JP2006034189A - Method for detecting carcinogenesis of tissue - Google Patents

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Sachiko Nishihara
祥子 西原
Shin Kamiyama
伸 神山
Hisashi Narimatsu
久 成松
Yoshifumi Chikami
芳文 地神
Yasunori Chiba
靖典 千葉
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Seikagaku Corp
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a nucleic acid in which utilization as a reagent or a diagnostic for research of medical fields, biochemical fields, etc., is thought and to provide a method for detecting carcinogenesis of a tissue by using the expression level of the nucleic acid as index. <P>SOLUTION: The method for detecting carcinogenesis of the tissue to be detected comprises correlating detected value of the expression level in the tissue to be detected of a gene corresponding to a specific nucleic acid with carcinogenesis of the tissue to be detected. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、ヒトDNAライブラリーから見出された核酸の「被検組織における発現量の検出値」と「当該被検組織の癌化」とを関連づけることによる「組織の癌化の検出方法」に関する。   The present invention relates to “a method for detecting canceration of a tissue” by associating “the detected value of the expression level in a test tissue” of a nucleic acid found from a human DNA library with “carcinogenesis of the test tissue”. About.

組織の癌化を検出する方法としては、様々な方法が知られており、例えばＸ線検査、内視鏡検査や、CA19-9等の腫瘍マーカー検査等があげられる。Ｘ線検査や内視鏡検査などでは組織を外観からしか観察できず、また、腫瘍マーカーは偽陽性、偽陰性が現れる点で確定的な診断には不十分であった。   Various methods are known as methods for detecting canceration of tissues, such as X-ray examination, endoscopic examination, and examination of tumor markers such as CA19-9. In X-ray examination and endoscopy, tissues can be observed only from the appearance, and tumor markers are insufficient for definitive diagnosis in that false positives and false negatives appear.

組織の癌化の確定診断は、実際に組織を生検により採取し、その組織の培養を行って確認する方法が行われているが、この方法は組織の培養の為の相当の時間を要する。
一方、内視鏡下で外科的手法により、生体組織の病変部を切除する手術は一般に行われており、その様な病変部について簡単に癌化の有無を確認する手法が存在すれば、癌化の早期発見にも繋がり、その後の患者の治療や予防に有用となる。 For the definite diagnosis of tissue canceration, a method of actually collecting a tissue by biopsy and culturing the tissue for confirmation is performed, but this method requires a considerable time for culturing the tissue. .
On the other hand, an operation to remove a lesion in a living tissue by a surgical technique under an endoscope is generally performed. If there is a method for easily confirming the presence or absence of cancer in such a lesion, This will lead to early detection of aging, and will be useful for the subsequent treatment and prevention of patients.

採取した組織から、早期に信頼性の高い結果が得られる「組織の癌化を検出する方法」の開発が望まれている。   The development of a “method for detecting canceration of a tissue” that can provide a reliable result at an early stage from the collected tissue is desired.

本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ヒトDNAライブラリーから特定の核酸（遺伝子）を見出し、当該核酸（遺伝子）の転写産物量を指標として、癌細胞における当該核酸の発現量を測定したところ、「癌化した組織における発現量」が「健常組織における発現量」と異なるという実験結果を得、これら知見を組織の癌化の検出方法に応用することで本発明を完成した。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found a specific nucleic acid (gene) from a human DNA library, and the amount of the transcription product of the nucleic acid (gene) as an index, the relevant in cancer cells By measuring the expression level of the nucleic acid, we obtained an experimental result that “expression level in cancerous tissue” differs from “expression level in healthy tissue”, and applying these findings to a method for detecting canceration of tissues Completed the invention.

すなわち本発明は以下の（１）〜（９）に関する。
（１） 下記（ａ）〜（ｄ）の何れかに記載の核酸に対応する遺伝子の「被検組織における発現量の検出値」と、「前記被検組織の癌化」とを関連づけることを特徴とする被検組織の癌化の検出方法。
（ａ） 配列番号１記載の塩基配列、又は、当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸。
（ｂ） 配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列、又は、当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸。
（ｃ） 上記（ａ）又は（ｂ）記載の核酸の塩基配列において、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列、又は、当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸。
（ｄ） 上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）記載の核酸の塩基配列と、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする塩基配列、又は、当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸。 That is, the present invention relates to the following (1) to (9).
(1) Associating the “detected value of the expression level in the test tissue” of the gene corresponding to the nucleic acid according to any of the following (a) to (d) with “carcinogenesis of the test tissue” A method for detecting canceration of a test tissue, which is characterized.
(A) A nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a base sequence complementary to the base sequence.
(B) A nucleic acid comprising a base sequence of a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary to the base sequence.
(C) A base sequence having one or several base substitutions, deletions, insertions or rearrangements, or a base sequence complementary to the base sequence in the nucleic acid sequence described in (a) or (b) above A nucleic acid consisting of
(D) A nucleic acid comprising the base sequence of the nucleic acid described in (a), (b) or (c) above, a base sequence that hybridizes under stringent conditions, or a base sequence complementary to the base sequence.

（２） 「被検組織における発現量の検出値」が、被検組織と健常組織における前記遺伝子の転写産物量をそれぞれ定量し、当該定量によって得られた被検組織における値と健常組織における値との差又は比である（１）記載の被検組織の癌化の検出方法。   (2) “Detected value of expression level in test tissue” quantifies the amount of the transcription product of the gene in the test tissue and healthy tissue, respectively, and the value in the test tissue and the value in healthy tissue obtained by the quantification (1) The method for detecting canceration of a test tissue according to (1).

（３） 「被検組織における発現量の検出値」が、配列番号１記載の塩基番号１２７３〜１３６９の領域を増幅させることにより得られた値である（１）又は（２）記載の被検組織の癌化の検出方法。   (3) The test according to (1) or (2), wherein the “detected value of the expression level in the test tissue” is a value obtained by amplifying the region of base numbers 1273 to 1369 described in SEQ ID NO: 1. A method for detecting canceration of a tissue.

（４） 被検組織が大腸由来の組織であることを特徴とする（１）〜（３）の何れかに記載の被検組織の癌化の検出方法。   (4) The method for detecting canceration of a test tissue according to any one of (1) to (3), wherein the test tissue is a tissue derived from the large intestine.

（５） 下記（Ａ）〜（Ｃ）の何れかに記載の塩基配列を有する核酸。
（Ａ） 配列番号１記載の塩基番号１２７３〜１３６９の塩基配列。
（Ｂ） 上記（Ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列。
（Ｃ） 上記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列において、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列であって、かつ、当該塩基配列を含む核酸に対応する遺伝子の転写産物量が癌化組織と健常組織において異なることを特徴とする核酸。 (5) A nucleic acid having the base sequence described in any of (A) to (C) below.
(A) The base sequence of base numbers 1273 to 1369 described in SEQ ID NO: 1.
(B) A base sequence complementary to the base sequence described in (A) above.
(C) In the base sequence of (A) or (B) above, a base sequence having substitution, deletion, insertion or rearrangement of one or several bases, or a base sequence complementary to the base sequence, and A nucleic acid characterized in that the amount of a transcription product of a gene corresponding to the nucleic acid containing the base sequence differs between a cancerous tissue and a healthy tissue.

（６） 配列番号１記載の塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする塩基配列からなる核酸であり、かつ、当該核酸に対応する遺伝子の転写産物量が癌化組織と健常組織において異なることを特徴とする核酸。   (6) A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, and a gene corresponding to the nucleic acid A nucleic acid characterized in that the amount of transcript differs between cancerous tissue and healthy tissue.

