JP2005535629A - 分化調節薬剤およびその使用法 - Google Patents
分化調節薬剤およびその使用法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005535629A JP2005535629A JP2004516341A JP2004516341A JP2005535629A JP 2005535629 A JP2005535629 A JP 2005535629A JP 2004516341 A JP2004516341 A JP 2004516341A JP 2004516341 A JP2004516341 A JP 2004516341A JP 2005535629 A JP2005535629 A JP 2005535629A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fgf
- fgfr
- gene
- agent
- drug
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/113—Acidic fibroblast growth factor (aFGF, FGF-1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/28—Vascular endothelial cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Obesity (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
Abstract
Description
肥満症はもはや従来の「西洋化された」地域社会に限定されない全世界的に重大な健康上の問題となっているが、それは民族特有の伝統的な生活様式に優先して伝統的な「西洋」諸国の高脂肪食および定住性生活様式が取り入れられてきたためである(Dollら、Int.J.Obes.Relat.Metab.Disord.26(1):48-57,2002)(Fall.Br.Med.Bull.60:33-50,2001)。肥満症、および特に小児における肥満症の発生率は、ほぼすべての他の医学的状態より速い速度で増大しつつある。世界中でおよそ2千2百万人の5歳未満の小児が過体重であり(Deckelbaumら、Obes.Res.,9,Suppl.4:239S-243S,2001)、世界中で7%を超える成人が肥満症であり、さらに成人の21%が過体重であると分類されている(Seidell.Acta.Paediatr.,Suppl.88(428):46-50,1999)。世界保健機関は、世界的な成人における肥満症の高発生率を「世界的な汎流行病」と表現している。
構造的に関連するポリペプチド増殖因子の線維芽細胞増殖因子ファミリーは、多様な認識された作用を備える20種を超えるメンバーを含む。ファミリー間には限定された直接的コード配列相同性が存在する。この名称は増殖の刺激がファミリーメンバー間で普遍的ではないので誤解を招きやすいが、FGFは1ファミリーとして、増殖および発生、細胞複製および血管形成、細胞生存およびアポトーシス、ならびに腫瘍発生および形態形成において極めて重要な役割を果たす。FGFは、一部はFGFと類似もしくは相補的作用を備える極めて多数の増殖因子を含むより規模の大きなヘパリン結合性増殖因子ファミリーに属している。
リガンドと同様に、FGF受容体(FGFR)は(少なくとも)5つの構造的に関連するタンパク質をコードする遺伝子ファミリーを含んでいる。それらはチロシンキナーゼクラスの受容体のメンバーであり、広範囲に発現する。5つの受容体のアミノ酸配列は、シグナル伝達に関係する最高に保存された領域を含む60〜95%である。FGFは受容体への結合において相違する特異性を有しており、そしてこれは、受容体およびそれらのスプライス変異体の細胞特異的発現とともに、シグナルオプションにおけるさらなる多様性を提供する。原形質膜内の局在化に加えて、FGFRは核エンベロープおよびマトリックス内でもまた発現する。FGFに反応したシグナル伝達は、受容体の二量体化およびヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)との複合体形成を通して発生する。その後のFGFRの細胞内ドメイン上の複数部位でのリン酸化は、複数の下流シグナル伝達分子および経路の動員および/またはリン酸化を開始させる。3つまでの特徴的なIg様細胞外ドメインがあり、それらはFGFRをIG受容体スーパーファミリー(PDGFRおよびIL-1Rも含有する)内に配置する。
HSPGは、コアタンパク質へ共有結合している硫酸化グリコサミノグリカンであり、FGF-FGFR相互作用を促進するように機能する。これは、FGFおよびFGFRにおける構造変化を誘導して各々が二量体化かつ結合することを許容するHSPG、またはFGFおよびFGFRとの活性なシグナリング複合体の一部を形成するHSPGのいずれかに起因する可能性がある。両方のモデルを支持する実験的証拠が存在しており、両方の機序が存在することは高度に想定できる。一部のFGFの初期の反応はHSPGの非存在下で引き出される可能性があるが、持続的なシグナリングのためにはHSPGが不可欠であると思われる。HSPGは細胞外マトリックス内での分解からFGFを保護するためにも機能する。これまでにFGFシグナリングに関連付けられているHSPGには、シンデカン(細胞関連性膜貫通プロテオグリカン)、グリピカン(グリコシルホスファチジルイノシトール基によって原形質膜へ固定されたプロテオグリカン)およびパールカン(細胞外基底板プロテオグリカン)が含まれる。HSPGがFGFシグナリングの調節に関係しているという証拠は、インビトロ試験および公知のHSPG突然変異を有する個体についての試験から得られている。これらの試験は、例えばグリピカンがFGF-2誘導性有糸***誘発を促進できるが、FGF-7反応を阻害することを示している。
システインに富むFGFR(CFR)は、ヘパラン硫酸鎖が欠如した、FGFを結合する内在性膜シアロ糖タンパク質である。CFRおよびFGFRへのFGFの結合は相互に排他的である。CFRは、細胞内部位へのFGFターゲティングおよび細胞内FGF濃度の調節において役割を果たすと思われる。
1.FGFR-依存性細胞内シグナリング
上記に述べたように、そして図1に示したFGFシグナル経路の略図を参照すると、リガンド結合は受容体の二量体化および自己リン酸化を誘導する。突然変異分析は、シグナル伝達のためには二量体化単独で十分であることを示唆している。FGFRは多数の細胞内リン酸化部位(FGFR-1の場合には7つ)を有しており、リン酸化部位を突然変異させ、キナーゼを死滅させると、受容体はFGFの多数の生物学的シグナルを伝達することができない。しかし、一部の作用は維持されており、これは非受容体媒介性シグナル経路が重要な検討課題であることを示唆している。
受容体のリン酸化に引き続いてsrcホモロジー(SH-2)ドメイン含有およびホスホチロシン結合(PTB)ドメインタンパク質は特定の細胞内FGFRホスホチロシンへ結合する。これらのタンパク質には、PLCγ、SHC、およびFRS2(FGFR基質2)が含まれ、これらの分子の一部はFGFRに特異的であり(例、FRS2)、その他はより***雑である(例、SHC)。リン酸化すると、これらのドッキングタンパク質はRASへのアダプターとして機能するGRB2-SOS複合体へ直接的に結合する。膜関連性RASは次にMAPK伝達経路を動員して活性化する。
PLCγはSH-2ドメインタンパク質であり、FGFR内の特定のホスホチロシン(FGFR-1中のY766)へ結合し、引き続きホスホイノシトールをイノシトール1,4,5三リン酸(IP3)およびジアシルグリセロール(DAG)へ加水分解する。IP3は細胞内貯蔵からのCa2+遊離を誘導するが、他方DAGはセリン/トレオニン特異的キナーゼであるPKCを活性化する。
FGF処理は、多数の遺伝子の発現を変化させ、かつ非FGFR媒介性機序を介して変化させることができる。これは直接作用であると推定され、かつ多数のFGFは核ターゲティングモチーフを有しており、核内および核小体内で、ならびにクロマチンと関連して見いだされる。FGFが遺伝子転写に及ぼす作用は細胞型特異的である。さらに、FGFは初期誘導が他の因子に左右される遺伝子の発現を維持することが証明されている。転写調節に加えて、FGFはmRNAの安定性ならびにタンパク質の翻訳および翻訳後修飾にも影響を及ぼす。
FGFは多数の他の増殖因子をアンタゴナイズできる、またはそれらと相乗作用することができる。FGFとトランスフォーミング増殖因子(TGF)、インスリン様増殖因子-1(IGF-1)、およびWNTシグナリングとの協同性は一般的である。
そこで1つの局面では、本発明は特に脂肪症関連状態の治療もしくは予防において有用な脂質生成を調節する方法を提供する。これらの方法は、一般にFGFシグナル経路を調節するために十分な時間および条件下で細胞をある薬剤と接触させる段階を含む。いくつかの態様では、FGFシグナル経路はFGF-1シグナル経路およびFGF-2シグナル経路から選択される。これらの経路の代表的メンバーには、FGFR、HSPG、SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK経路のメンバー、PLCγ-PKC-Ca2+経路のメンバー、FGF-1核移行経路のメンバー、ならびにP34およびFIF(FGF-相互作用因子)等の細胞内結合パートナーが含まれるが、それらに限定されない。適切な薬剤の非限定的例には、本明細書で詳細に説明するように、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、炭水化物、脂質、もしくは他の有機分子(炭素を含有する)または無機分子等の小分子が含まれる。
1.用語の定義
他に定義していない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同一の意味を有する。本発明の実施または試験には本明細書に記載した方法および材料に類似する、または等価の任意の方法および材料を使用できるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明のために、以下の用語を下記に定義する。
本発明は、部分的に、前脂肪細胞の脂肪細胞へのインビトロ分化(脂質生成)は前脂肪細胞の複製期を通じて培地中のMVECの存在によって強化でき、かつこの作用は培地へのFGF-1またはFGF-2の添加によってMVECの非存在下でも複製できるという発見に基づいている。何らかの特定の理論あるいは作動形態に結び付けることを望んではいないが、本発明者らは、MVEC(または、もしかすると他の細胞型)によるFGF-1およびその他のFGFスーパーファミリーのメンバーのインビボ産生が隣接する前脂肪細胞上のFGF受容体を活性化し、それらが脂肪細胞へ分化するのを直接的もしくは間接的に促進すると考えている。さらに、本発明者らはFGF-1がヒト前脂肪細胞の複製を促進すること(IGF-1、FGF-2、または血清単独より強力に)、かつ複製期中のヒト前脂肪細胞のFGF-1処理が引き続いて分化する能力を劇的に増加させること(すなわち、「初回刺激(priming)」作用)を見いだした。さらに、本発明者らはこのFGF-1の「プライミング」作用が分化中のTZD処理により劇的に増加することを証明したが、これはFGF-1がPPARgリガンドではないことを示唆している。ヒト前脂肪細胞はFGFを産生しないこと、かつFGF-1の増殖前の作用がFGFに対する中和抗体によって阻止されることも見いだされた。このため、FGFシグナル経路、特にFGF-1またはFGF-2シグナル経路の調節因子は特に肥満症、脂質生成における局所性で異常に増加した状態、悪液質、および脂肪症における局所性欠乏症の状態を含む脂肪症関連状態の治療または予防、ならびに過剰な脂質生成および不十分な脂質生成に関する研究のために有用であることを提案する。
