JP2006078195A - Method of measuring interaction between ligand and specimen - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method of measuring an interaction between ligand and a specimen for screening a chemical for exhibiting a higher pharmacologic effect in a disease section than a normal section. <P>SOLUTION: The interaction between the ligand and the specimen is measured under at least two or more kinds of environments. Thus, the interaction between the ligand and the specimen is measured, and the specimen having large difference in interaction degree between different environments is identified as a candidate material, thereby screening the candidate material. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、リガンドと被験物質との相互作用の測定方法に関する。より詳細には、本発明は、少なくとも２種類以上の環境下で測定を行うリガンドと被験物質との相互作用の測定方法に関する。   The present invention relates to a method for measuring an interaction between a ligand and a test substance. More specifically, the present invention relates to a method for measuring an interaction between a ligand and a test substance that is measured in at least two or more environments.

医薬品は疾患部位で薬理効果を発現し、正常部ではできる限り不活性であること、つまり疾患部選択性が高いことが好ましい。一方、正常部と疾患部で様々な細胞内あるいは周辺の液物性が異なることが知られている。例えば、癌細胞ではpHが正常細胞に比較して著しく低い。また、癌細胞は代謝も激しいことから代謝産物も多い。   It is preferable that the drug develops a pharmacological effect at the diseased site and is as inactive as possible in the normal part, that is, has high disease part selectivity. On the other hand, it is known that various physical or peripheral liquid properties are different between a normal part and a diseased part. For example, cancer cells have a significantly lower pH than normal cells. In addition, cancer cells are also heavily metabolized, so there are many metabolites.

また、疾患部と正常部では同一の蛋白質が機能していることが多く、疾患部のみで医薬品の薬理効果を発現させるには、このような正常部と疾患部の溶液の性質や含有物の違いを利用する方法が知られている。具体的には、同一の蛋白質であっても溶液の性質や含有物の違いにより、化学物質の吸脱着性は変化する。例えば、等電点以下ではアニオン性の化合物は吸着しやすく、カチオン性の化合物は吸着し難いが、等電点以上では逆になる。   In addition, the same protein often functions in the diseased part and the normal part, and in order to express the pharmacological effect of the drug only in the diseased part, the properties and contents of the solution of such normal part and diseased part There are known ways to take advantage of the differences. Specifically, even for the same protein, the adsorption / desorption properties of chemical substances vary depending on the properties of the solution and the content. For example, an anionic compound is easily adsorbed below the isoelectric point, and a cationic compound is difficult to adsorb, but the reverse is observed above the isoelectric point.

医薬品を開発するうえで、このような正常部と疾患部の溶液の性質や含有物の違いを活用することが、疾患部選択性を高めることにつながる。   In developing a medicinal product, utilizing the difference in the properties and contents of the solution between the normal part and the diseased part leads to an increase in diseased part selectivity.

本発明は、正常部よりも疾患部においてより高い薬理効果を発現する医薬品をスクリーニングするための、リガンドと被験物質との相互作用の測定方法を提供することを解決すべき課題とする。   It is an object of the present invention to provide a method for measuring an interaction between a ligand and a test substance for screening a drug that exhibits a higher pharmacological effect in a diseased part than in a normal part.

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、リガンドと被験物質との相互作用を少なくとも２種類以上の環境下で測定し、当該２種類以上の環境下において相互作用の程度の相違が比較的大きい物質を選択することにより、疾患部に特異的に薬理効果を発現する可能性が高い物質をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。   As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have measured the interaction between the ligand and the test substance in at least two kinds of environments, and determined the degree of interaction in the two or more kinds of environments. It has been found that by selecting a substance having a relatively large difference, a substance having a high possibility of expressing a pharmacological effect specifically in the diseased part can be screened, and the present invention has been completed.

即ち、本発明によれば、リガンドと被験物質との相互作用を少なくとも２種類以上の環境下で測定することを含む、リガンドと被験物質との相互作用の測定方法が提供される。   That is, according to the present invention, there is provided a method for measuring the interaction between a ligand and a test substance, which comprises measuring the interaction between the ligand and the test substance in at least two kinds of environments.

好ましくは、リガンドと被験物質との相互作用を測定する環境は、温度、pH、塩濃度、金属イオン濃度、又は基質濃度を変化させた環境である。   Preferably, the environment for measuring the interaction between the ligand and the test substance is an environment in which the temperature, pH, salt concentration, metal ion concentration, or substrate concentration is changed.

好ましくは、リガンドと被験物質との相互作用は非電気的方法で測定し、さらに好ましくは表面プラズモン共鳴分析法で測定する。   Preferably, the interaction between the ligand and the test substance is measured by a non-electric method, more preferably by surface plasmon resonance analysis.

好ましくは、金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用いて、前記流路系内の液体を被験物質を含まない溶液から被験物質を含む溶液へと交換して表面プラズモン共鳴の変化を測定することによって、リガンドと被験物質との相互作用を分析することができる。   Preferably, a metal film, a light source that generates a light beam, and an optical system that causes the light beam to be incident so as to obtain a total reflection condition at an interface with the metal film and include various incident angle components; Surface plasmon resonance measurement comprising a flow path system including cells formed on the metal film, and light detection means for detecting the state of surface plasmon resonance by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface. Using the apparatus, the interaction between the ligand and the test substance is measured by exchanging the liquid in the flow path system from a solution containing no test substance to a solution containing the test substance and measuring the change in surface plasmon resonance. Can be analyzed.

好ましくは、流路系内の液体を、被験物質を含まない溶液から被験物質を含む溶液へと交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。   Preferably, the change in surface plasmon resonance can be measured in a state where the flow of the liquid is stopped after the liquid in the flow path system is changed from a solution containing no test substance to a solution containing the test substance.

本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法によりリガンドと被験物質との相互作用を測定し、異なる環境下における相互作用の程度の差が大きい被験物質を候補物質として同定する、候補物質のスクリーニング方法が提供される。   According to another aspect of the present invention, the interaction between a ligand and a test substance is measured by the above-described method of the present invention, and a test substance having a large difference in the degree of interaction under different environments is identified as a candidate substance. Methods for screening candidate substances are provided.

本発明によれば、疾患部に特異的に薬理効果を発現する物質を多数の被験物質の中から速やかにスクリーニングことが可能である。   According to the present invention, a substance that expresses a pharmacological effect specifically in a diseased part can be rapidly screened from a large number of test substances.

以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明によるリガンドと被験物質との相互作用の測定方法は、リガンドと被験物質との相互作用を少なくとも２種類以上の環境下で測定することを特徴とする。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
The method for measuring the interaction between a ligand and a test substance according to the present invention is characterized in that the interaction between the ligand and the test substance is measured in at least two kinds of environments.

