibits the functions of endogenous Notch protein and RBP-J protein, but it has a dominant negative action, for example, a partial peptide of Notch having only a ligand binding site or transcription. And a partial peptide of RBP-J lacking the activation site. The length of the partial peptide is not particularly limited, but a peptide consisting of 100 to 400 amino acids is preferable.
RBP-J is known to have four types of variants in humans. For example, the amino acid sequences of the variants and the base sequences of the genes encoding them are disclosed in GenBank Accession Nos. NM_005349, NM_015874, NM_203283, and NM_203284. ing. Further, the amino acid sequence of mouse RBP-J and the base sequence of the gene encoding them are disclosed in GenBank Accession No. NM_009035. The partial peptide of RBP-J may be any of these partial peptides.
上記ペプチドは、目的ペプチドの細胞内への取り込みを促進させることが知られているHIVウイルスのTATタンパク質（Methods. 2001, vol. 24(3):p247-56）に結合した融合ペプチドであってもよい。HIVウイルスのTATタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。なお、TATタンパク質は、目的ペプチドの細胞内への取り込みを促進させることができる限り、配列番号２のアミノ酸配列を有するものの類似体であってもよい。類似体としては、配列番号２において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加された配列を有するタンパク質を挙げることができる。ここで、数個とは、例えば、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個が挙げられる。
なお、上述したようなNotchシグナル阻害ペプチド又は融合ペプチドは、化学合成されたものでもよいし、通常の遺伝子組換え法によって生産されたものであってもよい。
The above peptide is a fusion peptide bound to the TAT protein of HIV virus (Methods. 2001, vol. 24 (3): p247-56), which is known to promote the uptake of the target peptide into cells. Also good. Examples of the TAT protein of HIV virus include those having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The TAT protein may be an analog having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as long as it can promote the uptake of the target peptide into cells. Examples of the analog include a protein having a sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added in SEQ ID NO: 2. Here, the term “several” includes, for example, 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5.
Note that the Notch signal inhibitory peptide or fusion peptide as described above may be either chemically synthesized or produced by a normal genetic recombination method.
Notchシグナル阻害ペプチドは単独又は医薬的に許容可能な担体と組み合わせた医薬組成物として投与される。剤型は特に制限されないが、上述したような溶解剤・希釈剤などを用いて調製される注射剤または点滴剤が好ましい。投与法は特に制限されないが、上述したような局所投与が好ましい。 The Notch signal inhibitory peptide is administered alone or as a pharmaceutical composition in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. The dosage form is not particularly limited, but an injection or infusion prepared using the above-described solubilizer / diluent is preferable. The administration method is not particularly limited, but local administration as described above is preferable.
Notchシグナル阻害物質はさらに、核酸であってもよい。Notchシグナルを阻害する核酸
としては、上記Notchシグナル阻害ペプチドをコードする核酸であってもよいし、Notchシグナルの構成因子のいずれかの発現を抑制する核酸であってもよい。ここでNotchシグナルの構成因子としては、Notch、RBJ-J、hes１などが挙げられる。
核酸はDNAであってもよいし、アンチセンスRNAであってもよいし、RNA干渉（RNA interference）作用を有する二本鎖RNAであってもよい。Notchシグナルの構成因子のいずれかの発現を抑制する核酸としては、例えば、これらの因子をコードする塩基配列の部分配列を有する核酸が挙げられ、翻訳や転写の開始点を含む配列を有する核酸がより好ましい。その長さは特に制限されないが、１９〜２３塩基がより好ましい。なお、核酸は修飾されたものであってもよい。
The Notch signal inhibitor may further be a nucleic acid. The nucleic acid that inhibits the Notch signal may be a nucleic acid that encodes the above Notch signal-inhibiting peptide, or a nucleic acid that suppresses the expression of any of the components of the Notch signal. Here, examples of constituents of the Notch signal include Notch, RBJ-J, and hes1.
