JP2006042734A - Drug metabolism type cyp protein mutant - Google Patents
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Description
本発明は、酵素化学反応が起こる位置に結合した候補化合物との複合体結晶を形成する新規蛋白質、前記蛋白質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された細胞、前記蛋白質の結晶、前記蛋白質と候補化合物の複合体、前記複合体の結晶、及び前記複合体の製造法等に関する。また候補化合物とCytochrome P450 2C9蛋白質との相互作用の評価方法、及び前記相互作用や候補化合物と前記蛋白質の複合体結晶の構造座標データ等を指標として候補化合物をスクリーニングする方法等に関する。 The present invention relates to a novel protein that forms a complex crystal with a candidate compound bound to a position where an enzymatic chemical reaction occurs, a polynucleotide encoding the protein, an expression vector containing the polynucleotide, and an expression vector transformed with the expression vector. The present invention relates to a cell, a crystal of the protein, a complex of the protein and a candidate compound, a crystal of the complex, a method for producing the complex, and the like. The present invention also relates to a method for evaluating an interaction between a candidate compound and a Cytochrome P450 2C9 protein, and a method for screening a candidate compound using the interaction, structure coordinate data of a complex crystal of the candidate compound and the protein, or the like as an index.
Cytochrome P450(CYP)は、様々な代謝系、生合成系に関わる酵素群である。中でも肝臓に存在するCYPは、薬物、異物の代謝に関わっていることが知られている。特に、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4の4つのサブタイプは、臨床で用いられている薬物の92%を代謝すると考えられている（Anzenbacher, P. & Anzenbacherova, E. Cytochromes P450 and metabolism of xenobiotics. Cell. Mol. Life Sci. 58, 737-747 (2001)）。これらのCYPはいずれも基質特異性が低く、1つのサブタイプが様々な薬物の代謝に関わるが、そのことが薬物間相互作用が起こる原因となっている。薬物間相互作用とは、複数の薬物を併用した際、一方が他方の代謝を阻害することにより単独投与時に比べ血中の薬物濃度が著しく上昇する現象を引き起こす2種類以上の薬物の作用をいう。 Cytochrome P450 (CYP) is an enzyme group involved in various metabolic and biosynthetic systems. Among them, CYP existing in the liver is known to be involved in the metabolism of drugs and foreign substances. In particular, the four subtypes CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, and CYP3A4 are thought to metabolize 92% of clinically used drugs (Anzenbacher, P. & Anzenbacherova, E. Cytochromes P450 and metabolism of xenobiotics. Cell. Mol. Life Sci. 58, 737-747 (2001)). All of these CYPs have low substrate specificity, and one subtype is involved in the metabolism of various drugs, which causes drug-drug interactions. Drug-drug interaction refers to the action of two or more drugs that cause a phenomenon in which the concentration of the drug in the blood rises significantly compared to when administered alone, by inhibiting the metabolism of the other when one drug is used in combination. .
副作用や毒性発現の危険性から、薬物間相互作用を起こさない薬を開発することが望まれており、近年、創薬研究においてはCYP阻害活性の評価と阻害活性を軽減するための修飾合成等が必須となってきている。このCYP阻害活性軽減のための修飾合成の際、代謝型P450蛋白質の3次元立体構造、更には対象となる化合物と代謝型P450蛋白質の結合状態に関する3次元立体構造を知ることは、CYP阻害回避策立案のための重要な情報になる。 Due to the risk of side effects and toxicity, it is desired to develop drugs that do not cause drug interactions. In recent years, in drug discovery research, evaluation of CYP inhibitory activity and modified synthesis to reduce inhibitory activity, etc. Has become essential. During the modification synthesis to reduce this CYP inhibitory activity, knowing the three-dimensional structure of the metabolized P450 protein and the three-dimensional structure of the target compound and the metabolized P450 protein can be avoided. It will be important information for planning.
ところで、これらの3次元立体構造を原子レベルで直接明らかにする手段としては、現実的にはX線結晶構造解析しかない。蛋白質のX線結晶構造解析を行うには、高純度な蛋白質を大量に調製すること、及び当該蛋白質を結晶化させることが必要である。通常の蛋白質であれば、組換え蛋白質発現法や精製のためのクロマトグラフィーなどの操作が周知であり、それらを組み合わせる事によって大量かつ高純度に調製することが可能である。しかしながら野生型CYP蛋白質は、膜貫通ドメインを持つ膜蛋白質であるため、単離精製が困難であるばかりでなく構造解析のための結晶化も困難であった。このため種々の膜貫通ドメインを削除した種々のCYP蛋白質を作成し可溶化する試みが行われており、削除した領域によりその蛋白質の溶解度などの物性が異なることが知られている（Archieves of Biochemistry and Biophysics 305、123-131(1993)）。 By the way, the only means for directly revealing these three-dimensional structures at the atomic level is actually X-ray crystal structure analysis. In order to perform X-ray crystal structure analysis of a protein, it is necessary to prepare a large amount of a highly pure protein and to crystallize the protein. For ordinary proteins, operations such as recombinant protein expression methods and chromatography for purification are well known, and can be prepared in large quantities and in high purity by combining them. However, since the wild-type CYP protein is a membrane protein having a transmembrane domain, it is difficult not only to isolate and purify but also to crystallize for structural analysis. For this reason, attempts have been made to prepare and solubilize various CYP proteins from which various transmembrane domains have been deleted, and it is known that physical properties such as solubility of the protein differ depending on the deleted region (Archieves of Biochemistry and Biophysics 305, 123-131 (1993)).
周知の遺伝子操作技術により種々の組換え蛋白質を作成し、そのX線結晶構造解析を行うことが試みられているものの、現在までヒト薬物代謝型CYP蛋白質の立体構造は、CYP2C9, CYP2C19及びCYP3A4に関する3例が知られているだけである（特許文献１,２,３及び非特許文献１）。ヒト薬物代謝型CYP蛋白質と有機化合物との複合体についても、1例のみ報告がある（非特許文献１）。この複合体は、ヒトCYP2C9の一部アミノ酸配列を、構造が報告されているラビットCYP2C5の配列（非特許文献２）に置換し、CYP2C9のキメラ蛋白質を作成し、次にCYP2C9により水酸化反応を受けることが広く知られているワルファリン（S-Warfarin）をリガンドとして複合体を形成させたものである。しかしながら、当該複合体の構造解析結果によれば、ワルファリンの結合位置は水酸化反応を受けるCYP2C9ヘム鉄近傍ではなく、現実の酵素化学反応機構を表現できている構造とは言えないものであった(非特許文献１)。
Although attempts have been made to create various recombinant proteins using well-known gene manipulation techniques and to analyze their X-ray crystal structures, the three-dimensional structure of human drug metabolizing CYP proteins is related to CYP2C9, CYP2C19 and CYP3A4. Only three examples are known (
本発明の課題は、実際の酵素化学反応機構を表現するCYP2C9変異体蛋白質、その基質との複合体、殊にこれらの結晶を提供することにある。また、前記複合体結晶の構造座標やこれを用いたCYP2C9蛋白質との相互作用が低減された化学修飾体をスクリーニングする方法等を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a CYP2C9 mutant protein expressing an actual enzyme chemical reaction mechanism, a complex thereof with a substrate, and particularly a crystal thereof. Another object of the present invention is to provide a method for screening a chemical modification in which the interaction with the CYP2C9 protein using the structural coordinates of the complex crystal and the complex crystal is reduced.
本発明者は、実際の酵素化学反応機構を表現するCYP2C9蛋白質の立体構造の解明に使用できる変異体並びにその結晶の創製を目指し、まず、野生型CYP2C9蛋白質の膜貫通部位の適当な部位での削除を検討した。次に、野生型配列では蛋白質が凝集を起こしやすく結晶化を困難にしていることを知見し、凝集を起こし難い変異体の探索を行った。得られた多数の変異体を種々の蛋白質結晶化法に供し、結晶化可能な変異体を見出し、更に複合体結晶の創製と構造解析を行った。その結果、CYP2C9変異体蛋白質と、CYP2C9蛋白質により水酸化反応を受けることが知られているワルファリン並びにトルブタミド（Tolbutamide）との複合体結晶を取得し、当該複合体が実際の酵素化学反応機構を表現する立体構造を有すること、即ち、上記化合物の水酸化される部位が酵素化学反応が起こりうる距離（ヘム鉄から約4Å）に結合していることを知見して本発明を完成した。 The present inventor aimed to create a mutant that can be used to elucidate the three-dimensional structure of the CYP2C9 protein that expresses the actual enzyme chemical reaction mechanism and a crystal thereof, first, at the appropriate site of the transmembrane site of the wild-type CYP2C9 protein. Deletion was considered. Next, we found that the wild-type sequence is prone to aggregation and difficult to crystallize, and searched for mutants that are difficult to aggregate. Many of the obtained mutants were subjected to various protein crystallization methods to find crystallizable mutants, and further, complex crystals were created and structural analysis was performed. As a result, we obtained complex crystals of CYP2C9 mutant protein, warfarin and tolbutamide (Tolbutamide), which are known to undergo hydroxylation by CYP2C9 protein, and the complex expresses the actual enzyme chemical reaction mechanism. In other words, the present invention has been completed by knowing that it has a three-dimensional structure, that is, the hydroxylated portion of the above compound is bound to a distance (about 4 km from heme iron) where an enzymatic chemical reaction can occur.
即ち、本発明は、以下に列記する発明に関する。
（１）（i）配列番号62で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、あるいは、（ii）配列番号62で表されるアミノ酸配列、または配列番号62で表されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ大腸菌で発現させたときに、Cytochrome P450 2C9蛋白質により代謝される非ペプチド性有機化合物が酵素化学反応が起こる位置に結合した複合体結晶を、少なくとも１つ形成する蛋白質。
（２）ALA103、ALA106、ASN107、VAL113、PHE114、LEU201、ASN204、ILE205、LEU208、LEU233、VAL237、VAL292、ASP293、LEU294、PHE295、GLY296、ALA297、GLY298、THR299、GLU300、THR301、LEU362及びLEU366のアミノ酸により酵素ポケットを形成する（１）の蛋白質。
（３）（１）に記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（４）（３）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（５）（４）に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
（６）（１）に記載の蛋白質の結晶。
（７）（１）に記載の蛋白質と、Cytochrome P450 2C9蛋白質により代謝される若しくはCytochrome P450 2C9蛋白質の酵素活性を阻害する非ペプチド性有機化合物との複合体。
（８）（７）に記載の複合体の結晶。
（９）（１）に記載の蛋白質と、Cytochrome P450 2C9蛋白質により代謝される若しくはCytochrome P450 2C9蛋白質の酵素活性を阻害する非ペプチド性有機化合物とを接触させる工程を含むことを特徴とする（７）に記載の複合体の製造法。
（１０）i)候補化合物を、（１）に記載の蛋白質と接触させる工程、並びにii)当該候補化合物と（１）に記載の蛋白質の複合体形成の程度もしくは相互作用の程度を測定する工程を含むことを特徴とする、当該候補化合物のCytochrome P450 2C9蛋白質との相互作用の評価方法。
（１１）構造座標１または構造座標２に記載の構造座標。
（１２）（１１）に記載の構造座標のデータが格納された、機械読み取り可能な媒体。
（１３）少なくとも、中央演算処理装置、入力装置、出力装置及びデータ記憶装置を含むハードシステムと、構造座標データにアクセスして解析し、得られた三次元立体構造を用いて候補化合物の検索、評価若しくは設計を行うことができるソフトウェアとからなるコンピューターシステムであって、（８）に記載の複合体結晶の構造座標データを格納し、当該座標データから得られた三次元立体構造を用いて候補化合物の検索、評価若しくは設計を行うようプログラムされたことを特徴とするコンピューターシステム。
（１４）複合体結晶の構造座標データが構造座標１または構造座標２に記載の構造座標データである（１３）のコンピューターシステム。
（１５）（１３）に記載のコンピューターシステムを用いて、Cytochrome P450 2C9蛋白質による代謝の程度が低減された、若しくはCytochrome P450 2C9蛋白質の酵素活性を阻害する程度が低減された非ペプチド性有機化合物を検索、評価若しくは設計する方法。
（１６）（１）に記載の蛋白質と、Cytochrome P450 2C9蛋白質により代謝される若しくはCytochrome P450 2C9蛋白質の酵素活性を阻害する非ペプチド性有機化合物との複合体結晶の構造座標データを使用して、該非ペプチド性有機化合物の化学修飾体の検索、評価若しくは設計を行うようプログラムされたコンピューターシステムを用いることを特徴とする、Cytochrome P450 2C9蛋白質による代謝の程度が該非ペプチド性有機化合物の1/10以下に低減された、若しくはCytochrome P450 2C9蛋白質の酵素活性を阻害する程度が該非ペプチド性有機化合物の1/10以下に低減された化学修飾体のスクリーニング方法。
（１７）更に、コンピュータシステムによって選択若しくは設計された化学修飾体を合成し、そのCytochrome P450 2C9蛋白質による代謝の程度若しくはCytochrome P450 2C9蛋白質の酵素活性を阻害する程度を測定する工程を包含する（１６）のスクリーニング方法。
（１８）（１７）に記載の方法によって選択されたことを特徴とする化学修飾体。
（１９）Cytochrome P450 2C9蛋白質による代謝の程度が低減された、若しくはCytochrome P450 2C9蛋白質の酵素活性を阻害する程度が低減された化学修飾体の検索、評価若しくは設計を行うための、構造座標１または構造座標２に記載の構造座標の使用。
（２０）可溶性Cytochrome P450変異体の、分子としての均一性を確認する工程、及び均一性を有する変異体を選択する工程を含む結晶化可能なCytochrome P450変異体をスクリーニングする方法。
That is, the present invention relates to the invention listed below.