本発明における環境とは、タンパクとの相互作用を測定する目的の化合物の濃度以外を全て含むものを言う。例えば、温度、pH、塩濃度（具体的にはCl^-濃度、SO₄ ^2-濃度、PO₄ ^3-濃度など）、金属イオン濃度（具体的には、K⁺濃度、Na⁺濃度、Zn²⁺濃度、Ca²⁺濃度、Mg²⁺濃度など）、キレート剤濃度、基質（タンパクと相互作用して、別の物質に変換されることが知られているタンパク、化合物など）濃度などが挙げられる。 The environment in the present invention refers to an environment containing everything except the concentration of the target compound for measuring the interaction with the protein. For example, temperature, pH, salt concentration (specifically Cl ⁻ concentration, SO ₄ ²⁻ concentration, PO ₄ ³⁻ concentration, etc.), metal ion concentration (specifically, K ⁺ concentration, Na ⁺ concentration, Zn ^{2) +} Concentration, Ca ²⁺ concentration, Mg ²⁺ concentration, etc.), chelating agent concentration, substrate (proteins, compounds, etc. that are known to interact with proteins and convert to other substances), etc. It is done.

本発明においては、上記方法によりリガンドと被験物質との相互作用を測定し、異なる環境下における相互作用の程度の差が大きい被験物質を候補物質として同定することにより、候補物質のスクリーニングを行うことができる。異なる環境下における相互作用の程度の差が大きい被験物質とは、例えば、第一の環境における相互作用の程度と、第二の環境における相互作用の程度との差が大きいことを言う。本発明においては、リガンドと被験物質との相互作用の程度は、結合定数（KD）などの数値として表すことができる。このように相互作用の程度を数値で表した場合、第一の環境下での測定値と、第二の環境下での測定値との比を求め、その比の値が大きいものを候補物質として同定することができる。   In the present invention, screening of a candidate substance is performed by measuring the interaction between a ligand and a test substance by the above method and identifying a test substance having a large difference in the degree of interaction in different environments as a candidate substance. Can do. A test substance having a large difference in the degree of interaction under different environments means, for example, that the difference between the degree of interaction in the first environment and the degree of interaction in the second environment is large. In the present invention, the degree of interaction between the ligand and the test substance can be expressed as a numerical value such as a binding constant (KD). When the degree of interaction is expressed as a numerical value in this way, the ratio between the measured value in the first environment and the measured value in the second environment is obtained, and a substance with a large ratio is obtained as a candidate substance. Can be identified as

多数の被験物質と用いて上記のスクリーニングを行う場合には、第一の環境下での測定値と、第二の環境下での測定値との比を求め、その比の平均値よりも好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上高い比の値を示す物質を候補物質として同定することができる。   When the above screening is performed using a large number of test substances, the ratio between the measured value in the first environment and the measured value in the second environment is obtained, and is more preferable than the average value of the ratios. Can identify as a candidate substance a substance having a ratio value of 10% or more, more preferably 20% or more.

本発明で用いる被験物質としては例えば、本明細書中以下に記載するような生理活性物質（リガンド）と相互作用する物質であれば特に限定されないが、低分子有機化合物、高分子化合物、ＤＮＡ等の核酸、蛋白質（抗体などを含む）、ペプチド又はその断片、糖、アミノ酸などが挙げられる。   The test substance used in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that interacts with a physiologically active substance (ligand) as described below in the present specification, but a low molecular organic compound, a high molecular compound, DNA, etc. And nucleic acids, proteins (including antibodies), peptides or fragments thereof, sugars, amino acids and the like.

本発明において好ましくは、リガンドと被験物質との相互作用を非電気的方法（例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術など）で測定することができ、より好ましくは表面プラズモン共鳴分析法で測定することができる。   In the present invention, preferably, the interaction between the ligand and the test substance is conducted by a non-electric method (for example, surface plasmon resonance (SPR) measurement technique, quartz crystal microbalance (QCM) measurement technique, gold colloidal particles to ultrafine particles). And the like, and more preferably, the surface plasmon resonance analysis can be used.

本発明の一実施態様においては、表面プラズモン共鳴測定装置の流路系内の液体を、被験物質を含まない溶液から被験物質を含む溶液へと交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。このような測定により、測定時間内における参照セルの信号変化のノイズ幅、及びベースライン変動を抑制することができ、これにより信頼性の高い結合検出データを取得することができる。液の流れを停止させる時間は特に限定されないが、例えば、１秒以上３０分以下であり、好ましくは１０秒以上２０分以下であり、さらに好ましくは１分以上２０分以下程度である。   In one embodiment of the present invention, after the liquid in the flow path system of the surface plasmon resonance measuring apparatus is exchanged from a solution not containing the test substance to a solution containing the test substance, the surface of the surface is stopped in a state where the liquid flow is stopped. Changes in plasmon resonance can be measured. By such measurement, it is possible to suppress the noise width of the signal change of the reference cell and the baseline fluctuation within the measurement time, and thereby it is possible to acquire highly reliable combined detection data. The time for stopping the flow of the liquid is not particularly limited, but is, for example, 1 second to 30 minutes, preferably 10 seconds to 20 minutes, and more preferably about 1 minute to 20 minutes.

本発明においては好ましくは、被験物質と相互作用する物質を結合していない参照セルと、被験物質と相互作用する物質を結合した検出セルとを直列に連結して流路系内に設置し、該参照セルと該検出セルに液体を流すことにより、表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。   In the present invention, preferably, a reference cell that does not bind a substance that interacts with a test substance and a detection cell that binds a substance that interacts with the test substance are connected in series and installed in the flow path system, A change in surface plasmon resonance can be measured by flowing a liquid through the reference cell and the detection cell.

また、本発明においては、測定に用いるセルの体積(Vs ml)（上記した参照セルと検出セルを用いる場合はそれらのセルの合計体積）に対し、1回の測定あたりの液交換量(Ve ml)の比率(Ve/Vs)を、例えば、1以上100以下とすることができる。Ve/Vsは、より好ましくは1以上50以下であり、特に好ましくは1以上20以下である。測定に用いるセルの体積(Vs ml)は特に限定されないが、好ましくは１×１０^-6〜１．０ml、特に好ましくは１×１０^-5〜１×１０^-1ml程度である。また、液体の交換にかける時間としては、0.01秒以上100秒以下が好ましく、0.1秒以上10秒以下がより好ましい。 In the present invention, the amount of liquid exchange per measurement (Ve) with respect to the volume (Vs ml) of the cell used for measurement (the total volume of those cells when the reference cell and the detection cell are used). ml) (Ve / Vs) can be, for example, 1 or more and 100 or less. Ve / Vs is more preferably 1 or more and 50 or less, and particularly preferably 1 or more and 20 or less. The volume (Vs ml) of the cell used for the measurement is not particularly limited, but is preferably about 1 × 10 ^{−6 to} 1.0 ml, particularly preferably about 1 × 10 ⁻⁵ to 1 × 10 ⁻¹ ml. Further, the time required for exchanging the liquid is preferably 0.01 seconds or more and 100 seconds or less, and more preferably 0.1 seconds or more and 10 seconds or less.

表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。以下、本発明で用いることができる表面プラズモン共鳴測定装置について説明する。   The phenomenon of surface plasmon resonance is due to the fact that the intensity of monochromatic light reflected from the boundary between an optically transparent substance such as glass and the metal thin film layer depends on the refractive index of the sample on the metal exit side. Yes, so the sample can be analyzed by measuring the intensity of the reflected monochromatic light. Hereinafter, a surface plasmon resonance measuring apparatus that can be used in the present invention will be described.

