JP2006061019A - Method for measuring saccharification rate of specific protein and disposable inspection device for measuring saccharification rate of specific protein - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血液中の特定タンパク質の糖化割合を測定する方法及び同糖化割合の測定用に用いられる使い捨て検査具に関する。 The present invention relates to a method for measuring a glycation ratio of a specific protein in blood and a disposable test instrument used for measuring the glycation ratio.
従来から、糖尿病患者等の血糖レベルを観察するために血液中のアルブミンの糖化割合（相対濃度）を測定することが行われている。
ここで、アルブミンは血液（血漿）中の主なタンパク質であり、糖化されたアルブミンは糖化アルブミン又はグリコアルブミン（ＧＡ）と呼ばれる。アルブミンの糖化割合は、グリコアルブミン濃度とトータルアルブミン濃度との比により決まる。
この糖化アルブミン相対濃度は、過去２〜３週間の血糖レベルの平均と比例するため、糖尿病患者の過去２〜３週間の血糖平均レベルを反映する安定な血糖指標として広く使用されてきている。
また、安定な血糖レベルを反映する他の指標として、ヘモグロビンの糖化割合（ＨｂＡ１Ｃ、相対濃度）及びフルクトサミンの糖化割合（ＦＡ、相対濃度）等がある。グリコヘモグロビンは、過去１ヶ月〜２ヶ月の血糖レベルを反映する指標として広く認識され、またフルクトサミンは約過去１〜２週間の血糖レベルを反映する指標と認識されている。
上記した糖化アルブミン相対濃度を測定するためには血液中の糖化アルブミンと総アルブミンとを測定する必要があり、グリコヘモグロビン相対濃度を測定するためには糖化グリコヘモグロビンと総ヘモグロビンとを測定する必要があり、また、フルクトサミン相対濃度を測定するためには、総糖化タンパク質と血漿総タンパク質とを測定する必要がある。
このような糖化アルブミン及び総アルブミン、糖化グリコヘモグロビン及び総ヘモグロビン、又は総糖化タンパク質及び血漿総タンパク質の測定には、通常、液クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、電気泳動、免疫等の方法が用いられる。
最近ではタンパク質分解酵素プロテアーゼを用いてアルブミンの糖化割合を測定する方法も開発され応用されてきている。
この従来の酵素測定方法では、患者の血液サンプル（血漿、又は血清）にプロテアーゼを混合してアルブミン中の糖化アルブミンを切断し、糖化ε―リジンを生成させる。次に、この糖化ε―リジンをフルクトシルアミンオキシダーゼ（ＦＡＯＤ）酸化酵素で過酸化水素へ酸化し、呈色反応で酸化反応により生成された過酸化水素濃度を測定し、糖化ε―リジンの量を得る。得た糖化ε―リジンの量に基づいて糖化アルブミンの量を求める。そして、別途、同じ血液サンプルを用いて非酵素法の呈色反応でアルブミン総量を測定する。最後に、二つの異なる測定から得られた糖化アルブミンの量と総アルブミンの量との比でアルブミンの糖化割合を求める（特許文献１、２）。ここの総アルブミンの量を測定するための非酵素法では、BCG（ブロムクレゾールグリーン）又はBCP（ブロムクレゾールパープル）等の発色試薬を使用している。この発色試薬を血液中のアルブミンと結合させ、生成する色素の光学的な吸収特性の変化によってアルブミンは測定される。
別の方法として、プロテアーゼを用いて血液中の特定タンパク質から糖化ペプチド及び非糖化ペプチドに切断し、生成された糖化ペプチド及び非糖化ペプチドを分離精製した後に、それぞれ測定し、その比率から特定タンパク質の糖化割合（相対濃度）を得る方法も提案されている（特許文献３）。
Conventionally, in order to observe the blood glucose level of a diabetic patient or the like, the glycation ratio (relative concentration) of albumin in blood has been measured.
Here, albumin is a main protein in blood (plasma), and glycated albumin is called glycated albumin or glycoalbumin (GA). The saccharification ratio of albumin is determined by the ratio between the glycoalbumin concentration and the total albumin concentration.
Since this relative concentration of glycated albumin is proportional to the average blood glucose level over the past 2-3 weeks, it has been widely used as a stable blood glucose index reflecting the average blood glucose level over the past 2-3 weeks for diabetic patients.
Other indicators that reflect a stable blood glucose level include hemoglobin saccharification rate (HbA1C, relative concentration), fructosamine saccharification rate (FA, relative concentration), and the like. Glycohemoglobin is widely recognized as an index reflecting the blood sugar level of the past one to two months, and fructosamine is recognized as an index reflecting the blood sugar level of about the past one to two weeks.
In order to measure the relative concentration of glycated albumin, it is necessary to measure glycated albumin and total albumin in the blood, and in order to measure the relative concentration of glycated hemoglobin, it is necessary to measure glycated glycated hemoglobin and total hemoglobin. In addition, in order to measure the relative concentration of fructosamine, it is necessary to measure total glycated protein and plasma total protein.
For measurement of such glycated albumin and total albumin, glycated glycohemoglobin and total hemoglobin, or total glycated protein and plasma total protein, methods such as liquid chromatography (HPLC), electrophoresis and immunization are usually used.
Recently, a method for measuring the rate of saccharification of albumin using a protease enzyme has been developed and applied.
In this conventional enzyme measurement method, protease is mixed with a blood sample (plasma or serum) of a patient to cleave glycated albumin in albumin to produce glycated ε-lysine. Next, this glycated ε-lysine is oxidized to hydrogen peroxide with fructosylamine oxidase (FAOD) oxidase, and the concentration of hydrogen peroxide produced by the oxidation reaction in the color reaction is measured. Get. The amount of glycated albumin is determined based on the amount of glycated ε-lysine obtained. Separately, the total amount of albumin is measured by a non-enzymatic color reaction using the same blood sample. Finally, the ratio of saccharified albumin obtained from two different measurements and the amount of total albumin is determined to determine the saccharification ratio of albumin (
As another method, a protease is used to cleave a specific protein in blood into a glycated peptide and a non-glycated peptide, and the resulting glycated peptide and non-glycated peptide are separated and purified, and each is measured and the ratio of the specific protein is determined from the ratio. A method for obtaining a saccharification ratio (relative concentration) has also been proposed (Patent Document 3).
しかし、上記した従来の特定タンパク質の糖化割合測定方法で用いられるＨＰＬＣ、電気泳動及び免疫法等は、煩雑な操作及び高価かつ大型な専用装置が必要である。
また、特許文献１及び２に開示された方法は、糖化アルブミンの量と総アルブミンの量とは全く別々の方法で測定するので、煩雑である。又、これらの方法は、アルブミン総量を測定するためにBCG又はBCPのような発色試薬が用いられているが、これらの発色試薬はアルブミンに対する特異性が低いため、交差反応によりアルブミン濃度測定の誤差が生じる場合がある。例えば、低アルブミン血症の血液や、A/G(アルブミン対グロブリンの比)の低い血液では、総アルブミン測定の高値が生じ易い（文献：生物試料分析、2004 Vol.27、No.2, P97；文献：日本臨床検査自動化学会第３５回大会抄録集、演題２４１〜演題２４６）。このような測定誤差は間接的にアルブミン糖化割合に影響するので好ましくない。また、特許文献１及び２に開示された方法では、糖化アルブミンの量と総アルブミンの量は異なる方法で測定するため使い捨ての測定カード等の検査具では実施することが困難である。
特許文献３に提案された測定方法は、血液とプロテアーゼと反応させて生成された糖化ペプチドと非糖化ペプチドとを分離・精製してから測定する。このため、糖化ペプチドと非糖化ペプチドとを分離・精製工程が必須である。しかし、糖化ペプチド及び非糖化ペプチドの分離・精製処理は非常に煩雑であり、大型な装置及び高価な材料を必要とする。そのため特許文献３に提案された方法は、使い捨ての測定カード等の検査具では実施することが困難である。
一方で、糖尿病患者の血糖レベルを反映する安定な指標としてのタンパク質の糖化割合は定期的に検査する必要があり、使い捨ての測定カード等の簡易検査具により簡単に、かつ、安価に測定することが望ましい。
本発明は、上記した従来の問題点を解決し、使い捨ての測定カード等に適用することが可能な特定タンパク質の糖化割合測定方法及び特定タンパク質の糖化割合測定用使い捨て検査具を提供することを目的としている。
However, HPLC, electrophoresis, immunization, and the like used in the above-described conventional methods for measuring the glycation ratio of a specific protein require complicated operations and expensive and large dedicated devices.
In addition, the methods disclosed in
The measurement method proposed in Patent Document 3 performs measurement after separating and purifying a glycated peptide and a non-glycated peptide produced by reacting blood with a protease. For this reason, the separation / purification process of glycated peptide and non-glycated peptide is essential. However, separation / purification of glycated peptides and non-glycated peptides is very complicated, and requires a large apparatus and expensive materials. Therefore, it is difficult to implement the method proposed in Patent Document 3 with an inspection tool such as a disposable measurement card.
On the other hand, the glycation ratio of protein as a stable index that reflects the blood glucose level of diabetic patients needs to be examined regularly, and should be measured easily and inexpensively with a simple test tool such as a disposable measurement card. Is desirable.
An object of the present invention is to solve the above-described conventional problems and to provide a method for measuring a glycation ratio of a specific protein and a disposable test tool for measuring the glycation ratio of a specific protein that can be applied to a disposable measurement card or the like. It is said.