(1) (i) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62, or (ii) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62, or 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62 Non-peptidic organic compounds metabolized by the Cytochrome P450 2C9 protein bound to the position where an enzymatic chemistry occurs when the amino acid contains an amino acid sequence deleted, substituted, and / or inserted and expressed in E. coli A protein that forms at least one complex crystal.
(2) ALA103, ALA106, ASN107, VAL113, PHE114, LEU201, ASN204, ILE205, LEU208, LEU233, VAL237, VAL292, ASP293, LEU294, PHE295, GLY296, ALA297, GLY298, THR299, GLU300, THR301, LEU362 and LEU366 (1) The protein which forms an enzyme pocket by.
(3) A polynucleotide encoding the protein according to (1).
(4) An expression vector comprising the polynucleotide according to (3).
(5) A cell transformed with the expression vector according to (4).
(6) The protein crystal according to (1).
(7) A complex of the protein according to (1) and a non-peptidic organic compound that is metabolized by the Cytochrome P450 2C9 protein or inhibits the enzyme activity of the Cytochrome P450 2C9 protein.
(8) A crystal of the composite according to (7).
(9) The method comprises contacting the protein according to (1) with a non-peptide organic compound that is metabolized by the Cytochrome P450 2C9 protein or inhibits the enzyme activity of the Cytochrome P450 2C9 protein (7) ).
(10) i) a step of contacting the candidate compound with the protein according to (1), and ii) a step of measuring the degree of complex formation or interaction between the candidate compound and the protein according to (1) A method for evaluating the interaction of the candidate compound with the Cytochrome P450 2C9 protein, comprising:
(11) Structure coordinates described in
(12) A machine-readable medium storing the data of the structural coordinates described in (11).
(13) A hardware system including at least a central processing unit, an input device, an output device, and a data storage device, and access to and analysis of structural coordinate data, and search for candidate compounds using the obtained three-dimensional structure, A computer system comprising software capable of performing evaluation or design, storing the structure coordinate data of the complex crystal described in (8), and using a three-dimensional structure obtained from the coordinate data as a candidate A computer system programmed to search, evaluate or design compounds.
(14) The computer system according to (13), wherein the structure coordinate data of the composite crystal is the structure coordinate data described in the
(15) Using the computer system according to (13), a non-peptidic organic compound having a reduced degree of metabolism by Cytochrome P450 2C9 protein or a reduced degree of inhibiting the enzyme activity of Cytochrome P450 2C9 protein How to search, evaluate or design.
(16) Using the structure coordinate data of a complex crystal of the protein according to (1) and a non-peptidic organic compound that is metabolized by the Cytochrome P450 2C9 protein or inhibits the enzyme activity of the Cytochrome P450 2C9 protein, The degree of metabolism by the Cytochrome P450 2C9 protein is 1/10 or less of that of the non-peptidic organic compound, characterized by using a computer system programmed to search for, evaluate or design a chemically modified form of the non-peptidic organic compound. A method for screening a chemically modified product wherein the degree of inhibition of the enzyme activity of the Cytochrome P450 2C9 protein is reduced to 1/10 or less of the non-peptidic organic compound.
(17) The method further includes a step of synthesizing a chemical modification selected or designed by a computer system and measuring the degree of metabolism by the Cytochrome P450 2C9 protein or the degree of inhibition of the enzyme activity of the Cytochrome P450 2C9 protein (16). ) Screening method.
(18) A chemically modified product selected by the method according to (17).
(19)
(20) A method for screening a crystallizable Cytochrome P450 mutant, comprising a step of confirming homogeneity as a molecule of a soluble Cytochrome P450 mutant and a step of selecting a mutant having uniformity.
本発明のCYP2C9変異体蛋白質は、CYP2C9蛋白質により水酸化反応を受けることが知られる有機化合物(基質)と複合体を形成し、実際の酵素化学反応機構を表現する立体構造を有する複合体結晶を与える。よって、本発明の蛋白質、基質との複合体及びその複合体結晶は、代謝型CYP蛋白質の3次元立体構造、更には対象となる基質と代謝型CYP蛋白質の結合状態に関する3次元立体構造の研究を可能とするものであり、薬物との相互作用の解析、薬物間相互作用の解明、薬物間相互作用の回避を目的とする化合物修飾研究などに有用である。
また、当該複合体結晶の構造座標のデータが格納された機械読み取り可能な媒体、複合体の構造座標データから得られた三次元立体構造を用いて候補化合物の検索、評価若しくは設計を行うようプログラムされたことを特徴とするコンピューターシステム等も同様に有用である。更に、本発明のコンピューターシステムを用いた非ペプチド性有機化合物を検索、評価若しくは設計する方法、あるいはスクリーニング方法は、CYP阻害が回避された所望の有機化合物、あるいはCYP阻害活性の低減が望まれる有機化合物の化学修飾体を、効率的に入手することを可能とし、こうして得られた化学修飾体自体も薬物間相互作用が回避された薬剤として有用である。
また、結晶化可能な可溶性CYP変異体のスクリーニング方法は、3次元立体構造の研究に有用な変異体蛋白質を簡便に選択する方法として有用である。
The CYP2C9 mutant protein of the present invention forms a complex crystal with an organic compound (substrate) known to undergo hydroxylation reaction by the CYP2C9 protein, and has a three-dimensional structure expressing the actual enzyme chemical reaction mechanism. give. Therefore, the protein of the present invention, the complex with the substrate, and the complex crystal are the three-dimensional structure of the metabotropic CYP protein, and further the three-dimensional structure of the binding state between the target substrate and the metabotropic CYP protein. It is useful for analysis of drug interactions, elucidation of drug-drug interactions, compound modification studies for the purpose of avoiding drug-drug interactions, and the like.
Also, a program for searching, evaluating, or designing candidate compounds using a machine-readable medium storing structure coordinate data of the complex crystal and a three-dimensional structure obtained from the structure coordinate data of the complex A computer system or the like characterized by the above is also useful. Further, a method for searching, evaluating or designing a non-peptidic organic compound using the computer system of the present invention, or a screening method is a desired organic compound in which CYP inhibition is avoided, or an organic in which CYP inhibitory activity is desired to be reduced. The chemical modification of the compound can be efficiently obtained, and the chemical modification thus obtained is also useful as a drug in which the drug-drug interaction is avoided.
In addition, the screening method for crystallizable soluble CYP mutants is useful as a simple method for selecting mutant proteins useful for studying three-dimensional structures.
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、蛋白質は下記に示すIUPAC-IUB生化学命名委員会（CBN）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限りペプチド及び蛋白質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように、またＮ末端が１番になるように表される。
A又はALA：アラニン残基、D又はASP：アスパラギン酸残基、E又はGLU：グルタミン酸残基、F又はPHE：フェニルアラニン残基、G又はGLY：グリシン残基、H又はHIS：ヒスチジン残基、I又はILE：イソロイシン残基、K又はLYS：リジン残基、L又はLEU：ロイシン残基、M又はMET：メチオニン残基、N又はASN：アスパラギン残基、P又はPRO：プロリン残基、Q又はGLN：グルタミン残基、R又はARG：アルギニン残基、S又はSER：セリン残基、T又はTHR：スレオニン残基、V又はVAL：バリン残基、W又はTRP：トリプトファン残基、Y又はTYR：チロシン残基、C又はCYS：システイン残基を示す。
本明細書において、「非ペプチド性有機化合物」とは、ペプチドや抗体ではない有機化合物をいい、医薬品となりうる分子量500Da以下の低分子化合物や酵素の基質・阻害剤等が含まれる。
本明細書において、「CYP蛋白質」とは、Cytochrome P450蛋白質の総称である。Cytochrome P450蛋白質は、アミノ酸配列の類似度を基準として分類され、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4等の表記として、ファミリー番号、サブファミリー記号、遺伝子番号の順に記載され区別される。本明細書においては、CYP蛋白質とは、Cytochrome P450蛋白質であるCYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4等の蛋白質並びにそれらの変異体を含むことを意味する。「薬物代謝型CYP蛋白質」とは、ヒト肝臓由来のCYP蛋白質であって主に薬物代謝にかかわるCYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4などを指す。また「可溶性CYP変異体」とは、膜貫通部位を一部または全て削除したCYP蛋白質で生理的条件下で水溶性蛋白質として扱える状態である蛋白質を意味する。この膜貫通部位の削除の領域によって蛋白質の溶解度などの諸物性が変化する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present specification, amino acids, peptides, and proteins are represented using abbreviations adopted by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Committee (CBN) shown below. Unless otherwise specified, the amino acid residue sequences of peptides and proteins are expressed from the N-terminal to the C-terminal from the left end to the right end and so that the N-terminal is
A or ALA: alanine residue, D or ASP: aspartic acid residue, E or GLU: glutamic acid residue, F or PHE: phenylalanine residue, G or GLY: glycine residue, H or HIS: histidine residue, I Or ILE: isoleucine residue, K or LYS: lysine residue, L or LEU: leucine residue, M or MET: methionine residue, N or ASN: asparagine residue, P or PRO: proline residue, Q or GLN : Glutamine residue, R or ARG: Arginine residue, S or SER: Serine residue, T or THR: Threonine residue, V or VAL: Valine residue, W or TRP: Tryptophan residue, Y or TYR: Tyrosine Residue, C or CYS: indicates a cysteine residue.
In the present specification, the “non-peptidic organic compound” means an organic compound that is not a peptide or an antibody, and includes a low molecular compound having a molecular weight of 500 Da or less, an enzyme substrate / inhibitor, and the like that can be used as a medicine.
In this specification, “CYP protein” is a general term for Cytochrome P450 protein. Cytochrome P450 proteins are classified based on the similarity of amino acid sequences, and are described and distinguished in the order of family number, subfamily symbol, and gene number as CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, etc. In the present specification, the CYP protein is meant to include proteins such as CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, and CYP3A4, which are Cytochrome P450 proteins, and mutants thereof. “Drug metabolizing CYP protein” refers to CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, etc., which are CYP proteins derived from human liver and mainly involved in drug metabolism. The “soluble CYP mutant” means a protein that is a CYP protein from which a transmembrane site has been partially or entirely deleted and that can be treated as a water-soluble protein under physiological conditions. Various physical properties such as protein solubility vary depending on the region where the transmembrane site is deleted.