表面プラズモン共鳴測定装置とは、表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析するための装置である。本発明で用いられる表面プラズモン共鳴測定装置の一例は、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備える。   A surface plasmon resonance measuring apparatus is an apparatus for analyzing the characteristics of a substance to be measured using a phenomenon in which surface plasmons are excited by light waves. An example of the surface plasmon resonance measuring apparatus used in the present invention is a dielectric block, a metal film formed on one surface of the dielectric block, a light source for generating a light beam, and the light beam to the dielectric block. On the other hand, the optical system that allows the total reflection condition to be obtained at the interface between the dielectric block and the metal film and that includes various incident angle components, and the intensity of the light beam that is totally reflected at the interface Photodetection means for measuring and detecting the surface plasmon resonance state.

また、前記の通り、前記誘電体ブロックは、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている。   Further, as described above, the dielectric block is formed as one block including all of the light beam incident surface, the light exit surface, and one surface on which the metal film is formed, and the metal film is formed on the dielectric block. It is integrated.

本発明では、具体的には、特開２００１−３３０５６０号公報記載の図１〜図３２で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置、特開２００２−２９６１７７号公報記載の図１〜図１５で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置を好ましく用いることができる。特開２００１−３３０５６０号公報および特開２００２−２９６１７７号公報に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。   In the present invention, specifically, the surface plasmon resonance measuring apparatus described in FIGS. 1 to 32 described in JP 2001-330560 A and described in FIGS. 1 to 15 described in JP 2002-296177 A are described. A surface plasmon resonance measuring apparatus which is used can be preferably used. The contents described in Japanese Patent Laid-Open No. 2001-330560 and Japanese Patent Laid-Open No. 2002-296177 are all cited in this specification as part of the disclosure of this specification.

例えば、特開２００１−３３０５６０号公報記載の表面プラズモン共鳴測定装置としては、例えば、誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる薄膜層、およびこの薄膜層の表面上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる複数の測定ユニットと、これら複数の測定ユニットを支持した支持体と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、表面プラズモン共鳴による全反射減衰の状態を検出する光検出手段と、前記複数の測定ユニットの各誘電体ブロックに関して順次前記全反射条件および種々の入射角が得られるように、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、各測定ユニットを順次前記光学系および光検出手段に対して所定位置に配置する駆動手段とを備えてなることを特徴とする表面プラズモン共鳴測定装置が挙げられる。   For example, as a surface plasmon resonance measuring apparatus described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-330560, for example, a dielectric block, a thin film layer made of a metal film formed on one surface of the dielectric block, and a surface of the thin film layer A plurality of measurement units each including a sample holding mechanism for holding a sample; a support that supports the plurality of measurement units; a light source that generates a light beam; and the light beam with respect to the dielectric block. An optical system that is incident at various incident angles so that a total reflection condition can be obtained at the interface between the dielectric block and the metal film, and the intensity of the light beam that is totally reflected at the interface are measured, and the total intensity by surface plasmon resonance. The total reflection condition and various incident angles can be obtained sequentially with respect to the light detection means for detecting the reflection attenuation state and each dielectric block of the plurality of measurement units. As described above, the apparatus includes a driving unit that relatively moves the support, the optical system, and the light detection unit, and sequentially arranges each measurement unit at a predetermined position with respect to the optical system and the light detection unit. And a surface plasmon resonance measuring apparatus.

なお、上記の測定装置においては、例えば前記光学系および光検出手段が静止状態に保たれるものとされ、前記駆動手段が、前記支持体を移動させるものとされる。   In the above measurement apparatus, for example, the optical system and the light detection means are kept stationary, and the driving means moves the support.

その場合、前記支持体は、回動軸を中心とする円周上に前記複数の測定ユニットを支持するターンテーブルであり、また前記駆動手段は、このターンテーブルを間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、この支持体を前記複数の測定ユニットの並び方向に間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。   In that case, the support body is a turntable that supports the plurality of measurement units on a circumference around a rotation axis, and the driving means rotates the turntable intermittently. It is desirable to be. Further, in this case, the support body is one that supports the plurality of measurement units arranged in a line in a straight line, and the support body is intermittently linear in the arrangement direction of the plurality of measurement units as the driving means. You may apply what is moved.

一方、上記とは反対に、前記支持体が静止状態に保たれるものであり、前記駆動手段が、前記光学系および光検出手段を移動させるものであっても構わない。   On the other hand, contrary to the above, the support may be kept stationary, and the drive means may move the optical system and the light detection means.

その場合、前記支持体は、円周上に前記複数の測定ユニットを支持するものであり、前記駆動手段は、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。   In that case, the support body supports the plurality of measurement units on a circumference, and the driving means places the optical system and the light detection means on the plurality of measurement units supported by the support body. It is desirable to rotate intermittently along. Further, in this case, the support body is one that supports the plurality of measurement units arranged in a line in a line, and the optical system and the light detection means are supported by the support body as the drive means. You may apply what moves linearly intermittently along this measurement unit.

他方、前記駆動手段が、その回動軸を支承するころがり軸受けを有するものである場合、この駆動手段は、該回動軸を一方向に回動させて前記複数の測定ユニットに対する一連の測定が終了したならば、この回動量と同量だけ該回動軸を他方向に戻してから、次回の一連の測定のためにこの回動軸を前記一方向に回動させるように構成されることが望ましい。   On the other hand, when the drive means has a rolling bearing that supports the rotation shaft, the drive means rotates the rotation shaft in one direction to perform a series of measurements on the plurality of measurement units. When completed, the rotation shaft is returned to the other direction by the same amount as the rotation amount, and then the rotation shaft is rotated in the one direction for the next series of measurements. Is desirable.

また上記の測定装置においては、前記複数の測定ユニットが連結部材により１列に連結されてユニット連結体を構成し、前記支持体が、このユニット連結体を支持するように構成されていることが望ましい。   Further, in the measurement apparatus, the plurality of measurement units are connected in a row by a connecting member to form a unit connection body, and the support body is configured to support the unit connection body. desirable.

また上記の測定装置においては、前記支持体に支持されている複数の測定ユニットの各試料保持機構に、自動的に所定の試料を供給する手段が設けられることが望ましい。   In the measurement apparatus, it is preferable that a means for automatically supplying a predetermined sample is provided to each sample holding mechanism of the plurality of measurement units supported by the support.

さらに上記の測定装置においては、前記測定ユニットの誘電体ブロックが前記支持体に固定され、測定ユニットの薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが上記誘電体ブロックに対して交換可能に形成されていることが望ましい。   Furthermore, in the measurement apparatus, the dielectric block of the measurement unit is fixed to the support, and the thin film layer of the measurement unit and the sample holding mechanism are integrated to form a measurement chip. It is desirable that the block is formed to be exchangeable.