上記した目的を達成するために本発明に係る特定タンパク質の糖化割合測定方法は、血液中の特定タンパク質の糖化割合を測定する方法であって、前記特定タンパク質に特異的に作用するプロテアーゼと血液とを混合し、血液中の特定タンパク質から糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを切断すると共に、血液中の特定タンパク質から非糖化アミノ酸及び非糖化ペプチドを切断する工程と、前記切断により生成された糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの中の特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドと、これらに特異的に反応する酸化酵素とを反応させて反応により生成又は消費される物質の濃度を測定する工程Ａと、前記切断により生成された非糖化アミノ酸の中の特定の非糖化アミノ酸と、それに特異的に反応する酸化酵素とを反応させて反応により生成又は消費される物質の濃度を測定する工程Ｂと、前記工程Ａと前記工程Ｂとで測定した生成又は消費される物質の濃度に基づいて特定タンパク質中の糖化タンパクの量及び特定タンパク質の総量を演算する工程と、求めた特定糖化タンパクの量及び特定タンパク質の総量の比率に基づいて特定タンパク質の糖化割合を求める工程とより成ることを特徴とする。 In order to achieve the above object, a method for measuring a glycation ratio of a specific protein according to the present invention is a method for measuring a glycation ratio of a specific protein in blood, comprising a protease that specifically acts on the specific protein and blood. And cleaving glycated amino acids and glycated peptides from specific proteins in blood, cleaving non-glycated amino acids and non-glycated peptides from specific proteins in blood, and glycated amino acids and glycated peptides generated by the cleaving A step A for measuring the concentration of a substance produced or consumed by the reaction by reacting a specific glycated amino acid and a glycated peptide in the oxidase and an oxidase that specifically reacts with the glycated amino acid; By reacting a specific non-glycated amino acid in a glycated amino acid with an oxidase that specifically reacts with it. Step B for measuring the concentration of the produced or consumed substance, and the amount of glycated protein in the specific protein and the total amount of the specific protein based on the concentration of the produced or consumed substance measured in Step A and Step B And a step of obtaining a glycation ratio of the specific protein based on the ratio of the obtained amount of the specific glycated protein and the total amount of the specific protein.
好ましくは、プロテアーゼと混合して反応させた後の血液を、二つに分ける工程を有する。その場合には、一方の血液に、特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドに特異的に反応する酸化酵素を混合し、特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドと前記酸化酵素との酵素反応により生成又は消費された物質濃度を測定すると共に、他方の血液に、特定の非糖化アミノ酸に特異的に反応する酸化酵素を混合し、特定の非糖化アミノ酸と前記酸化酵素との酵素反応により生成又は消費された物質濃度を測定し、一方の血液から測定した物質濃度と、他方の血液から測定した物質濃度から特定タンパク質中糖化タンパク質の量及び特定タンパク質総量を演算し出し、演算した特定糖化タンパク質の量及び特定タンパク質総量との比率に基づいて特定タンパク質の糖化割合が求められ得る。 Preferably, the method has a step of dividing the blood after mixing with protease and reacting it into two. In that case, one blood was mixed with an oxidase that specifically reacts with a specific glycated amino acid and a glycated peptide, and was produced or consumed by an enzymatic reaction between the specific glycated amino acid and glycated peptide and the oxidase. The concentration of the substance produced or consumed by measuring the substance concentration, mixing an oxidase that specifically reacts with a specific non-glycated amino acid into the other blood, and an enzymatic reaction between the specific non-glycated amino acid and the oxidase The amount of glycated protein in the specific protein and the total amount of the specific protein are calculated from the substance concentration measured from one blood and the substance concentration measured from the other blood, and the calculated amount of the specific glycated protein and the total amount of the specific protein are calculated. The glycation ratio of a specific protein can be determined based on the ratio of
前記特定タンパク質として、アルブミン、グリコヘモグロビン、又はフルクトサミン等が測定され得る。
タンパク質の種類、使用するタンパク分解酵素プロテアーゼの種類、特異性及び反応条件等によって切断産物が異なる。切断産物の中には、様々な種類の糖化アミノ酸、糖化ペプチド及び非糖化アミノ酸が含まれる。
本発明では、これらの糖化アミノ酸、糖化ペプチド及び非糖化アミノ酸の中から、特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチド、又は特定の非糖化アミノ酸を選択し、それらに特異的に作用する酸化酵素を用いて測定対象物質を測定する。
As the specific protein, albumin, glycohemoglobin, fructosamine or the like can be measured.
The cleavage products vary depending on the type of protein, the type of protease used, the specificity and reaction conditions. Among the cleavage products, various types of glycated amino acids, glycated peptides and non-glycated amino acids are included.
In the present invention, specific glycated amino acids and glycated peptides or specific non-glycated amino acids are selected from these glycated amino acids, glycated peptides and non-glycated amino acids, and measurement is performed using an oxidase that specifically acts on them. Measure the target substance.
前記プロテアーゼは、
少なくとも、特定タンパク質以外の他タンパク質から測定対象となる特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチド、並びに特定の非糖化アミノ酸を切断せず、血液中の特定のタンパク質に特異的作用し、効率よく、糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを切断すると共に、非糖化アミノ酸及び非糖化ペプチドを切断することができる種のプロテアーゼが用いられ得る。
具体的には、例えば、
動物由来のエラスターゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等、又は、
植物由来のカリクレイン、フィシン、パパイン、キモパパイン等、又は、
微生物由来のバチルス属由来プロテアーゼ、ズブチリシン、プロテアーゼタイプ-VIII, -IX, -X, -XV, -XXIV, -XXVII, -XXXI(シグマ社)、ナガーゼ（和光純薬）、オリエンターゼー９０N、−１０NL、−２２BF、−Y、−５BL、ヌクレイシン（阪急バイオインタダストリー社）、プロレザー、プロテアーゼ-N、−NL、−S（天野）、プロチンーA、−P、デスキン、デピレイス、ビオソーク、サモアーゼ（大和化成）、ニュートラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、アルカラーゼ、ピラーゼ（ノボノルディスクバイオ）、エンチロンーNBS、−SA（洛東）、アルカリプロテアーゼGL440、オプティクリンーM375プラス、−L1000、−ALP440（協和発酵）、ビオプラーゼAPL-30、SP-4FG、XL-416F、AL-15FG（ナガセ）、アロアーゼAP-10、プロテアーゼY（ヤクルト）、コロラーゼーN、−７０８９、ベロンW（樋口商会）、キラザイムP-1（ロシュ）等
がプロテアーゼとして用いられ得る。
The protease is
At least a specific glycated amino acid and a glycated peptide to be measured from a protein other than the specific protein, and a specific non-glycated amino acid without cleaving, and specifically acting on a specific protein in blood, efficiently, Any protease that can cleave glycated peptides and cleave non-glycated amino acids and non-glycated peptides can be used.
Specifically, for example,
Elastase from animals, pepsin, trypsin, chymotrypsin, etc., or
Plant-derived kallikrein, ficin, papain, chymopapain, etc., or
Microorganism-derived Bacillus-derived protease, subtilisin, protease type-VIII, -IX, -X, -XV, -XXIV, -XXVII, -XXXI (Sigma), Nagase (Wako Pure Chemical Industries), Orientase 90N,- 10NL, -22BF, -Y, -5BL, Nucleicin (Hankyu Bio Interdustry), Pro Leather, Protease-N, -NL, -S (Amano), Protin-A, -P, Deskin, Depilace, Biosoak, Samoaase (Daiwa Kasei), Neutase, Esperase, Sabinase, Alcalase, Pyrase (Novo Nordisk Bio), Entilon-NBS, -SA (Pingtung), Alkaline protease GL440, Opticlin-M375 plus, -L1000, -ALP440 (Kyowa Hakko) ), Biolase APL-30, SP-4FG, XL-416F, AL-15FG (Nagase), Alloase AP-10, Protease Y (Yakult), Corolase N, -708 , Veron W (Higuchi Shokai) Chirazyme P-1 (Roche) and the like can be used as a protease.
特定タンパク質総量は、プロテアーゼ反応により切断された非糖化アミノ酸の中の特定の非糖化アミノ酸と、それに特異的に反応する酸化酵素との反応により生成又は消費される物質の濃度に基づいて算出される。
この場合、酸化酵素の種類は限定されることがない。例えば、特定の非糖化アミノ酸として、非糖化リジンを酸化酵素法で測定する場合には、LyODが用いることができる。また、特定の非糖化アミノ酸として非糖化グルタミン酸を酸化酵素法で測定する場合には、グルタミン酸オキシダーゼを用いることができる。
The total amount of the specific protein is calculated based on the concentration of the substance produced or consumed by the reaction of the specific non-glycated amino acid among the non-glycated amino acids cleaved by the protease reaction and the oxidase specifically reacting with the specific non-glycated amino acid. .
In this case, the type of oxidase is not limited. For example, when a non-glycated lysine is measured by an oxidase method as a specific non-glycated amino acid, LyOD can be used. Moreover, when measuring non-glycated glutamic acid as a specific non-glycated amino acid by an oxidase method, glutamic acid oxidase can be used.
特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの量を測定するために用いられる酸化酵素は、測定すべき糖化アミノ酸及び糖化ペプチドに特異的に反応する酸化酵素であれば任意の酸化酵素を利用することができる。具体的には、例えば、特定の糖化アミノ酸が糖化ε―リジンの場合、フルクトシルリジンオキシダーゼ、ケトアミンオキシダーゼ、又はフルクトシルアミンオキシダーゼ等を用いることができる。
プロテアーゼを利用して特定糖化タンパク質を切断する場合、プロテアーゼの種類や反応条件によってアミノ酸配列の切断する箇所が異なる為、生成される産物の中に通常糖化アミノ酸及び糖化ペプチド両方が含まれる。特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチド両方に反応する酸化酵素を使用することにより、より高い感度を得ることができる。
具体的には、特定糖化タンパク質が糖化アルブミンの場合、糖化ε―リジンと糖化ε―リジン残基を含むペプチドと両方に反応する酸化酵素のFPOXを用いる事が好ましい。
これらの酸化酵素の酸化反応により生成した過酸化水素又は消費した酸素の量は、公知の検出手段によって測定する事ができる。例えば過酸化水素を検出する場合、光学的に測定する場合、ペルオキシダーゼ（POD）及び発色試薬を用いた呈色反応を利用し、過酸化水素の濃度に比例した色素の吸光度変化を反射光又は透過光で検出する事ができる。また、電気的に測定する場合、アンペロメトリック電極法等が利用できる。具体的には、貴金属又はカーボン等の作用極と対極（必要に応じて参照極も）から構成した電極に、一定の電位を印加することによって、作用極表面の過酸化水素が酸化される。この電極表面の酸化反応で発生した酸化電流は過酸化水素濃度に比例するので、過酸化水素の濃度を測定する事ができる。
As the oxidase used for measuring the amount of the specific glycated amino acid and glycated peptide, any oxidase can be used as long as it is an oxidase that specifically reacts with the glycated amino acid and glycated peptide to be measured. Specifically, for example, when the specific glycated amino acid is glycated ε-lysine, fructosyl lysine oxidase, ketoamine oxidase, or fructosylamine oxidase can be used.
