JP2006055125A - New peptide having function to suppress transcription of gene, polynucleotide encoding the same and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、遺伝子の転写抑制機能を有する新規ペプチドとその代表的な利用に関するものであり、より具体的には、転写因子と融合させることによって転写因子を転写抑制因子に変換することができるペプチド、及びこれをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらを利用した転写抑制方法等に関するものである。 The present invention relates to a novel peptide having a transcriptional repression function of a gene and a typical use thereof, and more specifically, a peptide capable of converting a transcription factor into a transcriptional repression factor by fusing with the transcription factor. , And a polynucleotide encoding the same, and a transcription repression method using the same.
生体において、遺伝子の発現制御又は転写調節は、種々の遺伝子の機能を解析するために有用であるだけでなく、様々な産業にも応用が期待される。特に、転写の調節のうち転写の抑制については、応用分野として、例えば、癌遺伝子等の疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する等の医療産業や、植物の改良等のアグリビジネス産業等が挙げられる。 In vivo, gene expression control or transcriptional regulation is not only useful for analyzing the functions of various genes, but is expected to be applied to various industries. In particular, with regard to the suppression of transcription in the regulation of transcription, the applied fields include, for example, the medical industry such as suppressing the expression of genes that cause diseases such as oncogenes, and the agribusiness industry such as plant improvement. Can be mentioned.
上記転写抑制の具体的な手段としては、アンチセンス法及びリボザイム法が一般に知られている。 As specific means for suppressing the transcription, an antisense method and a ribozyme method are generally known.
アンチセンス法では、転写を抑制しようとする標的遺伝子や当該標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡ等の特異部位と結合させるため、当該特異部位と相補的な配列を有するポリヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ）を用いる。 In the antisense method, a polynucleotide (antisense DNA or RNA) having a sequence complementary to the specific site in order to bind to a specific site such as a target gene whose transcription is to be suppressed or mRNA transcribed from the target gene. Is used.
また、リボザイム法では、リボザイムすなわち酵素活性を有するＲＮＡ分子を用いる。 In the ribozyme method, a ribozyme, that is, an RNA molecule having enzyme activity is used.
上記アンチセンス法及びリボザイム法は、転写を抑制する標的遺伝子の塩基配列に注目し、それを利用して転写抑制を行うものである。 The antisense method and ribozyme method pay attention to the base sequence of a target gene that suppresses transcription and use it to suppress transcription.
一方、上記アンチセンス法及びリボザイム法とは別のアプローチによって遺伝子の転写を抑制する方法もある。 On the other hand, there is a method of suppressing gene transcription by an approach different from the antisense method and the ribozyme method.
以前、本発明者らは、シロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３、ＡｔＥＲＦ４、ＡｔＥＲＦ７又はＡｔＥＲＦ８タンパク質を転写因子と融合させたタンパク質が遺伝子の転写を顕著に抑制するとの知見を得た。そこで、上記タンパク質をそれぞれコードする遺伝子及びこれから切り出したＤＮＡを含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に遺伝子の転写を抑制することに成功している（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３、及び特許文献４参照）。
Previously, the present inventors have found that a protein obtained by fusing an Arabidopsis-derived AtERF3, AtERF4, AtERF7, or AtERF8 protein with a transcription factor remarkably suppresses gene transcription. Thus, by constructing an effector plasmid containing a gene encoding each of the above proteins and DNA excised therefrom, and introducing this into a plant cell, it has succeeded in actually suppressing the transcription of the gene (for example, patent document). 1, Patent Document 2,
さらに本発明者らは、Ｃｌａｓｓ II ＥＲＦ（ethylene responsive element binding factor）遺伝子群の一つであるタバコＥＲＦ３（例えば特許文献５参照）、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質をコードする遺伝子（特許文献６参照）、並びにＺｎフィンガータンパク（Zinc finger Protein）の遺伝子群の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０、同ＺＡＴ１１をコードする遺伝子についても上記と同様な試験を行い、遺伝子の転写を抑制することを見出している。 Furthermore, the inventors of the present invention have classified tobacco ERF3 (see, for example, Patent Document 5) which is one of Class II ERF (ethylene responsive element binding factor) genes, a gene encoding rice OsERF3 protein (see Patent Document 6), and Zn. Tests similar to those described above have been performed on genes encoding Arabidopsis thaliana ZAT10 and ZAT11, which are one of the gene groups of finger proteins (Zinc finger Protein), and it has been found that gene transcription is suppressed.
上記各遺伝子の塩基配列はまちまちであるが、これらの遺伝子がコードするタンパク質又はペプチドには、７つのアミノ酸からなる共通のモチーフが存在することが明らかになっている（例えば非特許文献１、２参照）。
Although the base sequences of the above genes vary, it has been clarified that a common motif consisting of seven amino acids exists in the proteins or peptides encoded by these genes (for example, Non-Patent
なお、このようなキメラ遺伝子を用いた遺伝子の転写抑制の技術は、上記と同様、幾つかの植物で報告されており（非特許文献３、４参照）、さらに動物でも報告されている（非特許文献５〜９）。
In addition, the gene transcription suppression technology using such a chimeric gene has been reported in several plants as described above (see Non-Patent
そして、本発明者らはこれらの知見を基にして、特許文献７に開示しているように、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドを得ることに成功している。この特許文献７には、最小１０アミノ酸残基からなり、転写因子に結合させることによって当該転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドが記載されている。
しかしながら、上述のアンチセンス法及びリボザイム法は、以下のような問題点を有している。 However, the above-described antisense method and ribozyme method have the following problems.
まず、アンチセンス法では、調製されたアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡは、上記標的遺伝子以外の遺伝子の発現を抑制することには使用できない。それゆえ、他の標的遺伝子に対してはその配列に合わせて新たにアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを調製する必要がある。従って、アンチセンス法は、転写抑制の方法としては汎用性に欠けるという問題点を有している。 First, in the antisense method, the prepared antisense DNA or RNA cannot be used to suppress the expression of genes other than the target gene. Therefore, it is necessary to prepare a new antisense DNA or RNA in accordance with the sequence of other target genes. Therefore, the antisense method has a problem that it lacks versatility as a method for suppressing transcription.
また、アンチセンス法と同様にリボザイム法においても、リボザイムは、特異部位と結合させるための相補的な配列を有する必要があり、さらには、所定の位置で特異部位を切断可能なようにリボザイムを設計する必要がある。従って、リボザイム法も、転写抑制の方法としては汎用性に欠けるという問題点を有している。 In addition, in the ribozyme method as in the antisense method, the ribozyme must have a complementary sequence for binding to a specific site. Further, a ribozyme is used so that the specific site can be cleaved at a predetermined position. Need to design. Therefore, the ribozyme method also has a problem that it lacks versatility as a transcription suppression method.
加えてリボザイム法では、リボザイムを実際にホスト細胞中に導入すると、転写されたリボザイムに余分な配列が付加されてリボザイム活性が失われる場合がある。具体的には、例えば植物をホスト細胞とする場合、標的遺伝子を切断するように設計されたリボザイムを用いたとする。このとき、当該リボザイムをプロモーター（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子のプロモーター等）及びターミネーター（転写終結配列）に連結してベクターを構築し、実際に植物細胞中に導入した際、上記のようなリボザイム活性が失われてしまうという現象が生じる場合がある。従って、リボザイム法では、条件によっては再現性が低いという問題点も有している。
In addition, in the ribozyme method, when a ribozyme is actually introduced into a host cell, an extra sequence may be added to the transcribed ribozyme and the ribozyme activity may be lost. Specifically, for example, when a plant is used as a host cell, a ribozyme designed to cleave a target gene is used. At this time, when the ribozyme is linked to a promoter (such as a promoter of the
また、上記アンチセンス法及びリボザイム法は、標的遺伝子の特定及び塩基配列の決定が不可欠となっており、特定の遺伝子群や塩基配列が未決定の遺伝子等に対しては転写を抑制することができないという問題点も有している。 In addition, in the antisense method and ribozyme method, identification of the target gene and determination of the base sequence are indispensable, and it is possible to suppress transcription of a specific gene group or genes whose base sequence has not been determined. It also has the problem that it cannot.
以上のように、上記アンチセンス法又はリボザイム法等の転写制御方法は、汎用性に欠ける、条件によっては再現性が低い、塩基配列まで特定された遺伝子にしか利用できない等の課題を有している。そのため、その用途が限られるといった問題点がある。 As described above, transcription control methods such as the antisense method and ribozyme method have problems such as lack of versatility, low reproducibility depending on conditions, and use only for genes specified up to the base sequence. Yes. Therefore, there is a problem that its use is limited.
これに対して、本発明者らによって見出された、転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドを用いる方法によれば、上記アンチセンス法やリボザイム法のもつ汎用性や再現性の問題を克服して遺伝子の転写を抑制することができる。 On the other hand, according to the method using a peptide that has been found by the present inventors to convert a transcription factor into a transcription repressor, the problems of versatility and reproducibility of the antisense method and ribozyme method are overcome. Thus, gene transcription can be suppressed.
本発明者らは、上記ペプチドに関してさらに鋭意検討した結果、６アミノ酸残基からなり、かつ、転写因子を転写抑制因子に変換する新規なペプチドを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of further intensive studies on the above peptides, the present inventors have found a new peptide comprising 6 amino acid residues and converting a transcription factor into a transcription repressing factor, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明に係る変換ペプチドは、上記課題を解決するために、次に示す一般式（１）、（２）又は（３）
α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ ・・・（１）
α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ ・・・（２）
α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ ・・・（３）
（ただし、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ又はＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｃｙｓ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ又はＳｅｒを示し、β２は、Ａｓｎ又はＳｅｒを示し、γ1は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＨｉｓを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、転写因子を転写抑制因子に変換することを特徴とする。
That is, in order to solve the above problems, the conversion peptide according to the present invention is represented by the following general formula (1), (2) or (3).
α 1 -Leu-β 1 -Leu-γ 1 -Leu (1)
α 1 -Leu-β 2 -Leu-Arg-Leu (2)
α 2 -Leu-β 1 -Leu-Arg-Leu (3)
(Wherein α 1 represents Asp, Asn, Cys or Ser, α 2 represents Asn, Cys or Ser, β 1 represents Asp, Asn or Ser, and β 2 represents Asn or Ser. And γ 1 represents Ser, Lys, or His.)
And a transcription factor is converted into a transcriptional repression factor.
また、本発明に係る変換ペプチドにおいて、上記一般式（１）乃至（３）におけるα１及びα２は、Ｃｙｓであってもよい。 In the conversion peptide according to the present invention, α 1 and α 2 in the general formulas (1) to (3) may be Cys.
また、本発明に係る変換ペプチドは、配列番号１乃至６の何れか１つで表されるアミノ酸配列を有し、かつ、転写因子を転写抑制因子に変換することを特徴とする。 The conversion peptide according to the present invention has an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 6, and is characterized by converting a transcription factor into a transcription repressing factor.
また、本発明に係る変換ペプチドは、上記変換ペプチドにおいて第１，３，５番目に存在するアミノ酸のうち１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、転写因子を転写抑制因子に変換するものであってもよい。 The conversion peptide according to the present invention comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids of the first, third, and fifth amino acids in the conversion peptide are substituted, and the transcription factor is a transcriptional repression factor. It may be converted to.
本発明に係る転写抑制因子は、上記課題を解決するために、上記変換ペプチドと、任意の転写因子又は少なくともＤＮＡ結合ドメインを含む任意の転写因子の一部とを融合させてなることを特徴とする。 The transcriptional repressing factor according to the present invention is characterized in that, in order to solve the above-mentioned problems, the conversion peptide is fused with any transcription factor or a part of any transcription factor including at least a DNA binding domain. To do.
また、本発明に係る転写抑制因子において、上記転写因子は、ＧＡＬ４タンパク質、ＥＲＦ１タンパク質、ＥＩＮ３タンパク質、ＣＵＣ１タンパク質、ＰＡＰ１タンパク質又はＡｔＭＹＢ２３タンパク質であってもよい。 In the transcription repressing factor according to the present invention, the transcription factor may be GAL4 protein, ERF1 protein, EIN3 protein, CUC1 protein, PAP1 protein, or AtMYB23 protein.
本発明に係る変換オリゴヌクレオチドは、上記課題を解決するために、上記変換ペプチドをコードすることを特徴とする。 The conversion oligonucleotide according to the present invention is characterized by encoding the conversion peptide in order to solve the above-mentioned problems.
本発明に係る転写抑制因子ポリヌクレオチドは、上記課題を解決するために、上記転写抑制因子をコードすることを特徴とする。 The transcriptional repressing factor polynucleotide according to the present invention encodes the above transcriptional repressing factor in order to solve the above-mentioned problems.
本発明に係るベクターは、上記課題を解決するために、上記変換オリゴヌクレオチドと、これに隣接する１つ以上の制限酵素認識部位とを含むことを特徴とする。 In order to solve the above-mentioned problems, the vector according to the present invention comprises the above-mentioned conversion oligonucleotide and one or more restriction enzyme recognition sites adjacent thereto.
また、本発明に係る別のベクターは、上記課題を解決するために、上記転写抑制因子ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。 Another vector according to the present invention is characterized by including the transcription repressor polynucleotide in order to solve the above-mentioned problems.
本発明に係る形質転換体は、上記課題を解決するために、上記ベクターによって形質転換されたことを特徴とする。 The transformant according to the present invention is characterized by being transformed with the above-mentioned vector in order to solve the above problems.
また、本発明に係る形質転換細体は、単細胞生物であってもよい。 Moreover, the single cell organism may be sufficient as the transformation body which concerns on this invention.
また、本発明に係る形質転換細胞は、植物由来の細胞又は個体であってもよい。 The transformed cell according to the present invention may be a plant-derived cell or an individual.
本発明に係る発現ベクター構築用ベクターは、転写抑制因子を植物細胞において発現させる発現ベクターを構築するために用いられるベクターであって、上記課題を解決するために、２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター、上記変換オリゴヌクレオチド及び１個以上の制限酵素認識部位を備え、前記２つのａｔｔ部位の間に、前記プロモーター及びターミネーターが存在し、さらに当該プロモーター及びターミネーターとの間に、前記変換オリゴヌクレオチドと１個以上の制限酵素部位とが存在することを特徴とする。 The vector for constructing an expression vector according to the present invention is a vector used for constructing an expression vector for expressing a transcriptional repressing factor in a plant cell, and in order to solve the above problems, two att sites, a promoter, and a terminator The conversion oligonucleotide and one or more restriction enzyme recognition sites, the promoter and terminator are present between the two att sites, and the conversion oligonucleotide and 1 are located between the promoter and terminator. It is characterized by the presence of one or more restriction enzyme sites.
また、本発明に係る別の発現ベクター構築用ベクターは、転写抑制因子を植物細胞において発現させる発現ベクターを構築するために用いられるベクターであって、上記課題を解決するために、２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター及び上記転写抑制因子ポリヌクレオチドを備え、前記２つのａｔｔ部位の間に、前記プロモーター及びターミネーターが存在し、さらに当該プロモーター及びターミネーターとの間に、前記転写抑制因子ポリヌクレオチドが存在することを特徴とする。 Another expression vector construction vector according to the present invention is a vector used for constructing an expression vector for expressing a transcriptional repressing factor in a plant cell. In order to solve the above problems, two att sites are used. A promoter, a terminator and the transcription repressor polynucleotide, wherein the promoter and terminator are present between the two att sites, and further, the transcription repressor polynucleotide is present between the promoter and terminator. It is characterized by that.
また、本発明に係る発現ベクター構築用ベクターは、ｐＵＣ系プラスミドベクターであることが好ましい。 Moreover, the expression vector construction vector according to the present invention is preferably a pUC plasmid vector.
また、本発明に係る発現ベクター構築用ベクターにおいて、上記プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子のプロモーター又はアクチン遺伝子のプロモーターであることが好ましい。
In the expression vector construction vector according to the present invention, the promoter is preferably a promoter of the
また、本発明に係る発現ベクター構築用ベクターにおいて、上記ターミネーターは、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域であることが好ましい。 In the expression vector construction vector according to the present invention, the terminator is preferably a transcription termination region of a nopaline synthase gene.
本発明に係る発現ベクターの構築方法は、上記課題を解決するために、上記発現ベクター構築用ベクターを用いることを特徴としている。 The method for constructing an expression vector according to the present invention is characterized by using the above-described vector for constructing an expression vector in order to solve the above problems.