本発明は、遺伝子の発現またはその遺伝子の発現産物のレベルおよび/または機能活性を調節する段階を含むFGFシグナル経路を調節する薬剤をスクリーニングする方法もさらに特徴とし、このときその遺伝子はFgf遺伝子、Fgfr遺伝子、Fgf遺伝子もしくはFgf遺伝子と同一の調節もしくは生合成経路に関連する遺伝子、FGFR遺伝子と同一の調節もしくは生合成経路に関連する遺伝子、またはその発現産物がFGFとFGFRとの相互作用を調節する(例、促進する、強化する、もしくは可能にする;または阻害する、もしくは損傷させる)遺伝子、またはその発現がFgf遺伝子の発現産物によって直接的もしくは間接的に調節される、あるいはFGFが相互作用するFGFRの機能をアゴナイズする、もしくはその機能をアンタゴナイズする遺伝子から選択される。
FGFシグナル経路の遺伝子(例、Fgf遺伝子およびFgfr遺伝子)は脂質生成、そして特に前脂肪細胞の分化をプライミングすることに関連していると考察されるので、そのような遺伝子の発現における異常が肥満症、または家族性肥満症、アテローム硬化症、高血圧、および糖尿病を含むがそれらに限定されない肥満症関連状態の素因とつながっている可能性のある、脂質生成の上昇を含む機能不全の脂質生成の基礎となっている、もしくは原因である可能性がある。したがって、本発明は、患者から入手した生物学的サンプル中でのFGFシグナル経路に関係する異常な遺伝子(例、異常なFgf遺伝子もしくはFgfr遺伝子)またはその遺伝子の異常な発現産物の存在を決定する段階を含む、患者における肥満症の存在を検出する、または肥満症のリスクを診断する方法を想定している。このとき、異常な遺伝子または異常な発現産物は肥満症または肥満症関連状態を発生する素因の存在と相関している。
本発明の1つの態様は、FGFシグナル経路に関係する遺伝子発現の増加を検出する方法を含む。例えば、細胞(例、MVEC)中のFgf遺伝子の転写体、または細胞(例、前脂肪細胞)中のFgfr遺伝子の転写体を定性的もしくは定量的に決定することにより、Fgf遺伝子もしくはFgfr遺伝子の発現を検出できる。本発明のまた別の態様は、細胞(例、MVEC)の遺伝子および転写体を試験することによってFGFシグナル経路に関係する遺伝子(例、Fgf遺伝子またはFgfr遺伝子)の発現または機能の増加を検出する方法を含んでいる。これらの態様では、核酸は標準的方法(Sambrookら、「Molecular Cloning.A Laboratory Manual」,Cold Spring Harbor Press,1989;Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」,John Wiley & Sons Inc,1994-1998)によって生物学的サンプルに含有される細胞から単離できる。核酸は、ゲノムDNAまたは断片化もしくは全細胞RNAであってよい。RNAが使用される場合、RNAを相補的DNAへ転換させるのが望ましいことがある。1つの態様では、RNAは全細胞RNAであり、また別の態様では、RNAはポリ-A RNAである。1つの態様では、核酸は核酸増幅法によって増幅させられる。適切な核酸増幅法は当業者には周知であり、例えばAusubelら(前記)に記載されたポリメラーゼ連鎖反応(PCR);例えば米国特許第5,422,252号に記載されたストランド置換増幅法(strand displacement amplification:SDA);例えばLiuら(1996)(国際出願国際公開公報第92/01813号)およびLizardiら(国際出願国際公開公報第97/19193号)に記載のローリングサークル型複製法(rolling circle replication:RCR);例えばSooknananら(1994,Biotechniques 17:1077-1080)に記載された核酸配列に基づく増幅法(nucleic acid sequence-based amplification:NASBA);ならびに例えばTyagiら(1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5395-5400)に記載されたQ-βレプリカーゼ増幅法が含まれる。
4.2.1 抗原結合分子
本発明の標的分子と免疫相互作用性である抗原結合分子を使用して、FGFシグナル経路遺伝子発現の増加または減少を測定することができる。そこで本発明は、FGFシグナル経路に関係する遺伝子(例、FGFもしくはFGFRポリペプチド、または一つまたは複数のFGFポリペプチドもしくはFGFRポリペプチドのレベルおよび/または機能活性を調節する、さもなければ影響を及ぼすタンパク質)の発現産物に特異的に結合する抗原結合分子もまた企図している。例えば、抗原結合分子は完全ポリクローナル抗体を含んでいてよい。そのような抗体は、ポリクローナル抗血清を入手するために、例えば本発明の標的分子をマウスもしくはウサギが含まれてよい生産種内に注射することによって調製できる。ポリクローナル抗体を製造する方法は当業者には周知である。使用できる例示的プロトコールは、例えばColiganら、「Current Protocols In Immunology」(John Wiley & Sons,Inc.1991)およびAusubelら(1994-1998、前記)の特に第11章第III節に記載されている。
上記の抗原結合分子は、ELISA法およびウェスタンブロッティング法等の方法を通して、健康および疾患状態におけるFGFシグナル経路遺伝子発現の調節を直接的または間接的に測定することに有用性がある。本発明の標的ポリペプチドを検出するために使用できる代表的なアッセイ戦略には、サンプル中の標的ポリペプチド(例、FGFポリペプチド)と抗原結合分子とを結合させて抗原結合分子および標的ポリペプチドを含む複合体の検出を含有する免疫アッセイ法が含まれるが、それらに限定されない。例示的免疫アッセイは、本発明の標的分子のレベルもしくは機能活性を測定できる免疫アッセイである。典型的には、本発明の標的ポリペプチドと免疫相互作用性である抗原結合分子と、標的ポリペプチドを含有することが疑われる生物学的サンプルとが接触させられる。抗原結合分子および標的ポリペプチドを含む複合体の濃度が測定され、測定された複合体濃度が次にサンプル中の標的ポリペプチドの濃度と関連付けられる。本発明と一致して、標的ポリペプチドの異常な濃度、特に上昇した濃度の存在は、肥満症を含む脂質生成機能不全の存在、または脂質生成機能不全と関連する可能性がある苦痛の指標である。
本発明によると、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする薬剤が肥満症、肥満症関連状態、脂肪腫、および脂肪腫症を含む過剰な脂質生成の治療または予防のための活性薬剤として有用であることが提案されている。FGFシグナル経路をアゴナイズする薬剤が、例えば悪液質および悪液質関連状態において脂質生成を強化するために有用であることもさらに提案されている。そのような薬物は、それら自体で、またはそれらが適切な薬学的に許容される担体と混合されている薬学的組成物中のいずれかで患者に投与することができる。
この方法は、その治療法の有効性を増加させるために、さらに発現ベクターによってコードされるタンパク質に反応性である細胞の注射、外科的埋め込み、点滴注入、または任意の他の手段による局所適用と併用できる。この方法は、タンパク質の活性のために必要な他の因子の注射、外科的埋め込み、点滴注入、または任意の他の手段による局所適用とも併用できる。
ターゲティングの向上は、ポリヌクレオチド/発現ベクターと標的分子とを連結することによって(例えば、抗原結合分子を使用するいわゆる「魔法の弾丸(magic bullet)」アプローチ)、または発現ベクターによってコードされるタンパク質、またはそのタンパク質に反応性である細胞の活性のために必要な他の因子の注射、外科的埋め込み,
もしくは任意の他の手段による局所適用によって達成されてよい。例えば、アンチセンスFgfポリヌクレオチドを含有するリポソームの場合には、免疫相互作用性物質をMVEC表面抗原に特異的であるリポソームコーティング剤に組み込むことによってMVECを標的とすることができる。MVEC特異的細胞表面抗原の例はPECAM-1である。
その修飾は、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、ウイルスベクター(アデノウイルスベクターもしくはレトロウイルスベクター等;Mulligan,1993;Miller,1992;Salmonsら、1993)もしくはその他のベクター、リポソーム(Zhuら、1993)、ウイルスカプシド、もしくはナノ粒子(Bertlingら、1991)、または任意のその他の修飾メディエーターもしくはその他のベクター、または任意その他の修飾メディエーター等の修飾物質によって媒介される可能性がある。遺伝子または遺伝子産物の送達溶剤としての細胞の使用は、Barrら、1991およびDhawanら、1991によって記載されている。処理された細胞は、治療される対象においてそれらの生存を促進するいずれかの栄養素、増殖因子、マトリックス、または他の物質と組み合わせて送達することができる。
材料および方法
抗PECAM-1抗体でコーティングされた磁気ビーズの生成
共有結合したヒツジ抗マウスIgG1(Dynal社)を備えるDynabeads M-450を製造業者の取扱説明書にしたがってPECAM-1(CD31)に対する精製マウス抗ヒトモノクローナル抗体(PharMingen社)でコーティングした。抗PECAM-1抗体でコーティングしたDynabeadsは濃度30mg/mLの脱イオン化リン酸緩衝食塩液(DPBS)+0.1% BSA中に再懸濁させ、4℃で無菌保存した。調製されたビーズは少なくとも4ヵ月間は活性のままであった。
対の大網(O)および腹部皮下(S)脂肪組織生検材料を、選択的開腹外科手術(婦人科手術または血管手術)を受けた4例の男性患者(平均年齢69歳、範囲66〜70歳;平均BMI:27、範囲26〜29)および5例の女性患者(平均年齢55歳、範囲39〜67歳;平均BMI:27、範囲20〜32)から入手した。糖尿病または重度の全身性疾患を有している患者は含まれず、脂肪組織質量または代謝に影響を及ぼすことが知られている薬物を摂取している患者もいなかった。本試験プロトコールは、プリンセス・アレクサンドラ病院およびクイーンズランド工科大学の治験審査委員会によって承認された。全患者から文書によるインフォームド・コンセントを入手した。
図2を参照すると、生検材料は研究室のリンガー液中へ運ばれた(輸送時間15分間)。前脂肪細胞および微小血管内皮細胞は同一生検材料から単離した。(1)目に見える神経、血管、および線維組織の除去後、脂肪を細かく細分化し、3mg/mLのII型コラゲナーゼおよび1.5%ウシ血清アルブミンを含有する37℃の消化液(25mM HEPES、5mM グルコース、120mM 塩化ナトリウム、50mM 塩化カリウム、および1mM 塩化カルシウム)中で1時間インキュベートした。消化液 対 脂肪組織の比率は4:1であった。結果として生じた消化物を250μmメッシュ(Sigma社)に通して濾過し、脂肪細胞および遊離油を間質-血管成分から4℃での5分間にわたる250gでの遠心により分離した。(2)間質-血管ペレットをDPBS+10% BSA中に再懸濁させ、洗浄し、遠心した(600g、5分間、4℃)。これを繰り返し、次にDPBS単独の中で最終洗浄した。(3)結果として生じたペレットを室温で15分間にわたり、1mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(CSL社、ブリスベン)を含有する0.25%トリプシン中で時折撹拌しながらインキュベートした。5%ウシ胎児血清(ICN社)を含有するハンクス平衡食塩液(HBSS)の添加によりトリプシンを中和した。(4)結合組織の大きなフラグメントは100μmメッシュ(Sigma社)を通しての濾過により除去した。(5)濾液を遠心し(600g、5分間、4℃)、1%ゼラチンをコーティングしたペレットを25cm2培養フラスコ(Corning社)内に再懸濁させて10%FBS;100IU ペニシリン;100μg/mL ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン(全部がICN Biomedical Australasia社);90μg/μL ヘパリン;30ng/mLのβ-内皮細胞増殖因子(β-ECGF);0.014M HEPES;0.15% NaHCO3を含有する内皮細胞(EC)増殖培地(M-199;ICN社)中でプレーティングした。この混合細胞集団を37℃、5% CO2中で3〜5日間にわたり培養した。
