JP2005527235A - デフェンシン:抗ウイルス剤の使用 - Google Patents
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Abstract
本発明はデフェンシンを用いるウイルス(例えばHIV)の阻害に関する。本発明はさらに、天然起源デフェンシンの発現または活性を増加させ、その結果、細胞中でHIVを阻害する低分子量化学組成物、抗体、ペプチド、核酸、アンチセンス核酸およびリボチームを含む試薬の同定法と使用法ならびに、診断および予防における発現プロフィルと組成物の使用、ならびにHIV感染および関連する病態(例えば、AIDS)の治療に関する。
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は米国特許仮出願第60/412,414号(出願日2002年9月20日)、第60/405,595号(出願日2002年8月23日)、および第60/384,428号(出願日2002年5月31日)に関連し、これらの仮出願の教示内容はあらゆる目的で参考として本明細書において援用される。
本出願は米国特許仮出願第60/412,414号(出願日2002年9月20日)、第60/405,595号(出願日2002年8月23日)、および第60/384,428号(出願日2002年5月31日)に関連し、これらの仮出願の教示内容はあらゆる目的で参考として本明細書において援用される。
(発明の背景)
本発明は、デフェンシンを用いるウイルス(例えばHIV)の阻害に関する。本発明はさらに、天然に存在するデフェンシンの発現または活性を増加させることにより細胞においてHIVを阻害する薬剤(小有機分子、抗体、ペプチド、核酸(例えばアンチセンス核酸およリボザイム)等)を同定し使用する方法、ならびにHIV感染およびAIDS等の関連する病態に関連する診断、予防および治療における、発現プロファイルおよび組成物の使用に関する。
本発明は、デフェンシンを用いるウイルス(例えばHIV)の阻害に関する。本発明はさらに、天然に存在するデフェンシンの発現または活性を増加させることにより細胞においてHIVを阻害する薬剤(小有機分子、抗体、ペプチド、核酸(例えばアンチセンス核酸およリボザイム)等)を同定し使用する方法、ならびにHIV感染およびAIDS等の関連する病態に関連する診断、予防および治療における、発現プロファイルおよび組成物の使用に関する。
ヒト免疫欠損ウイルス(HIV)は全世界で何百万もの人に感染している。症例はほとんど全ての国で報告され、HIV/AIDSに罹患して生存する成人および子供は4千万人にも及ぶ。2001年には5百万人が新たに感染し、HIV/AIDSで死亡した成人や子供は3百万人であった。AIDSと共生しているこれらの人々の優に1/3は15〜24歳である(世界保健機構(World Health Organization)、2001)。HIV/AIDSの処置は存在するが、現在処置療法に使用されている薬物は、頭痛、下痢、疲労、吐き気、めまい、過敏症、腹痛および食欲減退から、腎臓および肝臓機能昂進におよぶ様々な副作用を示す。さらに、HIV/AIDS治療に現在用いられている薬剤は長期治療を必要とし、薬剤耐性を誘発することが多く、体からこのウイルスを完全に根絶することはできない。
CD8+Tリンパ球がHIV−1感染に対する免疫反応に重要な役割を果たすことが知られている。CD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)によりHIV−1感染細胞を直接殺すことがウイルス抑制に重要であり、他方、CD8+Tリンパ球により分泌される可溶性因子(単数または複数)もインビトロでHIV−1の複製を阻害し得ることが15年より多く前から知られている。これらの非細胞溶解性可溶性因子はWalkerおよびその共同研究者により、CD8抗ウイルス因子(「CAF」)、すなわちあるHIV−1感染者から刺激されたCD8+細胞により分泌される拡散性分子として最初に報告された。CTL依存性およびCAF関連抗ウイルス活性の両者は、良性の臨床状態および長期間のHIV−1感染による長期非進行症状である高いCD4+T細胞数に相関することが実証されている。しかしながら、CTLとは異なり、CAFの抗ウイルス活性は非細胞傷害性であり、主要組織適合性複合体クラスI分子または細胞相互の接触による制約を必要としない。CAFは臨床的に良性のHIV−1感染者、特に長期非進行性感染者(LTNP)であることが特徴である感染者由来の、刺激されたCD8+Tリンパ球により大量に分泌されることが示されている(Levyら、Immunol.Today、17:217、1996、Caoら、N.Engl.J.Med.、332:201(1995)、Barkerら、Blood、92:3105(1998)、およびMackewiczら、J.Clin.Invest.、87:1462(1991))。対照的に、進行性患者、すなわち免疫不全の兆候が見られる感染者由来のCD8+T細胞の刺激により分泌されることは希である。モノクローナル抗体を用いてCD8+細胞を枯渇させた場合、マカクサルにおけるSIV複製が劇的に増加することが1999年に報告された(X.Jinら、J.Exp.Med.、189:991(1999)およびJ.E.Schmitzら、Science、283:857(1999))。SIV感染アカゲザル、アフリカミドルサル、HIV−1感染チンパンジー、および健康な非感染ヒトから採取した、刺激されたCD8+T細胞由来の上澄にCAF様活性が検出されている(Kannagiら、J.Immunol.、140:2237(1998)、Ennenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91:7207(1994)、Castroら、Cell Immunol.、132:246(1991)、およびHsuehら、Cell Immunol.、159:271(1994))。
過去20年間に及ぶ多大な努力にも拘わらず、CAFの正体は依然として不明である(Levyら、Immunol.Today、17:217(1996))。数多くの研究グループがCAFの同定を試みたが、不成功であった。1995年にCocchiらは刺激されたCD8+Tリンパ球がインビトロでHIV−1感染を妨害するβ−ケモカイン(RANTES、MIP−1αおよびMIP−1β)を分泌し得ることを示した(Science、270:1811(1995))。しかしながら、その抗ウイルス活性はマクロファージ型分離ウイルスに対して観察されたが、抗T細胞(T−cell−line−tropic)株に対して観察されなかった。この二律背反性はその後、β−ケモカインに対する受容体CCR5もまたCD4+T細胞中へのHIV−1侵入の共受容体として作用するという発見で説明された(Dengら、Nature、381:661(1996)、Dragicら、Nature、381:667(1996)、Cheoら、Cell、85:1135(1996)、Doranzら、Cell、85:1149(1996)、およびAlkhatibら、Science、272:1955(1996))。従って、β−ケモカインはCCR5を共受容体として使用する、いわゆるR5ウイルスを完全に妨害し得るが、別の共受容体CXCR4を利用するいわゆるX4ウイルスを妨害できないことが明らかとなった(Fengら、Science、272:872(1996))。このような抗ウイルス特性はβ−ケモカインと両方の型のHIV−1を阻害し得るCAFとを明確に区別した。その上、特異性モノクローナル抗体でβ−ケモカインまたはCXCR4に対するリガンドである間質性細胞由来因子1α(「SDF−1α」)の何れを除去しても、CAF活性を除外することはできないことを示す研究がいくつか行われた(Bakerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95:1725(1998)、Moriuchiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93:15341(1996)、およびLaceyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、94:9842(1997))。マクロファージ由来ケモカインおよびインターロイキン16を含む他のケモカインもまた、CAFの可能な候補としてその後提示されたが、その後の試験で否定された(Palら、Science、278:695(1997)、およびBaierら、Nature、378:563(1995))。
従って、CAFはインビトロでHIV複製を阻害する因子であり、AIDSに進行する感染者よりもAIDSに進行しないHIV−1感染者由来の刺激されたCD8細胞により大量に分泌される。1986年前後にこの因子の存在が発見され、その後著名なAIDS研究者により努力が続けられたが、誰もCAFの正体を決定することはできなかった。その結果、研究および医療機関は、ウイルス抑制の生体それ自体の機構、すなわちCAF分泌に依存する抗ウイルス治療法を開発することが不可能であった。
上記の様な事情に鑑み、HIV複製および/または感染を阻害するために用い得るCAFを同定し新しい治療法を開発する必要がある。本発明はこのような要請を含めその他の要請を満足するものである。
(発明の要旨)
本発明において、デフェンシン、すなわちα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3がCAFの抗ウイルス活性を担っていることが発見された。好中球がα−デフェンシンを生産することが知られていたが、CD8+細胞もα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3を生産することが本発明において発見された。インビトロでα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3がCD4+におけるHIVの複製を阻害することも本発明において示された。さらに、α−デフェンシン1とα−デフェンシン2、またはα−デフェンシン1とα−デフェンシン3の組み合わせがデフェンシン単独よりも大きなHIV阻害活性を示すことも発見された。
本発明において、デフェンシン、すなわちα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3がCAFの抗ウイルス活性を担っていることが発見された。好中球がα−デフェンシンを生産することが知られていたが、CD8+細胞もα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3を生産することが本発明において発見された。インビトロでα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3がCD4+におけるHIVの複製を阻害することも本発明において示された。さらに、α−デフェンシン1とα−デフェンシン2、またはα−デフェンシン1とα−デフェンシン3の組み合わせがデフェンシン単独よりも大きなHIV阻害活性を示すことも発見された。
本発明の一部は、デフェンシン(例えばα−デフェンシンおよびβ−デフェンシン)が抗ウイルス活性を有し、患者のウイルス性疾患を治療し得ると言う発見に基づいている。特に、α−デフェンシン等のデフェンシンがCD8抗ウイルス活性、具体的には抗HIV活性を担っていることが発見された。さらに、2つのデフェンシンの組み合わせ、例えばα−デフェンシン1とα−デフェンシン2の組み合わせがデフェンシン単独より更に大きい活性を有することが発見された。従って、本発明はデフェンシンの抗ウイルス活性を利用する医薬組成物、予防および治療処置、診断および予後予測法およびキット、および薬学的スクリーニング法を提供する。
デフェンシンがCAF活性を担っていると言う発見に基づき、本発明はHIV治療法におけるデフェンシンの使用を提供する。例えば、予防的または治療的にデフェンシンを患者に投与することにより、HIV感染を予防または治療することができる。HIV感染の危険性がある人にとっては予防処置が特に有用である。本発明は薬学的に有効な量のデフェンシン(例えばα−デフェンシン、好ましくは2種のデフェンシン(例えば2種のα−デフェンシン))の投与により、体内でHIV複製を阻害する方法を提供する。ある実施形態では、デフェンシンが修飾した形で、例えばデフェンシン部分と他のペプチド部分を有する融合タンパク質の一部として提供され、例えばCD4+細胞を標的とするか、インビボにおける安定性または生物適合性を改善することによりデフェンシンの効果を増大する。本発明はまた、薬学的に許容し得る担体中の少なくとも1種のデフェンシンまたはその修飾型を含む医薬組成物を提供する。他の実施形態では、HIV複製阻害法は、刺激されるとα−デフェンシン等のデフェンシンを生産するCD8+細胞を活性化する組成物を患者に投与することを含む。
他の実施形態では、CD8+細胞がエクス・ビボで増幅され、デフェンシンの生産についてモニターされる。その後、デフェンシンを生産する細胞が予防または治療目的で患者に導入される。
本発明はまた、デフェンシン遺伝子治療を含む治療法を提供する。ある実施形態では、デフェンシンまたはその修飾型、または少なくとも2種のデフェンシンをコードする核酸配列を有する核酸が患者に投与される。その結果核酸が細胞に取り込まれ、転写され翻訳されてデフェンシンポリペプチドを生産する。この核酸配列はα−デフェンシン、β−デフェンシン、またはその修飾型をコードし得るか、または少なくとも2種のデフェンシンをコードする投与し得る。遺伝子治療の利用を含む他の実施形態では、CD8+細胞等の細胞をα−デフェンシン等のデフェンシンをコードする核酸でエクス・ビボでトランスフェクトさせ、トランスフェクト細胞にデフェンシンを生産させ、トランスフェクトした細胞を患者に導入する。
上記および本実施形態に記載のHIV複製の阻害法は、インビトロの培養細胞にも応用し得る。従って、本発明の方法はインビトロのみならずインビボにも応用できる。
長期非進行性患者はAIDSへ進行する患者よりかなり大量のα−デフェンシン等のデフェンシンを発現する。この事実を患者のHIV感染状態を決定するために用いることができる。すなわち、患者由来の血清、尿、血液その他の体液等の試料中のデフェンシンの量がある量より多いか少ないかを測定することにより、彼または彼女がAIDSへ進行する可能性があるかないかという、その患者のHIV感染状況を決定することができる。α−デフェンシン量が予測量(例えばほとんどのAIDS患者中の現在の平均値)より多い患者は非進行性である可能性が高く、一方、この量またはそれ以下の患者はAIDSに進行する可能性が高い。この情報に基づき治療法を決定し、進行性患者にはより積極的な抗HIV治療が推奨される。ある実施例では、CD8+細胞が患者から単離され、デフェンシン分泌レベルが測定される。別法では、試料中のデフェンシンmRNA(またはcDNA)、例えばα−デフェンシンmRNAの量がある量より多いかまたは少ないかを測定する。
別の実施形態では、本発明は少なくとも1種のデフェンシン検出用のキットを提供する。このようなキットは本発明の予後予測法にとりわけ有用である。このキットには抗デフェンシン抗体で被覆または被覆し得るマイクロタイタープレートまたはSELDIマススペクトルバイオチッププローブ、またはデフェンシンを結合するクロマトグラフィー表面を有するSELDIマススペクトルバイオチッププローブ等の一般的に少なくとも1種のデフェンシンを捕捉する手段を有する基材が含まれる(例えばCiphargen Biosystems、Inc.、Fremont、CA)製のWCXまたはIMCA Protein Chip)。このキットはまた、サンドイッチ免疫アッセイにおいて使用するための2次標識抗体および/またはデフェンシンを検出し、そして検出されたデフェンシンの量をHIV感染状態の予後および/またはAIDS発症と相関付けるための指示書を含む。
デフェンシンがHIVを阻害するという知見は、デフェンシン活性を調節する化合物を発見する指針を与える。従って、本発明は薬剤スクリーニングアッセイを提供する。これらのアッセイでは、CD8+細胞等のデフェンシンを生産する細胞が試験化合物に晒され、その化合物のデフェンシンmRNAまたはポリペプチド生産、または生物活性に対する効果がモニターされる。この方法で発見された薬剤をHIV感染の予防または治療に医薬品として投与することができる。
本発明はまたデフェンシンに結合するポリペプチドの検出法を提供する。そのポリペプチドはデフェンシン活性の機構に含まれるリガンドであってもよい。このような方法には細胞をデフェンシンと接触させることが含まれる。次いで細胞由来のデフェンシンとそれに結合したポリペプチドが固相に捕捉され、検出される。他の実施形態では、デフェンシンを固相に結合させ、細胞内容物を結合したデフェンシンと接触させ、その後検出される。
ある局面では、本発明はデフェンシンポリペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む組成物を提供する。ある実施形態では、デフェンシンはα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれるα−デフェンシンポリペプチドである。
別の局面では、本発明はデフェンシンポリペプチドと薬学的に許容し得る担体を含む組成物であって、α−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる少なくとも2種のα−デフェンシンポリペプチドを含む組成物を提供する。
別の局面では、本発明はデフェンシンポリペプチドと薬学的に許容し得る担体を含む組成物であって、α−デフェンシン1およびα−デフェンシン2からなる群より選ばれる少なくとも2種のα−デフェンシンポリペプチドを含む組成物を提供する。
別の局面では、本発明はデフェンシンポリペプチドと薬学的に許容し得る担体含む組成物であって、デフェンシンはα−デフェンシンポリペプチドであり、α−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3を含む組成物を提供する。
別の局面では、本発明はヒトのHIV感染の治療法を提供する。この方法はデフェンシンポリペプチドをヒトに投与することを含む。ある実施形態では、デフェンシンポリペプチドはα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれたα−デフェンシンポリペプチドである。第2の実施形態では、HIV感染の治療法にはさらに第2のα−デフェンシンポリペプチドを投与することが含まれる。第2のα−デフェンシンポリペプチドはα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる。
別の局面では、本発明は、ヒトのHIV感染の処置法であって、治療上有効量のα−デフェンシン1およびα−デフェンシン2をヒトに投与することを含む方法を提供する。
別の局面では、本発明は予防的な量のデフェンシンポリペプチドをHIV感染の危険性が高い患者に投与することを含む方法を提供する。ある実施形態では、デフェンシンポリペプチドはα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれるα−デフェンシンポリペプチドである。第2の実施形態では、その方法にはさらに第2のα−デフェンシンポリペプチドをHIV感染の危険性が高い患者に投与することが含まれる。α−デフェンシンポリペプチドはα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる。第3の実施形態では、α−デフェンシンポリペプチドはα−デフェンシン1およびα−デフェンシン2である。
別の局面では、本発明は培養液中のCD4+細胞のHIV感染の防止法を提供する。その方法は細胞をデフェンシンポリペプチドと接触させる工程を包含する。ある実施形態では、デフェンシンポリペプチドはα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群から選ばれたα−デフェンシンポリペプチドである。第2の実施形態では、その方法はさらに細胞をα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群から選ばれた第2のα−デフェンシンポリペプチドと接触させる工程を有する。
別の局面では、薬学的に許容し得る担体中に第1デフェンシンポリペプチドをコードする第1核酸を含む組成物を提供する。
別の局面では、本発明は薬学的に許容し得る担体中に第1デフェンシンポリペプチドをコードする第1核酸および第2デフェンシンポリペプチドをコードする第2核酸を含む組成物を提供する。ある実施形態では、第1デフェンシンポリペプチドはα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群から選ばれる。第2の実施形態では、第1および第2デフェンシンポリペプチドはα−デフェンシン1およびα−デフェンシン2である。
別の局面では、本発明は細胞にデフェンシンポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸のトランスフェクトを含むヒトのHIV感染を阻止する方法を提供する。
別の局面では、本発明は細胞にデフェンシンポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸をトランスフェクションさせることを含むヒトのHIV感染を阻止する方法であって、そのデフェンシンポリペプチドはα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群から選ばれたα−デフェンシンポリペプチドである方法を提供する。ある実施形態では、その細胞は筋肉細胞である。第2の実施形態では、その細胞はAC133+またはCD34+始原細胞である。第3の実施形態では、その細胞はAC133+またはCD34+始原細胞であり、トランスフェクションはエクス・ビボで行われる。
別の局面では、本発明は細胞を、デフェンシンポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸にトランスフェクとさせることを含むヒトのHIV感染防止法であって、その核酸はデフェンシンをコードする核酸配列と結合して作用する誘発性プロモーターを含む方法を提供する。
