JP2006020568A - 赤潮原因珪藻キートケロス属に特異的に感染して増殖・溶藻しうるウイルス、該ウイルスを利用するキートケロス赤潮防除方法およびキートケロス赤潮防除剤、並びに該ウイルスの単離方法、継代培養方法、および保存方法 - Google Patents
赤潮原因珪藻キートケロス属に特異的に感染して増殖・溶藻しうるウイルス、該ウイルスを利用するキートケロス赤潮防除方法およびキートケロス赤潮防除剤、並びに該ウイルスの単離方法、継代培養方法、および保存方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 キートケロス属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径0.1μm未満のウイルス。該ウイルスの単離方法は、ウイルスを含有する液体試料を孔径0.2μmのフィルターで濾過し、得られた濾液をキートケロス属の藻類の培養液に接種して培養を行い、キートケロス属の藻類の溶藻が観察された培養液を限界希釈することにより前記ウイルスをクローニングする工程を含む。前記のウイルスを有効成分として含む赤潮防除剤。前記のウイルスを赤潮水域に散布することからなる赤潮防除方法。前記のウイルスの単離方法、継代培養方法、および保存方法。
【選択図】 図1
Description
Nagasaki et al. Appl. Environ. Microbiol. 70, 704-711 (2004)
本発明のウイルスに感染して、溶藻が確認されたキートケロス属の藻類の培養液を遠心処理(例えば、7,500 rpm、5分)し、得られた上清を対数増殖中のキートケロス属の藻類の培養液に接種して培養を行う。培養液中の細胞密度を光学顕微鏡下で経日的にモニターする方法により、その後の藻体の増殖を評価することができる。これにより、上記の方法で継代培養したウイルスが、キートケロス属の藻類に対する感染性を保持していることがわかる。
材料および方法
殺藻因子の分離には、有明海から分離されたキートケロス・サルスギネウム Ch42株を用いた。培地には改変SWM3培地を用い、培養は温度15°C、光強度100〜150μmol photons m-2 s-1、12hL: 12hDの明暗周期条件下で行った。
殺藻因子の分離に供した試泥(0-3cm深)は、2003年4月18日に有明海の福岡県海域でEkman Berge採泥器により採取した。得られた試泥12gを12mlのSWM3培地と混合し、400 rpmで30分間攪拌した後、2,000 rpmで10分間、4℃で遠心した。得られた遠心上清を孔径0.2μmのフィルターで濾過後、得られた各濾水0.2mlを対数増殖中のキートケロス・サルスギネウム Ch42株の培養液0.8mlにそれぞれ接種した。また、対照として0.2μm以下の画分を加熱処理(100℃×5分)したものを同様にそれぞれ接種し、上述の条件下で培養を行った。
殺藻因子をクローニングすることを目的とし、以下のように限界希釈法を2回繰り返し行った。上述の培養で溶藻が確認された培養液を孔径0.2μmのフィルターで濾過後、改変SWM3培地で100-10-10倍に段階希釈し、各希釈液100μlを対数増殖中のキートケロス株の培養液150μlに接種した。実験には96穴マイクロプレートを使用し、各希釈段階につき8本立てで接種を行った。また、改変SWM3培地のみを接種したものを対照区として設けた。これらを上述の条件下で14日間培養した。溶藻が見られたウェルのうち、最も高い希釈段階で接種を行ったウェル中の溶藻培養液を採取し、再度上述の段階希釈法による処理を試みた。2回目の処理で溶藻が見られたウェルのうち、最高希釈段階の溶藻培養液を200μl採取し、孔径0.1μmのフィルターで濾過後、その濾液を対数増殖中のキートケロス・サルスギネウムCh42株(溶藻がみられた実験区で使用したものと同じ株)の培養液1mlに接種した。以上の操作をもって、殺藻因子のクローニングが完了したものとみなした。また、得られた殺藻因子懸濁液を無菌検査培地ST10-1に接種し20℃で1-2日間培養後、白濁の有無によって混在する細菌の有無を確認した。
殺藻因子接種後、溶藻が確認された宿主培養液を孔径0.2μmのフィルターで濾過後、それぞれ1mlを-196℃, -20℃, 4℃, 10℃,および20℃で暗所に28日間保存した。実験開始時のウイルス懸濁液および保存後のウイルス懸濁液の力価(殺藻因子の単位体積あたりの密度)をそれぞれ限界希釈法により算出し、比較した。
得られた殺藻因子CsNIV21株による溶藻培養液25ml(2.26x107感染単位/ml)を対数増殖中のキートケロス株の培養液529ml(9.9x104細胞/ml)にそれぞれ接種した。接種前および接種から約24時間後にサンプルを採取し、常法により固定包埋処理後、JEOL社製JEM-1010透過型電子顕微鏡による観察を行った。また、溶藻培養液中の殺藻因子の形態観察をネガティブ染色法により行った。