さらになお図2を参照すると:(6)短い培養期間(およそ3日間)の後、細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAと一緒に4〜5分間にわたりインキュベートし、次にハンクス緩衝食塩液(HBSS)+5% FBSを用いてトリプシンを中和し、遠心した。(7)ペレット化細胞を1mLのHBSS+5% FBS中に再懸濁させ、50μLの抗PECAM-1でコーティングしたDynabeads(15分間、4℃)と一緒にインキュベートした。(8)HBSS+5% FBSを用いて細胞/ビーズ懸濁液の総量を10mLとし、室温で3分間にわたり磁気粒子濃縮機を使用して内皮細胞を選択した。マグネット内に配置したままのチューブを用いて、洗浄液中の選択されなかった細胞(前脂肪細胞)を新鮮なチューブへ移した。次にさらに10mLのHBSS+5% FBSを用いて内皮細胞を洗浄し、磁気粒子濃縮機(3分間)を使用して再選択した。この洗浄/選択の過程を5回繰り返した。(9a)選択された細胞(内皮細胞)を次に1%ゼラチンをコーティングした培養フラスコ内のEC増殖培地中でプレーティングした(上記のとおりに)。(9b)非選択細胞(前脂肪細胞-PA)を遠心し、100IU ペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、および10% FBS(PA増殖培地)を含有するDMEM/Ham’s F12 1:1(ICN Biomedical Australasia社)中に再懸濁させた。
さらになお図2を参照すると:(10)混入している線維芽細胞からの内皮細胞の分離は、0.25%トリプシン/1mM EDTA(T/V)を用いて培養を30〜40秒間処理し、HBSS+5% FCSを用いてT/Vを中和し、EC増殖培地を含む1%ゼラチンでコーティングしたフラスコへ非付着性内皮細胞を移すことによって達成した。このトリプシン化および移動方法を均質な内皮細胞培養が入手されるまで培養の初期2週間にわたって1回もしくは2回繰り返した。
細胞は37℃、5% CO2中で維持した。培地を2〜3日毎に取り換え、トリプシン/EDTAを用いて細胞を慣例的に継代培養した。内皮細胞はゼラチンをコーティングしたフラスコ内のEC増殖培地中で維持し、前脂肪細胞はコーティングしていない培養フラスコ内のPA増殖培地中で維持した。内皮細胞数が増加するにつれて、EC増殖培地中のβ-ECGFの濃度は30ng/mLから10ng/mLへと低下した。継代培養2〜4の実験作業では、内皮細胞および前脂肪細胞の両方を使用した。
ヒト皮膚微小血管内皮細胞系CADMEC(Cell Applications社、サンディエゴ)(脂肪由来初代内皮細胞と同一条件下で培養した)、およびヒト皮膚線維芽細胞(パンチ生検によって入手し、ヒト前脂肪細胞と同一条件下で培養した)を内皮細胞試験のための各々陽性および陰性コントロールとして使用した。
脂肪症組織生検材料から入手した微小血管内皮細胞(MVEC)を多数の方法で特性付けした。
培養を倒立位相差顕微鏡により内皮細胞の特徴的な敷石状形態について試験した(図3A)。
細胞はフォン・ウィルブランド因子(vWF)(クローンF8/86、DAKO社)および血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM-1;CD31)(クローンJC/70A、DAKO社)の発現について特定のモノクローナル抗体を使用する免疫蛍光法によって評価した。細胞を24ウェルプレート(1%ゼラチンをコーティングした)の個々のウェル内でコンフルエンスまで増殖させた。コントロール細胞(ヒト皮膚微小血管内皮細胞-CADMEC)、ヒト前脂肪細胞およびヒト皮膚線維芽細胞の初代培養を平行して処理した。培地を除去した後、細胞を2%パラホルムアルデヒド(BDH Laboratory Supplies社、英国)中で2分間、室温(RT)で固定した。次に細胞を、0.1%トリトンX 100(Ajax Chemicals社、オーストラリア)を用いて30秒間、RTで易透化処理した。固定かつ易透化処理した細胞をPBS中の1% BSAを用いて洗浄かつブロッキングし(3回)、その後PBS+1% BSA中で希釈した後に添加した一次抗体(全抗体を1:100の希釈率で使用した)と一緒に4℃で4時間インキュベートした。二次抗体の非特異的結合により産生する擬陽性を排除するために、すべての細胞型をさらに初代抗体に置換して緩衝液または非免疫抗体(アイソタイプコントロール)のいずれかを用いて類似の方法で処理した。細胞をPBSにより洗浄し(3回)、次にPBS+1% BSA中の1:50の希釈率でフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-標識二次抗体(ウサギ抗マウスIgG FITC;DAKO社)と一緒に室温で30分間インキュベートした。細胞をPBSにより洗浄し(2回)、次に核を4℃で5分間かけてヨウ化プロピジウム(ストック液:100mLの0.1Mクエン酸3ナトリウム中の5mgのヨウ化プロピジウム;使用液:1部のストック液対3部の0.1M PBS)により対比染色した。細胞をPBSによりさらに2回洗浄し、その後Nikon TE-FM Epi-Fluorescenceアタッチメントを装備したNikon Eclipse TE300倒立顕微鏡を使用して試験し、そしてKodak MAX 400 ASAフィルムを装填したNikon F70カメラで撮影した。上記のようにモノクローナル抗体(クローンBBIG-E4,R & D Systems社)および免疫蛍光法を使用して、10ng/mLの腫瘍壊死因子(TNF)α(Biosource International社、米国)を含有する増殖培地中で4時間にわたり前処理した細胞中でのE-セレクチン(CD62E)の発現についてさらに調査した。結果は図3に示した。
MVECおよびCADMECをNOS3遺伝子による内皮細胞一酸化窒素シンターゼ(eNOS)の発現について試験した。全RNAは細胞から製造業者の指示にしたがってTri-reagent(Sigma社)を使用して抽出した。2μgのRNAを標準的方法によりExpand Reverse Transcriptase(Roche社)を使用してcDNAへ転換させた。PCRは、1×のPCRバッファー、1μLのcDNA、12.5pmolの各プライマー、1.5mMのMgCl2、および0.625UのTaq DNAポリメラーゼを含有する総量25μLの反応液中で実施した。プライマー配列および熱サイクル条件は以前に記載されたとおりであった(Rockettら、In Vitro Cell Dev.Biol.Anim.,31:473-481,1998)。PCR産物は、1×のTBEバッファー中に1mL当たり1μgの臭化エチジウムを含有する1.2%アガロースゲル上で分離し、紫外光線下で視認かつ写真撮影した。ФX174マーカーを使用した。
前脂肪細胞は形態(位相差顕微鏡および細胞計数)ならびに分化能力に基づいて特性付けした。後者はG3PDH酵素活性およびトリアシルグリセロール蓄積によって評価した。
活性は、以前に記載されたように評価した(Adamsら、J.Clin.Invest.100:3149-53,1998)(Primary Mesenchymal Cells,第1版,Kluwer Academic 5:173-87,2001中のHutleyら)。
細胞計数およびNile Redアッセイを使用して脂質の蓄積を評価した。
分化培地中での14日間の処理後、1mm2マイクロメーターグリッドを使用する倍率100倍の位相差顕微鏡(***、ノイバウエル)下で各処理において細胞を含有する脂質の数を推定した。各処理について相違する10ヵ所の領域を試験し、細胞総数および脂質含有細胞の割合の両方を評価した(データは示していない)。
以前に記載されたように(Hutleyら、2001、前記)、6ウェルプレート内で培養した前脂肪細胞をリン酸緩衝食塩液(PBS)(pH 7.4)中で3回洗浄し、各ウェルに150μLのトリプシン-バーゼン液を添加した。細胞が培養プレートから離れるまで、細胞を37℃で10分間インキュベートした。Nile Redを含有するPBSを各ウェルに最終濃度1μg/mLとなるように添加し、細胞をさらに室温で5〜7分間インキュベートした。488nm(励起時)/540nm(発光時)で分光蛍光計(Aminco Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer)を使用して室温で蛍光を測定した。結果は表面積で標準化した。各処理は3回ずつ実施した。
血管内皮細胞由来因子が脂質生成に及ぼす役割を調査するために、本発明者らは、微小血管内皮細胞由来因子を含有する増殖培地の存在下で前脂肪細胞をインビトロ培養した場合の作用について試験した。
前脂肪細胞およびMVECの生検材料を入手して単離かつ培養する方法は、実施例1と同様であった。
すべてが1%ゼラチンをコーティングした培養上でコンフルエンス状態にあるヒト脂肪由来微小血管内皮細胞(MVEC)、ヒト皮膚微小血管内皮細胞(CADMEC)、およびヒト皮膚線維芽細胞(HSF)の個別培養の各々を、10ng/mLのβ-ECGFを含有するEC増殖培地(上記参照)へ37℃、5% CO2中で48時間にわたり曝露させた。この培地を次に収集し、0.22μ低タンパク質結合フィルターを使用して濾過し、その後の使用時まで-20℃で貯蔵した。EC増殖培地+10ng/mLのβ-ECGFもまた上記のとおりに処理したが、培養フラスコに細胞は含めなかった(ブランクコントロール)。使用直前に、各培地を解凍し、各々へ5%FCSをさらに添加した。
皮下および大網前脂肪細胞ならびにヒト皮膚線維芽細胞を、96ウェルプレート内のDMEM/Ham’s F12(1:1)+10% FCS(PA増殖培地)中で約1×103cells/ウェル(サブコンフルエント)の密度で個別にプレーティングし、37℃、5% CO2大気中で16〜20時間に渡り接着させた。この培地を次にEC増殖培地と取り換え、コンフルエントな皮下もしくは大網MVEC、ヒト皮膚線維芽細胞(HSF)、または細胞を含有しないウェル(ブランクコントロール)のいずれかへ曝露させること(各処理は4回ずつ実施した)により馴化させた(上記参照)。個別実験において皮下および大網PAを上記のとおりにプレーティングし、引き続いてS MVEC、O MVEC、ヒト皮膚EC(CADMEC)馴化培地、新鮮なEC増殖培地、またはブランクコントロールのいずれかを用いて処理した。48時間後、前脂肪細胞の細胞数をホルマザンの比色アッセイ(Promega社)により評価した。水溶性テトラゾリウム塩である3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム(MTS)を200μg/mLの濃度で各ウェルに添加した。37℃で4時間に渡りインキュベーションした後、Bio-Rad 3550マイクロプレートリーダーを使用して490nmの吸光度で測定した。このアッセイの妥当性を二通りの方法で試験した;1)前脂肪細胞を1ウェル当たりの細胞250個;500個;1,000個;2,000個;4,000個でプレーティングし(4回ずつ)、そして490nmで吸光度を測定した;2)A490nmで測定した後、細胞を引き続きヨウ化プロピジウムにより染色し、蛍光顕微鏡を使用して直接細胞計数を実施した。1ウェル当たり計4領域について計数し、これらの結果を490nmでのホルマザンの吸光度により入手した細胞数と比較した。
細胞数と光学密度との相関関係は、ピアソンの相関係数によって推定した。増殖に関するデータは、反復測定値についての一方向性の分散分析によって評価した。条件内作用についての事後比較はα=0.05で対応のあるt-検定(paired-t test)を用いて処理した。
MVEC馴化培地がPA増殖に及ぼす作用