本明細書における「CYP変異体」とは、可溶性CYP変異体であって、更に、1又は2個以上のアミノ酸を野生型から異なるアミノ酸に置換し、一部配列が欠損及び/若しくは挿入されていてもよい変異体を意味する。
「酵素ポケット」とはCYP2C9蛋白質が薬物代謝反応を行うために反応基質を取り込む空間、具体的には酵素化学反応に関与するヘム鉄近傍を意味する。本発明蛋白質において、ワルファリンとの複合体においては、ALA103、ALA106、ASN107、VAL113、PHE114、LYS200、LEU201、ASN202、GLU203、ASN204、ILE205、LEU208、LEU233、ASN236、VAL237、MET240、ASN289、VAL292、ASP293、LEU294、PHE295、GLY296、ALA297、GLY298、THR299、GLU300、THR301、LEU362、SER365およびLEU366のアミノ酸で特定される部位がワルファリンとの結合部位であり、また、トルブタミドとの複合体においては、LEU102、ALA103、GLU104、ARG105、ALA106、ASN107、VAL113、PHE114、LEU201、ASN204、ILE205、LEU208、LEU233、VAL237、VAL292、ASP293、LEU294、PHE295、GLY296、ALA297、GLY298、THR299、GLU300、THR301、THR302、LEU362及びLEU366のアミノ酸で特定される部位がトルブタミドとの結合部位である。本発明蛋白質の酵素ポケットとしては、好ましくは、両複合体で共通する部位である、ALA103、ALA106、ASN107、VAL113、PHE114、LEU201、ASN204、ILE205、LEU208、LEU233、VAL237、VAL292、ASP293、LEU294、PHE295、GLY296、ALA297、GLY298、THR299、GLU300、THR301、LEU362及びLEU366のアミノ酸で特定される領域である。
As used herein, the term “CYP variant” refers to a soluble CYP variant, in which one or more amino acids are further replaced with different amino acids from the wild type, and a partial sequence is deleted and / or inserted. It means a variant that may be.
“Enzyme pocket” means a space in which a CYP2C9 protein takes in a reaction substrate to perform a drug metabolism reaction, specifically, the vicinity of heme iron involved in an enzyme chemical reaction. In the protein of the present invention, in the complex with warfarin, ALA103, ALA106, ASN107, VAL113, PHE114, LYS200, LEU201, ASN202, GLU203, ASN204, ILE205, LEU208, LEU233, ASN236, VAL237, MET240, ASN289, VAL292, ASP293 , LEU294, PHE295, GLY296, ALA297, GLY298, THR299, GLU300, THR301, LEU362, SER365 and the site specified by LEU366 are the binding sites for warfarin, and in the complex with tolbutamide, LEU102, ALA103, GLU104, ARG105, ALA106, ASN107, VAL113, PHE114, LEU201, ASN204, ILE205, LEU208, LEU233, VAL237, VAL292, ASP293, LEU294, PHE295, GLY296, ALA297, GLY298, THR299, GLU300, THR301, THR302, LEU362 and The site specified by the amino acid of LEU366 is a binding site with tolbutamide. The enzyme pocket of the protein of the present invention is preferably a site common to both complexes, ALA103, ALA106, ASN107, VAL113, PHE114, LEU201, ASN204, ILE205, LEU208, LEU233, VAL237, VAL292, ASP293, LEU294, It is a region specified by amino acids of PHE295, GLY296, ALA297, GLY298, THR299, GLU300, THR301, LEU362 and LEU366.
本発明の蛋白質は、薬物代謝型CYP蛋白質による代謝反応の解析に有用な、新規なCYP2C9変異体蛋白質である。具体的には、野生型CYP2C9蛋白質の膜貫通部位の一部を削除し可溶性蛋白質とし、かつ酵素ポケットの形状を変えることなくX線結晶構造解析に供するための結晶化に適した蛋白質、即ち、分子表面に存在すると予想される部位のアミノ酸を他のアミノ酸へ変換し、その凝集を押さえた蛋白質である。即ち、（１）配列番号62で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、あるいは、（２）配列番号62で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、あるいは、（２）配列番号62で表されるアミノ酸配列、または配列番号62で表されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ大腸菌で発現させたときに、Cytochrome P450 2C9蛋白質により代謝される非ペプチド性有機化合物が酵素化学反応が起こる位置に結合した複合体結晶を、少なくとも１つ形成する蛋白質である。好ましくは、配列番号62で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。
ここに、「配列番号62で表されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列」としては、本発明蛋白質の立体構造に影響の少ない任意のアミノ酸1〜10個、好ましくは１〜5個、より好ましくは１〜3個が欠失、置換、及び/若しくは挿入した配列であり、例えば、2C9以外のCytochrome P450蛋白質の対応する位置のアミノ酸と置換された配列が挙げられる。ここに、「2C9以外のCytochrome P450蛋白質」としては、薬物代謝型P450が挙げられ、CYP2C19、CYP2D6、CYP1A2およびCYP3A4が好ましい。
「酵素化学反応が起こる位置に結合した複合体結晶」とは、本発明の蛋白質のヘム鉄から5Å以下、好ましくは4.5Å以下の距離に、代謝される非ペプチド性有機化合物の水酸化される分子が存在することで、化合物が本発明の蛋白質に水酸化反応可能な位置に結合している状態である複合体結晶をいう。
本発明の複合体結晶としては、好ましくは、ａ=ｂ=16.5±0.3nm、ｃ=11.1±0.3nm、α=β=90°、γ=120°の単位格子定数およびP321の空間群を有する三方晶形結晶が、より好ましくは、ａ=ｂ=16.5±0.1nm、ｃ=11.1±0.1nm、α=β=90°、γ=120°の単位格子定数およびP321の空間群を有する三方晶形結晶である。
The protein of the present invention is a novel CYP2C9 mutant protein that is useful for analysis of metabolic reactions caused by drug-metabolized CYP proteins. Specifically, a part of the transmembrane site of the wild-type CYP2C9 protein is deleted to form a soluble protein, and a protein suitable for crystallization for use in X-ray crystal structure analysis without changing the shape of the enzyme pocket, It is a protein that suppresses the aggregation by converting the amino acid at the site expected to exist on the surface of the molecule to other amino acid. That is, (1) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62, or (2) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62, or (2) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62 Or an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, and / or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62, and are metabolized by Cytochrome P450 2C9 protein when expressed in E. coli. It is a protein that forms at least one complex crystal in which a non-peptidic organic compound is bound at a position where an enzymatic chemical reaction occurs. A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62 is preferred.
Here, the “amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, and / or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62” is any arbitrary one that has little influence on the three-dimensional structure of the protein of the present invention. A sequence in which 1 to 10 amino acids, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 are deleted, substituted, and / or inserted, for example, an amino acid at a corresponding position of a Cytochrome P450 protein other than 2C9 Examples include substituted sequences. Here, examples of the “Cytochrome P450 protein other than 2C9” include drug-metabolized P450, and CYP2C19, CYP2D6, CYP1A2, and CYP3A4 are preferable.
The “complex crystal bound at the position where the enzyme chemical reaction occurs” means that the metabolized non-peptidic organic compound is hydroxylated at a distance of 5 mm or less, preferably 4.5 mm or less from the heme iron of the protein of the present invention. The compound crystal | crystallization which is in the state which has couple | bonded with the position which can be hydroxylated with the protein of this invention by the presence of a molecule | numerator.
The composite crystal of the present invention preferably has a unit cell constant of a = b = 16.5 ± 0.3 nm, c = 11.1 ± 0.3 nm, α = β = 90 °, γ = 120 ° and a space group of P321. Trigonal crystals more preferably have a unit cell constant of a = b = 16.5 ± 0.1 nm, c = 11.1 ± 0.1 nm, α = β = 90 °, γ = 120 °, and a space group of P321. It is.
本発明蛋白質の好ましい態様を以下に示す。
（１）酵素化学反応に関与するヘム鉄近傍の酵素ポケットに該当する配列である、ALA103、ALA106、ASN107、VAL113、PHE114、LEU201、ASN204、ILE205、LEU208、LEU233、VAL237、VAL292、ASP293、LEU294、PHE295、GLY296、ALA297、GLY298、THR299、GLU300、THR301、LEU362及びLEU366のアミノ酸配列を有する蛋白質。
（２）配列番号62に示されるアミノ酸配列の数個のアミノ酸が、2C9以外のCytochrome P450蛋白質の対応する位置のアミノ酸と置換された配列を有する蛋白質であり、当該置換された配列が、i)前記（１）に記載するCYP2C9蛋白質の酵素ポケットに該当するアミノ酸配列並びにii)野生型から変異させたアミノ酸配列のいずれにも該当しない配列から選択されるアミノ酸配列である蛋白質。
Preferred embodiments of the protein of the present invention are shown below.
(1) ALA103, ALA106, ASN107, VAL113, PHE114, LEU201, ASN204, ILE205, LEU208, LEU233, VAL237, VAL292, ASP293, LEU294, sequences corresponding to the enzyme pocket near heme iron involved in enzymatic chemistry A protein having an amino acid sequence of PHE295, GLY296, ALA297, GLY298, THR299, GLU300, THR301, LEU362 and LEU366.
(2) A protein having a sequence in which several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62 are substituted with amino acids at corresponding positions of Cytochrome P450 protein other than 2C9, and the substituted sequence is i) A protein having an amino acid sequence selected from a sequence not corresponding to any of the amino acid sequence corresponding to the enzyme pocket of the CYP2C9 protein described in (1) above and ii) the amino acid sequence mutated from the wild type.
本発明者等は、本発明蛋白質と、CYP2C9により水酸化反応を受けることが広く知られているワルファリン、トルブタミドとの複合体結晶を作成し、その構造解析を試みた。
本発明の配列番号62で示される蛋白質の結晶は、三方晶形結晶でP321の空間群で表現される結晶である。先行技術（非特許文献３）に開示されるCYP2C9とワルファリンの複合体の結晶では、ワルファリンの水酸化される部位がCYP2C9のヘム鉄から約10Å以上離れており水酸化反応が可能な位置に結合しておらず、現実の化学反応を反映した構造となっていないと思われる。これに対し、本発明の複合体結晶は、酵素化学反応が起こると予想されるヘム鉄近傍（約4Å）に、ワルファリンの水酸化される部位がヘム鉄に向くように結合している。同様に水酸化反応を受けるトルブタミドについても、水酸化される部位が本発明CYP2C9変異体のヘム鉄から約3.5Åと水酸化反応が可能な位置に結合していた。即ち、本発明変異体蛋白質並びにその結晶は、実際の酵素化学反応機構を表現するCYP2C9蛋白質の立体構造を保持する蛋白質並びにその結晶であることが確認された。
The present inventors made complex crystals of the protein of the present invention and warfarin and tolbutamide, which are widely known to undergo hydroxylation reaction by CYP2C9, and tried to analyze the structure.
The protein crystal represented by SEQ ID NO: 62 of the present invention is a crystal represented by the P321 space group as a trigonal crystal. In the CYP2C9-warfarin complex crystal disclosed in the prior art (Non-patent Document 3), the hydroxylated site of warfarin is separated from the heme iron of CYP2C9 by about 10 mm or more and binds to a position where hydroxylation is possible. The structure does not reflect the actual chemical reaction. In contrast, the complex crystal of the present invention is bound in the vicinity of heme iron (about 4 mm) where an enzymatic chemical reaction is expected to occur so that the hydroxylated site of warfarin faces heme iron. Similarly, with respect to tolbutamide that undergoes a hydroxylation reaction, the hydroxylated site was bound to a position where the hydroxylation reaction was possible at about 3.5 mm from the heme iron of the CYP2C9 mutant of the present invention. That is, it was confirmed that the mutant protein of the present invention and its crystal are a protein that retains the three-dimensional structure of the CYP2C9 protein that expresses the actual enzyme chemical reaction mechanism and its crystal.