（７） 配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする塩基配列からなる核酸であり、当該核酸に対応する遺伝子の転写産物量が癌化組織と健常組織において異なることを特徴とする核酸。   (7) a nucleic acid comprising a base sequence of a gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence; A nucleic acid characterized in that the amount of a transcript of a gene corresponding to is different between a cancerous tissue and a healthy tissue.

（８） ＤＮＡであることを特徴とする（５）〜（７）の何れか一項に記載の核酸。   (8) The nucleic acid according to any one of (5) to (7), which is DNA.

（９） （５）〜（８）の何れか一項に記載の核酸の、被検組織の癌化の検出のための使用。   (9) Use of the nucleic acid according to any one of (5) to (8) for detection of canceration of a test tissue.

本発明核酸の発現量を指標とする組織の癌化の検出方法を提供する。また、本発明核酸の医学分野、生化学分野等の研究用試薬又は診断薬としての利用も考えられる。   Provided is a method for detecting canceration of a tissue using the expression level of the nucleic acid of the present invention as an index. Further, the use of the nucleic acid of the present invention as a research reagent or diagnostic agent in the medical field, biochemical field, etc. is also conceivable.

以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
（１）本発明核酸
本発明核酸は、配列番号１記載の全塩基配列（GenBank Accession No.NM_017945）からなる核酸、又は、当該全塩基配列の一部の塩基配列若しくは当該一部の塩基配列に相補的な塩基配列を含み３０ｂｐ以上である核酸、及び、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸、又は、当該塩基配列の一部の塩基配列若しくは当該一部の塩基配列に相補的な塩基配列を含み３０ｂｐ以上である核酸であり、これら核酸に対応する遺伝子の転写産物量が癌化組織と健常組織において異なることを特徴とする。 Hereinafter, the present invention will be described in detail by embodiments of the invention.
(1) Nucleic acid of the present invention The nucleic acid of the present invention is a nucleic acid comprising the entire base sequence described in SEQ ID NO: 1 (GenBank Accession No. NM_017945), or a part of the base sequence or part of the base sequence. A nucleic acid comprising a complementary base sequence and 30 bp or more, and a nucleic acid comprising a base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a part of the base sequence or part of the base sequence It is a nucleic acid having a complementary base sequence and 30 bp or more, and is characterized in that the amount of a transcription product of a gene corresponding to these nucleic acids is different between cancerous tissue and healthy tissue.

なお、本発明核酸は用いる目的により、後述の本発明検出方法において遺伝子の発現量の検出対象となる遺伝子を構成する核酸（以下、本発明核酸１とも言う。）と、ポリペプチドの遺伝子工学的製造や遺伝子の測定等の遺伝子工学に関する研究においてプローブやプライマー等として用いられる核酸及び後述の本発明検出方法において検出対象となる核酸に対応する遺伝子の発現量を定量する際に増幅領域として選択可能な遺伝子の一部分に相当する核酸（以下、本発明核酸２とも言う。）とに分けられる。   Depending on the purpose of using the nucleic acid of the present invention, the nucleic acid constituting the gene whose expression level is to be detected in the detection method of the present invention described later (hereinafter also referred to as the present nucleic acid 1) and the genetic engineering of the polypeptide. Can be selected as an amplification region when quantifying the expression level of nucleic acids used as probes and primers in genetic engineering research such as manufacturing and gene measurement, and the nucleic acids that will be detected in the detection method of the present invention described later And a nucleic acid corresponding to a part of a gene (hereinafter also referred to as the nucleic acid 2 of the present invention).

本発明核酸１は、上記本発明核酸の中でも３０〜２９００ｂｐ、より好ましくは２８８０ｂｐである核酸が好ましい。本発明核酸１における「配列番号１記載の全塩基配列の一部」又は「配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の一部」は、塩基数３０〜２８００ｂｐが好ましく、５０〜１５００ｂｐがより好ましく、更には８０〜１３００ｂｐが好ましく、より具体的には、配列番号１記載の塩基番号１８７〜１４６１の塩基配列、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする全塩基配列、及び、配列番号１記載の塩基番号１２７３〜１３６９の塩基配列等が好ましく挙げられる。   The nucleic acid 1 of the present invention is preferably a nucleic acid of 30 to 2900 bp, more preferably 2880 bp among the nucleic acids of the present invention. The “part of the entire base sequence described in SEQ ID NO: 1” or the “part of the base sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2” in the nucleic acid 1 of the present invention preferably has a base number of 30-2800 bp, and 50-1500 bp. More preferably, 80 to 1300 bp is more preferable. More specifically, the base sequence of base numbers 187 to 1461 shown in SEQ ID NO: 1, the entire base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 1 Preferable examples include the nucleotide sequences of the described base numbers 1273 to 1369.

本発明核酸１として具体的には、（Ａ）配列番号１記載の塩基配列からなる核酸（GenBank Accession No.NM_17945）、（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み全長２８８０ｂｐである核酸、（Ｃ）配列番号１記載の塩基番号１８７〜１４６１の塩基配列を含み全長２８８０ｂｐである核酸、（Ｄ）配列番号１記載の塩基番号１２７３〜１３６９の塩基配列を含み全長２８８０ｂｐである核酸、（Ｅ）配列番号２記載のアミノ酸をコードする遺伝子の塩基配列からなる核酸、及び（Ｆ）配列番号１記載の塩基番号１８７〜１４６１の塩基配列からなる核酸等が挙げられ、これら核酸が有する塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸も同様に挙げられる。
更に、上記本発明核酸１の具体例（Ａ）〜（Ｆ）の核酸において、１又は数個（好ましくは２以上６０以下）の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸も本発明核酸１として挙げられる。 Specifically, the nucleic acid 1 of the present invention includes (A) a nucleic acid consisting of a base sequence described in SEQ ID NO: 1 (GenBank Accession No. NM_17945), (B) a base sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, and a total length of 2880 bp. (C) a nucleic acid having a total length of 2880 bp including the base sequence of base numbers 187 to 1461 described in SEQ ID NO: 1, and (D) a total length of 2880 bp including the base sequence of base numbers 1273 to 1369 described in SEQ ID NO: 1. And (E) a nucleic acid consisting of a base sequence of a gene encoding the amino acid described in SEQ ID NO: 2, and (F) a nucleic acid consisting of a base sequence of base numbers 187 to 1461 described in SEQ ID NO: 1, and the like. The nucleic acid which consists of a base sequence complementary to the base sequence which has is also mentioned similarly.
Furthermore, in the nucleic acids of the specific examples (A) to (F) of the nucleic acid 1 of the present invention, a base sequence having one or several (preferably 2 or more and 60 or less) base substitutions, deletions, insertions or rearrangements, or A nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence is also exemplified as the nucleic acid 1 of the present invention.

