JP2006087325A - Analytical reagent, dry analytical element and analytical method - Google Patents
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本発明は、試料溶液中のアナライト（分析目標成分）の定性または定量分析を正確に行うことのできる分析用試薬、乾式分析要素、および分析方法に関し、特に生体試料中のアナライト（分析目標成分）の定性または定量分析を正確に行うことのできる分析用試薬、乾式分析要素、および分析方法に関する。 The present invention relates to an analytical reagent, a dry analytical element, and an analytical method capable of accurately performing qualitative or quantitative analysis of an analyte (analysis target component) in a sample solution, and more particularly to an analyte (analysis target) in a biological sample. The present invention relates to an analytical reagent, a dry analytical element, and an analytical method capable of accurately performing a qualitative or quantitative analysis of a component.
臨床検査において、血液等の生体試料に含まれるアナライト（分析目標成分）を定量するために、乾式分析要素を用いることが知られている。例えば特許文献１には、オキシダーゼの存在下で生成する過酸化水素を定量することにより、水性液体試料中のアナライトを定量し得る呈色試薬組成物を含有する層を光透過性水不透過性支持体の上に有する乾式多層分析要素が開示されている。特許文献１の乾式多層分析要素は、アナライトまたはアナライトから誘導される物質に特異的に作用して過酸化水素を生成するオキシダーゼ、過酸化水素分解酵素、フェロシアン化アルカリ、色原体を必須成分とする呈色試薬組成物を前記支持体の片面上の層に乾燥状態で保持したものである。 In clinical tests, it is known to use a dry analytical element to quantify an analyte (analysis target component) contained in a biological sample such as blood. For example, Patent Document 1 discloses that a layer containing a color reagent composition capable of quantifying an analyte in an aqueous liquid sample by quantifying hydrogen peroxide generated in the presence of an oxidase is light-transmissive and water-impermeable. A dry multilayer analytical element having an adhesive support on top is disclosed. The dry multi-layer analytical element of Patent Document 1 includes an oxidase, a hydrogen peroxide-degrading enzyme, an alkali ferrocyanide, and a chromogen that act specifically on an analyte or a substance derived from the analyte to generate hydrogen peroxide. A color reagent composition as an essential component is held in a dry state on a layer on one side of the support.
図４に、特許文献１の乾式多層分析要素の断面図を示す。図４に示す乾式多層分析要素５００は、コレステロールを定量するためのものであり、光透過性水不透過性支持体１００の上に色原体含有層２００、その上にフェロシアン化アルカリおよび酸化チタン微粒子を含む光反射層４００、その上にコレステロースエステラーゼ、過酸化水素分解酵素（ペルオキシダーゼ）およびコレステロールオキシダーゼを含む試薬展開層５２０が設けられている。この乾式多層分析要素５００を用いてコレステロールを検出するには、例えば血液を試薬展開層５２０に点着し、血液中の成分濃度に応じて発色する色原体の色濃度を、支持体側から反射測光法によって検出する。
測定原理は以下のようなものである。すなわち、リポプロテインを含む血清は、ほぼその容量に比例した拡がりをもって試薬展開層５２０中に浸透する。試薬展開層５２０において、血清中のリポプロテインに含まれるコレステロールエステルは、コレステロースエステラーゼによってコレステロールと脂肪酸とに加水分解される。生成したコレステロールはそこに存在するコレステロールオキシダーゼによって酸化され、過酸化水素が生成する。この過酸化水素はペルオキシダーゼにより水に変換される際に、フェロシアンイオンを酸化し、フェリシアンイオンを生成させる。このフェリシアンイオンは、色原体を有色色素に酸化して色素を形成し、その色素生成量は血清中のコレステロールに相関する。
FIG. 4 shows a cross-sectional view of the dry multilayer analytical element of Patent Document 1. The dry multilayer
The measurement principle is as follows. That is, serum containing lipoprotein permeates into the
上記特許文献１に開示されているコレステロール測定用の乾式分析要素を用いてコレステロールを測定すると、生体試料中のコレステロールが実際の濃度よりも低値化することが問題となっていた。
本発明の目的は、試料溶液中のアナライトの定性または定量分析を正確に行うことのできる分析用試薬および乾式分析要素を提供することである。
When cholesterol is measured using the dry analytical element for measuring cholesterol disclosed in Patent Document 1, the cholesterol in the biological sample becomes lower than the actual concentration.
An object of the present invention is to provide an analytical reagent and a dry analytical element capable of accurately performing qualitative or quantitative analysis of an analyte in a sample solution.
上記の反応系でコレステロールが低値化する要因について探索したところ、生体試料中に存在する尿酸が、コレステロールオキシダーゼによって生成された過酸化水素と、ペルオキシダーゼとの酵素反応を妨害し、さらに、還元性物質である尿酸がフェロシアンイオンの酸化反応を妨害して、これらの結果として、生体試料中のコレステロール量の分析結果に負誤差を与えることが明らかとなった。本発明は、このコレステロールオキシダーゼにより生成した過酸化水素が、尿酸により分解して負誤差に与えることに対して、尿酸にウリカーゼを作用させ、尿酸由来の過酸化水素を生成させることにより、コレステロールの低値化を防止できることを見出し、本発明を完成するに至った。 In the above reaction system, we investigated the factors that lower cholesterol levels. Uric acid present in biological samples interfered with the enzymatic reaction between hydrogen peroxide produced by cholesterol oxidase and peroxidase. It became clear that uric acid, which is a substance, interferes with the oxidation reaction of ferrocyan ion, and as a result, it gives a negative error to the analysis result of the amount of cholesterol in a biological sample. In the present invention, the hydrogen peroxide produced by this cholesterol oxidase is decomposed by uric acid to give a negative error. On the other hand, uricase is allowed to act on uric acid to produce uric acid-derived hydrogen peroxide. It has been found that lowering can be prevented, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１） 試料溶液中のアナライトまたはアナライトから誘導される物質にオキシダーゼを作用させて酸化性物質を生成させ、前記酸化性物質を利用して発色性物質を発色させて前記アナライトを定性または定量分析するための分析用試薬において、前記分析用試薬が、少なくとも前記オキダーゼと尿酸酸化酵素とをともに含むことを特徴とする分析用試薬。
（２） 前記オキシダーゼがコレステロールオキシダーゼであることを特徴とする上記（１）に記載の分析用試薬。
（３） 試料溶液中のアナライトまたはアナライトから誘導される物質にオキシダーゼを作用させて酸化性物質を生成させ、前記酸化性物質を利用して発色性物質を発色させて前記アナライトを定性または定量分析するための乾式分析要素であって、前記オキシダーゼと尿酸酸化酵素とを含む試薬層を備えることを特徴とする乾式分析要素。
（４） 前記オキシダーゼがコレステロールオキシダーゼであることを特徴とする上記（３）に記載の乾式分析要素。
（５） 試料溶液中のアナライトまたはアナライトから誘導される物質に、尿酸酸化酵素の存在下でオキシダーゼを作用させて酸化性物質を生成させ、前記酸化性物質を利用して発色性物質を発色させて前記アナライトを定性または定量分析する分析方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) An oxidase is made to act on an analyte in a sample solution or a substance derived from the analyte to generate an oxidizing substance, and the coloring substance is developed using the oxidizing substance to qualify the analyte. Alternatively, in the analytical reagent for quantitative analysis, the analytical reagent contains at least both the oxidase and urate oxidase.
(2) The analytical reagent according to (1), wherein the oxidase is cholesterol oxidase.
(3) An oxidase is allowed to act on an analyte in a sample solution or a substance derived from the analyte to generate an oxidizing substance, and the coloring substance is developed using the oxidizing substance to qualify the analyte. Alternatively, a dry analysis element for quantitative analysis, comprising a reagent layer containing the oxidase and urate oxidase.
(4) The dry analytical element as described in (3) above, wherein the oxidase is cholesterol oxidase.
(5) An oxidase is produced by causing an oxidase to act on an analyte in a sample solution or a substance derived from the analyte in the presence of uric acid oxidase, and a chromogenic substance is produced using the oxidizing substance. An analysis method in which the analyte is qualitatively or quantitatively analyzed by coloring.
