JP2005528120A

JP2005528120A - 直接ｐｃｒ定量

Info

Publication number: JP2005528120A
Application number: JP2004510474A
Authority: JP
Inventors: ハッサルドスチュアート
Original assignee: デルタドットリミテッド
Priority date: 2002-05-31
Filing date: 2003-06-02
Publication date: 2005-09-22
Also published as: GB0212764D0; US20050250099A1; WO2003102238A3; EP1509620A2; WO2003102238A2; AU2003244764A1; CA2485411A1

Abstract

固有ＰＣＲ混合物からの干渉性核酸分子の産生をモニターする方法であって、チャンバー中にＰＣＲ出発材料をコレートすること、ならびに変性、アニーリングおよび伸長のＰＣＲステップを行うこと、その間に、混合物中に紫外光を当てることによって干渉性核酸分子の産生をモニターし、前記分子によって吸収される光の量を測定することを含む方法。

Description

本発明は、固有（ｉｎｈｅｒｅｎｔ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物からの干渉性（ｃｏｈｅｒｅｎｔ）核酸分子の産生をモニターする方法、およびそのような方法のための機器に関する。

ＰＣＲは、特に興味深い核酸断片の量を増加させるための洗練された技法である。この断片は、ある遺伝子、または分子制御機構の一部のどちらであってもよく、制限酵素消化によって配列決定または解析する必要がある。何であろうとも、豊富に供給することは有利である。

ＰＣＲが一般に有用であるばかりでなく、リアルタイムの定量的ＰＣＲは、遺伝子発現解析、遺伝子型特定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）、病原体検出／定量、変異スクリーニング、核酸定量および一塩基多型（ＳＮＰ）実証（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）などの多くの遺伝子研究に使用することができる強力な道具である。

リアルタイムＰＣＲ定量化は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システムを用いてすでに実現されている。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（２０〜３０ｂｐ）は、３’末端における伸長が無効にされており、蛍光リポーター色素および蛍光クエンチャー色素で標識された部位特異的配列からなる。ＰＣＲの間、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、ＰＣＲ標的内の相補的一本鎖ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。増幅が起きると、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’――＞３’エキソヌクレアーゼ活性により分解され、それによって伸長の間にリポーターからクエンチャーを分離する。リポーターに対するクエンチング効果の解除により、リポーター色素の蛍光強度は増加する。全増幅プロセスの間に、この発光は指数関数的に増加し、最終レベルは、ＰＣＲ終了後に分光光度法によって測定される。リポーター色素の蛍光強度の増加は、標的配列のプローブ・ハイブリダイゼーションおよび増幅が起きた場合にのみ実現するため、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、特定の配列の有無を判定するための高感度な方法を提供する。

ＰＣＲにおけるプローブの使用法については、非特許文献１および２を含む多くの論文に記載されている。

国際公開第９６／３５９４６号パンフレット Holland PM, Abramson RD, Watson R & Gelfland DH (1991. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilising the 5’-->3’ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase, and Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 88: 7276-7280 Lee LG, Connell CR & Block W (1993). Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes. Nucleic Acid Research, 21: 3761-3766 Vanden Heuvel, J.P., Tyson, F.L. and Bell, D.A. Constructions of recombinant RNA templates for use as internal standards in quantitative RT-PCR,Biotechniques 14: 395-395 (1994) Cheng, S., Fockler, C., Barnes, W., Higuchi, R. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA. Proc: Natl. Acad. Sci. 91, 5695-5699 (1994) Kopp, M.U., de Mello, A.J., and Manz, A. Chemical Amplification: Continuous-Flow PCR on a Chip. Science, Vol 280,1998

しかしながら、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システムは、以下の様々な不利点を伴う。
・複雑かつ高価である
・高価なプライマーシステムが必要である
・ＰＣＲは極めて最適化されたシステムであり、不必要な成分の追加は、効率の損失を引き起こすことがある
・汚染されたＰＣＲ産物。

したがって、上記問題点のうち１つまたは複数を克服または軽減するＰＣＲ産物を直接定量するシステムが創出できれば極めて有益であろう。本発明は、そのようなシステムを提供する。

本発明の第１の態様は、固有のＰＣＲ混合物からの干渉性核酸分子の産生をモニターする方法であって、チャンバー中にＰＣＲ出発材料をコレートすること（ｃｏｌｌａｔｉｎｇ）、ならびに変性、アニーリングおよび伸長のＰＣＲステップを行うこと、その間に、混合物中に紫外光を当てることによって干渉性核酸分子の産生をモニターし、前記分子によって吸収される光の量を測定することを含む方法を提供する。