更に、本発明核酸１には、上述に挙げられた本発明核酸１の具体例の核酸それぞれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。例えば、上記（Ａ）〜（Ｆ）の核酸又はこれらが有する塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸、及び、これら（Ａ）〜（Ｆ）の核酸において１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列からなる核酸又は当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハブリダイズする核酸（特にＤＮＡ）で、且つ、これら核酸に対応する遺伝子の転写産物量が癌化組織と健常組織で異なる核酸が挙げられる。   Furthermore, the nucleic acid 1 of the present invention also includes a nucleic acid that hybridizes with each of the nucleic acids of the specific examples of the nucleic acid 1 of the present invention mentioned above under stringent conditions. For example, a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid of the above (A) to (F) or a base sequence thereof, and substitution of one or several bases in the nucleic acid of (A) to (F), A nucleic acid consisting of a base sequence having a deletion, insertion or rearrangement, or a nucleic acid consisting of a base sequence complementary to the base sequence, and a nucleic acid (particularly DNA) that hybridizes under stringent conditions, and corresponds to these nucleic acids Nucleic acids whose gene transcripts are different between cancerous tissue and healthy tissue can be mentioned.

なお、例えば配列番号１記載の全塩基配列からなる核酸に対応する遺伝子とは、当該核酸を逆転写酵素によって合成する際の鋳型であるＲＮＡが、生体内での遺伝情報の転写により合成されるｍＲＮＡとなる様なゲノムＤＮＡが挙げられる。また、遺伝子工学的に発現させる場合等においては、配列番号１記載の全塩基配列からなる核酸に対応する遺伝子には、当該核酸そのものであるｃＤＮＡも同様に含まれる。   For example, a gene corresponding to a nucleic acid consisting of the entire base sequence described in SEQ ID NO: 1 is synthesized by transcription of genetic information in vivo, which is a template for synthesizing the nucleic acid by reverse transcriptase. Examples include genomic DNA that becomes mRNA. In addition, in the case of expression by genetic engineering, etc., the gene corresponding to the nucleic acid consisting of the entire base sequence described in SEQ ID NO: 1 also includes cDNA which is the nucleic acid itself.

ここで「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等参照）。一般に「核酸のハイブリダイズを使用する実験手法（例えばノザンブロットハイブリダイゼーション、サザンブロットハイブリダイゼーション）」等で用いられる条件が挙げられ、好ましくは３７．５％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／EDTA（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、５×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下での４２℃の条件が例示される。   Here, “stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). The conditions generally used in “experimental techniques using nucleic acid hybridization (for example, Northern blot hybridization, Southern blot hybridization)” and the like are mentioned, preferably 37.5% formamide, 5 × SSPE (sodium chloride / sodium phosphate) / EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) buffer), 5 × Denhardt's solution, and 42 ° C. conditions in the presence of 0.5% SDS (sodium dodecyl sulfate).

なお、本明細書における核酸の長さを表す単位「ｂｐ」とは、核酸が二本鎖となっている場合には、その二本鎖を形成する塩基対の数、一本鎖となっている場合には、その核酸に相補的な塩基配列からなる一本鎖がハイブリダイズした二本鎖の塩基対数に相当する数に換算した核酸の長さである。従って、例えば、「１０００ｂｐ」の一本鎖のＤＮＡは１０００個のヌクレオチドで形成されていることになり、「１０００ｂｐ」の二本鎖のＤＮＡは２０００個のヌクレオチド（１０００対のヌクレオチド）で形成されていることになるが、双方とも同じ「１０００個のヌクレオチドからなる鎖長」のＤＮＡを表すことになる。   In this specification, the unit “bp” representing the length of a nucleic acid is the number of base pairs that form a double strand when the nucleic acid is double stranded, or a single strand. The length of the nucleic acid converted to a number corresponding to the number of double-stranded base pairs hybridized with a single strand having a base sequence complementary to the nucleic acid. Thus, for example, a single-stranded DNA of “1000 bp” is formed of 1000 nucleotides, and a double-stranded DNA of “1000 bp” is formed of 2000 nucleotides (1000 pairs of nucleotides). However, both represent the same “chain length of 1000 nucleotides”.

一方、本発明核酸２は、用いる目的により必要な長さを適宜選択することが出来る。
配列番号１記載の塩基番号１２７３〜１３６９の塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸、配列番号１記載の塩基番号１８７〜１４６１の塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸、配列番号１記載の全塩基配列中における５００〜１０００ｂｐの連続した塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸等は、これらの核酸の長さにより、ハイブリダイズ能と取り扱いやすさの双方を兼ね備えている為、ハイブリダイズ用プローブとして優れている。同様に、これら核酸に対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする核酸（特にＤＮＡ）も有用である。例えば、配列番号１記載の塩基配列からなる核酸に対応する遺伝子の転写産物量の検査に際し、ハイブリダイズ用プローブとして使用することが可能であり、医学、生化学等の研究用試薬又は診断薬として極めて有用である。 On the other hand, the necessary length of the nucleic acid 2 of the present invention can be appropriately selected depending on the purpose of use.
A nucleic acid comprising the base sequence of base numbers 1273 to 1369 described in SEQ ID NO: 1 or a base sequence complementary to the base sequence, the base sequence of base numbers 187 to 1461 described in SEQ ID NO: 1, or the base sequence complementary to the base sequence A nucleic acid consisting of a continuous base sequence of 500 to 1000 bp in the entire base sequence described in SEQ ID NO: 1 or a base sequence complementary to the base sequence, and the like. Since it has both ease of handling, it is excellent as a probe for hybridization. Similarly, nucleic acids (especially DNA) that hybridize under stringent conditions to these nucleic acids are also useful. For example, it can be used as a probe for hybridization in examining the amount of a transcription product of a gene corresponding to a nucleic acid comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1, and can be used as a research reagent or diagnostic agent for medicine, biochemistry, etc. Very useful.

また、配列番号１記載の全塩基配列中における３０〜３００ｂｐの連続した塩基配列領域は、後述の本発明検出方法における本発明核酸１に対応する遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて定量する際の増幅領域として選択可能な領域であり、当該領域の塩基配列からなる核酸が増幅される。例えば、配列番号１記載の塩基番号１２７３〜１３６９の塩基配列からなる核酸等が挙げられる。
なお、当該増幅領域をＰＣＲ法において増幅させるのに用いるプライマーとしては、後述のプライマーが挙げられ、これらも本発明核酸２に包含される。 In addition, a continuous base sequence region of 30 to 300 bp in the entire base sequence described in SEQ ID NO: 1 is used to quantify the expression level of the gene corresponding to the nucleic acid 1 of the present invention in the detection method of the present invention described later using the RT-PCR method. This is a region that can be selected as an amplification region, and a nucleic acid consisting of the base sequence of the region is amplified. For example, the nucleic acid etc. which consist of a base sequence of base numbers 1273-1369 of sequence number 1 are mentioned.
In addition, examples of the primer used for amplifying the amplification region in the PCR method include those described below, and these are also included in the nucleic acid 2 of the present invention.

更に、配列番号１記載の塩基配列からなる核酸、及び、配列番号１記載の塩基番号１８７〜１４６１の塩基配列を少なくとも含む核酸（好ましくは配列番号１記載の塩基番号１８７〜１４６１の塩基配列からなる核酸）は、タンパク質合成における終止コドンに相当する塩基配列を含む為、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを遺伝子工学的に調製する為に用いることが出来、有用である。なお、この様なポリペプチドの遺伝子工学的調製を目的とする際には、その目的を効率良く行う為にプロモーター配列、シグナル配列等の塩基配列を連結していても構わない。   Furthermore, a nucleic acid comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid comprising at least the base sequence of base numbers 187 to 1461 described in SEQ ID NO: 1 (preferably consisting of the base sequence of base numbers 187 to 1461 described in SEQ ID NO: 1 Since the nucleic acid includes a base sequence corresponding to a stop codon in protein synthesis, it can be used for genetic engineering to prepare a polypeptide comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2. In addition, when aiming at the genetic engineering preparation of such a polypeptide, base sequences such as a promoter sequence and a signal sequence may be linked in order to efficiently perform the purpose.

