JP2005537813A - ポリマー表面へのリガンドのクラスターの固定化方法および細胞工学上の利用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、細胞工学用のポリマー表面上に高密度の細胞特異的リガンドを固定化する方法について述べる。この方法は、高密度の官能基を生成する表面グラフト重合方法と、この表面の官能基に細胞特異的リガンドを結合させる化学結合工程を組み合わせる。この表面機能付与方法は、ポリマー製メンブレン、フィルム、繊維、中空繊維、発泡体など、様々な形態のポリマー材に適用することができる。同様に、細胞特異的リガンドを用いて組織工学用足場に機能を付与することができる。
Description
(関連の出願)
本願は、2002年9月6日に「ポリマー表面へのリガンドのクラスターの固定化方法および細胞工学上の利用」の名称で出願された米国仮出願第60/408,789号に関連し、該仮出願に対する優先権を主張するものであって、その全体が本明細書に引用の形で盛り込まれている。
本願は、2002年9月6日に「ポリマー表面へのリガンドのクラスターの固定化方法および細胞工学上の利用」の名称で出願された米国仮出願第60/408,789号に関連し、該仮出願に対する優先権を主張するものであって、その全体が本明細書に引用の形で盛り込まれている。
本発明は、細胞工学および組織工学用ポリマー材の機能付与に関する。本発明は、高密度の細胞特異的リガンドをポリマー材表面に固定化する方法に関する。これらの表面機能化ポリマー材(2次元または3次元;非生分解性または生分解性)は、細胞または組織を技術的に作成する目的で設計される。
急性肝不全(AFL)は、70%もの高い死亡率を有する生命を脅かす疾病であり、米国では、年間3万人を超える死亡者を出している。大部分のALF患者にとって最善の策は肝臓移植であるが、ドナーの深刻な不足がこの方策の広範な適用を阻んでいる(非特許文献1)。生命を脅かす肝臓外の合併症を防止あるいは処置する集中治療の下であれば、さらに生命を維持できる肝機能が残っている患者の何分の1かを回復させることができる。生体機能を与えることはできないが、一時的な肝臓補助システムによって生命を維持するならば再生が可能な肝臓を持つ患者群も存在する。バイオ人工肝補助装置(BLAD)は、そのような補助システムを提供して、ドナーが得られるまで、あるいは悪化した肝臓が再生するまで肝機能を一時的に代替し、患者の生命を維持させることを目的としている。BLADは、3つの主要な構成要素、すなわち、重要な肝臓の表現型を示す細胞と、これら表現型の発現を促進し持続させる足場すなわち基質と、肝細胞と潅流血液との間の生化学反応および生体的輸送を容易にするバイオリアクタとから構成されている(非特許文献2,3)。
肝細胞は足場依存性細胞であるので、効を奏するBLAD構成を決定する要因の一つは、肝細胞の付着と機能維持にとって適切な足場すなわち基質である(非特許文献4)。肝細胞培養用の基質として、コラーゲン(非特許文献5,6)、フィブロネクチン(非特許文献7)、ラミニン(非特許文献8)などの様々な細胞外マトリックス(ECM)タンパク質や、RGD、YIGSR(非特許文献9)などの細胞接着ペプチドが使用されている。肝細胞の付着性および生存能は、これらECMタンパク質で被覆された表面上で組織培養を行うことによって向上させることができる。この向上は、ECMタンパク質内の細胞接着ペプチド(例えば、RGD)と肝細胞表面の受容体インテグリンとの間の相互作用によるものと考えられているが、その機序は依然として不明である。コラーゲンゲルまたはMatrigel(商標)のオーバレイを用いて培養構成を3次元に変更すれば、初代ラット肝細胞の肝機能の維持と寿命を大幅に向上させることができるであろう(非特許文献10)。にもかかわらず、そのようなヒドロゲル系をバイオリアクタ構成に適用することは非常に難題である。
ガラクトシル化された表面は、そのガラクトースリガンドと肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体(ASGP−R)との特異的な相互作用のゆえに、肝細胞培養基質として魅力的な別の選択肢である。いくつかの研究により、固定化されたガラクトースリガンドが肝細胞の付着性向上と、細胞機能の維持を可能にすることが分かっている(非特許文献11−13)。固定化ガラクトースリガンドとしては、ガラクトピラノシル基が固定化されたポリアクリルアミドゲル(11)や、ポリ−N−p−ビニルベンジル−D−ラクトンアミド(PVLA)で被覆されたポリスチレン表面(非特許文献14)などがある。後者のポリスチレン表面は、肝細胞接着性を向上させ、アルブミン合成機能を2週間持続させることが分かっている(非特許文献14)。この効果は、ガラクトシルリガンド(すなわちPVLA)の表面密度に依存していた。低密度のPLVA(0.15nmol/cm2のガラクトースに相当)で被覆された表面は、伸展する形態と低濃度の胆汁酸分泌を発生させる一方、より高密度のPVLA被覆(2.3nmol/cm2のガラクトースに相当)は、丸い形態を維持するとともに、肝細胞凝集体の形成を誘発して、高濃度の胆汁酸分泌と長期の生存能を発現する(非特許文献15,16)。
ツァナカキス(Tzanakakis) ES, ヘス(Hess) DJ, ジーラフ(Sielaff) TD, フー(Hu) WS 「組織工学により作成された体外肝臓補助装置(Extracorporeal tissue engineered liver-assist devices)」アンニュアル・レビュー・オブ・バイオメディカル・エンジニアリング(Annu Rev Biomed Eng) 2000; 2:607-632 アレン(Allen) JW, ハッサネイン(Hassanein) T, バーティア(Bhatia) SN「バイオ人工肝臓装置の進歩(Advances in bioartificial liver devices)」ヘパトロジー(Hepatology) 2001; 34(3):447-455 ザウアー(Sauer) IM, オーベルメイヤー(Obermeyer) N, カルダッシス(Kardassis) D, テルヴァス(Theruvath) T, ガーラック(Gerlach) JC「ハイブリッド型肝臓補助システムの開発(Development of a hybrid liver support system)」アナルズ・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(Ann NY Acad Sci) 2001; 944:308-19 ル・クリュイズ(Le Cluyse) EL, ブロック(Bullock) PL, パーキンソン(Parkinson) A「ラット肝細胞の長期培養における正常な肝構造および肝機能の修復と維持に関する手法(Strategies for restoration and maintenance of normal hepatic