そして、このような測定チップを適用する場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、前記誘電体ブロックと組み合う状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。   When such a measurement chip is applied, a cassette containing a plurality of the measurement chips, and a chip supply means for taking out the measurement chips one by one from the cassette and supplying the measurement chips in combination with the dielectric block are provided. It is desirable to be provided.

あるいは、測定ユニットの誘電体ブロック、薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが前記支持体に対して交換可能に形成されてもよい。   Alternatively, the dielectric block, the thin film layer, and the sample holding mechanism of the measurement unit may be integrated to form a measurement chip, and the measurement chip may be formed to be replaceable with respect to the support.

測定チップをそのような構成とする場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、支持体に支持される状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。   When the measurement chip has such a configuration, a cassette in which a plurality of measurement chips are stored and chip supply means for taking out the measurement chips one by one from the cassette and supplying them in a state supported by the support are provided. It is desirable that

他方、前記光学系は、光ビームを誘電体ブロックに対して収束光あるいは発散光の状態で入射させるように構成され、そして前記光検出手段は、全反射した光ビームに存在する、全反射減衰による暗線の位置を検出するように構成されることが望ましい。   On the other hand, the optical system is configured to make the light beam incident on the dielectric block in the state of convergent light or divergent light, and the light detection means is present in the totally reflected light beam, and is attenuated by total reflection. It is desirable to be configured to detect the position of the dark line.

また上記光学系は、光ビームを前記界面にデフォーカス状態で入射させるものとして構成されることが望ましい。そのようにする場合、光ビームの上記界面における、前記支持体の移動方向のビーム径は、この支持体の機械的位置決め精度の１０倍以上とされることが望ましい。   The optical system is preferably configured to allow a light beam to enter the interface in a defocused state. In that case, it is desirable that the beam diameter in the moving direction of the support at the interface of the light beam be 10 times or more the mechanical positioning accuracy of the support.

さらに上記の測定装置において、測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光源は前記支持体より上の位置から下方に向けて前記光ビームを射出するように配設され、前記光学系は、前記下方に向けて射出された前記光ビームを上方に反射して、前記界面に向けて進行させる反射部材を備えていることが望ましい。   Furthermore, in the measurement apparatus, the measurement unit is supported above the support, the light source is disposed so as to emit the light beam downward from a position above the support, and the optical system includes It is desirable that a reflection member that reflects the light beam emitted toward the lower side to travel upward toward the interface is preferably provided.

また、上記の測定装置において、前記測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光学系は、前記光ビームを前記界面の下側から該界面に入射させるように構成され、前記光検出手段は前記支持体よりも上の位置で光検出面を下方に向けて配設されるとともに、前記界面で全反射した光ビームを上方に反射して、前記光検出手段に向けて進行させる反射部材が設けられることが望ましい。   In the measurement apparatus, the measurement unit is supported on an upper side of the support, and the optical system is configured to cause the light beam to enter the interface from a lower side of the interface. Is a reflecting member that is disposed at a position above the support so that the light detection surface faces downward, reflects the light beam totally reflected at the interface upward, and travels toward the light detection means. It is desirable to be provided.

他方、上記の測定装置においては、前記支持体に支持される前および／または支持された後の前記測定ユニットを、予め定められた設定温度に維持する温度調節手段が設けられることが望ましい。   On the other hand, in the above-described measuring apparatus, it is preferable that temperature adjusting means for maintaining the measuring unit at a predetermined set temperature before and / or after being supported by the support body is provided.

また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された測定ユニットの試料保持機構に貯えられた試料を、前記全反射減衰の状態を検出する前に撹拌する手段が設けられることが望ましい。   In the measurement apparatus, it is preferable that a means for stirring the sample stored in the sample holding mechanism of the measurement unit supported by the support before detecting the total reflection attenuation state is provided.

また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された複数の測定ユニットの少なくとも１つに、前記試料の光学特性と関連した光学特性を有する基準液を供給する基準液供給手段が設けられるとともに、前記光検出手段によって得られた、試料に関する前記全反射減衰の状態を示すデータを、前記基準液に関する前記全反射減衰の状態を示すデータに基づいて補正する補正手段が設けられることが望ましい。   In the measurement apparatus, a reference liquid supply unit that supplies a reference liquid having optical characteristics related to the optical characteristics of the sample is provided in at least one of the plurality of measurement units supported by the support. In addition, it is preferable that correction means for correcting the data indicating the total reflection attenuation state relating to the sample obtained by the light detection means based on the data indicating the total reflection attenuation state relating to the reference liquid is preferably provided. .

そのようにする場合、試料が被検体を溶媒に溶解させてなるものであるならば、前記基準液供給手段は、基準液として前記溶媒を供給するものであることが望ましい。   In that case, it is desirable that the reference liquid supply means supplies the solvent as a reference liquid if the sample is obtained by dissolving the analyte in the solvent.

さらに、上記の測定装置は、測定ユニットの各々に付与された、個体識別情報を示すマークと、測定に使用される測定ユニットから前記マークを読み取る読取手段と、測定ユニットに供給される試料に関する試料情報を入力する入力手段と、測定結果を表示する表示手段と、この表示手段、前記入力手段および前記読取手段に接続されて、各測定ユニット毎の前記個体識別情報と前記試料情報とを対応付けて記憶するとともに、ある測定ユニットに保持された試料について求められた測定結果を、その測定ユニットに関して記憶されている前記個体識別情報および前記試料情報と対応付けて前記表示手段に表示させる制御手段とを備えることが望ましい。   Further, the measuring apparatus includes a mark indicating individual identification information given to each measurement unit, reading means for reading the mark from the measurement unit used for measurement, and a sample relating to a sample supplied to the measurement unit An input means for inputting information, a display means for displaying a measurement result, and connected to the display means, the input means, and the reading means to associate the individual identification information and the sample information for each measurement unit And a control means for displaying the measurement result obtained for the sample held in a certain measurement unit on the display means in association with the individual identification information and the sample information stored for the measurement unit. It is desirable to provide.

上記した測定装置を用いて生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する場合、前記測定ユニットの１つにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出した後、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、別の測定ユニットにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出し、その後前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、前記１つの測定ユニットにおける試料に関して、再度全反射減衰の状態を検出することにより測定を行うことができる。   When detecting or measuring a substance that interacts with a physiologically active substance using the measurement apparatus described above, after detecting the state of total reflection attenuation with respect to the sample in one of the measurement units, the support, the optical system, and the light are detected. The detection means is moved relative to each other to detect the state of total reflection attenuation with respect to the sample in another measurement unit, and then the support, the optical system and the light detection means are moved relative to each other in the one measurement unit. Measurement can be performed on the sample by detecting the total reflection attenuation state again.

本発明で用いる測定チップは、本明細書中に記載した構成を有する表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、誘電体ブロックとこの誘電体ブロックの一面に形成された金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている。   A measurement chip used in the present invention is a measurement chip for use in a surface plasmon resonance measurement apparatus having the configuration described in the present specification, and is a dielectric block and a metal film formed on one surface of the dielectric block. The dielectric block is formed as one block including all of the light beam incident surface, the light exit surface, and one surface on which the metal film is formed, and the metal film is integrated with the dielectric block. It has become.