なお、配列番号１記載の塩基配列はｃＤＮＡの塩基配列であるが、本発明核酸はＤＮＡに限定されない。例えば、配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸としては、ＲＮＡも含まれる。つまり、本発明核酸に対応する遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡも含む。
本発明核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても構わないが、本発明核酸２、つまり、後述の本発明検出方法でハイブリダイズ用プローブ等として使用する場合や、組換ベクター及び組換体の調製時に安定である点で優れるため、ＤＮＡであることが好ましい。 The base sequence described in SEQ ID NO: 1 is the base sequence of cDNA, but the nucleic acid of the present invention is not limited to DNA. For example, the nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 includes RNA. That is, mRNA which is a transcription product of a gene corresponding to the nucleic acid of the present invention is also included.
The nucleic acid of the present invention may be either DNA or RNA, but the nucleic acid of the present invention 2, that is, when used as a hybridization probe or the like in the detection method of the present invention described later, a recombinant vector or a recombinant Since it is excellent in that it is stable during the preparation of DNA, it is preferably DNA.

本発明核酸は例えば以下の方法により調製することが可能である。
公知のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（UDP-GlcNAc）トランスポーター関連遺伝子の塩基配列（GenBank accession No.AB021981）をクエリーとしてBLASTにより塩基配列の検索を行ない、配列番号１の全配列を含むクローン(GenBank accession No.NM_017945)を得ることができる。得られたクローンを相補配列として用いポリメラーゼチェイン反応（以下「PCR法」とも記載する）などを行いcDNAライブラリー等から本発明核酸を増幅して調製することができる。
本発明核酸は、例えば配列番号３記載の塩基配列（aaaaagcagg cttcggtgga atggaaaaac agtgctgta）を5'プライマーとして、配列番号４記載の塩基配列（agaaagctgg gtcgaaagta tcttcatctg act）を3'プライマーとして使用し、例えばヒトゲノムcDNAライブラリーを鋳型として常法に従って一次PCR法を行い、更に配列番号５記載の塩基配列（ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct）を5'プライマー、配列番号６記載の塩基配列（ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt）を3'プライマーとして使用し、上記一次PCR法による産物を鋳型として二次PCR法を行うことで調製することができる。 The nucleic acid of the present invention can be prepared, for example, by the following method.
Using the base sequence of a known uridine diphosphate-N-acetyl-D-glucosamine (UDP-GlcNAc) transporter-related gene (GenBank accession No. AB021981) as a query, the base sequence is searched by BLAST. A clone containing the sequence (GenBank accession No. NM_017945) can be obtained. It can be prepared by amplifying the nucleic acid of the present invention from a cDNA library or the like by performing a polymerase chain reaction (hereinafter also referred to as “PCR method”) using the obtained clone as a complementary sequence.
The nucleic acid of the present invention uses, for example, the base sequence described in SEQ ID NO: 3 (aaaaagcagg cttcggtgga atggaaaaac agtgctgta) as a 5 ′ primer and the base sequence described in SEQ ID NO: 4 (agaaagctgg gtcgaaagta tcttcatctg act) as a 3 ′ primer, for example, human genome cDNA live The primary PCR method is carried out in accordance with a conventional method using a rally as a template, and the base sequence described in SEQ ID NO: 5 (ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct) is used as a 5 ′ primer, and the base sequence described in SEQ ID NO: 6 (ggggaccactact ttgtacaaga aagctgggt) is used as a 3 ′ primer. It can be prepared by performing a secondary PCR method using the product of the primary PCR method as a template.

また、配列番号１に記載の本発明核酸の塩基配列に基づき、当業者であれば目的とする本発明核酸や、調製したい「本発明核酸の部分領域」の両端の塩基配列を基に適宜プライマーを作製し、それを用いてPCR法などによって目的の塩基配列領域を有する核酸を増幅して、部分核酸を調製することが容易である。
例えば、配列番号１記載の塩基配列においてポリペプチドをコードしている領域（塩基番号１８７〜１４６１）は、配列番号７の塩基配列（atggaaaaac agtgctgtag tcatc）を5'プライマーとして及び配列番号８の塩基配列（ttagaaagta tcttcatctg actca）を3'プライマーとして用いPCR法で調製することができる。また、配列番号１記載の全塩基配列からなる核酸の調製は、例えば配列番号９（tttttgttct gcaataggcg gctta）の塩基配列を5'プライマー、配列番号１０記載の塩基配列（aggtttaata attattttaa ttaca）を3'プライマーとして使用して、市販のcDNAライブラリーを鋳型としてPCR法により調製することができる。更に、配列番号１記載の塩基番号１２７３〜１３６９の領域は、配列番号１１の塩基配列（gccccatcag tccttctctc t）を5'プライマーとして、配列番号１２の塩基配列（cacttagatc tcggatcctt tcttg）を3'プライマーとして使用し、同様にcDNAライブラリーから調製することができる。 Further, based on the base sequence of the nucleic acid of the present invention described in SEQ ID NO: 1, those skilled in the art will appropriately primer based on the target nucleic acid of the present invention and the base sequences at both ends of the “partial region of the nucleic acid of the present invention” to be prepared. It is easy to prepare a partial nucleic acid by amplifying a nucleic acid having a target base sequence region by PCR or the like using
For example, the region (base numbers 187 to 1461) encoding a polypeptide in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 is the base sequence of SEQ ID NO: 8 using the base sequence of SEQ ID NO: 7 (atggaaaaac agtgctgtag tcatc) as the 5 ′ primer. (Ttagaaagta tcttcatctg actca) can be used as a 3 ′ primer and prepared by PCR. The nucleic acid comprising the entire base sequence described in SEQ ID NO: 1 is prepared by, for example, using the 5 ′ primer as the base sequence of SEQ ID NO: 9 (tttttgttct gcaataggcg gctta) and the 3 ′ primer as the base sequence (aggtttaata attattttaa ttaca) described in SEQ ID NO: 10. Can be prepared by PCR using a commercially available cDNA library as a template. Furthermore, the region of base numbers 1273 to 1369 described in SEQ ID NO: 1 uses the base sequence of SEQ ID NO: 11 (gccccatcag tccttctctct) as the 5 ′ primer and the base sequence of SEQ ID NO: 12 (cacttagatc tcggatcctt tcttg) as the 3 ′ primer. Similarly, it can be prepared from a cDNA library.

この場合、配列番号３及び配列番号４のプライマーを使用したPCR法では、産物として１３０８ｂｐのDNA断片が得られ、配列番号５及び配列番号６のプライマーを使用したPCR法においては産物として１３４２ｂｐのDNA断片が得られ、また、配列番号７及び配列番号８のプライマーを使用したPCR法において産物として１２７５ｂｐのDNA断片が得られる。これらをアガロースゲル電気泳動等の様な分子量によりDNA断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す等の様な常法に従って単離して「本発明核酸」を得ることができる。   In this case, in the PCR method using the primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, a 1308 bp DNA fragment is obtained as a product, and in the PCR method using the primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, a DNA of 1342 bp is obtained as a product. A fragment is obtained, and a DNA fragment of 1275 bp is obtained as a product in the PCR method using the primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8. These can be separated by a method of sieving DNA fragments by molecular weight such as agarose gel electrophoresis, and isolated according to a conventional method such as cutting out a specific band to obtain the “nucleic acid of the present invention”.