本発明に係る発現ベクターは、上記課題を解決するために、上記発現ベクターの構築方法により得られたものであることを特徴とする。 The expression vector according to the present invention is obtained by the above-described method for constructing an expression vector in order to solve the above-mentioned problems.
本発明に係る遺伝子の転写抑制方法は、上記課題を解決するために、上記変換オリゴヌクレオチドと、任意の転写因子、又は少なくともＤＮＡ結合ドメインを含む任意の転写因子の一部をコードする転写因子ポリヌクレオチドと、プロモーターとを含んでなる発現ベクターを宿主細胞に導入し、転写因子を転写抑制因子に変換する変換ペプチドと転写因子とを融合させた転写抑制因子を発現させる工程を含んでいることを特徴とする。 In order to solve the above-described problems, the gene transcription repression method according to the present invention comprises the above-described conversion oligonucleotide and an arbitrary transcription factor, or a transcription factor poly- gram encoding at least a part of an arbitrary transcription factor containing a DNA binding domain. Introducing an expression vector comprising a nucleotide and a promoter into a host cell, and expressing a transcriptional repressing factor in which the transcription factor is fused with a conversion peptide that converts the transcription factor into a transcriptional repressing factor. Features.
本発明に係る遺伝子の転写抑制方法は、さらに、上記発現ベクターを構築する工程を含んでいてもよい。 The gene transcription repression method according to the present invention may further include a step of constructing the expression vector.
また、本発明に係る別の遺伝子の転写抑制方法は、上記発現ベクターを宿主細胞に導入し、転写因子を転写抑制因子に変換する変換ペプチドと転写因子とを融合させた転写抑制因子を発現させる工程を含んでいることを特徴とする。 Another gene transcription repression method according to the present invention introduces the above expression vector into a host cell, and expresses a transcription repression factor fused with a conversion peptide that converts the transcription factor into a transcription repression factor and a transcription factor. It includes a process.
本発明は上記の構成を備えているので、転写因子抑制変換ペプチドを任意の転写因子と融合させることによって上記転写因子を転写抑制因子に変換することができる。また、変換した転写抑制因子を用いれば、上記転写因子の標的となる特定の遺伝子の転写を抑制することができる。従って、塩基配列が未知の遺伝子であっても、或いは、単一遺伝子ではなく特定の遺伝子群であっても、任意の転写因子の標的となるものであれば、当該遺伝子又は遺伝子群の転写を再現性よく抑制することができる。以上のように、本発明によれば汎用的に、かつ、簡単な工程によって遺伝子の転写を抑制することができるという効果を奏する。 Since this invention is equipped with said structure, the said transcription factor can be converted into a transcriptional repression factor by fusing the transcription factor repression conversion peptide with arbitrary transcription factors. Moreover, if the transcription | transfer suppression factor converted is used, transcription | transfer of the specific gene used as the target of the said transcription factor can be suppressed. Therefore, even if it is a gene whose base sequence is unknown, or a specific gene group rather than a single gene, transcription of the gene or gene group is possible as long as it is a target of any transcription factor. It can be suppressed with good reproducibility. As described above, according to the present invention, there is an effect that gene transcription can be suppressed by a general and simple process.
本発明の実施の一形態について説明すると以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。 An embodiment of the present invention will be described as follows. Note that the present invention is not limited to this.
以下の説明では、説明の便宜上、適宜略称を用いることがある。同じく説明の便宜上、例えば配列番号Ｘで示されるアミノ酸配列を有するペプチドを、適宜「配列番号Ｘのペプチド」と表現することがある。塩基配列についても同様である。また、（Ｘ）式で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを、「（Ｘ）式のペプチド」と表現することがある。 In the following description, abbreviations may be used as appropriate for convenience of description. Similarly, for convenience of explanation, for example, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: X may be appropriately expressed as “peptide of SEQ ID NO: X”. The same applies to the base sequence. In addition, a peptide having an amino acid sequence represented by formula (X) may be expressed as “peptide of formula (X)”.
また、本発明において、「ポリヌクレオチド」には、全てのＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えばクローニング及び／又は化学合成技術で得られるようなｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ等が含まれる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい。 In the present invention, “polynucleotide” includes all DNA and RNA. DNA includes, for example, cDNA and genomic DNA obtained by cloning and / or chemical synthesis techniques. DNA may be double-stranded or single-stranded.
［変換ペプチドの構造］
本発明者は、植物特異的なＥＲＦ転写因子群（非特許文献１参照）及びＴＦＩＩＩＡ−Ｔｙｐｅ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ転写（ＳＵＰＥＲＭＡＮを含む、非特許文献２参照）の中で、転写抑制因子として機能する因子のカルボキシル基末端に共通して存在するアミノ酸配列を見出した。このアミノ酸配列、すなわちＥＡＲ（ERF-associated Amphihilic Repression）モチーフは、７つのアミノ酸からなっている。本発明者は、以前、このＥＡＲモチーフを基に、最小で１０アミノ酸からなり、かつ、転写因子と融合させることによって転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドを発明している（特許文献７を参照）。そして本発明者はさらに鋭意検討した結果、今回新たに６つのアミノ酸残基からなり、第２，４，６番目のアミノ酸は全てロイシンであり、転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドを完成するに至った。
[Structure of converted peptide]
The present inventor is a group of plant-specific ERF transcription factors (see Non-Patent Document 1) and TFIIIA-Type Zinc Finger transcription (including SUPERMAN, see Non-Patent Document 2) of factors that function as transcription repressors. A common amino acid sequence was found at the carboxyl group terminal. This amino acid sequence, that is, the EAR (ERF-associated Amphihilic Repression) motif is composed of seven amino acids. The inventor has previously invented a peptide consisting of a minimum of 10 amino acids based on this EAR motif and converting a transcription factor into a transcriptional repressing factor by fusing with the transcription factor (Patent Document 7). reference). As a result of further intensive studies, the present inventor has now completed a peptide that consists of 6 amino acid residues, the second, fourth, and sixth amino acids are all leucine and converts a transcription factor into a transcription repressor. It came to.
すなわち、本発明に係る変換ペプチドは、次に示す一般式（１）、（２）又は（３）
α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ ・・・（１）
α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ ・・・（２）
α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ ・・・（３）
（ただし、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ又はＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｃｙｓ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ又はＳｅｒを示し、β２は、Ａｓｎ又はＳｅｒを示し、γ1は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＨｉｓを示す。）
によって表されるアミノ酸配列を有する。
That is, the converted peptide according to the present invention has the following general formula (1), (2) or (3)
α 1 -Leu-β 1 -Leu-γ 1 -Leu (1)
α 1 -Leu-β 2 -Leu-Arg-Leu (2)
α 2 -Leu-β 1 -Leu-Arg-Leu (3)
(Wherein α 1 represents Asp, Asn, Cys or Ser, α 2 represents Asn, Cys or Ser, β 1 represents Asp, Asn or Ser, and β 2 represents Asn or Ser. And γ 1 represents Ser, Lys, or His.)
The amino acid sequence represented by
本発明に係る変換ペプチドでは、上記の一般式（１）、乃至（３）におけるα１及びα２は、Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列を有していてもよい。 In the conversion peptide according to the present invention, α 1 and α 2 in the general formulas (1) to (3) may have an amino acid sequence represented by Cys.
本発明に係る変換ペプチドは、配列番号１乃至６の何れかで表されるアミノ酸配列を有することが好ましい。なお、配列番号１，２，５，６のペプチドは（１）式のペプチドに含まれ、配列番号３，４のペプチドは（３）式のペプチドに含まれる。
The conversion peptide according to the present invention preferably has the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 6. In addition, the peptide of
また、本発明に係る変換ペプチドは、上記変換ペプチドにおいて、第１，３，５番目に存在するアミノ酸のうち１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつ転写因子を転写抑制因子に変換するものであってもよい。ここで、「１若しくは数個」は、特に限定されないが、例えば１から３個を示し、好ましくは１又は２個を示し、より好ましくは１個を示す。 The conversion peptide according to the present invention comprises an amino acid sequence obtained by substituting one or several amino acids among the first, third, and fifth amino acids in the conversion peptide, and the transcription factor is a transcriptional repression factor. It may be converted to. Here, “1 or several” is not particularly limited, but represents, for example, 1 to 3, preferably 1 or 2, and more preferably 1.
上述のように、本発明の変換ペプチドは、その構造として６つのアミノ酸残基からなると共に第２，４，６番目のアミノ酸が全てロイシンであり、上記の構造の何れかを持つ。そして、上記変換ペプチドは、当該ペプチドと融合した任意の転写因子を転写抑制因子に変換する。その結果、上記転写因子が標的とする遺伝子又は遺伝子群の転写を抑制することができる。従って、上記の構成によれば、上記変換ペプチドは、標的とする遺伝子又は遺伝子群の転写を再現性よく抑制することができるという効果を奏する。また、転写因子を変換した転写抑制因子を介して、標的となる遺伝子の転写を抑制するため、当該遺伝子の塩基配列が未知のものであっても抑制することができる。 As described above, the conversion peptide of the present invention has six amino acid residues as its structure, and the second, fourth, and sixth amino acids are all leucine, and has any of the above structures. The conversion peptide converts an arbitrary transcription factor fused with the peptide into a transcription repressing factor. As a result, transcription of the gene or gene group targeted by the transcription factor can be suppressed. Therefore, according to said structure, the said conversion peptide has an effect that the transcription | transfer of the target gene or gene group can be suppressed with sufficient reproducibility. Further, since transcription of a target gene is suppressed via a transcriptional repressing factor obtained by converting a transcription factor, it can be suppressed even if the base sequence of the gene is unknown.
本発明に係る変換ペプチドは、特許文献７に開示されている従来の変換ペプチドをさらに短くすることによって、以下に説明する利点を持っている。 The conversion peptide according to the present invention has the advantages described below by further shortening the conventional conversion peptide disclosed in Patent Document 7.
上記変換ペプチドを用いて転写抑制因子を作製するためには、転写因子をコードする遺伝子（以下「転写因子遺伝子」という。）と上記変換ペプチドをコードする変換オリゴヌクレオチドとを連結する必要がある。この連結する工程において、本発明の変換ペプチドをコードする変換オリゴヌクレオチドは塩基数が１８塩基しかないことから、当該オリゴヌクレオチドと、鋳型になる転写因子遺伝子の末端配列に対して相補的な配列とを含む合成プライマーを作製し、当該プライマーを用いて転写因子遺伝子を鋳型としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことによって容易に転写抑制因子をコードするポリヌクレオチドを得ることができるようになった。 In order to produce a transcription repressing factor using the conversion peptide, it is necessary to link a gene encoding the transcription factor (hereinafter referred to as “transcription factor gene”) and a conversion oligonucleotide encoding the conversion peptide. In this linking step, since the conversion oligonucleotide encoding the conversion peptide of the present invention has only 18 bases, the oligonucleotide and a sequence complementary to the terminal sequence of the transcription factor gene used as a template It is now possible to easily obtain a polynucleotide encoding a transcription repressing factor by performing a PCR (Polymerase Chain Reaction) using the primer and a transcription factor gene as a template.
以上のように本発明の変換ペプチドは、その塩基数が少ないために転写因子と融合させる等するための後段の組換え作業を飛躍的に簡素化できるという利点を有している。 As described above, the conversion peptide of the present invention has the advantage that the subsequent recombination operation for fusing with a transcription factor can be greatly simplified because of its small base number.
［変換オリゴヌクレオチドの構造］
変換オリゴヌクレオチドの具体的な構成は、遺伝暗号表に基づいて上記変換ペプチドをコードする塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるか、或いは上記塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドでれば特に限定されるものではない。便宜上、以下の説明においては、上記の相補的な塩基配列も変換ペプチドをコードしていることとする。
[Conversion oligonucleotide structure]
The specific structure of the conversion oligonucleotide is an oligonucleotide consisting of a base sequence encoding the conversion peptide based on the genetic code table, or an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence. There is no particular limitation. For convenience, in the following description, it is assumed that the above complementary base sequence also encodes a conversion peptide.
上記変換オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号７から１８のオリゴヌクレオチドを挙げることができる。 As said conversion oligonucleotide, the oligonucleotide of sequence number 7 to 18 can be mentioned, for example.
なお、配列番号７，８のオリゴヌクレオチドは配列番号１のペプチドをコードしており、配列番号９，１０のオリゴヌクレオチドは配列番号２のペプチドをコードしており、配列番号１１，１２のオリゴヌクレオチドは配列番号３のペプチドをコードしており、配列番号１３，１４のオリゴヌクレオチドは配列番号４のペプチドをコードしており、配列番号１５，１６のオリゴヌクレオチドは配列番号５のペプチドをコードしており、配列番号１７，１８のオリゴヌクレオチドは配列番号６のペプチドをコードしている。 The oligonucleotides of SEQ ID NOs: 7 and 8 encode the peptide of SEQ ID NO: 1, the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 9 and 10 encode the peptide of SEQ ID NO: 2, and the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 11 and 12 Encodes the peptide of SEQ ID NO: 3, the oligonucleotides of SEQ ID NO: 13, 14 encode the peptide of SEQ ID NO: 4, the oligonucleotides of SEQ ID NO: 15, 16 encode the peptide of SEQ ID NO: 5 The oligonucleotides of SEQ ID NOs: 17 and 18 encode the peptide of SEQ ID NO: 6.
また、上記変換オリゴヌクレオチドは、必要により、転写因子又はその一部をコードするポリヌクレオチドと連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。或いは、上記変換ペプチドをコードする塩基配列のアミノ酸読み枠と転写因子又はその一部をコードする遺伝子のアミノ酸読み枠とが一致しないような場合には、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。 Moreover, the said conversion oligonucleotide may contain the base sequence used as the connection part for connecting with the polynucleotide which codes a transcription factor or its part if needed. Alternatively, if the amino acid reading frame of the base sequence encoding the conversion peptide does not match the amino acid reading frame of the gene encoding the transcription factor or a part thereof, an additional base sequence for matching them May be included.
例として、付加的な塩基配列を含んだ変換オリゴヌクレオチドとして配列番号１９から３０のオリゴヌクレオチドを挙げる。上記塩基配列には、酵母ＧＡＬ４タンパク質に含まれるＤＮＡ結合ドメインをコードする塩基配列のアミノ酸読み枠と、変換オリゴヌクレオチドのアミノ酸読み枠とを一致させるために付加的な塩基配列を含んでいる。 As an example, oligonucleotides of SEQ ID NOs: 19 to 30 are listed as conversion oligonucleotides containing an additional base sequence. The above base sequence contains an additional base sequence for matching the amino acid reading frame of the base sequence encoding the DNA binding domain contained in the yeast GAL4 protein with the amino acid reading frame of the conversion oligonucleotide.
なお、配列番号１９，２０のオリゴヌクレオチドは配列番号１のペプチドをコードしており、配列番号２１，２２のオリゴヌクレオチドは配列番号２のペプチドをコードしており、配列番号２３，２４のオリゴヌクレオチドは配列番号３のペプチドをコードしており、配列番号２５，２６のオリゴヌクレオチドは配列番号４のペプチドをコードしており、配列番号２７，２８のオリゴヌクレオチドは配列番号５のペプチドをコードしており、配列番号２９，３０のオリゴヌクレオチドは配列番号６のペプチドをコードしている。 The oligonucleotides of SEQ ID NOS: 19 and 20 encode the peptide of SEQ ID NO: 1, the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 21 and 22 encode the peptide of SEQ ID NO: 2, and the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 23 and 24 Encodes the peptide of SEQ ID NO: 3, the oligonucleotides of SEQ ID NO: 25, 26 encode the peptide of SEQ ID NO: 4, and the oligonucleotides of SEQ ID NO: 27, 28 encode the peptide of SEQ ID NO: 5. The oligonucleotides of SEQ ID NOs: 29 and 30 encode the peptide of SEQ ID NO: 6.
