JP2005529342A

JP2005529342A - 生物学的または他の分子のアレーの製造装置および方法

Info

Publication number: JP2005529342A
Application number: JP2004512161A
Authority: JP
Inventors: ロバートジークックス; ツェンオウヤン
Original assignee: パデューリサーチファンデイション
Priority date: 2002-06-07
Filing date: 2003-06-09
Publication date: 2005-09-29
Also published as: US20030226963A1; WO2003105183A1; CA2488623A1; CN1675739A; ZA200500091B; US20080227657A1; EP1540698A4; EP1540698A1; AU2003245426A1; KR20050032034A; RU2004138798A; US7361311B2

Abstract

気相イオンへの転換、質量/電荷比および/または移動度に基く分離、および各分離イオンの収集による混合物中の種の分離方法および装置。該装置(１８)は、イオン化種の流れ(２３)を生成させる多重化エレクトロスプレーイオン源(１９)を含み、イオン化種の流れは分離用の線型イオントラップに供給する。各々の分離した種は、焦点化用レンズ(２９)を通って基体上のスポット(１４)上に付着する。

Description

発明の詳細な説明

本出願は、2002年6月7日に出願された米国仮出願第60/387,241号に対する35 U.S.C. §119(e)による権利を請求する。
(発明の概要)

本発明は、一般に、たんぱく質または他の分子の混合物から分離した生物学的または他の分子のアレーの製造装置および方法に関する。
（背景技術）

化学試験を実施するための位置形成された試薬ターゲットスポットのマトリックスを有するマイクロアレーは、公知である。既知の試薬を、当該技術において周知のスポット化方法によって付着させている。サンプルの分析においては、サンプルを上記アレーと反応させ、別の化学試験を各スポットの上記試薬によって実施する。
種々のタイプの質量分析計が、たんぱく質のような分子を質量分析によって同定するのに使用されている。これらの分子は、イオン化され、その後、質量分析用の質量分析計に導入される。近年、質量分析計は、生化学者がたんぱく質のような小および大分子の双方を同定し且つたんぱく質のような分子の分子構造を判定するのに使用されてきている。
生物学的化合物の混合物は、通常、混合物の構成成分を質量分析する前に、クロマトグラフィー法によって分離されている。ある場合には、混合物のクロマトグラフィー分離成分を使用してチップまたはアレー類を作成している。
プロテオミクスにおいては、その目的は、任意の所定時間における細胞内での完全たんぱく質補体、即ち、プロテオームの発現レベルを定量することである。プロテオームは、個々に、環境および時間依存性であり、広大な力学的範囲の濃度を有する。２次元電気泳動または電気泳動による分離およびアレー上でのスポットの作成は、厄介で遅い。質量分析のような近代の分析方法は、たんぱく質補体の分離成分の最終分析において使用されている。
表面上へのイオン軟着法(soft-landing)は、1977年に提案され[文献４]、20年後に、成功裏に実証されている[文献５]。インタクトな多価イオン類を、質量分析計において質量選択し、低運動エネルギー(典型的には、5〜10 cV)で表面上に付着させている。SIMS分析を使用して、軟着種C₃H₁₀Si₇O³⁵Cl⁺のフッ素化SAM表面上での存在が確認された。証拠により、立体的に嵩高の基を有するイオン類は小イオン類よりも良好な付着効率を有することが示唆されている[文献６]。有機カチオン類[文献７]および16量体二本鎖DNA[文献８] (質量、約10 kDa)も、金属クラスターを有するような表面上への軟着完全体である[文献９]。これらの場合の幾つかにおいては、表面上の分子存在物がイオンであり、他の場合では、当該存在物が相応する中性分子であるという証拠が存在している。インタクトウイルス類をイオン化し、真空下で質量分析計に通し、収集し、そして生存し得たままであるという証拠さえも存在する[文献１１]。

(発明の概要及び目的)
たんぱく質のような分子のアレー中での保存と組合せた異なる分離方法が求められている。
本発明の装置および方法においては、たんぱく質または他の生化学分子の混合物中のサンプル分子をイオン化し、気相中で種々の質量のイオン類として分離し、これらサンプル分子を後で加工または分析するために保存する基体上に付着または軟着させる。さらに詳細には、たんぱく質およびオリゴヌクレオチドのような生物学的化合物の分子を、例えば、エレクトロスプレーイオン化、マトリックス支援レーザー脱離イオン化または他のイオン化手段によりイオン化する。混合物のイオン化した分子を、質量、電荷および移動度またはこれらパラメーターの組合せに従い、イオンまたは相応する中性物として分離し、その後、アレーを形成する基体上の別々の位置に軟着させる。その後、各位置の収集生体分子は、アフィニティー結合法または他の生化学的に特異性の方法により、さらに、表面増強ラマン分光法(SERS)、蛍光法もしくはマトリックス支援レーザー脱離/イオン化法(MALDI)のようなレーザー系方法、または他の質量分析法により、同定し分析し得る。
本発明の目的は、たんぱく質または他の生化学分子のイオンを、分離したたんぱく質または他の生化学分子のアレー(これらの分離したたんぱく質または他の生化学分子を同定しまたはさらに反応させ、さもなくば加工し得る形の)として、分離し保存する改良された装置および方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、生化学化合物の分子をイオン化し、質量、移動度またはその双方に従って分離し、その後分析するための特定の分離たんぱく質または他の生体分子のスポットのマイクロアレーとして保存する装置および方法を提供する。
また、本発明の目的は、アッセイ用の基質として機能する既知または未知の化合物のアレーを製造することである。
本発明は、添付図面と一緒に読むときの以下の説明からより明らかに理解し得るであろう。