このようにして単離した本発明核酸は、本発明核酸がコードするポリペプチドを発現する組換体を調製するためにも使用することができる。   The nucleic acid of the present invention isolated in this manner can also be used to prepare a recombinant that expresses the polypeptide encoded by the nucleic acid of the present invention.

（２）本発明検出方法
本発明検出方法は、上述の本発明核酸１に対応する遺伝子の「被検組織における発現量の検出値」と「前記被検組織の癌化」とを関連づけることを特徴とする被検組織の癌化の検出方法である。
例えば、被検組織と健常組織における、本発明核酸１に対応する遺伝子の転写産物量（ｍＲＮＡ量）をそれぞれ定量し、当該定量によって得られた被検組織における値と健常組織における値との差又は比を「被検組織における発現量の検出値」とし、これを指標に癌化を検出する方法である。 (2) Detection method of the present invention The detection method of the present invention relates to associating “the detected value of the expression level in the test tissue” of the gene corresponding to the above-described nucleic acid 1 of the present invention with “carcinogenesis of the test tissue”. A feature is a method for detecting canceration of a test tissue.
For example, the amount of the transcription product (mRNA amount) of the gene corresponding to the nucleic acid 1 of the present invention in the test tissue and the healthy tissue is quantified, and the difference between the value in the test tissue and the value in the healthy tissue obtained by the quantification is determined. Alternatively, the ratio is “detection value of expression level in test tissue”, and this is used as an index to detect canceration.

本発明検出方法において発現量を検出する対象となる核酸は、上述の本発明核酸１であり、「配列番号１記載の全塩基配列の一部」又は「配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の一部」が、例えば、配列番号１記載の塩基番号１８７〜１４６１の塩基配列、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、配列番号１記載の塩基番号１２７３〜１３６９の塩基配列等から選択され、全長３０〜２９００ｂｐ、より好ましくは２８８０ｂｐである核酸が好ましい。   The nucleic acid whose expression level is to be detected in the detection method of the present invention is the above-described nucleic acid 1 of the present invention, which encodes “a part of the entire base sequence described in SEQ ID NO: 1” or “the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2. The “part of the base sequence” includes, for example, the base sequence of base numbers 187 to 1461 described in SEQ ID NO: 1, the base sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, and the base sequences of 1273 to 1369 described in SEQ ID NO: 1. A nucleic acid selected from the base sequence and the like and having a total length of 30 to 2900 bp, more preferably 2880 bp is preferable.

更に具体的には、上述の本発明核酸の説明部分に挙げられた本発明核酸１の具体例である（Ａ）〜（Ｆ）の核酸又はこれら核酸が有する塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸が挙げられ、また上述と同様に、これら核酸の塩基配列において１又は数個（好ましくは２以上６０以下）の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸も挙げられる。
更に、上記のこれら核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸で、且つ、当該核酸に対応する遺伝子の転写産物量（ｍＲＮＡ量）が癌化組織と健常組織で異なる核酸が挙げられる。 More specifically, from the nucleic acid of (A) to (F), which is a specific example of the nucleic acid 1 of the present invention mentioned in the explanation part of the nucleic acid of the present invention, or a base sequence complementary to the base sequence of these nucleic acids. In the same manner as described above, the base sequence of these nucleic acids has one or several (preferably 2 to 60) base substitutions, deletions, insertions or rearrangements, or the base sequence. A nucleic acid comprising a complementary base sequence is also mentioned.
Furthermore, nucleic acids that hybridize with the above-described nucleic acids under stringent conditions, and that have different transcription product amounts (mRNA amounts) of genes corresponding to the nucleic acids between cancerous tissues and healthy tissues.

「配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列」の一例として、「配列番号１記載の塩基番号１８７〜１４６１の塩基配列」が挙げられるが、アミノ酸をコードする塩基コドンの縮重によって、「配列番号１記載の塩基番号１８７〜１４６１の塩基配列」とは異なる塩基配列を有する核酸であっても配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする限り、同様に用いることが出来る。   An example of “a base sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2” includes “a base sequence of base numbers 187 to 1461 described in SEQ ID NO: 1”. Even a nucleic acid having a nucleotide sequence different from the nucleotide sequence of nucleotide numbers 187 to 1461 described in SEQ ID NO: 1 can be used in the same manner as long as it encodes the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.

本発明検出方法における本発明核酸に対応する遺伝子の発現量の検出方法としては、特に限定されないが、本発明核酸１に対応する遺伝子の遺伝情報の転写によって生じる転写産物量を指標とする定量方法が適用可能である。例えば、配列番号１記載の塩基番号１２７３〜１３６９の塩基配列を含む核酸（ＤＮＡ）を指標として転写産物量を定量することで、簡単に本発明核酸の発現量の検出を行うことが出来る。   The detection method of the expression level of the gene corresponding to the nucleic acid of the present invention in the detection method of the present invention is not particularly limited, but is a quantification method using as an index the amount of transcript produced by transcription of the genetic information of the gene corresponding to the nucleic acid 1 of the present invention. Is applicable. For example, the expression level of the nucleic acid of the present invention can be easily detected by quantifying the amount of the transcript using the nucleic acid (DNA) containing the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1273 to 1369 described in SEQ ID NO: 1 as an index.

この様な転写産物量の測定は、DNAの転写産物であるmRNAを検出する為に通常用いられている方法を利用することが可能であり、例えば、ＰＣＲ法やノーザンブロット法等が挙げられる。ｍＲＮＡの相補的配列を有するｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅することにより転写産物量を定量するＲＴ−ＰＣＲ法（reversed transcription- polymerase chain reaction）がより好ましく、例えば、Cybergreen法やTaqManプローブ法等のようなリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法が特に好ましく挙げられる。   For the measurement of the amount of such a transcription product, a method usually used for detecting mRNA which is a transcription product of DNA can be used, and examples thereof include a PCR method and a Northern blot method. The RT-PCR method (reversed transcription-polymerase chain reaction) that quantifies the amount of transcription product by amplifying cDNA having a complementary sequence of mRNA using the PCR method is preferable, such as the Cybergreen method or the TaqMan probe method. Such a real-time RT-PCR method is particularly preferred.

本発明核酸１に対応する遺伝子の転写産物量をTaqManプローブ法やCybergreen法などのＲＴ−ＰＣＲ法により測定する場合に用いるプライマーやプローブは、転写産物量を定量可能な配列を常法に従い設計することにより得ることが出来る。
ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅する領域は、転写産物であるmRNAの塩基配列に相補的なｃＤＮＡ配列において増幅可能な領域であれば特に限定されないが、本発明検出方法では、通常、転写産物であるmRNAの塩基配列に相補的なｃＤＮＡの一部である配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、好ましくは配列番号１記載の塩基配列において３０ｂｐ〜３００ｂｐの連続した塩基配列からなる領域が選択される。
例えば、配列番号１記載の塩基配列中に存在する３０〜３００ｂｐの連続した塩基配列の領域が選択され、選択した塩基配列に従い適宜プライマーを設計する。 Primers and probes used when measuring the amount of a transcription product of a gene corresponding to the nucleic acid 1 of the present invention by RT-PCR methods such as TaqMan probe method and Cybergreen method are designed according to a conventional method with a sequence capable of quantifying the amount of the transcript. Can be obtained.
The region amplified by the RT-PCR method is not particularly limited as long as it is a region that can be amplified in a cDNA sequence complementary to the base sequence of mRNA that is a transcription product. However, in the detection method of the present invention, mRNA that is a transcription product is usually used. A region consisting of a continuous base sequence of 30 bp to 300 bp in the base sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 which is a part of cDNA complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1, preferably in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 is selected. The
For example, a region having a continuous base sequence of 30 to 300 bp existing in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 is selected, and primers are appropriately designed according to the selected base sequence.