金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記金属膜への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。   The metal constituting the metal film is not particularly limited as long as surface plasmon resonance can occur. Preferred examples include free electron metals such as gold, silver, copper, aluminum, and platinum, with gold being particularly preferred. These metals can be used alone or in combination. In consideration of adhesion to the metal film, an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal.

金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。   Although the thickness of the metal film is arbitrary, for example, when considering use for a surface plasmon resonance measuring apparatus, it is preferably 1 angstrom or more and 5000 angstrom or less, and particularly preferably 10 angstrom or more and 2000 angstrom or less. If it exceeds 5000 angstroms, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. When an intervening layer made of chromium or the like is provided, the thickness of the intervening layer is preferably 1 angstrom or more and 100 angstrom or less.

金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。   The metal film may be formed by a conventional method, for example, sputtering, vapor deposition, ion plating, electroplating, electroless plating, or the like.

金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。   The metal film is preferably disposed on the substrate. Here, “arranged on the substrate” means that the metal film is arranged so as to be in direct contact with the substrate, and that the metal film is not directly in contact with the substrate, but through other layers. This also includes the case where they are arranged. As a substrate that can be used in the present invention, for example, when considering use for a surface plasmon resonance measuring apparatus, generally, optical glass such as BK7, or synthetic resin, specifically, polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, polycarbonate A material made of a material transparent to laser light such as a cycloolefin polymer can be used. Such a substrate is preferably made of a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarized light and has excellent processability.

金属膜は、最表面に生理活性物質（即ち、被験物質に対するリガンド）を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「最表面」とは、「金属膜から最も遠い側」という意味である。   The metal film preferably has a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance (that is, a ligand for the test substance) on the outermost surface. Here, the “outermost surface” means “the side farthest from the metal film”.

好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ¹Ｒ²（式中、Ｒ¹及びＲ²は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ³ＮＲ¹Ｒ²（式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。 Preferred functional groups include —OH, —SH, —COOH, —NR ¹ R ² (wherein R ¹ and R ² independently represent a hydrogen atom or a lower alkyl group), —CHO, —NR ³ NR ^1. R ² (wherein R ¹ , R ² and R ³ each independently represents a hydrogen atom or a lower alkyl group), —NCO, —NCS, an epoxy group, or a vinyl group can be mentioned. Here, the number of carbon atoms in the lower alkyl group is not particularly limited, but is generally about C1 to C10, preferably C1 to C6.

最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、例えば、それらの官能基の前駆体を含有する高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。   As a method for introducing those functional groups on the outermost surface, for example, a polymer containing a precursor of those functional groups is coated on a metal surface or metal film, and then a precursor located on the outermost surface by chemical treatment. The method of producing | generating those functional groups from is mentioned.

上記のようにして得られた測定チップにおいて、上記の官能基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属膜に生理活性物質を固定化することができる。   In the measurement chip obtained as described above, the physiologically active substance can be immobilized on the metal film by covalently bonding the physiologically active substance via the functional group.

本発明の測定チップの表面上に固定される生理活性物質（即ち、リガンド）としては、測定対象物である被験物質と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。   The physiologically active substance (that is, the ligand) immobilized on the surface of the measurement chip of the present invention is not particularly limited as long as it interacts with the test substance that is the measurement target. For example, immune proteins, enzymes, microorganisms Nucleic acid, low molecular weight organic compound, non-immune protein, immunoglobulin binding protein, sugar binding protein, sugar chain that recognizes sugar, fatty acid or fatty acid ester, or polypeptide or oligopeptide having ligand binding ability .

免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。   Examples of immunity proteins include antibodies and haptens that use the measurement target as an antigen. As the antibody, various immunoglobulins, that is, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD can be used. Specifically, when the measurement target is human serum albumin, an anti-human serum albumin antibody can be used as the antibody. In addition, when using pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, ***e, heroin, cracks, etc. as antigens, for example, anti-atrazine antibodies, anti-kanamycin antibodies, anti-methamphetamine antibodies, or pathogenic E. coli Among them, antibodies against O antigens 26, 86, 55, 111, 157 and the like can be used.

酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。   The enzyme is not particularly limited as long as it shows activity against the measurement object or a substance metabolized from the measurement object, and various enzymes such as oxidoreductase, hydrolase, isomerase , A desorbing enzyme, a synthesizing enzyme, etc. Specifically, if the measurement object is glucose, glucose oxidase can be used, and if the measurement object is cholesterol, cholesterol oxidase can be used. In addition, when pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, ***e, heroin, cracks, etc. are used as measurement objects, they exhibit specific reactions with substances metabolized from them, such as acetylcholinesterase. Enzymes such as catecholamine esterase, noradrenaline esterase and dopamine esterase can be used.

微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。 The microorganism is not particularly limited, and various microorganisms including Escherichia coli can be used.
As the nucleic acid, one that hybridizes complementarily with the nucleic acid to be measured can be used. As the nucleic acid, either DNA (including cDNA) or RNA can be used. The type of DNA is not particularly limited, and may be any of naturally derived DNA, recombinant DNA prepared by gene recombination technology, or chemically synthesized DNA.
Examples of the low-molecular organic compound include any compound that can be synthesized by an ordinary organic chemical synthesis method.

非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。 The non-immune protein is not particularly limited, and for example, avidin (streptavidin), biotin or a receptor can be used.
As the immunoglobulin-binding protein, for example, protein A or protein G, rheumatoid factor (RF) and the like can be used.
Examples of sugar-binding proteins include lectins.
Examples of the fatty acid or fatty acid ester include stearic acid, arachidic acid, behenic acid, ethyl stearate, ethyl arachidate, and ethyl behenate.

生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。   When the physiologically active substance is a protein or nucleic acid such as an antibody or an enzyme, the immobilization can be performed by covalently bonding to a functional group on the metal surface using the amino group, thiol group or the like of the physiologically active substance. .

上記のようにして生理活性物質を固定化した測定チップは、当該生理活性物質と相互作用する被験物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。 The measurement chip on which the physiologically active substance is immobilized as described above can be used for detection and / or measurement of a test substance that interacts with the physiologically active substance.
The following examples further illustrate the present invention, but the scope of the present invention is not limited to these examples.