別の局面では、本発明は個々の患者のHIV症状を決定する方法を提供する。その方法は各患者由来の試料中のα−デフェンシン量を測定し、その量をHIV感染状態と関連付ける工程を有する。ある実施形態では、その方法にはさらに、デフェンシンの量およびCD8+細胞数、CD4+細胞数、HIVウイルス負荷、および全T細胞数からなる群から選ばれた少なくとも1種の指標とHIV感染状態を相関付ける工程が含まれる。第2の実施形態では、α−デフェンシンはELISAまたはマススペクトル、例えばMALDIまたはSELDIで検出される。第3の実施形態では、α−デフェンシンはα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる。
別の局面では、本発明は個々の患者のHIV症状を決定する方法を提供する。その方法は各患者由来の試料中のα−デフェンシンmRNAの量を測定し、その量をHIV感染状態と関連付ける工程を有する。ある実施形態では、α−デフェンシンmRNAはα−デフェンシン1 mRNA、α−デフェンシン2 mRNAおよびα−デフェンシン3 mRNAからなる群より選ばれる。
別の局面では、本発明はある化合物が細胞中のα−デフェンシン活性を調節するかどうかを決定する方法を提供する。その方法は、α−デフェンシン生産細胞を化合物と接触させ、その化合物のα−デフェンシン活性に対する機能効果を測定する工程を含む。ある実施形態では、細胞は好中球、CD8+細胞および上皮細胞から選ばれる。第2の実施形態では、機能効果はデフェンシン発現レベル、細胞増殖またはHIV複製を測定して決定される。第3の実施形態では、その化合物は低分子量有機分子である。第4の実施形態では、α−デフェンシンはα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる。
別の局面では、本発明はヒトに細胞、例えばCD8+細胞中のデフェンシン活性を昂進する化合物をヒトに投与する工程を含む、ヒトのHIV感染を阻止する方法を提供する。ある実施形態では、その化合物は、化合物が細胞中のα−デフェンシン活性を調節するかどうかを決定する本明細書に記載の方法により同定される。
別の局面では、本発明は細胞をα−デフェンシンと接触させる工程、固定化抗α−デフェンシン抗体を細胞溶解物と接触させ、その結果、細胞由来のα−デフェンシンを固相に結合させる工程、および固定化α−デフェンシンに結合したタンパク質を検出する工程を有する方法を提供する。ある実施形態では、細胞はCD4+細胞、HeLa細胞、HOS細胞または2B4細胞である。第2の実施形態では、α−デフェンシンポリペプチドはα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる。
別の局面では、本発明は細胞をα−デフェンシンと接触させる工程、固定化抗α−デフェンシン抗体を細胞溶解物と接触させ、その結果、α−デフェンシンと結合するタンパク質を捕捉する工程、および固定化α−デフェンシンに結合したタンパク質を検出する工程を有する方法を提供する。ある実施形態では、細胞はCD4+細胞、HeLa細胞、またはHOS細胞である。第2の実施形態では、α−デフェンシンポリペプチドはα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる。
別の局面では、本発明はキットを提供する。キットは抗体を結合する手段を有する基板、抗α−デフェンシンポリペプチド抗体、および患者試料中で検出されたα−デフェンシンの量を進行中のAIDSの予後と相関付ける指示書を含む。ある実施形態では基材はマススペクトルプローブである。第2の実施形態では、基板はマイクロタイタープレートである。第3の実施形態では、キットにはさらにα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3と特異的に結合する第2抗体を有する。第4の実施形態では、第2抗体は標識されている。
別の局面では、本発明は別のキットを提供する。そのキットにはα−デフェンシンポリペプチドを結合する手段を有する基板、および患者試料中のα−デフェンシンの量を進行中のAIDSの予後と関連付ける指針が含まれる。
別の局面では、本発明は別のキットを提供する。そのキットにはα−デフェンシンと特異的に結合する第1抗体、およびα−デフェンシン1、α−デフェンシン2またはα−デフェンシン3と特異的に結合する第2抗体が含まれる。
別の局面では、本発明はCD4+細胞に結合する第1デフェンシンポリペプチド部分と第2デフェンシンポリペプチド部分を有するα−デフェンシン融合タンパク質を提供する。
別の局面では、本発明は第1デフェンシンポリペプチド部分と第2デフェンシンポリペプチド部分(例えばTPAシグナルペプチド)を有するα−デフェンシン融合タンパク質を提供する。
別の局面では、本発明は第1デフェンシンポリペプチド部分と第2デフェンシンポリペプチド部分(例えばTPAシグナルペプチド)を有するα−デフェンシン融合タンパク質をコードする核酸配列を有する核酸を提供する。
別の局面では、本発明はインビボで安定性または生物適合性を増加させる第1デフェンシンポリペプチド部分と第2デフェンシンポリペプチド部分を有するα−デフェンシン融合タンパク質を提供する。
別の局面では、本発明はPEG化α−デフェンシンポリペプチドと薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。
別の局面では、本発明はタンパク質分解酵素切断部位を除去したアミノ酸置換体、またはデフェンシンの生物適合性および/または生物活性を増進させるアミノ酸置換体を有するα−デフェンシンを提供する。
別の局面では、本発明はCD8+細胞を活性化する組成物を投与する工程を有する内因性α−デフェンシンの増加法を提供する。ある実施形態では、その組成物は抗CD3その他のT細胞活性化因子を含む。
別の局面では、本発明はCD8+細胞をエクス・ビボで培養し、CD8+細胞によりα−デフェンシン生産を追跡し、培養CD8+細胞をHLA適合患者に投与する工程を有する方法を提供する。
別の局面では、本発明は患者にワクチン、およびα−デフェンシンポリペプチドまたはα−デフェンシンをコードする核酸を有する方法を提供する。
別の局面では、本発明はワクチン、およびα−デフェンシンポリペプチドまたはα−デフェンシンをコードする核酸を含む組成物を提供する。
別の局面では、本発明はα−デフェンシンおよび第2の治療薬(複数または単数)を含む組成物を提供する。ある実施形態では、第2の治療薬はHIV感染の予防または治療に使用される。他の実施形態では、第2の治療薬はHIV感染に伴う日和見感染の治療に使用される。他の実施形態では、第2の治療薬はプロテアーゼ阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、融合阻害剤、抗レトロウイルスヌクレオシド、侵入阻害剤、またはHIV感染予防または治療に有効な任意の他の抗ウイルス剤である。他の実施形態では、第2の治療薬はジドブジン、ジダノシン、スタブディン、インターフェロン、ラミブジン、アデフォビル、ネビラピン、デラビリジン、ロビリド、サキナビル、インジナビル、AZT、T20、T22およびT2からなる群より選ばれる。別の実施形態では、第2の治療薬は抗生物質またはアシクロビルである。他の実施形態では、α−デフェンシンは、α−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる。別の実施形態では、組成物は少なくとも2種のα−デフェンシンを含む。他の実施形態では、α−デフェンシンはα−デフェンシン1タンパク質、α−デフェンシン2タンパク質、α−デフェンシン3タンパク質、このようなα−デフェンシンタンパク質をコードする核酸配列、またはこのような融合タンパク質をコードする核酸配列である。
他の局面では、本発明は、デフェンシンポリペプチドを第2治療薬(単数または複数)と組み合わせてヒトに投与する工程を包含する、ヒトにおけるHIV感染治療法または予防法を提供する。1つの実施形態では、HIV感染を予防または処置するために第2治療薬が用いられる。他の実施形態では、この第2治療薬はHIV感染に伴う日和見感染を処置するために用いられる。他の実施形態では、この第2治療薬は、プロテアーゼ阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、融合阻害剤、抗レトロウイルスヌクレオシド、侵入阻害剤、または任意の他のHIV感染を阻害または処置するために有効な抗ウイルス剤である。他の実施形態では、この第2治療薬は、ジドブジン、ディダノシン、スタブディン、インターフェロン、ラミブディン、アデフォビール、ネビラピン、デラビリディン、ロビリド、サクイナビール、インディナビール、AZT、T20、T22およびT2からなる群より選ばれる。他の実施形態では、この第2治療薬は抗生物質またはアシクロビールである。他の実施形態では、α−デフェンシンはα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群から選ばれる。他の実施形態では、上記組成物は、2種以上のデフェンシンを含む。他の実施形態では、α−デフェンシンはデフェンシンタンパク質、デフェンシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列、融合タンパク質または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
他の局面では、本発明は、細胞をデフェンシンポリペプチドおよび第2治療薬、または他の治療薬の組み合わせと接触させる工程を包含する、CD4+培養液中でHIV感染を阻害する方法を提供する。ある実施形態では、治療薬(単数または複数)はHIV感染を処置または予報するために使用される。第2の実施形態では、治療薬は、プロテアーゼ阻害剤、非ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤、融合阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、抗レトロウイルスヌクレオシド、侵入阻害剤、およびHIV感染を予防または治療するために有効な任意の他の抗ウイルス剤からなる群より選ばれる。第3の実施形態では、治療薬は、ジドブジン、ディダノシン、スタブディン、インターフェロン、ラミブディン、アデフォビール、ネビラピン、デラビリディン、ロビリド、サクイナビール、インディナビール、AZT、T20、T22およびT2からなる群より選ばれる。
(発明の詳細な説明)
(A.概説)
本発明は、ウイルス感染、例えばHIV感染を予防、治療、診断または予知し、ウイルス感染細胞、例えばHIV感染細胞を殺し、ウイルス、好ましくはHIVウイルスの複製を阻害するする新規の組成物、アッセイ、キットおよび方法を提供する。本発明は、一部、天然起原のデフェンシンが、10年間の感染にも拘わらずその疾患状態がAIDSまで進行しなかったHIV感染個体で、AIDSを有するHIVで感染した個体に比べて増加したレベルで存在し、しかも、長期感染にも拘わらず本格的なAIDSを獲得しなかった個体で天然に存在するデフェンシンがHIV複製を阻止しているという驚くべき発見に基づいている。従って、本発明は、一部、外部投与によるか、または内因性生産の増加によって個体中でデフェンシンまたはその断片が増加した場合、その個体中でHIV感染が阻害され、HIV感染細胞を殺し、および/またはHIV感染を阻止するという驚くべき発見に基づいている。
(A.概説)
本発明は、ウイルス感染、例えばHIV感染を予防、治療、診断または予知し、ウイルス感染細胞、例えばHIV感染細胞を殺し、ウイルス、好ましくはHIVウイルスの複製を阻害するする新規の組成物、アッセイ、キットおよび方法を提供する。本発明は、一部、天然起原のデフェンシンが、10年間の感染にも拘わらずその疾患状態がAIDSまで進行しなかったHIV感染個体で、AIDSを有するHIVで感染した個体に比べて増加したレベルで存在し、しかも、長期感染にも拘わらず本格的なAIDSを獲得しなかった個体で天然に存在するデフェンシンがHIV複製を阻止しているという驚くべき発見に基づいている。従って、本発明は、一部、外部投与によるか、または内因性生産の増加によって個体中でデフェンシンまたはその断片が増加した場合、その個体中でHIV感染が阻害され、HIV感染細胞を殺し、および/またはHIV感染を阻止するという驚くべき発見に基づいている。
本発明は、治療用化合物、例えば、デフェンシンタンパク質(合成、組換え、または天然起原)、デフェンシン核酸、および1つ以上のデフェンシンを含む薬学的組成物をHIV感染個体またはHIV感染の危険性が高い個体に投与することによる、個体中での外因性デフェンシンレベルを増加する方法に関する。
本発明はまた、内因性デフェンシン活性を増加する方法を提供することによる、HIV感染または複製を阻害する方法を提供する。例えば、本発明ははねデフェンシン活性の調節剤を同定するためのアッセイを提供する。この様なデフェンシン活性の調節剤は、体内の内因性デフェンシンのレベルを増加させることにより、HIV感染および複製を阻害するのに有用である。
本発明はまた、HIV感染個体の予後を決定する方法を提供する。個体中の内因性デフェンシンレベル、例えば、好中球中のデフェンシンレベルを検出することにより、ある個体のHIV感染がAIDSへ進行するかどうかを決定することができる。この様な決定は薬剤投与、治療戦略および治療期間の選択を支援し得る。
本発明はまた、デフェンシンポリペプチドおよび、HIV感染個体またはHIV感染の危険性が高い個体への送達のための薬学的に受容可能な担体を含む組成物を提供する。この様な組成物は個体におけるHIV感染の治療に使用し得る。
本発明はまた、個体におけるHIV感染およびAIDS発症を診断および予見するためのキットを提供する。
(B.定義)
本明細書の「HIV感染に伴う障害」または「HIV感染に伴う疾患」という用語は、HIV感染の特徴である病態を言う。HIV感染に伴うこの様な疾患には、AIDS、カポシ肉腫、ニューモシチス・カリニ(Pneumocystis carini)および結核菌(Mycobacterium tuberculosis)で発症する日和見感染、鷲口瘡を含む口腔病変、毛様白板症、およびアフタ性潰瘍、全身性リンパ節障害、帯状疱疹、血小板減少症、無菌性髄膜炎、トキソプラズマ症等の神経疾患、クリプトコッカス症、CMV感染、原発性CNSリンパ腫、HIV−関連痴呆症、末梢神経症、発作、筋障害等が含まれるが、それに限定されない。
本明細書の「HIV感染に伴う障害」または「HIV感染に伴う疾患」という用語は、HIV感染の特徴である病態を言う。HIV感染に伴うこの様な疾患には、AIDS、カポシ肉腫、ニューモシチス・カリニ(Pneumocystis carini)および結核菌(Mycobacterium tuberculosis)で発症する日和見感染、鷲口瘡を含む口腔病変、毛様白板症、およびアフタ性潰瘍、全身性リンパ節障害、帯状疱疹、血小板減少症、無菌性髄膜炎、トキソプラズマ症等の神経疾患、クリプトコッカス症、CMV感染、原発性CNSリンパ腫、HIV−関連痴呆症、末梢神経症、発作、筋障害等が含まれるが、それに限定されない。
「長期非進行性個体」という用語は、約10年以上もHIVに感染しているが、CD4+細胞が正常で安定したレベルであり、抗レトロウイルス治療を受けていないことが特徴である個体を言う。
HIV感染の「危険性が高い」個体とは、そのHIV感染の危険性が全人口の危険性より高い場合を言う。
デフェンシンポリペプチドの活性を調節する化合物のアッセイの文脈における「機能的効果」という用語には、直接的または間接的にデフェンシンの影響下にあるパラメーター、例えば、HIV感染、HIV複製、HIV感染細胞によるHIVマーカーの表示、または細胞(例えばリンパ球、好ましくはCD4+リンパ球)増殖、アポトーシス、または、例えば、リガンド結合またはリガンド結合阻害等の物理的効果を増加または減少させる能力のような、表現型または化学効果の決定が含まれる。従って、機能的効果には、リガンド結合活性、細胞の増殖能、HIVが細胞に感染しウイルスタンパク質を発現する能力、アポトーシス、および酵素活性が含まれる。「機能的効果」にはインビトロ、インビボおよびエクスビボ活性が含まれる。
「機能的効果の測定」という用語は、直接的または間接的にデフェンシンタンパク質の影響下にあるパラメーターを増加または減少させる化合物のアッセイ、例えば、物理的および化学的または表現型効果の測定を言う。この様な機能的効果は、当業者に公知の任意の手段、例えば、分光学的特性(例えば蛍光、吸光度、屈折率)の変化;流体力学(例えば形状);クロマトグラフィー;またはタンパク質の溶解度の測定;タンパク質の誘発性マーカーまたは転写活性の測定;結合活性または結合アッセイ、例えば、抗体への結合の測定;リガンドまたは基質結合活性の変化の測定;細胞増殖の測定;アポトーシスの測定;ウイルスタンパク質発現の測定;ウイルス複製の測定;血清中のウイルス力価またはウイルスRNAコピーの測定;デフェンシンまたはデフェンシン関連配列に対するタンパク質レベルの変化の測定;RNAの安定性の測定;例えば、化学発光、蛍光、発色反応、抗体結合および誘導性マーカーによる下流またはレポーター遺伝子発現(CAT、ルシフェラーゼ、β−gal、GFP等)の同定により測定することができる。
デフェンシンヌクレオチドおよびポリペプチド配列の「阻害剤」、「活性化剤」および「調節剤」は、デフェンシンヌクレオチドチドおよびポリペプチド配列のインビトロおよびインビボアッセイを用いて同定される活性化、阻害または調節分子を指して用いられる。阻害剤は、例えば、デフェンシンタンパク質に結合し、活性を部分的または完全にブロックし、デフェンシンタンパク質の活性または発現を減少し、阻止し、遅延し、不活性化し、脱感作するか、または下方調節する分子、例えばアンタゴニストである。「活性化剤」とは、デフェンシンタンパク質活性またはデフェンシン発現を増加する、開放する、活性化する、増進する、増大する、感作する、拮抗させる、または上方制御する分子、例えばアゴニストである。阻害剤、活性化剤または調節剤には、例えばデフェンシンタンパク質の遺伝的に修飾されたバージョン等の活性が変化したバージョンの他、天然起原および合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、ペプチド、環状ペプチド、核酸、アンチセンス分子、リボザイム、低分子量化学分子も含まれる。阻害剤および活性化剤のアッセイには例えば、インビトロ、細胞内または細胞膜内でのデフェンシンタンパク質を発現すること、および推定調節剤化合物を付与すること、および、次いで上記の様な活性に対する機能的効果を測定することが含まれる。
潜在的な活性化剤、阻害剤または調節剤で処理されたデフェンシンタンパク質を含む試料またはアッセイを活性化剤、阻害剤または調節剤のない対照試料と比較し、阻害剤の程度を調べる。対照試料(阻害剤非処理)の相対的なタンパク質活性値を100%とする。対照試料に対する活性値が約80%、好ましくは50%、より好ましくは25〜0%であるとデフェンシンの阻害が達成される。対照試料(活性化剤未処理)に対する活性値に対する活性値が、110%、好ましくは150%、より好ましくは200〜500%(すなわち、対照に対して2倍〜5倍より高い)、さらに好ましくは1000〜3000%高い場合、デフェンシンの活性化が達成される。
本明細書で用いる「試験化合物」、「薬剤候補」または「調節剤」とは、天然起原または合成のいずれかのタンパク質、オリゴペプチド(例えばアミノ酸長約5〜25、好ましくは10〜20または12〜18、より好ましくは12、15または18)、低分子量有機分子、多糖、脂質、脂肪酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等の任意の分子である。この様な分子のウイルス感染、例えばHIV感染を直接的または間接的に調節する能力が試験され得る。試験化合物は、十分な範囲の多様性を与えるコナビナトリアルまたは無秩序化ライブラリー等の試験化合物のライブラリーであってもよい。場合によっては試験化合物を標的化化合物、レスキュー化合物、二体量体化化合物、安定化化合物、アドレス可能化合物および他の機能性成分等の融合パートナーと結合する。便利には、通常は、有用な性質を有する新規化学実体が、何らかの望ましい性質または活性、例えば阻害活性を有する試験化合物(「リード化合物」と呼ばれる)を同定すること、リード化合物の改変体を生成すること、そしてこの様な改変体化合物の性質および活性を評価することにより生成する。この様な分析のために高スループットスクリーニング法(HTS)がしばしば採用される。
「低分子量有機分子」とは約50ダルトンを越え、約2500ダルトン未満の、好ましくは約100〜1000ダルトンの間の、より好ましくは約200〜500ダルトンの間の分子量を有する天然起原または合成いずれかの分子である。本明細書で言う「低分子量有機分子」はペプチドとは異なる。
「生物学的試料」にはバイオプシーまたはオートプシー試料等の組織切片、および組織学的な目的で採取された凍結切片が含まれる。この様な試料には血液、唾液、組織、培養細胞、例えば1次培養物、移植組織および形質転換細胞、および大便および尿等が含まれる。生物学的試料は代表的には真核生物、最も好ましくは、チンパンジーまたはヒト等の霊長類、ウシ、イヌ、ネコ、齧歯類、例えばモルモット、ラット、マウス、または鳥類、爬虫類または魚類が含まれる。
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で「同一」または「同一性」と言う用語は、以下に説明するデフォルトパラメーターでBLASTまたはBLAST2.0配列比較アルゴリズムを用いて測定するか、手作業アラインメントおよび目視検査により(例えば、NCBIウエブサイト参照のこと)、比較ウインドウまたは指定された領域にわたる最大対応について比較およびアラインしたとき、同一であるか、または特定された%の同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチド(すなわち、特定の領域(例えば本明細書に記載のデフェンシンをコードするヌクレオチド配列または本明細書に記載のデフェンシンのアミノ酸配列)にわたり、約60%の同一性、好ましくは、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上、またはそれより高い同一性を有する2つ以上の配列または部分配列をいう。この様な配列を「実質的に同一」であると言われる。この定義はまた、試験配列の相補体を指すか、それに当てはめることができる。この定義には欠失および/または付加を有する配列の他、置換を有するものも含まれる。下記の様に、好ましいアルゴリズムではギャップ等も考慮される。長さで少なくとも約25個のアミノ酸またはヌクレオチドで同一性であることが好ましく、50〜100個のアミノ酸またはヌクレオチドで同一であることがより好ましい。