(好ましい態様の説明)
生体分子アレーを有する微小チップの製造を図１に略図的に示している。第１工程は、サンプル混合物液体溶液１０(または、他の場合は、固形物質)中に含有されたたんぱく質または生体分子のイオン化１１である。分子は、エレクトロスプレーイオン化(ESI)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)または他の周知のイオン化法によってイオン化し得る。その後、各イオンをそれらの質量/電荷比、それらの移動度、またはそれらの質量/電荷比および移動度の双方に基づき分離する(１２)。例えば、各イオンは、４重極イオントラップ(ポールトラップ、円筒型イオントラップ[文献２]および線型イオントラップ[文献３]として知られる変形を含む)またはイオンサイクロトロン共鳴(ICR)トラップのようなイオン貯蔵装置内に集積し得る。この装置内または別の質量分析器(４重極質量フィルターまたは扇形磁場もしくは飛行時間のような)を使用するのいずれかにより、貯蔵イオンを質量/電荷比に基づき分離する。更なる分離はイオン浮動装置を使用する移動度に基づき得、或いはこれら２つの方法を合体させ得る。その後、分離した各イオンをこれらイオンの質量/電荷比または移動度に従い、個々のスポット即ち位置１４で微小チップ即ち基体１３上に付着させてマイクロアレーを作成する。これを達成するためには、微小チップ即ち基体をx-y方向１６および１７に移動または走査し、各スポット位置で所定時間停止させて十分な数の生体分子を付着可能にして所定密度を有するスポットを形成させる。また、上記各気相イオンを静止チップ即ち基体の表面上の異なるスポットに電子的にまたは磁力的に導いてもよい。各分子は、好ましくは、その構造を保ったままで表面上に付着させる、即ち、各分子を軟着させる。以下の２つの事実が、付着時の分解または変性を回避し得るのを可能にしている。第１に、大きいイオン類は、その低速度および自由度数の多さにより、小さいイオン類よりも分解または異性化(変性)を受けるのがはるかに少ないようであり、第２に、穏やかな付着を達成し得るという以前の証拠が存在する(Feng, B, et al., J. Am. Chem. Soc. 121 (1999) 8961-8962)。軟着に適する表面は、軟着中の振動エネルギーを効率的に排除するが分光同定を可能にする化学的に不活性な表面である。中和、再水和を促進する或いは他の特定の特徴を有する表面もたんぱく質軟着において使用し得る。

上記で簡単に説明したように、質量分析計を、サンプルイオン類をその質量/電荷比に従って分離するのに使用し得る。本発明に従う装置１８を図２に略図的に例示する。サンプルを多重化エレクトロスプレーイオン源１９に適用する[文献１]。ナノスプレーノズル２１を出る各生体分子を各ナノスプレーノズルと部材２２間に適用された電圧によりイオン化する。各イオン化生体分子の流れ２３を１つの高イオン容量線型イオントラップ２４中に供給する。該イオントラップは、間隔を置いた複数のロッド２６と末端電極２７、２８を含む。知られているように、該イオントラップは、トラップ内に各イオンを集積させるように操作し、その後、各イオンを選択的に励起して、各イオンがそれらイオンの質量/電荷比に従ってトラップを出るようにし得る。焦点化用レンズアッセンブリ２９により、発出生体分子イオンを微小チップ１３上のスポット１４中に焦点化する。該レンズアッセンブリは、各イオンの速度、従って、軟着における付着エネルギーを制御し得る。以下でより詳細に説明するように、他のタイプの質量分析計または分析器を使用して各生体分子イオンを分離し微小チップ上に付着させることもできる。多重化イオンスプレーの使用は、十分なイオン数を集積して所望量のスポットを形成させるのに要する時間を短縮する。
１つの実施例においては、たんぱく質および生体分子類を線型４重極質量フィルターを使用して軟着させた。市販のThermo Finnigan (San Jose社、カリフォルニア州) SSQ 710Cをエレクトロスプレーイオン化(ESI)源を加えることによって修正した(図３)。該イオン化源は、毛管３２中にたんぱく質混合物を導入するシリンジ３１を含んでいた。高電圧(IIV)を毛管３２とエレクトロスプレーイオン化用のイオン化チャンバー(図示せず)の間に適用した。この計器の各種のチャンバー(図示せず)および素子並びにそれらの圧力を図３において略図的に示し特定している。マイクロアレープレート１３を最後の真空チャンバー内でx-y移動するように取付けた。x-yマイクロアレープレート駆動は、その構造が当業者において周知であるので図示していない。１つの実施例においては、0.5μl/分の流量を試験全体に亘って使用した。イオン付着用の表面は、検出器アッセンブリの後に置いた。イオン検出モードにおいては、転換ダイノード３３および乗算器３４上の高電圧を作動させ、各イオンを検出して全体スペクトル量、シグナル対ノイズ比および全質量範囲に亘っての質量解明を検証可能にした。イオン付着モードにおいては、上記転換ダイノードおよび乗算器上の電圧を解除し、各イオンを検出アッセンブリ内の孔を通過させてプレート１３の金表面に到達させた。この表面は接地させて、上記イオン源と表面との電位差は0ボルトであった。