The nucleic acid may be DNA, antisense RNA, or double-stranded RNA having an RNA interference action. Examples of the nucleic acid that suppresses the expression of any of the constituent elements of the Notch signal include nucleic acids having a partial sequence of a base sequence encoding these factors, and nucleic acids having a sequence including a translation or transcription start point. More preferred. The length is not particularly limited, but 19 to 23 bases are more preferable. The nucleic acid may be modified.
上記のような核酸はそのまま投与されるものであってもよいが、ベクター上に保持されたものであってもよい。
ベクターは、当業者に知られているような、通常のウイルス又は非ウイルスベクターを用いることができる。ウイルスベクターを使用する場合、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターを使用し得る。非ウイルスベクターとしては、プラスミドベクターなどを用いることができる。
The nucleic acid as described above may be administered as it is, or may be retained on a vector.
As the vector, a normal viral or non-viral vector known to those skilled in the art can be used. When a viral vector is used, a retroviral vector, an adenoviral vector, or an adeno-associated viral vector can be used. A plasmid vector etc. can be used as a non-viral vector.
レトロウイルスは、感染後、宿主細胞の染色体中にその遺伝子を挿入することができるＲＮＡウイルスである。ウイルスのタンパク質をコードする遺伝子を欠き、細胞に感染する能力を保持し、その遺伝子を標的細胞の染色体中に挿入するレトロウイルスベクターが開発されている（Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１：５〜１４（１９９０））。 Retroviruses are RNA viruses that can insert their genes into the host cell chromosome after infection. Retroviral vectors have been developed that lack the gene encoding the viral protein, retain the ability to infect cells, and insert the gene into the chromosome of the target cell (AD Miller, Hum. Gen. Ther. .1: 5-14 (1990)).
アデノウイルスベクターは、患者に直接投与することができる。レトロウイルスベクターとは異なり、アデノウイルスベクターは宿主細胞の染色体中には組み込まれない。その代わり、アデノウイルスベクターを用いて細胞中に導入された遺伝子は、限られた期間だけ存続する染色体外因子（エピソーム）として核の中に維持される（Ｂ．Ｃ．Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ Ｒｅｖ．１２：１８５〜１９９（１９９３））。 Adenoviral vectors can be administered directly to patients. Unlike retroviral vectors, adenoviral vectors do not integrate into the host cell chromosome. Instead, genes introduced into cells using adenoviral vectors are maintained in the nucleus as extrachromosomal factors (episomes) that persist only for a limited period of time (BC Trapnell, Adv Drug Del Rev). 12: 185-199 (1993)).
本発明の核酸を含む医薬は、核酸をリポソーム又はリポプレックス(lipoplexes)中に内包する形態のものが好ましい。ここで、「リポプレックス」とは、ＤＮＡとカチオン性脂質が複合体を形成したものをいう（Hum Gene Ther. 2001, vol. 12 (8): p861-70）。リポソーム又はリポプレックスは当業者によってよく知られているものを用いることができる。 The medicine containing the nucleic acid of the present invention preferably has a form in which the nucleic acid is encapsulated in liposomes or lipoplexes. Here, “lipoplex” refers to a complex of DNA and cationic lipid (Hum Gene Ther. 2001, vol. 12 (8): p861-70). As the liposome or lipoplex, those well known by those skilled in the art can be used.
上記核酸を含む医薬は内耳に局所的に投与することが好ましい。内耳に導入し、その中で核酸を機能させるためには、直接注入、電気穿孔、ウイルスによって介される遺伝子送達、アミノ酸によって介される遺伝子送達、遺伝子銃による遺伝子送達、リポフェクション及び熱ショックを含む本分野で知られている任意の遺伝子送達法を使用することができる。なお、核酸を含む医薬の投与量は核酸の発現効率や阻害効率に基づいて適宜調節される。 The medicament containing the nucleic acid is preferably administered locally to the inner ear. Fields including direct injection, electroporation, virus mediated gene delivery, amino acid mediated gene delivery, gene gun gene delivery, lipofection and heat shock for introduction into the inner ear and functioning of nucleic acids therein Any gene delivery method known in can be used. In addition, the dosage of the medicine containing the nucleic acid is appropriately adjusted based on the expression efficiency and inhibition efficiency of the nucleic acid.