配列の比較では、代表的には1つの配列を参照配列とし、試験配列をそれと比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピューターに入力し、必要あれば部分配列の座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用することが好ましいが、それに代わり、パラメーターを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムはプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対して試験配列の同一性の%を計算する。
本明細書で用いる「比較ウインドウ」には、20〜600個、通常約50〜200個、より一般的には約100〜150個からなる群より選ばれた任意の連続位置の数のセグメントに対する参照も含まれ、そこでは、2つの配列を最適にアラインした後に、ある配列が、同じ数の連続位置の参照配列と比較され得る。比較のための配列のアラインメント法は公知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、SmithおよびWatermanの局所ホモロジーアルゴリズム(Adv.Appl.Math.、2:482(1981))により、NeedlemanおよびWunschのホモロジーアラインメントアルゴリズム(J.Mol.Biol.、48:443(1970))、PearsonおよびLipmanの類似性法の検索(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:2444(1988))により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行により(Wisconsin Genetics中のソフトウエアパッケージ中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA(Genetic Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WI))により、または手作業のアラインメントおよび目視検査(例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Ausbelら編集、1995年、付録)を参照のこと)により実行することができる。
配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの好ましい例は、Altschulら(Nuc.Acids Res.25:3389−3402(1977))およびAltschulら(J.Mol.Biol.、215:403−410(1990))にそれぞれ記載のBLASTおよびBLAST2.0である。本明細書に記載のパラメーターでBLASTおよびBLAST2.0を用い、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性を決定する。BLAST解析を実行するためのソフトウエアは、National Center for Biotechnology Information(http://ncbi.nlm.nih.gov/)で公開されている。このアルゴリズムは質問配列中の長さWの短いワードを同定することにより、最初、高スコア配列ペア(HSP)を同定することを含み、これは、データーベース配列中の同じ長さのワードとアラインさせた場合、ある正の値の閾値スコアTと一致するかそれを満足するかのいずれかである。Tは近隣ワードスコア閾値である(Altchul、前出)。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見出すための検索を開始する種となる。累積アラインメントスコアが増加され得る限り、ワードヒットは各配列に沿って両方向に延長される。ヌクレオチド配列については、累積スコアはパラメーターM(マッチング残基対に対する報酬スコア、常に>0)およびN(ミスマッチ残基に対する罰則スコア、常に<0)を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアマトリックスが用いて累積スコアを計算する。量Xによってその最大達成値から累積アラインメントスコアが減少した場合;1つ以上のネガテブスコア残基アラインメントの累積により累積スコアがゼロまたはそれ未満になった場合;またはいずれかの配列が末端に到着した場合、各方向へのワードヒットの延長を停止する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXはアラインメントの感度と速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)はワード長(W)11、期待値(E)10、M=5、N=−4および二つの鎖の比較をデフォルトとして用いる。アミノ酸配列では、BLASTPプログラムはワード長3、期待値(E)10、およびBLOSUM62スコアマトリックス(HenikoffおよびHenikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:10915(1989)参照のこと)のアラインメント(B)50、期待値(E)10、M=5、N=−4および二つの鎖の比較をデフォルトとして使用する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」と言う用語は、本明細書ではアミノ酸残基のポリマーを指す用語として互換的に用いられている。この用語は1つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーの他、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび非天然起原アミノ酸ポリマーにも用いられる。
「アミノ酸」と言う用語は、天然起原アミノ酸および合成アミノ酸の他、天然起原アミノ酸と類似の方法で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を指す。天然起原アミノ酸は遺伝子コードでコードされるアミノ酸の他、その後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびO−ホスフォセリンを指す。アミノ酸アナログとは、天然起原アミノ酸と同じ基本化学構造、例えば水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム等のことである。この様なアナログは修飾されたR基(例えばノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然起原アミノ酸と同じ基本化学構造を維持している。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なった構造を有するが、天然起原アミノ酸と類似の方法で機能する化学的化合物をいう。
本明細書ではアミノ酸は一般的に知られる3文字記号、またはIUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Comissionが推薦する1文字記号のいずれかで表され得る。同様に、ヌクレオチドは一般に容認されるそれらの1文字コードで表され得る。
「保存的修飾改変体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に用いられる。特定の核酸配列に関して言えば、保存的に改変された改変体とは同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするような核酸であるか、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUはすべてアミノ酸であるアラニンをコードする。従って、アラニンがコドンで指定されるあらゆる位置で、このコドンは、コードされたポリペプチドを変えることなく記載された対応するコドンの任意の一つに変更することができる。この様な核酸改変体は「サイレント改変体」であり、保存的に修飾された改変体の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列はまた、可能な全ての核酸のサイレント改変体を記載している。核酸中の各コドン(通常メチオニンの唯一のコドンであるAUG、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除いて)を修飾して機能的に同一の分子を生成し得ることを、当業者は認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント改変体は発現生成物に関しては各記載の配列中に暗黙に認められているが、実際のプローブ配列に関してはそうではない。
アミノ酸配列に関して言えば、コードされた配列中で単一アミノ酸または小さな割合のアミノを変更、追加または削除する核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列への個々の置換、欠失または追加は「保存的修飾改変体」であり、その変更が化学的に類似のアミノ酸への置換となることは、当業者が認めることと思われる。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は公知である。この様な修飾改変体は本発明の多形変異体、種間ホモログおよび対立遺伝子改変体に追加され、それらを除外するものではない。
以下の8個のグループは相互に保存的置換であるアミノ酸を含む:1)アラニン(A)、グリシン(G);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);7)セリン(S)、トレオニン(T);8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton、Protein(1984)参照を参照のこと)。
ポリペプチド構造等の高分子構造を様々なレベルの組織化の観点で記述することができる。この組織化の一般的な議論については、例えばAlbertsら、「Molecular Biology of the Cell、第3版、1944」、およびCantorおよびSchimel、Biophysical Chemistry Part I:“The Conformation of Biological Macromolecules、(1980)を参照のこと。「1次構造」とは特定のペプチドのアミノ酸配列のことである。「2次構造」とはポリペプチド内の局所的に規則的な3次元構造のことである。これらの構造は一般的にドメイン、例えば酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜横断ドメイン、ポアドメイン、および細胞質テールドメインとして知られている。ドメインは密な単位を形成するポリペプチドの部分であり、典型的にはアミノ酸長が15〜350である。代表的なドメインには酵素活性ドメイン、例えばキナーゼドメインがある。典型的なドメインはβシートおよびαヘリックス等のより組織化の低い部分で形成されたドメインがある。「3次構造」とはポリペプチド単量体の完全に3次元的な構造を言う。「4次構造」とは独立の3次ユニットの非共有結合集合体で形成する3次元構造を言う。
特定の核酸は「スプライス改変体」も暗黙に包括する。同様に、核酸でコードされる特定のタンパク質はその核酸のスプライス改変体でコードされる任意のタンパク質を暗黙に包括する。その名前が示唆する様に、「接合改変体」は遺伝子の別なスプライシングの生成物である。転写後、最初の核酸転写体を、異なった(別な)核酸スプライス生成物が異なったポリペプチドをコードする様にスプライスし得る。スプライス改変体生成の機構は様々であるが、エクソンの別なスプライシングを含む。リードスルー転写による同じ核酸由来の別なポリペプチドもこの定義に含まれる。スプライス生成物の組換え型を含むスプライス反応の任意の生成物がこの定義に含まれる。
「標識」または「検出可能部分」とは、分光学、光化学、生化学、免疫化学、化学的手段、またはその他の物理的手段で検出可能な成分である。例えば、有用な標識には32P、蛍光染料、電子稠密試薬、酵素(例えばELISAで通常用いられる酵素)、ビオチン、ジオキシゲニン、またはパプテン、およびペプチド中に放射線標識を取り込ことで検出可能にした、またはペプチドト特異的に反応する抗体を検出するためのタンパク質が含まれる。
例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関連して用いられる「組換え体」と言う用語は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸またはタンパク質の導入、または天然の核酸またはタンパク質の改変で修飾された、または細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、例えば組換え細胞は、細胞の天然(非組換え体)形態内に見出されない遺伝子、またはそうでなければ異常発現するか、十分に発現しないか、または全く発現しない天然遺伝子を発現し得る。組換え細胞は、その発現がプロモーターおよびエンハンサー等の制御DNA配列の挿入により誘発される天然遺伝子も発現し得る。
核酸の一部に関して用いられる「異種」と言う用語は、核酸が、天然では相互に同じ関係で見出されない2つ以上の部分配列を有することを示す。例えば、組換えで生成する典型的な核酸は、例えばある起原由来のプロモーターと他の起原由来のコード領域等、新規の機能性核酸を生成する様に配列された無関係の遺伝子由来の2つ以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質とは、そのタンパク質が天然では相互に同じ関係で見出されない2つ以上の部分配列を有すること(例えば、融合タンパク質)を示す。
「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」と言う用語は、プローブが、代表的には、核酸の複雑な混合物中でその標的部分配列にハイブリダイゼーションするが、他の配列にはハイブリダイゼーションしない条件を言う。ストリンジェント条件は配列に依存し、異なった環境では異なり得る。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイゼーションする。核酸のハイブリダイゼーションの詳しい案内はTijssen、「Techniques in Biochemistry and Molecular Biology、Hybridization with Nucleic Probes」、「Overview of Principles of Hybtidization and Strategy of Nuckeic Acid Assays」(1993)に見られる。一般的にストリンジェント条件は規定されたイオン強度pHにおける特定の配列の熱溶融点(Tm)より約5〜10°C低く選ばれる。Tmは標的に相補的であるプローブの50%が平衡状態(標的配列は過剰に存在するので、Tmで50%のプローブが平衡状態で占有される)で標的配列とハイブリダイゼーションする(規定されたイオン強度、pHおよび核酸濃度で)温度である。ストリンジェント条件はホルムアミド等の脱安定化試薬を添加して達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションでは、陽性信号はバックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は以下の通りであり得る:50%ホルムアミド、5×SSC、および1%SDS、42°Cでのインキュベーション、または5×SSC、1%SDS、65°Cでのインキュベーション、0.2×SSCおよび65°Cで0.1%SDSにおける洗浄。
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイゼーションしない核酸も、それがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、実質的に同一である。このことは例えば、核酸のコピーが遺伝子コードで許容される最大のコドン縮重を用いて生成する場合に生じる。この様な場合、核酸は代表的には中程度のストリンジェントハイブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーションする。「中程度のストリンジェントハイブリダイゼーション条件」には37°Cでの40%ホルムアミド中、1M NaCl、1%SDSおよび45°Cでの1XSSC洗浄によるハイブリダイゼーションが含まれる。陽性ハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも2倍である。同様なストリンジェンシー条件を提供するために別なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用い得ることを、当業者は容易に理解し得る。ハイブリダイゼーションパラメーターを決定する別なガイドラインは多くの参考資料、例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biologyで提供される。
PCRでは、約36°Cの温度が低ストリンジェント増幅で典型的であるが、プライマーの長さによっては、アニール温度は約32〜48°Cの間でで変化し得る。高ストリンジェントPCR増幅では約62°Cが典型的であるが、プライマーの長さと特異性によっては高ストリンジェントアニール温度は、約50から65°Cの範囲であり得る。高および低ストリンジェント増幅の両方に典型的な条件には90〜95°Cで30秒〜2分の変性期、30秒〜2分間のアニール期、および約72°Cで1〜2分の伸長期が含まれる。低および高ストリンジェント増幅反応のプロトコールとガイドラインは、例えば、Innisら、「PCR Protocols、A Guide to Methods and Applicatins」、1990、Academic Press、Inc.NYに見られる。
「抗体」とは免疫グロブリン遺伝子由来の骨格領域を含むポリペプチド、または、抗原を特異的に認識し結合するその断片を言う。認識される免疫グロブリン遺伝子にはκ、λ、α、γ、δ、εおよびμ不変領域遺伝子と、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεに分類され、これらは、次に、免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEそれぞれを規定する。代表的には、抗体の抗原結合領域は結合の特異性と親和性に最も重要である。
免疫グロブリン(抗体)構造ユニットの例には4量体がある。各4量体は2個のポリペプチド鎖の同じ対で構成され、各対は1本の「軽」鎖(約25kD)と1本の「重」鎖(約50〜70kD)を有する。各鎖のN−末端は抗原認識に基本的に重要な約100〜110個のアミノ酸の可変領域を規定する。用語、可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖のことである。
例えば抗体は無傷の免疫グロブリン、または様々なペプチダーゼによる消化で生成したいくつかの性質が良く分かった断片として存在する。従って、例えば、ペプシンはヒンジ領域のジスルフィド結合より下で抗体を消化し、Fabの2量体であるF(ab)’2を生成し、それ自体がジスルフィド結合でVH−CH1に結合した軽鎖である。このF(ab)’2は温和な条件で還元されてヒンジ領域でジスルフィド結合を開裂し、それによって、F(ab)’22量体をF(ab)’単量体に変換する。このF(ab)’単量体は基本的にヒンジ領域の一部を有するFabである(Paul編集、第3版、1993年、Fundamental Immunologyを参照のこと)。無傷の抗体の消化による様々な抗体断片が規定されているが、この様な断片が化学的に、または組換えDNA技法を用いて新規に合成されることは、当業者が理解し得る。従って、本明細書で用いる抗体という用語は、抗体全体を修飾して製造されたか、組換えDNA技法を用いて新たに合成されたか(例えば単一鎖FV)、またはファージ発現ライブラリー(例えばMacCaffertyら、Nature、348:552−554(1990)を参照のこと)を用いて同定された抗体断片も含む。