structure and function in long-term cultures of rat hepatocytes)」アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ(Adv Drug Deliv Rev) 1996; 22:133-186 タグチ(Taguchi) K, マツシタ(Matsushita) M, タカハシ(Takahashi) M, ウチノ(Uchino) J「コラーゲンゲル2層間でサンドイッチ培養された肝細胞を有する人工肝の開発(Development of a bioartificial liver with sandwiched-cultured hepatocytes between two collagen gel layers)」アーティフィシャル・オーガンズ(Artif Organs) 1996; 20(2):178-185 ダン(Dunn) JC, ヤルムシュ(Yarmush) ML, ケーベ(Koebe) HG, トンプキンス(Tompkins) RG「肝細胞機能および細胞外マトリックス形状(Hepatocyte function and extracellular matrix geometry): サンドイッチ構造での長期培養(long-term culture in a sandwich configuration)」ザ・FASEB・ジャーナル(FASEB J) 1989; 3(2):174-177 サンチェス(Sanchez) A, アルヴァレス(Alvarez) AM, パガン(Pagan) R, ロンセロ(Roncero) C, ヴィラーロ(Vilaro) S, ベニート(Benito) M, ファブレガ(Fabregat) I「フィブロネクチンは初代培養のラット胎児肝細胞の形態、細胞組織化および遺伝子発現を調節する(Fibronectin regulates morphology, cell organization and gene expression of rat fetal hepatocytes in primary culture.)」ジャーナル・オブ・ヘパトロジー(J Hepatol) 2000; 32(2):242-250 オダ(Oda) H, ノザワ(Nozawa) K, ヒトミ(Hitomi) Y, カキヌマ(Kakinuma) A「ラミニンリッチな細胞外マトリックスはラット肝細胞培養において高濃度の肝細胞核因子4を維持する(Laminin-rich extracellular matrix maintains high level of hepatocyte nuclear factor 4 in rat hepatocyte culture.)」バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem Biophys Res Commun) 1995; 212(3):800-805 カーライル(Carlisle) ES, マリアッパン(Mariappan) MR, ネルソン(Nelson) KD, トーメス(Thomes) BE, ティモンズ(Timmons) RB, コンスタンチネスキュ(Constantinescu) A, エバーハート(Eberhart) RC, バンケイ(Bankey) PE「パルス状プラズマ堆積とポリエチレングリコールのカップリングによる肝細胞接着の向上(Enhancing hepatocyte adhesion by pulsed plasma deposition and polyethylene glycol coupling)」ティッシュ・エンジニアリング(Tissue Eng) 2000; 6(1):45-52 モーグ(Moghe) PV, ベルティオーメ(Berthiaume) F, エゼル(Ezzell) RM, トナー(Toner) M, トンプキンス(Tompkins) RG, ヤルムシュ(Yarmush) ML「肝細胞の極性と機能の維持における培養マトリックスの構成と組成(Culture matrix configuration and composition in the maintenance of hepatocyte polarity and function)」バイオマテリアルズ(Biomaterials) 1996; 17(3):373-385 ワイゲル(Weigel) PH「ラット肝細胞はアシアロ糖タンパク質受容体のパッチを介して合成ガラクトシド表面に結合する(Rat hepatocytes bind to synthetic galactoside surfaces via a patch of asialoglycoprotein receptors.)」ザ・ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J Cell Biol) 1980; 87(3 Pt 1):855-861 コバヤシ(Kobayashi) A, コバヤシ(Kobayashi) K, アカイケ(Akaike) T「基層としてラクトース担持ポリスチレンを用いた肝実質細胞の接着と分離の制御(Control of adhesion and detachment of parenchymal liver cells using lactose-carrying polystyrene as substratum)」ジャーナル・オブ・バイオマテリアル・サイエンス・ポリマー・エディション(J Biomater Sci Polym Ed) 1992; 3(6):499-508 ヤン(Yang) J, ゴトウ(Goto) M, イセ(Ise) H, チョー(Cho) CS, アカイケ(Akaike) T「肝細胞捕捉用足場としてのガラクトシル化アルギン酸塩(Galactosylated alginate as a scaffold for hepatocytes entrapment)」バイオマテリアルズ(Biomaterials) 2002; 23(2):471-479 トベ(Tobe) S, タケイ(Takei) Y, コバヤシ(Kobayashi) K, アカイケ(Akaike) T「アシアロ糖タンパク質モデルポリマー上での初代培養ラット肝細胞の組織再構成(Tissue reconstruction in primary cultured rat hepatocytes on asialoglycoprotein model polymer)」アーティフィシャル・オーガンズ(Artif Organs) 1992; 16(5):526-532 コバヤシ(Kobayashi) A, ゴトウ(Goto) M, セキネ(Sekine) T, マスモト(Masumoto) A, ヤマモト(Yamamoto) N, コバヤシ(Kobayashi) K, アカイケ(Akaike) T「ラクトース担持ポリスチレンによるラット肝細胞の分化および増殖の調節(Regulation