When a specific glycated protein is cleaved using a protease, the amino acid sequence is cleaved at different sites depending on the type of protease and reaction conditions, so that both the glycated amino acid and the glycated peptide are usually included in the generated product. By using an oxidase that reacts with both specific glycated amino acids and glycated peptides, higher sensitivity can be obtained.
Specifically, when the specific glycated protein is glycated albumin, it is preferable to use FPOX, an oxidase that reacts with both glycated ε-lysine and a peptide containing a glycated ε-lysine residue.
The amount of hydrogen peroxide produced or consumed by the oxidation reaction of these oxidases can be measured by a known detection means. For example, when hydrogen peroxide is detected or optically measured, a color reaction using a peroxidase (POD) and a coloring reagent is used to reflect the change in absorbance of the dye in proportion to the concentration of hydrogen peroxide. It can be detected with light. Moreover, when measuring electrically, the amperometric electrode method etc. can be utilized. Specifically, hydrogen peroxide on the surface of the working electrode is oxidized by applying a constant potential to an electrode composed of a working electrode such as a noble metal or carbon and a counter electrode (also a reference electrode if necessary). Since the oxidation current generated by the oxidation reaction on the electrode surface is proportional to the hydrogen peroxide concentration, the concentration of hydrogen peroxide can be measured.
使用する酸化酵素の種類によっては、血液中に残留するプロテアーゼの影響を受ける酵素もあるので、必要に応じて、特定タンパク質の切断後の血液に、酸化酵素を混合する前に、プロテアーゼ阻害物質を混合し、プロテアーゼを失活させ得る。プロテアーゼの種類によって、使用する阻害物質の種類も異なる。
例えば、
セリンプロテアーゼの場合は、DFP(ヂイソプロピルフルオロリン酸)、PMSF（フェニルメタンスルホニルフルオリド）等、
チオールプロテアーゼの場合は、NEM(N-エチルマレイミド)、ロイペプチン等、
カルポキシルプロテアーゼの場合は、ペプスタチンA等、又、
メタロプロテアーゼの場合は、EDTA、O-フェナンスロリン、TIMP-1等
が用いられ得る。
また、場合によっては複数種類の阻害物質を選んで混合して使用することもできる。
Depending on the type of oxidase used, some enzymes are affected by proteases remaining in the blood, so if necessary, before mixing the oxidase into the blood after cleavage of a specific protein, add a protease inhibitor. Mix to inactivate protease. The type of inhibitor used varies depending on the type of protease.
For example,
In the case of serine protease, DFP (diisopropylfluorophosphate), PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride), etc.
In the case of thiol protease, NEM (N-ethylmaleimide), leupeptin, etc.
In the case of carboxyoxyl protease, pepstatin A, etc.
In the case of a metalloprotease, EDTA, O-phenanthroline, TIMP-1, etc. can be used.
In some cases, a plurality of types of inhibitors can be selected and mixed for use.
また、酵素法を用いて血液中の特定タンパク質から切断した糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの中の特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの量を測定する場合、切断前から血液中に遊離している特定の糖化アミノ酸及び／又は特定の糖化ペプチドの影響を受ける事がある。なぜなら、これらの遊離している特定の糖化アミノ酸及び／又は特定の糖化ペプチドが、測定すべき特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドと同一物質である場合、これら遊離している特定の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドが前記酸化酵素により酸化され、測定目的物質である特定糖化タンパク質から切断した糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの中の特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの測定に正の誤差を与えることになる。具体的には、例えば、糖化アルブミンを測定する場合、切断前から血液中に遊離する糖化ε―リジン（血液中の内因性糖化ε―リジン及びビタミン製剤由来の糖化アミノ酸）が、測定目的物質である糖化アルブミンから切断した糖化ε―リジンと同様に特異的な酸化酵素と反応する為、酸化酵素としてのFPOXとを混合する時に、切断前から血液中に遊離していた糖化ε―リジンもFPOXにより酸化されてしまうため、結果として、糖化アルブミン濃度測定に正の誤差を与えることになる。
そのため、血液とプロテアーゼを混合する前に、必要に応じて、予め血液中に遊離する特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを除去する工程を設け、血液中に遊離する特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを除去しておくことができる。具体的な方法としては、公知の夾雑物質除去する方法が用いられ得る。
例えば、文献（生体成分の酵素的分析法、P205、村地孝著、講談社出版、１９８５）に記載されている方法がある。例えば、予め、血液をFPOX、POD、及びカタラーゼと混合させ、血液中に遊離する特定の糖化アミノ酸（糖化ε―リジン）及び特定の糖化ペプチドを過酸化水素へ変換する。さらに、生成された過酸化水素をカタラーゼにより消費させる。残ったカタラーゼは次の工程においてアジ化ナトリウムを混合することにより失活させることができる。また、残ったFPOXは、次の工程において混合されるプロテアーゼにより失活される。これにより、以降の処理工程に影響を及ぼすことなく、血液中の内因性特定糖化アミノ酸及び特定糖化ペプチドを血液から除去することができる。
同文献（生体成分の酵素的分析法、P205、村地孝著、講談社出版、１９８５）には、もう一つの内因性物質除去する方法が開示されている。具体的には、例えば、FPOX-POD-TOOS-４AA発色系を利用して糖化ε―リジンを測定する場合、まず、FPOX、POD、TOOS（４AA除き）を検体と混合させ、FPOXと血液中に遊離する糖化ε―リジンとを反応させる。生成した過酸化水素はPOD-TOOSと反応して測定に影響しない物質へ変化させる。４AAはプロテアーゼ反応の後に測定系に添加してから発色させるので、血液中遊離する内因性糖化ε―リジンの影響を受けずに正確に測定する事ができる。
In addition, when measuring the amount of glycated amino acids and glycated peptides in glycated amino acids and glycated peptides cleaved from specific proteins in blood using an enzymatic method, specific glycation released in the blood before cleaving May be affected by amino acids and / or certain glycated peptides. Because, when these free specific glycated amino acids and / or specific glycated peptides are the same substance as the specific glycated amino acids and glycated peptides to be measured, these free specific glycated amino acids and / or The glycated peptide is oxidized by the oxidase and gives a positive error in the measurement of the specific glycated amino acid and the glycated peptide in the glycated amino acid and the glycated peptide cleaved from the specific glycated protein which is the measurement target substance. Specifically, for example, when glycated albumin is measured, glycated ε-lysine (endogenous glycated ε-lysine in blood and glycated amino acid derived from vitamin preparation) released into the blood before cleavage is the target substance to be measured. Like glycated ε-lysine cleaved from glycated albumin, it reacts with specific oxidase, so when FPOX as oxidase is mixed, glycated ε-lysine released in the blood before cleaving is also FPOX. As a result, a positive error is given to the measurement of glycated albumin concentration.
Therefore, before mixing blood and protease, if necessary, a step to remove specific glycated amino acids and glycated peptides that are released into the blood in advance is provided to remove specific glycated amino acids and glycated peptides that are released into the blood. Can be kept. As a specific method, a known method for removing contaminants can be used.
For example, there is a method described in literature (enzymatic analysis method of biological components, P205, Takashi Murachi, Kodansha Publishing, 1985). For example, blood is previously mixed with FPOX, POD, and catalase, and a specific glycated amino acid (glycated ε-lysine) and a specific glycated peptide that are released into the blood are converted into hydrogen peroxide. Further, the generated hydrogen peroxide is consumed by catalase. The remaining catalase can be inactivated by mixing sodium azide in the next step. The remaining FPOX is inactivated by the protease mixed in the next step. Thereby, the endogenous specific glycated amino acid and the specific glycated peptide in the blood can be removed from the blood without affecting the subsequent processing steps.
The same document (enzymatic analysis of biological components, P205, Takashi Murachi, Kodansha Publishing, 1985) discloses another method for removing endogenous substances. Specifically, for example, when glycated ε-lysine is measured using the FPOX-POD-TOOS-4AA coloring system, first, FPOX, POD, and TOOS (excluding 4AA) are mixed with the sample, and FPOX and blood are mixed. And glycated ε-lysine that is released. The produced hydrogen peroxide reacts with POD-TOOS and changes into a substance that does not affect the measurement. Since 4AA is colored after being added to the measurement system after the protease reaction, it can be accurately measured without being influenced by endogenous glycated ε-lysine released in the blood.
また、酵素法を用いて特定の非糖化アミノ酸を測定して特定タンパク質の総量を測定する場合、血液中に遊離する特定の非糖化アミノ酸の影響を受ける場合がある。
例えば、プロテアーゼとアルブミンの反応で切断したリジンを測定してアルブミンの濃度を定量する場合、血液中に切断前から遊離している内因性リジンが存在していると、測定に正の誤差を与える。
本発明に係る測定方法では、血液とプロテアーゼを混合する前に、必要に応じて、予め血液中に遊離する特定アミノ酸を除去する工程を設け、血液中に遊離する特定のアミノ酸を除去しておくことができる。
具体的には、特定タンパク質がアルブミンの場合、血液とプロテアーゼとを混合させる前に、血液中に遊離するリジンをイオン交換法で除去する方法がある。具体的には、リジンは酸性又は中性溶媒の中にはプラスチャージを持つ為、陽イオン交換樹脂を用いてイオン交換法で除去する事ができる。
Moreover, when measuring a specific non-glycated amino acid using an enzyme method and measuring the total amount of a specific protein, it may be influenced by the specific non-glycated amino acid released in the blood.
For example, when lysine cleaved by the reaction between protease and albumin is measured and the concentration of albumin is quantified, the presence of endogenous lysine released in the blood before cleavage gives a positive error in the measurement. .
In the measurement method according to the present invention, before mixing blood and protease, if necessary, a step of removing a specific amino acid released in the blood in advance is provided to remove the specific amino acid released in the blood. be able to.
Specifically, when the specific protein is albumin, there is a method of removing lysine released in the blood by an ion exchange method before mixing the blood and protease. Specifically, since lysine has a positive charge in an acidic or neutral solvent, it can be removed by an ion exchange method using a cation exchange resin.