本発明において、「Cytochrome P450 2C9蛋白質により代謝される若しくはCytochrome P450 2C9蛋白質の酵素活性を阻害する非ペプチド性有機化合物」としては、CYP2C9蛋白質で代謝される非ペプチド性の有機化合物（基質）、若しくは、CYP2C9蛋白質による酵素活性を阻害する非ペプチド性の有機化合物（阻害剤）である。既知の基質としては、ジクロフェナック(diclofenac)、イブプロフェン（ibuprofen）、メロキシカム（meloxicam）、ピロキシカム（piroxicam）、スプロフェン（suprofen）、グリピジド（glipizide）、トルブタミド（tolbutamide）、ロサルタン（losartan）、イルベサルタン（irbesartan）、アミトリプチリン（amitriptyline）、セレコキシブ（celecoxib）、フルオキセチン（fluoxetine）、フェニトイン（phenytoin）、タモキシフェン（tamoxifen）、トルセミド（torsemide）、ワルファリン（S-warfarin）などが挙げられ、既知の阻害剤としてはアミオダロン（amiodarone）、フルコナゾール（fluconazole）、フルバスタチン（fluvastatin）、フルボキサミン（fluvoxamine）、イソニアジド（isoniazid）、ロバスタチン（lovastatin）、パロキセチン（paroxetine）、フェニルブタゾン（phenylbutazone）、プロベニシド（probenicid）、セルトラリン（sertraline）、サルファメトキサゾール（sulfamethoxazole）、サルファフェナゾール（sulfaphenazole）、テニポシド（teniposide）、トリメトプリム（trimethoprim）、ザフィルルカスト（zafirlukast）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。より好ましくはワルファリン及びトルブタミドである。 In the present invention, the “non-peptide organic compound that is metabolized by the Cytochrome P450 2C9 protein or inhibits the enzyme activity of the Cytochrome P450 2C9 protein” is a non-peptide organic compound (substrate) that is metabolized by the CYP2C9 protein, or , A non-peptidic organic compound (inhibitor) that inhibits the enzyme activity of CYP2C9 protein. Known substrates include diclofenac, ibuprofen, meloxicam, piroxicam, suprofen, glipizide, tolbutamide, losartan, irbesartan (irbesartan) Amitriptyline, celecoxib, fluoxetine, phenytoin, tamoxifen, torsemide, warfarin (S-warfarin), and other known inhibitors are amiodarone ( amiodarone), fluconazole, fluvastatin, fluvoxamine, isoniazid, lovastatin, paroxetine, phenylbutazone, pro These include, but are not limited to, probeidid, sertraline, sulfamethoxazole, sulfaphenazole, teniposide, trimethoprim, zafirlukast, etc. It is not a thing. More preferred are warfarin and tolbutamide.
本発明の「i)候補化合物を、（１）に記載の蛋白質と接触させる工程、並びにii)当該候補化合物と（１）に記載の蛋白質の複合体形成の程度もしくは相互作用の程度を測定する工程を含むことを特徴とする、当該候補化合物のCytochrome P450 2C9蛋白質との相互作用の評価方法」において、複合体形成の程度の測定は、複合体結晶を作成してX線結晶解析を行うことにより、また、相互作用の程度の測定は、結晶を作成しなくとも溶液状態においてNMRなどを用いてその相互作用を確認することにより行うことができる。当該方法によって、CYP蛋白質を阻害しにくい又は阻害しやすい候補化合物およびCYP蛋白質の代謝を受けにくい又は受けやすい候補化合物をスクリーニングすることができる。 “I) a step of contacting the candidate compound with the protein described in (1) of the present invention; and ii) measuring the degree of complex formation or interaction between the candidate compound and the protein described in (1). In the method for evaluating the interaction of the candidate compound with the Cytochrome P450 2C9 protein, characterized in that it comprises a step, the measurement of the degree of complex formation involves preparing a complex crystal and performing X-ray crystallography. In addition, the degree of interaction can be measured by confirming the interaction using NMR or the like in a solution state without preparing a crystal. By this method, it is possible to screen candidate compounds that are difficult or susceptible to inhibition of CYP protein and candidate compounds that are difficult or susceptible to metabolism of CYP protein.
本発明において、「構造座標データが格納された、機械読み取り可能な媒体」としては、コンピューターが直接アクセスすることが可能な媒体であり、好ましくは、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープのような磁気記憶媒体、光学ディスク、CD-ROMのような光学的記憶媒体、RAMやROMのような電気的記憶媒体、さらに光磁気記憶媒体のようなそれらを組み合わせた媒体である。 In the present invention, the “machine-readable medium storing structural coordinate data” is a medium that can be directly accessed by a computer, preferably a magnetic storage medium such as a flexible disk, a hard disk, or a magnetic tape. An optical storage medium such as an optical disk or a CD-ROM, an electrical storage medium such as a RAM or a ROM, and a combination medium such as a magneto-optical storage medium.
また、「複合体結晶の構造座標データを格納し、当該座標データから得られた三次元立体構造を用いて候補化合物の検索、評価若しくは設計を行うようプログラムされたことを特徴とするコンピューターシステム」において、当該コンピュータシステムは、座標データを格納することができ、かつ、その座標データを用いて本発明蛋白質と候補化合物の三次元立体構造における相互作用の程度を計算することができる機能を有するシステムである。システムを構成するハードウェアの構成に制限は無いが、本発明コンピューターシステムは、少なくとも、中央演算処理装置、入力装置、出力装置、データ記憶装置を含み、望ましくは立体構造を可視化するためのモニターが含まれる。入力装置、出力装置及び/又はデータ記憶装置は複数の機能を有する１つの装置であってもよい。このようなハードシステムの代表的なものとしては、Silicon Graphics Incorporated社やIBM社から提供されており、Unix（登録商標）あるいはWindows（登録商標） NTを基礎としたオペレーティングシステムを実行するマイクロコンピューターワークステーションが代表的である。また、ソフトウェアとしては、構造座標データにアクセスして解析し、得られた三次元立体構造を用いて候補化合物の検索、評価若しくは設計を行なうことができるソフトウェアであり、例えば、InsightII（Accelrys Inc.）が挙げられる。これらのハードウェア並びにソフトウェアから構成されるシステムに本発明構造座標データを保持させることにより、本発明コンピュータシステムを得ることができる。 In addition, “a computer system that is programmed to store structure coordinate data of a complex crystal and to search, evaluate, or design a candidate compound using a three-dimensional structure obtained from the coordinate data” The computer system is capable of storing coordinate data and having a function capable of calculating the degree of interaction in the three-dimensional structure of the protein of the present invention and the candidate compound using the coordinate data. It is. Although there is no limitation on the hardware configuration that constitutes the system, the computer system of the present invention includes at least a central processing unit, an input device, an output device, and a data storage device, and preferably a monitor for visualizing a three-dimensional structure. included. The input device, the output device and / or the data storage device may be a single device having a plurality of functions. A typical example of such a hard system is a microcomputer work that is provided by Silicon Graphics Incorporated or IBM and that runs an operating system based on Unix (registered trademark) or Windows (registered trademark) NT. Stations are typical. The software is software that can access and analyze structural coordinate data, and can search, evaluate, or design candidate compounds using the obtained three-dimensional structure. For example, InsightII (Accelrys Inc. ). The computer system of the present invention can be obtained by holding the structural coordinate data of the present invention in a system constituted by these hardware and software.
本発明は、前期コンピューターシステムを用いて、CYP2C9蛋白質による代謝の程度が低減された、若しくはCYP2C9蛋白質の酵素活性を阻害する程度が低減された化学修飾体をスクリーニングする方法にも関する。ここに、「代謝の程度が低減された」とは、化学修飾体がCYP2C9により代謝される程度が、そのリード化合物の1/10、好ましくは1/100、より好ましくは1/1000以下に低減された、すなわち代謝を受けにくい状態となったことを意味する。また、「CYP2C9蛋白質の酵素活性を阻害する程度が低減された」とは、リード化合物が存在する場合は、CYP2C9阻害活性がリード化合物に比して1/10、好ましくは1/100、より好ましくは1/1000以下に低減された状態を意味する。リード化合物が存在しない場合は、当該化学修飾体が目的とする薬理作用を発現する有効薬物濃度に比して、CYP2C9蛋白質の酵素活性を50％阻害する濃度が100倍、好ましくは1,000倍、より好ましくは10,000倍以上高い濃度であることを意味する。
上記構造座標、媒体、コンピューターシステムを用いた薬物間相互作用の低減された目的化合物のスクリーニング方法の好ましい一態様を以下に示す。
目的とする薬理作用を有するがCYP阻害作用を有するリード化合物の場合、
（１）本発明複合体結晶の構造座標のデータ、あるいはこれを格納した媒体から読み出したデータを、既存のコンピューターシステムを用いて、立体構造を認識できる状態にし、リード化合物のCYP蛋白質との相互作用に重要な部位および代謝を受ける部位を推定或いは計算し、
（２）推定、或いは計算された部位について、化学合成可能であり、かつリード化合物の薬物としての主活性に影響を及ぼさない構造に変換した候補化合物を推定或いは既存の分子設計システムを用いて設計するか、又は本発明コンピューターシステムにより複合体形成能の低い候補化合物を設計し、
（３）当該候補化合物を実際に合成し、次いで
（４）前記本発明評価方法あるいは当業者に既知のCYP阻害活性測定法を用いて、合成された候補化合物から複合体形成能の低い、言い換えればCYP阻害作用の低い化合物を選択することができる。
The present invention also relates to a method of screening for a chemical modification in which the degree of metabolism by the CYP2C9 protein is reduced or the degree of inhibition of the enzyme activity of the CYP2C9 protein is reduced by using a computer system in the previous period. Here, “the degree of metabolism has been reduced” means that the degree to which the chemically modified compound is metabolized by CYP2C9 is reduced to 1/10, preferably 1/100, more preferably 1/1000 or less of the lead compound. That is, it is difficult to be metabolized. In addition, “the degree to which the enzyme activity of CYP2C9 protein is inhibited is reduced” means that when a lead compound is present, CYP2C9 inhibitory activity is 1/10, preferably 1/100, more preferably compared to the lead compound. Means a state reduced to 1/1000 or less. In the absence of the lead compound, the concentration of the CYP2C9 protein inhibiting 50% of the enzyme activity of the CYP2C9 protein is 100 times, preferably 1,000 times, compared to the effective drug concentration at which the chemical modified substance exhibits the desired pharmacological action. It means that the concentration is preferably 10,000 times higher.
A preferred embodiment of a screening method for a target compound with reduced interaction between drugs using the structural coordinates, medium, and computer system is shown below.
In the case of a lead compound having the desired pharmacological action but CYP inhibitory action,
(1) The structure coordinate data of the complex crystal of the present invention or the data read from the medium storing it is made into a state in which the three-dimensional structure can be recognized using an existing computer system, and the mutual relationship with the CYP protein of the lead compound Estimate or calculate sites important for action and undergo metabolism;
(2) Estimating or calculating a candidate compound converted into a structure that can be chemically synthesized and does not affect the main activity of the lead compound as a drug for the estimated or calculated site, or designed using an existing molecular design system Or by designing a candidate compound having a low complex-forming ability with the computer system of the present invention,
(3) actually synthesizing the candidate compound, and then (4) using the above-described evaluation method of the present invention or the CYP inhibitory activity measurement method known to those skilled in the art, the complex formation ability is low from the synthesized candidate compound. For example, a compound having a low CYP inhibitory action can be selected.