［変換ペプチドおよび変換オリゴヌクレオチドの取得（生産）方法］
本発明に係る変換ペプチドの生産方法は特に限定されるものではない。例えば、上記の変換オリゴヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、それによって発現する変換ペプチドを回収することによって取得してもよい。また、本発明に係る変換ペプチドは６つのアミノ酸残基のみからなっているので、シンセサイザーにより合成することでも容易に取得でできる。或いは、変換ペプチドを含むタンパク質から消化酵素等で切断等することによって取得してもよい。
[Acquisition (Production) Method of Conversion Peptide and Conversion Oligonucleotide]
The method for producing the converted peptide according to the present invention is not particularly limited. For example, it may be obtained by transforming Escherichia coli or the like using an expression vector containing the above-described conversion oligonucleotide, and recovering the converted peptide expressed thereby. Moreover, since the conversion peptide according to the present invention consists of only six amino acid residues, it can be easily obtained by synthesis with a synthesizer. Alternatively, it may be obtained by cleaving with a digestive enzyme or the like from a protein containing a conversion peptide.
同様に、本発明に係る変換オリゴヌクレオチドの取得方法及び生産方法も特に限定されるものではない。例えば、上述した配列番号に記載されている塩基配列等に基づいて、シンセサイザーにより合成して取得してもよい。また、変換ペプチドを含むタンパク質をコードする遺伝子を鋳型として、該当する変換オリゴヌクレオチドをＰＣＲ等で増幅して取得してもよい。或いは、変換ペプチド含むタンパク質をコードする遺伝子から消化等することによって取得してもよい。また、変換オリゴヌクレオチドは、取得された変換オリゴヌクレオチドを鋳型としてＰＣＲ等により増幅することで大量に生産することができる。また、取得した上記オリゴヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌等を形質転換して、増幅したオリゴヌクレオチドを回収することによっても大量に生産することができる。 Similarly, the method for obtaining and producing the conversion oligonucleotide according to the present invention is not particularly limited. For example, it may be obtained by synthesizing with a synthesizer based on the base sequence described in the above-mentioned SEQ ID NO. Alternatively, the corresponding conversion oligonucleotide may be amplified by PCR or the like using a gene encoding a protein containing the conversion peptide as a template. Or you may acquire by digesting from the gene which codes the protein containing conversion peptide. In addition, the conversion oligonucleotide can be produced in large quantities by amplifying by PCR or the like using the obtained conversion oligonucleotide as a template. It can also be produced in large quantities by transforming Escherichia coli using the obtained vector containing the oligonucleotide and recovering the amplified oligonucleotide.
次に、上記の変換ペプチドにおいて、第１，３，５番目に存在するロイシン以外のアミノ酸のうち１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつ転写因子を転写抑制因子に変換することを特徴とする変換ペプチド（置換ペプチド）、及びこれをコードするオリゴヌクレオチド（置換オリゴヌクレオチド）の取得方法を説明する。上記置換ペプチド及び置換オリゴヌクレオチドの取得（生産）方法も特に制限されるものではない。 Next, in the above-mentioned conversion peptide, it consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids other than the first, third, and fifth amino acids other than leucine are substituted, and a transcription factor is converted into a transcription repressor. The conversion peptide (substitution peptide) characterized by this, and the method for obtaining the oligonucleotide (substitution oligonucleotide) encoding the same will be described. The method for obtaining (producing) the substituted peptide and the substituted oligonucleotide is not particularly limited.
置換オリゴヌクレオチドは、例えば、上述の変換ペプチドを元に、第１，３，５番目のアミノ酸残基が１若しくは数個異なるアミノ酸配列をコードするように、遺伝暗号表に基づいて塩基配列を作製し、上記塩基配列を有するポリヌクレオチドをシンセサイザーで合成する等することによって取得及び生産することができる。また、置換ポリペプチドは、取得された置換ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、当該ポリペプチドを発現させることによって生産することができる。 For example, based on the above-mentioned conversion peptide, a substitution oligonucleotide is prepared based on the genetic code table so that the first, third, and fifth amino acid residues encode one or several different amino acid sequences. It can be obtained and produced by synthesizing a polynucleotide having the above base sequence with a synthesizer. The substituted polypeptide can be produced by transforming E. coli or the like using an expression vector containing the obtained substituted polynucleotide and expressing the polypeptide.
［転写抑制因子及びこれをコードする転写抑制因子ポリヌクレオチド］
本発明に係る転写抑制因子は、上述した変換ペプチドと転写因子とを融合させてなり、転写因子が標的とする遺伝子の転写を抑制することができる。ここで、転写因子として、例えば、ＧＡＬ４タンパク質やＬｅｘＡタンパク質、Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒタンパク質等の一般的な転写因子や、後述のＥＲＦ１タンパク質、ＥＩＮ３タンパク質、ＣＵＣ１タンパク質、ＰＡＰ１タンパク質、ＡｔＭＹＢ２３タンパク質や、ＴＣＰファミリーに属するタンパク質、ＷＲＫＹファミリーに属するタンパク質、Ｄｏｆファミリーに属するタンパク質、ＭＡＤＳボックス型転写因子、ホメオドメイン転写因子等の植物の転写因子、さらには、ＭＹＣタンパク質等の動物の転写因子を用いることができる。なお、上記転写因子は、少なくともＤＮＡ結合ドメインを含んでいれば、転写因子の一部であってもよい。以下の説明においては、少なくともＤＮＡ結合ドメインを含む転写因子の一部も転写因子と称する。
[Transcriptional repressing factor and transcriptional repressing factor polynucleotide encoding the same]
The transcriptional repressing factor according to the present invention is obtained by fusing the above-described conversion peptide and a transcription factor, and can suppress transcription of a gene targeted by the transcription factor. Here, as transcription factors, for example, general transcription factors such as GAL4 protein, LexA protein, and Zinc-finger protein, ERF1 protein, EIN3 protein, CUC1 protein, PAP1 protein, AtMYB23 protein described later, and TCP family Proteins, proteins belonging to the WRKY family, proteins belonging to the Dof family, plant transcription factors such as MADS box type transcription factor and homeodomain transcription factor, and animal transcription factors such as MYC protein can be used. The transcription factor may be a part of the transcription factor as long as it contains at least a DNA binding domain. In the following description, a part of a transcription factor including at least a DNA binding domain is also referred to as a transcription factor.
上記の構成において、変換ペプチドは、当該ペプチドと融合した上記転写因子の転写活性を転写抑制活性に変換する。従って、転写抑制因子は、上記転写因子の標的となる遺伝子又は遺伝子群の転写活性を抑制することができる。 In the above configuration, the conversion peptide converts the transcriptional activity of the transcription factor fused with the peptide into transcriptional repression activity. Therefore, the transcriptional repressing factor can suppress the transcriptional activity of the gene or gene group that is the target of the transcription factor.
上記転写抑制因子は公知の方法、例えば、下記の方法によって取得することができる。まず、変換オリゴヌクレオチドと転写因子をコードするポリヌクレオチド（転写因子ポリヌクレオチド）とを連結させてなる転写抑制因子ポリヌクレオチドを作製する。ここで、変換オリゴヌクレオチドと転写因子ポリヌクレオチドとを連結させる方法としては、例えば、以下のようなものが挙げられる。まず、転写因子ポリヌクレオチドを鋳型としてＰＣＲによって増幅させるプライマーとして、転写因子ポリヌクレオチドの末端配列と変換ヌクレオチドとを連結させたプライマーを合成する。このプライマーと、転写因子ポリヌクレオチドのもう一方の末端配列を有するプライマーとを用いて転写因子ポリヌクレオチドを鋳型としてＰＣＲを行うことによって容易に転写抑制因子ポリヌクレオチドを得ることができる。 The transcription repressing factor can be obtained by a known method, for example, the following method. First, a transcription repressing factor polynucleotide is prepared by linking a conversion oligonucleotide and a polynucleotide encoding a transcription factor (transcription factor polynucleotide). Here, examples of the method for linking the conversion oligonucleotide and the transcription factor polynucleotide include the following. First, as a primer to be amplified by PCR using a transcription factor polynucleotide as a template, a primer in which a terminal sequence of the transcription factor polynucleotide and a converted nucleotide are linked is synthesized. By performing PCR using this primer and a primer having the other terminal sequence of the transcription factor polynucleotide, the transcription repressor polynucleotide can be easily obtained.
次に、当該転写抑制因子ポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入して、転写抑制因子発現ベクターを構築する。転写抑制因子は、当該発現ベクターを用いて適切な細胞を形質転換し、転写抑制因子を細胞内で発現させ、これを回収することにより取得することができる。 Next, the transcription repressing factor polynucleotide is inserted into an appropriate expression vector to construct a transcription repressing factor expression vector. The transcriptional repressing factor can be obtained by transforming an appropriate cell using the expression vector, expressing the transcriptional repressing factor in the cell, and collecting it.
また、本発明に係る転写抑制因子を使用する際には、大腸菌、酵母、哺乳類細胞、又は植物細胞等から適宜選択された細胞内で、上記のように転写抑制因子を大量に発現させ、これを回収した後に対象となる生物に使用してもよいし、或いは、上記転写抑制因子発現ベクターを用いて使用の対象となる生物の細胞を形質転換し、上記生物の細胞内で直接転写抑制因子を発現させてもよい。 In addition, when using the transcriptional repressing factor according to the present invention, a large amount of the transcriptional repressing factor is expressed as described above in cells appropriately selected from Escherichia coli, yeast, mammalian cells, plant cells, etc. May be used for the target organism after recovery, or the cells of the target organism are transformed with the transcription repressor expression vector, and the transcription repressor directly in the cells of the organism May be expressed.
また、上記転写抑制因子には、付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、Ｍｙｃ−Ｔａｇ、或いはＦｌａｇ等によって上記転写抑制因子がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。 Further, the transcription repressing factor may contain an additional polypeptide. Examples of the case where such a polypeptide is added include a case where the transcription repressing factor is epitope-labeled by His-Tag, Myc-Tag, Flag, or the like.
また、上記の形質転換の対象となる細胞は、大腸菌、枯草菌又は酵母等の単細胞生物であってもよいし、動物又は植物等を由来とする培養細胞でもよく、さらには、動物又は植物等の多細胞生物の生体に含まれる細胞であってもよい。 The cells to be transformed may be single cell organisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, or yeast, may be cultured cells derived from animals or plants, and further, animals or plants, etc. It may be a cell contained in the living body of a multicellular organism.
［変換オリゴヌクレオチドを含むベクター］
本発明に係るベクターは、上述した変換オリゴヌクレオチドと、当該変換オリゴヌクレオチドに隣接する領域に制限酵素認識部位とを有していれば特に限定されるものではない。上記ベクターには、例として、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター又はウイルスベクター等の任意のものを用いることができる。また、その用途はクローニング用、発現用等の何れであってもよい。
[Vector containing conversion oligonucleotide]
The vector according to the present invention is not particularly limited as long as it has the above-described conversion oligonucleotide and a restriction enzyme recognition site in a region adjacent to the conversion oligonucleotide. As the vector, for example, any vector such as a plasmid vector, a cosmid vector, a phage vector, or a virus vector can be used. Moreover, the use may be any of cloning and expression.
また、上記ベクターは、変換オリゴヌクレオチド及び制限酵素認識部位を含む代わりに、上記の転写抑制因子を発現する転写抑制因子ポリヌクレオチドを含むベクターであってもよい。 Further, the vector may be a vector containing a transcription repressing factor polynucleotide that expresses the above transcription repressing factor instead of including a conversion oligonucleotide and a restriction enzyme recognition site.
また、上記ベクターは、上記変換オリゴヌクレオチド及び制限酵素認識部位、或いは転写抑制因子ポリヌクレオチドを挟むようにして、任意のプロモーター及びターミネーターをさらに含んでいてもよい。ここで用いられるプロモーター及びターミネーターは、変換ペプチド又は転写抑制因子を発現させる生物の細胞内で機能するものであれば特に限定されるものではなく、所望の発現量を達成できるものを用いることができる。プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子のプロモーター、チキンβアクチン遺伝子のプロモーター、イネ等が有するアクチン遺伝子のプロモーター、及びイネ等が有するユビキチン遺伝子のプロモーター等が挙げられる。また、ターミネーターの例として、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域、及びＲｕｂｉｓｃｏ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ遺伝子の転写終止領域等が挙げられる。
The vector may further include an arbitrary promoter and terminator so as to sandwich the conversion oligonucleotide and the restriction enzyme recognition site or the transcription repressor polynucleotide. The promoter and terminator used here are not particularly limited as long as they function in cells of an organism that expresses the conversion peptide or transcription repressor, and those that can achieve a desired expression level can be used. . Examples of the promoter include a
上記ベクターは、公知の遺伝子工学的手法を用いることによって容易に構築することができる。また、当該ベクターは、適切な細胞内に導入し、培養することによって容易に大量生産することができる。 The vector can be easily constructed by using a known genetic engineering technique. In addition, the vector can be easily mass-produced by introducing it into appropriate cells and culturing it.
［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、上述した変換オリゴヌクレオチド及び制限酵素認識部位、或いは転写抑制因子ポリヌクレオチドを含むベクターによって形質転換された細胞又は個体であればよい。
[Transformant]
The transformant according to the present invention may be any cell or individual transformed with a vector containing the above-described conversion oligonucleotide and restriction enzyme recognition site or transcription repressor polynucleotide.
形質転換をする際のベクターの導入方法は特に限定されるものではなく、公知の遺伝子工学的手法を用いればよい。例えばコンピテントセルの使用、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ウイルスによる感染、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等を用いることができる。 The method for introducing a vector for transformation is not particularly limited, and a known genetic engineering technique may be used. For example, use of competent cells, electroporation method, lipofection method, microinjection method, virus infection, Agrobacterium method, particle gun method and the like can be used.
上記形質転換体は大きく分けて２つの用途がある。１つ目は、上記ベクターを増殖させるための形質転換体（増殖用形質転換体）としての利用である。上記増殖用形質転換体としては、上記ベクターを複製することのできる細胞であればよい。当該細胞を培養し増殖させることによって、細胞に含まれる上記ベクターを任意に増殖させ、大量生産を行うことができる。上記の増殖用形質転換体の種類は特に限定されるものではないが、大腸菌、枯草菌又は酵母等の細菌類又は真菌類が好ましい。また、上記ベクターがウイルスベクターである場合は、当該ウイルスの宿主となる細胞を選択すればよく、当該細胞として、例えば、昆虫細胞、哺乳類細胞、植物細胞等を用いることができる。 The transformant has two main purposes. The first is use as a transformant (a transformant for propagation) for growing the vector. The proliferation transformant may be any cell that can replicate the vector. By culturing and proliferating the cell, the vector contained in the cell can be arbitrarily proliferated and mass production can be performed. The kind of the transformant for propagation is not particularly limited, but bacteria or fungi such as Escherichia coli, Bacillus subtilis or yeast are preferable. In addition, when the vector is a viral vector, a cell serving as a host for the virus may be selected. Examples of the cell include insect cells, mammalian cells, plant cells, and the like.