また、本発明に係る特定タンパク質の糖化割合測定用使い捨て検査具は、測定すべき血液を導入する血液導入部と、前記血液導入部に連通し、血液導入部から導入されてきた血液に、特定タンパク質に特異的に作用するプロテアーゼとを混合し、血液中の特定タンパク質から糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを切断すると共に、血液中の特定タンパク質から非糖化アミノ酸及び非糖化ペプチドを切断する切断処理部と、前記切断処理部において生成された糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの中の特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドと、これらに特異的に反応する酸化酵素とを反応させると共に、前記切断処理部において生成された非糖化アミノ酸の特定の非糖化アミノ酸と、それに特異的に反応する酸化酵素とを反応させる少なくとも一つの反応処理部とを備えていることを特徴とする
この構成により、適当な分析装置を用いて、反応処理部において特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドと、それらに特異的に反応する酸化酵素とを反応させることにより生成又は消費される物質の濃度を測定すると共に、特定の非糖化アミノ酸と、それに特異的に反応する酸化酵素とを反応させることにより生成又は消費される物質の濃度を測定することができる。そして、両方の測定結果の比率から特定タンパク質の糖化割合を得ることができる。
In addition, the disposable test tool for measuring the glycation ratio of a specific protein according to the present invention is specific to a blood introduction part that introduces blood to be measured, and blood introduced from the blood introduction part, which communicates with the blood introduction part. A protease that specifically acts on a protein, cleaves a glycated amino acid and a glycated peptide from a specific protein in the blood, and a cleavage processing unit that cleaves a non-glycated amino acid and a non-glycated peptide from the specific protein in the blood; The specific glycated amino acid and glycated peptide in the glycated amino acid and glycated peptide generated in the cleavage processing unit are reacted with an oxidase specifically reacting with the glycated amino acid and glycated peptide, and the non-glycation generated in the cleavage processing unit At least one reaction that reacts a specific non-glycated amino acid of an amino acid with an oxidase that specifically reacts with it. With this configuration, a specific glycated amino acid and a glycated peptide are reacted in the reaction processing section with an oxidase that reacts specifically with the reaction processing section. The concentration of a substance produced or consumed can be measured, and the concentration of a substance produced or consumed can be measured by reacting a specific non-glycated amino acid with an oxidase that specifically reacts with it. . And the saccharification rate of a specific protein can be obtained from the ratio of both measurement results.
前記切断処理部にて血液に混合されるプロテアーゼは、例えば、特定タンパク質がアルブミンの場合、血液中の糖化アルブミンから、少なくとも、糖化ε―リジン及び糖化ε―リジン残基を含むペプチドを切断すると共に、血液中のアルブミンから非糖化リジンを切断することができるプロテアーゼであり得る。プロテアーゼの種類は限定されることなく、特定タンパク質に対して特異的に切断性が高いものであれば任意のプロテアーゼが用いられ得る。 For example, when the specific protein is albumin, the protease mixed with blood in the cleavage processing unit cleaves at least a peptide containing glycated ε-lysine and glycated ε-lysine residues from glycated albumin in blood. It can be a protease capable of cleaving non-glycated lysine from albumin in blood. The type of protease is not limited, and any protease can be used as long as it has a high specific cleavage property for a specific protein.
また、プロテアーゼは、切断処理部に予め設けられ、切断処理部に血液が導入されると自動的にプロテアーゼが血液に混合されるように構成され得る。しかし、本発明に係る検査具は、この構成に限定されることなく、必要に応じて、切断処理部に切断処理部の外部からプロテアーゼを供給するように構成してもよい。 In addition, the protease may be provided in advance in the cutting processing unit, and the protease may be automatically mixed into the blood when blood is introduced into the cutting processing unit. However, the inspection tool according to the present invention is not limited to this configuration, and may be configured to supply protease to the cutting processing unit from the outside of the cutting processing unit as necessary.
前記反応処理部は、必要に応じて、二つの分離した第１反応処理部及び第２反応処理部で構成され得る。特定タンパク質がアルブミンであり、特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドが糖化ε―リジン及び糖化ε―リジン残基を含むペプチドである場合、前記第１反応処理部では酸化酵素としてFPOX が混合され得る。また、特定の非糖化アミノ酸が非糖化リジンである場合には、第２反応処理部では酸化酵素としてLyODが混合され得る。
これらの酸化酵素は、予め第１反応処理部及び第２反応処理部内に設けられ、血液が各処理部に導入されると自動的に酸化酵素が血液に混合されるように構成され得る。しかし、本発明に係る検査具は、この構成に限定されることなく、必要に応じて、第１反応処理部に第１反応処理部の外部からFPOX等の酸化酵素を供給するように構成してもよく、また、第２反応処理部に第２反応処理部の外部からLyOD等の酸化酵素を供給するように構成してもよい。
The reaction processing unit may include two separated first reaction processing units and second reaction processing units as necessary. When the specific protein is albumin and the specific glycated amino acid and glycated peptide are peptides containing glycated ε-lysine and glycated ε-lysine residues, FPOX can be mixed as an oxidase in the first reaction treatment section. When the specific non-glycated amino acid is non-glycated lysine, LyOD can be mixed as an oxidase in the second reaction processing section.
These oxidases can be provided in advance in the first reaction processing section and the second reaction processing section, and can be configured such that when blood is introduced into each processing section, the oxidase is automatically mixed into the blood. However, the inspection tool according to the present invention is not limited to this configuration, and is configured to supply an oxidase such as FPOX from the outside of the first reaction processing unit to the first reaction processing unit as necessary. Alternatively, the oxidase such as LyOD may be supplied to the second reaction processing unit from the outside of the second reaction processing unit.
本発明は、使用する酸化酵素によって血液中に残留するプロテアーゼの影響を受けることもあるので、必要に応じて、前記切断処理部と反応処理部との間にプロテアーゼ失活処理部を設け、プロテアーゼ失活処理部内で切断処理部にて処理された血液にプロテアーゼ阻害物質を混合し、血液中に残留するプロテアーゼを失活させるように構成してもよい。
プロテアーゼ阻害物質は、予めプロテアーゼ失活処理部部内に設けられ得るが、本発明に係る検査具は、この構成に限定されることなく、必要に応じて、プロテアーゼ失活処理部の外部からプロテアーゼ失活処理部内にプロテアーゼ阻害物質を供給するように構成してもよい。
Since the present invention may be affected by protease remaining in blood depending on the oxidase used, a protease deactivation treatment part is provided between the cleavage treatment part and the reaction treatment part as necessary. A protease inhibitor may be mixed with the blood processed in the cutting processing unit within the inactivation processing unit to inactivate the protease remaining in the blood.
The protease inhibitor can be provided in advance in the protease deactivation processing section, but the inspection tool according to the present invention is not limited to this configuration, and if necessary, the protease deactivation processing section can be provided from the outside of the protease deactivation processing section. You may comprise so that a protease inhibitor may be supplied in an active treatment part.
また、本発明に係る検査具は、血液中遊離する特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドからの影響を解決する為に、切断処理部の前、好ましくは、血球分離工程と切断処理部との間に、血液中に遊離する特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを除去する処理部を設け、血液中に遊離する特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを除去することができる。具体的には、特定タンパク質がアルブミンであり、特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドが糖化ε―リジン及び糖化ε―リジン残基を含むペプチドである場合、血球濾過層の下に、FPOX、POD及びカタラーゼを含有する処理層を設け、血液が前記FPOX、POD、及びカタラーゼ含有層を通過する時に、血液中に遊離する糖化リジン及び糖化ペプチドを過酸化水素へ変換し、カタラーゼにより生成された過酸化水素を消費するように構成され得る。残ったカタラーゼは切断処理部内にアジ化ナトリウムを設けておけば、このアジ化ナトリウムにより失活させることができる。また、残ったFPOXは切断処理部にて混合されるプロテアーゼにより失活するので、この以降の反応に影響しない。
もう一つの具体的な方法としては、例えばFPOX-POD-TOOS-４AA発色系を利用して糖化アルブミン割合を測定する場合、まず、FPOX、POD、TOOSを血液と混合させ、FPOXと血液中に遊離する糖化ε―リジン及び糖化ε―リジン残基を含むペプチドと反応させる。生成した過酸化水素はPOD-TOOSと反応して測定に影響しない物質へ変化させる。４AAはプロテアーゼ反応の後に測定系に添加すれば、血液中遊離する内因性糖化ε―リジンの影響を受けずに正確に測定することができる。
In order to solve the influence from the specific glycated amino acid and glycated peptide released in the blood, the test device according to the present invention is preferably provided before the cutting treatment section, preferably between the blood cell separation step and the cutting treatment section. A processing unit for removing specific glycated amino acids and glycated peptides released in blood can be provided to remove specific glycated amino acids and glycated peptides released in blood. Specifically, when the specific protein is albumin and the specific glycated amino acid and glycated peptide are peptides containing glycated ε-lysine and glycated ε-lysine residues, FPOX, POD, and catalase are placed under the blood cell filtration layer. Hydrogen peroxide produced by catalase is converted to hydrogen peroxide by converting glycated lysine and glycated peptide released into blood when blood passes through the FPOX, POD, and catalase-containing layer. Can be configured to consume. The remaining catalase can be inactivated by sodium azide if sodium azide is provided in the cleavage treatment section. In addition, the remaining FPOX is inactivated by the protease mixed in the cleaving section, so that the subsequent reaction is not affected.
As another specific method, for example, when measuring the ratio of glycated albumin using the FPOX-POD-TOOS-4AA coloring system, first, FPOX, POD, and TOOS are mixed with blood, and FPOX and blood are mixed into the blood. Reaction with a peptide containing free glycated ε-lysine and glycated ε-lysine residues. The produced hydrogen peroxide reacts with POD-TOOS and changes into a substance that does not affect the measurement. If 4AA is added to the measurement system after the protease reaction, it can be accurately measured without being influenced by endogenous glycated ε-lysine released in the blood.
また、本発明に係る検査具は、血液中に遊離する特定の非糖化アミノ酸の影響を解決する為、血液とプロテアーゼを混合する前、好ましくは、血球分離工程と切断処理部との間に、血液中に遊離する特定のアミノ酸を除去する処理部を設け、血液中に遊離する特定のアミノ酸を除去するように構成することができる。
具体的には、特定タンパク質がアルブミンであり、特定の非糖化アミノ酸が非糖化リジンである場合には、血液導入部に血球分離層を設け、該血球分離層の下方に陽イオン交換層を設け、血液中に遊離するリジンを陽イオン交換方法で除去するように構成することができる。
Moreover, in order to solve the influence of a specific non-glycated amino acid released in the blood, the test tool according to the present invention preferably mixes the blood with the protease, preferably between the blood cell separation step and the cutting treatment unit, A processing unit for removing a specific amino acid released in the blood can be provided, and the specific amino acid released in the blood can be removed.