本発明によれば、試料溶液中のアナライトの定性または定量分析の際に、尿酸酸化酵素によってその妨害物質となり得る尿酸を排除することができるので、アナライトの定性または定量分析を正確に行うことのできる分析用試薬、乾式分析要素および分析方法を提供することができる。 According to the present invention, uric acid that can be an interfering substance can be eliminated by uric acid oxidase during qualitative or quantitative analysis of an analyte in a sample solution, so that qualitative or quantitative analysis of the analyte is accurately performed. Analytical reagents, dry analytical elements and analytical methods can be provided.
本発明の分析用試薬は、いわゆるウェットケミストリーと呼ばれる方式を用いた複数の液体試薬を混合して分析する試薬キットの形態でもよいし、液体試薬を使用しないフィルム状の乾式分析要素の形態であってもよい。好ましくは、本発明の分析用試薬は分析を迅速且つ簡便に行える乾式分析要素の形態である。
本発明の分析用試薬の反応系としては、試料溶液中のアナライトまたはアナライトから誘導される物質にオキシダーゼを作用させ酸化性物質を生成させ、酸化性物質を利用して発色性物質を発色させる機構をもつものであれば、特に限定されない。
ここで、本明細書における「酸化性物質」とは、他の物質を酸化する作用を有する物質を意味する。また、「発色性物質」とは、電子の授受によって可視光を吸収することができる色素前駆体を意味する。
The analytical reagent of the present invention may be in the form of a reagent kit that analyzes by mixing a plurality of liquid reagents using a so-called wet chemistry method, or in the form of a film-like dry analytical element that does not use liquid reagents. May be. Preferably, the analytical reagent of the present invention is in the form of a dry analytical element that enables quick and simple analysis.
As the reaction system of the analytical reagent of the present invention, an oxidase is produced by causing an oxidase to act on an analyte in a sample solution or a substance derived from the analyte, and the coloring substance is colored using the oxidizing substance. There is no particular limitation as long as it has a mechanism.
Here, the “oxidizing substance” in the present specification means a substance having an action of oxidizing other substances. Further, the “chromogenic substance” means a dye precursor that can absorb visible light by transferring electrons.
また、本発明の分析用試薬は、オキシダーゼと尿酸酸化酵素（ウリカーゼ）とをともに含んでいる。例えば、本発明の分析用試薬が乾式分析要素の形態である場合は、オキシダーゼと尿酸酸化酵素とを含む試薬層を備えた形態であることが好ましい。 The analytical reagent of the present invention contains both oxidase and uric acid oxidase (uricase). For example, when the analytical reagent of the present invention is in the form of a dry analytical element, it is preferably in a form provided with a reagent layer containing oxidase and urate oxidase.
本発明の分析用試薬によって分析可能なアナライトとしては、上記反応機構によって分析できるものであれば特に限定されないが、例えば、生体試料中のコレステロールを分析対象とすることができる。生体試料中のコレステロールを分析対象とする場合、オキシダーゼとしてコレステロールオキシダーゼを、酸化性物質として過酸化水素を、発色性物質としてロイコ色素を用いて測定することができる。このコレステロールの測定原理の一例を、図１を用いて説明する。
生体試料中においては、コレステロールはリポプロテインの内部に包含されている。リポプロテイン中のコレステロールは、遊離コレステロールとコレステロールエステルの形態で、ほぼ１：３の割合で存在している。そこで、図１に示すようにリポプロテインを例えば界面活性剤により、コレステロール＋コレステロールエステル＋タンパク質に分離する（反応１）。次に、生じたコレステロールエステルにコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）を作用させ、脂肪酸と遊離コレステロールとに分離する（反応２）。これらの処理によって生じた遊離コレステロールを、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）と接触させ、過酸化水素（酸化性物質）を生成させる（反応３）。この過酸化水素をペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下で反応させることにより、フェロシアンイオン（Ｆｅ（ＣＮ）６ ４−）を酸化してフェリシアンイオン（Ｆｅ（ＣＮ）６ ３−）を生成させる。生成したＦｅ（ＣＮ）６ ３−により、ロイコ色素のような色原体を酸化して有色の色素を形成する（反応４）。この発色色素を定性分析するか、比色定量法により定量する。
The analyte that can be analyzed by the analytical reagent of the present invention is not particularly limited as long as it can be analyzed by the above reaction mechanism. For example, cholesterol in a biological sample can be analyzed. When cholesterol in a biological sample is an analysis target, it can be measured using cholesterol oxidase as an oxidase, hydrogen peroxide as an oxidizing substance, and a leuco dye as a coloring substance. An example of this cholesterol measurement principle will be described with reference to FIG.
In biological samples, cholesterol is contained within lipoproteins. Cholesterol in lipoprotein is present in a ratio of approximately 1: 3 in the form of free cholesterol and cholesterol ester. Therefore, as shown in FIG. 1, the lipoprotein is separated into cholesterol + cholesterol ester + protein using, for example, a surfactant (reaction 1). Next, cholesterol esterase (CE) is allowed to act on the resulting cholesterol ester to separate it into fatty acid and free cholesterol (Reaction 2). Free cholesterol produced by these treatments is brought into contact with cholesterol oxidase (CO) to produce hydrogen peroxide (oxidizing substance) (reaction 3). By reacting this hydrogen peroxide in the presence of peroxidase (POD), ferrocyan ion (Fe (CN) 6 4− ) is oxidized to generate ferricyan ion (Fe (CN) 6 3− ). The produced Fe (CN) 6 3- oxidizes a chromogen such as a leuco dye to form a colored dye (reaction 4). This coloring dye is qualitatively analyzed or quantified by a colorimetric method.
上記の反応系を用いてコレステロールを測定する場合、前述のように、生体試料中のコレステロール量の分析結果に負誤差を与えてしまうことが問題となっていた。負誤差を与える要因について本発明者らが検討したところ、生体試料中に含まれる尿酸が過酸化水素とペルオキシダーゼとに作用して、過酸化水素の酵素反応を妨害すること、さらには、尿酸がフェロシアンイオンの酸化反応（Ｆｅ(ＣＮ)6 4-→Ｆｅ(ＣＮ)6 3-）に対しても作用し、フェリシアンイオンの生成量を減じさせることが明らかとなった。そこで、本発明では、コレステロールオキシダーゼと尿酸酸化酵素（ウリカーゼ）とを共存させることで、生体試料中の尿酸をアラントインと過酸化水素に分解し、尿酸の還元反応に基づく悪影響を抑制し、かつ、尿酸由来の過酸化水素により、フェリシアンイオンの生成を起こさせ、尿酸の還元反応により減じたフェリシアンイオンを補償することができる。従って、本発明の分析用試薬は、上記機構により尿酸による負誤差を抑制することができ、アナライトの定性又は定量分析を正確に行うことができる。 When measuring cholesterol using the above reaction system, as described above, it has been a problem that a negative error is given to the analysis result of the amount of cholesterol in the biological sample. When the present inventors examined a factor that gives a negative error, uric acid contained in a biological sample acts on hydrogen peroxide and peroxidase to interfere with the enzymatic reaction of hydrogen peroxide. It has been clarified that it acts on the oxidation reaction (Fe (CN) 6 4− → Fe (CN) 6 3− ) of ferrocyan ion to reduce the amount of ferricyan ion produced. Therefore, in the present invention, by coexisting cholesterol oxidase and uric acid oxidase (uricase), uric acid in a biological sample is decomposed into allantoin and hydrogen peroxide, suppressing adverse effects based on the reduction reaction of uric acid, and Hydrogen peroxide derived from uric acid can generate ferricyan ions and compensate for the ferricyan ions reduced by the reduction reaction of uric acid. Therefore, the analytical reagent of the present invention can suppress negative errors due to uric acid by the above mechanism, and can accurately perform qualitative or quantitative analysis of the analyte.