ＰＣＲ出発材料をコレートすることとは、単に出発材料を構築または収集することである。通常は非干渉性ＰＣＲ混合物を含むＰＣＲ出発材料は通常のＰＣＲステップを受け、干渉性核酸分子の産生を可能にする。混合物中に紫外光を当て、その光が核酸分子の固有吸収能力によって吸収される程度を測定することによって、リアルタイムに分子の成り行き（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｅｎｔｓ）がモニターされる。紫外光は混合物を通して当てられ、通過する光の量がモニターされることが好ましい。透過光の量が時間と共にどのように変化するかを測定することにより、吸収の量、すなわち核酸分子の量を測定することができる。すなわち、リアルタイムにモニタリングを行うことができる。

このような方法およびシステムの利点には、
・高価なプライマーシステムへの支出がない、
・リアルタイム測定であること、および
・回収可能な非汚染ＰＣＲ産物であることが含まれる。

本発明におけるＰＣＲには、変性、アニーリングおよび伸長（必ずしもこの順番ではないが）のステップを含むすべての核酸増幅システムが含まれる。このようなシステムは当技術分野においてはよく知られており、基本的ＰＣＲは以下のような４つの主要構成要素を用いる。
１．増幅される配列すなわち標的配列を含む核酸フラグメント（通常ＤＮＡ）。理論的に、この核酸の単一断片（ｓｉｎｇｌｅｐｉｅｃｅ）だけが必要とされる。通常、二本鎖断片（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄｐｉｅｃｅ）が使用される。
２．標的配列の側面に位置するプライマー（ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｔｈａｔｆｌａｎｋｔｈｅｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅ）。プライマーは、標的の側面に位置する配列（ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｆｌａｎｋｉｎｇｔｈｅｔａｒｇｅｔ）を補完する核酸の小片（この場合も通常ＤＮＡ）である。核酸の新たな鎖が作成されるためには、作成される土台を有していなければならない。それがプライマーの機能である。プライマーは常に過剰に加えられ、すなわち使用される可能性があるもより多くの量が反応に加えられる。
３．ジヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、すなわち塩基対の塩基部分の遊離溶液（ｆｒｅｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）。これらのｄＮＴＰ、Ａ−Ｔ、Ｃ−Ｇから核酸の新たな鎖が作成される。プライマーと同様、これらは過剰に存在する。
４．耐熱性ポリメラーゼ（通常ＤＮＡポリメラーゼ）。これは、全反応を媒介するＴａｑポリメラーゼまたはその他の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素である。

ＰＣＲは、変性、アニーリングおよび伸長という３つの異なるステップで行われる。これら３段階（ｐｈａｓｅｓ）の１組は、サイクルと呼ばれる。典型的ＰＣＲは３０のこのようなサイクルからなる。

変性
天然の二本鎖型の標的核酸がプライマーに近づけないのは、プライマーが一本鎖核酸にのみ接着する（すなわちアニールする）ことができるためである。約９５℃の温度における短時間のインキュベーションは、二本鎖の変性をもたらす。

アニーリング
次に、反応物を５５℃まで急速に冷却し、約１分間その温度に保つ。この温度において、プライマーは、それらの配列によって決められた特定の場所においてのみ一本鎖核酸に接着することができる。

伸長
次に、プライマーは、標的配列に接着され、核酸の新たな鎖の合成が始まる。これは、２つの段階（ｔｗｏｐｈａｓｅｓ）で起きる。反応物を、７２℃、すなわち核酸ポリメラーゼが最も活性になる温度まで加熱する。ポリメラーゼは、テンプレートとして標的核酸を用い、新たな核酸鎖の作成を媒介する。ポリメラーゼは、テンプレートに沿って移動しながら、成長する鎖に相補的ｄＮＴＰを付加する。伸長ステップでは、核酸鎖が各プライマーから伸張され、２種類のプライマーによって規定される配列より長い標的核酸の多くのコピーを作成する。ポリメラーゼが標的核酸鎖を下って移動するためそれを停止する手だてがないことが原因である。ポリメラーゼは、条件が都合良いかぎり新たな核酸鎖を作り続ける。我々のＰＣＲ産物を与えるものではないため、これが望んだものでないことは言うまでもない。

しかしながら、次に反応物を９５℃の変性ステップまで加熱するため、この問題は一時的なものに過ぎない。ポリメラーゼは、新たな核酸鎖を伸長することを止め、２本の核酸鎖（すなわち標的鎖および新たな鎖）は分離する。このことが、プライマーの次の組が核酸に近づくことを可能にする。

次のアニーリングステップでは、元の核酸鎖と新たな核酸鎖の双方にプライマーが接着する。これは、我々が望む産物が作成される限りにおいてに過ぎない。

ＰＣＲを用い、細胞システムにおいてＤＮＡの存在またはＲＮＡ分子種の存在さえ検出することができるのは、正しいプライマーを使用することで、遺伝子または探しているどんなものでも、プライマーが捕捉することができるためである。