Specifically, when the specific protein is albumin and the specific non-glycated amino acid is non-glycated lysine, a blood cell separation layer is provided in the blood introduction part, and a cation exchange layer is provided below the blood cell separation layer. The lysine released in the blood can be removed by a cation exchange method.
また、本発明に係る検査具は、第１反応処理部又は第２反応処理部において酸化酵素を利用して過酸化水素を生成するか酸素を消費されるように構成されている場合、前記生成された過酸化水素又は消費された酸素は、公知の検出手段によって測定され得る。
例えば、光学的に過酸化水素を測定する場合、第１及び第２反応処理部に対応する位置に発光素子及び受光素子により成る測光ユニットを設け、ペルオキシダーゼ（POD）及び発色試薬を用いた呈色反応を利用し、前記測定ユニットにおいて、第１及び第２反応処理部内の血液サンプルの反射光又は透過光を検出することにより、過酸化水素の濃度に比例した色素の吸光度変化を測定することができる。
また、電気化学的に過酸化水素を測定する場合、アンペロメトリック電極法等が利用できる。具体的には、貴金属又はカーボン等の材料の作用極と対極（必要に応じて参照極も）から構成した電極を第１反応処理部又は第２反応処理部に各々設け、電極に、一定の電位を印加することによって、作用極表面の過酸化水素を酸化させる。この電極表面の酸化反応で発生した酸化電流は過酸化水素濃度に比例するので、酸化電流を検出することで過酸化水素の濃度を測定する事ができる。
In addition, when the inspection tool according to the present invention is configured to generate hydrogen peroxide or consume oxygen using an oxidase in the first reaction processing unit or the second reaction processing unit, the generation Hydrogen peroxide consumed or oxygen consumed can be measured by known detection means.
For example, when measuring hydrogen peroxide optically, a photometric unit comprising a light emitting element and a light receiving element is provided at a position corresponding to the first and second reaction processing units, and coloration using peroxidase (POD) and a coloring reagent is performed. Using the reaction, the change in absorbance of the dye proportional to the concentration of hydrogen peroxide can be measured by detecting reflected light or transmitted light of the blood sample in the first and second reaction processing units in the measurement unit. it can.
Moreover, when measuring hydrogen peroxide electrochemically, the amperometric electrode method etc. can be utilized. Specifically, an electrode composed of a working electrode and a counter electrode (also a reference electrode if necessary) of a material such as a noble metal or carbon is provided in each of the first reaction processing unit or the second reaction processing unit, By applying a potential, hydrogen peroxide on the surface of the working electrode is oxidized. Since the oxidation current generated by the oxidation reaction on the electrode surface is proportional to the hydrogen peroxide concentration, the concentration of hydrogen peroxide can be measured by detecting the oxidation current.
また、本発明に係る検査具は、血液中特定タンパク質の糖化割合を測定すると同時に、他の測定項目を測定するように構成することもできる。
例えば、血液中アルブミン糖化割合の測定とグルコース濃度の測定を同時に実行したい場合、血液導入部と切断処理部との間の流路を分岐させ、分岐された流路に、グルコース測定用試薬を配置したグルコース濃度測定部を設けることで、グルコース濃度の測定を可能にする。この場合、具体的な例としては、グルコース濃度測定部の中に、グルコースに特異的に反応する酸化酵素であるグルコースオキシダーゼ（GOD）と、発色試薬の４AA、TOOSを反応層として配置しておく。分岐された流路から流れてくる血液（血漿）はこれらの試薬と反応し、血液中グルコースの濃度に比例して紫色の色素が生成されるので、生成された色素を光学的に検出することで、グルコース濃度を測定することができる。
このように、血液導入部と切断処理部との間の流路を分岐させ、分岐された流路で別の測定項目を測定するように構成することで、分岐された流路に、糖化割合測定に関連する処理の影響を受けない血液を流すことが可能になる。特に、血液導入部と切断処理部とを繋ぐ流路に、希釈液を供給する希釈液供給部を接続し、血液導入部と切断処理部とを繋ぐ流路に、血液が溜まった状態で同流路に希釈液を供給し、供給された希釈液で同流路に溜まった血液を切断処理部に押し流すように構成した場合、血液導入部と切断処理部との間の流路を分岐させることで、始めに希釈されていない血液を、分岐された流路に流し、次いで、希釈液と共に希釈された血液を切断処理部に流すことも可能になる。これにより、分岐された流路から別の測定項目を測定するための測定部に供給される血液は希釈させることがないため、血液中のグルコース濃度を同時に正確に測定することも可能になる。
また、ここで他の測定項目はグルコースに限定されなく、様々な生化学測定項目の測定を実施することができる。例えば、クレアチニン、尿酸、尿素窒素、コレステロール、乳酸、等が挙げられる。また、必要に応じて、特定糖化タンパク質と複数の生化学項目を同時に測定することもできる。
Moreover, the test tool according to the present invention can be configured to measure other measurement items at the same time as measuring the glycation ratio of a specific protein in blood.
For example, if you want to measure blood albumin saccharification ratio and glucose concentration at the same time, branch the flow path between the blood introduction part and the cutting process part and place the glucose measurement reagent in the branched flow path By providing the glucose concentration measuring unit, the glucose concentration can be measured. In this case, as a specific example, glucose oxidase (GOD), which is an oxidase that specifically reacts with glucose, and coloring reagents 4AA and TOOS are arranged as a reaction layer in the glucose concentration measurement unit. . Blood (plasma) flowing from the branched channel reacts with these reagents, and a purple pigment is generated in proportion to the glucose concentration in the blood, so the generated pigment is optically detected. The glucose concentration can be measured.
In this manner, the flow rate between the blood introduction unit and the cutting processing unit is branched, and another measurement item is measured in the branched flow channel. It is possible to flow blood that is not affected by the processing related to the measurement. In particular, a diluting solution supply unit for supplying a diluting solution is connected to the flow channel connecting the blood introducing unit and the cutting processing unit, and the same is maintained in a state where blood has accumulated in the flow channel connecting the blood introducing unit and the cutting processing unit. When the diluent is supplied to the flow path, and the blood collected in the flow path is pushed away to the cutting processing section by the supplied diluent, the flow path between the blood introduction section and the cutting processing section is branched. Thus, it is also possible to first flow undiluted blood through the branched flow path, and then flow the blood diluted with the diluting solution to the cutting processing unit. Thereby, since the blood supplied to the measurement part for measuring another measurement item from the branched flow path is not diluted, the glucose concentration in the blood can be measured accurately at the same time.
Here, the other measurement items are not limited to glucose, and various biochemical measurement items can be measured. Examples include creatinine, uric acid, urea nitrogen, cholesterol, lactic acid, and the like. Moreover, the specific glycated protein and a plurality of biochemical items can be simultaneously measured as necessary.
本発明に係る特定タンパク質の糖化割合測定方法は、血液中の特定タンパク質の糖化割合を測定する方法であって、前記特定タンパク質に特異的に作用するプロテアーゼと血液とを混合し、血液中の特定タンパク質から糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを切断すると共に、血液中の特定タンパク質から非糖化アミノ酸及び非糖化ペプチドを切断する工程と、前記切断により生成された糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの中の特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドと、これらに特異的に反応する酸化酵素とを反応させて反応により生成又は消費される物質の濃度を測定する工程Ａと、前記切断により生成された非糖化アミノ酸の中の特定の非糖化アミノ酸と、それに特異的に反応する酸化酵素とを反応させて反応により生成又は消費される物質の濃度を測定する工程Ｂと、前記工程Ａと前記工程Ｂとで測定した生成又は消費される物質の濃度に基づいて特定タンパク質中の糖化タンパクの量及び特定タンパク質の総量を演算する工程と、求めた特定糖化タンパクの量及び特定タンパク質の総量の比率に基づいて特定タンパク質の糖化割合を求める工程とより成るので、血液とプロテアーゼ反応の混合液から測定対象物質である特定の非糖化アミノ酸及び糖化アミノ酸、並びに特定の糖化ペプチドとを分離精製する工程を必要としない。
従来の測定方法の特定非糖化アミノ酸と特定糖化アミノ酸とを分離精製する工程及び特定非糖化ペプチドと特定糖化ペプチドとを分離精製する工程は、非常に煩雑で大型の装置を必要とするため、これらの工程を必要としない本発明に係る測定方法は、特定タンパク質の糖化割合の測定が非常に簡単に行えるようになるという効果を奏する。また、このように分離精製処理を必要とせず、その結果、複雑な処理構造を備える必要がないため、使い捨てのセンサカード等の検査具にも適用することが可能になる。
また、本発明に係る測定方法は、特定糖化タンパク質の測定と、特定タンパク質総量の測定との両方を、血液とプロテアーゼとの反応から生成した産物に特異的に反応する酸化酵素との反応を利用して測定するため、従来の酵素測定方法と比べ、例えば、特定タンパク質がアルブミンの場合、特異性の低いBCGやBCP発色試薬を使わない為、正確に測定することができる。また、大型、専用装置を必要としなく、簡易測定装置でも容易に、正確に実現することができる。特に、使い捨ての測定カード等の検査具を用いても測定することが可能になるため、より安価に特定タンパク質の糖化割合の測定が可能になる。
A method for measuring a glycation ratio of a specific protein according to the present invention is a method for measuring a glycation ratio of a specific protein in blood, wherein a protease that specifically acts on the specific protein and blood are mixed, and the specific protein in the blood is determined. Cleaving glycated amino acid and glycated peptide from protein, cleaving non-glycated amino acid and non-glycated peptide from specific protein in blood, glycated amino acid and glycated amino acid in glycated peptide generated by said cleaving, and A step A in which a glycated peptide is reacted with an oxidase specifically reacting therewith to measure the concentration of a substance produced or consumed by the reaction; and a specific non-glycated amino acid among the non-glycated amino acids produced by the cleavage Concentration of substances produced or consumed by reacting a glycated amino acid with an oxidase that specifically reacts with it. And a step of calculating the amount of glycated protein in the specific protein and the total amount of the specific protein based on the concentration of the substance produced or consumed measured in the step A and the step B. A specific glycated amino acid and a glycated amino acid, which are substances to be measured, from a mixture of blood and protease reaction. In addition, a process for separating and purifying a specific glycated peptide is not required.