（実施例１）
（１）結合量の測定
リガンド固定（アミンカップリング）は以下の通り行った。測定装置としては、Biacore3000（Biacore社製）を使用した。リガンドとしては、ヒト血清アルブミン（以下HSAと略す）（シグマ社製）5mgをリン酸緩衝液10mM（pH7.4）（以下PBS7.4と略す）1mlに溶解したものを準備した。測定温度は25℃とした。使用チップは、CM5（カルボキシメチルデキストランセンサー）（Biacore社製）である。ランニングバッファーとして、PBS7.4を使用した。流速は10μl/minとした。活性化液として、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との等量混合液を使用した。活性化時間は15分である。固定化液としては、HSA 5mg/ml(PBS7.4)を酢酸バッファーpH5.0（Biacore社製）で10倍希釈したものを使用した。固定化時間は15分である。不活性化液としては、1Mエタノールアミン溶液（pH8.5）（biacore社製）を使用した。不活性化時間は15分である。 Example 1
(1) Measurement of binding amount Ligand fixation (amine coupling) was performed as follows. Biacore 3000 (manufactured by Biacore) was used as a measuring device. A ligand prepared by dissolving 5 mg of human serum albumin (hereinafter abbreviated as HSA) (manufactured by Sigma) in 1 ml of phosphate buffer 10 mM (pH 7.4) (hereinafter abbreviated as PBS 7.4) was prepared. The measurement temperature was 25 ° C. The chip used is CM5 (carboxymethyl dextran sensor) (Biacore). PBS 7.4 was used as a running buffer. The flow rate was 10 μl / min. As an activating liquid, an equal volume mixture of 1-ethyl-2,3-dimethylaminopropylcarbodiimide (400 mM) and N-hydroxysuccinimide (100 mM) was used. The activation time is 15 minutes. As the immobilization solution, HSA 5 mg / ml (PBS7.4) diluted 10 times with acetate buffer pH 5.0 (Biacore) was used. The immobilization time is 15 minutes. As the inactivation liquid, a 1M ethanolamine solution (pH 8.5) (manufactured by biacore) was used. Inactivation time is 15 minutes.

薬剤結合の測定は以下の通り行った。測定装置としては、Biacore3000（Biacore社製）を使用した。ランニングバッファーとしては、5重量％DMSO含有リン酸緩衝液10mM pH7.4（以下5%DMSO/PBS7.4と略す）を使用した。薬剤濃度は0.05mMである。溶解処方は、薬剤10mMDMSO溶液 2.5μl、PBS7.4 47.5μl、5%DMSO/PBS7.4 450μlとした。使用した薬剤は、以下の化合物１及び化合物２である。   The drug binding was measured as follows. Biacore 3000 (manufactured by Biacore) was used as a measuring device. As a running buffer, 5 wt% DMSO-containing phosphate buffer 10 mM pH 7.4 (hereinafter abbreviated as 5% DMSO / PBS 7.4) was used. The drug concentration is 0.05 mM. The dissolution formulation was 2.5 μl of drug 10 mM DMSO solution, 47.5 μl of PBS7.4, and 450 μl of 5% DMSO / PBS7.4. The drugs used are the following Compound 1 and Compound 2.

さらに、上記方法と同様に、リン酸緩衝液のpHのみを6.8に変更して、測定環境pH6.8で測定を実施した。Biacore3000付属のソフトにて、結合定数（KD）を求め、その比を計算した結果を表１に示す。   Further, in the same manner as the above method, only the pH of the phosphate buffer was changed to 6.8, and the measurement was performed in the measurement environment pH 6.8. Table 1 shows the results of calculating the binding constant (KD) using the software supplied with Biacore 3000 and calculating the ratio.

本発明では、pH変化に対するKD値の変化がより大きい化合物を候補物質として選択することができる。上記実施例の場合は、化合物２を選択することができる。   In the present invention, a compound having a larger change in KD value with respect to pH change can be selected as a candidate substance. In the case of the above Examples, Compound 2 can be selected.

（実施例２）
以下に記載の方法で結合定数（KD）を求めた。なお以下の実験は、特開２００１−３３０５６０号公報の図２２に記載の装置（以下、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置と呼ぶ）（本明細書において図１として示す）、及び同公報の図２３に記載の誘電体ブロック（以下、本発明の誘電体ブロックと呼ぶ）（本明細書において図２として示す）を用いて行った。 (Example 2)
The binding constant (KD) was determined by the method described below. The following experiment was performed using the apparatus shown in FIG. 22 of Japanese Patent Laid-Open No. 2001-330560 (hereinafter referred to as the surface plasmon resonance measuring apparatus of the present invention) (shown as FIG. 1 in this specification), and the diagram of the publication. 23 (hereinafter referred to as the dielectric block of the present invention) (shown as FIG. 2 in this specification).

図１に示す表面プラズモン共鳴測定装置は、測定ユニットを支持する支持体として、互いに平行に配された２本のガイドロッド400,400に摺動自在に係合し、それらに沿って図中の矢印Ｙ方向に直線移動自在とされたスライドブロック401が用いられている。そしてこのスライドブロック401には、上記ガイドロッド400,400と平行に配された精密ねじ402が螺合され、この精密ねじ402はそれとともに支持体駆動手段を構成するパルスモータ403によって正逆回転されるようになっている。   The surface plasmon resonance measuring apparatus shown in FIG. 1 slidably engages two guide rods 400, 400 arranged in parallel with each other as a support for supporting a measurement unit, and an arrow Y in FIG. A slide block 401 that is linearly movable in the direction is used. The slide block 401 is screwed with a precision screw 402 arranged in parallel with the guide rods 400, 400 so that the precision screw 402 is rotated forward and backward by a pulse motor 403 constituting the support driving means together with the precision screw 402. It has become.

なおこのパルスモータ403の駆動は、モータコントローラ404によって制御される。すなわちモータコントローラ404には、スライドブロック401内に組み込まれてガイドロッド400,400の長手方向における該スライドブロック401の位置を検出するリニアエンコーダ（図示せず）の出力信号Ｓ40が入力され、モータコントローラ404はこの信号Ｓ40に基づいてパルスモータ403の駆動を制御する。   The driving of the pulse motor 403 is controlled by a motor controller 404. That is, the motor controller 404 receives an output signal S40 of a linear encoder (not shown) that is incorporated in the slide block 401 and detects the position of the slide block 401 in the longitudinal direction of the guide rods 400, 400. Based on this signal S40, the drive of the pulse motor 403 is controlled.

またガイドロッド400,400の側下方には、それに沿って移動するスライドブロック401をそれぞれ左右から挟む形で、レーザ光源31および集光レンズ32と、光検出器40とが配設されている。集光レンズ32は光ビーム30を集光する。また、光検出器40が設置されている。   A laser light source 31, a condensing lens 32, and a light detector 40 are disposed below the guide rods 400, 400 so that slide blocks 401 that move along the guide rods 400 are sandwiched from the left and right. The condensing lens 32 condenses the light beam 30. In addition, a photodetector 40 is installed.

ここで本実施形態においては、一例として８個の測定ユニット10を連結固定してなるスティック状のユニット連結体410が用いられ、測定ユニット10は８個一列に並べた状態でスライドブロック401にセットされるようになっている。   Here, in the present embodiment, as an example, a stick-like unit connection body 410 formed by connecting and fixing eight measurement units 10 is used, and the eight measurement units 10 are set on the slide block 401 in a state of being arranged in a row. It has come to be.

図２は、このユニット連結体410の構造を詳しく示すものである。ここに示される通りユニット連結体410は、測定ユニット10が８個、連結部材411により連結されてなるものである。   FIG. 2 shows the structure of the unit connector 410 in detail. As shown here, the unit connection body 410 is formed by connecting eight measurement units 10 by connection members 411.