また、別の態様としてトルブタミドがリード化合物の場合を以下に示す。
（１）本発明の構造座標１より得られた構造図より、トルブタミドはCYP2C9によりベンゼン環上のメチル基が水酸化されるが、複合体結晶構造においてトルブタミドのベンゼン環は2C9中の疎水性残基と相互作用をし、メチル基はヘム鉄の方向を向いて結合していることが判る。よって、このメチルベンゼンがCYP蛋白質のヘム鉄近傍を好む官能基として捉えることができる。
（２）このメチルベンゼンとほぼ同じ大きさの他の官能基を、経験的に選択するか、既存の分子設計システムを用いて選択する、又は本発明コンピューターシステムにより複合体形成能の低い置換基を有する化合物を設計する。
（３）上記候補化合物を実際に合成する。合成はコンビナトリアル合成でも可能である。
（４）前記本発明評価方法あるいは当業者に既知のCYP阻害活性測定法を用いて、CYP阻害活性が低減されたトルブタミドの化学修飾体を選択する。
以上の様に、本発明の構造座標、媒体、コンピューターシステムは、CYP阻害作用の回避或いはCYPによる代謝を回避するための化学修飾研究に有用である。
また、上記の研究にて見出された、CYP蛋白質との相互作用が弱い官能基を、CYP阻害回避または代謝回避可能なフラグメントとして、他のリード化合物に関する分子設計に応用することもできる。
Moreover, the case where tolbutamide is a lead compound as another aspect is shown below.
(1) From the structural diagram obtained from the structural coordinate 1 of the present invention, tolbutamide is hydroxylated by methyl group on the benzene ring by CYP2C9, but the benzene ring of tolbutamide is a hydrophobic residue in 2C9 in the complex crystal structure. It can be seen that the methyl group is bonded in the direction of heme iron. Therefore, this methylbenzene can be understood as a functional group that favors the vicinity of heme iron in the CYP protein.
(2) Another functional group having the same size as that of methylbenzene is selected empirically, using an existing molecular design system, or a substituent having a low ability to form a complex by the computer system of the present invention. A compound having
(3) The candidate compound is actually synthesized. The synthesis can also be performed by combinatorial synthesis.
(4) Using the evaluation method of the present invention or a CYP inhibitory activity measurement method known to those skilled in the art, a chemically modified form of tolbutamide with reduced CYP inhibitory activity is selected.
As described above, the structural coordinates, medium, and computer system of the present invention are useful for chemical modification studies for avoiding CYP inhibitory action or avoiding metabolism by CYP.
In addition, the functional group found in the above research and having a weak interaction with the CYP protein can be applied to molecular design for other lead compounds as a fragment capable of avoiding CYP inhibition or metabolism.
本発明は、特定の非ペプチド性有機化合物と本発明蛋白との複合体結晶の構造座標データを使用した本発明のコンピュータシステムによって選択若しくは設計された化学修飾体を合成し、そのCytochrome P450 2C9蛋白質による代謝の程度若しくはCytochrome P450 2C9蛋白質の酵素活性を阻害する程度を測定することによって選択された、Cytochrome P450 2C9蛋白質による代謝の程度がリード化合物の1/10以下、好ましくは1/100以下に低減された、若しくはCytochrome P450 2C9蛋白質の酵素活性を阻害する程度がリード化合物の1/10以下、好ましくは1/100以下に低減された化学修飾体自体にも関する。
当該非ペプチド性有機化合物としては、CYP2C9蛋白質により代謝される化合物もしくはCYP2C9蛋白質の酵素活性を阻害する特定のリード化合物であり、好ましくは前記の既知の基質並びに既知の阻害剤から選択される化合物であり、より好ましくはワルファリン及びトルブタミドである。当該特定の非ペプチド性有機化合物と本発明蛋白質の複合体を形成させ、その構造座標データを用いて本発明のスクリーニング方法を実施することによって、CYP2C9蛋白質との相互作用が低減された当該化合物の化学修飾体を容易に見出すことができる。よって、本発明の化学修飾体は、そのリード化合物である特定の非ペプチド性有機化合物の薬理活性をほぼ引き継ぎつつ、CYP2C9阻害が回避された化合物である。
The present invention synthesizes a chemical modification selected or designed by the computer system of the present invention using the structural coordinate data of a complex crystal of a specific non-peptide organic compound and the protein of the present invention, and the Cytochrome P450 2C9 protein. The degree of metabolism by Cytochrome P450 2C9 protein, selected by measuring the degree of metabolism by Cytochrome P450 2C9 protein or by inhibiting the enzyme activity of Cytochrome P450 2C9 protein, is reduced to 1/10 or less, preferably 1/100 or less of the lead compound The present invention also relates to a chemical modification itself that has been reduced or has a degree of inhibiting the enzyme activity of Cytochrome P450 2C9 protein reduced to 1/10 or less, preferably 1/100 or less of the lead compound.
The non-peptidic organic compound is a compound metabolized by the CYP2C9 protein or a specific lead compound that inhibits the enzyme activity of the CYP2C9 protein, preferably a compound selected from the aforementioned known substrates and known inhibitors. More preferred are warfarin and tolbutamide. By forming a complex of the specific non-peptidic organic compound and the protein of the present invention, and carrying out the screening method of the present invention using the structural coordinate data, the compound of which the interaction with the CYP2C9 protein is reduced Chemical modifications can be easily found. Therefore, the chemically modified compound of the present invention is a compound in which CYP2C9 inhibition is avoided while almost inheriting the pharmacological activity of the specific non-peptidic organic compound that is the lead compound.
前記のように、トルブタミドがリード化合物の場合、本発明コンピューターシステムを用いて、トルブタミドとの複合体の構造座標データから、そのメチルベンゼンをCYP蛋白質のヘム鉄近傍を好む官能基として捉え、この基とほぼ同じ大きさの他の官能基を選択し、複合体形成能の低い置換基を有する化合物を設計することは容易にできる。その後の化学修飾体の合成、評価は当業者に公知の方法で容易に行うことができる。具体的には、リード化合物に特定の置換基を導入して所望の化学修飾体を合成する方法としては、例えば日本化学会編「実験化学講座」第4版(丸善)に記載の方法を用いることができる。 As described above, when tolbutamide is a lead compound, using the computer system of the present invention, from the structural coordinate data of the complex with tolbutamide, the methylbenzene is regarded as a functional group that favors the vicinity of heme iron of the CYP protein. It is easy to design a compound having a substituent having a low ability to form a complex by selecting other functional groups having the same size as the above. Subsequent synthesis and evaluation of chemically modified products can be easily performed by methods known to those skilled in the art. Specifically, as a method for synthesizing a desired chemical modification by introducing a specific substituent into a lead compound, for example, the method described in the 4th edition (Maruzen) edited by The Chemical Society of Japan is used. be able to.
また、本発明者らは、多数の変異体から結晶化に適する変異体を効率的に選択する方法、即ち、可溶化CYP変異体の、分子としての均一性を確認することを特長とする結晶化可能な可溶化蛋白質のスクリーニング方法を見出した。これは、物理化学的手法により分子としての均一性が確認できた変異体は、凝集が無く容易に結晶化可能であるという、本発明者等が見出した知見に基づく結晶化可能な変異体の選択方法である。 The present inventors also provide a method for efficiently selecting a mutant suitable for crystallization from a large number of mutants, that is, a crystal characterized by confirming the homogeneity of the solubilized CYP mutant as a molecule. A screening method for solubilized solubilized proteins was found. This is because the mutant that has been confirmed to be uniform as a molecule by a physicochemical method can be easily crystallized without aggregation, and is a crystallizable mutant based on the knowledge found by the present inventors. It is a selection method.
均一性の確認は、ゲルろ過やDLS（Dynamic Light Scattering）など物理化学的手法により、蛋白質をその大きさで分離した場合に、ある一定の大きさの蛋白質が1種類しか検出されないことを確認することにより行う。具体的には例えばゲルろ過の溶出パターンにおいて単一のピークが検出された場合に、均一性が確認されたということができる。均一性が確認された変異体は凝集が無く、当業者に常用される方法により容易に結晶化する。実際、実施例に示す様に、ゲルろ過の溶出パターンにおいて均一性を有することが確認された配列番号38, 46, 54および62で示す４つのCYP2C9変異体蛋白質は、容易に結晶化した。一方、ゲルろ過の溶出パターンにおいて複数のピークを有する変異体は結晶化しなかった。 For confirmation of homogeneity, confirm that only one type of protein of a certain size is detected when the protein is separated by its size using gel filtration or DLS (Dynamic Light Scattering). By doing. Specifically, for example, when a single peak is detected in the elution pattern of gel filtration, it can be said that the uniformity is confirmed. Mutants with confirmed homogeneity do not aggregate and are easily crystallized by methods commonly used by those skilled in the art. In fact, as shown in the Examples, the four CYP2C9 mutant proteins shown in SEQ ID NOs: 38, 46, 54 and 62, which were confirmed to have uniformity in the elution pattern of gel filtration, were easily crystallized. On the other hand, the mutant having a plurality of peaks in the elution pattern of gel filtration did not crystallize.
当該方法は、すべての変異体について結晶化を試みることなく、ゲルろ過等の簡便な物理化学的手法を用いて、多数の変異体から結晶化に適した変異体を効率的に選択することを可能とするものである。
更に、当該知見は同様に他の可溶化CYP蛋白質においても結晶化可能な変異体を選択する方法として有用である。よって、本発明は、可溶性CYP変異体の溶液中での分子としての均一性を確認することを特長とする、結晶化可能な可溶化蛋白質の選択方法、好ましくは、可溶化されたCYP2C9変異体であるスクリーニング方法を包含する。ここに、分子としての均一性を確認する方法としては、上記に例示したゲルろ過やDLSなど当業者に知られる均一性を確認可能な物理化学的手法が包含される。
The method involves efficiently selecting a mutant suitable for crystallization from a large number of mutants using a simple physicochemical technique such as gel filtration without attempting to crystallize all mutants. It is possible.
Furthermore, this finding is also useful as a method for selecting mutants that can be crystallized in other solubilized CYP proteins. Therefore, the present invention provides a method for selecting a crystallizable solubilized protein, preferably a solubilized CYP2C9 mutant, characterized by confirming the homogeneity of the soluble CYP mutant as a molecule in a solution. A screening method is included. Here, the method for confirming the homogeneity as a molecule includes a physicochemical method capable of confirming homogeneity known to those skilled in the art, such as gel filtration and DLS exemplified above.
本発明の蛋白質並びに結晶の製造法を以下に示す。
（１）変異体蛋白質をコードするポリヌクレオチド
CYP遺伝子は、ヒト肝cDNAライブラリーなどから適当なプライマーを用いてPCRを行う事により比較的容易にクローニングできる。あるいは、合成ポリヌクレオチドを連結する事でも作成できる。大腸菌での発現を想定して作成するには、その発現量を最大化する目的で大腸菌での発現蛋白質のコドン使用頻度を考慮に入れて合成ポリヌクレオチドを設計する事が合理的である。一部がアニールできるようプラス鎖とマイナス鎖を設計し遺伝子を全合成し、5'末端をリン酸化した当該オリゴマーをアニール後、ギャプをDNAポリメレースで１本鎖部分を埋め T4 DNA Ligaseを用いて連結させ遺伝子を作成することも可能である。変異体遺伝子は、前記のようにして得られたCYP遺伝子から、変異導入ポリヌクレオチドを用いてPCRを行う方法または市販の変異体作成キットを使用して容易に作成できる。具体的な実施態様として、例えば実施例1(1)に記載の方法により実施できる。
The method for producing the protein and crystal of the present invention is shown below.
(1) Polynucleotide encoding mutant protein
The CYP gene can be cloned relatively easily from a human liver cDNA library by PCR using appropriate primers. Alternatively, it can also be created by linking synthetic polynucleotides. In order to prepare the expression assuming the expression in E. coli, it is reasonable to design a synthetic polynucleotide taking into account the codon usage of the expressed protein in E. coli in order to maximize the expression level. Design the plus and minus strands so that a part of them can be annealed, fully synthesize the gene, anneal the oligomer phosphorylated at the 5 'end, fill the single strand with DNA polymerase, and use T4 DNA Ligase It is also possible to create genes by ligation. A mutant gene can be easily prepared from the CYP gene obtained as described above using a method of performing PCR using a mutation-introduced polynucleotide or using a commercially available mutant preparation kit. As a specific embodiment, it can be carried out, for example, by the method described in Example 1 (1).