前脂肪細胞の増殖に作用を及ぼす可溶性因子がMVECによって分泌されるかどうかを決定するために、ヒト前脂肪細胞をMVEC馴化培地による48時間の処理へ曝露させた。これらの結果は、コントロールと比較して、前脂肪細胞(皮下および大網の両方)の増殖率における統計的有意な増加を証明した(p=<0.001)。この結果は、皮下(S)および大網(O)脂肪組織部位由来のMVEC馴化培地を用いて処理した前脂肪細胞についての結果と類似であったが、「S」MVECを用いて処理した前脂肪細胞は「O」MVECを用いて処理した増殖率より増殖率がわずかに高い傾向を示した。脂肪由来MVECによって産生した因子が前脂肪細胞に及ぼす有糸***促進性作用は、ヒト皮膚MVEC(CADMEC)によって誘導された増殖が脂肪由来MVECによって誘導された増殖ほど高くなかったので(p=0.001)、ある程度の特異性を示した。ヒト皮膚線維芽細胞由来馴化培地は、ブランクコントロールに比較して前脂肪細胞への増加した増殖作用を有していなかった。これらの試験における増殖アッセイの妥当性を公知の数の前脂肪細胞を使用して確認したところ、結果は細胞数と490nmでの吸光度との直線関係を証明した(r2=0.9)。限られた数の実験において、直接細胞計数を使用してさらに結果の妥当性を確認したところ、試験アッセイおよび実験アッセイのどちらにおいても490nmでのホルマザンの吸光度との陽性相関関係(ピアソン相関係数=0.97)が示された。
MVECがFGF-1を産生するという観察に基づいて、調査者らは前脂肪細胞のインビトロでの複製および分化における特異的増殖因子FGF-1が果たす役割を調査する実験を実施した。結果(データは示していない)により、単離時点から精製FGF-1の存在下で増殖した前脂肪細胞が、FGF-1またはその他のMVEC由来因子の非存在下で培養した前脂肪細胞と比較して、類似の、だが付加的ではない分化能力の増加を示した。調査者らは、次にFGF-1産生細胞の同一性を確証し、そして同定された細胞中でのFGF-1 mRNA産生を定量するための実験をデザインした。
大網および皮下組織の生検および前脂肪細胞の単離は、実施例1に記載した方法にしたがって実施した。
特異的抗FGF-1抗体(Sigma社、F5421)を使用して細胞内FGF-1を検出した。標識化細胞内FGF-1の視認は、共焦点顕微鏡を使用して実施した。
FGF-1 mRNA発現は、リアルタイムRT-PCRを使用して評価した。標準プロトコール(TRI-reagent)を使用して各細胞型から全RNAを抽出し、そしてSuperscript preamplification system(Life Technologies社)を使用してcDNAを生成した。次にABI Prism 7700 Sequence Detector(Perkin Elmer社/Applied Biosystems社)を使用する蛍光に基づくリアルタイムPCR法であるTaqMan(商標)アッセイ法を使用してFGF-1の発現を決定した。
次にサンプル細胞型各々の全細胞溶解液中でのFGF-1タンパク質発現を評価するためにウェスタンブロッティング法を実施した。
初期データは、FGF-1 mRNAおよびタンパク質が成熟ヒト脂肪細胞中では極めて低レベルで発現するが、前脂肪細胞中ではmRNAもタンパク質も検出できないことを示した。以前の試験結果に一致して、FGF-1 mRNAおよびタンパク質は、どちらもMVECによって高レベルで発現した。
材料および方法
ヒト大網前脂肪細胞は、選択的開腹外科手術(婦人科手術または血管手術のいずれか)を受けた患者から組織生検により入手した。糖尿病または重症な全身性疾患を有する患者は1例もあるべきではなく、脂肪組織質量または代謝に影響を及ぼすことが知られている薬物を摂取している患者もいるべきではなかった。以下のプロトコールは、プリンセス・アレクサンドラ病院およびクイーンズランド工科大学の治験審査委員会によって承認された。実施例1に記載した方法によって前脂肪細胞を単離かつプレーティングした。
PLCγ2は身体の全組織における極めて多数のシグナル経路に関与しているので、前脂肪生成もしくは抗脂肪生成を目的としてその活性を調節する薬剤を使用するためには、前脂肪細胞への調節因子の選択的ターゲティングを必要とする。
免疫学的ターゲティングプロトコール
標準プロトコールを使用して、前脂肪細胞特異的タンパク質、脂肪細胞分化関連タンパク質(ADRP)に対するモノクローナル抗体を作製した。手短には、タンパク質からペプチド配列を合成し、次にこれを使用して12週間に渡り週2回、5匹のウサギ(同系交配シロウサギ系統)に接種した。この期間中に血清に基づくインビトロ免疫細胞化学的アッセイ法を使用して、ウサギ由来の血清をADRPとの反応性について試験することにより、導入されたペプチドに対する免疫学的反応を監視した。12週間後にウサギを屠殺し、抗ADRP抗体の変異体を単離および試験するために単離脾臓細胞を培養した。U-73122上の遊離カルボキシル基を抗ADRP抗体上のN-末端残基へ架橋結合させるカルボジイミドアミド化段階を使用して、U-73122との共役結合のために最も高い親和性定数を有する抗ADRP IgG抗体を選択した。
脂肪親和性ベンゾジアゼピンアンタゴニストであるフルマゼニルを脂肪組織中でのこのホスホリパーゼ阻害剤の蓄積を促進するためにU-73122と共役結合させた。共役結合は、各化合物上での選択した炭素原子間の共有結合を形成する単純な架橋結合反応を使用して実施した。
全細胞の溶解産物は、単離時点(1週間超)からのFGF-1ならびに大網および皮下単離ヒト脂肪細胞の存在下および非存在下で、分化した3T3-L1脂肪細胞、脂肪組織MVEC、大網および皮下のヒト前脂肪細胞から調製した。BCAを使用したタンパク質の定量後に、総タンパク質の20μgをレーン毎に装填し、SDS/PAGEによりタンパク質を分解し、ニトロセルロース膜へ移した。関心対象のタンパク質は、抗FGF-1抗体および関連する二次抗体のパネルを使用して検出した。結合した抗体は、強化された化学発光を使用して検出した。
複製
前脂肪細胞を96ウェルプレート内の血清含有培地中で細胞500個/ウェル(サブコンフルエント)の密度で12〜18時間にわたりプレーティングして接着させた。細胞をその後、1ng/mLのSCM+増殖因子中で48時間に渡りインキュベートし、そしてMTS増殖アッセイ(Promega社)を実施した。SCMコントロールと比較して表示した図5に示す結果は、FGF-1およびFGF-2の両方に反応した増殖の顕著な増加を証明した。
分化実験のために、前脂肪細胞を単離して、内皮細胞馴化培地(EC-DMEM)中で、または増殖因子の存在下で2ヵ月間まで継代培養し、その後6ウェルプレート内でコンフルエンスに到達させた。細胞を次に、0.1μMロシグリタゾンを含有する血清無含有の化学修飾された分化培地中で分化させた。分化は、標準G3PDHアッセイを使用して第21日に評価した。
ヒト大網および皮下前脂肪細胞を単離し、FGF-1またはFGF-2の存在下および非存在下でSCM中で継代培養した。コンフルエンスに達すると、細胞はFGF-1またはFGF-2の存在下および非存在下での標準的な化学修飾されたSFM+ロシグリタゾン中で分化した。分化はG3PDH活性によって評価した。図6に示す結果は、FGF-1およびFGF-2のどちらも、複製中または分化中のどちらかに存在した場合、脂質生成性であることを示した。両方の過程を通しての存在は付加的であった。FGF-1はFGF-2より大きな脂質生成性作用を有していた。これらのデータは、複製および分化中のFGF-1の脂質生成性作用が独立的かつ付加的であることを示唆している。
インビトロでのヒト前脂肪細胞分化の標準的要件は、血清の強制的除去である。これは、SCM中で高い分化能力を有するマウス脂肪細胞型(例、3T3-L1)とは対照的である。ヒト細胞のために開発された培養系は分化のために必要な因子のダウンレギュレーションを誘導する、または抗分化因子の発現を促進する(あるいはその両方)と推定されている。これらの実験において、ヒト大網および皮下前脂肪細胞を単離し、FGF-1の存在下で継代培養した。次にSCM+インスリンならびに(第1〜3日)デキサメタゾンおよびロシグリタゾン中で細胞を分化させた。
全RNAは、SCM(コントロール)またはSCM+FGF-1のいずれかの中で単離および増殖させたコンフルエントなヒト皮下前脂肪細胞から単離した。cRNAを調製し、チップへハイブリダイズさせ、引き続いてAffymetrix(登録商標)システムを使用して分析した。各処理を2例ずつのサンプルによって表示し、2回の独立実験を実施した。遺伝子発現は、発現が一貫して(CV<5%)少なくとも50%増加または減少した場合にFGF-1によって影響を受けたと見なした。100を超える遺伝子を各カテゴリーに分類し、現在調査中の遺伝子を図9に示した。
ヒト前脂肪細胞を24ウェルプレート内のSCM+/-FGF-1中で培養した。PLCγ発現を間接免疫蛍光法によって試験した。非免疫一次および二次抗体だけを含むコントロールは染色を示さなかった。図10に示す結果は、この分子の発現がSCM単独中での細胞と比較して、FGF-1の存在下でコンフルエンスまで増殖させたヒトPA中で増加することを証明した。これらの結果は、PLCγ2発現が、分化誘導が発生する段階であるコンフルエンス状態では大きくアップレギュレートされることも示した。
ヒト皮下前脂肪細胞を単離し、PLC阻害剤であるU-73122(Calbiochem社)を含めて、および含めずにFGF-1の存在下および非存在下のSCM中で継代培養した。細胞を次にコンフルエンスへ到達させ、U-73122を含めて、および含めずにFGF-1の存在下および非存在下でロシグリタゾンを含有する標準的な化学修飾されたSFMを使用して分化させた。分化はG3PDH活性によって評価した。図11に示す結果は、U-73122が複製期または分化期中にFGF-1誘導性分化を有意に損傷させたこと、およびどちらのプロセス中にも付加的な作用を及ぼしたことを示している。
ヒト前脂肪細胞を単離し、FGF-1+/-抗FGF-1抗体を含むSCM中で培養した。複製を上記に記載したとおりに評価した。図12に示す結果は、抗体を用いた複製の用量依存的な減少を示している。これらのデータは、細胞外FGF-1減少戦略の有効性を支持している。
ヒト前脂肪細胞を単離し、SCM+FGF-1中で継代培養した。分化の1週間前を通して、チロシンキナーゼ阻害剤を培地に添加した。次に細胞を初期3日間に渡りSFM+ロシグリタゾン+FGF-1+/-阻害剤中で分化させた。第15日に細胞を採取し、G3PDH活性により分化を評価した。
Claims (62)
- FGFシグナル経路を調節するために十分な時間および条件下で細胞と薬剤とを接触させる段階を含む、脂質生成を調節する方法。
- FGFシグナル経路がFGF-1シグナル経路およびFGF-2シグナル経路から選択される、請求項1記載の方法。
- 薬剤が遺伝子の発現または遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を調節し、遺伝子がFgf遺伝子、Fgfr遺伝子、Hspg遺伝子、SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK経路に属する遺伝子、PLCγ-PKC-Ca2+経路に属する遺伝子、FGF-1核移行経路に属する遺伝子、およびFGFの細胞内結合パートナーをコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 細胞と、遺伝子の発現または遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を調節する薬剤とを接触させ、遺伝子がFgf遺伝子およびFgf遺伝子と同一の調節経路もしくは生合成経路に属する遺伝子から選択される、請求項1記載の方法。
- 細胞が微小血管内皮細胞またはその前駆体である、請求項4記載の方法。
- Fgf遺伝子がFgf-1およびFgf-2から選択される、請求項4記載の方法。
- Fgf遺伝子と同一の調節経路または生合成経路に属する遺伝子がP34およびFIFから選択される、請求項4記載の方法。
- 細胞と、遺伝子の発現または遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を調節する薬剤とを接触させ、遺伝子がFgfr遺伝子、Fgfr遺伝子と同一の調節経路もしくは生合成経路に属する遺伝子、その発現がFgf遺伝子の発現産物によって直接的もしくは間接的に調節される遺伝子、またはFGFが相互作用するFGFRの機能をアゴナイズ(agonise)もしくはアンタゴナイズ(antagonise)する遺伝子からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- Fgfr遺伝子がFgfr-1、Fgfr-3、およびFgfr-4からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