本発明はまた、内耳疾患または内耳機能障害の治療のための内耳培養物の製造方法に関する。当該方法では、単離された内耳の対外培養物にNotchシグナル阻害物質を投与して有毛細胞を誘導する。ここでは、医師によって単離された内耳を用いることができる。単離された内耳はその一部、例えば、蝸牛又はコルチ器であってもよい。 The present invention also relates to a method for producing an inner ear culture for the treatment of inner ear disease or inner ear dysfunction. In this method, hair cells are induced by administering a Notch signal inhibitor to the isolated outer culture of the inner ear. Here, the inner ear isolated by a doctor can be used. The isolated inner ear may be part of it, for example a cochlea or a Corti organ.
単離された内耳の培養は、好ましくは約３７℃、約５％CO2、加湿の条件下で行うことができる。培養に用いる培地は特に制限されないが、例えば、DMEM培地、ＮｅｕｒａｌｂａｓａｌＴＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）などを用いることができる。さらに、Ｂ２７又
はＮ２などの培地サプリメントを追加してもよい。
内耳 をインビトロで培養するためには培養装置を用いてもよく、有用な装置の好ましい実施例は、例えば、米国特許第５，４３７，９９８号、米国特許第５，７０２，９４１号、及び米国特許第５，７６３，２７９号に開示されている。
The culture of the isolated inner ear can be performed preferably under conditions of about 37 ° C., about 5% CO 2 and humidification. The medium used for the culture is not particularly limited, and for example, DMEM medium, Neuralbasal TM medium (Gibco BRL) and the like can be used. Furthermore, medium supplements such as B27 or N2 may be added.
A culture device may be used to culture the inner ear in vitro, and preferred examples of useful devices include, for example, US Pat. No. 5,437,998, US Pat. No. 5,702,941, and US This is disclosed in Japanese Patent No. 5,763,279.
本発明においては、培養された内耳をNotchシグナル阻害物質で処理をすることにより、有毛細胞を誘導する。Notchシグナル阻害物質としては、上述したようなγ−セクレターゼ活性阻害剤、ペプチド、核酸などが挙げられるが、γ−セクレターゼ活性阻害剤が特に好ましい。γ−セクレターゼ活性阻害剤を用いる場合、培養液中に１〜100μMの濃度で加え、１〜５日間維持することが好ましい。内耳細胞の誘導はミオシン7aなどの発現によって確認することができる。有毛細胞を誘導することによって製造される細胞は、内耳疾患または内耳機能障害を治療するための再生医療に使用することができる。
In the present invention, hair cells are induced by treating the cultured inner ear with a Notch signal inhibitor. Examples of the Notch signal inhibitor include γ-secretase activity inhibitors, peptides, nucleic acids and the like as described above, and γ-secretase activity inhibitors are particularly preferable. When a γ-secretase activity inhibitor is used, it is preferably added to the culture solution at a concentration of 1 to 100 μM and maintained for 1 to 5 days. Induction of inner ear cells can be confirmed by expression of myosin 7a and the like. Cells produced by inducing hair cells can be used in regenerative medicine to treat inner ear diseases or inner ear dysfunction.
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
動物は以下のものを用いた。
ICRマウスは日本SLC（浜松）から入手した。RBP-Jf/fマウスはNat Immunol. 2002, vol. 3(5):p443-50.、Curr Biol. 2003, vol. 13(4):p333-8.およびInt Immunol. 2002, vol. 14(6):p637-45.に記載されているものを用いた。ROSA26 Creレポーター（R26R）マウス（Nat Genet. 1999, vol. 21(1):p70-1.）はJackson Laboratories（Bar Harbor, ME, USA）から入手した。
The following animals were used.