of differentiation and proliferation of rat hepatocytes by lactose-carrying polystyrene)」アーティフィシャル・オーガンズ(Artif Organs) 1992; 16(6):564-567 コバヤシ(Kobayashi) A, ゴトウ(Goto) M, コバヤシ(Kobayashi) K, アカイケ(Akaike) T「受容体を介在させた、アシアロ糖タンパク質の合成ポリマーモデルによる肝細胞の分化および増殖の調節(Receptor-mediated regulation of differentiation and proliferation of hepatocytes by synthetic polymer model of asialoglycoprotein)」ジャーナル・オブ・バイオマテリアル・サイエンス・ポリマー・エディション(J Biomater Sci Polym Ed) 1994; 6(4):325-342
ツァナカキス(Tzanakakis) ES, ヘス(Hess) DJ, ジーラフ(Sielaff) TD, フー(Hu) WS 「組織工学により作成された体外肝臓補助装置(Extracorporeal tissue engineered liver-assist devices)」アンニュアル・レビュー・オブ・バイオメディカル・エンジニアリング(Annu Rev Biomed Eng) 2000; 2:607-632 アレン(Allen) JW, ハッサネイン(Hassanein) T, バーティア(Bhatia) SN「バイオ人工肝臓装置の進歩(Advances in bioartificial liver devices)」ヘパトロジー(Hepatology) 2001; 34(3):447-455 ザウアー(Sauer) IM, オーベルメイヤー(Obermeyer) N, カルダッシス(Kardassis) D, テルヴァス(Theruvath) T, ガーラック(Gerlach) JC「ハイブリッド型肝臓補助システムの開発(Development of a hybrid liver support system)」アナルズ・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(Ann NY Acad Sci) 2001; 944:308-19 ル・クリュイズ(Le Cluyse) EL, ブロック(Bullock) PL, パーキンソン(Parkinson) A「ラット肝細胞の長期培養における正常な肝構造および肝機能の修復と維持に関する手法(Strategies for restoration and maintenance of normal hepatic structure and function in long-term cultures of rat hepatocytes)」アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ(Adv Drug Deliv Rev) 1996; 22:133-186 タグチ(Taguchi) K, マツシタ(Matsushita) M, タカハシ(Takahashi) M, ウチノ(Uchino) J「コラーゲンゲル2層間でサンドイッチ培養された肝細胞を有する人工肝の開発(Development of a bioartificial liver with sandwiched-cultured hepatocytes between two collagen gel layers)」アーティフィシャル・オーガンズ(Artif Organs) 1996; 20(2):178-185 ダン(Dunn) JC, ヤルムシュ(Yarmush) ML, ケーベ(Koebe) HG, トンプキンス(Tompkins) RG「肝細胞機能および細胞外マトリックス形状(Hepatocyte function and extracellular matrix geometry): サンドイッチ構造での長期培養(long-term culture in a sandwich configuration)」ザ・FASEB・ジャーナル(FASEB J) 1989; 3(2):174-177 サンチェス(Sanchez) A, アルヴァレス(Alvarez) AM, パガン(Pagan) R, ロンセロ(Roncero) C, ヴィラーロ(Vilaro) S, ベニート(Benito) M, ファブレガ(Fabregat) I「フィブロネクチンは初代培養のラット胎児肝細胞の形態、細胞組織化および遺伝子発現を調節する(Fibronectin regulates morphology, cell organization and gene expression of rat fetal hepatocytes in primary culture.)」ジャーナル・オブ・ヘパトロジー(J Hepatol) 2000; 32(2):242-250 オダ(Oda) H, ノザワ(Nozawa) K, ヒトミ(Hitomi) Y, カキヌマ(Kakinuma) A「ラミニンリッチな細胞外マトリックスはラット肝細胞培養において高濃度の肝細胞核因子4を維持する(Laminin-rich extracellular matrix maintains high level of hepatocyte nuclear factor 4 in rat hepatocyte culture.)」バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem Biophys Res Commun) 1995; 212(3):800-805 カーライル(Carlisle) ES, マリアッパン(Mariappan) MR, ネルソン(Nelson) KD, トーメス(Thomes) BE, ティモンズ(Timmons) RB, コンスタンチネスキュ(Constantinescu) A, エバーハート(Eberhart) RC, バンケイ(Bankey) PE「パルス状プラズマ堆積とポリエチレングリコールのカップリングによる肝細胞接着の向上(Enhancing hepatocyte adhesion by pulsed plasma deposition and polyethylene glycol coupling)」ティッシュ・エンジニアリング(Tissue Eng) 2000; 6(1):45-52 モーグ(Moghe) PV, ベルティオーメ(Berthiaume) F, エゼル(Ezzell) RM, トナー(Toner) M, トンプキンス(Tompkins) RG, ヤルムシュ(Yarmush) ML「肝細胞の極性と機能の維持における培養マトリックスの構成と組成(Culture matrix configuration and composition in the maintenance of hepatocyte polarity and function)」バイオマテリアルズ(Biomaterials) 1996; 17(3):373-385 ワイゲル(Weigel) PH「ラット肝細胞はアシアロ糖タンパク質受容体のパッチを介して合成ガラクトシド表面に結合する(Rat hepatocytes bind to synthetic galactoside surfaces via a patch of asialoglycoprotein receptors.)」