- Fgfr遺伝子と同一の調節経路もしくは生合成経路に属する遺伝子が、シンデカン-1、シンデカン-2、シンデカン-3、シンデカン-4、グリピカン-1、グリピカン-2、グリピカン-3、グリピカン-4、グリピカン-5、グリピカン-6、パールカン、βグリカン、CFR、SHC、Crk、FRS2、Src、FAK、Nck、Shb、SHP2、GRB-2、SOS、80K-H、pp66、Gab1、P38 MAPK、PI3K、AKT、PKB、RAS、RAF、ERK1,2、MAPKKK、MAPKK、MAPK、Jun、Fos、FPPS、PLC、Fes、PIP2、DAG、Ca2+チャンネル、IP3、CaMキナーゼ、PKC、PKA、cAMP、CREB、およびCBPからなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項8記載の方法。
- その発現がFgf遺伝子の発現産物によって直接的または間接的に調節される遺伝子が、Pparγ、Igfbp-3、Igfbp-6、Igf-2、Irs-2、Pi3キナーゼ、およびPkcθからなる群より選択される、請求項8記載の方法。
- FGFRと相互作用するFGFがFGF-1またはFGF-1である、請求項8記載の方法。
- 細胞が前脂肪細胞(preadipocyte)またはその前駆体である、請求項8記載の方法。
- 薬剤が前脂肪細胞の分化能力および/または増殖を減少させるためにFGFシグナル経路をアンタゴナイズする、請求項1記載の方法。
- 薬剤が遺伝子の発現またはその遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を減少させ、遺伝子がFgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3、およびIgfbp-6からなる群より選択される、請求項14記載の方法。
- 薬剤が遺伝子の発現または遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を増加させ、遺伝子がFgf-l、Fgfr-3、Igf-2、Irs-2、Pi3キナーゼ、およびPkcθからなる群より選択される、請求項14記載の方法。
- 薬剤がFGFRの機能をアンタゴナイズする、またはFGFRとFGFとの相互作用を妨害する、請求項14記載の方法。
- 薬剤が前脂肪細胞の分化能力および/または増殖を増加させるためにFGFシグナル経路をアゴナイズする、請求項1記載の方法。
- 薬剤が遺伝子の発現または遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を減少させ、遺伝子がFgf-l、Fgfr-3、Igf-2、Irs-2、Pi3キナーゼ、およびPkcθからなる群より選択される、請求項18記載の方法。
- 薬剤が遺伝子の発現または遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を増加させ、遺伝子がFgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3、およびIgfbp-6からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
- 薬剤がFGFRの機能をアゴナイズする、またはFGFRとFGFとの相互作用を強化する、促進する、さもなければ可能にする、請求項18記載の方法。
- 薬剤が遺伝子の発現およびその遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性を、その薬剤の非存在下における発現、レベル、または機能活性と比較して少なくとも10%増加または減少させる、請求項1記載の方法。
- (i)FGFシグナル経路のポリペプチド成分の少なくとも生物活性フラグメント、もしくはその変異体もしくは誘導体に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチド;または(ii)レポーター遺伝子に機能的に連結している成分を調節する遺伝子配列の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドを含む調製物と、試験薬剤とを接触させる段階;ならびに試験薬剤の非存在下における正常もしくは基準のレベルおよび/または機能活性と比較した、薬剤がFGFシグナル経路を調節することを示唆するポリペプチド成分またはレポーター遺伝子の発現産物のレベルおよび/または機能活性における変化を検出する段階を含む、FGFシグナル経路を調節する薬剤を同定する方法。
- FGFRを発現する細胞の第1サンプルとFGFとを接触させて少なくとも1つのマーカーを測定する段階;FGFRを発現する細胞の第2サンプルと薬剤およびFGFとを接触させてマーカーを測定する段階;ならびに細胞の第1サンプルのマーカーと細胞の第2サンプルのマーカーとを比較する段階を含む、FGFシグナル経路を調節する薬剤を同定する方法。
- マーカーが、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、FGF経路の細胞内成分、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
- 脂質生成を阻害するもしくは減少させる、または肥満症もしくは脂質生成が局所性で異常に増加した状態において脂質生成を制御するための薬物の製造における薬剤の使用であって、薬剤がFGFシグナル経路をアンタゴナイズする使用。
- FGFもしくはFGFRポリペプチドまたはその生物活性フラグメント、またはこれらの変異体もしくは誘導体、またはFgfもしくはFgfr遺伝子の発現を調節する遺伝子配列を含む調製物を接触させる段階;およびFGFもしくはFGFRポリペプチドまたはその生物活性フラグメント、または変異体もしくは誘導体、またはその遺伝子配列から発現した産物のレベルもしくは機能活性の減少を検出する段階によって決定されるように、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤が、FGFもしくはFGFRに、またはFgfもしくはFgfr遺伝子の発現を調節する遺伝子配列に結合する、請求項26記載の使用。
- FGFRおよびFGFと薬剤とを接触させてFGFRとFGFとの結合を測定する段階であって、FGFRとFGFとの結合を減少させた、または排除した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤が、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする、請求項26記載の使用。
- 薬剤がFGFまたはFGFRに特異的な拮抗性の抗原結合分子である、請求項28記載の使用。
- FGFRおよびHSPGと薬剤とを接触させてFGFRとHSPGとの結合を測定する段階であって、FGFRとHSPGとの結合を減少させたまたは排除した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤が、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする、請求項26記載の使用。
- 薬剤がHSPGまたはFGFRに特異的な拮抗性の抗原結合分子である、請求項30記載の使用。
- FGFおよびCFRと薬剤とを接触させてFGFとCFRとの結合を測定する段階であって、FGFとCFRとの結合を減少させたまたは阻止した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤が、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする、請求項26記載の使用。
- 薬剤がFGFまたはCFRに特異的な拮抗性の抗原結合分子である、請求項30記載の使用。
- 前脂肪細胞もしくはそれらの前駆体から選択される細胞の第1サンプルとFGFとを接触させて細胞の分化および/または増殖を測定する段階;前脂肪細胞もしくはそれらの前駆体から選択される細胞の第2サンプルと薬剤およびFGFとを接触させて細胞の分化および/または増殖を測定する段階;細胞の第1サンプルの分化および/または増殖と細胞の第2サンプルの分化および/または増殖とを比較する段階であって、細胞の分化および/または増殖を増加させた場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤が、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする、請求項26記載の使用。
- FGFとFGFRとの結合を妨害すること、FGFRのリン酸化を妨害すること、FGF/FGFR相互作用の上流もしくは下流のシグナル経路の成分を妨害すること、FGFRとHSPGとの結合を妨害すること、FGFとCFRとの結合を妨害すること、またはFGFRの二量体化を妨害することにより、薬剤がFGFシグナル経路をアンタゴナイズする、請求項26記載の使用。いくつかの態様では、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする薬剤はTGF、IGF-1、およびWNTシグナル経路から選択されるシグナル経路を妨害する。
- 動物モデルまたはヒトにシグナル経路をアンタゴナイズする薬剤を投与して薬剤に対する動物の応答性を測定する段階であって、動物における脂質生成を阻害したもしくは減少させた場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤が、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする、請求項26記載の使用。
- 悪液質の治療もしくは予防、または脂肪症における局所性欠乏症(localised deficiency)の状態において脂質生成を刺激するための薬物の製造における薬剤の使用であって、薬剤がFGFシグナル経路をアゴナイズする使用。
- FGFRポリペプチドまたはその生物活性フラグメント、またはこれらの変異体もしくは誘導体、またはFgfもしくはFgfr遺伝子の発現を調節する遺伝子配列を含む調製物を接触させる段階;およびFGFRポリペプチドまたはその生物活性フラグメント、または変異体もしくは誘導体、または遺伝子配列から発現した産物のレベルもしくは機能活性の増加を検出する段階によって決定されるように、脂質生成を刺激する薬剤がFGFRまたはFgfr遺伝子の発現を調節する遺伝子配列に結合する、請求項37記載の使用。
- FGFRおよびFGFと薬剤とを接触させてFGFRとFGFとの結合を測定する段階であって、FGFRとFGFとの相互作用を刺激した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を刺激する薬剤がFGFシグナル経路をアゴナイズする、請求項37記載の使用。
- 薬剤がFGFまたはFGFRに特異的なアゴニストの抗原結合分子である、請求項39記載の使用。
- FGFRおよびHSPGと薬剤とを接触させてFGFRとHSPGとの結合を測定する段階であって、FGFRとHSPGとの相互作用を刺激した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を刺激する薬剤がFGFシグナル経路をアゴナイズする、請求項37記載の使用。
- 薬剤がHSPGまたはFGFRに特異的なアゴニストの抗原結合分子である、請求項41記載の使用。
- FGFおよびCFRと薬剤とを接触させてFGFとCFRとの結合を測定する段階であって、CFRとFGFとの相互作用を刺激した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を刺激する薬剤がFGFシグナル経路をアゴナイズする、請求項37記載の使用。