抗体、例えば組換え、モノクローンまたはポリクローナル抗体を調製するため、当該分野で公知の多くの技術を使用することができる(例えば、KohlerおよびMilstein、Nature 256:495−497(1975);Kozborら、Immunology Today、4:72(1983);Coleら、「Monoclonal Antibodies and Cancer Theraphy」、p77−96、Alan R.Liss、Inc.(1985);Coligan、「Current Protocol in Immunology」、1991;HarlowおよびLane、「Antibodies A Labortory Manual、1988」;およびGoding、「Monoclonal Anribodies:Principleとs and Practice」、1986を参照のこと)。目的の抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子は細胞からクローニングすることができる。例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、組換えモノクローナル抗体を生成することができる。モノクローナル抗体の重鎖および/または軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーもハイブリドーマまたはプラズマ細胞から作成することができる。重鎖および軽鎖遺伝子生成物の無秩序な組み合わせにより、異なった抗原特異性を有する抗体の大きなプールを作成することができる(例えばKuby、Immunology、第3版、1997を参照のこと)。単一鎖抗体または組換え抗体の製造技術(米国特許第4、946、778号および同第4、816、567号)を用いて本発明のポリペプチドに対する抗体を製造することができる。また、遺伝子動導入マウスまたは他の哺乳動物等の他の生物を用いてヒト化またはヒト抗体を発現させることができる(例えば、米国特許第5、545、807号、5、545、806号、5、569、825号、5、625、126号、5、633、425号、5、661、016号;Markら、Bio/Technology、10:779−783(1992);Lonbergら、Nature、368:856−859(1994);Morrison、Nature、368:812−13(1994);Fishwildら、Nature Biotechnology、14:845−51(1996);Neuberger、Nature Biotechnology、14:826(1996);およびLonbergおよびHuszar、Intern.Rev.Immunol.、13:65−93(1995)を参照のこと)。また、ファージ表示技術を用いて選ばれた抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロメリックFab断片を同定することができる(例えば、MacCaffertyら、Nature、348:552−554(1990);Marksら、Biotechnology、10:779−783(1992)を参照のこと)。抗体を二重特性、即ち2つの異なった抗原を認識し得る様にすることもできる(例えばWO93/08829;Trauneckerら、EMBO J.、10:3655−3659(1991);およびSureshら、Methods in Enzymology、121:210(1986)を参照のこと)。抗体はヘテロ結合体、例えば、2個の共有結合で繋がった抗体、または免疫毒素であってもよい(例えば米国特許第4、676、980号、WO91/00360、WO92/200373、およびEP03089を参照のこと)。
非ヒト抗体をヒト化または霊長類化する方法は当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は非ヒト起原抗体から導入された1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、輸入残基と言われ、代表的には、輸入可変ドメインから取り出される。ヒト化は基本的にはWinterと共同研究者の方法に従い(例えばJonesら、Nature、321:522−525(1986);Riechmannら、Nature、332:323−327(1988);Verhoeyenら、Science、239:1534−1536(1988);およびPresta、Curr.Op.Struct.Biol.、2:593−596(1992)を参照のこと)。齧歯類のCDR(単数または複数)をヒト抗体の対応する配列で置換して行われる。従って、この様なヒト化抗体はキメラ抗体であり(米国特許第4、816、567号)、ここで、実質的に無傷のヒト可変ドメインより少なく非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。実際にはヒト化抗体は、代表的にはCDR残基のいくつかと、多分FR残基のいくつかが齧歯類抗体中の類似部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。
「キメラ抗体」は、(a)不変領域、またはその一部が、改変され、置換されまたは交換され、その結果、抗原結合部位(可変領域)が、異なった、または変更されたクラスの不変領域、エフェクター機能および/または種、またはキメラ抗体に、新規な性質を付与する全く異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤等に結合している抗体分子;または(b)可変領域またはその一部が異なった、または変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、置換または交換された抗体分子である。
ある実施形態では、抗体が「エフェクター」成分と結合する。エフェクター成分は放射性標識または蛍光標識等を含む任意の数の分子であるか、または治療成分である。ある局面では抗体はタンパク質の活性を調節する。
抗体に「特異的(または選択的)に結合」、または「特異的(または選択的)に反応」と言う用語は、タンパク質またはペプチドに関する場合は、しばしばタンパク質およびその他の生体分子の不均一な集合中のタンパク質の存在を測定し得る結合反応を言う。従って、特定の免疫分析条件では、特定の抗体がバックグラウンドの少なくとも2倍、代表的にはバックグラウンドの10〜100倍、特定のタンパク質に結合する。この様な条件では、抗体への特異的結合には特定のタンパク質に対する特異性で選ばれた抗体が必要である。例えば、デフェンシンタンパク質、多形変異体、対立遺伝子改変体、オーソログおよび保存的に修飾された改変体、またはスプライス改変体またはその一部に対して惹起されたポリクローナル抗体を選択して、デフェンシンタンパク質と特異的に免疫反応するが他のタンパク質とは反応しないポリクローナル抗体のみを得ることができる。この選択は他の分子と交差反応する抗体をサブトラクトすることで達成される。特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために様々な免疫分析形式を使用することができる。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を慣用的に選択するために、固相ELISA免疫アッセイが用いられる(特異的免疫反応性の決定に用いられ得る免疫アッセイ形式の説明および条件については、例えばHarlowおよびLane、Antibodies、A Laboratory Manual(1988)を参照のこと。
本明細書の「治療上有効用量」とは、投与により所望の効果が得られる用量を意味する。正確な用量は治療の目的に依存し、公知の技術を用いて当業者が確認し得る(例えばLieberman、Pharamceutical Dosage Forms(第1〜3巻、1922);Lloyd、The Art、Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999);およびPicker、Dosage Calculations(1999)を参照のこと)。抗HIV薬として使用するデフェンシンの治療に有効な量の場合は、治療に有効な量とは、各個体でHIV感染またはAIDSの治療で任意の成功の兆候を達成するために必要な量であり、HIVウイルス阻害、HIV感染およびAIDSに関連する症状の消滅、または個体の身体的または精神的健康の改善等の主観的または客観的判断基準を含む。例えば、ある個体では治療上有効用量は体重1kgあたり1マイクログラムから体重1kgあたり1グラムである。
(C.デフェンシン:調製と精製)
(1.デフェンシン)
デフェンシンは抗細菌剤または抗かび剤として周知である(Murphyら、米国特許第5、242、902号を参照のこと)。デフェンシンはヒト、モルモット、ラット、ウサギ、霊長類マカク属およびマウスを含む多くの動物の他、植物および昆虫で見出され、特徴付けされている。
(1.デフェンシン)
デフェンシンは抗細菌剤または抗かび剤として周知である(Murphyら、米国特許第5、242、902号を参照のこと)。デフェンシンはヒト、モルモット、ラット、ウサギ、霊長類マカク属およびマウスを含む多くの動物の他、植物および昆虫で見出され、特徴付けされている。
本発明の目的では、哺乳動物デフェンシンの構造クラスはαおよびβの二つである。本出願で用いられる“デフェンシン”と言う用語にはαおよびβデフェンシン、特にα−デフェンシン−1、−2および−3が含まれる。ヒトデフェンシンをコードする遺伝子は単一の染色体領域8p21−23に位置すると考えられている(Kaiserら、Journal of Leucocyte Biology)、68:779−784(2000))。構造的にはデフェンシンは空間的に離れた疎水性および荷電領域を有するカチオン分子である。既知のデフェンシンはすべてβシート構造と、分子内システインジスルフィド結合を形成する6個または8個のシステインが共通である。
本明細書で用いる「α−デフェンシン」と言う用語は、その生物学的活性が本明細書に記載のウイルス阻害アッセイ等のHIVウイルス阻害アッセイを用いて決定されるとき抗HIV活性であることで特徴付けされるポリペプチドである。α−デフェンシンは一般に長さが100個以下のアミノ酸、通常は約25〜35個のアミノ酸であり、種間で保存されるモチーフ中で6個のシステイン残基が特徴である(保存性モチーフは本明細書で配列番号3〜8に明らかである。(LiuおよびGanz、Genomics、43:316−320(1997);および米国特許第4、705、777号(Lehrerら)を参照のこと)。α−デフェンシンはまた、生理学的pHで正に荷電したアルギニンにほぼ帰せられる正味の正電荷を有する。従って、α−デフェンシンという用語はシステインおよびアルギニン含量の両方が多いカチオン性タンパク質を包含する。いくつかの実施形態では、α−デフェンシンは実質的に保存される6個のシステインと2〜4個のアルギニンを有することが特徴である。システインとアルギニンはオリゴペプチド全体に分散し、そのためシステインは分子内および分子間で、共有結合および非共有結合により全体的な架橋の機会を与え、そしてアルギニンは広い範囲のpHで、高度にカチオン性であるように、分子全体に静電荷を与える。例えば、いくつかの実施形態では、α−デフェンシンはシステイン残基が形成する3個のジスルフィド結合を含む。本発明のα−デフェンシンはまた、βシート、例えば三重螺旋反平行βシート等のβヘアピン配座を含む2次構造を形成する(Mandalら、J.Peptide Research、59;95−104(2002))。「α−デフェンシン」と言う用語は、天然起原のα−デフェンシン、すなわち天然起原より単離されたポリペプチド;合成α−デフェンシン、すなわち化学的に合成されたか組換えDNA技術で製造され、天然起原α−デフェンシンのアミノ酸配列を有するポリペプチド;およびα−デフェンシンアナログ、すなわちα−デフェンシンの生物学的活性を有し、天然に生じないアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。この用語はまた、細胞内で生物学的活性型にプロセッシングされるα−デフェンシンのプレプロタンパク質型も包含する。
α−デフェンシンは体内の様々な部位で発現する。しかしながら、α−デフェンシン1〜4は多形核好中球で優先的に見出され、一方、α−デフェンシン5、6は小腸中のパネート細胞の分泌顆粒中で高度に発現する。ヒトα−デフェンシン1〜3はCD8+T細胞によって分泌されることが現在同定されている。3種のデフェンシン、すなわちα−デフェンシン1〜3はN−末端のアミノ酸1個のみが異なる(Linzmeierら、FEBS LETT.、321(2−3):267−273(1993);Palfreeら、Mol.Endocrin.、7(2):199−205(1993);Mallowら、J.Biol.Chem.、271(8):4038―4045(1996);Marsら、J.Biol.Chem.、270(51):30371−30376;およびQuayleら、Am.J.Pathol.、152(5):1247−1258)。
ある実施形態では、上記α−デフェンシンには、本明細書に記載するヒトα−デフェンシン核酸でコードされるアミノ酸配列、例えばα−デフェンシン1〜6、好ましくはα−デフェンシン1〜3に対し約60%を越えるアミノ酸配列同一性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、好ましくは91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上のアミノ酸配列同一性を、好ましくは少なくとも約15、20、25、30個またはそれより多いアミノ酸の領域にわたって有するポリペプチド、プレプロタンパク質、処理タンパク質、多型改変体、対立遺伝子および突然変異体が含まれる。
他の実施形態では、上記で規定されるように、α−デフェンシンにはヒトα−デフェンシン核酸、および本明細書で上記に記載のような他の動物由来のα−デフェンシン、例えばウサギデフェンシン1〜5、ラットデフェンシン1〜4、およびモルモットのデフェンシンの核酸でコードされるアミノ酸配列に対し、約60%を越えるアミノ酸配列同一性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、好ましくは91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上のアミノ酸配列同一性を、好ましくは少なくとも15、20、25、30個またはそれを超えるアミノ酸の領域にわたって有するポリペプチド、プレプロタンパク質、処理タンパク質、多型改変体、対立遺伝子改変体、突然変異体および種間ホモログが含まれる。
他の実施形態では、上記に規定されるようなα−デフェンシンにはパネー細胞中で高度に発現するα−デフェンシン、例えばヒトα−デフェンシン5−6、マウスα−デフェンシン1、2、および1α、およびウサギα−デフェンシン6の核酸でコードされるアミノ酸配列に対し、約60%を越えるアミノ酸配列同一性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、好ましくは91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を、好ましくは少なくとも約15、20、25、30個またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって有するポリペプチド、プレプロタンパク質、処理タンパク質、多型変位体、対立遺伝子、突然変異体、および種間ホモログが含まれる。
あるいは、上記α−デフェンシンには35個以下のアミノ酸を有し、式Z0−2−(aa1)a−(aa2)b−cys−aa4−cys−arg−aa7−aa8−aa9−cys−aa11−aa12−aa13−glu−arg−aa16−aa17−gly−aa19−cys−aa21−aa22−a23−gly−aa25−aa26a27−aa28−a29−cys−cys−(aa32)c−w(配列番号1)の配列を有するカチオン性オリゴペプチドが含まれる。ここでZはそれが存在する場合、末端アミノ基に化学的に結合し、0〜1個のアミノ置換基を有する炭素原子数1〜6のアシル基、炭素原子数1〜3のアルキル基または保護基であり;a、bおよびcは独立して0または1;アミノ酸を表すaaの上付き数字は、2個のアミノ酸が存在するaa9以外はポリペプチド中のアミノ酸番号であり、続き番号は以下の定義も含めてすべて1づつ増加し;アミノ酸1、7、8、11、13、21、23、25、26および28は脂肪族アミノ酸であり;アミノ酸2、4、9、12、16、17、19、22、27、29および32は脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸であり;wは末端水酸基またはアミノ基、またはN−末端に塩基性アミノ酸を有するアミノ酸1〜6個のペプチドである。ある実施形態では、aa1はvalまたはgly;aa2はval、ile、arg、ser、phe、ala、またはasp;aa4はala、val、thrまたはtyr;aa7はarg、lys、glyまたはile;aa8はala、arg、gln、pheまたはpro;aa9は2個のleu、phe、serまたはala;aa11はleu、pro、ser、gly、またはile;aa12はpro、asn、lys、phe、serまたはala;aa13はarg、leu、serまたはgly;aa16はarg、pheまたはala;aa17はala、ser、ileまたはtyr;aa19はphe、tyr、asp、serまたはthr;aa21はarg、lys、thrまたはile;aa22はile、valまたはtyr;aa23はarg、asnまたはgln;aa25はarg、ala、またはval;aa26ile、leuまたはarg;aa27はhis、val、pheまたはtrp;aa28はpro、tyr、alaまたはthr;aa29はleu、argまたはphe;aa32はarg、ser、proまたはtrip;wは0〜2個のargである。ある実施形態では、aa1、aa2およびaa4等の置換基は、天然起原以外の配列を有して分泌され、本明細書ではアナログと呼ばれる。
また、上記α−デフェンシンには35個以下のアミノ酸を有し、式Z’0−2−val−aa2−cys−aa4−cys−arg−arg−aa8−aa9−cys−aa11−aa12−aa13−glu−arg−arg−aa17−gly−aa19−cys−arg−aa22−arg−gly−arg−aa26−his−aa28−leu−cys−cys−arg−(arg)0−1(配列番号2)の配列を有するカチオン性オリゴペプチドが含まれる。ここでZ’はメチル、アセチルまたはアミノ酸であり;アミノ酸2、4、8、9、11、17および22は中性アミノ酸であり;アミノ酸12および28は複素環アミノ酸または中性アミノ酸であり;アミノ酸19は芳香族アミノ酸または水酸基置換脂肪族アミノ酸であり;アミノ酸13および26は脂肪族アミノ酸または塩基性アミノ酸である。または、オリゴペプチドは式Z’0−2−val−aa2−cys−thr−cys−arg−aa7−phe−aa9−cys−gly−aa12−gly−glu−arg−ala−aa17−gly−aa19−cys−thr−aa22−asn−gly−val−arg−his−aa28−leu−cys−cys−arg−(arg)0−1の配列を有し、aa2およびaa12はpheまたはser;aa7はargまたはgly;aa9は水酸基置換または非置換脂肪族アミノ酸;aa17、aa19およびaa28は水酸基置換アミノ酸;aa22は炭素原子数5または6の脂肪族アミノ酸である。または、オリゴペプチドは式ala−cys−tyr−cys−arg−ile−pro−ala−cys−ile−ala−asp−gly−glu−arg−arg−tyr−gly−thr−cys−ile−tyr−gln−gly−arg−leu−trp−ala−phe−cyc−cysの配列を有し、alaおよびaspはそのアミノ酸がないか、またはそのアミノ酸の一つを示す。他の実施形態では、aa2、aa7およびaa9等の置換基は天然起原配列以外を有するように分泌され、本明細書ではアナログと呼ばれる。
α−デフェンシンはヒト、ウサギ、モルモット、ブタ、ラット、霊長類マカク族、およびハムスター好中球、ウサギ線房マクロファージ、ヒトおよび齧歯類小腸パネート細胞に見出されている(Daherら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:7327−7331;Lehrerら、Infect.Immun.、11:1226−1234;Selstedら、Infect.Immun.、55:2181−2186;Eisenhauerら、Infect.Immun.、57:2021−2027;Tangら、Infect.Immun.、67:6139−6144;Makら、Infect.Immun.、64:4444−4449;Ganzら、J.Immunol.、143:1358−1365;Mallowら、J.Biol.Chem.、271:4038−4045;Quelletteら、J.Cell.Biol.、108:1687−1695;およびQuら、Infect.Immun.、64:5161−5165)。
本明細書で用いる「ヒトα−デフェンシン」と言う用語は、以下のアミノ酸配列の1つを有するポリペプチド、その対立遺伝子改変体、およびそのプレプロタンパク質を言う。ヒトα−デフェンシン1〜6の配列は以下の通りである;α−デフェンシン1(HNP1):ACYCRIPACAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(配列番号3);α−デフェンシン2(HNP2):CYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(配列番号4);α−デフェンシン3(HNP3):DCYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(配列番号5);α−デフェンシン4(HNP4):VCSCRLVFCRRTELRVGNCLIGGVSFTYCCTRV(配列番号6);α−デフェンシン5(HD5):ARATCYCRTGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR(配列番号7);およびα−デフェンシン6(HD6):TRAFTCHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINHRFCCL(配列番号8)。α−デフェンシンは米国特許第4、705、777号(Lehrerら)に記載されている。
本明細書で用いる「ウサギα−デフェンシン」と言う用語は、以下のアミノ酸配列の1つを有するポリペプチド、その対立遺伝子改変体、およびそのプレプロタンパク質を言う。ウサギα−デフェンシン1〜6の配列は以下の通りである;α−デフェンシン1(NP1):VVCACRRALCLRPERRAGFCRIRGRIHPLCCRR(配列番号9);α−デフェンシン2(NP2):VVCACRRALCLPLERRAGFCRIRGRIHPLCCRR(配列番号10);α−デフェンシン3a(NP3a):GICACRRRFCPNSERFSGYCRVNGARYVRCCSRR(配列番号11);α−デフェンシン3b(NP3b):GRCVCRKQLLCSYRERRIGDCKIRGVRFPFCCPR(配列番号12);α−デフェンシン4(NP4):VSCTCRRFSCGFGERASGSCTVNGVRHTLCCRR(配列番号13);α−デフェンシン5(NP5):VFCTCRGFLCGSGERASGSCTINGVRHTLCCRR(配列番号14);α−デフェンシン6(NP6):GICACRRRFCLNFEQFSGYCRVNGARYVRCCSRR(配列番号15)。