ICR mice were obtained from Japan SLC (Hamamatsu). RBP-J f / f mice are Nat Immunol. 2002, vol. 3 (5): p443-50., Curr Biol. 2003, vol. 13 (4): p333-8. And Int Immunol. 2002, vol. 14 (6): The one described in p637-45. ROSA26 Cre reporter (R26R) mice (Nat Genet. 1999, vol. 21 (1): p70-1.) Were obtained from Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA).
野生型マウス（ICRマウス）のコルチ器における、Notchおよびそのリガンドの発現をRT-PCRによって調べた。RNeasyキット（Qiagen）を用いて、生後3日のICRマウスから切除したコルチ器からトータルRNAを抽出した。Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen）を用いて20μlの反応系でcDNAを合成した。ｃＤＮＡ産物の２０分の1をRT-PCR（50μlの反応系）の鋳型として用いた。Notchおよびそのリガンド（Notch1-3, RBP-J, Delta like 1（Dll1）, Delta like 3（Dll3）, Delta like 4（Dll4）, Jagged 1（J1）およびJagged2（J2））の転写物の増幅は、94℃、5分で熱変性を行った後に、94℃30秒、60℃30秒、72℃1分のサイクルを30サイクルという条件で、各種プライマーおよび組換えTaqポリメラ−ゼ（宝バイオ）を用いて行った。
Notch１の検出には配列番号３，４のプライマー、Notch2の検出には配列番号５，６のプライマー、Notch3の検出には配列番号７，８のプライマー、RBP-Jの検出には配列番号９，１０のプライマー、Dll1の検出には配列番号１１，１２のプライマー、Dll3の検出には配列番号１３，１４のプライマー、Dll4の検出には配列番号１５，１６のプライマー、J１の検出には配列番号１７，１８のプライマー、J2の検出には配列番号１９，２０のプライマーをそれぞれ用いた。
The expression of Notch and its ligand in the Corti organ of wild type mice (ICR mice) was examined by RT-PCR. Using the RNeasy kit (Qiagen), total RNA was extracted from a Corti organ excised from 3-day-old ICR mice. CDNA was synthesized in a 20 μl reaction system using Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). One-twentieth of the cDNA product was used as a template for RT-PCR (50 μl reaction system). Amplification of transcripts of Notch and its ligands (Notch1-3, RBP-J, Delta like 1 (Dll1), Delta like 3 (Dll3), Delta like 4 (Dll4), Jagged 1 (J1) and Jagged2 (J2)) After heat denaturation at 94 ° C for 5 minutes, various primers and recombinant Taq polymerase (Treasure Biotechnology) were used under the conditions of 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute. ).
SEQ ID NOS: 3 and 4 for detection of Notch1, primers of SEQ ID NOS: 5 and 6 for detection of Notch2, primers of SEQ ID NOS: 7 and 8 for detection of Notch3, SEQ ID NOS: 9 and 9 for detection of RBP-J 10 primers, SEQ ID NOS: 11 and 12 for detection of Dll1, SEQ ID NOs: 13 and 14 for detection of Dll3, SEQ ID NOS: 15 and 16 for detection of Dll4, SEQ ID NO: for detection of J1 The primers of SEQ ID NOs: 19 and 20 were used for the detection of the primers 17 and 18, respectively, and J2.
結果を図１ａに示す。それによると、Notch1,2,3、RBP-JおよびNotchリガンドであるJagged 1およびJagged2の発現が生後3日目のコルチ器において見られた。したがって、Notchは胎生期だけでなく、新生児の蝸牛でもその役割を果たしていることが考えられた。
次に、生後3日目のコルチ器全封入物（図１ｂ−ｄ）または組織切片（図１ｅ−ｇ）の免疫組織染色を行った。その結果、ＮotchリガンドであるJagged 1は、有毛細胞の側面に位置し、有毛細胞の供給源と考えられているHensen細胞を含む支持細胞に検出された。
The result is shown in FIG. According to it, expression of Notch1,2,3, RBP-J and Notch ligands Jagged 1 and Jagged2 was found in the Corti organ on the third day of life. Therefore, Notch may play a role not only in the embryonic period but also in the newborn cochlea.