なお、生体試料における特定成分を分析する技術分野において、尿酸に対してウリカーゼを作用させることによって生体試料中の尿酸を排除できることについては既に知られている（例えば、特開昭６０−２０９１７６号公報）。しかしながら、この特開昭６０−２０９１７６号公報に記載の発明は、生体試料をウリカーゼによって前処理して予め尿酸を排除することで尿酸の影響を回避するものであるのに対し、本発明は、コレステロールオキシダーゼにより生成した過酸化水素が、尿酸により分解して負誤差に与えることに対して、尿酸にウリカーゼを作用させ、尿酸由来の過酸化水素を生成させることにより、尿酸による誤差を排除するものである。この点で本発明は特開昭６０−２０９１７６号公報に記載の発明とは全く異なるものである。
なお、上記反応系においてウリカーゼを用いる際には、ウリカーゼを添加しすぎると、尿酸が専ら過酸化水素の生成に関与することになり、反対に正誤差を与えることがあるため、適正量のウリカーゼを提供することが重要である。ウリカーゼの適正な添加量は、生体試料に含まれるコレステロールおよび尿酸の推定量や、ロイコ色素の分散形態（例えば乳化分散と水分散ではフェリシアンイオンによる反応速度が異なる）等により適宜変更することができる。
In the technical field of analyzing a specific component in a biological sample, it is already known that uric acid in a biological sample can be eliminated by allowing uricase to act on uric acid (for example, JP-A-60-209176). ). However, the invention described in JP-A-60-209176 avoids the effects of uric acid by pretreating a biological sample with uricase to eliminate uric acid in advance. In contrast to the fact that hydrogen peroxide produced by cholesterol oxidase is decomposed by uric acid and gives a negative error, uricase is allowed to act on uric acid to produce hydrogen peroxide derived from uric acid, thereby eliminating errors due to uric acid. It is. In this respect, the present invention is completely different from the invention described in JP-A-60-209176.
In addition, when using uricase in the above reaction system, if too much uricase is added, uric acid is exclusively involved in the production of hydrogen peroxide, and on the contrary, it may give a positive error. It is important to provide The appropriate amount of uricase can be appropriately changed according to the estimated amount of cholesterol and uric acid contained in the biological sample, the dispersion form of leuco dye (for example, the reaction rate by ferricyan ion differs between emulsified dispersion and water dispersion), etc. it can.
上記のコレステロールオキシダーゼ（ＣＯＤ，ＥＣ １．１．３．６）、ウリカーゼ（ＥＣ １．７．３．３）、コレステロールエステラーゼ（ＣＥ，ＥＣ ３．１．１．１３）及びペルオキシダーゼ（ＰＯＤ，ＥＣ １．１１．１．７）は市販のものを使用することができる。
市販のコレステロールオキシダーゼとしては、例えば、東洋紡績（株）のＣＯＯ−３１１、旭化成（株）のＣＯＮ、エフ・ホフマン・ラ・ロシュ社（F.Hoffmann-La Roche Ltd.）のCholesterol oxidase、天野エンザイム（株）のＣＨＯ−１等が挙げられる。ウリカーゼとしては、例えば、東洋紡績（株）のＵＡＯ−２０１、旭化成（株）のＵＯＤＮ、エフ・ホフマン・ラ・ロシュ社のUricase、オリエンタル酵母工業（株）のUricase、キッコーマン（株）のＵ−ＴＥ等が挙げられる。ペルオキシダーゼとしては、例えば、東洋紡績（株）のＰＥＯ−３０１等が挙げられる。コレステロールエステラーゼとしては、例えば、天野エンザイム（株）のＣＨＥ−２等が挙げられる。
ロイコ色素は、例えば、ロイコ色素の酸化によって色素を生成する組成物（例、米国特許４，０８９，７４７号明細書）等に記載のトリアリールイミダゾールロイコ色素、特開昭５９−１９３３５２号公報等に記載のジアリールイミダゾールロイコ色素）等が挙げられる。これとは別に、酸化されたときに他の化合物とカップリングにより色素を生成する化合物を含む組成物（例えば4-アミノアンチピリン類とフェノール類又はナフトール類）などを使用することもできる。
Cholesterol oxidase (COD, EC 1.1.3.6), uricase (EC 1.7.3.3), cholesterol esterase (CE, EC 3.1.1.13) and peroxidase (POD, EC 1) Commercially available products can be used for.
Examples of commercially available cholesterol oxidase include COO-311 from Toyobo Co., Ltd., CON from Asahi Kasei Co., Ltd., Cholesterol oxidase from F. Hoffmann-La Roche Ltd., and Amano Enzyme. CHO-1 of Co., Ltd. etc. are mentioned. Examples of the uricase include UAO-201 of Toyobo Co., Ltd., UODN of Asahi Kasei Co., Ltd., Uricase of F. Hoffman La Roche, Uricase of Oriental Yeast Co., Ltd., U- of Kikkoman Corp. TE etc. are mentioned. Examples of peroxidase include PEO-301 from Toyobo Co., Ltd. Examples of cholesterol esterase include CHE-2 from Amano Enzyme Co., Ltd.
The leuco dye is, for example, a triarylimidazole leuco dye described in a composition that produces a dye by oxidation of a leuco dye (eg, US Pat. No. 4,089,747), JP-A-59-193352, etc. And diarylimidazole leuco dyes) described above. Apart from this, it is also possible to use a composition (for example, 4-aminoantipyrines and phenols or naphthols) containing a compound that forms a pigment by coupling with other compounds when oxidized.
本発明の分析用試薬の一例として、図１に示す反応系によってコレステロールを測定する乾式分析要素を図２に基づいて説明する。
図２に示す乾式分析要素１０は、支持体１１上に、ロイコ色素等の発色性物質を含む発色層１２が設けられており、この発色層１２の上に、フェロシアンイオンを含む第１試薬層１３が設けられている。さらに、この第１試薬層１３の上には、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、及びウリカーゼを含む第２試薬層１４が設けられている。
As an example of the analytical reagent of the present invention, a dry analytical element for measuring cholesterol by the reaction system shown in FIG. 1 will be described with reference to FIG.
In the dry
発色層１２、第１試薬層１３、及び第２試薬層１４（以下、これらを「反応層」と総称する）は、水浸透性を高くするために、多孔性媒体からなる多孔性層とするか、親水性ポリマーバインダーからなる層とするのが好ましく、親水性ポリマーバインダーからなる層とするのがより好ましい。
The
反応層を多孔性層とする場合、その多孔性媒体は繊維質であってもよいし、非繊維質であってもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、織物布地（例えば平織布地）、編物布地（例えばトリコット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることができる。非繊維質材料としては、特開昭49-53888号公報等に記載の酢酸セルロース等からなるメンブランフィルター、特開昭49-53888号公報、特開昭55-90859号公報、特開昭58-70163号公報等に記載の無機物又は有機物微粒子からなる連続空隙含有粒状構造物層等のいずれでもよい。特開昭61-4959号公報、特開昭62-116258号公報、特開昭62-138756号公報、特開昭62-138757号公報、特開昭62-138758号公報等に記載の部分接着された複数の多孔性層の積層物も好適である。 When the reaction layer is a porous layer, the porous medium may be fibrous or non-fibrous. As the fibrous material, for example, filter paper, non-woven fabric, woven fabric (for example, plain woven fabric), knitted fabric (for example, tricot knitted fabric), glass fiber filter paper, and the like can be used. Examples of non-fibrous materials include membrane filters made of cellulose acetate and the like described in JP-A-49-53888, JP-A-49-53888, JP-A-55-90859, JP-A-58- Any of the continuous void-containing granular structure layers composed of inorganic or organic fine particles described in Japanese Patent No. 70163 may be used. Partial adhesion described in JP-A-61-4959, JP-A-62-116258, JP-A-62-138756, JP-A-62-138757, JP-A-62-138758, etc. A laminate of a plurality of porous layers made is also suitable.
多孔性層からなる反応層の厚さは特に制限されないが、塗布によって設ける場合には、１μｍ〜50μｍ程度が好ましく、より好ましくは2μｍ〜30μｍの範囲が適当である。ラミネートによる積層など、塗布以外の方法による場合、厚さは数十μｍから数百μｍの範囲で大きく変化し得る。 The thickness of the reaction layer composed of the porous layer is not particularly limited, but when it is provided by coating, the thickness is preferably about 1 μm to 50 μm, more preferably 2 μm to 30 μm. In the case of a method other than coating, such as lamination by lamination, the thickness can vary greatly in the range of several tens to several hundreds of μm.
親水性ポリマーバインダーから反応層を形成する場合、親水性ポリマーバインダーの種類は、含有するロイコ色素や、酵素の種類又はその添加量等を考慮して適宜決めることができる。親水性ポリマーの具体例としては、ゼラチン及びこれらの誘導体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例えばヒドロキシエチルセルロース）、アガロース、アルギン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合体、メタアクリルアミド共重合体、アクリルアミド又はメタアクリルアミドと各種ビニル性モニマーとの共重合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体等が挙げられる。 When the reaction layer is formed from a hydrophilic polymer binder, the type of the hydrophilic polymer binder can be appropriately determined in consideration of the contained leuco dye, the type of enzyme, the amount of addition thereof, or the like. Specific examples of the hydrophilic polymer include gelatin and derivatives thereof (for example, phthalated gelatin), cellulose derivatives (for example, hydroxyethyl cellulose), agarose, sodium alginate, acrylamide copolymer, methacrylamide copolymer, acrylamide or methacrylamide. Examples include copolymers with various vinyl monomers, polyhydroxyethyl methacrylate, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, sodium polyacrylate, copolymers of acrylic acid and various vinyl monomers, and the like.