ザ・ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J Cell Biol) 1980; 87(3 Pt 1):855-861 コバヤシ(Kobayashi) A, コバヤシ(Kobayashi) K, アカイケ(Akaike) T「基層としてラクトース担持ポリスチレンを用いた肝実質細胞の接着と分離の制御(Control of adhesion and detachment of parenchymal liver cells using lactose-carrying polystyrene as substratum)」ジャーナル・オブ・バイオマテリアル・サイエンス・ポリマー・エディション(J Biomater Sci Polym Ed) 1992; 3(6):499-508 ヤン(Yang) J, ゴトウ(Goto) M, イセ(Ise) H, チョー(Cho) CS, アカイケ(Akaike) T「肝細胞捕捉用足場としてのガラクトシル化アルギン酸塩(Galactosylated alginate as a scaffold for hepatocytes entrapment)」バイオマテリアルズ(Biomaterials) 2002; 23(2):471-479 トベ(Tobe) S, タケイ(Takei) Y, コバヤシ(Kobayashi) K, アカイケ(Akaike) T「アシアロ糖タンパク質モデルポリマー上での初代培養ラット肝細胞の組織再構成(Tissue reconstruction in primary cultured rat hepatocytes on asialoglycoprotein model polymer)」アーティフィシャル・オーガンズ(Artif Organs) 1992; 16(5):526-532 コバヤシ(Kobayashi) A, ゴトウ(Goto) M, セキネ(Sekine) T, マスモト(Masumoto) A, ヤマモト(Yamamoto) N, コバヤシ(Kobayashi) K, アカイケ(Akaike) T「ラクトース担持ポリスチレンによるラット肝細胞の分化および増殖の調節(Regulation of differentiation and proliferation of rat hepatocytes by lactose-carrying polystyrene)」アーティフィシャル・オーガンズ(Artif Organs) 1992; 16(6):564-567 コバヤシ(Kobayashi) A, ゴトウ(Goto) M, コバヤシ(Kobayashi) K, アカイケ(Akaike) T「受容体を介在させた、アシアロ糖タンパク質の合成ポリマーモデルによる肝細胞の分化および増殖の調節(Receptor-mediated regulation of differentiation and proliferation of hepatocytes by synthetic polymer model of asialoglycoprotein)」ジャーナル・オブ・バイオマテリアル・サイエンス・ポリマー・エディション(J Biomater Sci Polym Ed) 1994; 6(4):325-342
最適のBLAD性能を得るためには、高親和性の接着と高密度の細胞培養を容易にする高ガラクトースリガンド密度の基質を作成することが課題である。
この研究課題において、発明者らは、ポリアクリル酸(PAA)グラフト技術を用いて高密度の固定化ガラクトースリガンドを実現する表面改質方法を開発した(図1)。ガラクトースの結合と表面固定化ガラクトースリガンドの結合活性とが特徴づけられた。高密度の肝細胞培養物を用いて、肝細胞の付着性、形態および機能に対する表面ガラクトース部分の効果をコラーゲン被覆基質と比較して調査した。
本発明は、ポリマー表面に高密度の細胞特異的リガンドを固定化する2つの方法について述べており、第1の固定化方法は以下の3つの工程を備えている。すなわち、
(1)まず、2次元または3次元構造の形状のポリマー材(例えば、フィルム、シート、メンブレン、繊維、中空繊維、フォーム、織物、編物、組物など)を(アルゴン、酸素、アンモニアなどの状態下での)プラズマ処理、オゾン処理または紫外線照射などによって活性化し、表面にフリーラジカル(遊離基)または官能基を生成する。
(1)まず、2次元または3次元構造の形状のポリマー材(例えば、フィルム、シート、メンブレン、繊維、中空繊維、フォーム、織物、編物、組物など)を(アルゴン、酸素、アンモニアなどの状態下での)プラズマ処理、オゾン処理または紫外線照射などによって活性化し、表面にフリーラジカル(遊離基)または官能基を生成する。
(2)これら予め活性化された表面をモノマー溶液と反応させ、ポリマー鎖にカルボキシル基、アミノ基、水酸基、スルフヒドリル基などの官能基をグラフトする。第1の工程中に生成された表面上のフリーラジカルまたは官能基は、グラフト重合の開始剤となる。
(3)第2の工程で生成された官能基に、特定細胞種用のリガンドを化学結合によって結合させる。リガンドの結合のために、リガンド上またはポリマー表面上の官能基に応じて様々な化学反応を利用することが可能である。
第2の方法は2つの工程を備えている。すなわち、
(1)(官能基、例えば、カルボキシル基やアミノ基を有する)ポリマー鎖を紫外線開始反応によりポリマー表面に直接グラフトする。例えば、PETメンブレンをアクリル酸溶液(0.01%ないし10%)に浸漬し、5ないし10分間紫外線照射にさらした後、水で十分に洗浄する。
(1)(官能基、例えば、カルボキシル基やアミノ基を有する)ポリマー鎖を紫外線開始反応によりポリマー表面に直接グラフトする。例えば、PETメンブレンをアクリル酸溶液(0.01%ないし10%)に浸漬し、5ないし10分間紫外線照射にさらした後、水で十分に洗浄する。
(2)第1の工程で生成された官能基に、肝細胞に特異的なリガンドを化学結合によって結合させる。リガンドの結合のために、リガンド上またはポリマー表面上の官能基に応じて様々な化学反応を利用することが可能である。通常は、EDCカップリング反応を用いて、機能付与された表面にリガンドを結合させる。
肝細胞に特異的な生体機能的基質および足場を利用するには、足場/基質の肝細胞(初代肝細胞または肝細胞系)を最適の培地(無血清培地または血清含有培地)で培養することが必要である。