The process of separating and purifying the specific non-glycated amino acid and the specific glycosylated amino acid and the process of separating and purifying the specific non-glycated peptide and the specific glycated peptide of the conventional measurement method are very complicated and require a large apparatus. The measurement method according to the present invention that does not require this step has the effect that the measurement of the glycation ratio of a specific protein can be performed very easily. Further, separation / purification processing is not required in this way, and as a result, it is not necessary to provide a complicated processing structure, and therefore, it can be applied to an inspection tool such as a disposable sensor card.
In addition, the measurement method according to the present invention utilizes both the measurement of the specific glycated protein and the measurement of the total amount of the specific protein using the reaction with an oxidase that specifically reacts with the product generated from the reaction between blood and protease. Therefore, compared with the conventional enzyme measurement method, for example, when the specific protein is albumin, it can be accurately measured because BCG or BCP coloring reagent with low specificity is not used. In addition, a large and dedicated device is not required, and a simple measuring device can be realized easily and accurately. In particular, since it is possible to measure using a test tool such as a disposable measurement card, the glycation ratio of a specific protein can be measured at a lower cost.
また、本発明に係る特定タンパク質の糖化割合測定用使い捨て検査具は、測定すべき血液を導入する血液導入部と、前記血液導入部に連通し、血液導入部から導入されてきた血液に、特定タンパク質に特異的に作用するプロテアーゼとを混合し、血液中の特定タンパク質から糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを切断すると共に、血液中の特定タンパク質から非糖化アミノ酸及び非糖化ペプチドを切断する切断処理部と、前記切断処理部において生成された糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの中の特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドと、これらに特異的に反応する酸化酵素とを反応させると共に、前記切断処理部において生成された非糖化アミノ酸の特定の非糖化アミノ酸と、それに特異的に反応する酸化酵素とを反応させる少なくとも一つの反応処理部とを備えているので、任意の分析方法を用いて、反応処理部において酸化酵素との反応により消費又は生成される物質の濃度を測定することにより、特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの量と、特定の非糖化アミノ酸の量とを得ることができ、結果として、血液中の特定タンパク質の糖化割合を得ることができる。
本発明に係る検査具は、特定糖化タンパク質の測定と、特定タンパク質総量の測定との両方を、血液とプロテアーゼとの反応から生成した産物に特異的に反応する酸化酵素との反応を利用して測定するため、簡単に、正確に、安価に実現することができる。
また、本発明に係る検査具は、特定タンパク質を切断する切断処理部の混合液から特定非糖化アミノ酸と特定糖化アミノ酸特定糖化ペプチドとを分離精製する構造を備える必要がないので、構造が簡単であり、安価に製造することができる。
In addition, the disposable test tool for measuring the glycation ratio of a specific protein according to the present invention is specific to a blood introduction part that introduces blood to be measured, and blood introduced from the blood introduction part, which communicates with the blood introduction part. A protease that specifically acts on a protein, cleaves a glycated amino acid and a glycated peptide from a specific protein in the blood, and a cleavage processing unit that cleaves a non-glycated amino acid and a non-glycated peptide from the specific protein in the blood; The specific glycated amino acid and glycated peptide in the glycated amino acid and glycated peptide generated in the cleavage processing unit are reacted with an oxidase specifically reacting with the glycated amino acid and glycated peptide, and the non-glycation generated in the cleavage processing unit At least one reaction that reacts a specific non-glycated amino acid of an amino acid with an oxidase that specifically reacts with it. The amount of specific glycated amino acids and glycated peptides by measuring the concentration of a substance consumed or produced by the reaction with the oxidase in the reaction processing section using an arbitrary analysis method. And the amount of a specific non-glycated amino acid, and as a result, the glycation ratio of a specific protein in blood can be obtained.
The test tool according to the present invention utilizes both the measurement of the specific glycated protein and the measurement of the total amount of the specific protein using the reaction with the oxidase that specifically reacts with the product generated from the reaction between blood and protease. Since it is measured, it can be realized easily, accurately and inexpensively.
In addition, since the inspection tool according to the present invention does not need to have a structure for separating and purifying a specific non-glycated amino acid and a specific glycated amino acid-specific glycated peptide from a mixed solution of a cleaving section that cleaves a specific protein, the structure is simple. Yes, it can be manufactured at low cost.
以下、添付図面に示した一実施例を参照して本発明に係る特定タンパク質の糖化割合測定方法及び特定タンパク質の糖化割合測定用使い捨て検査具の実施の形態について説明する。
始めに、アルブミンの糖化割合測定方法を例に挙げて、本発明に係る特定タンパク質の糖化割合測定方法について説明していく。
始めに、糖尿病患者から採血した血液から血球を分離する。そして、血球が分離された血液（血漿）にプロテアーゼを混合させる。
ここで用いられるプロテアーゼとしては、血液中の測定対象であるアルブミン（糖化アルブミンを含む）に効率よく、特異的作用するものであればよい。具体的には、例えば、動物由来プロテアーゼ、植物由来プロテアーゼ、又は微生物由来プロテアーゼ等が用いられる。
プロテアーゼを混合することにより、血液中のアルブミンから糖化アミノ酸及び糖化ペプチドが切断されると共に、血液中のアルブミンから非糖化アミノ酸が切断される。
次いで、血液は二つに分けられ、一方の血液には、
特定の糖化アミノ酸としての糖化ε―リジンと、
特定の糖化ペプチドとしての糖化ε―リジン残基を含むペプチドと
の両方に特異的に反応する酸化酵素であるFPOXが混合され、
他方の血液には、
特定の非糖化アミノ酸である非糖化リジンに特異的に反応する酸化酵素であるLyODが混合される。
酸化酵素を混合することにより、一方の血液では、糖化ε―リジン及び糖化ε―リジン残基を含むペプチドとFPOXとの酸化反応により過酸化水素が生成され、他方の血液では、非糖化リジンとLyODとの酸化反応により過酸化水素が生成される。
次いで、適当な分析装置を用いて、各血液の過酸化水素の量を測定される。そして、これら測定した過酸化水素の量に基づき、予め分析装置本体のメモリに内蔵された標準検量式により糖化アルブミン及び総アルブミンの量に演算される。この糖化アルブミン及び総アルブミンの量は同一の希釈血液で測定された為、両者の比率で血液中のアルブミンの糖化割合を知ることができる。
好ましくは、プロテアーゼと血液との混合切断反応の後に、血液にプロテアーゼ阻害物質を添加し、プロテアーゼを失活させ、その後に、酸化酵素が血液に添加され得る。これにより、酸化酵素がプロテアーゼの影響を受けることがない。
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Embodiments of a specific protein glycation ratio measuring method and a specific protein glycation ratio measuring disposable test instrument according to the present invention will be described below with reference to one embodiment shown in the accompanying drawings.
First, the method for measuring the glycation ratio of a specific protein according to the present invention will be described with reference to the method for measuring the glycation ratio of albumin.
First, blood cells are separated from blood collected from a diabetic patient. Then, protease is mixed with blood (plasma) from which blood cells have been separated.
As the protease used here, any protease can be used as long as it efficiently and specifically acts on albumin (including glycated albumin) to be measured in blood. Specifically, for example, animal-derived protease, plant-derived protease, or microorganism-derived protease is used.
By mixing protease, glycated amino acids and glycated peptides are cleaved from albumin in blood, and non-glycated amino acids are cleaved from albumin in blood.
The blood is then divided in two, with one blood
Glycated ε-lysine as a specific glycated amino acid,
FPOX, an oxidase that specifically reacts with both glycated ε-lysine-containing peptides as specific glycated peptides,
On the other blood,
LyOD, which is an oxidase that specifically reacts with non-glycated lysine, which is a specific non-glycated amino acid, is mixed.
By mixing oxidase, hydrogen peroxide is generated in one blood by oxidation reaction of glycated ε-lysine and a peptide containing glycated ε-lysine residue with FPOX, and in the other blood, non-glycated lysine and Hydrogen peroxide is produced by the oxidation reaction with LyOD.
The amount of hydrogen peroxide in each blood is then measured using a suitable analyzer. Based on the measured amounts of hydrogen peroxide, the amounts of glycated albumin and total albumin are calculated in advance by a standard calibration formula built in the memory of the analyzer main body. Since the amounts of glycated albumin and total albumin were measured in the same diluted blood, the ratio of glycated albumin in the blood can be determined from the ratio of both.
Preferably, after the mixed cleavage reaction between the protease and blood, a protease inhibitor is added to the blood to deactivate the protease, and then the oxidase can be added to the blood. As a result, the oxidase is not affected by the protease.
次に、図１〜図１０に示した実施例を参照して、本発明に係る特定タンパク質の糖化割合測定用使い捨て検査具の実施の形態について説明する。
図１は、特定タンパク質の糖化割合測定用使い捨て検査具の一実施例である使い捨て測定カードの概略上面図である。
この測定カードは、
血球分離層（図示せず）を備えた血液導入部１と、
希釈液パックが設けられた希釈液保持部２と、
希釈されていない血液の反応処理及び測定を行う非希釈血液反応兼測定部３と、
血液と希釈液とを混合すると共に、血液にプロテアーゼを添加するタンパク質分解処理部４（本発明に係る切断処理部）と、
血液にプロテアーゼ阻害物質を添加するプロテアーゼ失活処理部５と、
血液に、酸化酵素としてFPOXを添加する酸化反応処理部６（本発明に係る反応処理部又は第１反応処理部）と、
血液に、酸化酵素としての LyODを添加する酸化反応処理部７（本発明に係る反応処理部又は第２反応処理部）と
を備えている。
血液導入部１に繋がる流路１０ａと希釈液保持部２に繋がる流路１０ｂには、それぞれ電磁弁１１及び１２が設けられている。流路１０ａと１０ｂとは電磁弁１１及び１２の下流側で合流し流路１０ｃを形成する。流路１０ｃの下流端にはポンプ１３が設けられている。
流路１０ｃはポンプ１３の上流側で流路１０ｄに枝分かれしている。流路１０ｄには、電磁弁１４が設けられている。流路１０ｄの下流端は、非希釈血液反応兼測定部３に接続されている。非希釈血液反応兼測定部３には流路１０ｅが設けられており、この流路１０ｅの下流端には電磁弁１５が設けられている。
流路１０ｅは、電磁弁１４の下流側で流路１０ｆに枝分かれしている。この流路１０ｆの下流端はタンパク質分解処理部４に接続されている。
タンパク質分解処理部４には、流路１０ｆの他に二つの流路１０ｇ及び１０ｈが接続されている。一方の流路１０ｇの下流端には電磁弁１６が設けられている。他方の流路１０ｈはプロテアーゼ失活処理部５に接続されている。
プロテアーゼ失活処理部５には二つの流路１０ｉ及び１０ｊが接続されている。流路１０ｉは酸化反応処理部６に接続され、流路１０ｊは酸化反応処理部７に接続されている。
酸化反応処理部６には、流路１０ｋが接続されており、この流路１０ｋの下流端には電磁弁１７が設けられている。
酸化反応処理部７には、流路１０ｌが接続されており、この流路１０ｌの下流端には電磁弁１８が設けられている。
Next, with reference to the Example shown in FIGS. 1-10, embodiment of the disposable test device for measuring the saccharification ratio of the specific protein which concerns on this invention is described.
