JP2006078377A - Light signal analysis method - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a light signal analysis method which enables an accurate and efficient analysis at a plurality of points of measurement in a short time. <P>SOLUTION: Physical properties of samples are determined through the use of a step for making a photo-detector detect light emitted from a point of measurement specified for a sample; a time-division step for time-dividing a time-serial signal output from the photo-detector into a plurality of time-serial signals and extracting data and the number of items of the data for very point of measurement; a step for reconstituting the data and the number of items of the data for very point of measurement to different delay times; a step for performing both statistic computations through the use of each reconstituted data and statistic computations through the use of each reconstituted item of the data; and results of the two statistic computations. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、光信号解析方法に関するものである。   The present invention relates to an optical signal analysis method.

従来、光信号解析方法として以下の文献に示すような方法が提案されている。これらの光信号解析方法において、自己相関関数等を推定する場合には、１ヶ所のみの測定ポイントについて蛍光の強度の時系列信号を取得し、マルチプルτ方式の計算手法により自己相関関数を推定していた。また、複数の測定ポイントについては、それぞれ連続した蛍光強度の時系列信号を取得し、測定ポイント間は独立したシングルポイントマルチプルτ方式解析方法を用いていた。  Conventionally, methods as shown in the following documents have been proposed as optical signal analysis methods. In these optical signal analysis methods, when estimating the autocorrelation function, etc., obtain a time-series signal of fluorescence intensity at only one measurement point and estimate the autocorrelation function using the multiple τ method. It was. In addition, for each of a plurality of measurement points, a continuous time series signal of fluorescence intensity was acquired, and an independent single point multiple τ method analysis method was used between the measurement points.

標本内の複数の測定ポイントで一定時間間隔ごとに自己相関関数の推定を行おうとした場合、概して２つの方法が考えられる。第１の方法は、作業をすべての測定ポイントについて、順次行う方法である。すなわち、まず一つの測定ポイントで自己相関関数の推定を行い、次に他の測定ポイントに移動して、同様に自己相関関数を推定する。更にまた、別の測定ポイントに移動し、同様に自己相関関数を推定するという作業をすべての測定ポイントについて順次行う。   When trying to estimate an autocorrelation function at a certain time interval at a plurality of measurement points in a sample, two methods are generally conceivable. The first method is a method in which work is sequentially performed for all measurement points. That is, first, the autocorrelation function is estimated at one measurement point, and then the operation is moved to another measurement point to similarly estimate the autocorrelation function. Furthermore, the operation of moving to another measurement point and estimating the autocorrelation function is performed sequentially for all measurement points.

また、第２の方法として、複数の測定ポイントについて同時に測定を行い、同時に相関関数の推定を行う方法がある。
「New Concept in Correlator Design」, Klaus Sch-tzel, Inst. Phys. Conf. Ser. No.77, P175, 1985. 「Noise on Multiple-Tau Photon Correlation Data」, Klaus Sch-tzel, SPIE Vol.1430, P109, Photon Correlation Spectroscopy: Multicomponent Systems, 1991. 「Photon Correlation Measurements at Large Lag Times」, Klaus Sch-tzel et al., Journal of Modern Optics, Vol.35, No.4, P711, 1988. Further, as a second method, there is a method in which a plurality of measurement points are measured simultaneously and a correlation function is estimated simultaneously.
"New Concept in Correlator Design", Klaus Sch-tzel, Inst.Phys. Conf.Ser.No.77, P175, 1985. `` Noise on Multiple-Tau Photon Correlation Data '', Klaus Sch-tzel, SPIE Vol.1430, P109, Photon Correlation Spectroscopy: Multicomponent Systems, 1991. `` Photon Correlation Measurements at Large Lag Times '', Klaus Sch-tzel et al., Journal of Modern Optics, Vol.35, No.4, P711, 1988.

しかしながら、上記した第１の方法では、推定全体に時間がかかると共に、作業も繁雑である。また、測定ポイントを逐次移動していくために、測定ポイント間の時間差は大きく、長時間を要する。   However, in the above-described first method, the entire estimation takes time and the work is complicated. In addition, since the measurement points are sequentially moved, the time difference between the measurement points is large and requires a long time.

また、第２の方法をソフトウェアにより実現するには、メモリの制限、ＣＰＵの制限を受ける。また、光計測部分を複数セット要し、各セットの光測定条件（測定領域、照射強度、カウントレート等）を一致させることは難しく、誤差の原因となる。従って、上記した複数ポイントについて同時に測定を行って自己相関関数を推定することは非常に困難である。   Further, in order to realize the second method by software, there is a memory limitation and a CPU limitation. Further, a plurality of sets of optical measurement parts are required, and it is difficult to match the optical measurement conditions (measurement region, irradiation intensity, count rate, etc.) of each set, which causes an error. Therefore, it is very difficult to estimate the autocorrelation function by simultaneously measuring the above-described plurality of points.

すなわち、測定ポイントごとに測定時刻のずれ（時間遅れ）が生じ、測定条件の誤差が含まれるため、細胞内外で生じる速い反応、例えば、たんぱく質―たんぱく質相互作用、細胞内のシグナル伝達などをリアルタイムで測定することができなかった。  In other words, measurement time lag (time delay) occurs at each measurement point, and errors in measurement conditions are included, so fast reactions that occur inside and outside the cell, such as protein-protein interactions, intracellular signal transmission, etc. in real time. It could not be measured.

そこで、上記した欠点を克服するために、複数の測定ポイントについて短時間交替して測定し、測定の完了後、すべてのデータを用いたマルチポイントＦＣＳの一般的な解析方法が提案された。この方法では、複数ポイントの逐次測定法を用いて測定、計算と表示を順番に実現している。   Therefore, in order to overcome the above-described drawbacks, a general analysis method of multipoint FCS using a plurality of measurement points by measuring a plurality of measurement points alternately for a short time and using all data after completion of the measurement has been proposed. In this method, measurement, calculation, and display are realized in order using a multipoint sequential measurement method.

しかし、すべてのデータの測定を完了した後に解析計算をスタートさせ、すべてのデータ位置を計算チャンネルとし、すべてのデータを扱って繰り返し相関計算を行うため、画像化に要する時間が長い。したがって、測定時間が長くなるほど、測定ポイントが増えるほど、測定、計算、画像化をリアルタイムで行うことは実用上現実的でなくなってしまう。   However, since analysis calculation is started after measurement of all data is completed, all data positions are used as calculation channels, and all data is handled and repeated correlation calculation is performed, the time required for imaging is long. Therefore, as the measurement time becomes longer and the number of measurement points increases, it becomes practically impractical to perform measurement, calculation, and imaging in real time.

本発明はこのような課題に着目して行なわれたものであり、その目的とするところは、複数の測定ポイントについてリアルタイムで正確な解析を行うことができる光信号解析方法を提供することにある。   The present invention has been made paying attention to such a problem, and an object of the present invention is to provide an optical signal analysis method capable of accurately analyzing a plurality of measurement points in real time. .

上記の目的を達成するために、本発明の第１の態様は、光信号解析方法であって、試料に関して指定した測定ポイントから発せられる光を光検出器により検出するステップと、前記光検出器により出力される時系列信号を複数の時系列信号に時間分割して、測定ポイント毎のデータとデータ数を抽出する時分割ステップと、異なる遅延時間に対して測定ポイント毎のデータ及びデータ数を再構成するステップと、再構成した各データを用いて統計計算を行うとともに、再構成した各データ数を用いて統計計算を行うステップと、前記２つの統計計算の結果を用いて試料の物理的性質を求める。   In order to achieve the above object, according to a first aspect of the present invention, there is provided an optical signal analysis method, wherein a light emitted from a measurement point designated with respect to a sample is detected by a photodetector, and the photodetector The time-series step of time-dividing the time-series signal output by a plurality of time-series signals to extract data and the number of data for each measurement point, and the data and the number of data for each measurement point for different delay times Reconstructing, performing statistical calculation using each reconstructed data, performing statistical calculation using each reconstructed number of data, and using the results of the two statistical calculations Find the nature.