（２）発現ベクター
上記変異体蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、変異体をコードする遺伝子を適当なプロモーターを持つ発現ベクター、例えばpTrc99Aベクター(ファルマシア製)に組み込みむことにより作成することができる。具体的な実施態様として、例えば実施例1(1)に記載の方法により実施できる。
(2) Expression vector An expression vector containing a polynucleotide encoding the mutant protein should be prepared by incorporating a gene encoding the mutant into an expression vector having an appropriate promoter, such as a pTrc99A vector (Pharmacia). Can do. As a specific embodiment, it can be carried out, for example, by the method described in Example 1 (1).
（３）細胞による蛋白質発現
蛋白質を組換え発現するための宿主細胞としては周知の細胞を適宜用いることができる。なかでも大腸菌は、その増殖速度が早く、かつ操作が簡便であり、かかる費用も安価なため広く利用されており、工業的規模での生産に適している。またヘム蛋白質を大腸菌で大量発現させるには、ポルフィリン生合成経路の5-aminolevulinate synthaseが大腸菌では律速酵素になっているためその生産物であるδ-ALA(5-aminolevulic acid)を培地に供給する必要があることが知られている(Arch.Biochem.Biophys., vol.321, No.2, Aug.20, pp277-288, 1995)。
(3) Protein expression by cells Well-known cells can be appropriately used as host cells for recombinantly expressing proteins. Among them, Escherichia coli is widely used because of its high growth rate, simple operation, and low cost, and is suitable for production on an industrial scale. In order to express heme protein in large quantities in E. coli, the 5-aminolevulinate synthase of the porphyrin biosynthetic pathway is the rate-limiting enzyme in E. coli, and its product, δ-ALA (5-aminolevulic acid) is supplied to the medium. It is known that there is a need (Arch.Biochem.Biophys., Vol.321, No.2, Aug.20, pp277-288, 1995).
前記発現ベクターを用いて常法によりCYP変異体遺伝子を組み込んで形質転換した大腸菌、例えば市販コンピーテントセルJM109（宝酒造製）を、δ-ALAを添加した培養条件下で培養し、IPTGなどの誘導物質を添加することにより、大腸菌内にCYP蛋白質を発現させることができる。
CYP蛋白質を発現させた大腸菌を、適当な緩衝液、例えば、500mMリン酸緩衝液あるいは1M NaClを含む緩衝液に懸濁後、超音波処理または、ガラスビーズによる磨砕を行うことにより、CYP蛋白質を効率的に抽出できる（Archieves of Biochemistry and Biophysics 339、107-114(1997)）。CYP蛋白質を含む菌体抽出液は、遠心分離またはフィルターを用いて、未破砕菌体や細胞膜などを取り除く事が好ましい。更にカラムクロマトグラフィーの負荷を軽減するためポリエチレンイミン処理や核酸分解酵素処理を行う事により粘性のある核酸などを除去・分解することが好ましい。次に、種々のカラムクロマトグラフィーを組み合わせて用いることにより、CYP蛋白質を精製することができる。具体的な実施態様として、例えば実施例1(2)に記載の方法により実施できる。
E. coli transformed with a CYP mutant gene by a conventional method using the above-described expression vector, for example, commercially available competent cell JM109 (Takara Shuzo), is cultured under culture conditions to which δ-ALA is added to induce IPTG or the like. By adding the substance, CYP protein can be expressed in E. coli.
E. coli expressing CYP protein is suspended in an appropriate buffer, for example, a buffer containing 500 mM phosphate buffer or 1 M NaCl, and then subjected to sonication or grinding with glass beads to obtain CYP protein. Can be efficiently extracted (Archieves of Biochemistry and
（４）結晶化可能な変異体の選択
ゲルろ過やDLS（Dynamic Light Scattering）など物理化学的手法により分子としての均一性を有する変異体を選択し、次工程の結晶化に付することが好ましい。
(4) Selection of mutant capable of crystallizing It is preferable to select a mutant having homogeneity as a molecule by physicochemical methods such as gel filtration or DLS (Dynamic Light Scattering) and subject it to crystallization in the next step. .
（５）結晶化
本発明の蛋白質の結晶は、以下のようにして製造できる。
蛋白質溶液の蛋白質濃度、沈殿剤濃度などを変動させ結晶を析出させる方法として知られている、蒸気拡散法、透析法、バッチ法などを用いることができる。これらの方法で用いる、最適な沈殿剤の種類、濃度、塩、pHを見出すために、市販のスクリーニングキット、例えばCrystal Screen及びCrystal Screen2（ハンプトン社製）、あるいは硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコールなどを沈殿剤として含む種々の溶液を用いて、結晶が析出する条件を探索することが好ましい。結晶が析出する条件を発見した後、更に種々の条件を検討し、X線回折データの収集および構造解析において最適な結晶を製造することがより好ましい。
(5) Crystallization The protein crystal of the present invention can be produced as follows.
A vapor diffusion method, a dialysis method, a batch method, or the like, which is known as a method for precipitating crystals by changing the protein concentration or the precipitant concentration of the protein solution, can be used. In order to find the optimum type, concentration, salt and pH of the precipitating agent used in these methods, commercially available screening kits such as Crystal Screen and Crystal Screen 2 (manufactured by Hampton) or ammonium sulfate, polyethylene glycol, etc. are used as precipitants. It is preferable to search for conditions for crystal precipitation using various solutions. After discovering the conditions for crystal precipitation, it is more preferable to further study various conditions to produce an optimum crystal in the collection of X-ray diffraction data and the structural analysis.
（６）複合体
複合体を形成させる方法としては、CYP蛋白質溶液に対して基質又は阻害剤である化合物を等量以上で接触させることで複合体が形成できる。化合物を水溶液及びジメチルスルホキシド(DMSO)溶液などの有機溶媒などに高濃度に溶解し、その一部をCYP蛋白質溶液と混合し数時間放置する事によりCYP蛋白質と複合体を形成させる事ができる。また化合物の粉末とCYP蛋白質溶液を混合することによっても複合体を形成できる。
(6) Complex As a method for forming a complex, a complex can be formed by bringing a compound that is a substrate or an inhibitor into contact with the CYP protein solution in an equal amount or more. A compound can be formed into a complex with a CYP protein by dissolving the compound at a high concentration in an aqueous solution or an organic solvent such as a dimethyl sulfoxide (DMSO) solution, and mixing a part of the compound with the CYP protein solution and allowing to stand for several hours. A complex can also be formed by mixing a compound powder and a CYP protein solution.
（７）複合体の結晶
第一の方法として、化合物との共結晶化が挙げられる。この方法では、あらかじめ蛋白質溶液に適量の化合物を添加し複合体を形成させ、その混合液を用い蛋白質の結晶化を行なう。第二の方法としては、ソーキングと呼ばれる方法が挙げられる。この方法では、まず化合物を含まない結晶を作成し、それを化合物を含んだ結晶化母液（結晶化に用いた沈殿剤、塩、緩衝液などを含んだ溶液）に浸漬することによって化合物を結晶内部に浸潤させ、蛋白質と複合体を形成させ複合体の結晶を得る。本発明の複合体の結晶は、Ｘ線結晶構造解析により、複合体の３次元構造及び／又は全原子空間配置を解明し得る品質を有することが好ましい。
(7) Crystal of complex The first method includes co-crystallization with a compound. In this method, an appropriate amount of a compound is added to a protein solution in advance to form a complex, and the mixture is used to crystallize the protein. The second method includes a method called soaking. In this method, first, a crystal containing no compound is prepared, and the compound is crystallized by immersing it in a crystallization mother liquor containing the compound (a solution containing a precipitant, salt, buffer, etc. used for crystallization). Infiltrate the inside to form a complex with the protein to obtain a complex crystal. The crystal of the complex of the present invention preferably has a quality capable of elucidating the three-dimensional structure and / or the total atomic space arrangement of the complex by X-ray crystal structure analysis.
（８）結晶構造の解析・構造座標
上記のようにして得られた本発明蛋白質並びに複合体結晶のX線結晶構造の解析は、以下のようにして行うことができる。
単結晶のX線回折強度データは、回転対陰極を装備したX線発生装置または放射光を利用したX線を利用して取得できる。位相決定は、プログラムAMORE（J. Navaza et al.，Acta Crystallogr.，vol. A50,157(1994)）またはプログラムCNX（Brunger et al., Acta Crstallogr., vol. D54. 905 (1998)）を利用した分子置換法を用いて行なう。
立体構造モデルの構築はプログラムＯ（T.A. Jones et al., Acta Crstallogr., vol. A47,110(1991)）およびQUANTA（Accerlys Inc.）上で行う。構造精密化はプログラムCNXを用いて行い、立体構造を決定する。
(8) Analysis of crystal structure / coordinate of structure The X-ray crystal structure of the protein of the present invention and the complex crystal obtained as described above can be analyzed as follows.
X-ray diffraction intensity data of a single crystal can be obtained using an X-ray generator equipped with a rotating counter cathode or X-rays using synchrotron radiation. The phase determination is carried out using the program AMORE (J. Navaza et al., Acta Crystallogr., Vol. A50, 157 (1994)) or the program CNX (Brunger et al., Acta Crstallogr., Vol. D54. 905 (1998)). This is done using the molecular replacement method used.
The construction of the three-dimensional structure model is performed on the programs O (TA Jones et al., Acta Crstallogr., Vol. A47, 110 (1991)) and QUANTA (Accerlys Inc.). Structure refinement is performed using the program CNX to determine the three-dimensional structure.
前記解析された構造座標は、コンピューターアルゴリズムに適用して、必要によりモニター上に3次元空間を表示して、空間的に適合する化合物をモデリングすることにも使用できる。ここで「適合」とは、薬物代謝型CYP蛋白質の酵素ポケットに、標的となる化学物質の一部又は全部が取り込まれる状態をいう。「モデリング」とは、既存の化合物の置換基を変換／除去すること、化学物質のフラグメントを組み合わせて化合物を発生させること、酵素ポケットの情報から化合物及び／又はフラグメントを設計することなどを含む。 The analyzed structural coordinates can be applied to a computer algorithm to display a three-dimensional space on a monitor if necessary to model a spatially compatible compound. Here, “compatible” refers to a state in which a part or all of the target chemical substance is taken into the enzyme pocket of the drug metabotropic CYP protein. “Modeling” includes converting / removing substituents of existing compounds, combining chemical fragments to generate compounds, designing compounds and / or fragments from enzyme pocket information, and the like.
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従っても実施可能である。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited by this Example. In addition, when there is no notice in particular, it can implement according to a well-known method. In addition, when a commercially available reagent or kit is used, it can also be carried out in accordance with instructions for commercially available products.