上記形質転換細胞の２つ目の用途は、上記ベクターによって変換ペプチド又は転写抑制因子を発現させるための形質転換体（発現用形質転換体）としての利用である。ここで、「形質転換された」細胞とは、上記ベクターを有する細胞であってもよいし、或いは、導入された当該ベクターのうち、転写抑制因子ポリヌクレオチドを含む領域がゲノムＤＮＡ等に組み込まれ、当該ベクター自体は分解された細胞であってもよい。換言すれば、「形質転換された」細胞とは、上記ベクターが導入された結果として、上記転写抑制因子ポリヌクレオチドを含んでいる細胞であればよい。例えば、培養細胞等に上記ベクターを導入した後、恒常的に転写抑制因子を発現する細胞を選別したり、或いは、トランスポゾンを利用したベクターやレトロウイルスベクター等を用いたりすることによって、ゲノムＤＮＡ等に上記転写抑制因子ポリヌクレオチドを組み込んだ細胞等を挙げることができる。そのような細胞では、導入されたベクターは分解されていても、転写抑制因子ポリヌクレオチドは細胞内に残存し、それによって転写抑制因子を発現することができるので、形質転換された細胞と定義される。 The second use of the transformed cell is to use it as a transformant (expression transformant) for expressing a conversion peptide or a transcription repressing factor using the vector. Here, the “transformed” cell may be a cell having the above vector, or a region containing the transcription repressor polynucleotide in the introduced vector is incorporated into genomic DNA or the like. The vector itself may be a degraded cell. In other words, the “transformed” cell may be a cell containing the transcription repressor polynucleotide as a result of the introduction of the vector. For example, after introducing the above vector into cultured cells, etc., by selecting cells that constantly express the transcription repressing factor, or by using a vector using a transposon or a retroviral vector, etc. And cells incorporating the above transcription repressor polynucleotide. In such cells, even though the introduced vector has been degraded, the transcriptional repressor polynucleotide remains in the cell and is thereby capable of expressing the transcriptional repressor, so it is defined as a transformed cell. The
上記発現用形質転換体の種類は特に限定されるものではない。実験に本発明を適用する場合には、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物；シロイヌナズナ等の植物；マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、線虫等の動物；等に由来する細胞を用いることができる。また、農業分野に本発明を適用する場合は、各種作物（農林水産業で生産される植物、農作物）を生産する植物、具体的には、例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ等の穀物；各種野菜・花卉類；マツ、スギ、ヒノキ等の材木類；等を挙げることができる。さらに、医薬産業・医療産業分野では、ヒト又はヒト由来の培養細胞等を対象とすることもできる。また、上記の実験及び農業に適用される形質転換体は、培養細胞のみでなく、生体に含まれる細胞、臓器、器官あるいは個体をも含む。 The type of the transformant for expression is not particularly limited. When the present invention is applied to experiments, cells derived from microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast; plants such as Arabidopsis; animals such as mice, rats, zebrafish, Drosophila, nematodes; it can. When the present invention is applied to the agricultural field, plants that produce various crops (plants and crops produced in the agriculture, forestry and fisheries industry), specifically, grains such as rice, wheat, and corn; various vegetables・ Flowers: timbers such as pine, cedar and cypress; Furthermore, in the fields of the pharmaceutical industry and the medical industry, humans or cultured cells derived from humans can be targeted. Moreover, the transformant applied to said experiment and agriculture contains not only a cultured cell but the cell, organ, organ, or individual | organism | solid contained in a biological body.
［発現ベクター構築用ベクター］
本発明に係る発現ベクター構築用ベクターは、植物を形質転換するための発現ベクター（植物用発現ベクター）を構築するために用いられるベクターであって、２つのａｔｔ部位と、その間にプロモーター及びターミネーターと、当該プロモーター及びターミネーターに挟まれた変換オリゴヌクレオチドと、当該変換オリゴヌクレオチドに隣接した制限酵素認識部位とを有している。
[Vector for constructing expression vector]
An expression vector construction vector according to the present invention is a vector used for constructing an expression vector (plant expression vector) for transforming a plant, comprising two att sites, a promoter and a terminator therebetween. A conversion oligonucleotide sandwiched between the promoter and terminator and a restriction enzyme recognition site adjacent to the conversion oligonucleotide.
これらのＤＮＡセグメントの配列は、一方のａｔｔ部位を基準とすれば、当該ａｔｔ部位、プロモーター、変換オリゴヌクレオチド、ターミネーター、他方のａｔｔ部位の順でこれら各ＤＮＡセグメントが並ぶ構成となっている。 The sequence of these DNA segments is such that each DNA segment is arranged in the order of the att site, a promoter, a conversion oligonucleotide, a terminator, and the other att site, based on one att site.
また、前記ベクターは、制限酵素認識部位に上記の転写因子ポリヌクレオチドを有し、当該転写抑制ポリヌクレオチドと隣接する変換オリゴヌクレオチドとが転写抑制因子をコードしていてもよい。 Moreover, the said vector has said transcription factor polynucleotide in a restriction enzyme recognition site | part, and the conversion oligonucleotide adjacent to the said transcription repression polynucleotide may encode the transcription repression factor.
上記の構成によれば、以下のような効果を奏することができる。標的となる遺伝子の転写を抑制する転写抑制因子の発現ベクターを容易に得ることができる。また、上記発現ベクター構築用ベクターは、プロモーター及びターミネーターを含むので、発現ベクターに組み込んで適切な細胞を形質転換することにより、転写抑制因子を発現させることができる。 According to said structure, there can exist the following effects. An expression vector for a transcriptional repressing factor that suppresses transcription of a target gene can be easily obtained. Moreover, since the vector for constructing an expression vector includes a promoter and a terminator, a transcriptional repressing factor can be expressed by incorporating it into an expression vector and transforming an appropriate cell.
さらに、上記発現ベクター構築用ベクターはａｔｔ部位を含んでいるため、λファージ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系を用いて迅速に形質転換用の発現ベクターと組換えることができる。それゆえ、簡便で効果的に遺伝子の転写を抑制できるとともに、発現ベクターへのクローニング効率、速度を飛躍的に高めることができる。 Furthermore, since the expression vector construction vector contains an att site, it can be rapidly recombined with an expression vector for transformation using an integrase / att system derived from λ phage. Therefore, gene transcription can be easily and effectively suppressed, and the cloning efficiency and speed of expression vectors can be dramatically increased.
以下、元となるベクターと各ＤＮＡセグメントとについて詳細に説明する。 Hereinafter, the original vector and each DNA segment will be described in detail.
（ａ）ベースベクターの種類
本発明に係る上記構築用ベクターは、元となるベクター（以下の説明では、便宜上、ベースベクターと称する）に、上記２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター、制限酵素認識部位等を組み込んで構築すればよい。ここで、上記ベースベクターとしては、構築用ベクターで形質転換された形質転換体を特異的に検出できるものであれば、特に限定されるものではなく、公知のプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を好適に用いることができる。
(A) Types of base vectors The above construction vector according to the present invention includes the above two att sites, a promoter, a terminator, and a restriction enzyme recognition site in the original vector (in the following description, referred to as a base vector for convenience). Etc. may be built in. Here, the base vector is not particularly limited as long as the transformant transformed with the construction vector can be specifically detected, and a known plasmid vector, cosmid vector, phage vector, Viral vectors and the like can be preferably used.
上記ベースベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２等の大腸菌由来のプラスミドベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミドベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、ｐＹＥＳ２等の酵母由来プラスミドベクター；λファージ等のバクテリオファージ由来のファージベクター；アデノウイルス、バキュロウイルス等のＤＮＡウイルスベクター；レンチウイルスなどのレトロウイルスベクター；等が挙げられる。 Specific examples of the base vector include plasmid vectors derived from E. coli such as pBR322, pBR325, and pUC12; plasmid vectors derived from Bacillus subtilis such as pUB110, pTP5, and pC194; and plasmids derived from yeasts such as pSH19, pSH15, and pYES2. Vectors: phage vectors derived from bacteriophages such as λ phage; DNA virus vectors such as adenoviruses and baculoviruses; retrovirus vectors such as lentiviruses;
上記プラスミドベクターの具体的な種類は特に限定されるものではないが、大腸菌（E. coli）内でも増殖できるベクターが好ましく用いられ、さらには比較的サイズの小さいものがより好ましく用いられる。具体的には、例えば、ｐＵＣ型プラスミドを好ましく用いることができる。ｐＵＣ型プラスミドは、サイズが小さく（＜３ｋｂｐ）宿主大腸菌内でのコピー数が多いため、これを用いることにより、クローニング効率及びシーケンスの作業効率を高めることができる。 Although the specific kind of the plasmid vector is not particularly limited, a vector that can be propagated in E. coli is preferably used, and a relatively small one is more preferably used. Specifically, for example, a pUC type plasmid can be preferably used. Since the pUC-type plasmid is small in size (<3 kbp) and has a large copy number in the host E. coli, the use of this can increase the efficiency of cloning and the efficiency of sequencing.
（ｂ）ａｔｔ部位
本発明の発現ベクター構築用ベクターに含まれる上記ａｔｔ部位とは、λファージ由来の公知の組換え部位であり、リコンビナーゼ酵素であるλインテグラーゼにより認識されるａｔｔ配列であればよい。このようなａｔｔ配列としては、例えば、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ配列等を挙げることができる。
(B) att site The att site contained in the vector for constructing the expression vector of the present invention is a known recombination site derived from λ phage, as long as it is an att sequence recognized by λ integrase, which is a recombinase enzyme. Good. Examples of such att sequences include attB, attP, attL, and attR sequences.
上記ａｔｔ配列を用いれば、λインテグラーゼによりＤＮＡ中のこれら組換え部位（ａｔｔ部位）の配列が認識され、これらのセグメントに隣接するＤＮＡセグメントを転移させることが可能となる。 If the att sequence is used, the sequence of these recombination sites (att sites) in DNA is recognized by λ integrase, and the DNA segments adjacent to these segments can be transferred.
上記ａｔｔ部位は、野生型λファージ由来の組換え部位であってもよいし、野生型λファージ由来の組換え部位を操作した組換え部位であってもよい。ここでいう、操作した組換え部位とは、組換え反応の特異性や効率を増強するために公知の遺伝子工学的手法により操作された組換え部位を指し、市販のベクター等に含まれる組換え部位を用いてもよい。 The att site may be a recombination site derived from a wild-type λ phage or a recombination site obtained by manipulating a recombination site derived from a wild-type λ phage. As used herein, an engineered recombination site refers to a recombination site that has been manipulated by a known genetic engineering technique to enhance the specificity and efficiency of the recombination reaction, and is included in a commercially available vector or the like. A site may be used.
（ｃ）プロモーター
上記プロモーターは、植物体内で発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子のプロモーター又はアクチン遺伝子のプロモーターを用いることが好ましい。
(C) Promoter The promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in a plant body, and a known promoter can be preferably used. Among them, it is preferable to use a
上述した各プロモーターを用いれば、本発明に係る発現ベクター構築用ベクターにより構築される植物用発現ベクターに、上記プロモーターをそのまま組み込むことができる。そのため、得られた植物用発現ベクターを植物細胞内に導入することによって、転写抑制因子を強く発現させることが可能となる。 If each promoter mentioned above is used, the said promoter can be integrated as it is into the expression vector for plants constructed | assembled by the vector for construction of the expression vector which concerns on this invention. Therefore, the transcription repressing factor can be strongly expressed by introducing the obtained plant expression vector into plant cells.
（ｄ）ターミネーター
本発明に係る発現ベクター構築用ベクターに用いられるターミネーターは、植物細胞内で転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。中でも、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域を用いることが好ましい。
(D) Terminator The terminator used in the expression vector construction vector according to the present invention is not particularly limited as long as it has a function as a transcription termination site in plant cells. Good. Among these, it is preferable to use the transcription termination region of the nopaline synthase gene.
上述したターミネーターを用いれば、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがベクターのコピー数を減少させたりするような現象を防止することができる。なお、本発明におけるターミネーターの位置としては、後述するように、変換オリゴヌクレオチドの下流とすることが好ましい。 When the terminator described above is used, it is possible to prevent a phenomenon in which a long transcript is unnecessarily synthesized after being introduced into a plant cell or a strong promoter decreases the copy number of the vector. The terminator position in the present invention is preferably downstream of the conversion oligonucleotide as described later.
（ｅ）変換オリゴヌクレオチド、或いは転写抑制因子ポリヌクレオチド
本発明に係る発現ベクター構築用ベクターは、任意の転写因子を変換して、転写抑制因子を植物細胞内で発現させるために、上述のプロモーター及びターミネーターの間に変換オリゴヌクレオチドが配置されている。
(E) Conversion oligonucleotide or transcription repressor polynucleotide The expression vector constructing vector according to the present invention converts any transcription factor and expresses the transcription repressor in plant cells. A conversion oligonucleotide is placed between the terminators.
また、転写抑制因子を発現させるためには、上記に加えて、上記変換オリゴヌクレオチドと転写因子ポリヌクレオチドとが連結される必要があるため、転写因子ポリヌクレオチドが挿入される部位に制限酵素認識部位が配置されている。この制限酵素認識部位は１種類以上配置されており、複数種類あることが好ましい。さらに、上記制限酵素認識部位は１種類あたり発現ベクター構築用ベクター内に１箇所しかなく、他の部位には存在しないことが好ましい。上記制限酵素認識部位を認識する制限酵素の種類は特に限定されるものではなく、転写因子ポリヌクレオチドを消化して単離する際に用いられる制限酵素が含まれていることが好ましい。 Further, in order to express a transcription repressing factor, in addition to the above, since the conversion oligonucleotide and the transcription factor polynucleotide need to be linked, a restriction enzyme recognition site is inserted at the site where the transcription factor polynucleotide is inserted. Is arranged. One or more types of restriction enzyme recognition sites are arranged, and it is preferable that there are a plurality of types. Further, it is preferable that the restriction enzyme recognition site is present only once in the vector for constructing the expression vector per type and does not exist in other sites. The type of restriction enzyme that recognizes the restriction enzyme recognition site is not particularly limited, and preferably contains a restriction enzyme used when digesting and isolating a transcription factor polynucleotide.
例えば、後述する実施例では、SmaＩ、SalＩ等の制限酵素によって認識される制限酵素認識部位を含んでいる。上記制限酵素認識部位の具体的な作製方法は特に限定されるものではなく、例えば、用途に応じて公知の方法で合成した合成ポリヌクレオチドを用いてもよいし、市販のベクターに含まれているマルチクローニングサイトを単離して用いてもよい。 For example, the examples described later include restriction enzyme recognition sites that are recognized by restriction enzymes such as SmaI and SalI. The specific method for producing the restriction enzyme recognition site is not particularly limited. For example, a synthetic polynucleotide synthesized by a known method may be used according to the use, or it is included in a commercially available vector. Multiple cloning sites may be isolated and used.
本発明に係る発現ベクター構築用ベクターに用いられる変換オリゴヌクレオチドとしては、上述した変換オリゴヌクレオチドのうち任意のものを用いることができる。また、プロモーターが存在する方向を上流としたときに、変換オリゴヌクレオチドが制限酵素認識部位又は転写因子ポリヌクレオチドの上流に来る場合は、変換オリゴヌクレオチドの先頭に翻訳開始メチオニンをコードするＡＴＧ塩基配列が付加されていることが好ましい。 As the conversion oligonucleotide used in the vector for constructing an expression vector according to the present invention, any of the conversion oligonucleotides described above can be used. In addition, when the conversion oligonucleotide is located upstream of the restriction enzyme recognition site or transcription factor polynucleotide when the direction in which the promoter is present is upstream, the ATG base sequence encoding the translation initiation methionine is at the beginning of the conversion oligonucleotide. It is preferable that it is added.
また、本発明に係る発現ベクター構築用ベクターは、上述の構成のうち、上記制限酵素認識部位の代わりに上記転写因子ポリヌクレオチドを有し、当該転写因子ポリヌクレオチドとこれに隣接する変換オリゴヌクレオチドによって、転写抑制因子をコードしていてもよい。 Moreover, the vector for constructing an expression vector according to the present invention has the above transcription factor polynucleotide in place of the restriction enzyme recognition site in the above-described configuration, and includes the transcription factor polynucleotide and a conversion oligonucleotide adjacent thereto. It may also encode a transcriptional repressing factor.
（ｆ）その他のＤＮＡセグメント
本発明に係る構築用ベクターは、上記のａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター、変換オリゴヌクレオチド及び制限酵素認識部位以外に、他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。上記他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）に配置させることによって、目的遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、本発明に係る発現ベクター構築用ベクターは、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含むことができる。
(F) Other DNA Segment The construction vector according to the present invention may contain other DNA segments in addition to the att site, promoter, terminator, conversion oligonucleotide and restriction enzyme recognition site. Although the said other DNA segment is not specifically limited, Specifically, the omega sequence derived from tobacco mosaic virus can be mentioned, for example. By placing this omega sequence in the 5 ′ untranslated region (5′-UTR) of the promoter, the translation efficiency of the target gene can be increased. Thus, the vector for constructing an expression vector according to the present invention can contain various DNA segments depending on the purpose.
［発現ベクター構築用ベクターの作製方法、並びに生産方法］
本発明に係る発現ベクター構築用ベクターの作製方法については、特に限定されるものではなく、上記のベースベクターに、上述した各ＤＮＡセグメント（２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター、変換オリゴヌクレオチド及び制限酵素認識部位、或いは転写抑制因子ポリヌクレオチド等）を所定の順序となるように組換えればよい。
[Production method and production method of expression vector construction vector]
The production method of the vector for constructing the expression vector according to the present invention is not particularly limited, and each of the above-described DNA segments (two att sites, promoter, terminator, conversion oligonucleotide and restriction enzyme) is added to the base vector. The recognition site or transcription repressor polynucleotide may be recombined so as to be in a predetermined order.