ＰＣＲの標的核酸は、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。

任意の標的核酸は、例えば、ヒト、細菌、ウイルス、他の微生物、植物、または起源不明の核酸が適している。

ＰＣＲは、変性、アニーリングおよび伸長のステップを含む任意のＰＣＲであってよく、Ｈｏｌｌａｎｄ他（非特許文献１）またはＬｅｅ他（非特許文献２）に記載の基本的ＰＣＲ、ならびに逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（非特許文献３）、ロング（ｌｏｎｇ）ＰＣＲ（非特許文献４）、ホットスタートＰＣＲ、「タッチダウン」ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、ＡＰ−ＰＣＲ［任意のプライマーを用いた（ａｒｂｉｔｒａｒｙｐｒｉｍｅｄ）／ＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ）］、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴｉｎｓｉｔｕＰＣＲ、ネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）、ＤＤ−ＰＣＲ（ディファレンシャル・ディスプレイ）、多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、３’ミスマッチＳＮＰ実証などの知られているまたは将来のＰＣＲが含まれる。ＰＣＲは、競合的および／または定量的であってもよい。

上記のすべては標準的技法であり、さらなる詳細は、ＡｌｋａｍｉＢｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｒｏｃｈｅ、ＱｉａｇｅｎおよびＳｉｇｍａなどの供給品から見いだすことができる。

ＰＣＲ反応のチャンバー（ｃｈａｍｂｅｒ）は、核酸の固有紫外吸収を測定することができる任意のチャンバーであってもよい。このようなチャンバーには、石英、溶融シリカまたはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの任意の紫外透過材料が含まれる。

チャンバーは、従来式のＰＣＲ容器、または非特許文献５に記載のチップ（ｃｈｉｐ）などの代替配列であってもよい。

紫外光の固有吸収によって核酸分子を検出するため、分子イメージング装置を使用してもよい。このような装置は、検討されるサンプル上に当たるように配置された紫外光源および分子の位置を検出するように配置された紫外検出器を含む。フォトダイオードアレイまたは電荷結合素子（ＣＣＤ）を好適な検出器として使用することができる。

全内容が参照により本明細書に組み込まれている特許文献１に記載のように、ラベルフリー固有イメージングを使用してもよい。

分子を、ダイアモンド検出器などの任意の好適な検出器上に直接撮像してもよい。光源は、ヘリウム放電管のような広帯域装置、重水素放電管あるいはキセノンランプからの一定輝度の紫外光などの好適な任意の光源であってよい。撮像される対象に位置する検出器に達する様々な量の光が観察される。

ＰＣＲが進行している最中に分子の紫外吸収を測定することが可能であることから、干渉性核酸分子のグラフをリアルタイムに作成することができる。これは、
・任意の干渉性核酸分子が産生されているか否か
・どの程度の量か
・どのくらいの速さか
・どのくらいの大きさか
に関する情報をリアルタイムに提供する。

最後の黒点（どのくらいの大きさか）については、ＰＣＲにおける産生速度は使用する酵素に左右されるため（例えば、７２℃においてＴａｑポリメラーゼ−６０〜１５０’、Ｔｔｈポリメラーゼ−２５’）、スロープの勾配は産物の大きさに比例するはずである。

一本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子よりも光を多く吸収するため、時間に対する吸収のリアルタイムプロットによって作成される曲線は、滑らかにならず、むしろ図１ａおよび図１ｂに示すイメージとなる。

第２の態様では、本発明は、非干渉性ＰＣＲ混合物からの干渉性核酸分子の産生をモニターする機器であって、
ＰＣＲに適合するチャンバー；
前記チャンバーに当たるように適合する紫外光源；および
前記紫外光の固有紫外吸収をリアルタイムで検出する手段を含む機器を提供する。

チャンバーは、本発明の第１の態様について上記に記載の任意のチャンバーであってよい。チャンバーは、ＰＣＲに適している、すなわち、必要なサーマルサイクリングに適した手段を提供することはもとより、非干渉性ＰＣＲ混合物の添加を可能にする。直接ＰＣＲチャンバーに適した加熱方針を図２（ａ、ｂおよびｃ）に示す。

紫外光源および検出手段は、本発明の第１の態様に従って記載の任意の光源および手段であってよい。

機器の図表示を図３に見ることができる。

本発明の第３の態様は、非干渉性ＰＣＲ混合物からの干渉性核酸分子の産生をモニターするためのラベルフリー固有イメージングの使用を提供する。

本発明の第１および第２の態様の好ましい特徴はすべて、第３の態様にもあてはまる。

本発明は、ＰＣＲの改善されかつリアルタイムのモニターを可能にする。ラベルフリー核酸の利点は、ＰＣＲ後に核酸をさらに利用できることである。例えば、核酸を抽出し、場合により精製することができる。電気泳動により、場合によってさらに精製することにより、残存する非干渉性ＰＣＲ混合物から干渉性核酸分子を分離することができる。続いて、このような核酸を、ベクター中への挿入、配列決定などの他の核酸操作で使用することができる。