以下の例が示すように、ガラクトースリガンド結合方法と併せてポリアクリル酸(PAA)グラフト技術を用いることにより、表面リガンド密度が高くかつリガンド移動度が高い肝細胞特異的表面を作成することに成功した。そのようなガラクトシル化PET基質は、効率的な細胞付着を支援するとともに、肝細胞凝集体の形成を誘発した。この生体機能基質上で培養された肝細胞のアルブミン合成機能は、コラーゲン被覆表面上でのそれに比べてよく維持されていた。この研究により、肝臓組織工学において、特にバイオ人工肝補助装置の設計に対して、肝細胞特異的生体機能基質を利用することが可能であることが示された。
細胞外マトリックスは、肝細胞の表現型維持において重要な役割を果たすことが分かっている(文献17,18参照)。コラーゲン被覆表面(文献19参照)とガラクトース含有ポリマー(PVLA)被覆表面(非特許文献15参照)は、劇的に異なる細胞挙動を発生させた。コラーゲン被膜上に培養された肝細胞は平坦な形状の単分子層を形成したが、PVLA被膜は丸い形態と凝集体の形成を促した。これらの研究は、恐らくは相対的に低い表面リガンド密度のゆえに、相対的に低い細胞接種密度を用いて実行された。本稿は、基質表面上にはるかに多量のリガンドをもたらす表面改質方法を提供した。この方法は、PETフィルム表面にPAA鎖をグラフトする表面プラズマ処理と、その後のガラクトースリガンドの結合を伴った。
グラフト重合は、材料表面を改質するのに有効な手法である(文献20参照)。グラフト重合は、表面に機能を付与して材料の生体適合性を向上させるために広く利用されている。グラフト重合手法は、改質の程度を自由に調節することも可能にする。本研究では、表面にPAAグラフト化によって大量のカルボキシル基を導入するように、条件が最適化された。このことは、ひいては、ガラクトースリガンドの表面密度を高密度(0.513μmol/cm2)にすることになった。最大リガンド密度は、ポリスチレン表面へのPVLA被覆によって達成される密度(2.3nmol/cm2のガラクトース密度)よりも約220倍高かった。
この構成では、PAA鎖は、結合されたリガンドに高い移動性を付与するスペーサの働きもする。この特徴は、高いリガンド密度と相まって、FITC−レクチン結合実験が示すように、表面結合リガンドの結合親和性を高くすることになった。ラットのアシアロ糖タンパク質受容体など、レクチンは、3種類のサブユニットと多数の結合部位からなる、糖質リガンドを特異的に結合させるタンパク質である。研究により、糖質とレクチンとの結合親和性が、クラスター化された多重結合により、一価の態様に比べて数桁分増大することが明らかになっている(文献21,22参照)。発明者らは、高濃度のガラクトースと高移動度の表面ガラクトースリガンドがそのようなリガンドクラスターを表面上に多数発生させることになり、したがって、肝細胞の高い付着性を仲介することができる(文献23参照)という仮説を立てた。この仮説は、ガラクトシル化されたPETフィルムとFITC−レクチンとの間の結合が、溶液中の超過量(150倍)の遊離ガラクトースによって大きくは阻害され得ないことを示す結果によって支持される。
肝細胞の凝集体形成と機能維持は、リガンド密度に依存する(図6)。PET-Gal表面に対する肝細胞付着効率は、表面リガンド密度とともに上昇し、コラーゲン被覆表面上の肝細胞付着効率と同じの78%の横ばい状態(ガラクトース密度>47nmol/cm2)に達した。リガンド密度が9nmol/cm2を超えると広範囲の凝集体形成が明白になる一方で、約48nmol/cm2の表面リガンド密度のときは、尿素合成機能が上記横ばい状態に達した。スフェロイド形成に付随して、リガンド密度が高い(47.5ないし513nmol/cm2)基質に付着した肝細胞のほうが、リガンド密度が低い表面に付着した肝細胞よりも尿素合成機能が高かった。
このリガンド固定化方法は、多数の細胞工学および組織工学用途に広く利用して、細胞特異的リガンドを所望の密度で結合させることができる。この手法が一般性をもつことは、この方式を様々なポリマー材、生分解性および非生分解性ポリマーに2次元構成にも3次元構成にも広く適用可能であることを意味している。別の材料の一例は、生分解性ポリマーであるε−カルプロラクトン(carprolactone)・エチレンエチルフォスフェイト共重合体(P(CL−co−EEP))である。ガラクトシル化PET基質と同様に、ガラクトシル化P(CL−co−EEP)基質は、未改質の基質の細胞付着率(50.4%)よりもはるかに高い細胞付着率(90.2%)を示した。コラーゲンが被覆されたP(CL−co−EEP)メンブレンは、81.7%の細胞付着率を示した。ガラクトシル化P(CL−co−EEP)基質上で培養された肝細胞は、未改質表面上での3日目の飛散状の接着性とは対照的に、スフェロイドを形成した(図7)。コラーゲン被覆メンブレンは、予想通り、単分子層の形成を促した。
細胞−基質間相互作用は、多数の組織工学システムで細胞の挙動を調節する際の主要なパラメータである。基質による肝細胞の挙動調節の機序を理解することは、最適の肝細胞機能を維持するのに適した足場の設計にとってきわめて重要である。本稿において説明した化学的に特定の基質は、機序の研究にとって優れたモデルとなるであろう。そして、この細胞−基質間相互作用に関与する様々な因子、例えば、リガンドの種類、リガンド密度および多数のリガンドによる相乗効果を体系的に評価することを可能にするであろう。
以下の実施例は、実例として示されたものであり、いかようにも本発明を限定することを意図したものではない。
実施例1.ポリエチレンテレフタレート(PET)メンブレン表面への高密度ガラクトースリガンドの固定化(図1)
グッドフェロー(Goodfellow)社(英国)から厚さ100μmのPETフィルムを購入した。メルク(Merck)社(ドイツ)からアクリル酸(AAc)とガラクトースを購入した。ピアス(Pierce)社(米国)からN−ヒドロキシスクシニミド(Sulfo-NHS)を購入した。特に明記しない限り、シグマ−アルドリッチ(Sigma-Aldrich)社からその他全ての化学物質を購入した。
グッドフェロー(Goodfellow)社(英国)から厚さ100μmのPETフィルムを購入した。メルク(Merck)社(ドイツ)からアクリル酸(AAc)とガラクトースを購入した。ピアス(Pierce)社(米国)からN−ヒドロキシスクシニミド(Sulfo-NHS)を購入した。特に明記しない限り、シグマ−アルドリッチ(Sigma-Aldrich)社からその他全ての化学物質を購入した。
ポリアクリル酸(PAAc)によるPET表面グラフト化