- 薬剤がFGFまたはCFRに特異的なアゴニストの抗原結合分子である、請求項43記載の使用。
- 前脂肪細胞またはそれらの前駆体から選択される細胞の第1サンプルとFGFとを接触させて細胞の分化および/または増殖を測定する段階;前脂肪細胞もしくはそれらの前駆体から選択される細胞の第2サンプルと薬剤およびFGFとを接触させて細胞の分化および/または増殖を測定する段階;細胞の第1サンプルの分化および/または増殖と細胞の第2サンプルの分化および/または増殖とを比較する段階であって、細胞の分化および/または増殖を刺激した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を強化する薬剤がFGFシグナル経路をアゴナイズする、請求項37記載の使用。
- FGFとFGFRとの結合を刺激すること、FGFRのリン酸化を刺激すること、FGFRとHSPGとの結合を刺激すること、FGFとCFRとの結合を刺激すること、FGFRの二量体化を刺激すること、またはFGF/FGFR相互作用の上流もしくは下流のシグナル経路を刺激することにより、薬剤がFGFシグナル経路をアゴナイズする、請求項45記載の使用。
- 動物モデルまたはヒトにシグナル経路をアゴナイズする薬剤を投与してその薬剤に対する動物の応答性を測定する段階であって、動物における脂質生成を刺激した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を刺激する薬剤がFGFシグナル経路をアゴナイズする、請求項37記載の使用。
- FGFシグナル経路を調節することが疑われる薬剤を試験する段階;および調節についての試験結果が陽性であることに基づいて薬剤を合成する段階を含む、脂肪症関連状態における脂質生成を調節する薬剤を製造する方法。
- 薬剤を誘導体化する段階、ならびに任意で薬学的に許容される担体および/または希釈剤を用いて誘導体化薬剤を製剤する段階をさらに含む、請求項48記載の方法。
- 患者から得た生物学的サンプル中のFGFシグナル経路に関係する異常な遺伝子、またはFGFシグナル経路に関係する遺伝子の異常な発現産物の存在を決定する段階を含む、患者における脂肪症関連状態の存在を検出する、またはそのリスクを診断するための方法であって、異常な遺伝子または異常な発現産物が脂肪症関連状態の存在またはリスクと相関している方法。
- 異常な遺伝子が、異常なFgf遺伝子および異常なFgfr遺伝子から選択される、請求項50記載の方法。
- 異常な発現産物が、異常なFgf発現産物および異常なFgfr発現産物から選択される、請求項50記載の方法。
- 患者から得た生物学的サンプル中のFGFシグナル経路に関係する異常な遺伝子、またはFGFシグナル経路に関係する遺伝子の異常な発現産物の存在を決定する段階を含む、患者における異常に増加した脂肪症関連状態の存在を検出する、またはそのリスクを診断するための方法であって、異常な遺伝子または異常な発現産物が脂肪症関連状態の存在またはリスクと相関している方法。
- 状態が、肥満症および脂質生成における局所性で異常に増加した状態からなる群より選択される、請求項53記載の方法。
- 脂質生成における局所性で異常に増加した状態が、脂肪腫および脂肪腫症からなる群より選択される、請求項53記載の方法。
- 発現産物の正常な基準レベルまたは機能活性とは相違するFGFシグナル経路に関係する遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性を細胞中で決定する段階を含む、患者における異常に増加した脂肪症関連状態の存在を検出する、またはそのリスクを診断するための方法。
- Fgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3およびIgfbp-6からなる群より選択される遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性の増加または上昇を決定する段階を含む方法であって、細胞が前脂肪細胞またはその前駆体である、請求項56記載の方法。
- Fgf-l、Fgfr-3、Igf-2、Irs-2、Pi3キナーゼ、Pkcθからなる群より選択される遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性の減少を決定する段階を含む方法であって、細胞が前脂肪細胞またはその前駆体である、請求項56記載の方法。
- Fgf-1およびFgf-2から選択される遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性の増加または上昇を決定する段階を含む方法であって、細胞が微小血管内皮細胞である、請求項56記載の方法。
- 治療を必要とする患者にFGFシグナル経路を損傷、または妨害する脂質生成の阻害に有効な量の薬剤、および任意で薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を投与する段階を含む、肥満症または脂質生成の局所性で異常に増加した状態における脂質生成を阻害する、または減少させる方法。
- 治療を必要とする患者にFGFシグナル経路を刺激する脂質生成の強化に有効な量の薬剤、および任意で薬学的に許容される担体もしくは希釈剤とを投与する段階を含む、悪液質または脂肪症における局所性欠乏症の状態を治療または予防する方法。
- 脂肪症関連状態を治療または予防するための薬物の調製における、FGFシグナル経路を調節する薬剤の使用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US39213002P | 2002-06-27 | 2002-06-27 | |
PCT/AU2003/000826 WO2004003179A1 (en) | 2002-06-27 | 2003-06-27 | Differentiation modulating agents and uses therefor |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010106139A Division JP2010215636A (ja) | 2002-06-27 | 2010-05-06 | 分化調節薬剤およびその使用法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005535629A true JP2005535629A (ja) | 2005-11-24 |
Family
ID=30000816
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004516341A Pending JP2005535629A (ja) | 2002-06-27 | 2003-06-27 | 分化調節薬剤およびその使用法 |
JP2010106139A Pending JP2010215636A (ja) | 2002-06-27 | 2010-05-06 | 分化調節薬剤およびその使用法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010106139A Pending JP2010215636A (ja) | 2002-06-27 | 2010-05-06 | 分化調節薬剤およびその使用法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP2267117A3 (ja) |
JP (2) | JP2005535629A (ja) |
CN (1) | CN1678734B (ja) |
AU (2) | AU2003236557B2 (ja) |
CA (1) | CA2490261A1 (ja) |
NZ (1) | NZ537208A (ja) |
WO (1) | WO2004003179A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010215636A (ja) * | 2002-06-27 | 2010-09-30 | Verva Pharmaceuticals Pty Ltd | 分化調節薬剤およびその使用法 |
JP2017509628A (ja) * | 2014-03-11 | 2017-04-06 | ノバルティス アーゲー | リポジストロフィーおよびインスリン産生の欠損またはインスリンシグナル伝達の欠損と関連する代謝性障害を処置する方法 |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005037235A2 (en) * | 2003-10-16 | 2005-04-28 | Imclone Systems Incorporated | Fibroblast growth factor receptor-1 inhibitors and methods of treatment thereof |
WO2005093083A1 (ja) * | 2004-03-29 | 2005-10-06 | Kazuhisa Maeda | 疾病予測方法、及びその利用方法 |
US20090176306A1 (en) * | 2005-06-10 | 2009-07-09 | Toshio Taira | Method of inducing differentiation from visceral preadipocyte to visceral adipocyte |
GB0520063D0 (en) * | 2005-10-03 | 2005-11-09 | Novartis Forschungsstiftung | Methods for regulating metabolism and diagnosing disease |
US7946916B2 (en) | 2006-01-12 | 2011-05-24 | Waterleaf Ltd. | Variable payout wager games |
CN101058801B (zh) * | 2007-04-13 | 2010-05-19 | 中国人民解放军第二军医大学 | 促进人皮下脂肪干细胞分化成熟的方法及其应用 |
CA2701128A1 (en) | 2007-10-01 | 2009-04-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression |
CN101259266B (zh) * | 2008-04-14 | 2010-04-14 | 山东大学 | 一种前脂肪细胞异种疫苗及其制备方法和用途 |
US20130116171A1 (en) | 2010-04-16 | 2013-05-09 | Salk Institute For Biological Studies | Methods for treating metabolic disorders using fgf |
JP6043347B2 (ja) | 2011-06-16 | 2016-12-14 | アイオーニス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッドIonis Pharmaceuticals,Inc. | 線維芽細胞増殖因子受容体4の発現のアンチセンス調節 |
US9446096B2 (en) | 2011-12-30 | 2016-09-20 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Glypican-4 based compositions and methods for treating and diagnosing insulin resistance |
GB201202319D0 (en) | 2012-02-10 | 2012-03-28 | Orbsen Therapeutics Ltd | Stromal stem cells |
KR20150143625A (ko) | 2013-04-16 | 2015-12-23 | 오르브센 테라퓨틱스 리미티드 | 신데칸 2의 의학적 용도 |