上記各ＤＮＡセグメントを挿入する際に用いられる試薬、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。また、本発明に係る構築用ベクターを作製するための手順についても特に限定されるものではなく、上記各ＤＮＡセグメントを、所定の順序で効率的に配列させることができるようになっていればよい。また、上記組換えに用いられる生物も特に限定されるものではなく、大腸菌、枯草菌又は酵母等を用いてもよい。 There are no particular limitations on the types of reagents used when inserting the DNA segments, that is, restriction enzymes and ligation enzymes, and commercially available products may be appropriately selected and used. Further, the procedure for producing the construction vector according to the present invention is not particularly limited as long as the DNA segments can be efficiently arranged in a predetermined order. . Moreover, the organism used for the recombination is not particularly limited, and Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast or the like may be used.
本発明に係る発現ベクター構築用ベクターの生産方法、すなわち、上記作製方法で作製された発現ベクター構築用ベクターを増殖させる方法についても特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。一般的には、ベースベクターとして大腸菌内で複製できるベクターを用いた場合には、大腸菌を形質転換して当該大腸菌の細胞内で増殖させればよい。このときベースベクターや作製された構築用ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。また、大腸菌細胞から増殖した発現ベクター構築用ベクターを回収する方法も特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。 The method for producing the vector for constructing an expression vector according to the present invention, that is, the method for propagating the vector for constructing the expression vector produced by the above production method is not particularly limited, and a known method can be used. In general, when a vector that can replicate in E. coli is used as a base vector, E. coli may be transformed and propagated in the cells of the E. coli. At this time, a preferred E. coli type may be selected according to the type of the base vector or the prepared construction vector. Further, the method for recovering the expression vector construction vector grown from the E. coli cells is not particularly limited, and a known method may be used.
［植物における転写抑制の例］
本発明に係る転写抑制の一例としては、各種植物の転写因子を転写抑制因子に変換する例を挙げることができる。
[Examples of transcriptional repression in plants]
As an example of transcriptional repression according to the present invention, an example in which transcription factors of various plants are converted into transcriptional repression factors can be given.
具体的な転写因子としては、例えば、ＥＩＮ３タンパク質（Chao. Q., Rothenberg. M., Solano. R., Roman. G., Terzaghi. W., Echer. J. R., Cell, Vol.89, 1133-1144, 1997参照）、ＣＵＣ１タンパク質（Takada. S., Hibara. K., Ishida. T., Tasaka. M., Development Vol.128, 1127-1135, 2001参照）・ＣＵＣ２タンパク質（Aida. M., Ishida. T., Fukaki. H., Fujisawa. H., Tasaka. M., Plant Cell, Vol.9, 841-857, 1997参照）、ＰＡＰ１タンパク質（Borevitz. J. O., Xia. Y., Blount. J., Dixon. R. A., Lamb. C., Plant Cell, Vol.12, 2383-2393, 2000参照）、ＡｔＭＹＢ２３タンパク質（Kirik. V., Schnittger. A., Radchuk. V., Alder. K., Hulskamp. M., Baumlein. H., Development Biology Vol.235, 366-377, 2001参照）等を挙げることができる。 As specific transcription factors, for example, EIN3 protein (Chao. Q., Rothenberg. M., Solano. R., Roman. G., Terzaghi. W., Echer. JR, Cell, Vol. 89, 1133- 1144, 1997), CUC1 protein (see Takada. S., Hibara. K., Ishida. T., Tasaka. M., Development Vol. 128, 1127-1135, 2001), CUC2 protein (Aida. M., Ishida. T., Fukaki. H., Fujisawa. H., Tasaka. M., Plant Cell, Vol. 9, 841-857, 1997), PAP1 protein (Borevitz. JO, Xia. Y., Blount. J) , Dixon. RA, Lamb. C., Plant Cell, Vol. 12, 2383-2393, 2000), AtMYB23 protein (Kirik. V., Schnittger. A., Radchuk. V., Alder. K., Hulskamp) M., Baumlein. H., Development Biology Vol. 235, 366-377, 2001).
上記各転写因子の転写抑制因子への変換は、本発明に係る変換オリゴヌクレオチドと上述の転写因子をコードするポリヌクレオチド（転写因子ポリヌクレオチド）とを連結させて、最終的に融合タンパク質を作製することにより実現される。 The conversion of each of the above transcription factors into a transcriptional repression factor is performed by linking the conversion oligonucleotide according to the present invention and a polynucleotide encoding the above transcription factor (transcription factor polynucleotide) to finally produce a fusion protein. Is realized.
より具体的に説明すると、上記転写因子遺伝子のオープンリーディングフレームを、開始コドンＡＴＧを含むプライマーおよび終始コドンを除くように設計したプライマーを用いて増幅し、転写因子ポリヌクレオチドを得る。また、変換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成し、２本鎖にして変換オリゴヌクレオチドを得る。次に上記転写因子ポリヌクレオチドと上記変換オリゴヌクレオチドとをライゲーションし、得られた転写抑制因子ポリヌクレオチドを、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓタンパク質遺伝子のプロモーター（３５Ｓ−ｐｒｏ）及びノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（Ｎｏｓ−ｔｅｒ）を組み込んだ植物形質転換ベクターに挿入する。以上のようにして、転写抑制因子を発現するベクター（転写抑制因子発現ベクター）が構築される。そして、上記転写抑制因子発現ベクターを用いて、シロイヌナズナ等の植物の培養細胞又は生体内細胞を形質転換する。
More specifically, the open reading frame of the transcription factor gene is amplified using a primer including the initiation codon ATG and a primer designed to exclude the termination codon, thereby obtaining a transcription factor polynucleotide. In addition, a polynucleotide encoding a conversion peptide is synthesized and converted into a double strand to obtain a conversion oligonucleotide. Next, the transcription factor polynucleotide and the conversion oligonucleotide are ligated, and the transcription repressor polynucleotide obtained is used as a
なお、上記の転写因子は、少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むものであれば転写因子の一部であってもよく、以下の例についても同様である。 The above transcription factor may be a part of the transcription factor as long as it contains at least a DNA binding domain, and the same applies to the following examples.
上記転写抑制因子を発現させた植物についての具体的な結果を以下に示す。なお、以下の説明では、便宜上、例えば、転写因子ＥＩＮ３タンパク質を変換した転写抑制因子をＥＩＮ３変換転写抑制因子と略す。他の転写因子も同様である。 The specific result about the plant which expressed the said transcriptional repression factor is shown below. In the following description, for the sake of convenience, for example, a transcription repression factor obtained by converting the transcription factor EIN3 protein is abbreviated as an EIN3 conversion transcription repression factor. The same applies to other transcription factors.
（ａ）ＥＩＮ３タンパク質の場合
植物ホルモンであるエチレン存在下で植物を生育させると、細胞伸張が抑制され、結果として矮性の植物となる。転写因子ＥＩＮ３タンパク質はエチレンのシグナル伝達を制御する機能を有している。それゆえ、ＥＩＮ３変換転写抑制因子を発現させた植物は、エチレンに対して感受性を持たない植物体となる。同時に、ＥＩＮ３タンパク質で制御されていた遺伝子の発現が抑制される。
(A) In the case of EIN3 protein When a plant is grown in the presence of ethylene, which is a plant hormone, cell elongation is suppressed, resulting in a dwarf plant. The transcription factor EIN3 protein has a function of controlling ethylene signal transduction. Therefore, the plant in which the EIN3 conversion transcription repressing factor is expressed becomes a plant body that is not sensitive to ethylene. At the same time, the expression of the gene controlled by the EIN3 protein is suppressed.
（ｂ）ＣＵＣ１タンパク質（ＣＵＣ２タンパク質も含む）の場合
ＣＵＣ１タンパク質およびＣＵＣ２タンパク質は、何れも転写因子として機能的に重複している。それゆえ、ＣＵＣ１変換転写抑制因子を発現した植物は、ＣＵＣ１タンパク質及びＣＵＣ２タンパク質が制御する遺伝子の発現を、これら内在性の転写因子に優先して抑制する。その結果、ＣＵＣ１遺伝子およびＣＵＣ２遺伝子がともに不活性なＣＵＣ１／ＣＵＣ２二重変異体と同様な表現型が発現する。上記表現型は、子葉が融合したｃｕｐ ｓｈａｐｅｄ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ型の表現型である。
(B) In the case of CUC1 protein (including CUC2 protein) Both CUC1 protein and CUC2 protein are functionally duplicated as transcription factors. Therefore, a plant expressing a CUC1 conversion transcription repressing factor suppresses the expression of genes controlled by the CUC1 protein and the CUC2 protein in preference to these endogenous transcription factors. As a result, a phenotype similar to that of the CUC1 / CUC2 double mutant in which both the CUC1 gene and the CUC2 gene are inactive is expressed. The phenotype is a cup shaped cotylon type phenotype in which cotyledons are fused.
（ｃ）ＰＡＰ１タンパク質の場合
ＰＡＰ１タンパク質は、フェニルプロパノイド合成関連遺伝子の発現を活性化させる転写因子である。フェニルプロパノイド合成関連遺伝子としては、例えば、ＣＨＳ遺伝子、ＰＡＬ遺伝子、ＤＦＲ遺伝子等が挙げられ、これら遺伝子の発現はストレス存在下で上昇する。ＰＡＰ１変換転写抑制因子を発現した植物は、野生型では見られる、ストレス存在下でのＣＨＳ遺伝子、ＰＡＬ遺伝子、ＤＦＲ遺伝子等の発現上昇が見られない。また、ＰＡＰ１変換転写抑制因子を発現した植物は、３％のショ糖存在下で生育させた場合に野生型植物で観察されるアントシアニンの蓄積も起こらない。
(C) PAP1 protein PAP1 protein is a transcription factor that activates the expression of phenylpropanoid synthesis-related genes. Examples of phenylpropanoid synthesis-related genes include CHS gene, PAL gene, DFR gene and the like, and the expression of these genes increases in the presence of stress. Plants expressing a PAP1 conversion transcriptional repressor do not show increased expression of the CHS gene, PAL gene, DFR gene, etc. in the presence of stress, as seen in the wild type. In addition, plants expressing a PAP1 conversion transcriptional repressor do not accumulate anthocyanins observed in wild-type plants when grown in the presence of 3% sucrose.
（ｄ）ＡｔＭＹＢ２３タンパク質の場合
ＡｔＭＹＢ２３タンパク質は、葉の表面で発達するトリコームの発生に関連する転写因子であると考えられている。ＡｔＭＹＢ２３変換転写抑制因子を発現した植物は、野生型では見られるトリコームが無い植物体となる。また、トリコーム発生に関与している遺伝子の内、ＧＬ２遺伝子の発現抑制に関わっていることが明らかになった。
(D) In the case of AtMYB23 protein AtMYB23 protein is considered to be a transcription factor related to the development of trichomes that develop on the surface of leaves. A plant expressing an AtMYB23 conversion transcriptional repressor is a plant having no trichomes found in the wild type. Moreover, it became clear that it is related with the expression suppression of GL2 gene among the genes involved in trichome generation.
［産業上の利用例］
このように、本発明は、これまでの技術では困難であった遺伝子又は遺伝子群の発現抑制を可能とする技術である。それゆえ、本発明を用いれば、遺伝子の発現を阻害することによって有用な効果をもたらす各種産業分野に利用することが可能となる。
[Industrial use example]
Thus, the present invention is a technique that enables the suppression of gene or gene group expression, which has been difficult with conventional techniques. Therefore, if this invention is used, it will become possible to utilize for various industrial fields which bring about a useful effect by inhibiting the expression of a gene.
具体的には、植物を用いた産業分野としては、例えば、本発明を用いてエチレン非感受性植物、すなわち枯れにくい植物や切り花を創製する用途を挙げることができる。 Specifically, as an industrial field using plants, for example, the present invention can be used to create ethylene-insensitive plants, that is, plants and cut flowers that do not easily wither.
また、これまでにない色又は形を有する植物、或いは特定のタンパク質の含量を抑制した植物を創製することも可能となる。例えば、色素代謝系の酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することによって、これまでには得られなかった色違いの花弁を有する花を創製することが可能になる。また、アレルゲンとなるタンパク質の発現を抑制することで、アレルゲンの少ない食物（例えば、低アレルゲン米）を創製することが可能になる。或いは、特定のタンパク質の発現を抑制することで、雑味の無い米（吟醸米等）を創製することも可能となる。さらに或いは、リグニン合成の遺伝子の発現を抑制することによって、リグニン含量の少ない木を創製し、高品質のパルプを生産することも可能となる。 It is also possible to create a plant having an unprecedented color or shape, or a plant in which the content of a specific protein is suppressed. For example, by suppressing the expression of a gene encoding an enzyme of a pigment metabolism system, it becomes possible to create a flower having a petal of a different color that has not been obtained so far. Moreover, it becomes possible to create foods (eg, low allergen rice) with less allergen by suppressing the expression of allergen proteins. Alternatively, by suppressing the expression of a specific protein, it becomes possible to create rice (such as ginjo rice) having no miscellaneous taste. Furthermore, by suppressing the expression of the lignin synthesis gene, it is possible to create a tree having a low lignin content and produce high-quality pulp.
また、本発明は有用物質等の効率的生産への応用が可能である。植物が産生する二次代謝物質には、医療分野、食糧分野並びに工業的応用に有用とされている物質が数多く存在する。例えば、フラボノイドおよびテルペノイドの一部は、健康を促進する食品として、またある種のアルカロイドは、薬理作用を持つことが知られ、医薬品として利用されている。 In addition, the present invention can be applied to the efficient production of useful substances and the like. Many secondary metabolites produced by plants are useful for medical fields, food fields, and industrial applications. For example, some flavonoids and terpenoids are used as foods for promoting health, and certain alkaloids are known to have pharmacological actions and are used as pharmaceuticals.
植物の二次代謝産物の生合成経路を人為的に操作し、目的とする物質の収量を増加させる試みは、これまでにも多くなされている。しかし、多くの場合は、目的の物質生合成に関わる合成酵素を強発現させる等の方法であり、収量も十数パーセントの増加といったもので高効率の物質生産に結びつかないものが多い（Sato et al., PNAS, 98, 367-372 (2001)参照）。 Many attempts have been made to artificially manipulate the biosynthetic pathway of plant secondary metabolites to increase the yield of the target substance. However, in many cases, it is a method of strongly expressing a synthase involved in the target substance biosynthesis, and the yield is increased by a dozen percent, and there are many methods that do not lead to highly efficient substance production (Sato et al. al., PNAS, 98, 367-372 (2001)).
このような問題を解決し、目的とする植物の二次代謝産物をより効率的且つ簡便に生産する方法においても本発明を応用することが可能である。 The present invention can be applied to a method for solving such problems and producing a secondary metabolite of a target plant more efficiently and simply.
その手法の一例を図１に示した。図１はシロイヌナズナにおけるアントシアニン（Anthocyanins）、フラボノール（Flavonols）並びにプロアントシアニジン（Proanthocyanidins）といったフラボノイド生合成経路を示している（Plant Cell, 13, 2099-2114 (2001): Nesi et al. から引用）。 An example of the technique is shown in FIG. FIG. 1 shows the flavonoid biosynthetic pathways of Anthocyanins, Flavonols and Proanthocyanidins in Arabidopsis (quoted from Plant Cell, 13, 2099-2114 (2001): Nesi et al.).
例えば、フラボノールのみを選択的に大量に生産したい場合、アントシアニン及びプロアントシアニジンに分岐する経路に関わる酵素を制御する遺伝子を本発明により抑制する。つまり、ＴＴ２やＴＴ８といった転写因子を、本発明を用いて転写抑制因子に変換し、ジヒドロフラボノール（dihydroflavonols）をロイコアントシアニジン（leucoanthocyanidins）に変換する酵素であるＤＦＲ(dihydroflavonol-4-reductase)の発現を抑制する。上記によれば、フラボノイド生合成経路の中間産物であるジヒドロフラボノールは、アントシアニン及びプロアントシアニジン等の生合成に利用されず、図１の矢印で示すように、より選択的にフラボノールの生合成に利用される。 For example, when it is desired to selectively produce only a large amount of flavonols, the present invention suppresses a gene that controls an enzyme involved in a pathway branching into anthocyanins and proanthocyanidins. That is, expression of DFR (dihydroflavonol-4-reductase), which is an enzyme that converts transcription factors such as TT2 and TT8 into transcriptional repressors using the present invention and converts dihydroflavonols into leucoanthocyanidins. Suppress. According to the above, dihydroflavonol, which is an intermediate product of the flavonoid biosynthetic pathway, is not used for biosynthesis of anthocyanins and proanthocyanidins, but more selectively used for biosynthesis of flavonols as indicated by arrows in FIG. Is done.