また、本発明の第２の態様に係る光信号解析方法は、第１の態様において、前記試料に関する複数のポイントを選択し、各測定ポイントから発せられる光を前記光検出器により検出し、前記光検出器より出力される時系列信号を前記複数の測定ポイント毎に分割して取り出し、前記分割した時系列信号毎に解析を行うことにより、前記試料の複数の測定ポイント毎の物理的性質を求める。   The optical signal analysis method according to the second aspect of the present invention is the optical signal analysis method according to the first aspect, wherein a plurality of points related to the sample are selected, light emitted from each measurement point is detected by the photodetector, By dividing and extracting the time series signal output from the photodetector for each of the plurality of measurement points, and performing analysis for each of the divided time series signals, the physical properties of each of the plurality of measurement points of the sample are obtained. Ask.

また、本発明の第３の態様に係る光信号解析方法は、第２の態様において、前記光検出器から出力される時系列信号を前記複数の測定ポイント毎にデータ分割して記憶し、必要に応じて前記複数の測定ポイント毎の分割データを再構成して解析を行うことにより、前記複数の測定ポイント毎の物理的性質を求める。   Further, the optical signal analysis method according to the third aspect of the present invention is the second aspect, wherein the time series signal output from the photodetector is divided into data for each of the plurality of measurement points and stored. Accordingly, the physical property for each of the plurality of measurement points is obtained by reconstructing the divided data for each of the plurality of measurement points and performing analysis.

また、本発明の第４の態様は、第２の態様において、前記複数の測定ポイント毎の分割データを再構成して解析を行い、前記データ再構成によるデータ数に関する情報をウェイトとし、前記ウェイトと、複数の測定ポイント毎の分割再構成データとの組み合わせにより、前記複数の測定ポイント毎の物理的性質を求める。   According to a fourth aspect of the present invention, in the second aspect, the divided data for each of the plurality of measurement points is reconstructed and analyzed, information on the number of data by the data reconstruction is set as a weight, and the weight And the physical property for each of the plurality of measurement points is obtained by a combination of the divided reconstruction data for each of the plurality of measurement points.

また、本発明の第５の態様は、第１乃至第４の態様のいずれか１つにおいて、前記試料から発せられる光は、螢光、燐光、反射光または散乱光である。   According to a fifth aspect of the present invention, in any one of the first to fourth aspects, the light emitted from the sample is fluorescence, phosphorescence, reflected light, or scattered light.

また、本発明の第６の態様は、第１乃至第５の態様のいずれか１つにおいて、前記光信号の解析は、自己相関分析法または、フォトンカウンティングヒストグラム法を用いて行われる。   According to a sixth aspect of the present invention, in any one of the first to fifth aspects, the optical signal is analyzed using an autocorrelation analysis method or a photon counting histogram method.

また、本発明の第７の態様は、第１乃至第５のいずれか１つにおいて、前記光信号の解析は、相互相関分析法または、コインシデンス解析法を用いて行われる。   According to a seventh aspect of the present invention, in any one of the first to fifth aspects, the optical signal is analyzed using a cross-correlation analysis method or a coincidence analysis method.

また、本発明の第８の態様は、第１乃至第７の態様のいずれか１つにおいて、前記再構成するステップは、ａ）計測された各計測区間のデータおよびデータの数(ウェイト)を一定時間記憶するステップと、ｂ）隣接する複数の計測区間のデータおよびデータの数を演算するステップと、ｃ）演算結果を、演算に用いた隣接する計測区間の総和に等しい計測区間幅をもつ新たな計測区間のデータおよびデータの数として記憶するステップと、ｄ）新たに計測された計測区間のデータおよびデータの数を所定時間記憶するステップと、ｅ）隣接する複数の新たな計測区間のデータおよびデータの数を演算するステップと、ｆ）演算結果を、演算に用いた新たな計測区間の時間の総和に等しい次の新たな計測区間幅をもつ次の新たな計測区間のデータおよびデータの数として記憶するステップと、を具備し、上記d)からｆ）のステップを所定の回数繰り返すことにより、試料の物理的性質を求める。   Further, according to an eighth aspect of the present invention, in any one of the first to seventh aspects, the step of reconfiguring comprises: a) measuring data of each measurement section and the number of data (weight). A step of storing for a certain period of time, b) a step of calculating data and the number of data of a plurality of adjacent measurement sections, and c) a calculation result having a measurement section width equal to the sum of the adjacent measurement sections used in the calculation. Storing as new measurement section data and the number of data; d) storing newly measured measurement section data and the number of data for a predetermined time; and e) a plurality of adjacent new measurement sections. A step of calculating the data and the number of data; and f) calculating the data of the next new measurement section having the next new measurement section width equal to the total time of the new measurement section used for the calculation. And comprising the steps of storing as the number of data, and by repeating steps a predetermined number of times f) from the d), determining the physical properties of the sample.

また、本発明の第９の態様は、第１乃至第８のいずれか１つの態様において、前記試料に関する測定ポイントの物理的性質は分子、または粒子の並進拡散係数、回転拡散係数、あるいは前記測定領域内に存在する分子、または粒子の個数、あるいは蛍光寿命である。   According to a ninth aspect of the present invention, in any one of the first to eighth aspects, the physical property of the measurement point relating to the sample is a translational diffusion coefficient, a rotational diffusion coefficient of the molecule or particle, or the measurement. The number of molecules or particles present in the region, or the fluorescence lifetime.

本発明によれば、複数の測定ポイントについて短時間で正確な解析を効率よく行うことができる。また、複数の測定ポイントの物理的性質の解析を同時に行い、複数の測定ポイントについての測定の順序を自由に組み合わせ、試料の反応、試料間の相互作用などを解析することができる。特に、本発明をマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳとして実現した場合は、マルチプルτ方式シングルポイントＦＣＳと比較して、同時に複数のポイント点を観察することができ、生体の細胞内外の多様な反応を捉えることができる。   According to the present invention, accurate analysis can be efficiently performed in a short time for a plurality of measurement points. In addition, the physical properties of a plurality of measurement points can be analyzed simultaneously, and the order of measurement for the plurality of measurement points can be freely combined to analyze sample reactions, interactions between samples, and the like. In particular, when the present invention is realized as a multiple τ system multipoint FCS, it is possible to observe a plurality of point points at the same time as compared to the multiple τ system single point FCS, and to capture various reactions inside and outside the living cells. be able to.

マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの場合は、大量のデータとそのチャンネル位置に対して計算を行う一般的なＦＣＳ計算方式より、計算時間が短く、効率的である。先にデータ計算のτ位置（チャンネル）を決め、すべてのデータを計算に扱いながら、限られた少ないチャンネル位置だけに諸計算処理を限定して行う。  In the case of the multiple τ method multipoint FCS, the calculation time is shorter and more efficient than a general FCS calculation method for calculating a large amount of data and its channel position. First, the τ position (channel) for data calculation is determined, and all the data are handled for calculation, and various calculation processes are limited to a limited number of channel positions.

また、マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの場合は、平均値計算等の手法を用いて、特に大きいビンタイム領域において、計算用データの数を減らし、繰り返し数多いデータを処理することを避け、滑らか効果による誤差の低減を図っている。  In the case of multiple τ method multipoint FCS, an average value calculation method is used to reduce the number of calculation data, particularly in a large bin time region, avoid processing data with a large number of repetitions, and an error due to a smooth effect. We are trying to reduce it.

マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの場合は、データ読込、計算処理に最小解析データ単位として1個のデータを扱うため、割込み手法により、表示等の命令を随時実行することが可能である。リアルタイム表示で、システムのハードウェア的な調整、測定データの異常発見、中止、サンプルの選定、調整が可能である。  In the case of the multiple τ method multipoint FCS, since one piece of data is handled as a minimum analysis data unit for data reading and calculation processing, instructions such as display can be executed at any time by an interrupt method. Real-time display enables system hardware adjustment, measurement data abnormality detection, cancellation, sample selection, and adjustment.

なお、複数ポイントについて、一つの励起光源、測定装置を用いて解析、観察を行うため、ポイント間のハードウェア的な誤差がなく、同じ条件下で生体の細胞内外の多様な反応を捉えることができる。  Since multiple points are analyzed and observed using a single excitation light source and measurement device, there are no hardware errors between the points, and various reactions inside and outside the living cells can be captured under the same conditions. it can.

更にまた、マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの場合は、ポイント数の増加に伴うプログラミングの簡略化、効率化を目指すことができる。  Furthermore, in the case of the multiple τ system multipoint FCS, it is possible to aim at simplification and efficiency of programming accompanying an increase in the number of points.

まず、本発明の概略を説明する。本発明では、重み係数を用いたマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳのデータ解析において、複数の測定ポイントを時系列で繰り返し測定した測定信号をポイント毎に分割し、各ポイントについてデータテーブルとデータ数を意味する重み係数テーブルとを作成する。そして各測定ポイントにおけるテーブルのデータと重み係数だけを抽出して自己相関関数の計算を行う。ここで、抽出した各測定ポイントのデータと重み係数での計算結果により、同時に複数点の細胞反応を観察するだけではなく、細胞の異なる部位、相互作用等を観察することが可能である。   First, the outline of the present invention will be described. In the present invention, in the data analysis of a multiple τ method multipoint FCS using weighting factors, a measurement signal obtained by repeatedly measuring a plurality of measurement points in time series is divided for each point, and the data table and the number of data are meant for each point. A weighting coefficient table to be created. Then, only the table data and the weighting coefficient at each measurement point are extracted to calculate the autocorrelation function. Here, it is possible not only to observe cell reactions at a plurality of points at the same time, but also to observe different parts of cells, interactions, and the like, based on the data of each measurement point extracted and the calculation result using the weighting coefficient.

また、重み係数を用いたマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳのデータ解析において、相関関数の演算を行う際、データと重み係数の計算用チャンネルはオクターブ方式（８チャンネル毎に初期ビンタイム値を２倍に増していく計算方法であり、後述するステップＳ１２で実施される）を用い、データと重み係数の計算を数少ない有限個のチャンネルの結果に制限し、同間隔の計算結果のプロットを実現する。   In the data analysis of multiple τ method multipoint FCS using weighting factors, when calculating the correlation function, the channel for calculating data and weighting factors is the octave method (the initial bin time value is doubled every 8 channels). The calculation of data and weighting coefficients is limited to a few finite channel results, and a plot of calculation results at the same interval is realized.

更にまた、重み係数を用いたマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳのデータ解析において、相関関数の演算を行う際、先に異なるτ領域において、異なる遅延時間相当分のデータ平均値と重み係数平均値を計算する。相関計算は、平均した数少ないデータと重み係数だけを用いるため、計算に要する時間が短い。   Furthermore, in the data analysis of multiple τ method multipoint FCS using weighting factors, when calculating the correlation function, the data average value and weighting factor average value corresponding to different delay times are calculated in different τ regions first. To do. Since the correlation calculation uses only a few average data and weighting factors, the time required for the calculation is short.

なお、重み係数を用いたマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳのデータ解析において、相関関数の演算を行う際、抽出された測定ポイントのデータと重み係数による種々の処理は、1個のデータあるいは重み係数を計算最小単位とする。従って、計算は割り込み命令により、随時中断され、結果描画状態に移ることが可能で、計算と表示を同時進行させることで、リアルタイム的なマルチポイントＦＣＳの実現が可能である。  In the data analysis of the multiple τ method multipoint FCS using the weighting factor, when performing the correlation function, various processes using the data of the extracted measurement points and the weighting factor can be performed using one piece of data or the weighting factor. The minimum unit of calculation. Therefore, the calculation can be interrupted at any time by an interrupt command, and the result drawing state can be entered. Real-time multipoint FCS can be realized by simultaneously executing the calculation and the display.

以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。図１は、本発明が適用される光信号解析装置の構成を示す図である。本実施形態では、試料の蛍光像観察を行うためにレーザ走査型共焦点光学顕微鏡に適用した場合について説明する。装置の基本的な構成として、レーザ走査型共焦点光学顕微鏡本体10と、CCDカメラ11と、試料ステージ12と、試料ステージコントローラー13と、コンピュータ（PC）14と、TVモニタ15と、レーザ光源16とを備える。レーザ光源16の波長によって励起する螢光物質の種類が異なる。本実施形態では、螢光物質としてローダミン・グリーン(Rhodamine Green:RhG)等を用いるが、これを励起するのに適していると考えられる励起波長の一つとして波長488nmのアルゴンレーザを用いる。  Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. FIG. 1 is a diagram showing a configuration of an optical signal analyzing apparatus to which the present invention is applied. In the present embodiment, a case where the present invention is applied to a laser scanning confocal optical microscope in order to observe a fluorescent image of a sample will be described. As a basic configuration of the apparatus, a laser scanning confocal optical microscope body 10, a CCD camera 11, a sample stage 12, a sample stage controller 13, a computer (PC) 14, a TV monitor 15, and a laser light source 16 are provided. With. The type of fluorescent substance to be excited differs depending on the wavelength of the laser light source 16. In the present embodiment, rhodamine green (RhG) or the like is used as a fluorescent substance, and an argon laser having a wavelength of 488 nm is used as one of excitation wavelengths considered to be suitable for exciting the phosphor.

レーザ光源16から発せられたレーザ光をレーザ走査型共焦点光学顕微鏡本体10に導き、試料ステージ12上の試料50に照射する。そして、CCDカメラ11で試料50からの螢光を受光し、TVモニタ15、あるいは顕微鏡接眼部を通して試料50の螢光顕微鏡観察を行なう。レーザ走査型共焦点光学顕微鏡本体10の試料ステージ12には2個のステッピングモータ20がそれぞれ90°方向に取り付けられており、それぞれのステッピングモータ20は試料ステージコントローラ13に接続されている。コンピュータ14からの指令により、2個のステッピングモータ20を駆動し、試料ステージ12をX方向、Y方向に移動させる。  Laser light emitted from the laser light source 16 is guided to the laser scanning confocal optical microscope main body 10 and irradiated onto the sample 50 on the sample stage 12. Then, the fluorescent light from the sample 50 is received by the CCD camera 11, and the fluorescent microscope observation of the sample 50 is performed through the TV monitor 15 or the microscope eyepiece. Two stepping motors 20 are respectively attached to the sample stage 12 of the laser scanning confocal optical microscope body 10 in the 90 ° direction, and each stepping motor 20 is connected to the sample stage controller 13. In response to a command from the computer 14, the two stepping motors 20 are driven to move the sample stage 12 in the X direction and the Y direction.

次に走査系の構成について説明する。レーザ光源16より発せられたレーザ光をレンズ23‐1、23‐2から構成される拡大光学系(ビームエクスパンダ)に通してビーム直径を拡げてコリメート光とし、プレフォーカシングレンズ24を介してダイクロイックミラー25に導く。  Next, the configuration of the scanning system will be described. The laser light emitted from the laser light source 16 is passed through an enlarging optical system (beam expander) composed of lenses 23-1 and 23-2 to expand the beam diameter to be collimated light, and is dichroic via a prefocusing lens 24. Guide to mirror 25.