親水性ポリマーバインダーで構成される反応層は、特公昭53-21677号公報、特開昭55-164356号公報、特開昭54-101398 号公報、特開昭61-292063 号公報等に記載の方法に従って、各酵素液と親水性ポリマーとを含む水溶液又は水分散液を、支持体若しくは他の層の上に塗布し乾燥することにより設けることができる。親水性ポリマーをバインダーとする場合、乾燥時の反応層の厚さは約2μm〜約50μmの範囲であることが好ましく、約4μm 〜約30μmの範囲であることがより好ましく、被覆量では約2g/m2〜約50g/m2の範囲であることが好ましく、約4g/m2〜約30g/m2の範囲であることがより好ましい。 A reaction layer composed of a hydrophilic polymer binder is described in JP-B-53-21677, JP-A-55-164356, JP-A-54-101398, JP-A-61-292063, etc. According to the method, an aqueous solution or an aqueous dispersion containing each enzyme solution and a hydrophilic polymer can be provided on a support or other layer and dried. When a hydrophilic polymer is used as a binder, the thickness of the reaction layer when dried is preferably in the range of about 2 μm to about 50 μm, more preferably in the range of about 4 μm to about 30 μm, and the coating amount is about 2 g. / m 2 to about 50 g / m 2 is preferable, and about 4 g / m 2 to about 30 g / m 2 is more preferable.
反応層には、塗布特性、拡散性、反応性、保存性等の諸性能の向上を目的として、酵素の活性化剤、補酵素、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤組成物、微粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるいは無機物からなる各種添加剤を加えることができる。反応層に含有させることができる緩衝剤の例としては、日本化学会編「化学便覧 基礎編」（東京、丸善（株）、1966年発行）1312-1320 頁、R.M.C. Dawson et al編、「Data for Biochemical Research」第２版(Oxford at the Clarendon Press,1969 年発行) 476-508 頁、「Biochemistry」5,467-477頁 (1966年) 、「Analytical Biochemistry」 104,300-310 頁 (1980年) に記載のｐＨ緩衝剤系がある。ｐＨ緩衝剤の具体例として硼酸塩を含む緩衝剤；クエン酸又はクエン酸塩を含む緩衝剤；グリシンを含む緩衝剤；ビシン(Bicine)を含む緩衝剤；HEPES を含む緩衝剤；MES を含む緩衝剤などのグッド緩衝剤等がある。 For the reaction layer, enzyme activator, coenzyme, surfactant, pH buffer composition, fine powder, antioxidant for the purpose of improving various properties such as coating properties, diffusivity, reactivity, and storage stability. Various additives made of organic materials or inorganic materials can be added. Examples of buffers that can be included in the reaction layer include the Chemical Society of Japan “Basic Guide to Chemistry” (Tokyo, Maruzen Co., Ltd., 1966), pages 1312-1320, RMC Dawson et al, “Data for Biochemical Research "Second Edition (Oxford at the Clarendon Press, 1969), pages 476-508," Biochemistry "pages 5,467-477 (1966)," Analytical Biochemistry "pages 104, 300-310 (1980) There is a pH buffer system. Buffers containing borate as specific examples of pH buffers; buffers containing citrate or citrate; buffers containing glycine; buffers containing Bicine; buffers containing HEPES; buffers containing MES Good buffering agents such as agents.
発色層１２（図２）にロイコ色素等の発色性物質を含有させるには、発色性物質を親水性ポリマー中に分散させる方法又は乳化させる方法を用いることができる。発色性物質を乳化させる場合、発色性物質、界面活性剤、オイル等を親水性ポリマーに添加して、公知の乳化方法により乳化させることができる。一方、発色性物質を分散させる場合には、発色性物及び界面活性剤を親水性ポリマーに添加して公知の分散方法により分散させることができる。
発色層１２における発色性物質の配合量としては、特に限定されず、検出すべきアナライトのモル量を考慮して、適宜設定することができる。
In order to incorporate a color developing substance such as a leuco dye in the color developing layer 12 (FIG. 2), a method of dispersing or emulsifying the color developing substance in a hydrophilic polymer can be used. In the case of emulsifying the chromogenic substance, a chromogenic substance, a surfactant, oil or the like can be added to the hydrophilic polymer and emulsified by a known emulsification method. On the other hand, when the color developing substance is dispersed, the color developing substance and the surfactant can be added to the hydrophilic polymer and dispersed by a known dispersion method.
The blending amount of the color forming substance in the
第１試薬層１３におけるフェロシアンイオンは、例えば、フェロシアン化カリウム等のフェロシアン化アルカリ金属塩の形態で含有させることができる。第１試薬層１３におけるフェロシアンイオンの配合量としては、０．１〜３ｇ／ｍ2の範囲であることが好ましく、０．３〜１．０ｇ／ｍ2の範囲であることがより好ましい。
第１試薬層１３の至適ｐＨは、好ましくは４〜８の範囲であり、最も好ましいｐＨ範囲は５〜７の範囲である。
The ferrocyanide ions in the
The optimum pH of the
第２試薬層１４におけるコレステロールオキシダーゼの配合量については、試薬が含まれる層における塗布量として、５００〜３２０００Ｕ／ｍ２であることが好ましく、２０００〜１３０００Ｕ／ｍ２であることがより好ましい。なお、ここでいうユニット（Ｕ）については、コレステロールオキシダーゼの場合、２５℃で１分間あたり１μｍｏｌのコレステロールを酸化させるのに必要な酵素量を１Ｕとした。
また、第２試薬層１４におけるウリカーゼの配合量については、試薬が含まれる層における塗布量として、１０〜１００００Ｕ／ｍ２であることが好ましく、１００〜３５００Ｕ／ｍ２であることがより好ましい。なおここでいうユニット（Ｕ）については、ウリカーゼの場合、２５℃で１分間あたり１μｍｏｌの尿酸を酸化させるのに必要な酵素量を１Ｕとした。
About the compounding quantity of the cholesterol oxidase in the
Moreover, about the compounding quantity of the uricase in the
また、第２試薬層１４には、アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯ）を含有させてもよい。アスコルビン酸オキシダーゼとしては市販のものを使用することができ、例えば、ロシュ社、東洋紡績（株）より入手することができる。
第２試薬層１４の至適ｐＨは、好ましくは７〜９の範囲であり、より好ましいｐＨ範囲は７．５〜８．５の範囲である。至適ｐＨの調製には、必要に応じて緩衝剤などの試薬を用いることができる。
Further, the
The optimum pH of the
支持体１１としては、光透過性が高く、かつ水に対しては不透過性の支持体を用いることが好ましい。光透過性かつ水不透過性の支持体は従来の乾式分析要素に用いられる公知のものを用いることができる。その具体例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフエノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル（例えば、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０μｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０μｍから約３００μｍの範囲の透明な、例えば、波長約２００ｎｍから約９００ｎｍの範囲内の少なくとも一部の範囲の波長の電磁輻射線を透過させる、平滑平面状の支持体を用いることができる。支持体の表面には公知の下塗層又は接着層を設けることができる。
As the
さらに、本発明の乾式分析要素は、上記で挙げた層のほかに、展開層、反射層、接着層、下塗り層等の機能層を設けることができる。機能層としては、例えば特開昭49-53888号公報、特開昭51-40191号公報、及び特開昭55-164356号公報、特開昭61-4959号公報に記載のものを本発明に適用可能である。 Furthermore, the dry analytical element of the present invention can be provided with functional layers such as a spreading layer, a reflective layer, an adhesive layer, and an undercoat layer in addition to the layers mentioned above. As the functional layer, for example, those described in JP-A-49-53888, JP-A-51-40191, JP-A-55-164356, JP-A-61-4959 are used in the present invention. Applicable.