つまり、本発明に係る転写抑制因子を用いて目的物質の生合成に不要な反応経路を阻害することによって、効率的および計画的に目的物質を得ることができる。 That is, the target substance can be obtained efficiently and systematically by inhibiting the reaction pathway unnecessary for biosynthesis of the target substance using the transcriptional repressing factor according to the present invention.
上述した例では、主に、植物を用いた産業分野を挙げたが、本発明はもちろんこれに限定されるものではなく、動物を用いた産業分野にも好適に用いることができる。 In the above-described example, the industrial field using plants is mainly cited. However, the present invention is not limited to this, and can be suitably used in the industrial field using animals.
具体的には、例えば、医薬産業・医療産業分野の一例として、癌に対する抑制が挙げられる。動物における癌遺伝子の転写因子を同定し、それを変換した転写抑制因子を作製して動物細胞に作用させれば、より特異的な制ガン効果が期待できる。特に、本発明に係る変換ペプチドは植物由来であり動物には存在しないので、この特異性を利用すれば動物に内在する因子と競合せず、標的遺伝子あるいは細胞（癌等）に対する特異性を向上させることも可能となる。 Specifically, for example, suppression against cancer is mentioned as an example of the pharmaceutical industry / medical industry. If a transcription factor of an oncogene in an animal is identified, and a transcriptional repressing factor obtained by converting it is made to act on animal cells, a more specific anticancer effect can be expected. In particular, since the conversion peptide according to the present invention is derived from a plant and does not exist in animals, if this specificity is used, it will not compete with factors inherent in the animal and will improve the specificity for target genes or cells (such as cancer). It is also possible to make it.
以下、本発明の実施例を図２から図９に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
〔実施例１〕
本実施例では以下のようにして、変換ペプチドが転写因子を転写抑制因子に変換できるかどうかを調べた。まず、合成した種々の変換オリゴヌクレオチドを、酵母の転写因子であるＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと連結して、転写抑制因子ポリヌクレオチドを作製した。次に、当該転写抑制因子ポリヌクレオチドを含むエフェクターベクターを構築し、その一方で、ＧＡＬ４タンパク質結合ＤＮＡ配列とルシフェラーゼ遺伝子とを含むレポーターベクターを構築した。次に、これらエフェクターベクターとレポーターベクターを同時に、シロイヌナズナ葉にパーティクルガン法を用いて導入し、その後、レポーターとなるルシフェラーゼの活性を測定した。この測定した値を、レポーターベクターのみを導入したときのルシフェラーゼ活性と比較し、相対値を算出することによって転写抑制能を調査した。
Hereinafter, although the Example of this invention is described concretely based on FIGS. 2-9, this invention is not limited to this.
[Example 1]
In this example, it was examined whether the conversion peptide can convert a transcription factor into a transcription repressor as follows. First, the various converted oligonucleotides were ligated with a polynucleotide encoding the DNA binding domain of the GAL4 protein, which is a yeast transcription factor, to produce a transcriptional repressor polynucleotide. Next, an effector vector containing the transcription repressor polynucleotide was constructed, while a reporter vector containing a GAL4 protein-binding DNA sequence and a luciferase gene was constructed. Next, these effector vector and reporter vector were simultaneously introduced into Arabidopsis thaliana leaves using the particle gun method, and then the activity of luciferase serving as a reporter was measured. The measured value was compared with the luciferase activity when only the reporter vector was introduced, and the transcription repression ability was investigated by calculating the relative value.
ここで、上記エフェクターベクターは本発明に係るベクターの一例に相当し、このベクターが導入されたシロイヌナズナ葉は、本発明に係る形質転換体の一例に相当する。 Here, the effector vector corresponds to an example of the vector according to the present invention, and the Arabidopsis leaf into which the vector has been introduced corresponds to an example of the transformant according to the present invention.
（１−１）エフェクターベクターｐＧＡＬ４ＤＢＤ−ＲＤの作製
図２に示すように、クロンテック社製のプラスミドベクターｐＢＩ２２１（商品名）を制限酵素ＸｈｏＩとＳａｃＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端化処理をした後、アガロースゲル電気泳動に供することによって、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子のプロモーター（３５Ｓ−ｐｒｏ）及びノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（Ｎｏｓ−ｔｅｒ）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓ断片を得た。
(1-1) Preparation of effector vector pGAL4DBD-RD As shown in FIG. 2, after digesting plasmid vector pBI221 (trade name) manufactured by Clontech with restriction enzymes XhoI and SacI, and blunting with
クロンテック社製のプラスミドベクターｐＡＳ２−１（商品名、クロンテック社）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン(１−１４７アミノ酸残基)をコードする７４８ｂｐのＤＮＡ断片（ＧＡＬ４ＤＢＤ）をアガロースゲル電気泳動によって単離し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化処理を行った。 Plasmid vector pAS2-1 (trade name, Clontech) manufactured by Clontech was digested with restriction enzyme HindIII, and a 748 bp DNA fragment (GAL4DBD) encoding the DNA binding domain (1-147 amino acid residues) of yeast GAL4 protein was obtained. It was isolated by agarose gel electrophoresis and blunt-ended using T4 DNA polymerase.
そして、平滑末端化処理を行ったＧＡＬ４ＤＢＤを、先ほど得られた３５Ｓ−Ｎｏｓ断片の、３５Ｓ−ｐｒｏとＮｏｓ−ｔｅｒとの間の平滑末端化した部位に挿入し、３５Ｓ−ｐｒｏに対してＧＡＬ４ＤＢＤのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が順方向に並んでいるものを選抜することによって、エフェクターベクターｐ３５Ｓ‐ＧＡＬ４ＤＢＤを構築した。 Then, the GAL4DBD subjected to the blunt end treatment was inserted into the blunt-ended site between 35S-pro and Nos-ter of the 35S-Nos fragment obtained earlier, and the GAL4DBD of 35S-pro An effector vector p35S-GAL4DBD was constructed by selecting those in which open reading frames (ORFs) are aligned in the forward direction.
ＧＡＬ４ＤＢＤのアミノ酸読み枠と、読み枠（フレーム）が一致するように設計した調査対象のペプチドをコードする両鎖のオリゴヌクレオチドを合成した。具体的には、以下に示す通り、ペプチド１をコードするオリゴヌクレオチドとして合成ＤＮＡ１，２を合成した。
A double-stranded oligonucleotide encoding a peptide to be investigated, which was designed so that the amino acid reading frame of GAL4DBD and the reading frame (frame) match, was synthesized. Specifically, as shown below,
ペプチド１：Asp Leu Ser Leu Ser Leu（配列番号１）
合成ＤＮＡ１Ｆ：5’-AGATCTTAGCCTAAGCCTGTAAG-3’（配列番号１９）
合成ＤＮＡ１Ｒ：5’-TCGACTTACAGGCTTAGGCTAAGATCT-3’（配列番号２０）
さらに、このアミノ酸配列を基にして、第１，３，５番目に存在するアミノ酸のうち１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を作製し、それぞれのアミノ酸配列をコードする塩基配列を作製してオリゴヌクレオチドを合成した。作製したアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を以下に示す。
Peptide 1: Asp Leu Ser Leu Ser Leu (SEQ ID NO: 1)
Synthetic DNA1F: 5′-AGATCTTAGCCTAAGCCTGTAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 19)
Synthetic DNA1R: 5′-TCGACTTACAGGCTTAGGCTAAGATCT-3 ′ (SEQ ID NO: 20)
Furthermore, based on this amino acid sequence, an amino acid sequence in which one or several amino acids among the first, third and fifth amino acids are substituted is prepared, and a base sequence encoding each amino acid sequence is prepared. Thus, oligonucleotides were synthesized. The prepared amino acid sequence and the base sequence encoding it are shown below.
以下はペプチド２及びそれをコードする合成ＤＮＡ２Ｆ，２Ｒである。 The following are peptide 2 and the synthetic DNAs 2F and 2R that encode it.
ペプチド２：Asp Leu Ser Leu His Leu（配列番号２）
合成ＤＮＡ２Ｆ：5’-AGATCTTTCGCTACACCTGTAAG-3’（配列番号２１）
合成ＤＮＡ２Ｒ：5’-TCGACTTACAGGTGTAGCGAAAGATCT-3’（配列番号２２）
以下はペプチド３及びそれをコードする合成ＤＮＡ３Ｆ，３Ｒである。
Peptide 2: Asp Leu Ser Leu His Leu (SEQ ID NO: 2)
Synthetic DNA 2F: 5′-AGATCTTTCGCTACACCTGTAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 21)
Synthetic DNA 2R: 5′-TCGACTTACAGGTGTAGCGAAAGATCT-3 ′ (SEQ ID NO: 22)
The following are
ペプチド３：Cys Leu Asp Leu Arg Leu（配列番号３）
合成ＤＮＡ３Ｆ：5’-ATGCCTGGACCTTCGTCTGTAAG-3’（配列番号２３）
合成ＤＮＡ３Ｒ：5’-TCGACTTACAGACGAAGGTCCAGGCAT-3’（配列番号２４）
以下はペプチド４及びそれをコードする合成ＤＮＡ４Ｆ，４Ｒである。
Peptide 3: Cys Leu Asp Leu Arg Leu (SEQ ID NO: 3)
Synthetic DNA 3F: 5′-ATGCCTGGACCTTCGTCTGTAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 23)
Synthetic DNA 3R: 5′-TCGACTTACAGACGAAGGTCCAGGCAT-3 ′ (SEQ ID NO: 24)
The following are
ペプチド４：Ser Leu Asp Leu Arg Leu（配列番号４）
合成ＤＮＡ４Ｆ：5’-AAGCCTTGATTTAAGACTCTAAG-3’（配列番号２５）
合成ＤＮＡ４Ｒ：5’-TCGACTTAGAGTCTTAAATCAAGGCTT-3’（配列番号２６）
以下はペプチド５及びそれをコードする合成ＤＮＡ５Ｆ，５Ｒである。
Peptide 4: Ser Leu Asp Leu Arg Leu (SEQ ID NO: 4)
Synthetic DNA 4F: 5′-AAGCCTTGATTTAAGACTCTAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 25)
Synthetic DNA 4R: 5′-TCGACTTAGAGTCTTAAATCAAGGCTT-3 ′ (SEQ ID NO: 26)
The following are peptides 5 and synthetic DNAs 5F and 5R encoding them.
ペプチド５：Asn Leu Asn Leu Lys Leu（配列番号５）
合成ＤＮＡ５Ｆ：5’-GAATTTGAATCTCAAGTTGTGAG-3’（配列番号２７）
合成ＤＮＡ５Ｒ：5’-TCGACTCACAACTTGAGATTCAAATTC-3’（配列番号２８）
以下はペプチド６及びそれをコードする合成ＤＮＡ６Ｆ，６Ｒである。
Peptide 5: Asn Leu Asn Leu Lys Leu (SEQ ID NO: 5)
Synthetic DNA 5F: 5′-GAATTTGAATCTCAAGTTGTGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 27)
Synthetic DNA 5R: 5′-TCGACTCACAACTTGAGATTCAAATTC-3 ′ (SEQ ID NO: 28)
The following are peptides 6 and synthetic DNAs 6F and 6R encoding them.
ペプチド６：Cys Leu Asp Leu Ser Leu（配列番号６）
合成ＤＮＡ６Ｆ：5’-ATGTTTGGATCTGAGTCTATGAG-3’（配列番号２９）
合成ＤＮＡ６Ｒ：5’-TCGACTCATAGACTCAGATCCAAACAT-3’（配列番号３０）
上記の各ペプチドをコードする１対の合成ＤＮＡを、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせた。そして、制限酵素ＳｍａＩ及びＳａｌＩで予め消化しておいたｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤにライゲーションした。以上のようにして、エフェクターベクターｐＧＡＬ４ＤＢＤ−ＲＤが得られた。
Peptide 6: Cys Leu Asp Leu Ser Leu (SEQ ID NO: 6)
Synthetic DNA 6F: 5′-ATGTTTGGATCTGAGTCTATGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 29)
Synthetic DNA 6R: 5′-TCGACTCATAGACTCAGATCCAAACAT-3 ′ (SEQ ID NO: 30)
A pair of synthetic DNAs encoding each of the above peptides was heated at 90 ° C. for 2 minutes, then heated at 60 ° C. for 1 hour, and then allowed to stand at room temperature (25 ° C.) for 2 hours for annealing. And it ligated to p35S-GAL4DBD previously digested with restriction enzymes SmaI and SalI. As described above, an effector vector pGAL4DBD-RD was obtained.
（１−２）レポーターベクターｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣの作製
図３に示すように、ｐＢＩ２２１プラスミド（商品名、クロンテック社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｓｔＩで消化し、Ｎｏｓ−ｔｅｒを含む２７０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって単離した。
(1-2) Preparation of Reporter Vector p35S-GAL4-LUC As shown in FIG. 3, a 270 bp DNA fragment containing No-ter was obtained by digesting pBI221 plasmid (trade name, manufactured by Clontech) with restriction enzymes EcoRI and SstI. Was isolated by agarose gel electrophoresis.
上記のＮｏｓ−ｔｅｒ断片を、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｓｔＩで消化しておいたプラスミドベクターｐＵＣ１８に挿入した。 The above Nos-ter fragment was inserted into a plasmid vector pUC18 that had been digested with restriction enzymes EcoRI and SstI in advance.
次に、３５Ｓ−ｐｒｏのＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡ）を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＴＡＴＡ５（配列番号３１）及びそれに相補的なＴＡＴＡ３（配列番号３２）を合成し、それらを９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせることによって２本鎖ＤＮＡを形成させた。 Next, TATA5 (SEQ ID NO: 31), which is an oligonucleotide consisting of a base sequence containing a 35S-pro TATA box (TATA), and TATA3 (SEQ ID NO: 32) complementary thereto are synthesized, and these are synthesized at 90 ° C. for 2 minutes. After heating, the mixture was heated at 60 ° C. for 1 hour, and then allowed to stand at room temperature (25 ° C.) for 2 hours for annealing to form double-stranded DNA.
次に、Ｎｏｓ−ｔｅｒを含むｐＵＣ１８を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化した。そして、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に上記のＴＡＴＡを有する２本鎖ＤＮＡを挿入することによって、ＴＡＴＡ及びＮｏｓ−ｔｅｒを含むプラスミドベクターを構築した。さらに、それを制限酵素ＳｓｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。 Next, pUC18 containing Nos-ter was digested with restriction enzymes HindIII and BamHI. Then, a plasmid vector containing TATA and Nos-ter was constructed by inserting the above double-stranded DNA having TATA into the HindIII-BamHI site. Furthermore, it was digested with the restriction enzyme SstI and blunt-ended with T4 DNA polymerase.
ホタルのルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）をもつプラスミドベクターｐＧＶ−ＣＳ２（商品名、東洋インキ社製）を制限酵素ＸｂａＩとＮｃｏＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動によって、ＬＵＣを含む１．６５ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。このＬＵＣ断片を上記のＴＡＴＡとＮｏｓ−ｔｅｒを含むプラスミドにライゲーションした。以上のようにして、ｐＴＡＴＡ‐ＬＵＣレポーター遺伝子を構築した。 A plasmid vector pGV-CS2 (trade name, manufactured by Toyo Ink Co.) having a firefly luciferase gene (LUC) was digested with restriction enzymes XbaI and NcoI, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and then subjected to agarose gel electrophoresis. A 1.65 kb DNA fragment containing LUC was isolated. This LUC fragment was ligated to the above plasmid containing TATA and Nos-ter. A pTATA-LUC reporter gene was constructed as described above.