上述の殺藻因子クローンによる溶藻培養液を孔径0.2μmのフィルターで濾過して得られた濾液、ならびにその一部をオートクレーブ処理(121℃×15分)したものを、対数増殖中のキートケロス株培養液529mlに対してそれぞれ25mlずつ接種し、上述の条件下で培養を行った。接種時の感染多重度(1宿主細胞あたり何個のウイルスが接種されたかを示す数値)は10.8とした。実験は、各実験区につき1本立てで行い、細胞密度の変化を経日的にモニターすることで、その後の藻体の増殖を評価した。
また、感染の継続性について検討するため、溶藻培養液を7,500rpmで5分間遠心し得られた上清50μlを対数増殖中のキートケロス株培養液1 mlに接種するという操作を3回以上繰り返し行った。また、対照として非接種区を設け、ともに上述の条件下で培養を行った。
表1に示した対数増殖中の各藻体株培養液800μlに対して、上述の溶藻培養液を7,500rpmで5分間遠心して得られた上清40μlをそれぞれ接種し、上述の条件下で培養を行った。また、対照としてSWM3培地を接種した実験区(陰性対照区)を設けた。実験は各実験区につき2本立てで行い、経日的に光学顕微鏡により被検細胞の状態を観察し、その後の藻体の増殖を評価した。接種14日後までに溶藻が確認されなかったものについては、本殺藻因子の宿主ではないものと判定した。
対数増殖中のキートケロス株培養液にCsNIV21を接種して得られた溶藻液468mlより低速遠心(4,500 xg、10分)および濾過操作(8.0μm、0.8μm、0.2μmフィルタ使用)により死滅藻体細胞片等を除去し、CsNIV懸濁液を得た。これに、ポリエチレングリコール6000を終濃度10%となるように添加し、4℃暗所で一夜静置後、57,000 xgで1.5時間の超遠心分離を行った。得られたペレットを10mMリン酸バッファーで洗浄後、217,000 xgで4時間超遠心することにより得られたCsNIVのペレットを500μlの10mMトリス-HCl (pH 8.0)に懸濁した。得られたCsNIV懸濁液に、プロテイナーゼKを終濃度1mg/ml、サルコシルを終濃度1%となるようにそれぞれ添加し、55℃で1.5時間処理した。処理後、フェノール-クロロホルム抽出により核酸を抽出し、65℃×15分処理、または100℃×10分処理後に65℃×15分処理を施した後、変性ゲル(ホルムアルデヒドアガロースゲル:1%)電気泳動に供した。また、得られた核酸溶液に、RNaseA (終濃度0.05μg/μl)、DNaseI (終濃度0.5U/μl)、またはS1ヌクレアーゼ(終濃度0.7U/μl)をそれぞれ添加し、RNaseA添加区およびDNaseI添加区では37℃で1時間、S1ヌクレアーゼ添加区では22℃(室温)で15分間処理した。得られた各反応産物を、一切の酵素を添加せず氷上で保存しておいたウイルス核酸(対照区サンプル)とともに通常のアガロースゲル上で泳動し、消化の有無を確認した。
さらにCsNIVの構造タンパク質を調べるため、上記のウイルス懸濁液に4倍量のサンプル・バッファー(62.5 mM トリス-HCl, 5% 2-メルカプトエタノール, 2 % SDS, 20 % グリセロール and 0.005 % ブロモフェノルブルー)を添加後、100℃で5分間処理した。得られたタンパク溶液を、10-20%グラディエントのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーにより染色後、主要構造タンパク質のサイズ推定を行った。
殺藻因子の分離
キートケロス・サルスギネウムCh42株は、試水の0.2μm以下の画分を接種することにより、細胞の色素が失われ、死滅に至った(図1)。一方、0.2μm以下の画分を熱処理したものを接種した場合には、死滅は観察されず、増殖の継続が確認された。有明海の試泥および試水を材料として得られた各溶藻培養液に対して、限界希釈法による処理を2回施し、最終的に孔径0.1μmのフィルターで濾過して無菌の殺藻因子懸濁液とした。この結果、これまでに表2に示す殺藻因子クローン株計13株が分離された。これらの殺藻因子株は、現在、すべて細菌の混在しない状態で、本発明者らにより保持されている。
保存実験に供したウイルス懸濁液および各条件下に置いたウイルス懸濁液の7日目および28日目の力価をそれぞれ限界希釈法により算出した結果を表3に示した。この結果から、凍結および冷暗所保存によりCsNIVの力価はほとんど低下しないことが判明した。したがって、CsNIV懸濁液をきわめて安定な状態で簡単に保存できることが可能である。
透過型電子顕微鏡による細胞切片の観察結果を図2に示した。CsNIV21株の接種区では、接種から24時間目には一部の細胞の崩壊が確認された。透過型電子顕微鏡による観察の結果、殺藻因子接種から24時間後の宿主核内に小型のウイルス様粒子が多数検出された(図2B,C)。これに対して、熱処理した殺藻因子懸濁液を接種した実験区においては藻体細胞は活発な増殖を継続し、透過型電子顕微鏡による細胞切片観察によっても健常な細胞内構造が観察された(図2A)。
溶藻培養液をネガティブ染色法により観察した結果、直径約33−44nm(平均38nm)の球形ウイルス様粒子が多数観察され、いずれも外膜構造ならびに尾部構造を持たないことが確認された(図2D)。