本発明の乾式分析要素には、反射層を設けることができる。反射層は、光反射性又は光吸収性を有する微粒子または微粉末（以下、単に微粒子という）が少量の被膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーに分散保持されている水透過性または水浸透性の層である。反射層は発色性物質の検出可能な変化（色変化、発色等）を支持体１１（図１）側から反射測光する際に、供給された水性液体の色、特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等、を遮蔽する機能も有する。
光反射性を有する微粒子の例としては、二酸化チタン微粒子（ルチル型、アナターゼ型またはブルカイト型の粒子径が約０．１μｍから約１．２μｍの微結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、アルミニウム微粒子または微小フレーク等を挙げることができ、光吸収性微粒子の例としては、カーボンブラック、ガスブラック、カーボンミクロビーズ等を挙げることができ、これらのうちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子が好ましい。 特に好ましいのは、アナターゼ型二酸化チタン微粒子である。
なお、図２に示す乾式分析要素１０においては、第１試薬層１３と発色層１２との間に反射層を設けてもよいし、第１試薬層１３に光反射性又は光吸収性を有する微粒子を添加することにより、第１試薬層１３自体に反射層の機能を持たせることもできる。
The dry analytical element of the present invention can be provided with a reflective layer. The reflective layer is a water-permeable or water-permeable material in which light-reflective or light-absorbing fine particles or fine powder (hereinafter simply referred to as fine particles) are dispersed and held in a small amount of a hydrophilic polymer binder having a film-forming ability. Is a layer. When the reflective layer is photometrically reflected from the support 11 (FIG. 1) side for detectable changes (color change, color development, etc.) of the chromogenic substance, the color of the supplied aqueous liquid, particularly when the sample is whole blood It also has a function of shielding the red color of hemoglobin.
Examples of the light-reflecting fine particles include titanium dioxide fine particles (rutile type, anatase type or brookite type fine crystal particles having a particle diameter of about 0.1 μm to about 1.2 μm, etc.), barium sulfate fine particles, aluminum fine particles or Examples of the light-absorbing fine particles include carbon black, gas black, and carbon micro beads. Among these, titanium dioxide fine particles and barium sulfate fine particles are preferable. Particularly preferred are anatase-type titanium dioxide fine particles.
In the
本発明の乾式分析要素には展開層を設けることができる。展開層は、供給される液体の量にほぼ比例した面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有する層である。展開層としては、例えば、特開昭５５−１６４３５６、特開昭５７−６６３５９号の各公報等に記載の織物展開層（例えば、ブロード、ポプリン等の平織物）、特開昭６０−２２２７６９号公報等に記載の編物展開層（例えば、トリコット編、ダブルトリコット編、ミラニーズ編等）、特開昭５７−１４８２５０号公報に記載の有機ポリマー繊維パルプ含有抄造紙からなる展開層、特公昭５３−２１６７７号公報、米国特許第３，９９２，１５８号明細書等に記載のメンブランフイルタ（ブラッシュポリマー層）、ポリマーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ、珪藻土が親水性ポリマーバインダーに保持されてなる連続微空隙含有多孔性層等の非繊維等方的多孔性展開層、特開昭５５−９０８５９号公報に記載のポリマーミクロビーズが水で膨潤しないポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる連続微空隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）からなる非繊維等方的多孔性展開層等を用いることができる。
なお、図２に示す乾式分析要素１０において、第２試薬層１４の上に展開層を設けてもよいし、第２試薬層１４を多孔性物質によって形成することにより、第２試薬層１４に展開層の機能を持たせることもできる。展開層の機能を有する第２試薬層１４を形成するには、第１試薬層１３の上に多孔性物質（例えば、編み物布地等）による展開層を形成し、この展開層に、第２試薬層１４に用いる酵素液等をしみ込ませる等の方法により行うことができる。
The dry analytical element of the present invention can be provided with a spreading layer. The spreading layer is a layer having a so-called metering action that spreads the liquid in an area substantially proportional to the amount of the supplied liquid. As the spreading layer, for example, a fabric spreading layer (for example, a plain fabric such as broad or poplin) described in JP-A-55-164356 and JP-A-57-66359, JP-A-60-222769. A knitted fabric development layer (for example, a tricot knitting, a double tricot knitting, a miranese knitting, etc.) described in Japanese Patent Publication No. 57-148250, a development layer comprising a papermaking paper containing an organic polymer fiber pulp described in Japanese Patent Publication No. 57-148250 Containing continuous fine voids in which membrane filter (brush polymer layer), polymer microbeads, glass microbeads, and diatomaceous earth described in US Pat. No. 21,677 and US Pat. No. 3,992,158 are held in a hydrophilic polymer binder Non-fiber isotropic porous spreading layer such as porous layer, polymer microbeads described in JP-A-55-90859 are water Can be used consisting of Jun was not polymer adhesively bonded to the point contact formed by continuous fine voids-containing porous layer (three-dimensional lattice-like granular structure layer) non-fibrous isotropic porous spreading layer.
In the dry
本発明の乾式分析要素の層構成は、図２に示す形態に限定されず、公知の多種の乾式分析要素と同様の層構成を適用することができる。
例えば、本発明の乾式分析要素は図３に示すに示す形態でもよい。図３に示す乾式分析要素３０は、支持体１１上に、ロイコ色素等の発色性物質を含む発色層１２が設けられており、この発色層１２の上に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、及びフェロシアンイオンを含む試薬層３１が設けられている。このような形態においても、コレステロールオキシダーゼとウリカーゼとをともに含むので、尿酸による負誤差を防止し、正確にコレステロールの分析を行うことができる。
また、図２及び図３に示す乾式分析要素では、試薬層と発色層とを別々に設けた形態を例示したが、本発明はこれに限定されず、支持体上にロイコ色素とその他の酵素とフェロシアンイオンとを含む単一の層を設けた形態でもよい。
The layer structure of the dry analytical element of the present invention is not limited to the form shown in FIG. 2, and the same layer structure as that of various known dry analytical elements can be applied.
For example, the dry analytical element of the present invention may have the form shown in FIG. The dry
In the dry analytical element shown in FIGS. 2 and 3, the reagent layer and the coloring layer are separately provided. However, the present invention is not limited to this, and the leuco dye and other enzymes are supported on the support. And a single layer containing ferrocyanic ions may be used.
本発明の乾式分析要素は前述の各特許公報に記載の公知の方法により調製することができる。本発明の乾式分析要素は、製造、包装、輸送、保存、測定操作等の観点から、一辺約10mmから約30mmの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭57-28331、実開昭56-142454、特開昭57-63452、実開昭58-32350、特表昭58-501144号の各公報等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いることが好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、又は小片を開口のあるカードに貼付または収めて用いたり、あるいは裁断した小片をそのまま用いることなどもできる。 The dry analytical element of the present invention can be prepared by known methods described in the aforementioned patent publications. The dry analytical element of the present invention is cut into small pieces such as a square of about 10 mm to about 30 mm on one side or a circle of about the same size from the viewpoint of production, packaging, transportation, storage, measurement operation, etc. It is preferably used as a chemical analysis slide in a slide frame described in JP-A-56-142454, JP-A-57-63452, JP-A-58-32350, JP-A-58-501144. Depending on the purpose of use, the tape can be used in a long tape form in a cassette or magazine, or a small piece can be attached to or stored in a card with an opening, or a cut piece can be used as it is.
本発明の乾式分析要素は前述の各特許公報等に記載の操作と同様の操作によりアナライトの定性または定量分析ができる。具体的な分析方法としては、まず、例えば約2μL〜約30μL、好ましくは4〜15μLの範囲の血漿、血清、尿などの水性液体試料液を最上層に点着する。次いで、点着した乾式分析要素を約20℃〜約45℃の範囲の一定温度で、好ましくは約30℃〜約40℃の範囲内の一定温度で１〜１０分間インキュベーションする。乾式分析要素内の発色又は変色を支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中のアナライトの量を求めることができる。点着する生体試料の量、インキュベーション時間及び温度を一定にすることにより、定量分析を高精度に実施できる。 The dry analytical element of the present invention can perform qualitative or quantitative analysis of an analyte by the same operations as those described in the aforementioned patent publications. As a specific analysis method, first, an aqueous liquid sample solution such as plasma, serum, urine or the like in the range of about 2 μL to about 30 μL, preferably 4 to 15 μL is spotted on the uppermost layer. The spotted dry analytical element is then incubated at a constant temperature in the range of about 20 ° C to about 45 ° C, preferably at a constant temperature in the range of about 30 ° C to about 40 ° C for 1 to 10 minutes. The color development or discoloration in the dry analytical element is reflected and photometrically measured from the support side, and the amount of the analyte in the specimen can be determined by the principle of the colorimetric measurement method using a calibration curve prepared in advance. By making the amount of biological sample to be spotted, the incubation time and the temperature constant, quantitative analysis can be performed with high accuracy.