質量分析計を使用しての予備的分離を実証するために、３種のたんぱく質、即ち、シトクロムc、リゾチームおよびアポミオグロビンの混合物をエレクトロスプレーイオン化(ESI)に供した。個々のイオンをSSQ-710C (Thermo Finnigan、San Jose社、カリフォルニア州)質量分析計を使用して分離した。各純粋たんぱく質をイオン軟着により収集した。各々の場合において、質量検出窓は、5質量/電荷単位であった；質量対電荷比の単位は、トムソン(Th) (1Th = 1質量単位/単位電荷)を使用して報告する[文献１０]。各付着たんぱく質を1：1メタノール：H₂O(容量/容量)溶液で表面を洗浄することによって再溶解させた。各洗浄溶液をLCQ Classic (Thermo Finnigan、San Jose社、カリフォルニア州)質量分析計を使用して試験した。
溶液は、100μLの1：1メタノール：H₂O(容量/容量)中0.02 mg/mLシトクロムc (Sigma-Aldrich社、ミズーリ州セントルイス)、200μLの1：1メタノール：H₂O(容量/容量)中0.01 mg/mLリゾチーム(Sigma-Aldrich社、ミズーリ州セントルイス)、200μLのH₂O中0.05 mg/mLアポミオグロビン(Sigma-Aldrich社、ミズーリ州セントルイス)を混合することによって調製した。
金基体(20 mm×50 mm、International Wafer Service社)をイオン軟着用に使用した。この基体は、5 nmのクロム接着層と200 nmの多結晶性蒸着金を有するSiウェーハからなっていた。イオン付着に使用する前に、この基体は、2：1比のH₂SO₄とH₂O₂の混合物で清浄化し、脱イオン水と無水エタノールで十分に洗浄し、その後、150℃で乾燥させた。中心に8 mm直径の孔を有するテフロン（登録商標）マスク(24 mm×71 mm)を使用して金表面を覆い、金表面の8 mmの直径を有する円領域のみを各質量選択性イオンビームのイオン軟着用のイオンビームに暴露させるようにした。テフロン（登録商標）マスクも、使用前に、1：1のMeOH：H₂O(容量/容量)で清浄化し、昇温下に乾燥させた。上記表面およびマスクをホルダー上に固定し、暴露表面領域をイオン光軸の中心と照準合せした。

各たんぱく質において、90分間のイオン軟着時間を使用した。各々のイオン付着の間で、計器を通気し、テフロン（登録商標）マスクを移動させて新鮮表面領域を露出し、表面ホルダーを再配置してターゲット領域をイオン光軸と照準合せした。シリンジを上記たんぱく質混合物溶液で再充填し、ESI条件を、検出モードにおいてスペクトル量をモニターすることによって、イオン付着前に調整した。シリンジ先端に適用した電圧は変化させた：−7 kVをシトクロムCにおいて使用し、−4.9 kVをリゾチームにおいて使用し、−5.2 kVをアポミオグロブリンにおいて使用した。
図４は、シトクロムc、リゾチームおよびアポミオグロビンの混合物のESI質量スペクトルを示す。+9荷電状態のシトクロムc (1360 Th；化学平均質量)、+11荷電状態のリゾチーム(1301 Th)および+15荷電状態のアポミオグロビン(1131 Th)の各イオンを個々にイオン軟着において選択した。分離したイオンの質量対電荷比において中心とした5 Thの質量分離窓を使用した。３種のたんぱく質においてSSQ-710C (Thermo Finnigan、San Jose社、カリフォルニア州)上で選択した質量範囲は、次の通りであった：シトクロムcにおいて1360〜1365 Th；リゾチームにおいて1300.5〜1305.5 Th；およびアポミオグロビンにおいて1135〜1140 Th。
軟着後、テフロン（登録商標）マスクを表面から取除き、３つの暴露表面を1：1メタノール/H₂O(容量/容量)溶液で洗浄した。各領域を50μl溶液で２回洗浄した。洗浄溶液を、LCQ Classicを使用しループ注入(5μl)により分析した。アポミオグロビン溶液は、分析前に酸性化した。
図５は、各洗浄溶液の分析から記録したスペクトルを示す。シトクロムc +9に暴露させた表面領域の洗浄により得られた溶液からは、+7〜+12のシトクロムc荷電状態に相応するイオンが観察され(図５a)；+8〜+10のリゾチーム荷電状態に相応するイオンがリゾチーム+11に暴露させた表面領域の洗浄溶液において見出され(図５b)；アポミオグロビン荷電状態+9〜+18に相応するイオン⁵は、アポミオグロビン+15に暴露させた表面領域の洗浄溶液において観察された(図５c)。
４つの結論をこの試験から導き出し得る。1) たんぱく質類は、質量選択性イオンを使用してイオン軟着により表面上で収集し得る。2) 各洗浄溶液は、表面上で選択され付着したたんぱく質のみを含有しており、各イオンが気相中の他のイオン性または中性種から良好に分離されていることを示唆していた。3) 分子イオンのみが洗浄溶液中で観察されており、このことは、イオン軟着がインタクトたんぱく質分子構造を保持し得ることを意味する。4) 質量スペクトルが正しく特定の軟着状態ではなく荷電状態の分布を示すという事実は、たんぱく質が表面上への付着時または再溶媒和後に中性化されていることを示唆している。