ゲノムＤＮＡから転写され、スプライシングされたmRNAには、当該ＤＮＡの遺伝情報に基づく翻訳に実質的な影響を与えない範囲において塩基配列の相違を有するバリアントが存在する可能性があることが知られている。本発明検出方法においては、本発明核酸のバリアントも転写産物として測定されうる。
上記バリアントを考慮すると、ＲＴ−ＰＣＲ法において増幅させる領域は、本発明検出方法で検出対象となる本発明核酸の塩基配列中のバリアント間で共通しているエキソン上から選択するのが好ましい。 It is known that mRNA transcribed from spliced genomic DNA and spliced mRNA may have variants having base sequence differences within a range that does not substantially affect translation based on the genetic information of the DNA. Yes. In the detection method of the present invention, a variant of the nucleic acid of the present invention can also be measured as a transcript.
Considering the above variants, the region to be amplified in the RT-PCR method is preferably selected from exons that are common among variants in the nucleotide sequence of the nucleic acid of the present invention to be detected by the detection method of the present invention.

本発明検出方法における転写産物の定量方法の一例としては、配列番号１記載の塩基番号１２７３〜１３６９の塩基配列を増幅領域として選択し、当該塩基配列の5'末端と3'末端の塩基配列を基に作製したプライマー（例えば、配列番号１１及び配列番号１２記載の核酸）と、蛍光色素と消光物質とを結合させたプローブを用いた定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣR法（以下「定量的RT-PCR法」とも記載する）による測定が挙げられる。なお、プローブとしては、例えば配列番号１３記載の塩基配列（tataatgcca gcaagcctca agttccgg）の核酸が例示される。   As an example of a transcription product quantification method in the detection method of the present invention, the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1273 to 1369 described in SEQ ID NO: 1 is selected as the amplification region, and the nucleotide sequences of the 5 ′ end and 3 ′ end of the nucleotide sequence are determined. Quantitative real-time RT-PCR method (hereinafter “quantitative RT-PCR” using a probe prepared by binding a primer (for example, nucleic acids described in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) and a fluorescent dye and a quenching substance) Measurement ”) (also referred to as“ method ”). In addition, as a probe, the nucleic acid of the base sequence (tataatgcca gcaagcctca agttccgg) of sequence number 13 is illustrated, for example.

本発明検出方法における本発明核酸に対応する遺伝子の発現量の検出は、必ずしも「m RNA」や「DNAから転写されて生ずるmRNA（DNAの転写産物）」を定量して行なうことに限定はされない。例えば、本発明核酸に対応する遺伝子が転写、翻訳されて生ずる「本発明核酸がコードするポリペプチド」を定量して行なうことも可能である。このようなポリペプチドの定量は、精製した「本発明核酸によってコードされるポリペプチド」を用いて常法に従い調製した抗体などを使用するウエスタンブロット法やエンザイムイムノアッセイ等の一般的方法で行うことが出来る。   Detection of the expression level of the gene corresponding to the nucleic acid of the present invention in the detection method of the present invention is not necessarily limited to performing quantitative determination of "mRNA" or "mRNA transcribed from DNA (DNA transcription product)". . For example, the “polypeptide encoded by the nucleic acid of the present invention” produced by transcription and translation of a gene corresponding to the nucleic acid of the present invention can be quantified. Such a polypeptide can be quantified by a general method such as Western blotting or enzyme immunoassay using an antibody prepared according to a conventional method using a purified “polypeptide encoded by the nucleic acid of the present invention”. I can do it.

なお、ＰＣＲ法にて、遺伝子の発現量の検出を、当該遺伝子の転写産物量の測定によって行う場合、一般的に、cDNA調製の元となるＲＮＡ量の違い等に起因する全体のＲＮＡ総量の違いを補正した値を比較する。例えば、健常組織と癌化組織とに於ける遺伝子の発現量を比較するには、目的とする遺伝子の転写産物量の測定値を各組織に於けるβ-アクチン遺伝子やグリセロアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の様な標準遺伝子の転写産物量を同様の方法で測定し得られた値で補正した値（補正値）を用いるのが好ましい。   In addition, when detecting the expression level of a gene by PCR method by measuring the amount of the transcription product of the gene, in general, the total RNA amount due to the difference in the amount of RNA that is the source of cDNA preparation, etc. Compare the corrected values. For example, in order to compare the expression level of a gene in healthy tissue and cancerous tissue, the measured value of the transcript amount of the target gene can be obtained by comparing the β-actin gene and glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase in each tissue. It is preferable to use a value (correction value) obtained by correcting the amount of a transcription product of a standard gene such as (GAPDH) with a value obtained by measuring in the same manner.

その為、転写産物量の実測値での比較と、当該実測値を標準遺伝子の転写産物量の測定値で補正し得られた値（補正値）による比較とは、数値の大きさが異なる場合がある。つまり、実測値の比較では、被検組織の方が健常組織より値が増加しているが、補正値の比較では、被検組織の方が健常組織より減少している場合もある。
本発明方法では、補正値を比較し、被検組織の方が健常組織より値が減少している場合に当該被検組織が癌化していると判定される。 Therefore, the comparison between the measured value of the transcript amount and the comparison with the value (corrected value) obtained by correcting the measured value with the measured value of the transcript amount of the standard gene is different in the numerical value. There is. That is, in the actual value comparison, the value of the test tissue is higher than that of the healthy tissue. However, in the comparison of the correction value, the test tissue may be smaller than the healthy tissue.
In the method of the present invention, the correction values are compared, and when the value of the test tissue is smaller than that of the healthy tissue, it is determined that the test tissue is cancerous.

本発明検出方法は、組織から分離して得られる「組織片」を使用して行うことが好ましい。すなわち、生検などによって得られた組織に含まれる病変部分の組織（被検組織）と当該病変部分の周辺の健常部分の組織（健常組織）とを用いることが好ましい。
本発明検出方法が適用可能な組織としては、何れの組織であっても使用することが可能であるが、食道、胃、肺、膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、小腸、大腸、直腸および結腸などが挙げられ、食道、胃、小腸および大腸が好ましく、大腸がより好ましい。なお、本発明方法は、大腸癌を特異的に好ましく検出することが出来る。 The detection method of the present invention is preferably performed using a “tissue piece” obtained by separating from a tissue. That is, it is preferable to use a tissue of a lesion part (test tissue) included in a tissue obtained by biopsy or the like and a healthy part tissue (a healthy tissue) around the lesion part.
As the tissue to which the detection method of the present invention can be applied, any tissue can be used, but the esophagus, stomach, lung, pancreas, liver, kidney, duodenum, small intestine, large intestine, rectum, colon, and the like. The esophagus, stomach, small intestine and large intestine are preferable, and the large intestine is more preferable. The method of the present invention can specifically and preferably detect colorectal cancer.