測定操作は特開昭60-125543、同60-220862、同61-294367、同58-161867号の各公報などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精度によっては、目視により発色の度合いを判定して、定性または半定量的な測定を行ってもよい。
本発明によって分析可能な試料溶液としては、特に限定されないが、特に生体組織等から採取される生体試料や、生体試料を培養した培養物等に適用することができる。生体試料としては、例えば、血液、尿、ずい液等が挙げられる。
The measurement operation can be carried out with high accuracy and quantitative analysis by an extremely easy operation using a chemical analyzer described in JP-A-60-125543, JP-A-60-220862, JP-A-61-294367, and JP-A-58-161867. Depending on the purpose and required accuracy, the degree of color development may be determined visually to perform qualitative or semi-quantitative measurement.
The sample solution that can be analyzed by the present invention is not particularly limited, and can be applied to a biological sample collected from a biological tissue or the like, a culture obtained by culturing a biological sample, and the like. Examples of the biological sample include blood, urine, and spleen.
以上では、本発明の分析用試薬が乾式分析要素の形態である場合について説明したが、本発明の分析用試薬は上記のような形態に限定されず、例えば、複数の試薬液を備えた液体試薬キットの形態であってもよい。分析用試薬が液体試薬を用いた試薬キットの形態である場合は、複数の液体試薬のうち１つの液体試薬中に、オキシダーゼと尿酸酸化酵素とを含むようにする。この場合のオキシダーゼ及び尿酸酸化酵素の配合量は、上記の乾式分析要素と同様の数値とすることができる。 In the above, the case where the analytical reagent of the present invention is in the form of a dry analytical element has been described. However, the analytical reagent of the present invention is not limited to the above form, for example, a liquid having a plurality of reagent liquids It may be in the form of a reagent kit. When the analysis reagent is in the form of a reagent kit using a liquid reagent, one liquid reagent among the plurality of liquid reagents contains oxidase and uric acid oxidase. In this case, the blending amounts of oxidase and uric acid oxidase can be set to the same numerical values as in the dry analytical element.
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
以下の手順により、図２に示す乾式分析要素１０を作製した。
支持体１１として、ゼラチン下塗りされている１８０μｍのポリエチレンテレフタレ−ト無色透明平滑フィルムを用いて、このフィルム上に下記組成の発色層塗布液−１を塗布し乾燥して、発色層１２を形成した。なお、乾燥後の発色層１２の厚さは30μｍとした。
（発色層用塗布液−１）
ゼラチン ２５．０ｇ／ｍ２
界面活性剤 ０．８ｇ／ｍ２
ロイコ色素 ０．５ｇ／ｍ２
Ｎ，Ｎ−ジメチルラウリルアミド ７．５ｇ／ｍ２
ステアリルアルコール １．１ｇ／ｍ２
ここで、界面活性剤は、α-オレフィンスルホン酸ナトリウム（OS-14、日光ケミカル社製）を、ロイコ色素は、２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−（４−ジメチルアミノフェニル）−５−フェネチルイミダゾール酢酸塩を用いた。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further, this invention is not limited to a following example.
[Example 1]
The dry
Using a colorless and transparent smooth film of 180 μm polyethylene terephthalate coated with gelatin as the
(Coloring layer coating solution-1)
Gelatin 25.0 g / m 2
Surfactant 0.8g / m 2
Leuco dye 0.5 g / m 2
N, N-dimethyllaurylamide 7.5 g / m 2
Stearyl alcohol 1.1 g / m 2
Here, the surfactant is sodium α-olefin sulfonate (OS-14, manufactured by Nikko Chemical), and the leuco dye is 2- (3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl) -4- (4- Dimethylaminophenyl) -5-phenethylimidazole acetate was used.
次に、発色層１２の上に、下記組成の第１試薬層用塗布液−１を乾燥後の厚さが５μｍになるように塗布し、乾燥して、第１試薬層１３を形成した。
（第１試薬層用塗布液−１）
ゼラチン ３．３ｇ／ｍ２
二酸化チタン ０．９ｇ／ｍ２
界面活性剤 ０．３ｇ／ｍ２
フェロシアン化カリウム ０．７ｇ／ｍ２
ここで、界面活性剤は、ポリオキシ（２−ヒドロキシ）プロピレンノニルフェニルエーテル（Surfactant 10G、オーリン社製）を用いた。
Next, the first reagent layer coating solution-1 having the following composition was applied onto the
(First reagent layer coating solution-1)
Gelatin 3.3 g / m 2
Titanium dioxide 0.9g / m 2
Surfactant 0.3 g / m 2
Potassium ferrocyanide 0.7 g / m 2
Here, polyoxy (2-hydroxy) propylene nonylphenyl ether (Surfactant 10G, manufactured by Aurin) was used as the surfactant.
次に、第１試薬層１３上に、約３０ｇ／ｍ２の供給量で水を全面に供給して湿潤させた後５０デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を３６ゲージ編みしたトリコット編み物布地を軽く圧力をかけて積層し、乾燥させた。上記布地上に、ウリカーゼ量を表１のように変化させた下記組成の第２試薬層用塗布液−１を塗布、乾燥し、第２試薬層１４を形成して、乾式分析要素を作製した。
Next, a tricot knitted fabric knitted with 36-gauge polyethylene terephthalate spun yarn corresponding to 50 denier is lightly pressed on the
（第２試薬層用塗布液−１）
リン酸１Ｋ ０．３ｇ／ｍ２
リン酸２Ｋ ５．１ｇ／ｍ２
界面活性剤１ ０．５ｇ／ｍ２
界面活性剤２ １．１ｇ／ｍ２
デオキシコール酸 ３．７ｇ／ｍ２
スクロース ４．７ｇ／ｍ２
メトロース９０ＳＨ１００ ０．３ｇ／ｍ２
ウリカーゼ 表１記載
ペルオキシダーゼ ４６０００Ｕ／ｍ２
コレステロールオキシダーゼ ４３００Ｕ／ｍ２
コレステロールエステラーゼ ２５００Ｕ／ｍ２
ＡＳＯ １４０００Ｕ／ｍ２
(Second reagent layer coating solution-1)
Phosphoric acid 1K 0.3 g / m 2
Phosphoric acid 2K 5.1 g / m 2
Surfactant 1 0.5 g / m 2
Surfactant 2 1.1 g / m 2
Deoxycholic acid 3.7 g / m 2
Sucrose 4.7 g / m 2
Metroose 90SH100 0.3g / m 2
Uricase Table 1 Peroxidase 46000 U / m 2
Cholesterol oxidase 4300 U / m 2
Cholesterol esterase 2500U / m 2
ASO 14000U / m 2
界面活性剤１は、ポリオキシ（２−ヒドロキシ）プロピレンノニルフェニルエーテル（Surfactant 10G、オーリン社製）を、界面活性剤２は、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（HS240、日本油脂製）を用いた。ＡＳＯとはアスコルビン酸オキシダーゼを意味し、ここではロシュ社製のアスコルビン酸オキシダーゼを用いた。また、ウリカーゼは東洋紡績（株）のＵＡＯ−２０１を、ペルオキシダーゼは東洋紡績（株）のＰＥＯ−３０１を、コレステロールオキシダーゼはロシュ社のCholesterol oxidaseを、コレステロールエステラーゼは天野エンザイム（株）のＣＨＥ−２を用いた。 Surfactant 1 was polyoxy (2-hydroxy) propylene nonylphenyl ether (Surfactant 10G, manufactured by Orin), and surfactant 2 was polyoxyethylene octylphenyl ether (HS240, manufactured by NOF Corporation). ASO means ascorbate oxidase, and here, ascorbate oxidase manufactured by Roche was used. In addition, uricase is UAO-201 from Toyobo Co., Ltd., peroxidase is PEO-301 from Toyobo Co., Ltd., cholesterol oxidase is Cholesterol oxidase from Roche, and cholesterol esterase is CHE-2 from Amano Enzyme Co., Ltd. Was used.