付着リゾチームの生物活性を、基質としてヘキサ-N-アセチルキトヘキサオースを使用して試験した。[リゾチーム+8H]⁸⁺を、上述の試験条件を使用して、Auターゲット上に4時間付着させた。表面を、7.8のpHで2 mMのNa+を含有する1μMのヘキサ-N-アセチルキトヘキサオース溶液を使用して洗浄した。溶液を＋38℃で2.5時間インキュベートし、前記LCQ計器を使用して陽イオンESIモードで分析した。原溶液および消化生成物のスペクトルを図６Aおよび６Bに示す。
原基質溶液のスペクトルはヘキサ-N-アセチル-キトヘキサオースの存在のみを示しているが、消化生成物のスペクトルは、基質の酵素消化からの開裂生成物であるテトラ-N-アセチル-キトテトラオースおよび他のN-アセチルグルコサミンオリゴマーの強烈なナトリウム付加(sodiated)分子イオンを示している。４つの結論がこの試験から導き出され得る：1) 上記質量分析器によって選択されたたんぱく質イオン質量は、表面上にイオン軟着により収集されている；2) 各洗浄溶液は表面上に付着するように選択されたイオンに相応するたんぱく質のみを含有しており、このことは、各イオンが気相中の他のイオン性または中性種から良好に分離されていることを示唆している；3) インタクト分子イオンのみが洗浄溶液中で観察されており、このことは、イオン軟着がたんぱく質分子構造を保持し得ることを意味する；そして、4) 軟着リゾチームは、ヘキサ-N-アセチル-キトヘキサオースを開裂してテトラ-N-アセチルキトテトラオースを生成させ、このたんぱく質の正常な酵素活性を示唆し得ていた。

軟着たんぱく質が生物活性を保持しているという更なる実験的証拠を提供するために、２つの酵素、トリプシンとリゾチームの混合物をSSQ-710C (Thermo Finnigan、San Jose社、カリフォルニア州)質量分析計内で分離し、各純粋たんぱく質をイオン軟着によって収集した。２つのブランクサンプルを200 Th〜210 Thの質量/電荷領域(たんぱく質イオンを含有していない領域)内のイオンを付着させることによって生成させた。上述の試験の場合におけるのと同じ計器パラメーターを使用した。混合物溶液は、200μLの1：1 MeOH：H₂O(容量/容量)中0.01 mg/mLリゾチーム(Sigma-Aldrich社、ミズーリ州セントルイス)と0.01 mg/mLの1%AcOH含有1：1 MeOH：H₂O中トリプシンを混合することによって調製した。
4枚の10 mm×5 mmスチールプレート３６を、図７Aおよび７Bに示すようにしてステップモーター３９に連結させた開口３８を有する回転可能なスチールディスク３７上に取付けた。検出器３３、３４を上記ディスクの後に取付け、開口３８を通るイオンを検出した。
[リゾチーム+8H]⁸⁺、[トリプシン+12H]¹²⁺の各イオンおよび２つのブランクを、4枚の別々のスチールプレート上に、質量窓を変更し付着作業の間ディスクを回転させることによって付着させた。各作業は3時間長であった。計器は付着の間通気しなかった。付着リゾチームの生物活性を、7.8のpHで2 mMのNa⁺を含有する1μMのヘキサ-N-アセチルキトヘキサオース溶液の10μLを付着リゾチームを担持するプレートとブランクプレートの1枚上にピペット滴下することによって試験した。この系を37℃で4時間インキュベートした。蒸発溶媒は、連続的に補充した。4時間後、2μLのMeOH：H₂O 1：2中3% 2,5-ジヒドロキシ安息香酸を添加し、溶媒を蒸発させて乾固させた。プレートをBruker Reflex III MALDI-TOF質量分析計中に移し、MALDIデータを、低質量範囲においては反射モード(図８A)で、高質量範囲においては線形モード(図８B)で集めた。低質量MALDIスペクトルは、基質と開裂生成物の双方のナトリウム付加分子イオンを示した。高質量MALDIスペクトルは、インタクト酵素と酵素-基質複合体の単一および二重荷電イオンを示している。
付着トリプシンの生物活性を、10μLの10mM NH₄CO₃水溶液中1μMシトクロムC溶液を付着トリプシン担持プレート上およびブランク上にピペット滴下することによって試験した。この系を37℃で4時間インキュベートした。蒸発溶媒は、連続的に補充した。4時間後、2μLのACN：H₂O 1：2(0.1%TFAを含有する)中飽和α-シアノ-3-ヒドロキシ-桂皮酸を添加し、溶媒を蒸発させて乾固させた。プレートをBruker Reflex III MALDI-TOF質量分析計中に移し、MALDIデータを反射モードで集めた(図９)。シトクロムCの特徴的なトリプシン性フラグメントを検出した。