本明細書で用いる「ラットα−デフェンシン」と言う用語は、以下のアミノ酸配列の1つを有するポリペプチド、その対立遺伝子改変体、およびそのプレプロタンパク質を言う。ラットα−デフェンシンの配列は以下の通りである;α−デフェンシン1(RtNP1):VTCYCRRTRCGFRERLSGACGYRGRIYRLCCR(配列番号16);α−デフェンシン2(RtNP2):VTCYCRSTRCGFRERLSGACGYRGRIYRLCCR(配列番号17);α−デフェンシン3(RtNP3):CSCRTSSCRFGERLSGACRLNGRIYRLCC(配列番号18);α−デフェンシン4(RtNP4):ACYCRIGACVSGERLTGACGLNGRIYRLCCR(配列番号19)。
本明細書で用いる“マウスα−デフェンシン”と言う用語は、以下のアミノ酸配列の1つを有するポリペプチド、その対立遺伝子改変体、およびそのプレプロタンパク質を言う。マウスα−デフェンシンの配列は以下の通りである;α−デフェンシン1(MuCr1):LRDLVCYCRTRGCKRRERMNGTCRKGHLMYTLCCR(配列番号20);α−デフェンシン2(MuCr2):LRDLVCYCRARGCKGRERMNGTCRKGHLLYMLCCR(配列番号21);およびα−デフェンシン1α(MuCr1α):LRDLVCYCRKRGCKRRERMNGTCRKGHLMYTLCCR(配列番号22)。
本明細書で用いるβ−デフェンシンと言う用語は、本明細書に記載のウイルス阻害アッセイ等のHIVウイルス阻害アッセイを用いて測定された抗HIV活性を有することが特徴であるポリペプチドを言う。β−デフェンシンは一般に長さが100個のアミノ酸より短く、通常は長さが32〜45個のアミノ酸であり、保存されたシステインモチーフと正電荷が特徴である(保存されたモチーフは配列番号23と24で明らかである)。β−デフェンシンはその特有のアミノ酸パターン、システイン間隔およびジスルフィド連結でα−デフェンシンと異なる(Kaiserら、J.of Leukocyte Biology、68:779−784(2000))。α−デフェンシンと同様、システインはオリゴペプチド全体に分散し、その結果、システインは、分子間または分子内で、共有結合または非共有結合により広範囲の架橋の機会が与えられる。“β−デフェンシン”と言う用語は天然起原のβ−デフェンシン、すなわち天然起原から単離されたポリペプチド;合成β−デフェンシン、すなわち化学的に合成されたか組換えDNA技術で製造され、天然β−デフェンシンのアミノ酸配列を有するポリペプチド;およびβ−デフェンシンアナログ、即ちβ−デフェンシンの生物学的活性を有し、天然起原でないアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。この用語はまた、細胞内で生物学的活性型にプロセシングされるβ−デフェンシンのプレプロタンパク質形態も包含する。
β−デフェンシンはヒト、ウシ、ヒツジ、マウス、ブタ、鳥類、昆虫および植物、特にウシ気管粘膜、ウシ好中球、ウシの舌、ヒト好中球、膣および腎臓組織、および皮膚、腎臓および気管支被膜等の上皮細胞に見出されている(Diamondら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:4596−4600;Selstedら、J.Biol.Chem.、268:6641−6648;Singhら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95:14961−14966;Beneshら、FEBS Lett.、368:331−335;Schonwetterら、Science、3:267 1645−1648;およびLehrerら、Annals.New York Academy of Science、228−239)。
ある実施形態では、上記のβ−デフェンシンには、本明細書中に記載されるようなβ−デフェンシン核酸でコードされたアミノ酸配列、例えばヒトβ−デフェンシン1または−2に対し約60%、65%、70%、75%、80%、85%または90%、好ましくは91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%以上のアミノ酸配列同一性を、好ましくは少なくとも約15、20、25または30以上のアミノ酸の領域にわたって有する、ポリペプチド、プレプロタンパク質、処理タンパク質、多型改変体、対立遺伝子、挿入ホモログおよび突然変異体が含まれる。
本明細書で用いる「ヒトβ−デフェンシン」と言う用語は、以下のアミノ酸配列、その対立遺伝子改変体、およびそのプレプロタンパク質の一つを有するポリペプチドを言う。ヒトβ−デフェンシン1および−2の配列は以下の通りである:β−デフェンシン1(hBD−1):DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCC(配列番号23)、およびβ−デフェンシン2(hBD−2):TCLKSGAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCC(配列番号24)。β−デフェンシン配列はPCT公開番号WO02/22686およびKaiserら、Journal of Leukocyte Biology、68:779−784(2000)に記載されている。
本発明のデフェンシンは(1)抗体、例えばデフェンシンタンパク質のアミノ酸配列を含む免疫原およびその保存的に修飾された改変体に対し惹起されたポリクローナル抗体へ結合する;(2)デフェンシンタンパク質をコードする核酸、およびその保存的に修飾された改変体に対応するアンチセンス鎖に対しストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイゼーションする;または(3)デフェンシン核酸に対し約95%以上、好ましくは約96%、97%、98%、99%以上のヌクレオチド配列同一性を、好ましくは少なくとも約25、50、100、200、500、1000以上のヌクレオチドにわたって有する核酸配列を有する能力でさらに特徴付けられる。上記の様に、デフェンシンポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は代表的には哺乳動物、例えばヒト、齧歯類、例えばラット、マウスおよびハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジその他任意の哺乳動物由来であるがこれらに限定されない。例示された実施形態では、デフェンシンはヒト由来である。好ましい実施形態では、デフェンシンはヒトα−デフェンシン1、−2または−3である。本発明の核酸およびタンパク質には天然起原および組換え分子の両方が含まれる。本発明のデフェンシンタンパク質は抗ウイルス活性を有する。抗ウイルス分析は当業者に公知の方法および本明細書に記載の方法に従って行うことができる。
インビボでデフェンシンは前駆体として生成し、プロペプチドからプロセスされて、代表的にはジスルフィド架橋により成熟ペプチドを生じる。デフェンシンプレプロペプチドはGenBank寄託番号NP_525128、AAH27917、CAC85520、CAC85511、AAG02237、CAC03097、AAF73853、NP_066290、NP_005208、NP_001917、NP_001916、NP_004075、CAB65126、AAG22030、AAC69554、AAC51728、AAC50382、AAC33549、AAB59357、AAB49758、AAA52303、AAA35754、およびAAM62424に公表されている。プレプロペプチドは以下の文献に記載の様に続いて成熟デフェンシンにプロセスされる:Garciaら、Cell Tissue Res.、306(2):257−264(2001);Harderら、J.Biol.Chem.、276(8):5707−5713(2001);Jiaら、Gene、263(1−2):211−218(2001);Am.J.Pathol.、152(5):1247−1258(1998);Daherら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85(19):7327−7331(1988);Mallowら、J.Biol.Chem.、271(8):4038−4045(1966);Wildeら、J.Biol.Chem.、264(19):11200−11203(1989);Gabayら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86(14):5610−5614(1989);Palfreeら、Mol.Endocrinol.、7(2):199―205(1993);Selstedら、J.Clin.Invest.、76(4):1436−1439(1985);Marsら、Blood、71(6):1713−1719(1988);Daherら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85(19):7327−7331(1988);Sparkesら、Genomics、5(2):240−244(1989);Betemanら、Biol.Chem.、266(12):7524−7530(1991);Wagnerら、Genomics、10(1):114−125(1991);Valoreら、Blood、79(6):1538−1544(1992);Leherら、Annu.Rev.Immunol.、11:105−128(1993);Linzmeierら、FEBS Lett.、321(2−3):267−273(1993);Harderら、Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.、22(6):714−721(2000);Infect.Immunol.、68(1):113−119(2000);Genomics、43(3):316−320(1997);Mallowら、J.Biol.Chem.、271(8):4038−4045(1996);FEBS Lett.、315(2):187−192(1993);MacCrayら、Am.J.Respir.Cell Molec.Biol.、16:343−349(1997);Blood、71(6):1713−1719(1988);Jonesら、Biol.Chem.、267(32):23216−23225(1992);Rajら、FEMS Microbiology Leters、206:9−18(2002);Schutteら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、2129−2133(2002);Hooverら、J.Biol.Chem.、276(42):39021−39026;およびGanzら、Eur.J.Haematol.、44(1):1−8。
機能的にはデフェンシンは様々な微生物に対し抗菌性および抗真菌性を示すことが知られている(Rajら、FEMS Microbiolgy Letters、206:9−18(2002))。正に荷電したデフェンシンは、グラム陰性細菌中のリポ多糖、グラム陽性細菌中の多糖、およびリン脂質を含む微生物膜の負に荷電した成分と相互作用する。デフェンシンは細菌および真菌に対する宿主防衛に関与する細胞食性白血球により分泌されることが知られている。α−デフェンシンは高度に保存されるが、少量の改変体でも様々なデフェンシンの殺微生物性と特異性を十分に変化させる(Mandalら、J.Pept.Res.、59(3):95−104(2002);Schibliら、J.Biol.Chem.、277(10):8279−89(2002);Garciaら、Cell Tissue Res.、306(2):257−64;Fellermannら、Eur.J.Gastroentero Hepatol.、13(7):771−776;Kaganら、Toxicology、87(1−3):131−149(1994))。
様々な研究から、デフェンシンが感染と戦い、免疫反応を刺激する役割を果たすることが示唆されている。例えば、デフェンシン、特にβ−デフェンシン1および−2が1次免疫反応および記憶免疫反応の開始に含まれる未成熟樹脂状細胞と記憶T細胞の両方にに付着することが示されている(Ganzら、Science、286:420−421(1991);Lillardら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、96:651−656(1999))。本発明により、デフェンシンがHIVに対する抗ウイルス剤として作用し、HIV感染と共に他のウイルス感染の治療および/または予防に使用し得ることが現在発見されている。
本明細書で説明した様に、天然起原、化学合成、市販および組換えデフェンシンポリペプチドを本発明の組成物および方法に使用することができる。
公知の天然デフェンシンポリペプチドが本出願に記載されている。本発明の方法に有用な別な天然デフェンシンポリペプチドも、本明細書に記載の種または他の種から将来同定し得るものと考えられる。
2.天然起原からの単離
天然起原デフェンシンを好中球、多核白血球、PBMCまたは他の食細胞等のヒト組織由来、および上皮組織および他のデフェンシン発現組織由来の任意のデフェンシン源、例えば骨髄、気管、および腸細胞(例えばvan Weteringら、Am.J.Physiol.、272:L888(1997);Chertovら、J.Biol.Chem.271:2935−2940(1996);およびRajらBiochem J.、347:633−641(2000)参照)、および他の哺乳動物、例えばラットおよびモルモットのデフェンシン発現組織から精製することができる。例示実施形態では、天然起原デフェンシンは好中球およびマクロファージ骨髄細胞から精製される。この様な精製法には大量精製、例えば血液銀行または急性骨髄性白血病患者由来の送風排気口アプハレーシス等の医療廃棄物から得られる全血液由来の好中球からの単離、および正に荷電したペプチドに対する公知のペプチド精製法を用いる精製が含まれる。例えば、ポリペプチドを逆相HPLC、ゲル濾過、イオン交換、例えば陰イオン交換、サイズ排除、親和性、分配または交流分配等のクロマトグラフィー法で精製し得る。デフェンシンの精製法は上記のRajら、およびGanzら、J.Clin.Invest.、76:1427−1435(1985)に記載されている。
天然起原デフェンシンを好中球、多核白血球、PBMCまたは他の食細胞等のヒト組織由来、および上皮組織および他のデフェンシン発現組織由来の任意のデフェンシン源、例えば骨髄、気管、および腸細胞(例えばvan Weteringら、Am.J.Physiol.、272:L888(1997);Chertovら、J.Biol.Chem.271:2935−2940(1996);およびRajらBiochem J.、347:633−641(2000)参照)、および他の哺乳動物、例えばラットおよびモルモットのデフェンシン発現組織から精製することができる。例示実施形態では、天然起原デフェンシンは好中球およびマクロファージ骨髄細胞から精製される。この様な精製法には大量精製、例えば血液銀行または急性骨髄性白血病患者由来の送風排気口アプハレーシス等の医療廃棄物から得られる全血液由来の好中球からの単離、および正に荷電したペプチドに対する公知のペプチド精製法を用いる精製が含まれる。例えば、ポリペプチドを逆相HPLC、ゲル濾過、イオン交換、例えば陰イオン交換、サイズ排除、親和性、分配または交流分配等のクロマトグラフィー法で精製し得る。デフェンシンの精製法は上記のRajら、およびGanzら、J.Clin.Invest.、76:1427−1435(1985)に記載されている。
デフェンシンはデフェンシン生産細胞を培養し、本発明に記載の方法を用いてデフェンシン分子を単離するための公知の細胞培養技術を用いて得ることもできる。適当なデフェンシン生産細胞株にはCD8+Tリンパ球、ヒトα−デフェンシン1〜3のための好中球および骨髄細胞株、ヒトα−デフェンシン−5、6のための小腸細胞株、およびヒトβ−デフェンシン1、−2のための上皮細胞株が含まれるが、それに限定されない。一般的な細胞培養技術についてはFreshneyら、「Culture of Animal Cells」、第3版、1994年参照。
デフェンシン分子はPeptide International、American PeptidesおよびNJ Research、Inc.等の市販の原料から得ることもできる。
本発明の一部は組換え遺伝学の分野で用いられる通常の技術に依存している。本発明で使用するに適した一般的な組換え法を記載する基礎的なテキストにはSambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版、1989年;Krieglerら、Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990);およびAusubelら編集、Current Protocol in Molecular Biology(1994)が含まれるが、それに限定されない。
本明細書に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のデフェンシン核酸、多型改変体、オーソログおよび対立遺伝子を、デフェンシン核酸プローブおよびオリゴヌクレオチドを用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングして単離することができる。または、抗血清またはヒトデフェンシンまたはその一部に対して作成された精製抗体で発現したホモログを免疫学的に検出することにより、デフェンシンタンパク質、プレプロタンパク質、多型改変体、オーソログおよび対立遺伝子をクローニングするために発現ライブラリーを使用することもできる。
cDNAライブラリーを作成するため、デフェンシンRNAが豊富な起原、例えばPBMC、多核白血球、好中球、リンパ芽球細胞株、および他の食細胞を選ぶ必要がある。細胞は1次細胞または細胞株であり得る。次に逆転写酵素を用いてmRNAをcDNAとし、組換えベクターにライゲートし、増殖、スクリーニングおよびクローニングのために組換え宿主中にトランスフェクトさせる。cDNAライブラリーを作成しスクリーニングする方法は周知である(例えばGublerら、Gene、25:263−269(1983);Sambrookら、前出;Ausubelら、前出参照)。
遺伝子ライブラリーを作成するため、DNAを組織から抽出し、機械的にせん断するか酵素的に消化して約12〜20kbの断片を得る。断片を濃度勾配遠心分離で選択し、バクテリオファージλベクターを構築する。これらのベクターとファージをインビトロで組み合わせる。組換えファージを、BentonおよびDavis、Science、196:180−182(1977)に記載される様にプラークハイブリダイゼーションで分析する。コロニーハイブリダイゼーションはGrunsteinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、72:3961−3965(1975)に一般的に記載されている様に行われる。
デフェンシン核酸、オーソログ、対立遺伝子、変異体、多型改変体および保存的修飾改変体を単離する別な方法は、合成オリゴヌクレオチドプライマーとRNAまたはDNA鋳型の増幅と組み合わされる(米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号;PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications、Innisら編、1990年参照)。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびリガーゼ連鎖反応(LCR)等の方法を、mRNA、cDNA、ゲノムライブラリー、またはcDNAライブラリーからヒトデフェンシンの核酸配列を直接増幅するために用いることができる。縮重オリゴヌクレオチドを、本明細書に記載の配列を用いて、デフェンシンホモログを増幅するために設計することができる。制限エンドヌクレアーゼ部位をプライマー中に取り込ませることができる。ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増幅法も、例えば発現されるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングし、生理的試料中のデフェンシンをコードするmRNAの存在の検出、核酸配列決定、またはその他の目的のためのプローブとして使用するための核酸を作成するために有用である。PCR反応により増幅された遺伝子をアガロースゲルから精製し、適当なベクター中へクローニングすることができる。
デフェンシンポリペプチドのための遺伝子を、複製および/または発現のために原核細胞または真核細胞中へ形質転換する前に、代表的には、中間ベクター中にクローニングしてもよい。これらの中間ベクターは代表的にはプラスミドまたはシャトルベクター等の原核ベクターである。または、天然のデフェンシン遺伝子を活性化するために相同組換えを用いることもできる。
3.デフェンシンポリペプチドの化学合成および精製
本発明のデフェンシンポリペプチドは比較的長さの短い鎖であるので、溶液法および固相法の双方を含む当業者に周知のいくつかの化学的ペプチド合成技術の何れかを用いて調製することができるが、ここでは固相法合成が好ましい。デフェンシンポリペプチドを化学的に合成するための適当なアプローチはRajら、Biochem.J.、347:633−641(2000)に開示され、その教示は本明細書に採用され援用される。