ダイクロイックミラー25は波長488nm付近以下の波長の光を反射し、488nm付近以上の波長の光を透過させるように形成されている。ダイクロイックミラー25により反射されたレーザ光はXYスキャナ22に入射する。レーザ光はXYスキャナ22でX軸、Y軸方向に２次元走査されて対物レンズ21に導かれる。レーザ光はランダムに試料50内をスキャンされ、試料50内に存在する蛍光物質を励起することができる。  The dichroic mirror 25 is formed to reflect light having a wavelength of about 488 nm or less and to transmit light having a wavelength of about 488 nm or more. The laser beam reflected by the dichroic mirror 25 enters the XY scanner 22. The laser light is two-dimensionally scanned in the X-axis and Y-axis directions by the XY scanner 22 and guided to the objective lens 21. The laser beam is scanned in the sample 50 at random, and the fluorescent material existing in the sample 50 can be excited.

試料50内で微小な共焦点領域を形成させるためにここではNA(開口数)1.0の対物レンズ21を用いる。これにより得られる共焦点領域の大きさとして、直径0.6μm程度、長さ2μm程度の中央部がくびれた略円筒状となり、測定領域に存在する蛍光分子は平均して数個程度となる。試料50内の所望の蛍光物質から発せられた蛍光は励起光と同じ光路を通り、ダイクロイックミラー25により入射光路から分離された後、ピンホール26、ハーフミラー27を介して光検出器28により受光される。光検出器28としてはアバランシェフォトダイオード(APD)、あるいは光電子増倍管などの微弱光検出器を用いれば良い。  In order to form a minute confocal region in the sample 50, an objective lens 21 having an NA (numerical aperture) of 1.0 is used here. The size of the confocal region thus obtained is a substantially cylindrical shape with a central portion with a diameter of about 0.6 μm and a length of about 2 μm, and the average number of fluorescent molecules present in the measurement region is several. Fluorescence emitted from a desired fluorescent substance in the sample 50 passes through the same optical path as the excitation light, is separated from the incident optical path by the dichroic mirror 25, and then received by the photodetector 28 via the pinhole 26 and the half mirror 27. Is done. As the photodetector 28, a weak photodetector such as an avalanche photodiode (APD) or a photomultiplier tube may be used.

光検出器28で受光した螢光出力信号を画像処理装置に導き、コントラスト向上、輪郭強調などの画像処理を行なった後、コンピュータ14を通してTVモニタ15上に試料50の2次元画像、あるいは3次元画像を得る。  The fluorescent output signal received by the photodetector 28 is guided to an image processing device, and after image processing such as contrast enhancement and contour enhancement is performed, a two-dimensional image or three-dimensional image of the sample 50 is displayed on the TV monitor 15 through the computer 14. Get an image.

各XYスキャナ22は互いに直交する方向に走査できるように互いに垂直方向の向きに配置されており、コンピュータ14によって制御されたそれぞれのXYスキャナ駆動装置（不図示）により回動運動を精確に制御される。  The XY scanners 22 are arranged in vertical directions so that they can be scanned in directions orthogonal to each other, and the rotational movement is accurately controlled by respective XY scanner driving devices (not shown) controlled by the computer 14. The

XYスキャナ駆動装置にはXYスキャナ角度検出装置(図示しない)が装備されており、リアルタイムで走査角度が精度良く検知され、コンピュータ14にフィードバック制御される。本実施形態ではXYスキャナ22としてガルバノスキャナを用いている。なお、レーザ光をXY走査する手段、すなわちXYスキャナとしてガルバノスキャナに限らず、音響光学変調素子(AOM)やポリゴン鏡、ホログラムスキャナなどを用いても良い。  The XY scanner driving device is equipped with an XY scanner angle detection device (not shown), and the scanning angle is accurately detected in real time and feedback controlled by the computer 14. In this embodiment, a galvano scanner is used as the XY scanner 22. The means for performing XY scanning of the laser light, that is, the XY scanner is not limited to the galvano scanner, but an acousto-optic modulation element (AOM), a polygon mirror, a hologram scanner, or the like may be used.

光検出器28に入射した光強度信号は電気信号に変換され、信号処理装置で波形整形され、on-offの2値化パルスに変換されて、コンピュータ14に導かれる。コンピュータ14は、入力された2値化パルス信号に対して相関演算を行なって自己相関関数を算出する。さらには得られた自己相関関数から、蛍光物質の並進拡散速度や測定領域内に存在する蛍光分子の数の変化などが求められる。  The light intensity signal incident on the photodetector 28 is converted into an electric signal, shaped in a waveform by a signal processing device, converted into an on-off binary pulse, and guided to the computer 14. The computer 14 performs a correlation operation on the input binary pulse signal to calculate an autocorrelation function. Furthermore, from the obtained autocorrelation function, the translational diffusion rate of the fluorescent material, the change in the number of fluorescent molecules present in the measurement region, and the like are obtained.

光検出器28に入射する光強度信号が比較的大きい場合は、光検出器28から出力される電気信号はアナログの時系列信号となる。この場合は信号処理装置でA/D変換し、波形整形を行ない、先と同様に2値化パルス信号に変換する。  When the light intensity signal incident on the photodetector 28 is relatively large, the electrical signal output from the photodetector 28 is an analog time-series signal. In this case, A / D conversion is performed by the signal processing device, waveform shaping is performed, and conversion to a binary pulse signal is performed as before.

また対物レンズ21を光軸方向に移動させることにより、レーザ光のフォーカス位置を光軸方向に沿って上下させることができる。これにより、3次元画像をTVモニタ15上に生成させることができる。  Further, by moving the objective lens 21 in the optical axis direction, the focus position of the laser beam can be moved up and down along the optical axis direction. As a result, a three-dimensional image can be generated on the TV monitor 15.

なお、螢光物質についてはローダミン・グリーンに限ることなく、例えば、TMR(Tetrame- hylrhodamine)、サイファイヴ(Cy5)、FITC(Fluorescein-isothiocyanate)、TOTO1、Acridine-Orange、Texas-Redなどを用いても良い。  Note that the fluorescent substance is not limited to rhodamine green, for example, using TMR (Tetrame-hylrhodamine), Cyfive (Cy5), FITC (Fluorescein-isothiocyanate), TOTO1, Acridine-Orange, Texas-Red, etc. Also good.

図３は、重み係数を用いたマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳ演算の手順を説明するためのフローチャートである。ここで、図３の重み係数を用いたマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの計算の流れは次のとおりである。   FIG. 3 is a flowchart for explaining the procedure of the multiple τ method multipoint FCS calculation using the weighting factor. Here, the flow of calculation of the multiple τ method multipoint FCS using the weighting factor of FIG. 3 is as follows.

まず、ステップS０では、図１の構成を用いて試料50についての測定データとしての時系列測定信号を取得する。図４はこのとき得られる時系列測定信号を示している。縦軸はＩ（蛍光強度）であり、横軸はｔ（時間）である。次に、取得データが存在するか否かを判断し（ステップＳ１）、ＹＥＳの場合にはステップＳ２−1〜２−４に進んで、測定したポイント数とポイント番号を同時に判断する。測定信号のデータファイルあるいは信号にはポイント数とポイント番号の情報が含まれているが、この情報は後部のポイント毎のデータとデータ数情報の分割（分割テーブルの作成）に用いる。   First, in step S0, a time series measurement signal is obtained as measurement data for the sample 50 using the configuration of FIG. FIG. 4 shows a time series measurement signal obtained at this time. The vertical axis is I (fluorescence intensity), and the horizontal axis is t (time). Next, it is determined whether or not there is acquired data (step S1). If YES, the process proceeds to steps S2-1 to 2-4, and the measured number of points and point number are simultaneously determined. The data file or signal of the measurement signal includes information on the number of points and the point number, and this information is used to divide the data for each point and the data number information (create a division table).