もう１つの実施態様においては、線型イオントラップを軟着用計器のコンポーネントとして使用した。軟着用計器の略図を図１０に示す。この計器は、大気圧下でのESI源のようなイオン源を含む。各イオンは、加熱毛管を経て真空度を増大中の各チャンバー内のイオンガイド４４、４６により第２チャンバー中に移動する。各イオンは、電極４７と４８に適切な電圧を、イオントラップロッド４９の部分にRFおよびDC電圧を適用することによって線型イオントラップ４３内に捕捉される。貯蔵イオンは、検出のために放射状に発出させ得る。また、イオントラップは、選択した質量の各イオンをイオンガイド５３、プレート５４を経てマイクロアレープレート１３上に発出させるように操作し得る。上記プレートは、機械的ゲートバルブ装置(図示せず)により、計器全体を通気することなく挿入し得る。
標準のポール(Paul)イオントラップを上回る線型４重極イオントラップの利点としては、イオン貯蔵容量の増大およびイオン類を軸方向および半径方向の双方に発出する能力がある。線型イオントラップは、単位分解能を少なくとも2000トムソン(Th)に与え、単一質量/電荷比のイオンのイオン類を分離する能力を有し、次いで、その後の生成物イオンMS/MSスペクトルを記録するための励起と解離を実行する。質量分析は、共鳴波形法を使用して実施する。線型トラップの質量範囲(2000 Thまたは4000 Thであるが20,000 Thに調整し得る)は、興味ある殆どの生体分子の質量分析および軟着を可能にする。
上述の軟着計器においては、各イオンは、質量フィルターロッドまたはイオントラップロッド中に軸方向で導入する。図２は、適切な軸多重化エレクトロスプレーイオン源を例示している。また、各イオンは、線型イオントラップ中に半径方向に導入してもよい。
単一の高イオン容量線型イオントラップ中に半径方法に供給する各々の先端部を有する多重化ナノエレクトロスプレーイオン源を図１１A、１１B、１１Cおよび１１Dに例示する。この配列は、ナノスプレーイオン化がより高流量のミクロスプレー法よりもはるかに高効率である故に選択している。これらの図面は、２つの可能性あるイオン源/分析器配列を示している。１つの図１１Aにおいては、イオン源は、単純に、イオンを注入する線型イオントラップ分析器の１部である。他方の図１１Bにおいては、イオン源は、別個の装置であるが、分析器と同じrf捕捉電圧を使用して操作し、そのdc電位は軸方向捕捉を与えるよう設定する。イオンを導入する２つの方法も示しており、１つ(図１１D)は各電極中にスリットを切込みこれらのスリットを通して電子をスプレーすることを含み、他方(図１１C)は、電極間にイオンをスプレーすることを含む。

上述の軟着計器および他のタイプの質量分析器を操作してマイクロアレー上で異なる質量のイオンを異なるスポットに軟着させる方法を以下に説明する。図１２の略図的なダイアグラムに関しては、この図は、質量フィルターとして操作される図２および３に示すロッド類のような計器の各ロッドを例示する。たんぱく質混合物の各イオン５６は、質量フィルター５７中に導入する。選択された質量対電荷比のイオンは、質量濾過して所定時間で基体５８上に軟着させる。その後、質量フィルター設定条件を走査しまたはステップさせ、基体の位置の相応する移動が基体５８上の限られた位置でのイオンの付着を可能にする。
各イオン５６は、経時的に分離して、イオンが表面上に異なる時間で到達し付着するようにすることができる。これを実施する間、基体は、分離した各イオンが異なる位置に付着するように移動している。回転ディスクは、とりわけ回転時間が装置の負荷サイクルと合致する場合に使用し得る。使用し得る装置としては、図１３に略図的に例示している飛行時間および線型イオン移動度ドリフトチューブ５９がある。また、各イオンは、走査電界または磁界により、固定表面上の異なるスポットに導き得る。
もう１つの実施態様の図１４においては、各イオン５６は、イオン貯蔵装置および質量分析器の双方として機能する単一装置６１を使用して集積させ分離することができる。使用し得る装置は、イオントラップ類(ポール、円筒型イオントラップ、線型トラップまたはICR) である。各イオンを集積し、その後、各イオンの選択的発出を行って軟着させる(ぞれぞれ、図１４Aおよび１４B)。各イオン５６は、選択された質量対電荷比のイオンとして集積し、分離し、その後、基体５８上に軟着させ得る。このことは、図１５A、１５Bおよび１５Cに例示している。各イオンは、同時に集積し付着させ得る。もう１つの実施例である図１６においては、種々の質量対電荷比の各イオンをイオントラップ中に連続的に集積し、同時に、選択された質量対電荷比の各イオンをSWIFTを使用して発出させ基体５８上に軟着させ得る。

軟着計器の更なる実施態様においては、イオン移動度を、追加の(または別法としての)分離パラメーターとして使用する。前述のように、各イオンは、ESIまたはMALDI源のような適切なイオン化源により発生させる。その後、各イオンを、横方法空気流および電界を使用して空気選別に供する。軟着計器は、図１７に示している。各イオンは、気流６２の力と電界６３によって加えられた力との合さった力によって確立された方向で気体中を通る。各イオンは、経時的に且つ空間で分離される。高めの移動度を有するイオンは表面６４に早く到達し、低めの移動度を有するイオンは表面上の空間または位置において遅く表面に到達する。
上記計器は、分離用および異なる位置での異なる質量の各イオンの軟着用の上述の各装置の組合せを含み得る。２つのそのような組合せとしては、イオン貯蔵(イオントラップ類)プラス経時分離(TOFまたはイオン移動度ドリフトチューブ)、およびイオン貯蔵(イオントラップ類)プラス空間での分離(扇形またはイオン移動度分離器)がある。