本発明のデフェンシンポリペプチドは比較的長さの短い鎖であるので、溶液法および固相法の双方を含む当業者に周知のいくつかの化学的ペプチド合成技術の何れかを用いて調製することができるが、ここでは固相法合成が好ましい。デフェンシンポリペプチドを化学的に合成するための適当なアプローチはRajら、Biochem.J.、347:633−641(2000)に開示され、その教示は本明細書に採用され援用される。
具体的には、ペプチド配列のC−末端アミノ酸が不溶性支持体に結合し、配列中の残りのアミノ酸を順番に付加する固相合成が、本発明のデフェンシンポリペプチドを調製するための好ましい方法である。固相合成の技術はBaranyおよびMerrifield、Solid−Phase Peptide Synthesis in The Peptide:Analysis、Synthesis、Biology(GrossおよびMeienhofer編集、Academic Press、N.Y.、第2巻、3−328頁、1980年);Merrifieldら、J.Am.Chem.Soc.、85:2149−2156(1963);およびStewartら、Solid Phase Peptide Synthesis、第2版、Piere Chem.Co.、Rockford、Ill.、1984年に記載されている。
固相合成はペプチドのカルボキシル末端(すなわち、C−末端)から出発し、保護されたアミノ酸をそのカルボキシル基を経て適当な固体支持体に結合する。使用される固体支持体は、それがカルボキシル基と結合可能で、ペプチド合成工程で使用される試薬に対し実質的に不活性である限り、本発明の重要な特徴ではない。例えば、アミノ基保護アミノ酸をベンジルエステル結合によりクロロメチル化樹脂またはヒドロキシメチル化樹脂に付加して、またはアミド結合によりにベンズヒドリルアミン(BHA)樹脂またはp−メチルベンズヒドリスアミン(MBHA)樹脂に付加して出発材料を調製することができる。固体支持体として使用するに適した材料は当業者に公知であり、クロロメチル樹脂またはブロモメチル樹脂等のハロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、4−(α−[2,4−ジメトキシフェニル]−Fmoc−アミノメチル)フェノキシ樹脂等のフェノール樹脂、tert−アルキルオキシカルボニル−ヒドラジン化樹脂等を含むが、それに限定されない。これらの樹脂は市販されており、その調製法は当業者に公知である。
本発明のペプチドの酸型を、ベンジルエステル樹脂を固体支持体として用いる固相ペプチド合成法で調製することができる。対応するアミドをベンズヒドリスアミンまたはメチルベンズヒドリル樹脂を固体支持体として用いて製造することができる。BHAまたはMBHA樹脂を用いた場合、無水弗化水素酸で処理してポリペプチドを固体支持体から切り離すことにより、末端アミド基を有するポリペプチドが生産されることを、当業者は理解し得ると考えられる。
反応性α−アミノ酸官能基が関与する副反応を阻止するため、合成に用いられる各アミノ酸のα−アミノ基をカップリング反応中に保護する必要がある。特定のアミノ酸には反応性側鎖官能基(例えばスルフヒドリル、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル等)を含むものもあり、それらはポリペプチドの合成の間、これらの位置で化学反応を生じるのを防止するため、適当な保護基で保護する必要がある。保護基は当業者に周知である。例えば、The Peptide:Analysis、Synthesis、Biology、第3巻、Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis(GrossおよびMeienhofer編集、Academic Press、N.Y.、1981年参照)。
アニソールおよびジメチルスルフィドの存在下、約0°Cで約20〜90分間、好ましくは60分間、無水液体弗化水素(HF)中で不溶性担体または固体支持体を攪拌して;選択した保護基によってはトリフルオロ酢酸(TFA)中の1mg/10mLの樹脂懸濁液中に室温付近で60〜360分間、臭化水素(HBr)を連続的にバブリングして;または固相合成に用いた反応カラム内の固体支持体を90%のトリフルオロ酢酸、5%の水および5%のトリエチルシランと約30〜60分間インキュベーションして、ペプチドを切断し保護基を除去することができる。当業者に周知のその他の脱保護法も使用することができる。
公知の天然起原α−デフェンシンには6個のシステイン残基がある。システイン残基が形成するジスルフィド結合は第1および第6システイン、第2および/または第4システインおよび第3および第5システインの間であり、システインはペプチドのN−末端からC−末端へ1から6の番号が付けられる。さらに、公知のβ−デフェンシンのほとんどには6個のシステイン残基がある。β−デフェンシンのジスルフィド結合は第1および第5システイン、第2および第4システインならびに第3および第6システインの間であり、システインはペプチドのN−末端からC−末端へ1から6の番号が付けられる。
デフェンシン分子内に存在するシステイン残基間のジスルフィド結合の形成は、公知の方法を用いて行われる。例えばRajら(前出)によると、必要のない副反応を最少にするため、3つの異なったチオール保護基があり、ジスルフィド結合を形成するために3段階の工程が用いられる。結合形成のために適切な配向を与えるため、ジスルフィド架橋がNおよびC末端システイン間で最初に形成される(Hillら、Science、25:1481−1485;およびPardiら、Biochemistry、31:11357−11364参照)。他の方法では、6個のチオール基の同時酸化、またはジスルフィド結合形成のための2段階工程が行われる(Khan、Methods Emzymol.、61:339−378;およびLauthら、Insect Biochem.Mol.Biol.、28:1959−1066参照)。
陽イオン性ポリペプチド、すなわち本発明のデフェンシンポリペプチドを反応混合物から、当業者に周知のペプチド精製法、例えば上記の精製法を用いて単離精製することができる。
本発明の組成物と方法に用いられるデフェンシンポリペプチドに対していくつかの修飾(付加、欠失または置換)を加え得ることは、当業者に自明であると思われる。例えば、活性を増加させるために別なアミノ酸をデフェンシンポリペプチドのN−末端および/またはC−末端に付加することが見出されている(Rajら、Biochem.J.、347:633−641(2000)参照)。さらに、デフェンシンポリペプチドを修飾してプロテアーゼ切断部位(例えばトリプシンおよびキモトリプシン切断部位)を除去することができる(例えばSelstedら、J.Clin.Invest.、76:1436−1439(1985)参照)。代表的には、これはプロテアーゼが認識するアミノ酸(例えばアルギニン)を類似のアミノ酸(プロテアーゼによって認識されない)で置換することで行われる。この様な修飾(付加、欠失または置換)は、この様な修飾デフェンシンポリペプチドを本発明の組成物および方法に使用し得る点で本発明の範囲内である。
公知の天然起原デフェンシンポリペプチドとは1個以上の異なったアミノ酸を有する活性デフェンシンポリペプチドを生成するために、公知の修飾法を使用し得ることも当業者に自明であると思われる。そのデフェンシン活性を、本明細書に記載の分析法の一つを用いて分析することができる。抗HIV活性を有するデフェンシンポリペプチドを本発明の方法と組成物に使用することができる。修飾法の例には部位指向突然変誘発、ポイント不整合修復またはオリゴヌクレオチド指向突然変異誘発が含まれる。
部位指向性突然変異誘発は周知であり、以下に文献に記載されている:Lingら、Anal.Biochem.、254(2):157−178(1997);Daleら、Methods.Mol.Biol.、57:369−374(1996);Smith、Ann.Rev.Genet.、19:423−462(1985);Botsteinら、Science、229:1193−1201(1985);Carter、Biochem.J.、237:1−7(1986);およびKunkel、Nucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein、FおよびLilley、D.M.J編集、Springer Verlag、Berlin(1987));ウラシル含有テンプレートを用いる突然変異誘発(Kunkel、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82:488−492(1985);Kunkelら、Methods in Enzymol.、154:367−382(1987);およびBassら、Science、242:240−245(1988));オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発(Mehtod in Enzymol.、100:468−500(1983);Mehtod in Enzymol.、154:329−350(1987);Zollerら、Nucleic Acid Res.、10:6487−6500;Zollerら、Mehtod in Enzymol.、100:468−500;およびZollerら、Mehtod in Enzymol.、154:329−350);ホスホロチオエート修飾DNA突然変異誘発(Taylorら、Nucl.Acid Res.、13:8749−8764(1985);Taylorら、Nucl.Acid Res.、13:8765−8787(1985);Nakayamaら、Nucl.Acid Res.、14:9679−9698(1986);Sayersら、Nucl.Acid Res.、16:791−802(1988);およびSayersら、Nucl.Acid Res.、16:803−814(1988));ギャップ付き二重螺旋DNAを用いる突然変異誘発(Kramerら、Nuc.Acid Res.、12:9441−9456(1984);Kramerら、Methods in Enzymol.、154:350−367(1987);Kramerら、Nucl.Acid Res.、16:7207(1988);およびFritzら、Nucl.Acid Res.、16:6987−6999(1988))。
当該分野で周知なさらなる修飾法はポイント不整合修復(Kramerら、Cell、38:879−887(1984))、修復欠失宿主株を使用する変異誘発(Carterら、Nucl.Acid Res.、13:4431−4443(1985);およびCarter、Method.in Enzymol.、154:382−403(1987)、欠失突然変異誘発(Eghtedarzadehら、Nucl.Acid Res.、14:5115(1986))、制限選択および制限選択/制限精製(Wellsら、Phil.Trans.R.Soc.Lond.、A317:415−423(1986))、全遺伝子合成による突然変異誘発(Nambiarら、Science、223:1299−1301(1984);Sakamarら、Nucl.Acid Res.、14:6361−6372(1988);Wellsら、Gene、34:315−323(1985);およびGrundstromら、Nucl.Acid Res.、13:3305−3316(1985))、二重鎖破壊修復(Mandecki(1986);Arnold、Current Opinion in Biotechnology、4:450−455(1993)、“Oligonucleotide−directed double−strand break repair in plasmid of Escherichia coli:a method for site−specific mutagenesis”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、83:7177−7181)。上記の方法の多くの更に詳しい詳細はMethods in Enzymology、154巻に見られ、様々な突然変異誘発による不具合対策の有用な制御法が記載されている。
オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発を、関心のある核酸配列中に部位特異性突然変異を誘導するために使用することができる。この様な技術の例は上記の参考文献、および例えばReidhaar−Olsonら、Science、241:53−57(1988)に記載されている。同様に、カセット突然変異誘発を、二重鎖DNA分子の小さな領域を天然配列とは異なる合成オリゴヌクレオチドカセットで置換する方法に使用できる。オリゴヌクレオチドは例えば完全に、および/または部分的に無秩序化した天然配列を含み得る。
4.組換えデフェンシンの精製
組換えデフェンシンを以下の記載の様に任意の適当な発現系で精製することができる。デフェンシンタンパク質を硫酸アンモニウム等の物質による選択沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法その他を含む標準技術で相当な純度に精製可能である(例えばScopes、Protein Purification:Principles and Practice(1982);米国特許第4,673,641号;Ausubelら、前出;Sambrookら、前出)。
組換えデフェンシンを以下の記載の様に任意の適当な発現系で精製することができる。デフェンシンタンパク質を硫酸アンモニウム等の物質による選択沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法その他を含む標準技術で相当な純度に精製可能である(例えばScopes、Protein Purification:Principles and Practice(1982);米国特許第4,673,641号;Ausubelら、前出;Sambrookら、前出)。
組換えデフェンシンタンパク質を精製する場合、いくつかの方法を用いることができる。例えば、確立された分子付着性を有するタンパク質をデフェンシンタンパク質へ可逆的に融合することができる。適当なリガンドまたは基質、例えば抗デフェンシン抗体または負に荷電した基質を用いて、デフェンシンタンパク質を精製カラムに選択的に吸着させ、次いで比較的純粋な形でカラムから遊離することができる。次いで、融合タンパク質が酵素活性によって除去される。最後に、デフェンシンタンパク質を免疫親和性カラムを用いて精製できる。組換えデフェンシンタンパク質を、酵母、昆虫、細菌および哺乳動物細胞等の任意の適当な起原から精製できる。
組換えタンパク質を形質転換細菌で、代表的にはプロモーター誘導後に大量に発現することができるが、発現は構成的であり得る。IPTGによるプロモーター誘導は誘導可能なプロモーター系の1例である。細菌は当業者の標準法で生育することができる。タンパク質の単離には新鮮な、または凍結細菌細胞が用いられる。
細菌中で発現したタンパク質は不溶性凝集体(封入体)を形成することもある。いくつかのプロトコールがデフェンシンタンパク質封入体の精製に適している。例えば、封入体の精製の代表例には細菌細胞の破壊による封入体の抽出、分離および/または精製、例えば50mM トリス塩酸塩緩衝液(pH7.5)、50mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、0.1mM ATP、および1mM PMSF中でのインキュベーションがある。細胞懸濁物をフレンチプレスを2〜3回通して溶菌し、Polytron(Brinkman Instruments製)を用いて、または氷上で超音波処理均一化することができる。細菌溶菌の別な方法は当業者に自明である(例えばSambrookら、前出;Ausubelら、前出)。
必要あれば封入体を可溶化し、溶菌細胞懸濁物を遠心分離して不必要な不溶物を除去する。封入体を形成するタンパク質は適合し得る緩衝液で希釈または透析して復元し得る。適した溶剤には尿素(約4M〜約8M)、ホルムアミド(少なくとも80%、容積/容積)およびグアニジン塩酸塩(約4M〜約8M)が含まれるが、それに限定されない。凝集体形成タンパク質を可溶化し得るいくつかの溶剤、例えばSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)および70%蟻酸は、免疫原性および/または活性の欠損を伴うタンパク質の非可逆的変性の可能性があるため、この方法には不適当である。グアニジン塩酸塩および類似の試薬は変性剤であるが、この変性は不可逆的であり、変性剤を除去(例えば透析により)または希釈するとタンパク質が復元され、免疫的および/または生物的に活性なタンパク質を再生することができる。その他の適した緩衝液は当業者に公知である。ヒトデフェンシンタンパク質が標準分離技術、例えばNi−NTAアガロース樹脂により他の細菌タンパク質から分離される。
また、デフェンシンタンパク質を細菌周辺質から精製することも可能である。デフェンシンタンパク質が細菌の周辺質中に移行している場合、細菌の溶菌後に細菌の周辺質分画を当業者に公知の他の方法に加えて冷浸透圧ショックで単離することができる。周辺質から組換えタンパク質を単離するために、細菌細胞を遠心分離して錠剤にする。その錠剤を20%スクロースを含む緩衝液中に再懸濁する。細胞を溶解するため、細菌を遠心分離し、錠剤を氷冷5mM MgSO4中に再懸濁し、氷浴中に約10分間保つ。細胞懸濁物を遠心分離し、上澄を傾斜分離し保存する。上澄中に存在する組換えタンパク質を当業者に周知の標準分離技術で宿主タンパク質から分離することができる。
5.組換えデフェンシンタンパク質を精製するための標準タンパク質分離技術
a)溶解度分画
最初の工程として、特にデフェンシンタンパク質混合物が複雑である場合、最初の塩分画により不要な宿主細胞タンパク質(または細胞培養培地由来のタンパク質)の多くを関心のある組換えタンパク質から分離できることが多い。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムはタンパク質混合物中の水の量を効果的に減少させてタンパク質を沈殿させる。その結果、タンパク質はその溶解度に基づいて沈殿する。タンパク質が疎水性であるほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿し易い。代表的なプロトコールでは、タンパク質溶液に飽和硫酸アンモニウムを添加し、得られた硫酸アンモニウム濃度を20〜30%とする。この濃度は疎水性タンパク質がほとんど沈殿すると考えられる。(関心のあるタンパク質が疎水性でなければ)沈殿を廃棄し、関心のあるタンパク質が沈殿することが知られている濃度になる様に硫酸アンモニウムを上澄に加える。沈殿を緩衝液中に溶解し、必要あれば過剰の塩を透析またはダイアフィルトレーションで除去する。冷エタノール沈殿等のタンパク質の溶解度に依存する他の方法も周知であり、複雑なタンパク質混合物の分画に使用し得る。
a)溶解度分画
最初の工程として、特にデフェンシンタンパク質混合物が複雑である場合、最初の塩分画により不要な宿主細胞タンパク質(または細胞培養培地由来のタンパク質)の多くを関心のある組換えタンパク質から分離できることが多い。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムはタンパク質混合物中の水の量を効果的に減少させてタンパク質を沈殿させる。その結果、タンパク質はその溶解度に基づいて沈殿する。タンパク質が疎水性であるほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿し易い。代表的なプロトコールでは、タンパク質溶液に飽和硫酸アンモニウムを添加し、得られた硫酸アンモニウム濃度を20〜30%とする。この濃度は疎水性タンパク質がほとんど沈殿すると考えられる。(関心のあるタンパク質が疎水性でなければ)沈殿を廃棄し、関心のあるタンパク質が沈殿することが知られている濃度になる様に硫酸アンモニウムを上澄に加える。沈殿を緩衝液中に溶解し、必要あれば過剰の塩を透析またはダイアフィルトレーションで除去する。冷エタノール沈殿等のタンパク質の溶解度に依存する他の方法も周知であり、複雑なタンパク質混合物の分画に使用し得る。
b)サイズ差濾過
ポアサイズの異なった膜(例えばアミコンまたはミリポア膜)を通す限外濾過を用いてデフェンシンタンパク質をより大きい、またはより小さいサイズのタンパク質から分離するため、デフェンシンタンパク質の分子量を利用できる。最初の工程で、関心のあるタンパク質の分子量より低い分子量カットオフのポアサイズを有する膜を用いてタンパク質混合物を限外濾過する。次に限外濾過で保持されたタンパク質を、関心のあるタンパク質の分子量より大きい分子量カットオフの膜で限外濾過する。組換えデフェンシンタンパク質は膜を通って濾液中に移行する。濾液を以下に記す様にクロマトグラフィーに供することができる。
ポアサイズの異なった膜(例えばアミコンまたはミリポア膜)を通す限外濾過を用いてデフェンシンタンパク質をより大きい、またはより小さいサイズのタンパク質から分離するため、デフェンシンタンパク質の分子量を利用できる。最初の工程で、関心のあるタンパク質の分子量より低い分子量カットオフのポアサイズを有する膜を用いてタンパク質混合物を限外濾過する。次に限外濾過で保持されたタンパク質を、関心のあるタンパク質の分子量より大きい分子量カットオフの膜で限外濾過する。組換えデフェンシンタンパク質は膜を通って濾液中に移行する。濾液を以下に記す様にクロマトグラフィーに供することができる。
c)カラムクロマトグラフィー
デフェンシンタンパク質を他のタンパク質から、サイズ、正味表面電荷、疎水性およびリガンドに対する親和性に基づいて分離することができる。さらに、デフェンシンタンパク質に対して誘導した抗体をカラムマトリックスに結合し、タンパク質を免疫的に精製することができる。これらの方法の全ては周知である。クロマトグラフィー技術は任意の規模で、多くの異なった製造業者の装置を用いて実行され得ることは、当業者に自明であると思われる(例えば、Pharmacia Biotech)。
デフェンシンタンパク質を他のタンパク質から、サイズ、正味表面電荷、疎水性およびリガンドに対する親和性に基づいて分離することができる。さらに、デフェンシンタンパク質に対して誘導した抗体をカラムマトリックスに結合し、タンパク質を免疫的に精製することができる。これらの方法の全ては周知である。クロマトグラフィー技術は任意の規模で、多くの異なった製造業者の装置を用いて実行され得ることは、当業者に自明であると思われる(例えば、Pharmacia Biotech)。