Next, immunohistochemical staining was performed on the whole corti organ inclusions (FIG. 1b-d) or tissue sections (FIG. 1e-g) on the third day after birth. As a result, Jagged 1 which is a Notch ligand was detected on supporting cells including Hensen cells which are located on the side of hair cells and considered to be a source of hair cells.
次に、Creを発現するアデノウイルスベクター（AxCANCre：Nucleic Acids Res. 1995, vol. 23(19):p3816-21.）を、loxPに隣接したrbpsuhアレル（ＲＢＰ-Ｊfアレル）を有す
るRBP-Jf/fマウス（生後3日目）から単離されたコルチ器の体外培養物に導入することによって、生後のコルチ器においてNotchシグナルを破壊した。NotchはRBP-Jを介してシグナルを伝達するため、この操作はNotchシグナルを完全に遮断する。
Next, an adenoviral vector expressing Cre (AxCANCre: Nucleic Acids Res. 1995, vol. 23 (19): p3816-21.) Was added to RBP- having an rbpsuh allele (RBP-J f allele) adjacent to loxP. The Notch signal was disrupted in postnatal corti organs by introduction into in vitro cultures of corti organs isolated from J f / f mice (day 3 postnatal). Since Notch transmits a signal via RBP-J, this operation completely blocks the Notch signal.
まず、以下のような手順でコルチ器を単離し、器官培養を行った。
新生児マウス（R26Rマウス、RBP-Jf/fマウスまたはRBP-Jf/＋マウス；それぞれ生後3日目）を麻酔下、二酸化炭素を用いて屠殺した。立体顕微鏡のもと、ピンセットを用いてマウスの頭から蝸牛を切除した。コルチ器を周りの組織から分離してセルカルチャーインサート（直径10.5mm、ポアサイズ3μm、Becton Dickinson and Company）に入れた。培養は、それぞれD−グルコースを添加したDMEM（Sigma-Aldrich Inc.）中で、加湿した5％CO2雰囲気下、37℃で行った。
体外培養開始後すぐにアデノウイルスベクター（AxCANCre）を１X108ＰＦＵ/mlの濃度で1時間感染させた。
First, the organ of Corti was isolated by the following procedure, and organ culture was performed.
Neonatal mice (R26R mice, RBP-J f / f mice or RBP-J f / + mice; each 3 days after birth) were sacrificed using carbon dioxide under anesthesia. Under a stereo microscope, the cochlea was excised from the head of the mouse using tweezers. The Colti device was separated from the surrounding tissue and placed in a cell culture insert (10.5 mm diameter, 3 μm pore size, Becton Dickinson and Company). Culturing was performed at 37 ° C. in a humidified 5% CO 2 atmosphere in DMEM (Sigma-Aldrich Inc.) supplemented with D-glucose.
Immediately after the start of in vitro culture, the adenovirus vector (AxCANCre) was infected at a concentration of 1 × 10 8 PFU / ml for 1 hour.
なお、遺伝子破壊の効率はR26Rマウス内のROSA26 Creレポーター（LacZ）遺伝子によって調べた。AxCANCre ウイルスで処理したコルチ器および非処理のコルチ器をX-galで染色した結果を図2に示す。それによれば、Creの発現を示すLacZの発現はコルチ器のすべての箇所で見られ（図２B）、有毛細胞および支持細胞を含むすべての細胞で見られたことから（図２D）、効率よく破壊が行われていることが確かめられた。 The efficiency of gene disruption was examined using the ROSA26 Cre reporter (LacZ) gene in R26R mice. FIG. 2 shows the results of staining with X-gal of a Corti apparatus treated with AxCANCre virus and an untreated Corti apparatus. According to it, the expression of LacZ indicating the expression of Cre was found in all parts of the Corti organ (FIG. 2B), and was seen in all cells including hair cells and supporting cells (FIG. 2D). It was confirmed that destruction was often done.