たんぱく質形態および生物活性を保持させることが好ましい。方策の組合せを使用し得る。１つは、付着するときの生物学的イオン類の分解または形質転換を回避するために付着エネルギーを低く保つことである。このことは、同時にスポットサイズを最小にするときに実施する必要がある。２つの事項が、付着時の分解を回避するのを可能にしているようである：第１に、大イオンは、その低速度およびエネルギーが分散され得る自由度数が多い故に、小イオンよりも分解または異性化(例えば、たんぱく質変性)を受けるのがはるかに少ないようであり、第２に、穏やかな付着を達成し得るという以前の証拠が存在している。もう１つの方策は、不完全溶媒和形のイオン価生体分子を質量選択し軟着させることである。過度の水和は、生体分子が気相中でその溶液相特性を保つのに必要ではない。水和生体分子イオンは、エレクトロスプレーによって生成させ、まだ“湿潤”している間に分離して軟着させ得る。基体表面は、たんぱく質軟着において“湿潤”表面であり得、１層ほどの少ない水分単分子層を有する表面がある。また、基体表面は、たんぱく質がヒドロキシル官能基によって安定化されるデキストランのような表面であり得る。もう１つの方策は、たんぱく質を質量分離直後で軟着させる前に水和させることである。線型イオントラップのような幾つかのタイプの質量分析計は、水和反応のようなイオン/分子反応を可能にする。水和の水分子の数を調整することは可能であり得る。さらなる方策は、質量選択したイオン類を分離後で軟着前にイオン/分子またはイオン/イオン反応を使用して脱プロトン化して望ましくないイオン/表面反応を回避させるか、或いは後で喪失させる犠牲的な誘導基においてプロトン化することである。
種々の表面が、多かれ少なかれ成功裏に軟着させるのに良好に適しているようである。例えば、付着中に振動エネルギーを有効に除去し得る化学的に不活性な表面が適し得る。また、表面特性も、どのタイプの現場分光同定が可能性あるのかを決定するであろう。たんぱく質イオン類は、MALDIに適する基体上に直接軟着させ得る。同様に、SERS活性表面上への軟着も可能性がなければならない。現場MALDIおよび２次イオン質量分析は、イオン付着工程さらにまた付着物質分析工程において質量分析器としての線型トラップのような二方向質量分析器を使用して実施し得る。このことは、図１０におけるような軟着用計器を示している図１８に例示している。基体上の軟着たんぱく質のアレーは、レーザー７１によって励起され、これらたんぱく質を分析する線型イオントラップ７２中に逆に導かれる。この装置は、図１９に例示するように、殆ど修正することなくたんぱく質SIDに応用し得る。たんぱく質/ペプチド類を捕捉し、分離し、その後、表面に衝突するように発出させる。僅かな遅れの後(TOF-表面-TOF計器におけるような)、各フラグメントは、質量分析のために再び線型トラップ中に注入される。

要するに、本発明の装置および方法においては、たんぱく質または他の分子の混合物中の各サンプル分子をイオン化し、異なる質量のイオンとして気相中で分離し、サンプル分子が後の加工または分析のために保存される基体上に付着または軟着させる。各サンプル分子は、そのm/z (Th)、その移動度または双方によって分離し、荷電または中性の純粋または不純な種として収集し得る。気相分離中、分離すべき各々の種は、複数の分子即ち分子集団の形であり得る。各々の種は、以前の生物活性のいずれも保持して或いは保持することなく、荷電種または中性種として軟着させまたは収集し得る。分離した種は、個々のスポットを有するアレー中または連続トレース中の表面上に収集し得る。これらの種は、表面上で移動性であるか或いは固定し得る。また、分離した種は、液体中に収集してもよい。種々の分離メカニズム(その幾つかは説明してきているが)を使用し得る。これらのメカニズムとしては、濾過(４重質量分析計、他の装置においてイオンモニターモードを選定)、時間的分離(TOF、イオントラップ、IMS、ICR等)、および空間分離(扇形、IMS、TOF等)がある。これらの種は、分離しその後収集し得、或いは分離しながら収集し得る。また、本発明の装置および方法は、微小スケールの反応を実施するのにも使用し得る：小領域上での軟着およびその後の上部への第２の種の付着、化学活性表面の小領域上への軟着、または軟着およびその後のスポットのアレー中の収集物質の幾分かもしくは全部への試薬の付加。
この方法は、分離規模の分離においてクロマトグラフィーの代りに質量分析を使用するという特異な方法である。また、この方法は、アレーが微小液滴を噴霧することによって合成的に構築される方法或いはアレー中のある点で特異的化合物(典型的には、オリゴヌクレオチド類)の付着を可能にする混合物中に試薬類を混合する関連方法に代わる代替法である。上記の軟着計器における多くの潜在的に重要な応用が出現すべきである。これらとしては、複雑な生物学的混合物からの純粋たんぱく質の分離なしでの或いはそれら構成物の知識さえ無しでのたんぱく質(および他の分子)類のマイクロアレーの創生がある。アレー上のこれらの分離たんぱく質は、標準のアフィニティー結合法および生物学または薬理活性の他の試験を使用して検証し得るであろう。

一般に、軟着法は、サンプル類の保存および後での再測定の可能性を有する純粋形の生体分子を検証し認識する新たな方法を提供する。これらの試験は、高感度検出/同定法、例えば、ラマン分光測定法のような表面系分光測定法を使用しての活性アッセイに至るであろう。複雑な混合物(例えば、血清、血漿)からのたんぱく質類の質量分析による分離は、他の分離方法と直交しており、密接に関連した群の化合物(例えば、たんぱく質のグリコシル化形)を分離すべきときに最も有利であり得ることに注目されたい。軟着法の利点は、とりわけ毛管電気クロマトグラフィー(CEC)のようなクロマトグラフィー法と一緒に使用する場合の混合物の微少たんぱく質構成成分まで及ぶ。組換えおよび翻訳後修飾たんぱく質の関連物質分析並びに薬物レセプタースクリーニングのような高処理量試験を予見することが可能である。
他の潜在的な応用としては、以下がある：a) 酵素/基質反応およびレセプター/リガンド反応のような親和性を有する極めて純粋なたんぱく質と他の試薬との反応を実施し得る；b) 結合性試験、リガンド/レセプター同定、小分子薬物/ターゲット対同定；c) 複数修飾形のたんぱく質の解像；d) 生検材料の効果的な分析；およびe) たんぱく質機能に対する翻訳後修飾の効果の測定。
特定の応用分野と関連方法に関する注釈：
たんぱく質チップを製造する別の方法は、大量の高純度たんぱく質を必要とし、特定の用途に極めて絞られる。通常の生成方法は、効果的でない。触媒活性たんぱく質(キナーゼ)を含むチップは、標識化結合を使用し、個々の発現および生成工程のために時間消費性である。
現行技術は、細胞内のたんぱく質と潜在的な薬物との特異的な相互作用の同定を時間消費性で、費用高で困難なものにしている。軟着法を使用して、細胞からのたんぱく質を個々に表面上に付着させ、この表面を候補薬物と一緒にインキュベートし、その後、各スポットを分析してどのたんぱく質が上記潜在的薬物と相互作用するのかを決定し得ていた。