この測定ユニット10は、誘電体ブロック11と試料保持枠13とを例えば透明樹脂等から一体成形してなるものであり、ターンテーブルに対して交換可能な測定チップを構成している。交換可能とするためには、例えばターンテーブルに形成された貫通孔に、測定ユニット10を嵌合保持させる等すればよい。なお本例では、金属膜12の上にセンシング物質14が固定されている。   The measurement unit 10 is formed by integrally molding the dielectric block 11 and the sample holding frame 13 from, for example, a transparent resin, and constitutes a measurement chip that can be exchanged for the turntable. In order to make the exchange possible, for example, the measurement unit 10 may be fitted and held in a through hole formed in the turntable. In this example, the sensing substance 14 is fixed on the metal film 12.

（１）デキストラン測定チップの作製
金属膜として50nmの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分間処理した後、エタノール／水（80/20）中11−ヒドロキシ−1−ウンデカンチオールの5.0mM溶液を金属膜に接触するように添加し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。 (1) Preparation of dextran measurement chip The dielectric block of the present invention, in which 50 nm gold was deposited as a metal film, was treated with Model-208UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC.) For 30 minutes, and then ethanol / water (80 / 20) A 5.0 mM solution of 11-hydroxy-1-undecanethiol was added so as to contact the metal film, and surface treatment was performed at 25 ° C. for 18 hours. Thereafter, washing was performed 5 times with ethanol, once with an ethanol / water mixed solvent, and 5 times with water.

次に、11−ヒドロキシ−1−ウンデカンチオールで被覆した表面を10重量％のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：0.4M水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの1：1混合溶液）に接触させ、25℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。表面をエタノールで2回、水で5回洗浄した。   Next, the surface coated with 11-hydroxy-1-undecanethiol was brought into contact with a 10 wt% epichlorohydrin solution (solvent: 1: 1 mixture of 0.4 M sodium hydroxide and diethylene glycol dimethyl ether), The reaction was allowed to proceed for 4 hours in a shaking incubator. The surface was washed twice with ethanol and five times with water.

次に、25重量％のデキストラン（T500,Pharmacia）水溶液40.5mlに4.5mlの1M水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で25℃で20時間インキュベートした。表面を50℃の水で10回洗浄した。続いて、ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、28℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰り返した。   Next, 4.5 ml of 1 M sodium hydroxide was added to 40.5 ml of a 25 wt% aqueous dextran (T500, Pharmacia) solution and the solution was contacted on the epichlorohydrin treated surface. It was then incubated for 20 hours at 25 ° C. in a shaking incubator. The surface was washed 10 times with 50 ° C. water. Subsequently, a mixture of 3.5 g of bromoacetic acid dissolved in 27 g of 2M sodium hydroxide solution was brought into contact with the dextran-treated surface and incubated for 16 hours in a shaking incubator at 28 ° C. The surface was washed with water and then the above procedure was repeated once.

（２）リガンド固定チップの作成
上記（１）で作成したデキストラン測定チップ内の溶液を除去した後、200mM EDC(N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドハイドロクロライド)と50mM NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)の混合溶液70μlを添加し、10分間放置した。混合溶液を除去した後、100μlの水で3回、100μlのPBS7.4（実施例1.と同義）で3回洗浄した。PBS7.4を100μl入れた状態でこのチップを本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置し、チップ内をヒト血清アルブミン（以下HSAと略す）シグマ社製5mgをPBS7.4 1mlに溶解したものをさらにAcetate5.0バッファーで10倍に希釈した溶液100μlに入れ替え30分間放置し、HSAを固定した。チップ内を1M エタノールアミン溶液（pH8.5）（biacore社製）に置き換え、10分間放置した。チップ内を100μlのPBS7.4で10回洗浄した。 (2) Preparation of ligand-immobilized chip After removing the solution in the dextran measurement chip prepared in (1) above, 200 mM EDC (N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) and 50 mM NHS 70 μl of a mixed solution of (N-hydroxysuccinimide) was added and left for 10 minutes. After removing the mixed solution, the plate was washed 3 times with 100 μl of water and 3 times with 100 μl of PBS 7.4 (synonymous with Example 1). This chip was placed in the surface plasmon resonance measuring device of the present invention with 100 μl of PBS7.4, and 5 mg of human serum albumin (hereinafter abbreviated as HSA) made by Sigma was dissolved in 1 ml of PBS7.4. Furthermore, the solution was replaced with 100 μl diluted 10-fold with Acetate 5.0 buffer and allowed to stand for 30 minutes to immobilize HSA. The inside of the chip was replaced with a 1M ethanolamine solution (pH 8.5) (manufactured by biacore) and left for 10 minutes. The inside of the chip was washed 10 times with 100 μl of PBS7.4.

（３）参照チップの作成：
上記（１）で作成したデキストラン測定チップ内の溶液を除去した後、200mM EDCと50mM NHSの混合溶液70μlを添加し、10分間放置した。混合溶液を除去した後、100μlの水で3回、100μlのPBS7.4で3回洗浄した。チップ内を1M エタノールアミン溶液に置き換え、10分間放置した。チップ内を100μlのPBS7.4で10回洗浄した。 (3) Creation of reference chip:
After removing the solution in the dextran measurement chip prepared in (1) above, 70 μl of a mixed solution of 200 mM EDC and 50 mM NHS was added and left for 10 minutes. After removing the mixed solution, it was washed 3 times with 100 μl of water and 3 times with 100 μl of PBS7.4. The inside of the chip was replaced with a 1M ethanolamine solution and left for 10 minutes. The inside of the chip was washed 10 times with 100 μl of PBS7.4.

（４）流路系の作成
本発明のHSA固定チップに対し、誘電体ブロックをシリコンゴムでふたをすることで、内容積１５μlのセルを作成した。また、ふたのシリコンゴムに２箇所、1mm径の穴をあけ、内径0.5mm、外径1mmのテフロンチューブを通し、流路を作成した。同様に参照チップにもふた、流路を作成し、２つのチップを直列につなぎ、流路系を作成した。この流路系の２つのチップをそれぞれ、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置した。 (4) Creation of flow path system A cell having an internal volume of 15 μl was created by covering the dielectric block of the HSA fixed chip of the present invention with silicon rubber. Two channels of 1mm diameter were made in the silicon rubber of the lid, and a Teflon tube with an inner diameter of 0.5mm and an outer diameter of 1mm was passed through to create a flow path. Similarly, a lid and a flow path were created for the reference chip, and the two chips were connected in series to create a flow path system. Two chips of this flow path system were respectively installed in the surface plasmon resonance measuring apparatus of the present invention.

（５）被験物質の結合性能評価
流路系内を5重量％のDMSOを含有するリン酸緩衝液10mM（pH7.4）（以下5％DMSO/PBS7.4と略す）で満たした。液交換前を基準とした信号変化を0.5秒間隔で測定した。流路系内を20μl/secの速度で、被験化合物（実施例１で使用したものと同じ５０種類の化合物を10μg/mlになるよう5％DMSO/PBS7.4に溶解したもの）に置き換えた。置き換えに要した時間は５秒であった。 (5) Evaluation of binding performance of test substance The inside of the flow path system was filled with a phosphate buffer solution 10 mM (pH 7.4) containing 5 wt% DMSO (hereinafter abbreviated as 5% DMSO / PBS7.4). The signal change with reference to the time before liquid exchange was measured at 0.5 second intervals. The inside of the flow path system was replaced with the test compound (50 compounds same as those used in Example 1 dissolved in 5% DMSO / PBS7.4 to 10 μg / ml) at a rate of 20 μl / sec. . The time required for the replacement was 5 seconds.