上述の様に、例えば配列番号１記載の塩基配列からなる核酸に対応する遺伝子の転写産物の量の変化を指標として本発明検出方法を行う場合、生検等により得られた病変部分の組織とその周辺の健常部分の組織における当該転写産物量（被検転写産物量）を各々定量する。更に、同様に定量した標準遺伝子の転写産物量（標準転写産物量）で、定量した被検転写産物量を補正した後、補正した値を対比することにより、被検組織の癌の診断や治療の経過観察等が出来、有用である。なお、被検組織の当該補正値が、健常組織の補正値より減少している場合、被検組織と癌化を関連付けることが出来る。   As described above, for example, when the detection method of the present invention is performed using the change in the amount of the transcription product of the gene corresponding to the nucleic acid having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 as an index, the tissue of the lesioned part obtained by biopsy or the like The amount of the transcript (the amount of the test transcript) in the surrounding healthy tissue is quantified. Furthermore, after correcting the quantified amount of the test transcript by the amount of the transcript of the standard gene quantified in the same manner (standard transcript amount), the corrected value is compared and compared to diagnose or treat cancer in the test tissue. It is useful because it can be used for follow-up observations. In addition, when the said correction value of a test tissue has decreased from the correction value of a healthy tissue, a test tissue and canceration can be linked | related.

ちなみに、本発明検出方法にて本発明核酸１として配列番号１記載の全塩基配列からなる核酸を選択する場合は、対応する遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの塩基配列は、配列番号１記載のｃＤＮＡ配列を鋳型としＲＮＡポリメラーゼにより合成されるＲＮＡの塩基配列と同じである。   Incidentally, when a nucleic acid consisting of the entire base sequence described in SEQ ID NO: 1 is selected as the nucleic acid 1 of the present invention by the detection method of the present invention, the base sequence of mRNA that is a transcription product of the corresponding gene is the cDNA described in SEQ ID NO: 1. It is the same as the base sequence of RNA synthesized by RNA polymerase using the sequence as a template.

以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。しかしながら、これにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。   Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, this should not limit the technical scope of the present invention.

（実施例１）本発明核酸の調製方法
ヒトUDP-GlcNAcトランスポーターの塩基配列（GenBank accession No.AB021981）をクエリーとして、BLAST検索を行った。その結果、塩基配列（GenBank accession No.NM_17945）がホモロジーを有することが判明し、その塩基配列は配列番号１の通りであった。 (Example 1) Method for preparing nucleic acid of the present invention A BLAST search was performed using the base sequence of human UDP-GlcNAc transporter (GenBank accession No. AB021981) as a query. As a result, the base sequence (GenBank accession No. NM — 17945) was found to have homology, and the base sequence was as shown in SEQ ID NO: 1.

配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡを得るために、ヒト大腸由来のｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社製）を鋳型とし、５'プライマーとして配列番号３記載の塩基配列、３'プライマーとして配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡを用いて、常法により一次ＰＣＲ法を行った。なお、一次ＰＣＲの反応液は、２μＬの１０ x pfx amplification緩衝液（インビトロジェン社製）、０．４μＬの５０ｍＭ硫酸マグネシウム溶液、４μＬの１０ x PCRxenhancer 溶液（インビトロジェン社製）、２．５μＬの２．５ｍＭ dＮＴＰ混合溶液、０．５μＬの鋳型となるＤＮＡ（約５０ｎｇ）、１μＬの５'プライマー（終濃度０．５μＭとなる様に添加）、１μＬの３'プライマー（終濃度０．５μＭとなる様に添加）、０．５μＬのplatium pfx DNAポリメラーゼ（インビトロジェン社製）に、蒸留水を８．１μＬ加え、全量２０μＬとした。   In order to obtain DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a cDNA library derived from human large intestine (manufactured by Clontech) was used as a template, the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 3 as a 5 ′ primer, and SEQ ID NO: 4 described as a 3 ′ primer. A primary PCR method was performed by a conventional method using a DNA having the nucleotide sequence of The primary PCR reaction solution was 2 μL of 10 × pfx amplification buffer (manufactured by Invitrogen), 0.4 μL of 50 mM magnesium sulfate solution, 4 μL of 10 × PCRxenhancer solution (manufactured by Invitrogen), 2.5 μL of 2. 5 mM dNTP mixed solution, 0.5 μL of template DNA (about 50 ng), 1 μL of 5 ′ primer (added to a final concentration of 0.5 μM), 1 μL of 3 ′ primer (to give a final concentration of 0.5 μM) In addition, 8.1 μL of distilled water was added to 0.5 μL of platinum pfx DNA polymerase (manufactured by Invitrogen) to make a total volume of 20 μL.

更に配列番号５記載の塩基配列を５'プライマーに、配列番号６記載の塩基配列を３'プライマーとして使用して二次ＰＣＲ法を行った。なお、二次ＰＣＲの反応液は、２μＬの１０ x pfx amplification緩衝液、０．４μＬの５０ｍＭ硫酸マグネシウム溶液、３μＬの２．５ｍＭｄＮＴＰ混合溶液、４μＬの一次ＰＣＲの産物、２μＬの５'プライマー（終濃度１μＭとなる様に添加）、２μＬの３'プライマー（終濃度１μＭとなる様に添加）、０．５μＬのplatinum pfx DNAポリメラーゼに、蒸留水を６．１μｌ加え、全量を２０μＬとした。
二次ＰＣＲの産物から、アガロースゲル電気泳動を用いて、１３４２ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って回収した。 Further, secondary PCR was performed using the base sequence described in SEQ ID NO: 5 as a 5 ′ primer and the base sequence described in SEQ ID NO: 6 as a 3 ′ primer. The secondary PCR reaction solution was 2 μL of 10 × pfx amplification buffer, 0.4 μL of 50 mM magnesium sulfate solution, 3 μL of 2.5 mM dNTP mixed solution, 4 μL of the primary PCR product, 2 μL of 5 ′ primer (final 6.1 μl of distilled water was added to 2 μL of 3 ′ primer (added to a final concentration of 1 μM) and 0.5 μL of platinum pfx DNA polymerase to a total volume of 20 μL.
From the secondary PCR product, a 1342 bp DNA fragment was recovered according to a conventional method using agarose gel electrophoresis.

（実施例２）大腸癌組織における本発明核酸に対応する遺伝子の発現量の変化
定量的リアルタイムＰＣＲ法を用いてヒト大腸癌組織と同一患者の健常大腸組織での本発明核酸に対応する遺伝子の転写産物の量を比較した。 (Example 2) Change in the expression level of a gene corresponding to the nucleic acid of the present invention in a colon cancer tissue Using a quantitative real-time PCR method, the gene corresponding to the nucleic acid of the present invention in a healthy colon tissue of the same patient as a human colon cancer tissue The amount of transcript was compared.