FIG. 1 is a schematic top view of a disposable measurement card which is an embodiment of a disposable test tool for measuring the glycation ratio of a specific protein.
This measuring card
A
A
An undiluted blood reaction and measurement unit 3 that performs reaction processing and measurement of undiluted blood;
A proteolytic processing unit 4 (a cutting processing unit according to the present invention) that mixes blood and diluent and adds protease to the blood,
A protease deactivation treatment unit 5 for adding a protease inhibitor to blood;
An oxidation reaction processing section 6 (reaction processing section or first reaction processing section according to the present invention) for adding FPOX as an oxidase to blood,
And an oxidation reaction processing section 7 (reaction processing section or second reaction processing section according to the present invention) for adding LyOD as an oxidase to blood.
The
The
In addition to the
Two flow paths 10 i and 10 j are connected to the protease deactivation processing unit 5. The flow channel 10 i is connected to the oxidation
A
A
上記した希釈液保持部２、タンパク質分解処理部４及びプロテアーゼ失活処理部５は、図２に示すように、何れも、上面又は裏面から適当な押圧手段によって押圧すると若干変形できるように構成されている。分析装置等に設けられた押圧手段で各処理部２、４及び５を押圧することにより、内部の血液が所望の流路に押し流される。
As shown in FIG. 2, the
次に、上記したように構成された測定カードの作用について説明していく。
始めは電磁弁１１、１２、１４、１５、１６、１７及び１８は閉弁されており、ポンプ１３も停止している。
図３に示すように、血液を血液導入部１に導入した後、電磁弁１１を開弁し、ポンプ１３の吸引を開始する。これにより、血液は不図示の血球分離層を介して、流路１０ａから流路１０ｃに流れ込む。血液が流路１０ｃに満たされた後、ポンプ１３は停止され、かつ、電磁弁１１は閉弁される。
次に、図４に示すように、電磁弁１２、電磁弁１４及び電磁弁１５が開弁される。この状態で希釈液保持部２が押圧される。希釈液保持部２が押圧されると、内部の希釈液保持パックが開き、希釈液が流路１０ｂを通過して流路１０ｃに流れ込む。そして、希釈液は流路１０ｃに貯まっている血液を押出しながら流路１０ｄに流れる。これにより、希釈されていない血液が非希釈血液反応兼測定部３に満たされる。
非希釈血液反応兼測定部３に血液が満たされると、図５に示すように、電磁弁１５が閉弁され、電磁弁１６が開弁される。そして、さらに希釈液保持部２を押圧し続けると、血液及び希釈液は共にタンパク質分解処理部４に流れ込む。
タンパク質分解処理部４の内部には、プロテアーゼが設けられており、同処理部４の内部で血液は希釈液と混合されると同時に、プロテアーゼを溶解され、血液と混合される。
タンパク質分解処理部４において、必要に応じて加温処理をしながらプロテアーゼにより、血液中のアルブミンから糖化アミノ酸及び糖化ペプチドが切断されると共に、アルブミンから非糖化アミノ酸が切断される。
次に、図６に示すように、電磁弁１２、１４及び１６が閉弁され、電磁弁１７及び１８が開弁される。この状態でタンパク質分解処理部４を押圧すると、血液は流路１０ｈを介してプロテアーゼ失活処理部５に流れ込む。
プロテアーゼ失活処理部５には、プロテアーゼ阻害物質が設けられており、このプロテアーゼ阻害物質により、血液中に残留しているプロテアーゼは全て失活される。
さらに、図７に示すように、プロテアーゼ失活処理部５を押圧すると、血液は酸化反応処理部６及び７に流れ込む。
酸化反応処理部６には、FPOXが設けられている。酸化反応処理部６内に血液が流れ込むと、血液にFPOXが混合され、血液中の特定の糖化アミノ酸である糖化ε―リジン及び特定の糖化ペプチドであるε―リジン残基を含むペプチドと、FPOXとが酸化反応を起こし、この酸化反応により過酸化水素が生成される。
酸化反応処理部７には、LyODが設けられている。酸化反応処理部７内に血液が流れ込むと、血液にLyODが混合され、血液中の特定の非糖化アミノ酸である非糖化リジンとLyODとが酸化反応を起こし、この酸化反応により過酸化水素が生成される。
上記した酸化反応処理部６及び７において生成された過酸化水素量は、検出装置により光学的又は電気化学的に測定される。
過酸化水素量を光学的に測定する場合には、各酸化酵素を添加する段階で発色試薬も添加される。測定カード本体は光が透過可能な透明なプラスチック等で成形される。また、過酸化水素量を電気化学的に測定する場合には、測定カードに適当な電極（図示せず）が設けられる。
また、図示されていないが、必要に応じて、血球分離層を設けた血液導入部１の下流にと、タンパク質分解処理部４との間に、血液中に遊離する糖化ε―リジン及び糖化ε―リジン残基を含むペプチド、又は非糖化リジンを処理して除去する処理部を設ける事が出来る。
また、図示されていないが、電磁弁１４、１５、１６、１７、１８、及びポンプ吸引口１３に、吸水性高分子材料を設けることによって、空気と通させ、水や血液等を通せず、電磁弁と合わせて使うと、より安定に液流れをコントロールすることができる。
尚、前記した電磁弁の制御、ポンプの制御及び各処理部の押圧制御、加温処理等は、不図示の分析装置により行われる。
Next, the operation of the measurement card configured as described above will be described.
At first, the
As shown in FIG. 3, after introducing blood into the
Next, as shown in FIG. 4, the
When the undiluted blood reaction / measurement unit 3 is filled with blood, the electromagnetic valve 15 is closed and the
Protease is provided in the
In the
Next, as shown in FIG. 6, the
The protease deactivation processing unit 5 is provided with a protease inhibitor, and all proteases remaining in the blood are deactivated by the protease inhibitor.
Furthermore, as shown in FIG. 7, when the protease deactivation processing unit 5 is pressed, blood flows into the oxidation
The oxidation
The oxidation
The amount of hydrogen peroxide generated in the oxidation
When optically measuring the amount of hydrogen peroxide, a coloring reagent is also added at the stage of adding each oxidase. The measurement card body is formed of a transparent plastic that can transmit light. When the amount of hydrogen peroxide is measured electrochemically, an appropriate electrode (not shown) is provided on the measurement card.
Although not shown, glycated ε-lysine and glycated ε released in the blood between the downstream of the
Although not shown, by providing a water-absorbing polymer material in the
The control of the solenoid valve, the control of the pump, the press control of each processing unit, the heating process, etc. are performed by an analyzer (not shown).
図８は、測定カードと分析装置との関係の一例を示す図である。最終的な過酸化水素量の測定を光学的手段により行う場合には、図８に示すように、測定カードを垂直に立てた状態で分析装置にセットできるように分析装置を構成するのが好ましい。
測定カードを横に寝かせた状態で最終的な測定を行おうとすると、図９(a)及び(b)に示すように、酸化反応処理部６及び７に達した血液の量によって、光の透過距離が変わってしまうという問題がある。
しかし、測定カードを垂直に立てた状態で分析装置にセットすることで、図１０（ａ）及び（ｂ）に示すように、酸化反応処理部６及び７に達する血液の量が多くても少なくても、常に同じ光透過距離を得ることができるので、安定した測定を行うことが可能になる。
FIG. 8 is a diagram illustrating an example of the relationship between the measurement card and the analyzer. When the final measurement of the amount of hydrogen peroxide is performed by optical means, it is preferable to configure the analyzer so that the measurement card can be set in the analyzer in a vertical state as shown in FIG. .
When the final measurement is performed with the measurement card lying on the side, as shown in FIGS. 9 (a) and 9 (b), light is transmitted depending on the amount of blood reaching the oxidation
However, by setting the measurement card in the vertical state in the analyzer, as shown in FIGS. 10 (a) and 10 (b), the amount of blood reaching the oxidation
以上説明した実施例では、特定タンパク質としてのアルブミンの糖化割合を測定するために、プロテアーゼを用いて、アルブミンから糖化ε―リジンと、糖化ε―リジン残基を含むペプチド及び非糖化リジンを切断して測定しいるが、測定すべきタンパク質は本実施例に限定されることはない。 In the examples described above, in order to measure the glycation ratio of albumin as a specific protein, a protease is used to cleave glycated ε-lysine, a peptide containing a glycated ε-lysine residue, and non-glycated lysine. However, the protein to be measured is not limited to this example.