WO2015061331A1 (en) | 2013-10-21 | 2015-04-30 | Salk Institute For Biological Studies | Chimeric fibroblast growth factor (fgf) 2/fgf1 peptides and methods of use |
JP6621752B2 (ja) | 2013-10-21 | 2019-12-18 | ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ | 変異した線維芽細胞増殖因子(fgf)1および使用方法 |
WO2016154019A1 (en) | 2015-03-20 | 2016-09-29 | Orbsen Therapeutics Limited | Modulators of syndecan-2 and uses thereof |
WO2016172290A1 (en) * | 2015-04-21 | 2016-10-27 | Salk Institute For Biological Studies | Methods of treating lipodystrophy using fgf-1 compounds |
JP2018535964A (ja) | 2015-10-30 | 2018-12-06 | ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ | 線維芽細胞増殖因子(fgf)1アナログによるステロイド誘導性高血糖の処置 |
EP3922253A1 (en) | 2016-01-15 | 2021-12-15 | Orbsen Therapeutics Limited | Sdc-2 exosome compositions and methods of isolation and use |
US11268067B2 (en) | 2017-07-14 | 2022-03-08 | Orbsen Therapeutics Limited | Methods of isolation and use of CD39 stromal stem cells |
CA3117036A1 (en) * | 2018-10-26 | 2020-04-30 | Ivan GALANIN | Topical compositions and methods to promote optimal dermal white adipose tissue composition in vivo |
US11542309B2 (en) | 2019-07-31 | 2023-01-03 | Salk Institute For Biological Studies | Fibroblast growth factor 1 (FGF1) mutant proteins that selectively activate FGFR1B to reduce blood glucose |
AU2021327387A1 (en) | 2020-08-21 | 2023-05-04 | Genzyme Corporation | Fgfr3 antibodies and methods of use |
Family Cites Families (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US424279A (en) | 1890-03-25 | Supporting wheel or pulley | ||
US4018653A (en) | 1971-10-29 | 1977-04-19 | U.S. Packaging Corporation | Instrument for the detection of Neisseria gonorrhoeae without culture |
US4016043A (en) | 1975-09-04 | 1977-04-05 | Akzona Incorporated | Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies |
US4849338A (en) | 1982-07-16 | 1989-07-18 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay |
US4843000A (en) | 1979-12-26 | 1989-06-27 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay |
US4366241A (en) | 1980-08-07 | 1982-12-28 | Syva Company | Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
EP0420081A1 (en) * | 1989-09-26 | 1991-04-03 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Monoclonal antibody against an acidic FGF protein, its production and use |
US5433896A (en) | 1994-05-20 | 1995-07-18 | Molecular Probes, Inc. | Dibenzopyrrometheneboron difluoride dyes |
US5227487A (en) | 1990-04-16 | 1993-07-13 | Molecular Probes, Inc. | Certain tricyclic and pentacyclic-hetero nitrogen rhodol dyes |
US5405975A (en) | 1993-03-29 | 1995-04-11 | Molecular Probes, Inc. | Fluorescent ion-selective diaryldiaza crown ether conjugates |
US5326692B1 (en) | 1992-05-13 | 1996-04-30 | Molecular Probes Inc | Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift |
US5723218A (en) | 1990-04-16 | 1998-03-03 | Molecular Probes, Inc. | Dipyrrometheneboron difluoride labeled flourescent microparticles |
US5274113A (en) | 1991-11-01 | 1993-12-28 | Molecular Probes, Inc. | Long wavelength chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes and conjugates |
US5459276A (en) | 1994-05-20 | 1995-10-17 | Molecular Probes, Inc. | Benzazolylcoumarin-based ion indicators for heavy metals |
US5453517A (en) | 1992-02-25 | 1995-09-26 | Molecular Probes, Inc. | Reactive derivatives of bapta used to make ion-selective chelators |
US5648270A (en) | 1995-02-06 | 1997-07-15 | Molecular Probes, Inc. | Methods of sensing with fluorescent conjugates of metal-chelating nitrogen heterocycles |
WO1992001813A1 (en) | 1990-07-25 | 1992-02-06 | Syngene, Inc. | Circular extension for generating multiple nucleic acid complements |
WO1993006121A1 (en) | 1991-09-18 | 1993-04-01 | Affymax Technologies N.V. | Method of synthesizing diverse collections of oligomers |
US5422252A (en) | 1993-06-04 | 1995-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Simultaneous amplification of multiple targets |
EP0862656B1 (en) | 1995-11-21 | 2001-03-07 | Yale University | Unimolecular segment amplification and detection |
ATE212552T1 (de) * | 1998-04-17 | 2002-02-15 | Tufts College | Map kinase-inhibitoren zur behandlung von durch tnf-alpha induzierte lipolyse- verursachte krankheiten |
US6153432A (en) * | 1999-01-29 | 2000-11-28 | Zen-Bio, Inc | Methods for the differentiation of human preadipocytes into adipocytes |
BR0010482A (pt) * | 1999-05-21 | 2002-04-23 | Bristol Myers Squibb Co | Inibidores pirrolotriazìnicos de cinases |
JP2004500037A (ja) * | 1999-09-08 | 2004-01-08 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 繊維芽細胞成長因子−19(fgf−19)核酸及びポリペプチド並びに肥満の治療のための利用の方法 |
AU2631001A (en) * | 2000-01-05 | 2001-07-16 | Zymogenetics Inc. | Novel fgf homolog zfgf11 |
WO2001070977A2 (en) * | 2000-03-22 | 2001-09-27 | Amgen, Inc. | Fibroblast growth factor receptor-like molecules and uses thereof |
KR20080023768A (ko) | 2000-03-30 | 2008-03-14 | 화이트헤드 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치 | Rna 간섭의 rna 서열 특이적인 매개체 |
WO2001072957A2 (en) * | 2000-03-31 | 2001-10-04 | Nobuyuki Itoh | Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof |
EP1202065A1 (en) * | 2000-10-25 | 2002-05-02 | Aventis Pharma S.A. | Net, a transcription factor of the TCF family, as regulator of angiogenic expression. |
CA2486183C (en) * | 2002-05-23 | 2012-01-10 | Cytopia Pty Ltd. | Protein kinase inhibitors |
TW200401638A (en) * | 2002-06-20 | 2004-02-01 | Bristol Myers Squibb Co | Heterocyclic inhibitors of kinases |