上記の乾式分析要素を12mmX13mm四方のチップに切断し、スライド枠（特開昭５７−６３４５２号公報に記載）に収めて、本発明に従うコレステロール測定用乾式スライド(1-1)〜(1-5)を作製した。 The dry analytical element is cut into a 12 mm × 13 mm square chip and placed in a slide frame (described in JP-A-57-63452), and the cholesterol-measuring dry slides (1-1) to (1-5) according to the present invention are used. ) Was produced.
［比較例１］
ウリカーゼを添加しないこと以外は、実施例１と同様にしてコレステロール測定用乾式スライド(A)を作製した。
[Comparative Example 1]
A dry slide for cholesterol measurement (A) was prepared in the same manner as in Example 1 except that uricase was not added.
［測定例１］
ウリカーゼ添加による尿酸の影響改良の効果を確認するために下記測定液を調整した。 下記測定液は、コレステロールを一定濃度で含有し、尿酸を異なる濃度で含有するものであり、下記添加量の尿酸水溶液及び人血清900μLに精製水を加えて総和で1000μLとなるように調製したものである。
なお、ここで用いたコレステロールは、血清として日水製薬（株）より入手した。また、尿酸は、和光純薬工業（株）の尿酸を用いた。
[Measurement Example 1]
In order to confirm the effect of improving the influence of uric acid by adding uricase, the following measuring solution was prepared. The following measuring solution contains cholesterol at a constant concentration and uric acid at different concentrations, and is prepared to add 1000 μL of purified water to 900 μL of uric acid aqueous solution and human serum with the following addition amount. It is.
The cholesterol used here was obtained from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. as serum. Uric acid from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used as uric acid.
各測定液を上記実施例1で作製したスライド(1-1)〜(1-5)及び比較例1で作製したスライド(A)に10μL点着した。その後、37℃にて6分間インキュベートし、505nmにおける反射濃度（ＯＤｒ）を富士ドライケム５０００（富士写真フイルム（株）製）により測定した。 その反射濃度をあらかじめ作成された検量線（反射濃度とコレステロール濃度（TCHO）の関係式）より、TCHO濃度に換算した。結果を表４、５に示す。 10 μL of each measurement solution was spotted on the slides (1-1) to (1-5) prepared in Example 1 and the slide (A) prepared in Comparative Example 1. Then, it incubated at 37 degreeC for 6 minute (s), and the reflection density (ODr) in 505 nm was measured by Fuji Dry Chem 5000 (made by Fuji Photo Film Co., Ltd.). The reflection density was converted to a CHTO concentration from a calibration curve (relationship between reflection density and cholesterol concentration (TCHO)) prepared in advance. The results are shown in Tables 4 and 5.
以上より、実施例は、比較例に対して変化率が少なく、尿酸の影響が改善されていることが明らかとなった。特にウリカーゼの添加量が、1000U以上では（実施例１-2〜1-5）、改善効果が顕著であることがわかった。 From the above, it was clarified that the Examples had a lower rate of change than the Comparative Examples, and the influence of uric acid was improved. In particular, when the amount of uricase added was 1000 U or more (Examples 1-2 to 1-5), it was found that the improvement effect was remarkable.
［実施例２］
以下の手順により、図２に示す乾式分析要素１０を作製した。なお、使用した試薬等は特に記載がない限り実施例１と同様のものである。
支持体１１として、ゼラチン下塗りされている１８０μｍのポリエチレンテレフタレ−ト無色透明平滑フィルムを用いて、このフィルム上に下記組成の発色層塗布液−２を塗布し乾燥して、発色層１２を形成した。なお、乾燥後の発色層１２厚さは15μｍとした。
（発色層用塗布液−２）
ゼラチン １４．０ｇ／ｍ２
界面活性剤 １．０ｇ／ｍ２
ロイコ色素 ０．５ｇ／ｍ２
[Example 2]
The dry
Using a colorless and transparent smooth film of 180 μm polyethylene terephthalate coated with gelatin as the
(Coloring layer coating solution-2)
Gelatin 14.0 g / m 2
Surfactant 1.0 g / m 2
Leuco dye 0.5 g / m 2
ここで、界面活性剤は、ポリオキシ（２−ヒドロキシ）プロピレンノニルフェニルエーテル（Surfactant 10G、オーリン社製）を、ロイコ色素は、２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−（４−ジメチルアミノフェニル）−５−フェネチルイミダゾール酢酸塩を用いた。 Here, the surfactant is polyoxy (2-hydroxy) propylene nonylphenyl ether (Surfactant 10G, manufactured by Aurin), and the leuco dye is 2- (3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl) -4- ( 4-Dimethylaminophenyl) -5-phenethylimidazole acetate was used.
次に、発色層１２の上に、下記組成の第１試薬層用塗布液−２を乾燥後の厚さが５μｍになるように塗布し、乾燥して、第１試薬層１３を形成した。
（第１試薬層用塗布液−２）
ゼラチン ３．３ｇ／ｍ２
二酸化チタン ０．９ｇ／ｍ２
界面活性剤 ０．３ｇ／ｍ２
フェロシアン化カリウム ０．７ｇ／ｍ２
ここで、界面活性剤は、ポリオキシ（２−ヒドロキシ）プロピレンノニルフェニルエーテル（Surfactant 10G、オーリン社製）を用いた。
Next, the first reagent layer coating solution-2 having the following composition was applied on the
(First reagent layer coating solution-2)
Gelatin 3.3 g / m 2
Titanium dioxide 0.9g / m 2
Surfactant 0.3 g / m 2
Potassium ferrocyanide 0.7 g / m 2
Here, polyoxy (2-hydroxy) propylene nonylphenyl ether (Surfactant 10G, manufactured by Aurin) was used as the surfactant.
次に、第１試薬層１３上に、約３０ｇ／ｍ２の供給量で水を全面に供給して湿潤させた後５０デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を３６ゲージ編みしたトリコット編み物布地を軽く圧力をかけて積層し、乾燥させた。上記布地上に、ウリカーゼ量を表６のように変化させた下記組成の第１試薬層用塗布液−２を塗布、乾燥し、第２試薬層１４を形成して、乾式分析要素を作製した。
Next, a tricot knitted fabric knitted with 36-gauge polyethylene terephthalate spun yarn corresponding to 50 denier is lightly pressed on the
（第２試薬層用塗布液−２）
リン酸１Ｋ ０．３ｇ／ｍ２
リン酸２Ｋ ５．１ｇ／ｍ２
界面活性剤１ ０．５ｇ／ｍ２
界面活性剤２ １．１ｇ／ｍ２
デオキシコール酸 ３．７ｇ／ｍ２
スクロース ４．７ｇ／ｍ２
メトロース９０ＳＨ１００ ０．３ｇ／ｍ２
ウリカーゼ 表６記載
ペルオキシダーゼ ４６０００Ｕ／ｍ２
コレステロールオキシダーゼ ４３００Ｕ／ｍ２
コレステロールエステラーゼ ２５００Ｕ／ｍ２
ＡＳＯ １４０００Ｕ／ｍ２
(Second reagent layer coating solution-2)
Phosphoric acid 1K 0.3 g / m 2
Phosphoric acid 2K 5.1 g / m 2
Surfactant 1 0.5 g / m 2
Surfactant 2 1.1 g / m 2
Deoxycholic acid 3.7 g / m 2
Sucrose 4.7 g / m 2
Metroose 90SH100 0.3g / m 2
Uricase Table 6 Peroxidase 46000 U / m 2
Cholesterol oxidase 4300 U / m 2
Cholesterol esterase 2500U / m 2
ASO 14000U / m 2
界面活性剤1は、ポリオキシ（２−ヒドロキシ）プロピレンノニルフェニルエーテル（Surfactant 10G、オーリン社製）を、界面活性剤2は、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（HS240、日本油脂製）を用いた。また、ウリカーゼ等は実施例１と同じものを用いた。 Surfactant 1 was polyoxy (2-hydroxy) propylene nonylphenyl ether (Surfactant 10G, manufactured by Aurin), and surfactant 2 was polyoxyethylene octylphenyl ether (HS240, manufactured by NOF Corporation). Further, the same uricase as in Example 1 was used.
上記の乾式分析要素を12mmX13mm四方のチップに切断し、スライド枠（特開昭５７−６３４５２号公報に記載）に収めて、本発明に従うコレステロール測定用乾式スライド(2-1)〜(2-3)を作製した。 The dry analytical element is cut into a 12 mm × 13 mm square chip and placed in a slide frame (described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-63452), and the cholesterol measuring dry slides (2-1) to (2-3) according to the present invention are used. ) Was produced.