軟着法は、多数の極めて類似する質量のたんぱく質の分離(例えば、酸化インシュリンからのグリコ形物またはインシュリンの分離)に使用し得、この分離は、通常形のクロマトグラフィーによっては可能でない。分離方法として、軟着法は、質量分析系であり、従って、クロマトグラフィー分離と“直交”する。
軟着法は、細胞プロテオーム全体のたんぱく質チップアレーを製造し、低および高存在度たんぱく質双方を1回の実験で試験するのに使用し得る。条件は、操作して(付着時間)、低細胞存在度のたんぱく質のスポットを、その細胞存在アナログ類の量と等量で有する細胞から製造し得た(標準化)。
現在、たんぱく質を僅かにおよそ90％純粋まで精製し得る場合が存在する；90％精製形の活性がたんぱく質自体または汚染物のいずれかに基くのかに関して疑問が存在する。軟着法は、後で活性について試験することのできる極めて純粋なたんぱく質類を調製するのに使用し得た。
酵素類は、質量選択的に分離してアレー内の表面上に固定させて、その活性部位を利用し得るように残存させ得る。この種のアレーは、生物学的アッセイにおいて再使用し得た。
分析物と試薬の双方を軟着によって局在化領域に伝達し、超小規模反応を容易にすることは可能であり得る。例としては、キナーゼ類とその基質類、RNA対合等の試験があり得た。
たんぱく質または他の生化学分子の混合物中の各サンプル分子をイオン化し、異なる質量のイオンとして気相中で分離し、サンプル分子が後の加工または分析のために保存される基体上に付着または軟着させる装置と方法が提供される。さらに詳細には、たんぱく質類およびオリゴヌクレオチド類のような生物学的化合物の分子を、例えば、エレクトロスプレーイオン化、マトリックス支援レーザー離脱イオン化または他のイオン化方法によってイオン化する。混合物のイオン化された各分子を、質量、移動度またはその双方に従う質量分析器によって分離し、その後、基体の別々の位置に軟着させてアレーを形成させる。各位置の収集生体分子は、その後、アフィニティー結合法または他の生化学特異性方法によって、さらに、表面増強ラマン分光測定(SERS)、蛍光、またはマトリックス支援レーザー離脱イオン化(MALDI)分析のようなレーザー系方法によって同定し分析し得る。それらの収集生体分子は、既に既知の化合物であり(例えば、質量分析による分析の結果として)、その場合、後での生化学試験における試薬として使用し得る。

文献：

本発明を実施する１つの実施例における各工程を示すフローチャートである。本発明を実施するための質量分析器の略図である。たんぱく質混合物の各成分を軟着させるのに使用する質量分析計の略図である。種々の荷電状態のイオンを示す、シトクロムc、リゾチームおよびアポミオグロビンの混合物の質量スペクトルである；菱形は、付着用に選択した。シトクロムc +9 (図５A)；リゾチーム+11 (図５B)およびアポミオグロビン+15 (図５C)に対して暴露させた表面領域からの洗浄溶液のスペクトルを示す。ヘキサ-N-アセチルキトヘキサオースを含有する洗浄溶液のスペクトル、および軟着リゾチームによるヘキサ-n-アセチルキトヘキサオースの消化生成物のスペクトルを示す。軟着イオン受入れ用表面をモニターするための回転可能なディスクおよび駆動モーターを示す。軟着リゾチームを担持する表面上でMALDI-TOFによって検出した軟着ヘキサ-N-アセチルキトヘキサオース(NAG₆)とその開裂生成物テトラ-Nアセチル-キトテトラオースのスペクトルを示す。 MALDI-TOFによって検出した表面上の軟着リゾチームのスペクトルを示す。

軟着トリプシンを担持する表面上で検出したシトクロムCの特徴的膠質層フラグメントのスペクトルを示す。線型イオントラップを含むもう１つの装置の略図である。線型イオントラップによる多源イオン化の形状を示す。特定の質量/電荷比のイオン類における濾過による分離を例示する。種々の質量/電荷比のイオン類をすべて分析器に通す、時間による分離を例示する。集積およびその後の選択性発出による分離を例示する。集積、その後の分離、およびその後の軟着を例示する。集積、選択性発出および軟着の同時操作を例示する。移動度に基くイオン分離を例示する。レーザーによってイオン化する表面上の収集サンプルを示す計器の略図的ダイアグラムであり、発出されたイオンは分析用の質量分析計中に返注する。たんぱく質/ペプチド類を捕捉し、分離し、次いで発出して表面上に軟着させ、僅かな遅れの後、これらのたんぱく質/ペプチド類を質量分析用計器中に返注し得る計器を示す。