D.HIV、およびウイルス感染および複製の阻害法−「HIV感染およびAIDSの治療」
本明細書に記載の様に、デフェンシンタンパク質、デフェンシンタンパク質をコードする核酸、およびデフェンシンの活性または発現を増加させる低分子量有機分子またはその断片を、例えばHIV感染細胞を殺す、またはHIV複製を阻害することによりHIV阻害に使用することができる。デフェンシンは、ヒトにおいて治療的または予防的に使用され得る。例えば、デフェンシンを感染CD4+細胞によるHIV生産を阻害するために使用し得る。デフェンシンタンパク質、デフェンシンタンパク質をコードする核酸、および低分子量有機分子をHIV感染者でAIDSへの進行を止めるためにも使用できる。また、デフェンシンタンパク質、デフェンシンタンパク質をコードする核酸、および低分子量有機分子を予防的に、例えばHIVに晒した後または晒されたことが疑われる場合に、感染の阻止する、感染細胞を殺す、または伝播、例えばウイルスの母体から胎児への伝播を防止するために使用することができる。
本明細書に記載の様に、デフェンシンタンパク質、デフェンシンタンパク質をコードする核酸、およびデフェンシンの活性または発現を増加させる低分子量有機分子またはその断片を、例えばHIV感染細胞を殺す、またはHIV複製を阻害することによりHIV阻害に使用することができる。デフェンシンは、ヒトにおいて治療的または予防的に使用され得る。例えば、デフェンシンを感染CD4+細胞によるHIV生産を阻害するために使用し得る。デフェンシンタンパク質、デフェンシンタンパク質をコードする核酸、および低分子量有機分子をHIV感染者でAIDSへの進行を止めるためにも使用できる。また、デフェンシンタンパク質、デフェンシンタンパク質をコードする核酸、および低分子量有機分子を予防的に、例えばHIVに晒した後または晒されたことが疑われる場合に、感染の阻止する、感染細胞を殺す、または伝播、例えばウイルスの母体から胎児への伝播を防止するために使用することができる。
核酸およびタンパク質を治療のために個体に送達する公知の方法を、患者におけるHIV感染を治療または予防するための本発明の方法に使用し得るが、その方法は細胞トランスフェクション、遺伝子治療、送達ビヒクルまたは薬学的に許容し得る担体による直接投与、内因性タンパク質の生産を増大する組換え細胞または調節配列を提供することによる間接送達である。例えば、上記に説明した様に、本発明はCD8+細胞が先に述べたCAF活性を担うと特定されたα−デフェンシンを生産することを最初に示すものである。従って、デフェンシンを生産する様に刺激されたCD8+細胞を患者に投与することによりヒトに送達することができる。ある方法では、CD8+細胞を、この様な細胞が増殖することが公知である任意の方法でエキソビボで増殖させる。次いで細胞培養物を試験して細胞がデフェンシンを生産しているかどうかを決定する。その後、適当な量のデフェンシンを生産する細胞を患者に導入する。細胞は治療する個人由来であるか、または他の個人由来である。しかしながら、細胞に対する免疫反応の誘発を避けるため、HLA適合細胞を投与することが好ましい。
HIV感染とAIDSへの進行を測定する標準分析法を、患者がデフェンシン治療に陽性反応しているかどうかを決めるために使用できる。例えば、デフェンシン投与後に患者のT細胞を追跡する。T細胞が増加すれば、患者がデフェンシン投与の恩恵を受けていることが示される。さらに、Levyら、Immunology Today17、5:223(1996)記載の「内因性分析」または「急性感染分析」を患者内のCD8+細胞の抗HIV反応の測定に使用し得る。例えば、急性感染分析では、未感染個人由来のCD4+細胞をHIVで急性感染させ、感染者由来のCD8+細胞と共に異なったCD8+/CD4+細胞比で培養する。ウイルス生産の減少で抗ウイルス効果を決定する。本発明の組換えCD8+細胞によるウイルス生産の減少度を、本発明の方法が患者内でウイルス生産を阻害するに有効である程度を決定するために使用し得る。
上記に説明した様に、デフェンシンポリペプチドが抗ウイルス活性を有することが現在示されている。このため、デフェンシンポリペプチドを多様なウイルスを阻害、従ってヒトにおける多様なウイルス感染を治療するために使用することができる。デフェンシンポリペプチドを用いて阻害し得るウイルスにはDNAウイルス、RNAウイルスの他、レトロウイルスも含まれるが、それに限定されない。デフェンシンポリペプチドを用いて阻害し得るウイルスの例にはヘルペスウイルス、肝炎(A、BおよびC)ウイルス、インフルエンザウイルス、POXウイルス、リノウイルスおよびHTLV(ヒトT細胞白血病)ウイルス(例えばHTLV1および2)が含まれるが、それに限定されない。その抗ウイルス活性に基づき、当業者はデフェンシンポリペプチドを用いて阻害し得る他のウイルスも意識し得ると思われる。
1.細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療
本発明はインビトロおよびインビボで細胞トランスフェクションに使用し得るデフェンシンタンパク質の核酸配列を提供する。これらの核酸をいくつかの周知の任意のベクター中へ挿入し、以下に記載する様に標的細胞および生物をトランスフェクトすることができる。ベクターと標的細胞の相互作用によりエキソビボまたはインビボで核酸を細胞内にトランスフェクトする。次いでプロモーターの制御下にある核酸が本発明のデフェンシンタンパク質を発現し、その結果デフェンシン遺伝子、特にウイルス、例えばHIV感染に関連する遺伝子の低活性化、不活性化または部分活性化、または異常発現が緩和される。この組成物を患者に治療反応を誘発するに十分な量で、(例えば筋肉注射で)患者に投与する。これを達成するために適当な量は、「治療上有効(投与)量」と定義される。
本発明はインビトロおよびインビボで細胞トランスフェクションに使用し得るデフェンシンタンパク質の核酸配列を提供する。これらの核酸をいくつかの周知の任意のベクター中へ挿入し、以下に記載する様に標的細胞および生物をトランスフェクトすることができる。ベクターと標的細胞の相互作用によりエキソビボまたはインビボで核酸を細胞内にトランスフェクトする。次いでプロモーターの制御下にある核酸が本発明のデフェンシンタンパク質を発現し、その結果デフェンシン遺伝子、特にウイルス、例えばHIV感染に関連する遺伝子の低活性化、不活性化または部分活性化、または異常発現が緩和される。この組成物を患者に治療反応を誘発するに十分な量で、(例えば筋肉注射で)患者に投与する。これを達成するために適当な量は、「治療上有効(投与)量」と定義される。
他の態様では、本発明はデフェンシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸で細胞をトランスフェクトすることを包含するヒトにおけるHIV阻害法であって、その核酸がデフェンシンをコードするヌクレオチド配列と作動可能に結合する誘導プロモーターを有する方法を提供する。ある実施形態では、真核ベクター由来のデフェンシンタンパク質の発現を誘導プロモーターを用いて調節し得る。これらの試薬に対する反応エレメントをプロモーター中に取り込ませることにより、発現レベルが誘導プロモーターによりテトラサイクリンまたはエクジソン等の誘導試薬の濃度で決定される。一般に誘導試薬が存在する場合のみ高レベルの発現が誘導性プロモーターから得られ、基本発現レベルは最少である。関心のあるタンパク質の発現が真核細胞に有害である場合、誘導発現ベクターを選択することが多い。他の制御構造、例えばエンハンサーをデフェンシンポリペプチドの発現を増加するために用いることができる。
この様な遺伝子治療法は後天性および遺伝性遺伝子不全、癌、およびいくつかの状況における他の疾患の治療に用いられてきた。ヒトにおける人工遺伝子発現能は、他の治療法では治療し難い多くの重要なヒトの疾患の予防および/または治療を促進する(遺伝子治療法のレビューについてはAnderson、Science、256:808−813(1992);Nabelら、TIBTECH、11:211−217(1993);Mitaniら、TIBTECH、11:162−166(1993);Mulligan、Science、926−932(1993);Dillon、TIBTECH、11:167−175(1993);Miller、Nature、357:455−460(1992);Van Brunt、Biotechnology、6(10):1149−1154(1998);Vigne、Restorative Neurology and Neuroscience、8:35−36(1995);Kremerら、British Medical Bulletin、51(1):31−44(1995);Haddadaら、Current Topics in Microbiology and Immunology(DoerflerおよびBohm編集、1995年);およびYuら、Gene Therapy、1:13−26(1994)参照)。
本発明の他の態様では、デフェンシン核酸がトランスフェクションで細胞内に導入されず、その代わりに外因性レギュレーター配列、例えばプロモーターまたはエンハンサー、またはコードまたは非コード外因性エクソン、およびスプライスドナー部位が、デフェンシン遺伝子による相同組換え用ゲノム中の予め選択した部位に導入される。これらの方法を用いて、外部から供給された発現配列がゲノムDNAと組換えを行い、これらのタンパク質をコードする天然起原内因性エクソンを用いてヒト細胞中でデフェンシンが製造される。この様な方法はTrecoらによる米国特許第5,733,746号に記載されている。
2.医薬組成物および投与
薬学的に許容し得る担体は、部分的には投与される具体的な組成物(例えば核酸、タンパク質、低分子量有機分子または導入細胞のような調節細胞)の他、その組成物を投与する具体的な方法で決定される。本発明はタンパク質、核酸、低分子量有機分子等を含む医薬組成物の送達を包含する。従って、本発明の医薬組成物には多様な適切な配合がある(例えばRemington’s Pharmaceutical Scinece、第17版、1989年参照)。投与は注射、経口投与、吸入、経皮投与または直腸投与等の任意の便利な方法でよい。
薬学的に許容し得る担体は、部分的には投与される具体的な組成物(例えば核酸、タンパク質、低分子量有機分子または導入細胞のような調節細胞)の他、その組成物を投与する具体的な方法で決定される。本発明はタンパク質、核酸、低分子量有機分子等を含む医薬組成物の送達を包含する。従って、本発明の医薬組成物には多様な適切な配合がある(例えばRemington’s Pharmaceutical Scinece、第17版、1989年参照)。投与は注射、経口投与、吸入、経皮投与または直腸投与等の任意の便利な方法でよい。
経口投与に適した配合は(a)水、食塩水またはPEG400等の希釈剤中に懸濁した有効量の核酸パッケージ等の溶液;(b)それぞれ所定量の液体、固体、顆粒またはゼラチン状の活性成分を含むカプセル、サッシェまたは錠剤;(c)適当な液体中の懸濁物;および(d)適当な乳化物で構成され得る。錠剤形にはラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、燐酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化珪素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸その他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、保存剤、風味剤、染料、砕解剤、および薬剤相溶性担体の1つ以上が含まれる。糖錠形にはスクロース等の風味剤の他、ゼラチンおよびグリセリン等の不活性基剤中の活性成分、およびアカシア乳化物等を含み、活性成分に加えて公知の担体を含む口内錠も含まれる。
選ばれた化合物は単独、または他の適当な成分と組み合わせて、吸入により投与されるエアゾル製剤(即ち「噴霧可能」)とすることができる。エアゾル製剤をジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧可能な推進薬に入れることができる。
非経口投与、例えば関節内(関節中)、静脈中、筋肉内、真皮内、腹腔内および皮下経路等非経口投与に適した製剤には水性および非水性の等張滅菌注射液が含まれ、それには抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および配合物を目的の許容者の血液と等張にする溶質、および懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁物を含むことができる。本発明を実施する場合、組成物を例えば静脈内注入、経口、局所、腹腔内、膀胱内または髄腔内で投与することができる。非経口投与および静脈内投与が好ましい投与法である。推奨される製剤を1回投与分または複数回投与分でアンプルまたはバイアル等の密封容器中で提供することができる。
注射溶液および懸濁液を滅菌粉末、顆粒および先に述べた種類の錠剤から調製することができる。エキソビボ治療用に核酸により形質導入した細胞も、上記の様に静脈内または非経口的に投与することができる。
ポリペプチド化合物の投与で重要な因子は、ポリペプチドが細胞の形質膜、または核等の細胞内区画の膜を横断し得る能力を有することを確実にする。細胞膜は小さな非イオン性脂肪親和性化合物を自由に濾過し得る脂質−タンパク質二重膜で構成され、本質的に極性化合物、高分子および治療または診断薬に対し不透過性である。しかしながら、細胞膜を横切ってポリペプチドを移行させる能力を有するタンパク質およびリポソーム等の他の化合物が、記載されている。
さらに、ポリペプチドがより“粘着性”でなく、凝集体を形成しない、または他のタンパク質と結合しない様に、または薬物速度を増進し(例えばより長い半減期)、例えば血清中または保存中に、例えばタンパク質をPEG化するまたはタンパク質を脂質その他の化合物と複合化することにより、より安定である様に、ポリペプチドの性質を変化させることが重要であり得る。また、信号ペプチド、リーダー配列またはインビボまたはインビトロで分泌するための分泌ペプチドをタンパク質に備えることも重要であり得る。CD4+細胞の細胞表面分子に結合するリガンド等の標的部分、例えば抗体、リガンド、受容体等を用いて、本発明のデフェンシンポリペプチドがまた、細胞を特異的に標的とすることができる。従って、本発明は本明細書に記載のデフェンシンに対する送達ビヒクルの他、デフェンシンタンパク質に対し安定化、特異的送達または標的化、分泌、検出可能な標識の提供等の能力を有する相同部分を有する融合タンパク質を提供する。ある実施態様では、融合タンパク質はアルブミン部分とデフェンシン部分を有する。アルブミン部分は、デフェンシンの寿命を延長するに十分な、少なくともアルブミン(例えばヒトアルブミン)の一部であり得る。この様な構成は国際特許公報WO 01/79480(Rosenら、Albumin Fusion Proteins、2001年10月25日)により詳細に記載されている。
例えば、“膜移行ポリペプチド”は膜移行担体として作用する能力のある両親媒性または疎水性アミノ酸配列を有する。ある実施態様では、ホメオドメインタンパク質が細胞膜を通って移行する能力を有する。ホメオドメインタンパク質の最短内部化ペプチドであるアンテナペディア(Antennapedia)は、アミノ酸位置43〜58由来の第3のタンパク質ヘリックスであることが見出された(例えばProchiantz、Current Opnion in Neurobiology、6:629−634(1996)参照)。他の部分配列である信号ペプチドのh(疎水性)ドメインは、同様な細胞膜移行特性を有することが見出された(例えばLinら、J.Biol.Chem.、270(1):4255−14258(1995)参照)。
ペプチド配列の例にはHIVのtatタンパク質の11個のアミノ酸配列;p16タンパク質のアミノ酸84〜103に対応する20残基ペプチド配列(Fahraeusら、Current Biology、6:84(1996));アンテナペディアの60アミノ酸長ホメオドメインの第3ヘリックス(Derossiら、J.Biol.Chem、、269:10444(1994));カポシ線維芽成長因子(K−FGF)h領域等の信号ペプチドのh領域(Linら、前出);またはHSV由来のVP22移行ドメイン形(Elliotら、Cell、88:223−233(1997))が含まれるが、これらに限定されない。細胞取り込み増進を行う他の適当な化学部分も、本発明のデフェンシンに化学的に結合することができる。
毒素分子もポリペプチドを細胞膜を通って輸送する能力を有する。しばしば、この様な分子(“2元毒素”と呼ばれる)は少なくとも2つの部分で構成される:(1)移行または結合ドメインまたはポリペプチド、および(2)分離した毒素ドメインまたはポリペプチド。具体的には、移行ドメインまたはポリペプチドは細胞受容体に結合し、ついで毒素が細胞内へ輸送される。Clostridium perfringensイオタ毒素、ジフテリア毒素(DT)、Pseudomonas 内毒素A(PE)、百日咳毒素(PT)、Bacillus anthracis毒素、および百日咳アデニレートサイクラーゼ(CYA)を含むいくつかのバクテリア毒素が、ペプチドを内部またはアミノ末端融合体として細胞質へ送達する試みで使用されてきた(Aroraら、J.Biol.Chem.、268:3334−3341(1993);Perelleら、Infect.Immun.、61:5147−5156(1993);Stenmarkら、J.Cell.Biol.、113:1025−1032(1991);Donnellyら、PNAS、90:3530−3534(1993);Carbonettiら、Abstr.Annu.Meet.Am.Soc.Microbiol.、95:295(1995);Seboら、Infect.Immun.、63:3851−3857(1995);Klimpelら、PNAS USA.、89:10277−10281(1992);Novakら、J.Biol.Chem.、267:17186−17193(1992);および米国特許第5、602、095号、第4、892、827号および第5、608、039号)。
この様な部分配列を、デフェンシンを細胞膜を通って移行させるために使用できる。デフェンシンをこの様な配列と都合良く融合する、またはこの配列と誘導体にすることが出来る。具体的には、移行配列を融合タンパク質の一部として提供される。随意には、デフェンシンと移行配列を結合するためにリンカーを用いてもよい。任意の適切なリンカー(例えばペプチドリンカーまたは他の化学リンカー)が使用され得る。
デフェンシンがまた、マイクロ粒子およびリポソーム、および、免疫リポソーム等のリポソーム誘導体を経由して動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞に、導入され得る。“リポソーム”という用語は、水相を包み込む、1つ以上の同心円状に配列した、脂質層から構成されるビヒクルを言う。水相は、細胞に送達される化合物を含む。
リポソームはプラズマ膜と融合し、薬剤を細胞質内に放出する。または、リポソームは輸送ビヒクル内の細胞で食細胞作用を受けるか、細胞に取り込まれる。エンドソームまたはファゴソームに入ると、リポソームは分解されるか輸送ビヒクルの膜と融合し、その内容物を放出する。
リポソームを経由する薬剤送達の現在の方法では、リポソームは最後には透過性となり、包み込んだ化合物を標的組織または細胞で放出する。全身的または組織特異性送達のために、これは例えば受動的に行われ得、リポソーム二重層が体内の様々な試薬の作用で経時的に分解される。または、活性薬剤の放出にはリポソームビヒクルに透過性の変化を誘発する薬剤の使用が含まれる。リポソーム膜を、リポソーム膜の近傍で環境が酸性になった場合に不安定化する様に構成することができる(例えばPNAS、84:7851(1987);Biochemistry、28:908(1989)を参照)。例えばリポソームが標的細胞でエンドサイトーシスされると、リポソームは不安定になり、その内容物を放出する。この不安定化は“融合性”と名付けられる。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)は多くの“融合性”システムの基本である。
この様なリポソームは具体的には選択したデフェンシンと脂質成分、例えば中性および/または陽イオン性脂質を含み、所定の細胞表面受容体またはリガンド(例えば抗原)と結合する抗体等の受容体認識分子を随意に含む。種々のリポソーム調製法が以下の文献で得られる:Szokaら、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.、9:467(1980);米国特許第4、186、183号、第4、217、344号、第4、235、871号、第4、261、975号、第4、485、054号、第4、501、728号、第4、774、085号、第4、837、028号、第4、235、871号、第4、261、975号、第4、485、054号、第4、501、728号、第4、774、085号、第4、837、028号、第4、946、787号、PCT公開番号WO91/17424、Deamerら、Biochem.Biophys.Acta、443:629−634(1976);Fraleyら、PNAS、76:3348−3352(1979);Hopeら、Biochem.Biophys.Acta、812:55−65(1985);Mayerら、Biochem.Biophys.Acta、858:161−168(1986);Williamsら、PNAS、85:242−246(1988);Liposomes(Ostro(編)、1983,Chapter1);Hopeら、Chem.Phys.Lip.、40:89(1986);Gregoriadis、Liposome Technology(1984)およびLasic、リポソームス:Physics to Application(1993)。適した方法の例には超音波処理、押出し、高圧/均質化(homogenization)、微小流動化、洗浄剤透析(detergent dialysis)、小さなリポソームビヒクルのカルシウム誘導された融合、およびエーテル融合法が含まれ、その全てが周知である。