ヒト大腸癌組織及び健常大腸組織のＲＮＡを、RNeasy Mini Kit（キアゲン社製）で抽出し、Super-Script First-Strand Synthesis System（インビトロジェン社製）を用いたOligo（dT）法によりsingle strand DNAとした。このDNAを鋳型とし、配列番号１１記載の塩基配列を５'プライマーとして、配列番号１２記載の塩基配列を３'プライマーとして、及び、配列番号１３記載の塩基配列をTaqManプローブとして用いてABI PRISM 7700（アプライドバイオシステム社製）により定量的リアルタイムＰＣＲ法を行った。ＰＣＲの条件は、９５℃、１０分で反応を行った後、９５℃１５秒、６０℃１分のサイクルを４０回繰り返して行った。内部標準としてβ−アクチン遺伝子を用い、β-アクチン遺伝子の転写産物量に対するNM_017945に対応する遺伝子の転写産物量の比を算出して対比した。（表１、図１）   RNA of human colon cancer tissue and healthy colon tissue is extracted with RNeasy Mini Kit (Qiagen) and single strand DNA and Oligo (dT) method using Super-Script First-Strand Synthesis System (Invitrogen) did. Using this DNA as a template, the base sequence described in SEQ ID NO: 11 as a 5 'primer, the base sequence described in SEQ ID NO: 12 as a 3' primer, and the base sequence described in SEQ ID NO: 13 as a TaqMan probe, ABI PRISM 7700 Quantitative real-time PCR was performed by (Applied Biosystems). The PCR was carried out at 95 ° C. for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute. The β-actin gene was used as an internal standard, and the ratio of the transcript amount of the gene corresponding to NM_017945 to the transcript amount of the β-actin gene was calculated and compared. (Table 1, Fig. 1)

Figure 2006034189
Figure 2006034189

β-アクチン遺伝子の転写産物の測定値でNM_017945に対応する遺伝子の転写産物の測定値を除した値（NM_017945遺伝子転写産物の測定値／β-アクチン遺伝子転写産物の測定値）を算出することによって補正することにより、一様に癌化組織では健常組織と比べて補正値の値が減少していることが実施例２の結果から判明した。よって、NM_017945遺伝子転写産物の測定値／β-アクチン遺伝子転写産物の測定値の比が健常組織の値より減少している組織は、癌化している可能性が高いと関連づけることが出来ることが示された。   By calculating the value obtained by dividing the measured value of the transcript of the β-actin gene by the measured value of the transcript of the gene corresponding to NM_017945 (measured value of the NM_017945 gene transcript / measured value of the β-actin gene transcript) From the results of Example 2, it was found that the correction value was uniformly reduced in the cancerous tissue as compared with the healthy tissue. Therefore, it is shown that a tissue in which the ratio of the measured value of NM_017945 gene transcript / measured value of β-actin gene transcript is lower than that of healthy tissue can be correlated with a high possibility of being cancerous. It was done.

同一患者の大腸癌組織と大腸健常組織でのNM_017945に対応する遺伝子の転写産物量を示す。白抜きバーは大腸健常組織での量を、黒色バーは大腸癌組織での量を示し、縦軸は、内部標準として用いたβ-アクチン遺伝子の転写産物量に対するNM_017945に対応する遺伝子の転写産物量の相対値を示す。The transcription | transfer product amount of the gene corresponding to NM_017945 in the colorectal cancer tissue and colorectal healthy tissue of the same patient is shown. The open bars indicate the amount in healthy colon tissue, the black bars indicate the amount in colon cancer tissue, and the vertical axis indicates the transcript of the gene corresponding to NM_017945 relative to the amount of transcript of the β-actin gene used as the internal standard. Indicates the relative value of the quantity.

Claims (9)

下記（ａ）〜（ｄ）の何れかに記載の核酸に対応する遺伝子の「被検組織における発現量の検出値」と、「前記被検組織の癌化」とを関連づけることを特徴とする被検組織の癌化の検出方法。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列、又は、当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸。
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列、又は、当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸。
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）記載の核酸の塩基配列において、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列、又は、当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸。
（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）記載の核酸の塩基配列と、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする塩基配列、又は、当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸。 The “detected value of the expression level in the test tissue” of the gene corresponding to the nucleic acid according to any of the following (a) to (d) is associated with “carcinogenesis of the test tissue” A method for detecting canceration of a test tissue.
(A) A nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a base sequence complementary to the base sequence.
(B) a nucleic acid comprising a base sequence of a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary to the base sequence.
(C) A base sequence having a substitution, deletion, insertion or rearrangement of one or several bases in the base sequence of the nucleic acid described in (a) or (b) above, or a base sequence complementary to the base sequence A nucleic acid consisting of
(D) A nucleic acid comprising the base sequence of the nucleic acid described in (a), (b) or (c) above, a base sequence that hybridizes under stringent conditions, or a base sequence complementary to the base sequence. 「被検組織における発現量の検出値」が、被検組織と健常組織における前記遺伝子の転写産物量をそれぞれ定量し、当該定量によって得られた被検組織における値と健常組織における値との差又は比である請求項１記載の被検組織の癌化の検出方法。   “Detected value of expression level in test tissue” quantifies the amount of the transcript of the gene in the test tissue and healthy tissue, respectively, and the difference between the value in the test tissue and the value in healthy tissue obtained by the quantification The method for detecting canceration of a test tissue according to claim 1, wherein the ratio is a ratio. 「被検組織における発現量の検出値」が、配列番号１記載の塩基番号１２７３〜１３６９の領域を増幅させることにより得られた値である請求項１又は２記載の被検組織の癌化の検出方法。   The "detection value of the expression level in the test tissue" is a value obtained by amplifying the region of base numbers 1273 to 1369 described in SEQ ID NO: 1 for canceration of the test tissue according to claim 1 or 2 Detection method. 被検組織が大腸由来の組織であることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の被検組織の癌化の検出方法。   The method for detecting canceration of a test tissue according to any one of claims 1 to 3, wherein the test tissue is a tissue derived from the large intestine. 下記（Ａ）〜（Ｃ）の何れかに記載の塩基配列を有する核酸。
（Ａ）配列番号１記載の塩基番号１２７３〜１３６９の塩基配列。
（Ｂ）上記（Ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列。
（Ｃ）上記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列において、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列であって、かつ、当該塩基配列を含む核酸に対応する遺伝子の転写産物量が癌化組織と健常組織において異なることを特徴とする核酸。 A nucleic acid having the base sequence according to any of (A) to (C) below.
(A) The base sequence of base numbers 1273 to 1369 described in SEQ ID NO: 1.
(B) A base sequence complementary to the base sequence described in (A) above.
(C) In the base sequence of (A) or (B) above, a base sequence having substitution, deletion, insertion or rearrangement of one or several bases, or a base sequence complementary to the base sequence, and A nucleic acid characterized in that the amount of a transcription product of a gene corresponding to the nucleic acid containing the base sequence differs between a cancerous tissue and a healthy tissue. 配列番号１記載の塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする塩基配列からなる核酸であり、かつ、当該核酸に対応する遺伝子の転写産物量が癌化組織と健常組織において異なることを特徴とする核酸。   A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, and the amount of a transcription product of a gene corresponding to the nucleic acid A nucleic acid characterized in that is different between cancerous tissue and healthy tissue. 配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする塩基配列からなる核酸であり、当該核酸に対応する遺伝子の転写産物量が癌化組織と健常組織において異なることを特徴とする核酸。   A nucleic acid consisting of a base sequence of a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a nucleic acid consisting of a base sequence complementary to the base sequence under a stringent condition and corresponding to the nucleic acid A nucleic acid characterized in that the amount of a gene transcript differs between a cancerous tissue and a healthy tissue. ＤＮＡであることを特徴とする請求項５〜７の何れか一項に記載の核酸。   The nucleic acid according to any one of claims 5 to 7, wherein the nucleic acid is DNA. 請求項５〜８の何れか一項に記載の核酸の、被検組織の癌化の検出のための使用。   Use of the nucleic acid according to any one of claims 5 to 8 for detection of canceration of a test tissue.
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