PETフィルムを寸法2.5cmx5cmの小片に切り分け、超音波水槽内で5分間アルコール洗浄した。これらPETフィルムを石英製円筒形グロー放電セル(米国アナテック社(Anatech Ltd.)Model SP100)の平行な2枚の電極板の間に配置し、0.5Torrのアルゴンガス圧力下で30秒間グロー放電にさらした。プラズマパワーと無線周波数をそれぞれ30Wと40kHzに維持した。その後、アルゴンプラズマで処理したPETフィルムを30分間酸素ガスにさらし、パイレックス(登録商標)ガラス管内で、10容積%のアクリル酸(AAc)を含む水溶液30mLに浸漬した。AAc溶液をアルゴンを用いて30分間十分に脱気し、アルゴン雰囲気下で密封した。反応混合物をロータリー光化学反応装置(千葉県の理工科学産業株式会社製Riko RH400-10W)の100W高圧水銀ランプを用いて30分間紫外線照射にさらした。水槽を用いて反応温度を25℃に維持した。グラフト重合後、PETフィルムをガラス管から取り出し、ソックスレー抽出装置内で十分に水洗いした。
PETフィルムを寸法2.5cmx5cmの小片に切り分け、超音波水槽内で5分間アルコール洗浄した。これらPETフィルムを石英製円筒形グロー放電セル(米国アナテック社(Anatech Ltd.)Model SP100)の平行な2枚の電極板の間に配置し、0.5Torrのアルゴンガス圧力下で30秒間グロー放電にさらした。プラズマパワーと無線周波数をそれぞれ30Wと40kHzに維持した。その後、アルゴンプラズマで処理したPETフィルムを30分間酸素ガスにさらし、パイレックス(登録商標)ガラス管内で、10容積%のアクリル酸(AAc)を含む水溶液30mLに浸漬した。AAc溶液をアルゴンを用いて30分間十分に脱気し、アルゴン雰囲気下で密封した。反応混合物をロータリー光化学反応装置(千葉県の理工科学産業株式会社製Riko RH400-10W)の100W高圧水銀ランプを用いて30分間紫外線照射にさらした。水槽を用いて反応温度を25℃に維持した。グラフト重合後、PETフィルムをガラス管から取り出し、ソックスレー抽出装置内で十分に水洗いした。
1−O−(6´−アミノヘキシル)−D−ガラクトピラノシド(AHG)の合成
ガラクトースリガンドAHGを、文献24,25で報告されている手順をわずかに変更して合成した。
ガラクトースリガンドAHGを、文献24,25で報告されている手順をわずかに変更して合成した。
AHGとPAAグラフト化PETフィルムとの結合
PAAグラフト化PETフィルムを直径15mmの円板状に切り分けた。各円板を、2mgAFGおよび1mgSulfo-NHSを含むリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH7.0、1mL)に浸漬した。各ウェルにそれぞれ異なる量の1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミドヒドロクロリド)(EDC)を添加し、混合物を3日間反応させた。カップリング効率を最適化するため、(A)反応開始時に50mg/mL、(B)反応開始時に30mg/mL、(C)3日間毎日10mg/mL、(D)3日間毎日20mg/mLのそれぞれ異なるEDC添加態様を検査した。
PAAグラフト化PETフィルムを直径15mmの円板状に切り分けた。各円板を、2mgAFGおよび1mgSulfo-NHSを含むリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH7.0、1mL)に浸漬した。各ウェルにそれぞれ異なる量の1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミドヒドロクロリド)(EDC)を添加し、混合物を3日間反応させた。カップリング効率を最適化するため、(A)反応開始時に50mg/mL、(B)反応開始時に30mg/mL、(C)3日間毎日10mg/mL、(D)3日間毎日20mg/mLのそれぞれ異なるEDC添加態様を検査した。
カルボキシル基密度の測定
表面積3mm2の改質PETフィルムの試料を、トルイジン青O(TBO)の0.1mM水酸化ナトリウム(pH10)溶液1mL(0.5mM)で室温で5時間絶えず振盪させながら培養した。超過量の0.1mM水酸化ナトリウム溶液で洗浄することによって未複合化染料を除去した。サンプルを50%酢酸溶液1mL中で10分間振盪させながら培養させることによって、PETフィルム上で複合化したTBOを表面から脱離させた。酢酸溶液中のTBO濃度を、ベックマン分光光度計DU640Bを用いて633nmにおける光学密度で測定した。表面上のカルボキシル基密度は、TBOがカルボキシル酸と1対1の比で複合化すると想定することによって(文献26参照)、複合化TBOの含有量から算出された。
表面積3mm2の改質PETフィルムの試料を、トルイジン青O(TBO)の0.1mM水酸化ナトリウム(pH10)溶液1mL(0.5mM)で室温で5時間絶えず振盪させながら培養した。超過量の0.1mM水酸化ナトリウム溶液で洗浄することによって未複合化染料を除去した。サンプルを50%酢酸溶液1mL中で10分間振盪させながら培養させることによって、PETフィルム上で複合化したTBOを表面から脱離させた。酢酸溶液中のTBO濃度を、ベックマン分光光度計DU640Bを用いて633nmにおける光学密度で測定した。表面上のカルボキシル基密度は、TBOがカルボキシル酸と1対1の比で複合化すると想定することによって(文献26参照)、複合化TBOの含有量から算出された。
X線光電子分光法(XPS)
一定持続時間100ms、パスエネルギー40eVの単色型AlK線のX線光源(1486.6eVフォトン)を有するクレイトス(Kratos)社製AXIS His分光計により、XPS計測を行った。陽極電流は15mAであった。分析チャンバ内の圧力は、計測毎に5.0x10-8Torrに維持された。
一定持続時間100ms、パスエネルギー40eVの単色型AlK線のX線光源(1486.6eVフォトン)を有するクレイトス(Kratos)社製AXIS His分光計により、XPS計測を行った。陽極電流は15mAであった。分析チャンバ内の圧力は、計測毎に5.0x10-8Torrに維持された。
結果
PETフィルムは、最初に低温プラズマによって処理され、続いて酸素に暴露されることにより、PETメンブレン表面に過酸化物基が導入された。紫外線光の下で、過酸化物基を活性化させてラジカル開始中心を形成し、それにより、その後、AAcのグラフト重合が開始された。PAAグラフト化の程度は、プラズマ処理のパワーと持続時間、紫外線処理の強度と持続時間、およびアクリル酸溶液の濃度によって調節された。最適化された条件下では、トルイジン青O染色によって測定されたとおり、PAAグラフト化PETフィルム上で、530nmol/cm2(38.7μg/cm2)の平均カルボキシル基密度が達成された。
PETフィルムは、最初に低温プラズマによって処理され、続いて酸素に暴露されることにより、PETメンブレン表面に過酸化物基が導入された。紫外線光の下で、過酸化物基を活性化させてラジカル開始中心を形成し、それにより、その後、AAcのグラフト重合が開始された。PAAグラフト化の程度は、プラズマ処理のパワーと持続時間、紫外線処理の強度と持続時間、およびアクリル酸溶液の濃度によって調節された。最適化された条件下では、トルイジン青O染色によって測定されたとおり、PAAグラフト化PETフィルム上で、530nmol/cm2(38.7μg/cm2)の平均カルボキシル基密度が達成された。