RBP-Jが破壊されたコルチ器における有毛細胞の誘導を各種抗体を用いた組織染色により調べた。RBP-Jf/fマウスから単離したコルチ器をAxCANCreで処理した。当該処理の5日後、コルチ器は内耳の有毛細胞の特異的マーカーであるミオシン7a抗体で染色された（図３a、d）。ミオシン7aは、異所的、特に有毛細胞のそばに位置する通常はヘンセン細胞が存在する領域に陽性であった。これらの異所性の有毛細胞はLacZにも陽性であり（図3ｂ、ｅ）、RBP-Jの破壊の細胞自律的効果によってミオシン7a陽性になっていることが考えられた。
また、抗Math1抗体でRBP-J欠損マウスのコルチ器を染色した結果、異所性の有毛細胞が生じている領域ではMath1にも陽性であることがわかった（図３ｇ，ｈ）。
Induction of hair cells in the Corti organ in which RBP-J was destroyed was examined by tissue staining using various antibodies. Corti organs isolated from RBP-J f / f mice were treated with AxCANCre. Five days after the treatment, the Corti organ was stained with myosin 7a antibody, a specific marker of inner ear hair cells (FIGS. 3a, d). Myosin 7a was ectopic, particularly positive in the area where normal Hensen cells are located near the hair cells. These ectopic hair cells were also positive for LacZ (FIG. 3b, e), and were considered to be positive for myosin 7a due to the cell-autonomous effect of RBP-J destruction.
In addition, as a result of staining the Corti organ of RBP-J-deficient mice with anti-Math1 antibody, it was found that the region where ectopic hair cells were produced was also positive for Math1 (FIGS. 3g and h).
次に、別の手段を用いてNotchシグナルを阻害することを試みた。すなわち、4種類のNotchはγ−セクレターゼ依存的にシグナルを伝達することから、γ−セクレターゼ活性阻害剤を用いてNotchシグナルを阻害することを試みた。 Next, we tried to inhibit the Notch signal using another means. That is, since four types of Notch transmit signals in a γ-secretase-dependent manner, an attempt was made to inhibit the Notch signal using a γ-secretase activity inhibitor.
γ−セクレターゼ活性阻害剤実験では、妊娠マウス（胎生16日）または野生型新生児マウス（生後3日目）から単離されたコルチ器を用いた。
DMSO（１μl/ml）またはMDL28170 （S igma-Aldrich Inc.）（DMSOに３０μMの濃度で溶解したもの）を含むDMEM＋6g/l D-グルコースでコルチ器を培養した。12時間おきにDMSO（Sigma-Aldrich Inc.）または薬剤を含む培地を交換しながら、3日間培養した。
In a γ-secretase activity inhibitor experiment, a Corti organ isolated from a pregnant mouse (embryonic day 16) or a wild-type newborn mouse (day 3 after birth) was used.
The Corti organ was cultured in DMEM + 6 g / l D-glucose containing DMSO (1 μl / ml) or MDL28170 (Sigma-Aldrich Inc.) (dissolved in DMSO at a concentration of 30 μM). The culture was carried out for 3 days while changing the medium containing DMSO (Sigma-Aldrich Inc.) or drug every 12 hours.