前処理を施した殺藻因子クローンCsNIV21株を接種した場合のキートケロス・サルスギネウムCh42株の細胞密度の推移を図3に示した。ウイルス接種後12時間目から24時間目にかけて、ウイルス密度の急増が観察されたことから、ウイルス感染から宿主崩壊に伴う娘ウイルスの放出までに要する時間は約1日と判断された。細胞密度の減少は、接種後36時間目から76時間目にかけて顕著であった。また、本実験の結果に基づき、CsNIV21株の潜伏時間は12-24時間、バーストサイズ(宿主細胞崩壊時に放出される感染単位数)は325、最大収量は3x107感染単位/mlとそれぞれ推算された。
また、連続した植え継ぎ実験から、本殺藻因子クローンは対数増殖中のキートケロス細胞を速やかにかつ繰り返し溶藻せしめることが確認された。
以上の結果に基づき、本ウイルスを「CsNIV (キートケロス・サルスギネウム・ニュークリア・インクルージョン・ウイルス=キートケロス・サルスギネウムに感染し、その複製時に核に含まれるウイルス、の意)」と命名した。
CsNIV21株は、表1に示した58株の海産微細藻類株のうち、標的種であるキートケロス・サルスギネウム(Ch42株)を除くすべての珪藻、緑藻、真正眼点藻、渦鞭毛藻およびラフィド藻に対して殺藻性を示さなかった。この実験結果から、本ウイルスがキートケロス・サルスギネウムにのみ特異的に感染するウイルスである可能性が高いと推察された。
CsNIVより抽出された核酸はRNaseAに耐性であったが、DNaseIおよびS1ヌクレアーゼに感受性であったことから1本鎖領域を多く持つDNAであると推察された。ウイルス核酸を電気泳動した結果、図4Aに示すとおり3本のバンドが検出された。このうち最も移動度の小さかったバンドは、次に移動度の小さかったバンドの環状型であり、一部が物理的刺激により切れて後者のバンドを形成するものと考えられた。また、最も低分子域のバンドは上記の環状1本鎖DNAの一部と水素結合しているものと推察された(図4B)。
また、CsNIVは46.0kDaおよび43.5kDaの2種の主要構造タンパク質をもつことがSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により示された(図5)。
Claims (10)
- キートケロス属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径0.1μm未満のウイルス。
- キートケロス属の藻類がキートケロス・サルスギネウムである請求項1記載のウイルス。
- 尾部構造および外膜構造を欠き、粒径約33〜44nmの球形である請求項2記載のウイルス。
- キートケロス属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径0.1μm未満のウイルスを含有する液体試料をフィルターで濾過し、得られた濾液をキートケロス属の藻類の培養液に接種して培養を行い、キートケロス属の藻類の溶藻が観察された培養液を限界希釈することにより前記ウイルスをクローニングする工程を含む、キートケロス属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径0.1μm未満のウイルスの単離方法。
- キートケロス属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径0.1μm未満のウイルスに感染して、溶藻が確認されたキートケロス属の藻類の培養液を遠心処理し、得られた上清をキートケロス属の藻類の培養液に接種して培養を行う操作を少なくとも1回繰り返す工程を含む、キートケロス属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径0.1μm未満のウイルスを継代培養する方法。
- 培養を、温度15℃、光強度100〜150μmol photons m-2 s-1、明暗周期を与えた条件下で行う請求項5記載の方法。
- キートケロス属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径0.1μm未満のウイルスの懸濁液を-196℃〜20℃に保存することを含む、キートケロス属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径0.1μm未満のウイルスを保存する方法。
- キートケロス属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径0.1μm未満のウイルスを有効成分として含む赤潮防除剤。
- キートケロス属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径0.1μm未満のウイルスを赤潮水域に散布することを含む赤潮防除方法。
- ウイルスを固定化剤に包埋して、ノリ養殖筏に設置あるいはノリ養殖漁場の海底泥中に埋設することにより、ウイルスを赤潮水域に散布する請求項9記載の方法。
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