例えば、上記のステップＳ１で測定ポイントが図２に示すような４つのポイントであり、１→２→３→４→１の順にデータ測定が行われた場合、時系列測定信号は、図５に示すように、P1、P2、P3とP4の４つのポイント信号が時系列で配列されたものになる。ここで、P0は、レーザ光をＸＹ操作する手段としてのXYスキャナ22の移動時のランダム測定データ範囲である。P1は、測定ポイント１の測定データ範囲である。P2は、測定ポイント2の測定データ範囲である。P3は、測定ポイント3の測定データ範囲である。P4は、測定ポイント4の測定データ範囲である。  For example, if the measurement points are four points as shown in FIG. 2 in step S1 and data measurement is performed in the order of 1 → 2 → 3 → 4 → 1, the time series measurement signal is shown in FIG. As shown, four point signals P1, P2, P3 and P4 are arranged in time series. Here, P0 is a random measurement data range during movement of the XY scanner 22 as means for XY manipulation of laser light. P1 is the measurement data range of measurement point 1. P2 is the measurement data range of measurement point 2. P3 is the measurement data range of measurement point 3. P4 is the measurement data range of measurement point 4.

ステップＳ２−1〜２−４で測定ポイントがＰ１であったならば、ステップＳ３以降ではポイント１の計算部分Ｓ１００で示されるステップＳ３〜Ｓ１９の処理を順次実行する。また、測定ポイントがＰ２であった場合にはポイント２の計算部分の処理（ステップＳ２００）、測定ポイントがＰ３であった場合にはポイント３の計算部分の処理（ステップＳ３００）、測定ポイントがＰ４であった場合にはポイント４の計算部分の処理（ステップＳ４００）を実行するが、各計算部分Ｓ２００、Ｓ３００、Ｓ４００では上記ステップＳ３〜Ｓ１９の処理と同様の処理を行う。   If the measurement point is P1 in steps S2-1 to 2-4, the processing of steps S3 to S19 indicated by the calculation part S100 of point 1 is sequentially executed in step S3 and subsequent steps. Further, when the measurement point is P2, the calculation process of the point 2 (step S200), when the measurement point is P3, the calculation process of the point 3 (step S300), and the measurement point is P4. If it is, the process of the calculation part of the point 4 (step S400) is executed. In each calculation part S200, S300, S400, the same process as the process of steps S3 to S19 is performed.

ポイント１の計算部分Ｓ１００において、まずステップＳ３では、測定ポイント１のデータ分割を行う。つまり、複数ポイントにおいて、マルチポイントＦＣＳの測定方法で測定した場合、複数ポイントの信号が混在している時系列測定信号（図５）が得られるが、この時系列測定信号を測定ポイントごとのデータに分割する。   In the calculation part S100 of the point 1, first, in step S3, data division of the measurement point 1 is performed. That is, when measurement is performed using a multipoint FCS measurement method at a plurality of points, a time-series measurement signal (FIG. 5) in which signals from a plurality of points are mixed is obtained. This time-series measurement signal is used as data for each measurement point. Divide into

ここでは図５に示す信号を図６のような具体的なデータテーブルに例えて測定ポイント毎のデータ分割を行う。図６において、Pointの値は、測定ポイントを示し、１は測定ポイント１、２は測定ポイント２、３は測定ポイント３、４は測定ポイント４である。また、Dataの値は、蛍光強度を示す。   Here, the signal shown in FIG. 5 is compared with a specific data table as shown in FIG. 6 to perform data division for each measurement point. In FIG. 6, the value of Point indicates a measurement point, 1 is measurement point 1, 2 is measurement point 2, 3 is measurement point 3, and 4 is measurement point 4. The value of Data indicates the fluorescence intensity.

図５の測定信号から測定ポイント1のデータだけを抽出することを考えて、測定ポイント１以外のポイントに相当する位置にはデータ0を埋め込む。これによって、図7のような測定ポイント１の分割データテーブルが作成される。同様の方法によって、測定ポイント１〜４に対して、それぞれの異なる分割データテーブルを作成することができる。図８は、この４つの測定ポイントにおいて作成された４枚の分割データテーブル１０１〜１０４を示している。   Considering that only the data of measurement point 1 is extracted from the measurement signal of FIG. 5, data 0 is embedded at positions corresponding to points other than measurement point 1. Thereby, a divided data table of the measurement point 1 as shown in FIG. 7 is created. Different divided data tables can be created for the measurement points 1 to 4 by the same method. FIG. 8 shows four divided data tables 101 to 104 created at these four measurement points.

同様にしてステップＳ４において、測定ポイント毎に重み係数の分割を行う。図５に示す複数ポイントの測定信号には、ステップＳ3で示したようなデータの大きさを表す情報の他にデータ数（データのポイント位置）を表す情報が含まれている。この情報もポイント毎に分割するが、マルチプルτ方式を用いるマルチポイントＦＣＳではこの情報を重み係数として計算に用いる。   Similarly, in step S4, the weighting factor is divided for each measurement point. The multipoint measurement signal shown in FIG. 5 includes information indicating the number of data (point position of data) in addition to the information indicating the data size as shown in step S3. This information is also divided for each point, but in multipoint FCS using the multiple τ method, this information is used as a weighting factor for calculation.

以下に、上記したデータの分割と同様に、図９の具体的な重み係数テーブルを参照して重み係数の分割方法を説明する。図９は図６のテーブル内容に基づくもので、図９中のDataの値は、４つの測定ポイントに対して測定されたデータ数を示し、データ数1個（重み係数＝1）を表す。この部分は、マルチプルτ方式シングルポイントＦＣＳと比較したときの、マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの独特な解析方法で、解析アルゴリズム中では重み係数として表す。  Hereinafter, as with the above-described data division, a weight coefficient division method will be described with reference to a specific weight coefficient table in FIG. FIG. 9 is based on the contents of the table of FIG. 6, and the value of Data in FIG. 9 indicates the number of data measured at four measurement points, and represents one data (weighting factor = 1). This part is a unique analysis method of the multiple τ system multipoint FCS when compared with the multiple τ system single point FCS, and is represented as a weighting coefficient in the analysis algorithm.

以下に、重み係数の分割テーブルの作成方法を説明する。まず、図９の重み係数テーブルから測定ポイント1に対する重み係数だけを抽出するとともに、その他の測定ポイントに相当する位置には0という重み係数を埋め込む。これにより、図１０のような測定ポイント１の分割重み係数テーブルが作成される。同様の方法でP2、P3、P4に対して、それぞれの異なる分割重み係数テーブルを作成することができる。図１１は、この４つの測定ポイントにおいて作成された４枚の分割重み係数テーブル２０１〜２０４を示している。  A method for creating a weighting factor division table will be described below. First, only the weighting coefficient for the measurement point 1 is extracted from the weighting coefficient table of FIG. 9, and a weighting coefficient of 0 is embedded at positions corresponding to other measurement points. Thereby, the division weight coefficient table of the measurement point 1 as shown in FIG. 10 is created. Different division weight coefficient tables can be created for P2, P3, and P4 in the same manner. FIG. 11 shows four division weight coefficient tables 201 to 204 created at these four measurement points.

次に、ステップＳ５において、最終的なＦＣＳのプロットに用いる横軸基準値（チャンネル）とその数および所属する段数を計算する。マルチプルτ方式では、読込んだデータ総数によりチャンネル数を決めるが、具体的な計算方法は図１２に示す通りである。つまり、ビンタイムτ0を基準値として0段の初期値とするが、各段の初期値は前段の初期値の2倍とする。各段のチャンネル数は、0段を16個とし、以降の各段は8個ずつとする。ビンタイムが２μSecの場合、チャンネルストラクチャーは図１３のようになる。 Next, in step S5, the horizontal axis reference value (channel) used for the final FCS plot, its number, and the number of stages to which it belongs are calculated. In the multiple τ method, the number of channels is determined by the total number of read data, and a specific calculation method is as shown in FIG. In other words, the bin time τ 0 is used as a reference value, and the initial value of the zero stage is set, but the initial value of each stage is set to twice the initial value of the previous stage. The number of channels in each stage is 16 for the 0 stage and 8 for each subsequent stage. When the bin time is 2 μSec, the channel structure is as shown in FIG.