符号の説明

１０混合物溶液
１１イオン化
１２分離
１３マイクロアレー
１４スポット(位置)
１６ｘ方向
１７ｙ方向
１８本発明に従う装置
１９多重化エレクトロスプレーイオン源
２１ナノスプレーノズル
２２部材
２３イオン化生体分子の流れ
２４高イオン容量線型イオントラップ
２６ロッド
２７、２８電極
２９レンズアッセンブリ
３１シリンジ
３２毛管
３３転換ダイノード
３４乗算器
３６スチールプレート
３７回転可能なスチールディスク
３８開口
３９ステップモーター
４３線型イオントラップ
４４、４６イオンガイド
４７、４８電極
４９イオントラップロッド
５３イオンガイド
５４プレート
５６各イオン
５７質量フィルター
５８基体
５９線型イオン移動度ドリフトチューブ
６１貯蔵装置および質量分析器の双方として機能する単一装置
７１レーザー
７２線型イオントラップ

Claims

下記の各工程を含むことを特徴とする、物質の種の混合物を分離し個々の種を収集する方法：
前記混合物を、前記混合物の各々の種について気相イオンに転換する工程；
前記混合物の各々の種を、荷電種の質量/電荷比または移動度に基づき分離する工程；および、
前記分離した種を収集する工程。
前記種が、分子または分子集団および原子からなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
前記種を荷電種として収集する、請求項１記載の方法。
前記種を中性種として収集する、請求項２記載の方法。
前記種を生物活性により収集する、請求項３または４記載の方法。
前記種を生物活性によらないで収集する、請求項３または４記載の方法。
前記種を、表面上で、個々のスポットのアレーとして収集する、請求項１または２記載の方法。
前記種を連続トレースとして収集する、請求項１または２記載の方法。
収集した種が移動性である、請求項２記載の方法。
収集した種を固定化する、請求項２記載の方法。
前記種を液体中で収集する、請求項１または２記載の方法。
下記の各工程を含むことを特徴とする、分子の混合物から各分子を収集する方法：
前記混合物中の各分子を気相イオンに転換する工程；
前記各気相イオンを各々の質量/電荷比および/または移動度に従って分離する工程；および、
分離した各イオンを収集する工程。
下記の各工程を含むことを特徴とする、分子の混合物から各分子のアレーを製造する方法：
前記混合物を各気相分子イオンに転換する工程；
前記各分子イオンを分離する工程；および、
前記各分子イオンを表面上の種々の位置に付着させる工程。
前記種々の位置がスポットである、請求項１３記載の方法。
前記種々の位置がトレースに沿っている、請求項１３記載の方法。
前記各イオンを質量/電荷比に従って分離する、請求項１３記載の方法。
前記各分子イオンを集積し、その後、質量/電荷比に従って分離する、請求項１３記載の方法。
前記各分子イオンを、これらイオンを分離しながら集積する、請求項１３記載の方法。
前記各分子イオンをそれらの移動度に従って分離する、請求項１３記載の方法。
下記の手段を含むことを特徴とする、分子の混合物からの各分子のアレーの製造用装置：
前記混合物を前記混合物中の各分子の気相イオンとして転換するためのイオン化手段；
前記各イオンをこれらイオンの質量/電荷比または移動度に従って分離するための分離手段；
前記分離手段と共動関係にある表面；および、
分離した分子を前記分離手段から前記表面上に導くための手段。
前記イオン化手段が、エレクトロスプレーイオン化、マトリックス支援レーザー脱離イオン化および大気圧化学イオン化を含む群から選ばれる、請求項２０記載の装置。
前記分離手段が、マスフィルター、４重極イオントラップ、線型イオントラップ、円筒型イオントラップ、イオンサイクロトロン共鳴トラップ、飛行時間質量分析計、扇形磁場質量分析計を含む群から選ばれる、請求項２０記載の装置。
前記分離手段が前記各イオンを経時的に分離する、請求項２０記載の装置。
前記分離手段が前記各イオンを空間で分離する、請求項２０記載の装置。
前記分離手段が、前記各イオンを収集する前に、前記各イオンを分離する、請求項２０記載の装置。
前記分離手段が、前記各イオンを収集しながら、前記各イオンを分離する、請求項２０記載の装置。
下記の各工程を含むことを特徴とする、種を種の混合物として分離しこれらの種を付着種と化学反応させる方法：
前記混合物中の種を気相イオンに転換する工程；
前記種をこれらの種の質量/電荷比またはイオン移動度に基づき分離する工程；および、
前記種を化学活性表面の小領域中に軟着させる工程。
下記の各工程を含むことを特徴とする、第１混合物の種を第２混合物の種と合体させる方法：
前記第１混合物の種を気相イオンに転換する工程；
前記第１混合物の各イオンを所定の質量/電荷比またはイオン移動度に従って分離する工程；
前記所定の種を表面上の別々の位置に軟着させる工程；
前記第２混合物の種を気相イオンに転換する工程；
前記第２混合物の各イオンを所定の質量/電荷比またはイオン移動度に従って分離する工程；および、
前記第２混合物の所定の種を前記第１混合物のイオンの所定の位置に軟着させる工程。
下記の各工程を含むことを特徴とする、生化学化合物の分子の分離方法：
前記化合物を前記化合物の種のイオンに転換する工程；
前記化合物の種を荷電イオンの質量変化比または移動度に基づき分離する工程；および、
前記種を、前記生化学化合物がたんぱく質である場合の請求項２８記載の方法におけるようにして、別々の位置で収集する工程。