１ 血液導入部
２ 希釈液保持部
３ 非希釈血液反応兼測定部
４ タンパク質分解処理部
５ プロテアーゼ失活処理部
６ 酸化反応処理部
７ 酸化反応処理部
１０ａ 流路
１０ｂ 流路
１０ｃ 流路
１０ｄ 流路
１０ｅ 流路
１０ｆ 流路
１０ｇ 流路
１０ｈ 流路
１０ｉ 流路
１０ｊ 流路
１０ｋ 流路
１０ｌ 流路
１１ 電磁弁
１２ 電磁弁
１３ ポンプ
１４ 電磁弁
１５ 電磁弁
１６ 電磁弁
１７ 電磁弁
１８ 電磁弁
DESCRIPTION OF
11
Claims (16)
前記特定タンパク質に特異的に作用するプロテアーゼと血液とを混合し、
血液中の特定タンパク質から糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを切断すると共に、
血液中の特定タンパク質から非糖化アミノ酸及び非糖化ペプチドを切断する
工程と、
前記切断により生成された糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの中の特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドと、これらに特異的に反応する酸化酵素とを反応させて反応により生成又は消費される物質の濃度を測定する工程Ａと、
前記切断により生成された非糖化アミノ酸の中の特定の非糖化アミノ酸と、それに特異的に反応する酸化酵素とを反応させて反応により生成又は消費される物質の濃度を測定する工程Ｂと、
前記工程Ａと前記工程Ｂとで測定した生成又は消費される物質の濃度に基づいて特定タンパク質中の糖化タンパクの量及び特定タンパク質の総量を演算する工程と、
求めた特定糖化タンパクの量及び特定タンパク質の総量の比率に基づいて特定タンパク質の糖化割合を求める工程と
より成ることを特徴とする特定タンパク質の糖化割合測定方法。 A method for measuring the glycation rate of a specific protein in blood,
Mixing protease and blood specifically acting on the specific protein,
Cleaving glycated amino acids and glycated peptides from specific proteins in the blood,
Cleaving non-glycated amino acids and non-glycated peptides from specific proteins in blood;
A specific glycated amino acid and glycated peptide in the glycated amino acid and glycated peptide generated by the cleavage are reacted with an oxidase specifically reacting with the glycated amino acid and glycated peptide, and the concentration of a substance produced or consumed by the reaction is measured. Step A,
A step B of measuring a concentration of a substance produced or consumed by the reaction by reacting a specific non-glycated amino acid in the non-glycated amino acid generated by the cleavage with an oxidase specifically reacting with the non-glycated amino acid;
Calculating the amount of glycated protein in the specific protein and the total amount of the specific protein based on the concentration of the substance produced or consumed measured in the step A and the step B;
A method for measuring a glycation ratio of a specific protein, comprising the step of determining a glycation ratio of the specific protein based on the ratio of the obtained amount of the specific glycated protein and the total amount of the specific protein.
一方の血液と、切断により生成された糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの中の特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドと、それらに特異的に反応する酸化酵素とを反応させて、酵素反応により生成又は消費される物質濃度を測定し、
他方の血液と、切断により生成された非糖化アミノ酸の中の特定の非糖化アミノ酸と、それに特異的に反応する酸化酵素とを反応させて、酵素反応により生成又は消費される物質濃度を測定する
ことを特徴とする請求項１に記載の特定タンパク質の糖化割合測定方法。 After mixing the protease specifically acting on the specific protein and blood, cleaving the glycated amino acid and glycated peptide from the specific protein in the blood, and cleaving the non-glycated amino acid and non-glycated peptide from the specific protein in the blood Has the process of dividing the blood into two parts,
It is produced or consumed by an enzymatic reaction by reacting one blood with a specific glycated amino acid and glycated peptide in the glycated amino acid and glycated peptide produced by cleavage and an oxidase that specifically reacts with them. Measure substance concentration,
The other blood, a specific non-glycated amino acid in non-glycated amino acids generated by cleavage, and an oxidase that reacts specifically with it are measured, and the concentration of a substance produced or consumed by the enzymatic reaction is measured. The method for measuring a glycation ratio of a specific protein according to claim 1.
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の糖化割合測定方法。 The method for measuring a saccharification ratio according to claim 1 or 2, wherein the specific protein is albumin.
糖化ε―リジン及び糖化ε―リジン残基を含むペプチドに特異的に反応する酸化酵素がフルクトシルペプチドオキシダーゼ（FPOX）であり、
非糖化リジンに特異的に反応する酸化酵素がリジンオキシダーゼ（LyOD）である
ことを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の糖化割合測定方法。 The specific glycated amino acid is glycated ε-lysine, the specific glycated peptide is a peptide containing a glycated ε-lysine residue, and the specific non-glycated amino acid is lysine,
The oxidase that specifically reacts with peptides containing glycated ε-lysine and glycated ε-lysine residues is fructosyl peptide oxidase (FPOX),
The method for measuring a saccharification ratio according to any one of claims 1 to 3, wherein the oxidase specifically reacting with non-glycated lysine is lysine oxidase (LyOD).
前記血液に、プロテアーゼ阻害物質を混合し、プロテアーゼを失活させる工程を含む
ことを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の糖化割合測定方法。 Before mixing oxidase into blood after cleavage of specific proteins,
The method for measuring a saccharification ratio according to any one of claims 1 to 4, further comprising a step of mixing a protease inhibitor with the blood to inactivate the protease.
ことを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の糖化割合測定方法。 The method according to any one of claims 1 to 5, further comprising a step of removing a specific amino acid released in the blood before mixing the blood and a protease that specifically acts on the specific protein. Saccharification ratio measurement method.
ことを特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載の糖化割合測定方法。 The method according to any one of claims 1 to 6, further comprising a step of removing a specific glycated amino acid and a specific glycated peptide that are released into the blood before mixing the blood and a protease that specifically acts on the specific protein. The method for measuring a saccharification ratio according to claim 1.
測定すべき血液を導入する血液導入部と、
前記血液導入部に連通し、血液導入部から導入されてきた血液に、特定タンパク質に特異的に作用するプロテアーゼとを混合し、血液中の特定タンパク質から糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを切断すると共に、血液中の特定タンパク質から非糖化アミノ酸及び非糖化ペプチドを切断する切断処理部と、
前記切断処理部において生成された糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの中の特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドと、これらに特異的に反応する酸化酵素とを反応させると共に、前記切断処理部において生成された非糖化アミノ酸の特定の非糖化アミノ酸と、それに特異的に反応する酸化酵素とを反応させる少なくとも一つの反応処理部と
を備えている
ことを特徴とする特定タンパク質の糖化割合測定用使い捨て検査具。 A disposable test device used for measuring the glycation ratio of a specific protein in blood,
A blood introduction part for introducing blood to be measured;
The blood communicated with the blood introduction part, mixed with the blood introduced from the blood introduction part with a protease that specifically acts on the specific protein, cleaves glycated amino acids and glycated peptides from the specific protein in the blood, and blood A cleavage processing unit for cleaving a non-glycated amino acid and a non-glycated peptide from a specific protein therein,
The specific glycated amino acid and glycated peptide in the glycated amino acid and glycated peptide generated in the cleavage processing unit are reacted with an oxidase specifically reacting with the glycated amino acid and glycated peptide, and the non-glycation generated in the cleavage processing unit A disposable test tool for measuring a glycation ratio of a specific protein, comprising: a specific non-glycated amino acid of an amino acid and at least one reaction processing unit for reacting an oxidase specifically reacting with the non-glycated amino acid.
第１反応処理部及び第２反応処理部が各々と前記切断処理部と連通され、
第１反応処理部が、特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドと、これらと特異的に反応する酸化酵素とを反応させるように構成され、
第２反応処理部が、特定の非糖化アミノ酸と、それに特異的に反応する酸化酵素とを反応させるように構成されている
ことを特徴とする請求項８に記載の使い捨て検査具。 The reaction processing unit includes two separated first reaction processing unit and second reaction processing unit,
A first reaction processing unit and a second reaction processing unit communicate with each of the cutting processing unit,
The first reaction processing unit is configured to react a specific glycated amino acid and a glycated peptide with an oxidase that specifically reacts with these,
The disposable test tool according to claim 8, wherein the second reaction processing unit is configured to react a specific non-glycated amino acid with an oxidase specifically reacting with the non-glycated amino acid.
前記切断処理部が、アルブミンに特異的に作用するプロテアーゼと血液とを混合するように構成されている
ことを特徴とする請求項８又は９に記載の使い捨て検査具。 The specific protein is albumin;
The disposable inspection tool according to claim 8 or 9, wherein the cutting processing unit is configured to mix a protease that specifically acts on albumin and blood.
特定の糖化ペプチドが、糖化ε―リジン残基を含むペプチドであり、
第１反応処理部で混合される酸化酵素がフルクトシルペプチドオキシダーゼ（FPOX）であり、
前記特定の非糖化アミノ酸が、リジンであり、
第２処理部で混合される酸化酵素が、リジンオキシダーゼ（LyOD）である
ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の使い捨て検査具。 The specific glycated amino acid is glycated ε-lysine;
The specific glycated peptide is a peptide containing a glycated ε-lysine residue,
The oxidase mixed in the first reaction processing part is fructosyl peptide oxidase (FPOX),
The specific non-glycated amino acid is lysine;
The disposable inspection tool according to claim 9 or 10, wherein the oxidase mixed in the second processing unit is lysine oxidase (LyOD).
該プロテアーゼ失活処理部が、切断処理部にて処理された血液にプロテアーゼ阻害物質を混合し、血液中のプロテアーゼを失活させるように構成されている
ことを特徴とする請求項８〜１１の何れか一項に記載の使い捨て検査具。 A protease deactivation processing unit is provided between the cleavage processing unit and the reaction processing unit,
The protease deactivation treatment unit is configured to mix a protease inhibitor with blood treated in the cutting treatment unit to deactivate the protease in the blood. The disposable inspection tool according to any one of the above.
血液導入部から流れてくる血液の中に遊離する特定の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを除去する処理部が設けられている
ことを特徴とする請求項８〜１２の何れか一項に記載の使い捨て検査具。 Between the blood introduction part and the cutting processing part,
The disposable inspection according to any one of claims 8 to 12, further comprising a processing unit for removing a specific glycated amino acid and a glycated peptide that are liberated in blood flowing from the blood introduction unit. Ingredients.
血液導入部から流れてくる血液の中に遊離する特定の非糖化アミノ酸を除去する処理部が設けられている
ことを特徴とする請求項８〜１３の何れか一項に記載の使い捨て検査具。 Between the blood introduction part and the cutting processing part,
The disposable inspection tool according to any one of claims 8 to 13, wherein a processing unit for removing a specific non-glycated amino acid released in blood flowing from the blood introduction unit is provided.
ことを特徴とする請求項８〜１４の何れか一項に記載の使い捨て検査具。 The said reaction process part is comprised so that the substance produced | generated or consumed by reaction with an oxidase can be detected with an optical means. The disposable as described in any one of Claims 8-14 characterized by the above-mentioned. Inspection tool.
ことを特徴とする請求項８〜１４の何れか一項に記載の使い捨て検査具。
The said reaction process part is comprised so that the substance produced | generated or consumed by reaction with an oxidase can be measured with an electrochemical means. The thing as described in any one of Claims 8-14 characterized by the above-mentioned. Disposable inspection tool.
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