実施例１：CYP2C9蛋白質の製造及び変異体スクリーニング
(1) CYP2C9蛋白質の発現系作成
CYP2C9遺伝子内に含まれるアミノ酸をコードする遺伝子のうち大腸菌での使用頻度を考慮して使用頻度の低いコドンを使用頻度の高いコドンに修正するため、34種類の合成オリゴヌクレオチドを設計した(配列番号1-34)。これらの合成オリゴヌクレオチドは、ラビット CYP2C3の可溶化に関する報告（Archieves of Biochemistry and Biophysics 339、107-114(1997)）を参考にして、野生型CYP2C9蛋白質（配列番号35）のN末端領域のアミノ酸残基2-26を配列番号36に置換し、また、C末端に4つのヒスチジン残基を付加し、金属アフィニティークロマトグラフィーで精製できるように設計した。更に、ラビット CYP2C5の可溶化に関する報告（Jose Cosme et al., J.Biol.Chem, vol.275, No.4, 2545-2553 (2000)）を参考にして、アミノ酸5残基を置換（N202H、K206E、I207L、S209G、S210T）できるように設計した。
Example 1: Production of CYP2C9 protein and mutant screening
(1) Creation of CYP2C9 protein expression system
34 types of synthetic oligonucleotides were designed in order to correct the less frequently used codons to the more frequently used codons in consideration of the frequency of use in E. coli among the genes encoding amino acids contained in the CYP2C9 gene (SEQ ID NO: 1-34). These synthetic oligonucleotides were obtained by referring to the report on the solubilization of rabbit CYP2C3 (Archieves of Biochemistry and
PCRは、配列番号1-34で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとDNAポリメラーゼ（Pyrobest DNA polymerase；宝酒造社）を用いて、3段階で行った。なお、配列番号1および18のプライマーの5'末端には、それぞれ制限酵素NcoIおよびSalI認識部位を含む塩基配列が付加されている。まず、各オリゴクレオチド(100μMに調製)を1μlずつ混合した溶液を作成し、そのうちの半量をテンプレートとして１段階目のPCRを行った。１段階目は、95℃（1分間）/65℃（1分間）/72℃（1分間）からなる3ステップを1サクイル行い、次に95℃（1分間）/64℃（1分間）/72℃（1分間）からなる3ステップを2サクイル、以降サイクルの第2番目のステップのアニール温度を62℃、60℃、58℃、56℃、54℃と2℃ずつ下げながら、それぞれ２サイクルずつ行い、最後に95℃（20秒間）/55℃（1分間）/72℃（1分間）を13サイクル行った。これによって取得したPCR産物のうち10μlをテンプレートとして、上記サイクルで2段階目のPCRを行った。さらに、2段階目のPCR産物のうちの1μlをテンプレートに、配列番号1および18のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、95℃（30秒間）/55℃（30秒間）/72℃（3分間）を25サクイル行うことで、3段階目のPCR産物を得た。取得したPCR産物をNcoIおよびSalIで消化した後、発現ベクターpTrc99A（ファルマシア製）のNcoIおよびSalI部位に挿入することにより、発現ベクターpTrc99A-CYP2C9を得た。 PCR was performed in three stages using an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1-34 and a DNA polymerase (Pyrobest DNA polymerase; Takara Shuzo). Note that base sequences including restriction enzyme NcoI and SalI recognition sites are added to the 5 ′ ends of the primers of SEQ ID NOs: 1 and 18, respectively. First, a solution in which 1 μl of each oligonucleotide (prepared to 100 μM) was mixed was prepared, and the first stage PCR was performed using half of the solution as a template. In the first stage, three steps of 95 ° C (1 minute) / 65 ° C (1 minute) / 72 ° C (1 minute) are performed once, then 95 ° C (1 minute) / 64 ° C (1 minute) / 2 cycles of 3 steps consisting of 72 ° C (1 minute), 2 cycles each, while the annealing temperature of the second step of the cycle is lowered by 2 ° C by 62 ° C, 60 ° C, 58 ° C, 56 ° C, 54 ° C. Lastly, 13 cycles of 95 ° C. (20 seconds) / 55 ° C. (1 minute) / 72 ° C. (1 minute) were performed. The second stage PCR was performed in the above cycle using 10 μl of the PCR product obtained as a template. Furthermore, using 1 μl of the second-stage PCR product as a template and oligonucleotides of SEQ ID NOS: 1 and 18 as primers, 95 ° C. (30 seconds) / 55 ° C. (30 seconds) / 72 ° C. (3 minutes) By performing a squill, a PCR product at the third stage was obtained. The obtained PCR product was digested with NcoI and SalI and then inserted into the NcoI and SalI sites of the expression vector pTrc99A (Pharmacia) to obtain the expression vector pTrc99A-CYP2C9.
次に当該初期遺伝子pTrc99A-CYP2C9を基に部位特異的な変異を導入し、計25種類の変異体をQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社製）を用いて、キットの使用説明書に従って作成した。そのうちの5種類（変異体2〜6）について、作成方法を記述する。 Next, site-specific mutations were introduced based on the initial gene pTrc99A-CYP2C9, and a total of 25 mutants were created using the QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by STRATAGENE) according to the kit instructions. . Describe the preparation method for five of them (variants 2-6).
変異体2をコードするポリヌクレオチド（配列番号41）は、配列番号39および40で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに、初期遺伝子（配列番号37）を含む発現ベクターpTrc99A-CYP2C9をテンプレートとして、94℃（30秒間）/50℃（1分間）/72℃（15分間）を20サイクル行うことにより作成した。以下同様に、配列番号37を含む発現ベクターをテンプレートとして、変異体3、4および5を作成した。変異体3をコードするポリヌクレオチド（配列番号45）は配列番号43および44のオリゴヌクレオチド、変異体4をコードするポリヌクレオチド（配列番号49）は配列番号47および48のオリゴヌクレオチド、変異体5をコードするポリヌクレオチド（配列番号53）は配列番号51および52のオリゴヌクレオチドを、それぞれプライマーとして用いて、94℃（30秒間）/50℃（1分間）/72℃（15分間）を20サイクル行うことにより作成した。
Polynucleotide encoding SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 41) is a template based on the expression vector pTrc99A-CYP2C9 containing the initial gene (SEQ ID NO: 37) using the oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 39 and 40 as a primer. As above, it was prepared by carrying out 20 cycles of 94 ° C. (30 seconds) / 50 ° C. (1 minute) / 72 ° C. (15 minutes). Similarly,
変異体6は3段階のPCRにより作成した。1段階目は、変異体2のポリヌクレオチド（配列番号41）を含む発現ベクターをテンプレートに、配列番号55および56のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、94℃（30秒間）/50℃（1分間）/72℃（15分間）を20サイクル行った。2段階目は、1段階目のPCR産物をテンプレート、配列番号57および58のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、同様のサイクルでPCRを行った。3段階目は、2段階目のPCR産物をテンプレート、配列番号59および60のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、同様のサイクルでPCRを行った。以上の3段階のPCRにより、変異体6をコードするポリヌクレオチド（配列番号61）を含む発現ベクターを作成した。
(2) 大腸菌での変異体蛋白質の発現と蛋白質の精製
CYP2C9変異体6（配列番号62）の発現プラスミドで宿主大腸菌JM109株（宝酒造製）を形質転換し、100μg/mlアンピシリンナトリウムを含むLB培地（非特許文献１参照）に植菌、30℃で16時間 前培養を行った。前培養液を、100μg/mlアンピシリンナトリウム, 1 mM イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG), および0.5 mM 5-アミノレブリン酸を含むTerrific Broth（Sambrook J. et al., Molecular Cloning (1989)参照）、に植菌し、23℃で48時間培養した。培養菌体は遠心操作により回収した。
Archieves of Biochemistry and Biophysics 339、107-114(1997)を参考にして、培養菌体を1M 塩化ナトリウムを含む 20mM トリス-塩酸(pH 8.0), 0.2mg/ml リゾチーム, 14.4mM β-メルカプトエタノール(β-M.E.), 0.1% 3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸（CHAPS）, 1mM ふっ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)からなる溶媒中で超音波破砕した。遠心操作により上清を回収した後、沈査を再度超音波破砕した。これにより、可溶性画分にCYP2C9蛋白質を抽出、回収した。
(2) Mutant protein expression and protein purification in E. coli
Host E. coli strain JM109 (manufactured by Takara Shuzo) was transformed with the expression plasmid of CYP2C9 mutant 6 (SEQ ID NO: 62), inoculated into LB medium (see Non-patent Document 1) containing 100 μg / ml ampicillin sodium, and 16 at 30 ° C. Time Pre-culture was performed. Pre-culture solution is Terrific Broth (Sambrook J. et al., Molecular Cloning (1989) containing 100 μg / ml ampicillin sodium, 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), and 0.5 mM 5-aminolevulinic acid. ), And cultured at 23 ° C. for 48 hours. The cultured cells were collected by centrifugation.
Referring to Archieves of Biochemistry and
この粗抽出液に、ポリエチレンイミン(分子量60,000〜80,000（シグマ製）、10% v/v溶液、濃塩酸でpH7.0に調整済)を終濃度0.05%になるように添加し、撹拌したあと遠心操作で核酸を沈殿除去した。遠心上清は50%飽和硫安で塩析し、変異体蛋白質を沈殿させた。この塩析物をBuffer A（20mMトリス-塩酸(pH8.0), 20%グリセロール, 200mM塩化ナトリウム, 0.1%CHAPS, 10mMイミダゾール）で再溶解し、不溶性画分を遠心操作で除去した。 Polyethyleneimine (molecular weight 60,000-80,000 (manufactured by Sigma), 10% v / v solution, adjusted to pH 7.0 with concentrated hydrochloric acid) was added to this crude extract to a final concentration of 0.05% and stirred. The nucleic acid was removed by centrifugation. The centrifuged supernatant was salted out with 50% saturated ammonium sulfate to precipitate the mutant protein. The salted-out product was redissolved with Buffer A (20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0), 20% glycerol, 200 mM sodium chloride, 0.1% CHAPS, 10 mM imidazole), and the insoluble fraction was removed by centrifugation.
取得した塩析再溶解液を、NiをキレートしBuffer Aで平衡化したHis-Bind Resin(Novagen製)に展開し、変異体蛋白質を吸着させた。Buffer Aで10カラムボリューム洗浄し、さらに 20mM トリス-塩酸(pH8.0), 20%グリセロール, 200mM塩化ナトリウム, 20mMイミダゾールで10カラムボリューム洗浄した後、20mMトリス-塩酸(pH 8.0), 20%グリセロール, 200mM塩化ナトリウム, 250mMイミダゾールで吸着蛋白質を溶出した。溶出画分を10mMトリス-塩酸(pH8.0), 20%グリセロール, 14.4mMβ-M.E., 1mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)で3倍希釈した。希釈した蛋白質溶液を、Buffer B（10mMトリス-塩酸(pH8.0), 20%グリセロール, 100mM 塩化ナトリウム, 14.4mMβ-M.E., 1mMEDTA）で平衡化したQ-Sepharose（ファルマシア製）に展開すると、非吸着画分に変異体蛋白質が見出され、夾雑蛋白質の大部分が吸着した。
The obtained salting-out redissolved solution was developed on His-Bind Resin (manufactured by Novagen) chelated with Ni and equilibrated with Buffer A to adsorb the mutant protein.
Q-Sepharoseの非吸着画分を、Buffer Bで平衡化したSP-Sepharose（ファルマシア製）に展開すると、変異体蛋白質は吸着した。Buffer Bで10カラムボリューム洗浄した後、Buffer Bの塩化ナトリウム濃度を500mMまで段階的に上げることで、吸着蛋白質を溶出させた。変異体蛋白質は塩化ナトリウム濃度約300mMで主に溶出され、その前後の画分には夾雑蛋白質と一部の変異体蛋白質が溶出された。
SP-Sepharoseの塩化ナトリウム濃度約300mM溶出画分を回収し、セントリプレップYM-50（ミリポア製）を用いて濃縮した。濃縮した蛋白質溶液を、10mMリン酸カリウム(pH7.4), 20%グリセロール, 500mM塩化カリウム, 1mM EDTA, 2mMジチオスレイトール(DTT)で平衡化したHiLoad 16/60 Superdex 200prep grade(ファルマシア製)に展開した。波長417nmに吸収極大を示した画分を回収し、セントリプレップYM-50で濃度40mg/mlまで濃縮した。取得した変異体蛋白質溶液は、結晶化を行うまで4℃で保存した。
When the non-adsorbed fraction of Q-Sepharose was developed on SP-Sepharose (Pharmacia) equilibrated with Buffer B, the mutant protein was adsorbed. After washing 10 column volumes with Buffer B, the adsorbed protein was eluted by gradually increasing the sodium chloride concentration of Buffer B to 500 mM. Mutant proteins were eluted mainly at a sodium chloride concentration of about 300 mM, and contaminating proteins and some mutant proteins were eluted in the fractions before and after that.