上記のチャンネル値を段ごとに記すと図１４、図１５に示す通りである。図１４は、ビンタイムτ0を基準値とする一般的なもので、図１５はビンタイムが２μSecの場合である。ここでわかるように、チャンネルの値はビンタイムによって決まるが、チャンネル数および段数は読込んだデータ総数によって決まる。何段目の何チャンネル目までデータの計算を行うかは読込んだデータの総数でチャンネル数、段数を計算することでわかる。例えば、ビンタイム２μSecで32秒間データを測定した場合、計算用の総チャンネル数は約176で、段数は21である。 The above channel values are described for each stage as shown in FIGS. FIG. 14 is a general one using the bin time τ 0 as a reference value, and FIG. 15 is a case where the bin time is 2 μSec. As can be seen, the channel value is determined by the bin time, but the number of channels and the number of stages are determined by the total number of data read. How many channels and how many channels can be calculated can be found by calculating the number of channels and the number of steps based on the total number of data read. For example, when data is measured for 32 seconds with a bin time of 2 μSec, the total number of channels for calculation is about 176 and the number of stages is 21.

次に、ステップＳ６において、段数判断、つまり、マルチプルτ方式でデータを処理する処理タイミングを算出する。マルチプルτ方式でデータと重み係数を計算する際、各段の計算は常にタイミングが一致するとは限らず、各段の計算タイミングはそれぞれ異なる場合もある。つまり、上段に二つの新しいデータがグレードアップされた時が下段のデータの移動、和計算、積和計算のタイミングである。例えば、0段の諸処理は、新しいデータが読み込まれる毎に行われるが、1段目の諸処理は、21=2個のデータが新しく読込まれた際に行われ、n段目の諸処理は、2n個のデータが新しく読込まれた際に行われる。図１６は各段の処理のタイミングを示している。 Next, in step S6, the number of stages is determined, that is, the processing timing for processing data by the multiple τ method is calculated. When calculating the data and the weighting coefficient by the multiple τ method, the timing of each stage is not always the same, and the calculation timing of each stage may be different. In other words, the time when two new data are upgraded in the upper stage is the timing of data movement, sum calculation, and product-sum calculation in the lower stage. For example, the 0th stage of processing is performed each time new data is read, while the 1st stage of various processes is performed when 2 1 = 2 data are newly read, and the nth stage of various processes. Processing is performed when 2 n pieces of data are newly read. FIG. 16 shows the processing timing of each stage.

ステップＳ６での判断がＮＯの場合にはステップＳ１７に移行して読み込んだデータ総数をカウントする。カウント結果は段数ごとの相関値総合計算（自己相関関数あるいは相互相関関数の計算）（ステップＳ１６）の際に用いる。ステップＳ１７の後はステップＳ２−１〜２−４に戻る。   If the determination in step S6 is no, the process proceeds to step S17 to count the total number of data read. The count result is used in the correlation value total calculation (autocorrelation function or cross-correlation function calculation) for each stage number (step S16). After step S17, the process returns to steps S2-1 to 2-4.

また、ステップＳ６での判断がＹＥＳの場合にはステップＳ７に進んで、４枚のデータテーブル上の各データを上列に移動させる処理を行う。つまり、新しいデータを読込む前に、各テーブルの値をアップグレードするものである。   If the determination in step S6 is yes, the process proceeds to step S7 to perform processing for moving each data on the four data tables to the upper row. In other words, the value of each table is upgraded before reading new data.

各段のデータの移動はステップS6で示した処理タイミングに同期するもので、n段のデータは2n個のデータが新しく読込まれた際に移動処理が行われる。0段目と1段目のデータ移動は図１７と図１８に示す通りである。 The movement of the data in each stage is synchronized with the processing timing shown in step S6, and the movement process is performed on the n-stage data when 2 n pieces of data are newly read. The data movement of the 0th stage and the 1st stage is as shown in FIGS.

次に、ステップＳ８において、上記のステップＳ７のデータ移動と同様に、４枚の重み係数テーブルの各値を上列に移動させる処理を行う。つまり、新しい重み係数データを読込む前に、各重み係数テーブル値をアップグレードするものである。   Next, in step S8, similarly to the data movement in step S7 described above, a process for moving each value in the four weighting coefficient tables to the upper row is performed. That is, each weight coefficient table value is upgraded before reading new weight coefficient data.

各段の重み係数データの動きはステップＳ６で示した処理タイミングに同期するもので、n段のデータは2n個の重み係数が新しく読込まれた際に移動処理が行われる。0段目と1段目の重み係数の移動は図１７及び図１８と同様に考えることができるので、ここでは説明を省略する。 The movement of the weight coefficient data at each stage is synchronized with the processing timing shown in step S6, and the n-stage data is subjected to a movement process when 2 n weight coefficients are newly read. Since the movement of the weight coefficients in the 0th stage and the 1st stage can be considered in the same manner as in FIGS. 17 and 18, the description thereof is omitted here.

次に、ステップＳ９において、新規データの読込みを行う。つまり、0段0列目に1個の新しいデータを読込む。ステップＳ７の移動に続いて0段0列目に1個の新しいデータが読込まれる。新しく読込まれたデータは、データのポイント情報により４枚のデータテーブルに分割される。測定ポイント毎のデータテーブルへの分割方法はステップＳ３で示した通りである。   Next, in step S9, new data is read. That is, one new data is read in the 0th row and the 0th column. Following the movement of step S7, one new data is read in the 0th row and the 0th column. The newly read data is divided into four data tables according to the data point information. The method of dividing the measurement points into data tables is as shown in step S3.

次に、ステップＳ１０において、新規の重み係数の読込みを行う。つまり、ステップＳ９の0段0列目に新しい1個のデータが読込まれる動作に伴い、重み係数の読み込みと分割を行う。また、測定ポイント毎の重み係数テーブルに新しく読込んだ重み係数を分割代入するが、分割方法はステップＳ４で示した通りである。   Next, in step S10, a new weighting factor is read. In other words, the weighting factor is read and divided in accordance with the operation of reading one new data in the 0th row and 0th column of step S9. Further, the newly read weight coefficient is divided and substituted into the weight coefficient table for each measurement point, and the division method is as shown in step S4.

次に、ステップＳ１１において、各段0列目のデータを計算する。これは、マルチプルτ方式でデータを計算する重要な部分の一つである。チャンネル16以降の遅延時間τは、8チャンネルごとに初期ビンタイム値を2倍に増しているため（ステップＳ５を参照のこと）、各段のデータは上段の二つのデータ和からなる。具体的なデータの変化は図１９の通りである。また、ここでのデータの和計算タイミングは、上記のステップＳ６で示した各段の処理タイミングに同期しなければならない。   Next, in step S11, data in the 0th column of each stage is calculated. This is one of the important parts of calculating data by the multiple τ method. Since the delay time τ after channel 16 has doubled the initial bin time value every 8 channels (see step S5), the data at each stage is composed of the upper two data sums. Specific data changes are as shown in FIG. The data sum calculation timing here must be synchronized with the processing timing of each stage shown in step S6.

複数の測定ポイント１〜４において、和計算の処理を行うと、データ分割テーブルは図２０のように次々と下位段のデータが形成され、新しいデータ形態を有することになる。  When the sum calculation process is performed at a plurality of measurement points 1 to 4, the data division table is successively formed with lower-level data as shown in FIG. 20, and has a new data form.