［比較例２］
ウリカーゼを添加しないこと以外は、実施例２と同様にしてコレステロール測定用乾式スライド(B)を作製した。
[Comparative Example 2]
A dry slide for cholesterol measurement (B) was prepared in the same manner as in Example 2 except that uricase was not added.
［測定例２］
測定例１で調製した各測定液を実施例２で作製したスライド(2-1)〜(2-3)及び比較例２で作製したスライド(B)に10μL点着した。その後、37℃にて6分間インキュベートし、505nmにおける反射濃度（ＯＤｒ）を富士ドライケム５０００（富士写真フイルム（株）製）により測定した。その反射濃度をあらかじめ作成された検量線（反射濃度とコレステロール濃度（TCHO）の関係式）より、TCHO濃度に換算した。結果を表６、７に示す。
[Measurement Example 2]
10 μL of each measurement solution prepared in Measurement Example 1 was spotted on the slides (2-1) to (2-3) prepared in Example 2 and the slide (B) prepared in Comparative Example 2. Then, it incubated at 37 degreeC for 6 minute (s), and the reflection density (ODr) in 505 nm was measured by Fuji Dry Chem 5000 (made by Fuji Photo Film Co., Ltd.). The reflection density was converted to a CHTO concentration from a calibration curve (relationship between reflection density and cholesterol concentration (TCHO)) prepared in advance. The results are shown in Tables 6 and 7.
以上より、実施例は、比較例に対して変化率が少なく、尿酸の影響が改善されていることが明らかとなった。特にウリカーゼの添加量が、500U以上では（実施例2-2、2-3）、改善効果が顕著であることがわかった。 From the above, it was clarified that the Examples had a lower rate of change than the Comparative Examples, and the influence of uric acid was improved. In particular, when the amount of uricase added was 500 U or more (Examples 2-2 and 2-3), it was found that the improvement effect was remarkable.
［実施例３］
以下の手順により、図３に示す乾式分析要素３０を作製した。なお、使用した試薬等は特に記載がない限り実施例１と同様のものである。
支持体１１として、ゼラチン下塗りされている１８０μｍのポリエチレンテレフタレ−ト無色透明平滑フィルムを用いて、このフィルム上に下記組成の発色層塗布液−３を塗布し乾燥して、発色層１２を形成した。なお、乾燥後の発色層１２厚さは15μｍとした。
（発色層用塗布液−３）
ゼラチン １４．０ｇ／ｍ２
界面活性剤 １．０ｇ／ｍ２
ロイコ色素 ０．５ｇ／ｍ２
[Example 3]
The dry
Using a colorless transparent smooth film of 180 μm polyethylene terephthalate coated with gelatin as the
(Coloring layer coating solution-3)
Gelatin 14.0 g / m 2
Surfactant 1.0 g / m 2
Leuco dye 0.5 g / m 2
ここで、界面活性剤は、ポリオキシ（２−ヒドロキシ）プロピレンノニルフェニルエーテル（Surfactant 10G、 オーリン社製）を、ロイコ色素は、２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−（４−ジメチルアミノフェニル）−５−フェネチルイミダゾール酢酸塩を用いた。 Here, the surfactant is polyoxy (2-hydroxy) propylene nonylphenyl ether (Surfactant 10G, manufactured by Aurin), and the leuco dye is 2- (3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl) -4- ( 4-Dimethylaminophenyl) -5-phenethylimidazole acetate was used.
次に、上記発色層１２の上に、約３０ｇ／ｍ２の供給量で水を全面に供給して湿潤させた後５０デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を３６ゲージ編みしたトリコット編み物布地を軽く圧力をかけて積層し、乾燥させた。上記布地上に、ウリカーゼ量を表９のように変化させた下記組成の試薬層用塗布液を塗布し、乾燥して試薬層３１を形成し、乾式分析要素を作製した。
Next, a tricot knitted fabric knitted with 36-gauge polyethylene terephthalate spun yarn equivalent to 50 denier is lightly pressed on the
（試薬層用塗布液）
リン酸１Ｋ ０．３ｇ／ｍ２
リン酸２Ｋ ５．１ｇ／ｍ２
界面活性剤１ ０．５ｇ／ｍ２
界面活性剤２ １．１ｇ／ｍ２
デオキシコール酸 ３．７ｇ／ｍ２
スクロース ４．７ｇ／ｍ２
メトロース９０ＳＨ１００ ０．３ｇ／ｍ２
ウリカーゼ 表９記載
フェロシアン化カリウム ０．７ｇ／ｍ２
ペルオキシダーゼ ４６０００Ｕ／ｍ２
コレステロールオキシダーゼ ４３００Ｕ／ｍ２
コレステロールエステラーゼ ２５００Ｕ／ｍ２
ＡＳＯ １４０００Ｕ／ｍ２
(Reagent layer coating solution)
Phosphoric acid 1K 0.3 g / m 2
Phosphoric acid 2K 5.1 g / m 2
Surfactant 1 0.5 g / m 2
Surfactant 2 1.1 g / m 2
Deoxycholic acid 3.7 g / m 2
Sucrose 4.7 g / m 2
Metroose 90SH100 0.3g / m 2
Uricase listed in Table 9 Potassium ferrocyanide 0.7 g / m 2
Peroxidase 46000 U / m 2
Cholesterol oxidase 4300 U / m 2
Cholesterol esterase 2500U / m 2
ASO 14000U / m 2
界面活性剤１は、ポリオキシ（２−ヒドロキシ）プロピレンノニルフェニルエーテル（Surfactant 10G、オーリン社製）を、界面活性剤２は、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（HS240、日本油脂製）を用いた。また、ウリカーゼ等は実施例１と同じものを用いた。 Surfactant 1 was polyoxy (2-hydroxy) propylene nonylphenyl ether (Surfactant 10G, manufactured by Orin), and surfactant 2 was polyoxyethylene octylphenyl ether (HS240, manufactured by NOF Corporation). Further, the same uricase as in Example 1 was used.
上記の乾式分析要素を12mmX13mm四方のチップに切断し、スライド枠（特開昭５７−６３４５２号公報に記載）に収めて、本発明に従うコレステロール測定用乾式スライド(3-1)〜(3-2)を作製した。 The dry analytical element is cut into a 12 mm × 13 mm square chip and placed in a slide frame (described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-63452), and the cholesterol measuring dry slides (3-1) to (3-2) according to the present invention are used. ) Was produced.
［比較例３］
ウリカーゼを添加しないこと以外は、実施例３と同様にしてコレステロール測定用乾式スライド(C)を作製した。
[Comparative Example 3]
A dry slide for cholesterol measurement (C) was prepared in the same manner as in Example 3 except that uricase was not added.
［測定例３］
測定例１で調製した各測定液を実施例３で作製したスライド(3-1)〜(3-2)及び比較例３で作製したスライド(C)に10μL点着した。その後、37℃にて6分間インキュベートし、505nmにおける反射濃度（ＯＤｒ）を富士ドライケム５０００（富士写真フイルム（株）製）により測定した。その反射濃度をあらかじめ作成された検量線（反射濃度とコレステロール濃度（TCHO）の関係式）より、TCHO濃度に換算した。結果を表１０、１１に示す。
[Measurement Example 3]
10 μL of each measurement solution prepared in Measurement Example 1 was spotted on slides (3-1) to (3-2) prepared in Example 3 and slide (C) prepared in Comparative Example 3. Then, it incubated at 37 degreeC for 6 minute (s), and the reflection density (ODr) in 505 nm was measured by Fuji Dry Chem 5000 (made by Fuji Photo Film Co., Ltd.). The reflection density was converted to a CHTO concentration from a calibration curve (relationship between reflection density and cholesterol concentration (TCHO)) prepared in advance. The results are shown in Tables 10 and 11.
以上より、実施例は、比較例に対して変化率が少なく、尿酸の影響が改善されていることが明らかとなった。 From the above, it was clarified that the Examples had a lower rate of change than the Comparative Examples, and the influence of uric acid was improved.
１１ 支持体
１２ 発色層
１３ 第１試薬層
１４ 第２試薬層
１０，３０ 乾式分析要素
３１ 試薬層
DESCRIPTION OF
Claims (5)
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|---|---|---|---|
| JP2004274824A JP2006087325A (en) | 2004-09-22 | 2004-09-22 | Analytical reagent, dry analytical element and analytical method |
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