次に、図４に示すように、５コピーの酵母ＧＡＬ４タンパク質結合ＤＮＡ配列（５×ＧＡＬ４）を持つプラスミドベクターｐＧ５ＣＡＴ（商品名、クロンテック社製）を制限酵素ＳｍａＩ及びＸｂａＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、ＧＡＬ４ＢＳを含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。続いて、ｐＴＡＴＡ‐ＬＵＣベクターを制限酵素ＢｇｌＩＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。この部位に平滑末端化した上記の５×ＧＡＬ４断片を挿入し、得られたプラスミドのうち５×ＧＡＬ４が順方向に向いているものを選抜し、レポーター遺伝子ｐＧＡＬ４‐ＬＵＣを構築した。 Next, as shown in FIG. 4, a plasmid vector pG5CAT (trade name, manufactured by Clontech) having 5 copies of yeast GAL4 protein-binding DNA sequence (5 × GAL4) was digested with restriction enzymes SmaI and XbaI, and T4 DNA polymerase was used. After blunt end treatment, a DNA fragment containing GAL4BS was purified by agarose gel electrophoresis. Subsequently, the pTATA-LUC vector was digested with the restriction enzyme BglII and blunt-ended with T4 DNA polymerase. The blunt-ended 5 × GAL4 fragment was inserted into this site, and the resulting plasmid was selected with 5 × GAL4 oriented in the forward direction to construct a reporter gene pGAL4-LUC.
プライマーとして３５Ｓ−ｐｒｏ−Ｆ（配列番号３３）及び３５Ｓ−ｐｒｏ−Ｒ（配列番号３４）を用いて、プラスミドｐＢＩ１２１を鋳型としてＰＣＲを行い、３５Ｓ−ｐｒｏの塩基配列のうち−８００〜−４６番目の領域を含むＤＮＡ断片を得た。上記ＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、３５Ｓ−ｐｒｏを含む７６０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって単離した。 Using 35S-pro-F (SEQ ID NO: 33) and 35S-pro-R (SEQ ID NO: 34) as primers, PCR was performed using plasmid pBI121 as a template, and the −800 to −46th positions in the base sequence of 35S-pro A DNA fragment containing the region was obtained. After digesting the above DNA fragment with the restriction enzyme HindIII, a 760 bp DNA fragment containing 35S-pro was isolated by agarose gel electrophoresis.
この３５Ｓ−ｐｒｏ断片を、あらかじめ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたｐＧＡＬ４‐ＬＵＣに挿入し、３５Ｓ−ｐｒｏが順方向に向いているものを選別した。以上のようにして、レポーターベクターｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣが得られた。 This 35S-pro fragment was inserted into pGAL4-LUC that had been digested with the restriction enzyme HindIII in advance, and those having 35S-pro in the forward direction were selected. As described above, the reporter vector p35S-GAL4-LUC was obtained.
（１−３）リファレンスベクターｐＰＴＲＬの作製
ウミシイタケ由来のルシフェラーゼ遺伝子（ＲＬ）をもつカセットベクターｐＲＬ−ｎｕｌｌ（商品名、プロメガ社製）を制限酵素ＮｈｅＩとＸｂａＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動でＲＬを含む９４８ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。このＲＬ断片を、上記のエフェクターベクターを構築する際に用いたｐＢＩ２２１のＧＵＳを除いた部位に挿入した。そして、ＲＬが順方向に向いているものを選別した。以上のようにして、リファレンスベクターｐＰＴＲＬが得られた。
(1-3) Preparation of Reference Vector pPTRL A cassette vector pRL-null (trade name, manufactured by Promega) having a luciferase gene (RL) derived from Renilla is cleaved with restriction enzymes NheI and XbaI, and blunt-ended with T4 DNA polymerase. After that, a 948 bp DNA fragment containing RL was isolated by agarose gel electrophoresis. This RL fragment was inserted into the site excluding GUS of pBI221 used in constructing the above effector vector. Then, those with RL facing in the forward direction were selected. The reference vector pPTRL was obtained as described above.
（１−４）パーティクルガンによる遺伝子導入
上述のようにして構築したレポーターベクター及びエフェクターベクターを用いて、パーティクルガン法にてシロイヌナズナ葉の細胞を形質転換した。そして、形質転換した細胞内でレポーターの活性が抑制されているかどうかを測定することによって、エフェクターの効果を調べた。
(1-4) Gene transfer by particle gun Using the reporter vector and the effector vector constructed as described above, Arabidopsis thaliana leaf cells were transformed by the particle gun method. Then, the effector effect was examined by measuring whether the reporter activity was suppressed in the transformed cells.
１．６μｇのレポーターベクターｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣと、１．２μｇのエフェクターベクターｐＧＡＬ４ＤＢＤ−ＲＤと、０．３２μｇのリファレンスベクターｐＰＴＲＬとを５１０μｇの金粒（直径１μｍ、バイオラッド社製）にコーティングした。水で湿らせた濾紙を置いた９ｃｍシャーレに、生育期間２１日目のシロイヌナズナ葉４〜７枚を並べ、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅボンバートメント機（商品名、バイオラッド社製）を用いて上記各種ベクターをコーティングした金粒を打ち込んだ。
1.6 μg of reporter vector p35S-GAL4-LUC, 1.2 μg of effector vector pGAL4DBD-RD, and 0.32 μg of reference vector pPTRL were coated on 510 μg of gold grains (
なお、上記ボンバートメント機を用いたシロイヌナズナ葉へのＤＮＡの導入は、以下の条件でおこなった。金粒子を葉に導入するためのガス圧を調節するラプチャーディスクは、１１００ｐｓｉ用を用いた。金粒子を打ち込むシロイヌナズナ葉を並べたサンプル台は、ラプチャーディスクの位置より約２０ｃｍ下の位置にセットするため、器機の高さを調節する段の下から3段目に設置した。それ以外の条件は、機器の操作マニュアルに従った。 The introduction of DNA into Arabidopsis leaves using the bombardment machine was performed under the following conditions. The rupture disk for adjusting the gas pressure for introducing gold particles into leaves was used for 1100 psi. The sample stage on which the Arabidopsis leaves into which gold particles are to be placed was arranged was set at a position about 20 cm below the position of the rupture disk. Other conditions were in accordance with the device operation manual.
（１−５）ルシフェラーゼ活性測定
金粒子を打ち込んだシロイヌナズナ葉は２２℃の明所で６時間静置した後、液体窒素中で粉砕し、Ｄｕａｌ‐Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、プロメガ社製）のキットに添付されているＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ２００μｌに懸濁した。得られた懸濁液を遠心して上清を回収し、細胞抽出液２０μｌを上記キットに添付されている測定バッファー１００μｌと混合した。そして、ルミノメーター（TD20/20, Turener Design社製）を用いて上記混合液中のレポーター及びリファレンスのルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定した。ルシフェラーゼ活性の測定は１０秒間の発光を積分モードでカウントすることによって行い、その他の条件はキットの説明書に従った。さらに、得られたレポーターの活性測定値をリファレンスの活性測定値で割ることによって、導入効率も考慮に入れた活性値を求めた。
(1-5) Measurement of luciferase activity Arabidopsis leaves into which gold particles were implanted were allowed to stand for 6 hours in a bright place at 22 ° C., then pulverized in liquid nitrogen, and Dual-Luciferase Reporter System System (trade name, manufactured by Promega). The suspension was suspended in 200 μl of Passive Lysis Buffer attached to the kit. The resulting suspension was centrifuged to collect the supernatant, and 20 μl of the cell extract was mixed with 100 μl of the measurement buffer attached to the kit. Then, the reporter and reference luciferase activities in the mixed solution were measured using a luminometer (TD20 / 20, manufactured by Turener Design). The luciferase activity was measured by counting luminescence for 10 seconds in the integration mode, and other conditions were in accordance with the kit instructions. Furthermore, the activity value taking into account the introduction efficiency was determined by dividing the activity measurement value of the obtained reporter by the activity measurement value of the reference.
上述した活性値の測定を、遺伝子導入の段階から個別に３回行って、３回分の活性値の平均値を算出する作業を各種エフェクターベクターごとに行った。そして、エフェクターベクターを導入しない場合のレポーターの活性を１００として、各種エフェクターの相対活性値をそれぞれ算出した。その結果を表１に示す。 The activity value measurement described above was performed three times individually from the stage of gene introduction, and the work of calculating the average value of the activity values for the three times was performed for each effector vector. Then, the relative activity values of various effectors were calculated with the reporter activity when no effector vector was introduced as 100. The results are shown in Table 1.
上記のように、全てのエフェクターにおいて、相対活性値は１５．１％〜２５．０％となった。即ち、相対活性値は７５．０％〜８４．９％減少した。また、上記のエフェクターベクターから変換オリゴヌクレオチドを除いた、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤのみを有するベクターを用いてコントロール実験を行ったところ、レポーターの活性は抑制されなかった。従って、配列番号１から６のペプチドには転写因子を転写抑制因子に変換する能力があることが明らかとなった。 As described above, the relative activity values of all effectors ranged from 15.1% to 25.0%. That is, the relative activity value decreased by 75.0% to 84.9%. In addition, when a control experiment was performed using a vector having only p35S-GAL4DBD obtained by removing the conversion oligonucleotide from the effector vector, the reporter activity was not suppressed. Therefore, it was revealed that the peptides of SEQ ID NOs: 1 to 6 have the ability to convert a transcription factor into a transcription repressor.
〔実施例２〕
以下実施例２〜４において、発現ベクター構築用ベクター、及びこれを用いた発現ベクターの構築方法、並びにそれによって得られた発現ベクターの例について説示する。また、実施例５において、上記発現ベクターを用いた遺伝子の転写抑制方法の一例について説示する。本実施例では、変換ペプチドの一例としてＳＲＤＸ（配列番号４５）を用いた。使用する変換ペプチドはこれに限られるものではなく、既述した本発明に係る変換ペプチド（配列番号１〜６）に置換しても同様の結果が得られることは言うまでもない。また、変換ペプチドの標的となる転写因子として、シロイヌナズナ由来の転写因子ＥＲＦ１タンパク質（配列番号４１）を用いた。
[Example 2]
In Examples 2 to 4 below, an expression vector construction vector, an expression vector construction method using the same, and examples of expression vectors obtained thereby will be described. In Example 5, an example of a method for suppressing transcription of a gene using the expression vector will be described. In this example, SRDX (SEQ ID NO: 45) was used as an example of a conversion peptide. The conversion peptide to be used is not limited to this, and it goes without saying that the same result can be obtained even if the conversion peptide according to the present invention described above (SEQ ID NOs: 1 to 6) is substituted. Moreover, the transcription factor ERF1 protein (SEQ ID NO: 41) derived from Arabidopsis thaliana was used as a transcription factor to be a target of the conversion peptide.
実施例２では、発現ベクター構築用ベクター及びその構築方法の一例として、ｐ３５ＳＲＤＸＧ及びその構築方法について以下に説明する。 In Example 2, p35SRDXG and its construction method will be described below as an example of an expression vector construction vector and its construction method.
まず、図５に示すように、プラスミドベクターｐＥＮＴＲ（商品名、インビトロジェン社製）に含まれるａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２のそれぞれの領域をプライマーａｔｔＬ１−Ｆ（配列番号３５）、ａｔｔＬ１−Ｒ（配列番号３６）、ａｔｔＬ２−Ｆ（配列番号３７）、ａｔｔＬ２−Ｒ（配列番号３８）を用いてＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ反応の条件は、変性反応として９４℃１分間、アニーリング反応として４７℃２分間、伸長反応として７４℃１分間を１サイクルとして、２５サイクル行った。以下の実施例において、ＰＣＲ反応は全てこの条件で行った。得られたａｔｔＬ１断片は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ａｔｔＬ２断片はＥｃｏＲＩで消化し、それぞれ精製した。 First, as shown in FIG. 5, each region of attL1 and attL2 contained in a plasmid vector pENTR (trade name, manufactured by Invitrogen) is expressed by primers attL1-F (SEQ ID NO: 35), attL1-R (SEQ ID NO: 36), It amplified by PCR using attL2-F (sequence number 37) and attL2-R (sequence number 38). The PCR reaction conditions were 25 cycles with 94 ° C. for 1 minute as a denaturing reaction, 47 ° C. for 2 minutes as an annealing reaction, and 74 ° C. for 1 minute as an extension reaction. In the following examples, all PCR reactions were performed under these conditions. The obtained attL1 fragment was digested with the restriction enzyme HindIII, and the attL2 fragment was digested with EcoRI and purified.
プラスミドベクターｐＢＩ２２１（商品名、クロンテック社製）を制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｃＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳを除き、３５Ｓ−ｐｒｏとＮｏｓ−ｔｅｒを含む３５Ｓ−Ｎｏｓ断片を得た。 After digesting plasmid vector pBI221 (trade name, manufactured by Clontech) with restriction enzymes XbaI and SacI, GUS was removed by agarose gel electrophoresis to obtain a 35S-Nos fragment containing 35S-pro and Nos-ter.
配列番号３９，４０のＤＮＡ断片を合成し、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングして２本鎖ＤＮＡを形成した。これを上記３５Ｓ−Ｎｏｓ断片のＸｂａＩ−ＳａｃＩ領域にライゲーションし、ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓを構築した。配列番号３９，４０の配列を有するＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩが含まれる。 The DNA fragments of SEQ ID NOs: 39 and 40 were synthesized, heated at 90 ° C. for 2 minutes, then heated at 60 ° C. for 1 hour, and then allowed to stand at room temperature (25 ° C.) for 2 hours for annealing to obtain double-stranded DNA. Formed. This was ligated to the XbaI-SacI region of the 35S-Nos fragment to construct p35S-Nos. The DNA fragment having the sequences of SEQ ID NOs: 39 and 40 includes a BamHI restriction enzyme site at the 5 'end, an omega sequence derived from tobacco mosaic virus that enhances translation efficiency, and restriction enzyme sites SmaI, SalI, and SstI.
ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記ａｔｔＬ１断片を挿入した。さらにこれをＥｃｏＲＩで消化し、ａｔｔＬ２断片を挿入した。以上のようにして、ｐ３５ＳＧを構築した。 p35S-Nos was digested with the restriction enzyme HindIII, and the attL1 fragment was inserted. This was further digested with EcoRI and the attL2 fragment was inserted. As described above, p35SG was constructed.
次に、変換ペプチドＳＲＤＸ（配列番号４５）をコードするオリゴヌクレオチド（配列番号４６，４７）を合成して、アニーリングを行い、２本鎖ＤＮＡにした。図６に示すように、ｐ３５ＳＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記の変換ペプチドをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入した。以上のようにして、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧが得られた。 Next, an oligonucleotide (SEQ ID NO: 46, 47) encoding the converted peptide SRDX (SEQ ID NO: 45) was synthesized and annealed to obtain double-stranded DNA. As shown in FIG. 6, p35SG was digested with restriction enzymes SmaI and SalI, and double-stranded DNA encoding the above-mentioned conversion peptide was inserted into this region. As described above, p35SSRDXG was obtained.
〔実施例３〕
本実施例では、本発明に係る発現ベクター構築用ベクター及びその構築方法の別の例として、ｐＡｃｔＳＲＤＸＧ及びその構築方法について以下に説明する。
Example 3
In this example, pActSRDXG and its construction method will be described below as another example of the expression vector construction vector and its construction method according to the present invention.
まず、上記のプラスミドベクターｐ３５ＳＧを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩで消化し、電気泳動にて３５Ｓ−ｐｒｏ領域を除去するとともに、ａｔｔＬ１断片を回収した。 First, the above plasmid vector p35SG was digested with restriction enzymes HindIII and SmaI, the 35S-pro region was removed by electrophoresis, and the attL1 fragment was recovered.
東京大学より譲渡されたプラスミドベクターｐＡｃｔＦ１／ＴＡ（N.Sentoku, Y.Sato, M.Matsuoka, Develop.Biol.220,358-364(2000)）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩで消化し、電気泳動にてアクチン遺伝子のプロモーター（Ａｃｔ−ｐｒｏ）を含むＤＮＡ断片を回収した。 Plasmid vector pActF1 / TA (N. Sentoku, Y. Sato, M. Matsuoka, Develop. Biol. 220, 358-364 (2000)) transferred from the University of Tokyo was digested with restriction enzymes HindIII and SmaI, and actin was obtained by electrophoresis. A DNA fragment containing the gene promoter (Act-pro) was recovered.