WO2004003179A1 (en) * | 2002-06-27 | 2004-01-08 | The University Of Queensland | Differentiation modulating agents and uses therefor |
-
2003
- 2003-06-27 WO PCT/AU2003/000826 patent/WO2004003179A1/en active Application Filing
- 2003-06-27 CA CA002490261A patent/CA2490261A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-27 AU AU2003236557A patent/AU2003236557B2/en not_active Ceased
- 2003-06-27 EP EP10184571A patent/EP2267117A3/en not_active Withdrawn
- 2003-06-27 JP JP2004516341A patent/JP2005535629A/ja active Pending
- 2003-06-27 NZ NZ537208A patent/NZ537208A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-06-27 EP EP03735152A patent/EP1539931A4/en not_active Withdrawn
- 2003-06-27 CN CN03820407XA patent/CN1678734B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-12-24 AU AU2009251219A patent/AU2009251219B2/en not_active Ceased
-
2010
- 2010-05-06 JP JP2010106139A patent/JP2010215636A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010215636A (ja) * | 2002-06-27 | 2010-09-30 | Verva Pharmaceuticals Pty Ltd | 分化調節薬剤およびその使用法 |
JP2017509628A (ja) * | 2014-03-11 | 2017-04-06 | ノバルティス アーゲー | リポジストロフィーおよびインスリン産生の欠損またはインスリンシグナル伝達の欠損と関連する代謝性障害を処置する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NZ537208A (en) | 2009-02-28 |
CA2490261A1 (en) | 2004-01-08 |
WO2004003179A1 (en) | 2004-01-08 |
AU2003236557B2 (en) | 2009-10-01 |
EP1539931A4 (en) | 2006-08-23 |
AU2009251219B2 (en) | 2013-01-10 |
EP2267117A3 (en) | 2011-07-13 |
AU2003236557A1 (en) | 2004-01-19 |
EP2267117A2 (en) | 2010-12-29 |
CN1678734B (zh) | 2012-12-12 |
CN1678734A (zh) | 2005-10-05 |
EP1539931A1 (en) | 2005-06-15 |
AU2009251219A1 (en) | 2010-01-28 |
JP2010215636A (ja) | 2010-09-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2010215636A (ja) | 分化調節薬剤およびその使用法 | |
Schaefer et al. | Small proteoglycans in human diabetic nephropathy: discrepancy between glomerular expression and protein accumulation of decorin, biglycan, lumican, and fibromodulin | |
Shinoda et al. | Regulation of bone formation by adiponectin through autocrine/paracrine and endocrine pathways | |
Silaghi et al. | Expression of adrenomedullin in human epicardial adipose tissue: role of coronary status | |
Wulff et al. | Luteal angiogenesis: prevention and intervention by treatment with vascular endothelial growth factor trapA40 | |
Park et al. | Expression of transforming growth factor-β and type IV collagen in early streptozotocin-induced diabetes | |
Sharma et al. | Subtype-selective induction of wild-type p53 and apoptosis, but not cell cycle arrest, by human somatostatin receptor 3. | |
US20120059047A1 (en) | Differentiation modulating agents and uses therefor | |
US7645616B2 (en) | Use of lipocalin-2 as a diagnostic marker and therapeutic target | |
JP4863548B2 (ja) | 結合組織増殖因子のモジュレーション、調節および抑制による腎障害の検出、予防および治療方法 | |
US8383600B2 (en) | Increasing glucose transport and insulin-stimulated glucose uptake | |
US8889639B2 (en) | Compositions and methods for modulating PGC-1β to treat lipid-related diseases and disorders | |
US8519118B2 (en) | RIP140 regulation of glucose transport | |
US20090317393A1 (en) | Method of modifying glucose activity using polypeptides selectively expressed in fat tissue | |
Wookey et al. | Amylin as a growth factor during fetal and postnatal development of the rat kidney | |
Faraj et al. | Insulin regulation of gene expression and concentrations of white adipose tissue-derived proteins in vivo in healthy men: relation to adiponutrin | |
López et al. | Adrenomedullin as a pancreatic hormone | |
WO2005065686A1 (en) | Differentiation modulating agents and uses therefor | |
Yang et al. | Regulation of FAT/CD36 mRNA gene expression by long chain fatty acids in the differentiated 3T3-L1 cells | |
JP2004508326A (ja) | 心臓疾患治療用のcarp阻害剤の使用 | |
Kim et al. | Immunohistochemical localization of eight phospholipase C isozymes in pancreatic islets of the mouse | |
Wang et al. | Clusterin is closely associated with adipose tissue insulin resistance | |
CA2405548A1 (en) | Steatosis-modulating factors and uses thereof | |
JP2009204475A (ja) | インスリン抵抗性マーカー | |
Žarković et al. | Analysis of the in vitro secretory activity of human pituitary adenomas: modification of corticotropin release from adenoma tissue explant cultures by addition of a human plasma ultrafiltrate bioactive fraction |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060518 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20060518 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20071116 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20071116 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091102 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100201 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100208 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20100426 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100506 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100426 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110525 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110922 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111102 |
|
A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20111109 |
|
A912 | Removal of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20120120 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130606 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130611 |