PET表面上のカルボキシル基に対してガラクトース部分を結合させるため、アミノヘキシル基がガラクトース環のC1位に結合されたガラクトース誘導体を用いた。このAHG誘導体は、ガラクトシル基とPAA鎖上の結合点との間に短いスペーサを生成することによって、結合反応を容易にするとともに、リガンドの細胞受容体への接近容易性を高めた。AHGの末端アミノ基は、標準的なEDC化学反応により、表面上のカルボキシル基と結合された(文献27参照)。この縮合反応は、Sulfo-NHSの助けを借りて実行された。EDCは、水溶液中で急速に失活する(文献28参照)。Sulfo-NHSが添加されることにより、活性エステル中間体の安定性が増し、最終的に結合効率が向上した。結合効率は、反応の前後の表面のカルボキシル量の変化を分析することによって求められた。カップリング条件を最適化するとともに、最大結合効率を達成するため、EDCをそれぞれ異なる態様で反応溶液に添加した。すなわち、3日間にわたって3回の割当て分を添加する場合と、反応の開始時に一度の供給で添加する場合である。AHG結合効率の結果を図2に示した。AHGの濃度と添加の態様は、その結合効率に大きな影響を及ぼした。EDC濃度50mg/mLでは、1日間の反応後に表面カルボキシル基の転換率が62%であったのに対して、EDC濃度10mg/mLでは、わずか24%の転換率しか得られなかった。1日を超えて反応時間をさらに増やしても、表面カルボキシル基の転換率は向上しなかった。20mgのEDCが反応溶液(1mL)に3日間毎日添加された場合に、最大カップリング効率(97%)が達成された。ガラクトシル化PETフィルム上のカルボキシル量は、この条件下では、わずか17nmol/cm2であった。これは、表面上のガラクトースリガンド513nmol/cm2に相当する。
実施例2.表面結合ガラクトシル基のFITC−レクチンとの結合親和性
表面積3mm2のPETフィルムの試料を(シカクマメ(psophocarpus tetragonolobus)250μg/mL由来の)FITC−レクチン溶液250μLで37℃で1時間培養した。試料を十分に水洗いし、オリンパス社製FLUOVIEW共焦点顕微鏡(εex488nm)で観察した。それと並行する実験では、改質PETフィルムを培養する前に、FITC−レクチン溶液に遊離ガラクトースを添加し、5mg/mLの最終濃度をもたらした。
表面積3mm2のPETフィルムの試料を(シカクマメ(psophocarpus tetragonolobus)250μg/mL由来の)FITC−レクチン溶液250μLで37℃で1時間培養した。試料を十分に水洗いし、オリンパス社製FLUOVIEW共焦点顕微鏡(εex488nm)で観察した。それと並行する実験では、改質PETフィルムを培養する前に、FITC−レクチン溶液に遊離ガラクトースを添加し、5mg/mLの最終濃度をもたらした。
FITC−レクチンを用いて、表面結合ガラクトースリガンドの結合活性を確認した。この研究で使用されたレクチンは、シカクマメ(psophocarpus tetragonolobus)由来であり、ガラクトースまたはN−アセチル−D−ガラクトサミンに特異的に結合することができた。その結合を共焦点蛍光顕微鏡で視覚化するため、FITCで標識したレクチンを用いた。それぞれ異なるPETフィルム(未改質のもの、PAAグラフト化されたものおよびガラクトシル化されたもの)をFITC−レクチンで37℃で1時間培養し、観察前に十分に洗浄した。これらのフィルムの共焦点蛍光画像から、ガラクトシル化PETフィルムが高いFITC蛍光発光を示す一方、未改質PETフィルムおよびPAAグラフト化PETフィルムは顕著な蛍光発光を全く示さないことが分かった。
表面結合ガラクトースリガンドとFITC−レクチンとの間の結合親和性を評価するため、レクチン溶液に添加された遊離ガラクトースを用いて競合実験を実施した。ガラクトシル化PETフィルムを、未改質PETフィルム上の遊離ガラクトースリガンド量の150倍に相当する5mg/mLの遊離ガラクトースとともにFITC−レクチンで培養した。遊離ガラクトースの存在下でFITC−レクチンで培養したガラクトシル化PETフィルムの蛍光画像は、遊離ガラクトースが存在しない中でFITC−レクチンで培養したガラクトシル化PETフィルムの蛍光画像と比較して、蛍光強度の低下が全く示されなかった。この競合的な結合反応は、FITC−レクチンで培養した未改質PETメンブレンおよびPAAグラフト化PETメンブレンを用いた並行する試験では、そのメンブレン上に極わずかな蛍光発光しか発生させなかったことから、FITC−レクチンまたはFITC−レクチン/ガラクトース複合体の吸着の結果であるとは言えないであろう。この結果は、表面結合ガラクトースリガンドが、可溶性ガラクトースよりもはるかに高い受容体に対する結合親和性を有していることを示した。
実施例3.それぞれ異なる表面で培養された肝細胞の付着率および形態
体重250ないし300gの雌ウィスタ(Wister)ラットから、上述した2段階原位置コラゲナーゼ潅流(文献29参照)により肝細胞を採取した。NIHの「実験動物の管理と使用に関する指針(NIH guidelines for the care and use of laboratory animals)(NIH広報No.85-23 Rev. 1985)」を順守した。トリパンブルー除去術を用いて肝細胞生存率を90ないし95%であると測定した。
体重250ないし300gの雌ウィスタ(Wister)ラットから、上述した2段階原位置コラゲナーゼ潅流(文献29参照)により肝細胞を採取した。NIHの「実験動物の管理と使用に関する指針(NIH guidelines for the care and use of laboratory animals)(NIH広報No.85-23 Rev. 1985)」を順守した。トリパンブルー除去術を用いて肝細胞生存率を90ないし95%であると測定した。
未改質および改質PETフィルムを直径15mmの円板状に切り分け、24ウェル組織培養プレートの各ウェルに5ないし10μLのクロロフォルムで固定させた。70%エタノールで3時間培養し、PBSで3度洗浄することにより、プレートを殺菌した。コラーゲン被覆表面を対照として使用し、各ウェルに0.5mLコラーゲン溶液(PBS中に0.5mg/mL)を入れ、プレートを4℃で一晩放置することにより調製した。各ウェル内の溶液を吸引し、ウェルをPBSで3度洗浄した。