また、本発明を検出システムである方法として用い、ＰＣＲから干渉性核酸分子が産生されたか否かを判断することができる。このようなシステムは、リアルタイムモニタリングを必要とせず、むしろＰＣＲ開始後のある時点（ＰＣＲの間または終了時）におけるモニタリングを必要とする。本発明のすべての態様があてはまる。

このような最終産物モニターを、例えばＳＮＰ（一塩基多型）解析（３’ミスマッチＳＮＰ解析を含む）において使用することができる。本発明のこのような実施形態では、２個以上のチャンバーが、場合により並んで、またはトレー配列で提供される。

チャンバーのうち１個は、問題のＷＴ（野性型）対立遺伝子である核酸を含み、１個または複数の追加チャンバーはサンプル対立遺伝子を含むことができる。１個または複数のサンプル対立遺伝子はＳＮＰ解析のために提供される。

各チャンバーには、非干渉性ＰＣＲ混合物、ＷＴ対立遺伝子の増幅を可能にする好適なプライマーが提供される。

ＷＴ対立遺伝子を含むチャンバーは、事実上対照である。ＷＴ対立遺伝子増幅の成功は、チャンバーが変性、アニーリングおよび伸長を受けた場合に起こるはずである。１個または複数のサンプル対立遺伝子増幅の成功は、プライマー領域におけるＳＮＰの有無に左右されるはずである。ＰＣＲ（リアルタイムその他）のモニタリングは、サンプル対立遺伝子におけるＳＮＰの有無の判定を可能にするはずである。このような判定のための機器およびシステムを、多重システムとして提供することができる。

本発明を以下の図面を参照して説明する。

本発明の第１の態様による方法によって得られる時間に対する吸収を示すグラフである。ラベルフリー固有イメージング（ＬＦＩＩ）シグナルを示す。二本鎖ＤＮＡ産物が作成されるにつれて、吸収は増加する。直線相では、勾配は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドの取り込み速度およびテンプレート／産物の長さの関数になるはずである。本発明の第１の態様による方法によって得られる時間に対する吸収を示すグラフである。ラベルフリー固有イメージング（ＬＦＩＩ）シグナルを示す。図１ｂも、時間に対する吸収を示すグラフである。このグラフをより詳細に見ると、濃色効果が紫外光の吸収を高めている。これは、光学活性塩基の暴露増加が原因である。ＬＦＩＩによりＰＣＲを直接観察することにより、温度がサイクルするにつれてリアルタイムでこれを見ることができよう。理論的には、９５℃相にシグナルが増加し、ＤＮＡが復元するにつれてわずかに低下する。このことは、グラフに示されるような階段状シグナルを生み出すはずである。直接ＰＣＲチャンバーに適した加熱方針を示す図である。直接ＰＣＲチャンバーに適した加熱方針を示す図である。直接ＰＣＲチャンバーに適した加熱方針略を示す図である。本発明の第２の態様による機器の図表示である。

Claims

固有ＰＣＲ混合物からの干渉性核酸分子の産生をモニターする方法であって、チャンバー中にＰＣＲ出発材料をコレートすること、ならびに変性、アニーリングおよび伸長のＰＣＲステップを行うこと、その間に、混合物中に紫外光を当てることによって干渉性核酸分子の産生をモニターし、前記分子によって吸収される光の量を測定することを含むことを特徴とする方法。
非干渉性ＰＣＲ混合物は、二本鎖ＤＮＡである標的核酸分子を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
ＰＣＲは、ＲＴ−ＰＣＲ、ロングＰＣＲまたは３’ミスマッチＰＣＲであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
チャンバーは、石英、溶融シリカ、またはＰＤＭＳなどの紫外透過材料製であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
方法は、リアルタイムにモニターすることであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
非干渉性ＰＣＲ混合物からの干渉性核酸分子の産生をモニターする機器であって、
ＰＣＲに適合されるチャンバー；
前記チャンバーに当たるように適合される紫外光源；および
前記分子による前記紫外光の固有紫外吸収を検出する手段を含むことを特徴とする機器。
非干渉性ＰＣＲ混合物からの干渉性核酸分子の産生をモニターするためのラベルフリー固有イメージングの使用。
モニタリングはリアルタイムであることを特徴とする請求項７に記載の使用。
ＳＮＰ解析における請求項７または請求項８に記載の使用。
１または複数の図面に関して実質的に上に記載されているプロセス、機器または使用。