次にステップＳ１２において、各段0列目の重み係数を計算する。これは、マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳ演算の重要な部分の一つである。ステップＳ１１と同様に、チャンネル16以降の遅延時間τは、8チャンネルごとに初期ビンタイム値を2倍に増しているため（ステップＳ５を参照のこと）、各段の重み係数は各段のデータ計算方法と同様に上段の二つの重み係数和からなる。具体的な重み係数の変化は図２１に示すとおりである。また、ここでの重み係数の和計算タイミングも、上記のステップＳ６で示した各段の処理タイミングに同期しなければならない。   Next, in step S12, the weighting coefficient of the 0th column of each stage is calculated. This is one of the important parts of the multiple τ method multipoint FCS calculation. Similarly to step S11, the delay time τ after channel 16 has doubled the initial bin time value every 8 channels (see step S5), so the weighting factor of each stage is the data calculation of each stage. Like the method, it consists of two weight coefficient sums in the upper stage. A specific change in the weighting factor is as shown in FIG. The timing for calculating the sum of the weighting factors here must also be synchronized with the processing timing of each stage shown in step S6.

測定データにおける処理と同様に、複数の測定ポイント１〜４において、重み係数の和計算処理を行うと、重み係数分割テーブルは図２２のように次々と下位段の重み係数が形成され、新しい重み係数形態テーブルを有することになる。   Similar to the processing in the measurement data, when the sum calculation processing of the weighting coefficients is performed at the plurality of measurement points 1 to 4, the weighting coefficient division table sequentially forms lower weighting coefficients as shown in FIG. It will have a coefficient form table.

次のステップＳ１３は、マルチプルτ方式の計算方法にも含まれている部分であるが、ここでは、あるデータとτ遅延後のデータとの積和を計算する。計算は、同じ測定ポイントのデータテーブルを用いる。つまり、各段0列目のデータと同段各チャンネルのデータの掛け算（図２３）をする。掛け算計算の和は同段のデータが新しい値に更新される時に行われるが、各段の計算タイミングは上記のステップＳ６に同期しなければならない。   The next step S13, which is also included in the multiple τ calculation method, calculates the product sum of certain data and data after τ delay. The calculation uses a data table of the same measurement point. In other words, the data of the 0th column of each stage is multiplied by the data of each channel of the same stage (FIG. 23). The sum of multiplication calculations is performed when the data of the same stage is updated to a new value, but the calculation timing of each stage must be synchronized with the above step S6.

次に、ステップＳ１４は、マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの独特な計算方法で、重み係数間の積和を計算する。計算は、ステップＳ１３と同じ測定ポイントの重み係数テーブルを用いる。つまり、ステップＳ１３の計算方法と同様に、各段0列目の重み係数と同段各チャンネルの重み係数の掛け算をする。掛け算計算の和は同段の重み係数が新しい値に更新される時に行われるが、各段の計算タイミングは上記のステップＳ６に同期しなければならない。   Next, step S14 calculates the sum of products between the weighting factors by a unique calculation method of the multiple τ method multipoint FCS. The calculation uses the same weighting factor table of measurement points as in step S13. That is, similarly to the calculation method in step S13, the weighting coefficient of the 0th column of each stage is multiplied by the weighting coefficient of each channel of the same stage. The sum of the multiplication calculations is performed when the weighting factor of the same stage is updated to a new value, but the calculation timing of each stage must be synchronized with the above step S6.

次に、ステップＳ１５においてデータと重み係数の積和を計算する。これはマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの独自の手法であり、同じ測定ポイントのデータテーブルと重み係数テーブルを用いる。つまり、各段0列目のデータと同段各チャンネルの重み係数との掛け算（図２４）を行う。あるいは、各段0列目の重み係数と同段各チャンネルのデータとの掛け算(図２５)を行う。   Next, in step S15, the product sum of the data and the weighting coefficient is calculated. This is a unique method of the multiple τ method multipoint FCS, and uses a data table and a weight coefficient table of the same measurement point. That is, multiplication of the data in the 0th column of each stage and the weighting coefficient of each channel in the same stage (FIG. 24) is performed. Alternatively, the weighting coefficient in the 0th column of each stage is multiplied by the data of each channel in the same stage (FIG. 25).

掛け算計算の和は同段のデータと重み係数が新しい値に更新される時に行われるが、各段の計算タイミングは上記のステップＳ６に同期しなければならない。   The sum of multiplication calculations is performed when the data and weighting factors of the same stage are updated to new values, but the calculation timing of each stage must be synchronized with the above step S6.

次に、ステップＳ１８においてイメージング判断を行う。このステップでは、途中計算結果ステップＳ１１〜Ｓ１５を用いて最終自己相関総合計算を行い、イメージングステップ（ステップＳ１９：計算結果の表示）に移行するか否かを判断する。ここでＮＯの場合にはステップＳ２−１〜２−４に戻る。また、ＹＥＳの場合にはステップＳ１６に移行して、マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳのアルゴリズムにより最終的な相関計算を行う。具体的には、上記ステップＳ１３〜Ｓ１５での計算結果を以下の解析式

Figure 2006078377
に代入して自己相関値を計算する。 Next, imaging determination is performed in step S18. In this step, the final autocorrelation total calculation is performed using the intermediate calculation result steps S11 to S15, and it is determined whether or not to proceed to the imaging step (step S19: display of the calculation result). If NO here, the process returns to the steps S2-1 to 2-4. In the case of YES, the process proceeds to step S16, and a final correlation calculation is performed by a multiple τ method multipoint FCS algorithm. Specifically, the calculation results in the above steps S13 to S15 are expressed by the following analytical formulas:
Figure 2006078377
 Substituting into to calculate the autocorrelation value.

ステップＳ１６の後は、ステップＳ１９に移行してイメージングを実行する。ここでは、計算結果としてＦＣＳカーブをプロットする。ここでのプロットは1個の読込みデータを単位とするため、今までの一般的なＦＣＳ計算方式のような大量データの計算完了を待つ必要がなく、随時データの読込み、計算を中止させ、リアルタイムにプロットすることが可能である。その後、本フローの処理を終了する。   After step S16, the process proceeds to step S19 to execute imaging. Here, an FCS curve is plotted as a calculation result. Since the plot here is based on a single read data, there is no need to wait for the completion of the calculation of a large amount of data as in the conventional FCS calculation method so far. Can be plotted. Then, the process of this flow is complete | finished.

本発明が適用される光信号解析装置の構成を示す図である。It is a figure which shows the structure of the optical signal analyzer to which this invention is applied. 測定ポイントと測定順番を示す図である。It is a figure which shows a measurement point and a measurement order. 重み係数を用いたマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳ演算の手順を説明するためのフローチャートである。It is a flowchart for demonstrating the procedure of the multiple (tau) system multipoint FCS calculation using a weighting coefficient. 時系列測定信号を示す図である。It is a figure which shows a time series measurement signal. 複数のポイントの時分割表示測定信号を示す図である。It is a figure which shows the time division display measurement signal of several points. 複数のポイントの測定データの大きさを示す図である。It is a figure which shows the magnitude | size of the measurement data of several points. 測定ポイント１の分割データを示す図である。It is a figure which shows the division | segmentation data of the measurement point 1. FIG. 測定ポイント毎に分割したデータテーブルを示す図である。It is a figure which shows the data table divided | segmented for every measurement point. 複数ポイントの重み係数情報を示す図である。It is a figure which shows the weighting coefficient information of multiple points. 測定ポイント１の分割重み係数を示す図である。It is a figure which shows the division | segmentation weighting coefficient of the measurement point. ポイント毎に分割した重み係数テーブルを示す図である。It is a figure which shows the weighting coefficient table divided | segmented for every point. マルチプルτ方式のチャンネル構造を示す図である。It is a figure which shows the channel structure of a multiple τ system. ２μSecビンタイムのチャンネル構造を示す図である。It is a figure which shows the channel structure of 2 microsecond bin time. 各段のチャンネル値を示す図である。It is a figure which shows the channel value of each stage. ビンタイム２μSec時の各段のチャンネル値を示す図である。It is a figure which shows the channel value of each step | level at the time of bin time of 2 microseconds. 段数と処理タイミングを示す図である。It is a figure which shows a stage number and a process timing. ０段目のデータ移動について説明するための図である。It is a figure for demonstrating the data movement of the 0th step. １段目のデータ移動を示す図である。It is a figure which shows the data movement of the 1st step. ０列目のデータ構成を示す図である。It is a figure which shows the data structure of the 0th column. 各段のデータを有する分割データテーブルを示す図である。It is a figure which shows the division | segmentation data table which has the data of each step | level. ０列目の重み係数の構成を示す図である。It is a figure which shows the structure of the weighting coefficient of the 0th column. 各段の重み係数を有する分割重み係数テーブルを示す図である。It is a figure which shows the division | segmentation weight coefficient table which has a weight coefficient of each step | level. データ間の積和計算を示す図である。It is a figure which shows the product-sum calculation between data. データと重み係数との積和計算を示す図である。It is a figure which shows the product-sum calculation of data and a weighting coefficient. 重み係数とデータとの積和計算を示す図である。It is a figure which shows the product-sum calculation of a weighting coefficient and data.