細胞付着率測定に、5種類の表面、すなわち、組織培養ポリスチレン(TCPS)、コラーゲン被覆TCPS、未改質PET、PAAグラフト化PETおよびガラクトース固定化PETを使用した。抽出したばかりの肝細胞を、BSA1mg/mL、ペニシリン100単位/mLおよびストレプトマイシン100μg/mLが補足されたWilliam’s Eagle培地に1.2x106細胞個/mLの密度で懸濁させ、上記それぞれ異なる表面にウェルあたり300μLで分注した。これにより、2x105細胞個/cm2の表面細胞培養密度を得た。細胞を5%CO2の加湿された培養器内で培養した。1時間後、未付着の細胞を含んだ培地を吸引した。未付着の肝細胞の数を血球計で測定した。表面上の付着肝細胞数と接種密度から細胞付着率を算出した。その結果を図3に示した。37℃で1時間の培養後、肝細胞は、TCPSおよび未改質PET表面に対して15%未満の付着率で低い親和性を示した。PAAグラフト化PET表面は、TCPSおよびPETメンブレンよりも高い細胞付着率(39%)を示した。対照的に、ガラクトース化PET表面上の細胞付着率は、PAA結合PET表面上の細胞付着率の2倍(80%)であり、コラーゲン被覆TCPS上の細胞付着率(84%)に匹敵していた。それぞれ異なる表面に付着させた肝細胞を、BSA1mg/mL、EGF10ng/mL、インシュリン0.5μg/mL、デキサメタゾン5nM、リノール酸50ng/mL、ペニシリン100単位/mLおよびストレプトマイシン100μg/mLが補足されたWilliam’s Eagle培地で6日間培養した。培地は、毎日補充された。採取された培地を10分間14,000rpmで遠心分離にかけ、その上澄みをアルブミンアッセイのために20℃で保存した。様々な培養時点で、これら基質上の肝細胞の形態を位相差光学系を備えた倒立顕微鏡(カールツァイス社製)で観察し、デジタルカメラで記録した。
それぞれ異なる表面で培養された肝細胞は、それぞれ異なる形態を示した(図4)。細胞接種2時間後に、PAAグラフト化PETフィルムおよびガラクトシル化PETフィルム上の肝細胞が丸い形態を維持する一方で、コラーゲン被覆TCPS上に付着された肝細胞はこの時点で伸展を開始した。1日間の培養後、PAAグラフト化PETフィルムおよびガラクトシル化PETフィルム上の肝細胞は、それぞれ異なる形態をとった。ガラクトース結合PETフィルム上では、肝細胞が凝集体を形成したが、PAAグラフト化PETフィルム上の肝細胞は相対的に変化しないままであった。この時点で、コラーゲン被覆TCPS上の細胞は密集単分子層を形成した。それぞれ異なる表面上での肝細胞の形態の相違は、3日後ないし7日後により明確になった。PAAグラフト化PETフィルム上の肝細胞は、大部分が丸い1個の細胞の形で出現し、最大でも数個の細胞からなるいくつかの小さな凝集体であった。これに対して、ガラクトシル化表面上の肝細胞は、最大の移動性を示し、大きな凝集体を形成した。極わずかな孤立した細胞または小凝集体が表面上に残った。コラーゲン被覆表面上では、肝細胞がその特徴的な単分子層形態を維持した。5日目に核を2つ有する細胞が出現し、肝細胞が増殖期に入っていることを示した。
実施例4.それぞれ異なる表面上で培養された肝細胞のアルブミン合成機能
様々な時点で採集された培地内のアルブミン濃度を、フレンド(Friend),J.R.他によって報告された手順(文献30参照)に従って、競合的な固相酵素免疫検定法(ELISA)により測定した。要約すれば、試料を順次希釈し、ラットアルブミンに対するペルオキシダーゼ結合ウサギ抗体(米国ICN社製)を0.6μg/mLの最終濃度まで添加した。37℃で2時間培養した後、各試料の100μLアリコートを96ウェルMaxisorp(商標)プレート(米国ヌンク社(Nunc Inc.)製)に移した。各試料をラットアルブミン濃度0.2μg/mLのPBS溶液100μL/ウェルで培養することによってプリコートし、使用前に、0.05%Tween-20のPBS溶液で3回洗浄した。試料をウェルに入れた状態で、加湿チャンバ内で室温で2時間培養した。その後、プレートを0.05%Tween-20のPBS溶液で3回洗浄し、プレートに1-Step Turbo TMB基質(米国、ピアス(Pierce)社)を100μL/ウェルで充填した。プレートを加湿チャンバ内で室温で30分ないし45分間培養し、2NH2SO4100μLを添加することによって反応を停止させた。各ウェル内の溶液の450nmにおける光学密度(OD)をマイクロプレートリーダー(バイオラッドラボラトリーズ(Bio-rad Laboratories)社Model 550)で測定した。試料のラットアルブミン濃度を、ラットアルブミンを基準どおりに用いた光学密度から算出した。
様々な時点で採集された培地内のアルブミン濃度を、フレンド(Friend),J.R.他によって報告された手順(文献30参照)に従って、競合的な固相酵素免疫検定法(ELISA)により測定した。要約すれば、試料を順次希釈し、ラットアルブミンに対するペルオキシダーゼ結合ウサギ抗体(米国ICN社製)を0.6μg/mLの最終濃度まで添加した。37℃で2時間培養した後、各試料の100μLアリコートを96ウェルMaxisorp(商標)プレート(米国ヌンク社(Nunc Inc.)製)に移した。各試料をラットアルブミン濃度0.2μg/mLのPBS溶液100μL/ウェルで培養することによってプリコートし、使用前に、0.05%Tween-20のPBS溶液で3回洗浄した。試料をウェルに入れた状態で、加湿チャンバ内で室温で2時間培養した。その後、プレートを0.05%Tween-20のPBS溶液で3回洗浄し、プレートに1-Step Turbo TMB基質(米国、ピアス(Pierce)社)を100μL/ウェルで充填した。プレートを加湿チャンバ内で室温で30分ないし45分間培養し、2NH2SO4100μLを添加することによって反応を停止させた。各ウェル内の溶液の450nmにおける光学密度(OD)をマイクロプレートリーダー(バイオラッドラボラトリーズ(Bio-rad Laboratories)社Model 550)で測定した。試料のラットアルブミン濃度を、ラットアルブミンを基準どおりに用いた光学密度から算出した。
肝細胞の機能を時間の関数としてのアルブミン合成レベルによって評価した(図5)。PAAグラフト化基質上で培養された肝細胞のアルブミン合成機能は、1日後で1日あたりかつ細胞100万個あたり10μgまで急速に低下し、時間が経つにつれて低下し続けた。ガラクトシル化PET表面およびコラーゲン被覆表面上で培養された肝細胞は、4日間同じレベルの合成機能を示した後、コラーゲン被覆基質上では次第に低下した。ガラクトシル化PET表面上の肝細胞の合成機能は、少なくとも1週間同じレベルを維持した。
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なし
Claims (3)
- 細胞工学および組織工学用ポリマー材を改質する方法であって、ポリマー表面に結合された細胞特異的リガンドのクラスターを備えている方法。
- 上記リガンドは、肝細胞に特異的である請求項1記載の方法。
- 上記ポリマー表面は、織り地、不織地、編み地、編組み地または繊維状である請求項1記載の方法。
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