ＤＭＳＯまたはMDL28170で処理されたコルチ器をミオシン７ａ抗体又はファロイジンで染色した。結果を図４に示す。胎児のコルチ器をγ−セクレターゼ活性阻害剤であるMDL28170で処理した場合に有毛細胞の増加が見られた（図４b）。さらに、生後3日目のコルチ器の体外培養物をMDL28170で処理した結果、処理3日後には、RBP-J遺伝子破壊で見られたのと同じ位置に、遺伝子破壊で見られたよりも顕著な、異所性の有毛細胞の誘導が見られた（図４ｄ）。一方、DMSO処理では有毛細胞の誘導は見られなかった（図４ｃ）。以上より、γ−セクレターゼ活性阻害剤を用いてNotchシグナルを阻害することにより、生後のコルチ器においても有毛細胞の誘導ができることがわかった。 Corti organs treated with DMSO or MDL28170 were stained with myosin 7a antibody or phalloidin. The results are shown in FIG. When fetal Corti was treated with MDL28170, a γ-secretase activity inhibitor, an increase in hair cells was observed (FIG. 4b). In addition, after 3 days of treatment, the in vitro culture of the Corti organ was treated with MDL28170, and after 3 days of treatment, it was more prominent at the same position as seen with the RBP-J gene disruption than seen with the gene disruption. Induction of ectopic hair cells was seen (FIG. 4d). On the other hand, hair cells were not induced by DMSO treatment (FIG. 4c). From the above, it was found that hair cells can be induced even in postnatal corti organs by inhibiting a Notch signal using a γ-secretase activity inhibitor.
なお、組織染色は以下の手順で行った。
単離されたコルチ器の体外培養物を2時間、３７℃でX-gal染色液（３ｍMフェリシアニドカリウム、３ｍMフェロシアニドカリウム、１ｍM塩化マグネシウム、０．１％トライトンX、0.5mg/ml５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−D−ガラクトピラノシドを含有するPBS（pH7.4））を用いて染色した。
免疫組織染色では、蝸牛または培養コルチ器を直接、Tissue-Tek（MILES）で包埋し、液体窒素で凍結した。空気乾燥させた10μmのクリオスタット切片をシランでコートされたスライドガラス上に回収した。全封入物およびクリオスタット切片は４％パラホルムアルデヒドで固定した。抗原はTexas Redまたはビオチン結合２次抗体（抗ミオシン7a抗体；Jackson ImmunoResearch Laboratories、その他の抗体；Vector Laboratories）を用いて可視化した。蛍光像はライカTCS SP2システムで撮影した。免疫組織染色のための1次抗体は以下のものを用いた。ウサギ抗Jagged 1（１：２０）抗体；Santa Cruz Biotechnology Inc.、ウサギ抗ミオシン7a抗体（1：300）（ポリクローナル）；Tama Hasson博士より入手、ウサギ抗Math 1（１：１５０）抗体（ポリクローナル）；Jane-Johnson博士より入手、マウス抗lacZ（１：１０００）抗体（モノクローナル）；Promega Corp.。
アクチンフィラメントはFITC結合ファロイジン（3μg/ml）（Sigma-Aldrich Inc.）を用いて可視化した。
Tissue staining was performed according to the following procedure.
The in vitro culture of the isolated Corti apparatus was incubated for 2 hours at 37 ° C. with X-gal stain (3 mM potassium ferricyanide, 3 mM potassium ferrocyanide, 1 mM magnesium chloride, 0.1% Triton X, 0.5 mg / ml 5- Staining was carried out using PBS (pH 7.4) containing bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside.
For immunohistochemical staining, cochlea or cultured corti was directly embedded in Tissue-Tek (MILES) and frozen in liquid nitrogen. Air-dried 10 μm cryostat sections were collected on silane-coated glass slides. All inclusions and cryostat sections were fixed with 4% paraformaldehyde. Antigens were visualized using Texas Red or a biotin-conjugated secondary antibody (anti-myosin 7a antibody; Jackson ImmunoResearch Laboratories, other antibodies; Vector Laboratories). Fluorescence images were taken with a Leica TCS SP2 system. The following primary antibodies were used for immunohistochemical staining. Rabbit anti-Jagged 1 (1:20) antibody; Santa Cruz Biotechnology Inc., rabbit anti-myosin 7a antibody (1: 300) (polyclonal); obtained from Dr. Tama Hasson, rabbit anti-Math 1 (1: 150) antibody (polyclonal) Obtained from Dr. Jane-Johnson, mouse anti-lacZ (1: 1000) antibody (monoclonal); Promega Corp .;
Actin filaments were visualized using FITC-conjugated phalloidin (3 μg / ml) (Sigma-Aldrich Inc.).
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