符号の説明Explanation of symbols

１０…レーザ走査型共焦点光学顕微鏡本体、１１…CCDカメラ、１２…試料ステージ、１３…試料ステージコントローラ、１４…コンピュータ、１５…TVモニタ、１６…レーザ光源、２０…ステッピングモータ、２１…対物レンズ、２２…XYスキャナ、２３…ビームエクスパンダー、２４…プレフォーカシングレンズ、２５…ダイクロイックミラー、２６…ピンホール、２７…ハーフミラー、２８…光検出器、５０…試料。   DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Laser scanning confocal optical microscope main body, 11 ... CCD camera, 12 ... Sample stage, 13 ... Sample stage controller, 14 ... Computer, 15 ... TV monitor, 16 ... Laser light source, 20 ... Stepping motor, 21 ... Objective lens , 22 ... XY scanner, 23 ... beam expander, 24 ... prefocusing lens, 25 ... dichroic mirror, 26 ... pinhole, 27 ... half mirror, 28 ... photodetector, 50 ... sample.

Claims (9)

試料に関して指定した測定ポイントから発せられる光を光検出器により検出するステップと、
前記光検出器により出力される時系列信号を複数の時系列信号に時間分割して、測定ポイント毎のデータとデータ数を抽出する時分割ステップと、
異なる遅延時間に対して測定ポイント毎のデータ及びデータ数を再構成するステップと、
再構成した各データを用いて統計計算を行うとともに、再構成した各データ数を用いて統計計算を行うステップと、
前記２つの統計計算の結果を用いて試料の物理的性質を求めることを特徴とする光信号解析方法。 Detecting light emitted from a specified measurement point with respect to the sample by a photodetector;
A time division step of time-dividing the time-series signal output by the photodetector into a plurality of time-series signals and extracting data and the number of data for each measurement point;
Reconstructing data and number of data for each measurement point for different delay times;
Performing statistical calculations using each reconstructed data and performing statistical calculations using each reconstructed number of data;
A method of analyzing an optical signal, wherein physical properties of a sample are obtained using the results of the two statistical calculations. 前記試料に関する複数の測定ポイントを選択し、各測定ポイントから発せられる光を前記光検出器により検出し、前記光検出器より出力される時系列信号を前記複数の測定ポイント毎に分割して取り出し、前記分割した時系列信号毎に解析を行うことにより、前記試料の複数の測定ポイント毎の物理的性質を求めることを特徴とする請求項１記載の光信号解析方法。 A plurality of measurement points related to the sample are selected, light emitted from each measurement point is detected by the photodetector, and a time series signal output from the photodetector is divided and extracted for each of the plurality of measurement points. 2. The optical signal analysis method according to claim 1, wherein the physical property for each of a plurality of measurement points of the sample is obtained by performing analysis for each of the divided time series signals. 前記光検出器から出力される時系列信号を前記複数の測定ポイント毎にデータ分割して記憶し、必要に応じて前記複数の測定ポイント毎の分割データを再構成して解析を行うことにより、前記複数の測定ポイント毎の物理的性質を求めることを特徴とする請求項２記載の光信号解析方法。 By dividing and storing the time series signal output from the photodetector for each of the plurality of measurement points, and performing analysis by reconstructing the divided data for each of the plurality of measurement points as necessary, The optical signal analysis method according to claim 2, wherein a physical property for each of the plurality of measurement points is obtained. 前記複数の測定ポイント毎の分割データを再構成して解析を行い、前記データ再構成によるデータ数に関する情報をウェイトとし、前記ウェイトと、複数の測定ポイント毎の分割再構成データとの組み合わせにより、前記複数の測定ポイント毎の物理的性質を求めることを特徴とする請求項２記載の光信号解析方法。 Reconstructing and analyzing the divided data for each of the plurality of measurement points, information on the number of data by the data reconstruction as a weight, by combining the weight and the divided reconstructed data for each of the plurality of measurement points, The optical signal analysis method according to claim 2, wherein a physical property for each of the plurality of measurement points is obtained. 前記試料から発せられる光は、螢光、燐光、反射光または散乱光であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１つに記載の光信号解析方法。 The optical signal analysis method according to claim 1, wherein the light emitted from the sample is fluorescence, phosphorescence, reflected light, or scattered light. 前記光信号の解析は、自己相関分析法または、フォトンカウンティングヒストグラム法を用いて行われることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１つに記載の光信号解析方法。 6. The optical signal analysis method according to claim 1, wherein the analysis of the optical signal is performed using an autocorrelation analysis method or a photon counting histogram method. 前記光信号の解析は、相互相関分析法または、コインシデンス解析法を用いて行われることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１つに記載の光信号解析方法。 6. The optical signal analysis method according to claim 1, wherein the analysis of the optical signal is performed using a cross-correlation analysis method or a coincidence analysis method. 前記再構成するステップは、
ａ）計測された各計測区間のデータおよびデータの数を一定時間記憶するステップと、
ｂ）隣接する複数の計測区間のデータおよびデータの数を演算するステップと、
ｃ）演算結果を、演算に用いた隣接する計測区間の総和に等しい計測区間幅をもつ新たな計測区間のデータおよびデータの数として記憶するステップと、
ｄ）新たに計測された計測区間のデータおよびデータの数を所定時間記憶するステップと、
ｅ）隣接する複数の新たな計測区間のデータおよびデータの数を演算するステップと、
ｆ）演算結果を、演算に用いた新たな計測区間の時間の総和に等しい次の新たな計測区間幅をもつ次の新たな計測区間のデータおよびデータの数として記憶するステップと、を具備し、
上記d)からｆ）のステップを所定の回数繰り返すことにより、試料の物理的性質を求めることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１つに記載の光信号解析方法。 The reconfiguring step includes:
a) storing the measured data of each measurement section and the number of data for a certain period of time;
b) calculating the data of a plurality of adjacent measurement sections and the number of data;
c) storing the calculation result as data and the number of data of a new measurement section having a measurement section width equal to the sum of adjacent measurement sections used in the calculation;
d) storing newly measured data of the measurement section and the number of data for a predetermined time;
e) calculating data of a plurality of adjacent new measurement sections and the number of data;
f) storing the calculation result as data of the next new measurement section having the next new measurement section width equal to the total time of the new measurement section used for the calculation and the number of data. ,
8. The optical signal analysis method according to claim 1, wherein the physical properties of the sample are obtained by repeating the steps d) to f) a predetermined number of times. 前記試料に関する測定ポイントの物理的性質は分子、または粒子の並進拡散係数、回転拡散係数、あるいは前記測定領域内に存在する分子、または粒子の個数、あるいは蛍光寿命であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１つに記載の光信号解析方法。 The physical property of a measurement point with respect to the sample is a translational diffusion coefficient, a rotational diffusion coefficient of a molecule or particle, or the number of molecules or particles present in the measurement region, or a fluorescence lifetime. The optical signal analysis method according to any one of 1 to 8.
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