The fraction eluted with about 300 mM sodium chloride concentration of SP-Sepharose was collected and concentrated using Centriprep YM-50 (Millipore). Concentrate the protein solution into
(3)CYP2C9蛋白質変異体のスクリーニング
合計25種類の変異体について、上記と同様にして発現並びに精製した後、Superdex 200 HR 10/30(ファルマシア製)を用いてゲル濾過を行い、その溶出の様子を分析した。その結果、4つの変異体が単一なピークを示した。すべての変異体の中から単一なピークを示した4つの変異体と単一なピークを示さなかった15の変異体について、結晶化を試みた結果、単一なピークを示した４つの変異体（変異体1,3,5及び6）についてのみ結晶を得た。それ以外の変異体は結晶が析出しなかった。即ち、不規則な凝集のない均一な分子量分布を持つ変異体のみが結晶化可能であるとの知見を得た。6種類の変異体について、ゲル濾過の溶出パターンと結晶析出成否の関係を図1に示す。
CYP2C9変異体6(配列番号62)の結晶は、1μlの変異体6溶液（蛋白質を溶解する緩衝液：10mMリン酸カリウム、pH7.4、0.5M KCl、1mM EDTA、2mM DTT、20% v/v グリセロール）に対して、1μlのリザーバー溶液（0.1M Tris-HCl、pH8.4,0.2M KCl、10% v/v PEG400、10% w/v PEG8000、10% v/v グリセロール）を添加し、この溶液を同リザーバー溶液に対して、1日間蒸気拡散することによって作成した。作成した変異体6の結晶は、ａ=ｂ=16.5nm、ｃ=11.2nm、α=β=90°、γ=120°の単位格子定数およびP321の空間群を有する三方晶形結晶であった。
(3) Screening of CYP2C9 protein variants After expressing and purifying a total of 25 variants in the same manner as described above, gel filtration was performed using
The crystal of CYP2C9 mutant 6 (SEQ ID NO: 62) is 1 μl of
実施例２:複合体の結晶化と構造解析
(1) CYP2C9変異体／ワルファリン複合体
CYP2C9変異体6(配列番号62)／ワルファリン複合体溶液は、40mg/mlの変異体溶液（蛋白質を溶解する緩衝液：10mMリン酸カリウム、pH7.4、0.5M KCl、1mM EDTA、2mM DTT、20% v/v グリセロール）25μlに対して、200mM ワルファリン溶液（溶媒：ジメチルスルホキシド）1μｌを添加、攪拌し、氷上で１時間放置することにより作成した。
１μlの変異体／ワルファリン複合体溶液に対して、１μlのリザーバー溶液（0.1M Tris-HCl、pH8.4,0.2M KCl、14% v/v PEG400、9.5% w/v PEG8000、10% v/v グリセロール）を添加し、この溶液を同リザーバー溶液に対して、1〜2日間蒸気拡散することによって変異体6／ワルファリン複合体結晶が析出した。
Example 2: Crystallization and structural analysis of composite
(1) CYP2C9 mutant / warfarin complex
CYP2C9 mutant 6 (SEQ ID NO: 62) / warfarin complex solution is 40 mg / ml mutant solution (protein dissolving buffer: 10 mM potassium phosphate, pH 7.4, 0.5 M KCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, It was prepared by adding 1 μl of a 200 mM warfarin solution (solvent: dimethyl sulfoxide) to 25 μl of 20% v / v glycerol), stirring, and allowing to stand on ice for 1 hour.
For 1 μl of mutant / warfarin complex solution, 1 μl of reservoir solution (0.1 M Tris-HCl, pH 8.4, 0.2 M KCl, 14% v / v PEG400, 9.5% w / v PEG8000, 10% v / v Glycerol) was added, and this solution was vapor diffused to the same reservoir solution for 1-2 days to precipitate
当該複合体の立体構造は、上記で得られた、ａ=ｂ=16.5nm、ｃ=11.1nm、α=β=90°、γ=120°の単位格子定数およびP321の空間群を有する三方晶形結晶を用いて決定した。初期位相は、サーチモデルとしてラビット由来CYP2C5結晶構造（PDB ID:1DT6）を用い、プログラムAMoRe（J.Navaza et al., Acta Crystallogr., vol.A50,157(1994)）を利用した分子置換法により決定した。立体構造モデルの構築はプログラムQUANTA（Accerlys Inc.）上で行った。構造精密化はプログラムCNX（Brunger et al., Acta Crystallogr., vol. D54. 905 (1998)）を用いて行い、分解能3.2Åの立体構造モデルを得た。
本発明複合体結晶の回折データ統計値及び複合体立体構造精密化の統計値を表1及び表2に示す。また座標データを構造座標1として図5〜132に、これをビジュアル化した構造図を図2に示す。図5〜132の座標データにおいて、図5の1行目以降、図132の最終行を除いて、各原子の3次元座標を記述している。1列目のATOMはこの行が原子座標の行であることを示し、2列目は、その原子の順番を、3列目はアミノ酸残基等における原子の区別を、4列目はアミノ酸残基等を、5列目は分子の種類を（同一の種類は一本のポリペプチド鎖であることを示す）、6列目は配列番号62に対応したアミノ酸の番号等を、7、8、9列目はその原子の座標（a軸、b軸、c軸方向の順番でÅ単位）を、10列目は、その原子の占有率（本発明においてはすべて1.00）を、11列目はその原子の温度因子を、12行目は分子の区分を、13行目は原子の種類を示している。図132の最終行は、この座標データの終わりの行であることを示している。なお、この座標データは当業者にとって一般的に用いられている表記法であるプロテイン・データ・バンクの形式に従って記述している。
The three-dimensional structure of the complex is a trigonal crystal having the unit cell constants a = b = 16.5 nm, c = 11.1 nm, α = β = 90 °, γ = 120 °, and the space group of P321 obtained above. Determined using crystals. The initial phase is a molecular replacement method using the rabbit-derived CYP2C5 crystal structure (PDB ID: 1DT6) as a search model and using the program AMoRe (J. Navaza et al., Acta Crystallogr., Vol. A50, 157 (1994)). Determined by. The three-dimensional structure model was constructed on the program QUANTA (Accerlys Inc.). Structure refinement was performed using the program CNX (Brunger et al., Acta Crystallogr., Vol. D54. 905 (1998)), and a three-dimensional structure model with a resolution of 3.2 mm was obtained.
Tables 1 and 2 show the diffraction data statistics of the complex crystals of the present invention and the complex three-dimensional structure refinement statistics. Further, the coordinate data is shown as
(2) CYP2C9変異体／トルブタミド複合体
CYP2C9変異体６(配列番号62)／トルブタミド複合体溶液は、200mM ワルファリン溶液1μｌに代えて、200mMトルブタミド溶液（溶媒：シメチルスルホキシド）0.25μｌを用いた以外は上記(1)と同様にして作成した。更に、1μlの複合体溶液に対して、1μlのリザーバー液（0.1M Tris-HCl、pH8.4、0.2M KCl、24% v/v PEG400、5% w/v PEG8000、10% v/v グリセロール）を添加し、この溶液を同リザーバー液に対して、1〜2日間蒸気拡散することによって複合体結晶を得た。
(2) CYP2C9 mutant / tolbutamide complex
CYP2C9 variant 6 (SEQ ID NO: 62) / tolbutamide complex solution was prepared in the same manner as (1) above except that 0.25 μl of 200 mM tolbutamide solution (solvent: dimethyl sulfoxide) was used instead of 1 μl of 200 mM warfarin solution. did. In addition, 1 μl of complex solution for 1 μl of complex solution (0.1 M Tris-HCl, pH 8.4, 0.2 M KCl, 24% v / v PEG400, 5% w / v PEG8000, 10% v / v glycerol ) And vapor diffusion of this solution to the same reservoir solution for 1-2 days to obtain composite crystals.
CYP2C9変異体6／トルブタミド複合体の立体構造は、上記で得られた、ａ=ｂ=16.4nm、ｃ=11.1nm、α=β=90°、γ=120°の単位格子定数およびP321の空間群を有する三方晶形結晶を用いて決定した。初期位相は、サーチモデルとしてラビット由来CYP2C5結晶構造（PDB ID:1DT6）を用い、プログラムAMoRe（J.Navaza et al., Acta Crystallogr., vol.A50,157(1994)）を利用した分子置換法により決定した。立体構造モデルの構築はプログラムQUANTA（Accerlys Inc.）上で行った。構造精密化はプログラムCNX（Brunger et al., Acta Crystallogr., vol. D54. 905 (1998)）を用いて行い、分解能3.5Åの立体構造モデルを得た。複合体結晶の回折データ統計値及び複合体立体構造精密化の統計値を表3及び4に示した。また座標データを構造座標2として図133〜260に、これをビジュアル化した構造図を図3に示す。図133〜260の座標データにおいて、図133の1行目以降、図260の最終行を除いて、各原子の3次元座標を記述している。1列目のATOMはこの行が原子座標の行であることを示し、2列目は、その原子の順番を、3列目はアミノ酸残基等における原子の区別を、4列目はアミノ酸残基等を、5列目は分子の種類を（同一の種類は一本のポリペプチド鎖であることを示す）、6列目は配列番号62に対応したアミノ酸の番号等を、7、8、9列目はその原子の座標（a軸、b軸、c軸方向の順番でÅ単位）を、10列目は、その原子の占有率（本発明においてはすべて1.00）を、11列目はその原子の温度因子を、12列目は分子の区別を、13列目は原子の種類を示している。図260の最終行は、この座標データの終わりの行であることを示している。なお、この座標データは当業者にとって一般的に用いられている表記法であるプロテイン・データ・バンクの形式に従って記述している。
The three-dimensional structure of the
非特許文献1のCYP2C9変異体／ワルファリン複合体構造解析における結合部位の構造図を当該文献から抜粋して図4に示す。非特許文献1のワルファリン結合位置と本発明で得られたワルファリン結合位置は明らかに異なる。各複合体構造解析におけるヘム鉄原子から基質の水酸化される分子までの距離を下表に示す。実施例２(1)並びに(2)で得られた本発明複合体では、ヘム鉄から約3.5〜4.4Åの距離に基質の水酸化される分子が存在し、水酸化反応可能な位置にあることが分かる。
The structure diagram of the binding site in the CYP2C9 mutant / warfarin complex structure analysis of
※基質の原子（水素を除く）の中で最もヘム鉄に近い原子
* Atoms closest to heme iron among substrate atoms (excluding hydrogen)
以下の配列表の数字見出し＜223＞には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号1-34, 39, 40, 43, 44, 47, 48, 51, 52, 55-60の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。配列番号36の配列で表されるアミノ酸配列は、変異体の作製に用いた配列である。配列番号37, 41, 45, 49, 53, 61の配列で表される各塩基配列は、CYP2C9変異体の配列である。 The description of “Artificial Sequence” is described in the numerical heading <223> of the following sequence listing. Specifically, each base sequence represented by the sequences of SEQ ID NOs: 1-34, 39, 40, 43, 44, 47, 48, 51, 52, 55-60 in the sequence listing is an artificially synthesized primer. Is an array. The amino acid sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 36 is the sequence used for preparing the mutant. Each base sequence represented by the sequences of SEQ ID NOs: 37, 41, 45, 49, 53, 61 is the sequence of the CYP2C9 mutant.
Claims (20)
A method for screening a crystallizable Cytochrome P450 mutant, comprising a step of confirming homogeneity as a molecule of a soluble Cytochrome P450 mutant and a step of selecting a mutant having homogeneity.
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|---|---|---|---|---|
| JP2011520428A (en) * | 2008-04-25 | 2011-07-21 | ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ | Crystal structure of monoacylglycerol lipase (MGLL) |
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2004
- 2004-08-06 JP JP2004231735A patent/JP2006042734A/en not_active Withdrawn
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