回収した上記ＤＮＡ断片を、ｐ３５ＳＧから３５Ｓ−ｐｒｏを除去した断片のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ部位に挿入した。これをさらにＨｉｎｄＩＩＩで消化し、回収しておいたａｔｔＬ１断片を挿入した。以上のようにして、ｐＡｃｔＧを構築した。 The recovered DNA fragment was inserted into the HindIII-SmaI site of the fragment obtained by removing 35S-pro from p35SG. This was further digested with HindIII and the recovered attL1 fragment was inserted. As described above, pActG was constructed.
次に、変換ペプチドＳＲＤＸ（配列番号４５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４６，４７）を合成して、アニーリングを行い、２本鎖ＤＮＡにした。 Next, a polynucleotide (SEQ ID NO: 46, 47) encoding the converted peptide SRDX (SEQ ID NO: 45) was synthesized and annealed to obtain double-stranded DNA.
図８に示すように、ｐＡｃｔＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記変換ペプチドをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入して、ｐＡｃｔＳＲＤＸＧを完成させた。 As shown in FIG. 8, pActG was digested with restriction enzymes SmaI and SalI, and double-stranded DNA encoding the conversion peptide was inserted into this region to complete pActSRDXG.
〔実施例４〕
本実施例では、本発明に係る発現ベクター構築用ベクター及びその構築方法の別の例として、シロイヌナズナ由来の転写因子ＥＲＦ１タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだｐ３５ＥＲＦ１ＳＲＤＸＧ及びその構築方法について説明する。
Example 4
In this example, p35ERF1SRDXG incorporating a gene encoding a transcription factor ERF1 protein derived from Arabidopsis thaliana and a method for constructing it will be described as another example of the vector for constructing the expression vector and the method for constructing the expression vector according to the present invention.
また、本実施例では、発現ベクター構築用ベクターのａｔｔ部位を利用した発現ベクターの構築方法、並びにそれによって得られた発現ベクターの一例として、ｐ３５ＥＲＦ１ＳＲＤＸＧのａｔｔ部位を利用した発現ベクターの構築方法、並びにそれによって得られた発現ベクターｐＢＩＧ−ＥＲＦ１ＳＲＤＸについて以下に説明する。 Further, in this example, as an example of an expression vector construction method using an att site of an expression vector construction vector, and an expression vector obtained thereby, an expression vector construction method using an att site of p35ERF1SRDXG, and The expression vector pBIG-ERF1SRDX obtained thereby will be described below.
（４−１）発現用ベースベクターの作製
上記構築用ベクターのａｔｔ部位で挟まれたＤＮＡセグメントを転移させるために、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターであるｐＢＩＣＫＫ及びｐＢＩＧＣＫＨを以下のようにして作製した。
(4-1) Preparation of expression base vector In order to transfer a DNA segment sandwiched between att sites of the above construction vector, plant transformation vectors having two att sites, pBICKK and pBIGCKH, are as follows: It was made.
図９に示すように、米国ミシガン州立大学より譲渡されたプラスミドベクターｐＢＩＧ（Becker, D. Nucleic Acids Res. 18:203,1990）及びプラスミドベクターｐＢＩ１０１（商品名、クロンテック社）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化して、ＧＵＳ並びにＮｏｓ−ｔｅｒを電気泳動で除いた。 As shown in FIG. 9, plasmid vectors pBIG (Becker, D. Nucleic Acids Res. 18: 203, 1990) and plasmid vector pBI101 (trade name, Clontech) assigned by Michigan State University, USA were used as restriction enzymes HindIII and EcoRI. GUS and Nos-ter were removed by electrophoresis.
インビトロジェン社から購入したＧａｔｅｗａｙ(登録商標)ベクターコンバージョンシステムのＦｒａｇｍｅｎｔＡをプラスミドベクターｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶ部位に挿入した。これをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化して、ＦｒａｇｍｅｎｔＡ断片を回収した。 Fragment A of the Gateway® vector conversion system purchased from Invitrogen was inserted into the EcoRV site of the plasmid vector pBluescript. This was digested with HindIII and EcoRI to recover the Fragment A fragment.
回収したＦｒａｇｍｅｎｔＡ断片を上記の消化したｐＢＩ１０１又はｐＢＩＧ断片に挿入した。以上のようにして、ｐＢＩＣＫＫ及びｐＢＩＧＣＫＨが得られた。なお、これらのベクターは大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン社）でのみ増殖可能で、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性である。 The recovered Fragment A fragment was inserted into the digested pBI101 or pBIG fragment. As described above, pBICKK and pBIGCKH were obtained. These vectors can be grown only in E. coli DB3.1 (Invitrogen) and are resistant to chloramphenicol and kanamycin.
（４−２）発現ベクター構築用ベクターへの転写因子ポリヌクレオチドの挿入
転写抑制因子を発現させるために、シロイヌナズナ由来の転写因子ＥＲＦ１タンパク質（配列番号４１）をコードする遺伝子（配列番号４２）を発現ベクター構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧに以下のようにして挿入した。
(4-2) Insertion of transcription factor polynucleotide into expression vector construction vector Expression of transcription factor ERF1 protein (SEQ ID NO: 41) derived from Arabidopsis thaliana is expressed in order to express a transcription repressing factor. The vector was inserted into the vector construction vector p35SSRDXG as follows.
シロイヌナズナ由来ＥＲＦ１遺伝子のＯＲＦのうち、終始コドンを除く領域をプライマーＥＲＦ１−Ｆ（配列番号４３）及びプライマーＥＲＦ１−Ｒ（配列番号４４）を用いてＰＣＲにて増幅を行った。 Of the ORF of the ERF1 gene derived from Arabidopsis thaliana, the region excluding the termination codon was amplified by PCR using primer ERF1-F (SEQ ID NO: 43) and primer ERF1-R (SEQ ID NO: 44).
増幅されたＥＲＦ１のＯＲＦのＤＮＡ断片を、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。 The amplified DNA fragment of ORF1 of ERF1 was ligated to the SmaI site of the construction vector p35SSRDXG previously digested with the restriction enzyme SmaI.
得られたベクターの塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離した。以上のようにして、転写抑制因子ポリヌクレオチドを含む発現ベクター構築用ベクターｐ３５ＥＲＦ１ＳＲＤＸＧが得られた。 The base sequence of the obtained vector was determined, and the clone inserted in the forward direction was isolated. As described above, the expression vector construction vector p35ERF1SRDXG containing the transcriptional repressor polynucleotide was obtained.
（４−３）植物を形質転換するための発現ベクターの作製
上記の発現ベクター構築用ベクター上にある３５Ｓ−ｐｒｏ、転写抑制因子ポリヌクレオチド、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨに転移させることにより、植物を形質転換させるための発現ベクターｐＢＩＧ−ＥＲＦ１ＳＲＤＸを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）を用いて以下のように行った。
(4-3) Preparation of expression vector for transforming plant DNA fragment containing 35S-pro, transcription repressor polynucleotide, Nos-ter, etc. on the above expression vector construction vector is used for plant transformation. By transferring to the vector pBIGCKH, an expression vector pBIG-ERF1SRDX for transforming plants was constructed. The recombination reaction was performed as follows using Gateway (registered trademark) LR clonease (registered trademark) manufactured by Invitrogen.
まず、１．５μＬ（約３００ｎｇ）のｐ３５ＥＲＦ１ＳＲＤＸＧ及び４．０μＬ（約６００ｎｇ）のｐＢＩＧＣＫＨに、５倍希釈した４．０μＬのＬＲ ｂｕｆｆｅｒ及び５．５μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えた。 First, 4.0 μL LR buffer and 5.5 μL TE buffer (10 mM TrisCl pH 7.0, 1 mM EDTA) diluted 5-fold into 1.5 μL (about 300 ng) p35ERF1SRDXG and 4.0 μL (about 600 ng) pBIGCKH ) Was added.
上記の溶液に４．０μＬのＬＲ ｃｌｏｎａｓｅを加えて２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、２μＬのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。その後、この溶液を１〜２μＬ用いて大腸菌（ＤＨ５α株等）を形質転換し、カナマイシンで選択した。 4.0 μL of LR clonease was added to the above solution and incubated at 25 ° C. for 60 minutes. Subsequently, 2 μL of proteinase K was added and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 1 to 2 μL of this solution was used to transform E. coli (DH5α strain, etc.) and selected with kanamycin.
以上の方法を用いることによって、発現ベクター構築用ベクターを組換えて発現ベクターｐＢＩＧ−ＥＲＦ１ＳＲＤＸを得ることができた。 By using the above method, the expression vector pBIG-ERF1SRDX could be obtained by recombination of the expression vector construction vector.
〔実施例５〕
本実施例では、上記の発現ベクターを宿主細胞に導入し、転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドと転写因子とを融合させた転写抑制因子を発現させる工程を含む遺伝子の転写抑制方法の一例として、発現ベクターｐＢＩＧ−ＥＲＦ１ＳＲＤＸをシロイヌナズナの細胞に導入した。なお、シロイヌナズナの形質転換は、Transfomation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration (http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)に従った。
Example 5
In this example, an example of a gene transcription repression method comprising the step of introducing the above expression vector into a host cell and expressing a transcription repression factor fused with a peptide that converts a transcription factor into a transcription repression factor and a transcription factor. As an expression vector, pBIG-ERF1SRDX was introduced into Arabidopsis cells. The transformation of Arabidopsis was performed according to Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration (http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm).
まず上記の発現ベクターｐＢＩＧ−ＥＲＦ１ＳＲＤＸを、土壌細菌（（Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Sahell 1986)株）にエレクトロポレーション法にて導入した。そして、上記細菌を、抗生物質（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン２５μｇ／ｍｌ、リファンピシリン５０μｇ／ｍｌ）を含む１ＬのＹＥＰ培地中でＯＤ６００が１になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、以下の表２に示す１Ｌの感染用培地に懸濁した。 First, the expression vector pBIG-ERF1SRDX was introduced into a soil bacterium ((Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (C58C1Rifr) pMP90 (Gmr) (koncz and Sahell 1986) strain) by an electroporation method.) The cells were cultured in 1 L of YEP medium containing the substances (kanamycin 50 μg / ml, gentamicin 25 μg / ml, rifampicillin 50 μg / ml) until OD 600 was 1. Then, the cells were collected from the culture solution, and the following Table 2 Suspended in 1 L of infection medium as shown in FIG.
この懸濁液に、１４日間育成したシロイヌナズナを１分間浸漬し、上記細菌に感染させた後、再び育成し結種させた。回収した種子を２５％ブリーチ，０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液に７分間浸漬して滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、以下の表３に示す滅菌したハイグロマイシン選択培地に蒔種した。 In this suspension, Arabidopsis thaliana cultivated for 14 days was immersed for 1 minute to be infected with the bacteria, and then bred and seeded again. The collected seeds were sterilized by immersing in 25% bleach, 0.02% Triton X-100 aqueous solution for 7 minutes, rinsed three times with sterilized water, and seeded on the sterilized hygromycin selective medium shown in Table 3 below. .
蒔種した約５０００粒の種子から平均して２０個体のハイグロマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。これらの植物からＤＮＡを調製し、ＰＣＲを用いてＥＲＦ１ＳＲＤＸの遺伝子が導入されていることを確認した。 On average, 20 transformed plants that were resistant to hygromycin were obtained from about 5000 seeds that had been sowed. DNA was prepared from these plants, and it was confirmed that the gene for ERF1SRDX was introduced using PCR.
以上のようにして、本発明の変換オリゴヌクレオチドを含むベクターによって形質転換された植物個体が得られた。 As described above, a plant individual transformed with the vector containing the conversion oligonucleotide of the present invention was obtained.
なお、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。それゆえ、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 In addition, this invention is not limited to embodiment mentioned above, A various change is possible in the range shown to the claim. Therefore, embodiments obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments are also included in the technical scope of the present invention.
本発明に係る遺伝子の転写抑制機能を有する新規ペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチド、並びにその利用方法は、特定の遺伝子の転写を抑制することによって、研究用試薬や試料等の生産に関わる産業分野に好適に利用できるだけでなく、例えば、生物の品種改良、種苗産業、家畜水産業等にも利用でき、さらには医学的・薬学的な分野にも利用できる。 A novel peptide having a transcriptional repression function of a gene according to the present invention, a polynucleotide encoding the same, and a method for using the same, an industrial field related to production of research reagents, samples, etc. by suppressing transcription of a specific gene For example, it can also be used for biological improvement of seeds, seed and seedling industries, livestock and fishery industries, and also for medical and pharmaceutical fields.
Claims (23)
α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ ・・・（１）
α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ ・・・（２）
α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ ・・・（３）
（ただし、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ又はＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｃｙｓ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ又はＳｅｒを示し、β２は、Ａｓｎ又はＳｅｒを示し、γ1は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＨｉｓを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、転写因子を転写抑制因子に変換することを特徴とする変換ペプチド。 The following general formula (1), (2) or (3)
α 1 -Leu-β 1 -Leu-γ 1 -Leu (1)
α 1 -Leu-β 2 -Leu-Arg-Leu (2)
α 2 -Leu-β 1 -Leu-Arg-Leu (3)
(Wherein α 1 represents Asp, Asn, Cys or Ser, α 2 represents Asn, Cys or Ser, β 1 represents Asp, Asn or Ser, and β 2 represents Asn or Ser. And γ 1 represents Ser, Lys, or His.)
A conversion peptide characterized by having an amino acid sequence represented by the above formula and converting a transcription factor into a transcription repressor.
任意の転写因子又は少なくともＤＮＡ結合ドメインを含む任意の転写因子の一部とを融合させてなることを特徴とする転写抑制因子。 The converted peptide according to any one of claims 1 to 4, and
A transcription repressing factor characterized by fusing any transcription factor or at least a part of any transcription factor containing a DNA binding domain.
２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター、請求項７に記載の変換オリゴヌクレオチド及び１個以上の制限酵素認識部位を備え、
前記２つのａｔｔ部位の間に、前記プロモーター及びターミネーターが存在し、
さらに当該プロモーター及びターミネーターとの間に、前記変換オリゴヌクレオチドと１個以上の制限酵素部位とが存在することを特徴とする発現ベクター構築用ベクター。 A vector used to construct an expression vector for expressing a transcriptional repressor in plant cells,
Comprising two att sites, a promoter, a terminator, the conversion oligonucleotide of claim 7 and one or more restriction enzyme recognition sites;
The promoter and terminator are present between the two att sites,
An expression vector construction vector, wherein the conversion oligonucleotide and one or more restriction enzyme sites are present between the promoter and terminator.
２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター及び請求項８に記載の転写抑制因子ポリヌクレオチドを備え、
前記２つのａｔｔ部位の間に、前記プロモーター及びターミネーターが存在し、
さらに当該プロモーター及びターミネーターとの間に、前記転写抑制因子ポリヌクレオチドが存在することを特徴とする発現ベクター構築用ベクター。 A vector used to construct an expression vector for expressing a transcriptional repressor in plant cells,
Comprising two att sites, a promoter, a terminator and the transcriptional repressor polynucleotide of claim 8.
The promoter and terminator are present between the two att sites,
An expression vector construction vector, wherein the transcription repressor polynucleotide is present between the promoter and terminator.
任意の転写因子又は少なくともＤＮＡ結合ドメインを含む任意の転写因子の一部をコードする転写因子ポリヌクレオチドと、
プロモーターとを含んでなる発現ベクターを宿主細胞に導入し、
転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドと転写因子とを融合させた転写抑制因子を発現させる工程を含むことを特徴とする遺伝子の転写抑制方法。 A conversion oligonucleotide according to claim 7;
A transcription factor polynucleotide encoding any transcription factor or a portion of any transcription factor comprising at least a DNA binding domain;
Introducing an expression vector comprising a promoter into a host cell;
A method for suppressing transcription of a gene, comprising a step of expressing a transcription repressing factor obtained by fusing a transcription factor with a peptide that converts a transcription factor into a transcription repressing factor.
転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドと、転写因子又は少なくともＤＮＡ結合ドメインを含む転写因子の一部とを融合させてなる転写抑制因子を発現させる工程を含むことを特徴とする遺伝子の転写抑制方法。 Introducing the expression vector of claim 20 into a host cell;
Transcriptional repression of a gene comprising the step of expressing a transcriptional repressing factor formed by fusing a peptide that converts a transcription factor into a transcriptional repressing factor and a transcription factor or at least a part of a transcription factor containing a DNA binding domain Method.
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