液交換開始５秒後以降は、液の流れを停止させた。液置換５秒後から２分後までのデータを使用し、被検物質の結合定数（KD）を求めた。
結合定数は、以下の方法で算出した。 The liquid flow was stopped after 5 seconds from the start of the liquid exchange. Using data from 5 seconds to 2 minutes after liquid replacement, the binding constant (KD) of the test substance was determined.
The binding constant was calculated by the following method.

即ち、表面プラズモン共鳴の信号変化の測定結果から、下記式（１）、（２）及び（３）を用いることによって吸着速度係数（ka）及び離脱速度係数（kd）を求め、求めた吸着速度係数（ka）及び離脱速度係数（kd）から、KD＝kd／ka表される式により解離定数（KD）を算出した。   That is, from the measurement result of the signal change of surface plasmon resonance, the adsorption rate coefficient (ka) and the desorption rate coefficient (kd) are obtained by using the following formulas (1), (2) and (3), and the obtained adsorption rate is obtained. From the coefficient (ka) and the separation rate coefficient (kd), the dissociation constant (KD) was calculated by the equation represented by KD = kd / ka.

ｄθ／ｄｔ＝ka×ｃ_s×（１−θ）−kd×θ （１）
（式中、θは吸着率（＝吸着量／飽和吸着量）、kaは吸着速度係数、kdは離脱速度係数、ｃ_sは金属表面近傍の被解析分子の濃度を表す。）
∂ｃ／∂ｔ＝Ｄ×∂²ｃ／∂ｘ² （２）
（式中、ｘは金属表面からの距離、Ｄは被解析分子の拡散係数、ｃは被解析分子の濃度を表し、ｘ＝０のときｃ＝ｃ_sとなる。）
θ＝Ｒ／Ｒｍａｘ （３）
（式中、θは吸着率（＝吸着量／飽和吸着量）を示し、Ｒは表面プラズモン信号を示し、Ｒｍａｘは被解析分子が飽和吸着したときの信号を表す。） _{dθ / dt = ka × c s} × (1-θ) -kd × θ (1)
(In the formula, θ represents the adsorption rate (= adsorption amount / saturated adsorption amount), ka represents the adsorption rate coefficient, kd represents the desorption rate coefficient, and c _s represents the concentration of the molecule to be analyzed in the vicinity of the metal surface.)
^{∂c / ∂t = D × ∂ 2} c / ∂x 2 (2)
(Distance from wherein, x is a metal surface, D is the diffusion coefficient of the analyte molecule, c is represents the concentration of the analyte molecule, and c = c _s when x = 0.)
θ = R / Rmax (3)
(In the formula, θ represents an adsorption rate (= adsorption amount / saturated adsorption amount), R represents a surface plasmon signal, and Rmax represents a signal when the molecule to be analyzed is saturated adsorbed.)

実施例２は、実施例１と同様な結果を得られると共に、液使用量低減、ベースラインノイズ低減の効果が見られた。   In Example 2, the same results as in Example 1 were obtained, and the effects of reducing the amount of liquid used and reducing baseline noise were observed.

図１は、実施例で用いた表面プラズモン共鳴測定装置を示す。FIG. 1 shows a surface plasmon resonance measuring apparatus used in the examples. 図２は、実施例で用いた誘電体ブロックを示す。FIG. 2 shows a dielectric block used in the example.

符号の説明Explanation of symbols

１０ 測定ユニット
１１ 誘電体ブロック
１２ 金属膜
１３ 試料保持枠
１４ センシング物質
３０ 光ビーム
３１ レーザ光源
３２ 集光レンズ
４０ 光検出器
Ｓ４０ 出力信号
４００ ガイドロッド
４０１ スライドブロック
４０２ 精密ねじ
４０３ パルスモータ
４０４ モータコントローラ
４１０ ユニット連結体
４１１ 連結部材


DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Measurement unit 11 Dielectric block 12 Metal film 13 Sample holding frame 14 Sensing substance 30 Light beam 31 Laser light source 32 Condensing lens 40 Photodetector S40 Output signal 400 Guide rod 401 Slide block 402 Precision screw 403 Pulse motor 404 Motor controller 410 Unit connector 411 connecting member

Claims (7)

リガンドと被験物質との相互作用を少なくとも２種類以上の環境下で測定することを含む、リガンドと被験物質との相互作用の測定方法。 A method for measuring an interaction between a ligand and a test substance, comprising measuring an interaction between the ligand and the test substance in at least two kinds of environments. リガンドと被験物質との相互作用を測定する環境が、温度、pH、塩濃度、金属イオン濃度、又は基質濃度を変化させた環境である、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the environment for measuring the interaction between the ligand and the test substance is an environment in which the temperature, pH, salt concentration, metal ion concentration, or substrate concentration is changed. リガンドと被験物質との相互作用を非電気的方法で測定する、請求項１又は２に記載の方法。 The method according to claim 1 or 2, wherein the interaction between the ligand and the test substance is measured by a non-electric method. リガンドと被験物質との相互作用を表面プラズモン共鳴分析法で測定する、請求項１から３の何れかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the interaction between the ligand and the test substance is measured by surface plasmon resonance analysis. 金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用いて、前記流路系内の液体を被験物質を含まない溶液から被験物質を含む溶液へと交換して表面プラズモン共鳴の変化を測定することによって、リガンドと被験物質との相互作用を分析する、請求項１から４の何れかに記載の方法。 A metal film; a light source that generates a light beam; an optical system that causes the light beam to be incident so that a total reflection condition is obtained at an interface with the metal film and includes various incident angle components; and the metal film Using a surface plasmon resonance measuring apparatus comprising a flow path system including cells formed thereon and light detection means for detecting the state of surface plasmon resonance by measuring the intensity of a light beam totally reflected at the interface Analyzing the interaction between the ligand and the test substance by exchanging the liquid in the flow path system from a solution not containing the test substance to a solution containing the test substance and measuring the change in surface plasmon resonance, The method according to claim 1. 流路系内の液体を、被験物質を含まない溶液から被験物質を含む溶液へと交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定する、請求項５に記載の方法。 The method according to claim 5, wherein the change in surface plasmon resonance is measured in a state where the flow of the liquid is stopped after exchanging the liquid in the flow path system from a solution containing no test substance to a solution containing the test substance. . 請求項１から６の何れかに記載の方法によりリガンドと被験物質との相互作用を測定し、異なる環境下における相互作用の程度の差が大きい被験物質を候補物質として同定する、候補物質のスクリーニング方法。


A candidate substance screening, wherein the interaction between a ligand and a test substance is measured by the method according to any one of claims 1 to 6, and a test substance having a large difference in the degree of interaction in different environments is identified as a candidate substance. Method.

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