本発明のある実施態様では、特定の細胞型、組織等に特異的な標的部分を用いて本発明のリポソームを標的化することが望ましい。多様な標的部分(例えばリガンド、受容体およびモノクローナル抗体)を用いるリポソームの標的化は既に記載されている(例えば米国特許第4,957,773号および第4,603,044号参照)。
標的試薬をリポソームに結合する標準的方法を使用し得る。これらの方法には一般的に標的試薬が付着するために活性化し得るリポソーム脂質成分、例えばホスファチジルエタノールアミン中への包括、または脂質誘導体化したブレオマイシン等の誘導体化親油性化合物が含まれる。抗体標的化されたリポソームを、例えばプロテインAを取り込んだリポソームを用いて構成できる(Renneisenら、J.Biol.Chem.、265:16337−16342(1990);およびLeonettiら、PNAS、87:2448−2451(1990)参照)。
他の実施態様では、本発明のデフェンシンポリペプチドをアジュバントとして使用し得る。具体的には、デフェンシンポリペプチドを免疫原性を誘発するアジュバントとして使用できる。この様にして、デフェンシンポリペプチド、またはこの様なデフェンシンポリペプチドをコードする核酸をワクチンまたは他の抗原と組み合わせて使用して抗原反応を増加させることができる。
本発明の方法は患者におけるHIV感染およびAIDSを治療する、または予防する。これを達成するに適当なデフェンシンの量は“治療上有効な投与量”として定義される。デフェンシンまたはデフェンシン製剤の一回または複数回の投与を、必要な投与量および投与回数、および患者の許容量に応じて投与することができる。患者のHIV感染および/またはAIDSを有効に治療または予防するためには、製剤は十分な量の活性剤、すなわちデフェンシンを提供するべきである。
本発明の文脈において患者への投与量は、長い期間で患者に有益な治療成果を上げるに十分な量でなければならない。投与量は採用した具体的な送達法の効率、核酸、ポリペプチドまたは低分子量有機化合物等の投与する組成物および患者の状態ならびに治療する患者の体重または表面積で決められる。投与量の大きさはまた、特定のデフェンシン組成物の投与に付随する有害な副作用の存在、性質および程度、または特定の患者における形質導入細胞型で決められる。
投与に際して、本発明の化合物を候補化合物のLD−50と、患者の体重と全体的な健康状態に対して適用される様々な濃度における候補化合物の副作用で決められる速度で投与することができる。投与は一回、複数回に分割された投与量で達成され得る。一般的に、投与は体重kgあたり1μg〜100mg、1μg〜1mg、または10μg〜10mgの範囲である。当業者は、他の範囲も適当であり得、容易に確認し得ることを理解する。例えば、特定の組成物はより高い、またはより低い投与量でより有効である。本明細書に記載の方法で患者を評価することにより、当業者は患者が治療に反応しているかどうかを判断することが可能で、それに従っていかに投与量を調節するかを知る。
3.組み合わせ治療
様々な実施態様で、本発明のデフェンシンポリペプチドを1種以上のさらなる化合物または治療法と組み合わせて投与し得る。例えば、複数のデフェンシンポリペプチドを同時投与し得るか、1種以上のデフェンシンポリペプチドを1種以上の治療用化合物と組み合わせて投与し得る。ある実施態様では、他の治療用化合物はHIV感染を予防または治療するために使用されるものである。他の実施態様では、他の治療薬はHIV感染および/またはHIVの治療または予防に伴う日和見感染を治療するために用いられる薬剤である。
様々な実施態様で、本発明のデフェンシンポリペプチドを1種以上のさらなる化合物または治療法と組み合わせて投与し得る。例えば、複数のデフェンシンポリペプチドを同時投与し得るか、1種以上のデフェンシンポリペプチドを1種以上の治療用化合物と組み合わせて投与し得る。ある実施態様では、他の治療用化合物はHIV感染を予防または治療するために使用されるものである。他の実施態様では、他の治療薬はHIV感染および/またはHIVの治療または予防に伴う日和見感染を治療するために用いられる薬剤である。
本発明のデフェンシンポリペプチドと組み合わせて使用するに適した治療薬にはプロテアーゼ阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、抗レトロウイルスヌクレオシド、融合阻害剤、侵入阻害剤、ならびにHIV感染の阻害または治療に有効な他の抗ウイルス剤が含まれるがこれらに限定されない。適当な治療剤のさらなる例にはジドブジン、ジダノシン、スタブジン、インターフェロン、ラミブジン、アデフォビール、ネビラピン、デラビリジン、ロビライド、サキナビール、インジナビール、AZT、T20、T22およびT2が含まれるがこれらに限定されない。他の適当な治療剤には抗生物質その他の抗ウイルス剤(例えばアシクロビール)が含まれるがそれに限定されない。他の実施態様では、デフェンシンポリペプチド(単数または複数)がCCR5のCXCR4等のHIV共受容体の可溶な形態と一緒に投与される。当然、共受容体は細胞外部分、膜横断部分および細胞内部分を有する膜タンパク質である。それらは膜横断および細胞内部分を除去して可溶化することができる。これらの部分を組換えで除去し、細胞外部分を単独または融合タンパク質の一部としてのいずれかで発現することができる。
当業者に公知の他の組み合わせ治療が、本発明の方法と組み合わせて使用できる。
E.診断および予後への応用
本発明のデフェンシン分子(例えば核酸およびタンパク質)は、診断および予後にも有用である。例えば、生物試料(例えば組織または血清試料)におけるデフェンシンレベルの増加は、AIDSへの進行が遅れているか進行しない状態、またはT細胞数があるレベル(例えば200)以下であることを予見するものである。ある実施態様では、CD8+細胞が単離され、インビトロで刺激され、デフェンシンレベルが測定される。例えば好中球等のヒトの組織中のデフェンシンレベルの増加はHIV感染者の長期生存と相関している。従って、個人のデフェンシレベルを検出することにより、その人の病態を決定することができる。本明細書に例示する様に、増加したデフェンシンレベルを有する人は、より低いデフェンシンレベルを有する人にくらべてAIDSに進行し難いことが現在発見されている。また、デフェンシンレベルを抗ウイルス薬、投与量および治療期間の選択を決定するために使用することができる。従って、核酸およびタンパク質の検出のための当業者に公知の方法を、HIV感染、およびAIDSの進行の診断および予後に使用できる。それらの方法の例にはPCR、ノーザンおよびサウザンブロット、mRNAの逆転写および増幅、全RNAまたはポリA+RNAの単離、ドットブロット、核酸分析、ウエスターンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫沈殿等の免疫分析、ELISA、プロテオミクス分析、ポリヌクレオチドアレイ技術等が含まれる。
本発明のデフェンシン分子(例えば核酸およびタンパク質)は、診断および予後にも有用である。例えば、生物試料(例えば組織または血清試料)におけるデフェンシンレベルの増加は、AIDSへの進行が遅れているか進行しない状態、またはT細胞数があるレベル(例えば200)以下であることを予見するものである。ある実施態様では、CD8+細胞が単離され、インビトロで刺激され、デフェンシンレベルが測定される。例えば好中球等のヒトの組織中のデフェンシンレベルの増加はHIV感染者の長期生存と相関している。従って、個人のデフェンシレベルを検出することにより、その人の病態を決定することができる。本明細書に例示する様に、増加したデフェンシンレベルを有する人は、より低いデフェンシンレベルを有する人にくらべてAIDSに進行し難いことが現在発見されている。また、デフェンシンレベルを抗ウイルス薬、投与量および治療期間の選択を決定するために使用することができる。従って、核酸およびタンパク質の検出のための当業者に公知の方法を、HIV感染、およびAIDSの進行の診断および予後に使用できる。それらの方法の例にはPCR、ノーザンおよびサウザンブロット、mRNAの逆転写および増幅、全RNAまたはポリA+RNAの単離、ドットブロット、核酸分析、ウエスターンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫沈殿等の免疫分析、ELISA、プロテオミクス分析、ポリヌクレオチドアレイ技術等が含まれる。
例えば、mRNA群の発現を追跡するために核酸プローブアレイを使用する方法は、米国特許第6,040,138号、欧州特許第853,679号、およびPCT公報WO97/27317に記載されている。この様な方法は目的のmRNA標的配列に相補的なプローブ群を使用する。mRNA群またはその増幅生成物がこの様なアレイに応用され、目的の標的が同定され、随意には相補性プローブに特異的に結合する量から定量される。随意には、標的と不整合であることが知られている標的のプローブへの結合を、バックグラウンド非特異的結合の目安として使用し得、標的の相補性プローブへの特異的結合から差し引かれる。
従って、本発明のデフェンシンタンパク質、オーソログ、対立遺伝子、保存性修飾変位体および多形変位体をコードするcDNAを同定するために、デフェンシンタンパク質をコードする核酸を高密度および低密度オリゴヌクレオチドアレイ技術(例えばGeneChipTM)と共に使用することができる。同定されたホモログがウイルス感染の調節と結合している場合、それらをGeneChipTMアレイと共に生物試料中の疾患の検出における診断の道具として使用することができる(例えばGunthandら、AIDS Res.Hum.Retroviruses14:869−876(1998);Kozalら、Nat.Med.2:753−759(1996);Matsonら、Anal.Biochem.224:110−106(1995);Lockhartら、Nat.Biotechnol.14:1675−1680(1996);Gingerasら、Genome Res.8:435−448(1998);Haciaら、Nucleic Acids Res.26:3865−3866(1998)参照)。
1.デフェンシンポリペプチドの免疫学的検出
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いるデフェンシン遺伝子および遺伝子発現の検出に加えて、本発明のデフェンシンタンパク質を検出するために免疫分析を使用することもできる。この様な分析はデフェンシンの調節因子のスクリーニングならびに、治療および診断への応用に有用である。デフェンシンタンパク質を定量的または定性的に分析するために免疫分析を使用することができる。応用可能な技術の総説はHarlowおよびLane、Antibodies:A laboratory Manual(1988年)に見られる。
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いるデフェンシン遺伝子および遺伝子発現の検出に加えて、本発明のデフェンシンタンパク質を検出するために免疫分析を使用することもできる。この様な分析はデフェンシンの調節因子のスクリーニングならびに、治療および診断への応用に有用である。デフェンシンタンパク質を定量的または定性的に分析するために免疫分析を使用することができる。応用可能な技術の総説はHarlowおよびLane、Antibodies:A laboratory Manual(1988年)に見られる。
デフェンシタンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生産法は当業者に公知である(例えばColigan、Current Protocols in Immunology(1991);Harlow & Lane、前出;Goding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版、1986);およびKohler & Milstein、Nature、256:495−497(1975)参照)。この様な技術にはファージまたは類似のベクター中の組換え抗体ライブラリーからの抗体の選択による抗体の調製、ならびにウサギまたはマウスの免疫化によるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製が含まれる(例えばHuseら、Science、246:1275−1281(1989);Wardら、Nature、341:544−546(1989)参照)。
デフェンシンタンパク質の一部を有する多くの免疫原を、デフェンシンと特異的に反応する抗体を生産するために使用し得る。例えば、組換えまたは化学合成デフェンシンタンパク質、またはその抗原性断片を本明細書に記載通り単離することができる。組換えタンパク質を前記の通り真核細胞または原核細胞中で発現し得、上記に一般的に述べられた様に精製することができる。または、本明細書に開示された配列由来で担体タンパク質と融合した合成ペプチドが、免疫原として使用できる。天然起原のタンパク質も純粋な形、または不純な形で使用し得る。次いで生成物を抗体を生産し得る動物中へ注射する。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを、次にタンパク質測定のための免疫分析で使用するために生成し得る。
ポリクローナル抗体の製造法は当業者に公知である。マウス同系繁殖種(例えばBALB/Cマウス)またはウサギをFreundアジュバント等の標準アジュバントと、標準免疫化プロトコールを用いてタンパク質で免疫する。免疫原調製物に対する動物の免疫反応を、試験血液を取り、ベータサブユニットに対する反応性の力価を測定して追跡する。抗体の免疫原に対する適当に高い力価が得られた場合、血液を動物から採集し、抗血清を調製する。所望される場合タンパク質に反応する抗体を濃縮するための抗血清のさらなる分画を行い得る(HarlowおよびLane、前出参照)。
モノクローナル抗体は当業者が熟知する様々な技術で得られ得る。簡単に言えば、所望の抗原で免疫された動物由来の脾臓細胞を、通常は骨髄腫細胞と融合して不死化する(Kohlerら、Eur.J.Immunol.、6:511−519(1976)参照)。免疫化の別な方法には、エプスタインバールウイルス、癌遺伝子またはレトロウイルスによる形質移入、および当該分野で周知の他の方法が含まれる。単一不死化細胞から生じるコロニーを、所望の抗原に対する特異性および親和性を有する抗体の生産についてスクリーニングし、この様な細胞で生産されたモノクローナル抗体の収率を、脊椎動物宿主の腹腔中への注入を含む様々な技術で増大させ得る。または、Huseら、Science、246:1275−1281(1989)に概説される一般的なプロトコールに従ってヒトB細胞由来のDNAライブラリーをスクリーニングして、モノクローナル抗体またはその結合断片をコードするDNA配列を単離してもよい。
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗血清を採集し、免疫分析、例えば固体支持体に固定された免疫原による固相免疫分析で免疫原タンパク質に対する力価を測定する。具体的には、力価104以上を有するポリクローナル抗血清が選択され、競合結合免疫分析を用いて非デフェンシンタンパク質に対する交差反応性が試験される。特異的ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、Kdが通常は少なくとも0.1mM、より一般的には少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1μM以上、最も好ましくは0.001μM以上で結合する。ヒトデフェンシン等、特定のデフェンシンオーソログのみに特異性のある抗体も、非ヒト哺乳動物等の種由来の他の交差反応性オートログを差し引くことにより、作製することができる。この様にして、デフェンシンタンパク質のみに結合する抗体が得られ得る。
デフェンシンタンパク質に対する特異性抗体を一度入手すると、そのタンパク質を様々な免疫分析法で検出することができる。さらに、その抗体をデフェンシン調節因子として治療に用いることができる。免疫学的および免疫分析法の総説については“Basic and Clinical Immunology”StiteおよびTerr編集、第7版、1991年)参照。さらに、本発明の免疫分析を任意のいくつかの形態で行うことが可能で、Enzyme Immunoassay、Maggio編集、1980年;およびHarlow & Lane(前出)に詳しく検討されている(例えば米国特許第4、366、241号;第4、376、110、第4、517、288号および第4、837、168号参照)。一般的な免疫分析の総説については“Methods in Cell Biology:Antibodies in Cell Biology”、第37巻(Asai編、1993);“Basic and Clinical Immunology”(Stite & Terr編集、第7版、1991年)参照。具体的には、免疫学的結合分析(または免疫分析)は選択したタンパク質または抗原(この場合はデフェンシンタンパク質またはその抗原性部分配列)に特異的に結合する抗体を使用する。抗体(例えば抗デフェンシン抗体)を、当業者に周知の上記の多くの手段で製造し得る。
分析に用いられる具体的なラベルまたは検出可能基は、それが分析に用いられた抗体の特異的結合を実質的に妨害しない限り、本発明の重要な特徴ではない。検出可能基は検出可能な物理的または化学的性質を有する任意の材料でよい。この様な検出可能なラベルは免疫分析の分野で公知であり、この様な方法で有用なラベルのほとんどが本発明に適用することができる。従って、ラベルは分光学、光化学、生化学、免疫化学、電気学、光学または化学的手段で検出可能な任意の組成物である。本発明で有用なラベルには磁気ビーズ(例えばDYNABEADSTM)、蛍光染料(例えばフルオレッセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン等)、放射性ラベル(例えば3H、125I、35S、14Cまたは32P)、酵素(例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびELISAで共通に使用される他の酵素)、およびコロイド状金または着色ガラスまたはブラスチックビーズ(例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等)等の比色ラベルが含まれる。
ラベルを分析の所望の成分に、当該分野で周知の方法に従って直接または間接的に結合し得る。上記に示した様に、要求される感度、化合物との結合のし易さ、必要な安定性、使用可能な装置、および廃棄処理規制によってラベルを選んで多様なラベルを使用し得る。
非放射性ラベルを間接的手段で付着させることが多い。一般的に、リガンド分子(例えばビオチン)が分子に共有結合で結合する。リガンドは他の分子(例えばストレプトアビジン)に結合し、その分子が本質的に検出可能であるか、信号系(例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物または化学発光化合物等)に共有結合で結合する。リガンドとその標的をデフェンシンタンパク質を認識する抗体、または抗デフェンシンを認識する2次抗体と任意の適切な組み合わせで使用できる。
分子を信号発生化合物に、例えば酵素または蛍光発色団との結合により、直接結合することもできる。ラベルとして関心のある酵素は一義的にはヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼまたはオキシダーゼ(oxidotase)、具体的にはペルオキシダーゼである。蛍光化合物にはフルオレッセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等が含まれる。化学発光化合物にはルシフェリンおよび2、3−ジヒドロフタラジンジオン(例えばルミノール)が含まれる。使用される様々なラベルおよび信号発生系の総説については米国特許第4、391、904号参照。
ラベルの検出手段は当業者に周知である。従って、例えばラベルが放射性ラベルである場合、検出手段にはシンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーにおけるのと同様の写真フィルムが含まれる。ラベルが蛍光ラベルである場合、蛍光発色団を適当な波長の光で励起し、得られた蛍光を検出することで検出し得る。蛍光は目視で検出され得るか、電荷結合装置(CCD)、または光電子倍増管等の使用により検出され得る。同様に、酵素ラベルを酵素に対する適当な基質を提供し、得られた反応生成物を検出することにより検出し得る。比色または化学発光ラベルを単純にラベルに付いた色を観察して検出し得る。従って、様々なスティック浸漬分析では、結合した金はピンクに見える一方、様々な結合したビーズはそのビーズの色を示す。
ある分析形式では標識成分の使用を必要としない。例えば、凝集分析を標的抗体の存在の検出に使用し得る。この場合、抗原被覆粒子が標的抗体を有する試料で凝集する。この形式では、どの成分も標識する必要がなく、標的抗体の存在は単純な目視で検出される。
2.デフェンシンポリペプチドのSELDI検出
核酸ハイブリダイゼーション技術および免疫学的技術を用いるデフェンシン遺伝子およびデフェンシン発現の検出に加えて、表面エンハンサーレーザー脱吸着/イオン化(SELDI)も本発明のデフェンシン、またはデフェンシンを調節または結合する化合物の検出に使用できる。SELDIとは脱吸着/イオン化気相イオン分光学(例えばマススペクトロメトリー)の方法であり、被分析物が気相イオンスペクトロメーターのプローブ界面を占めるSELDIプローブの表面に捕捉される。SELDI MSでは、気相イオンスペクトロメーターはマススペクトロメーターである。ある実施態様では、SELDIには混合物から標的被分析物を捕捉する吸着剤で誘導化されるマススペクトロメータープローブ表面等の固体支持体の表面への被分析物分子の捕捉が含まれる。具体的にはマトリックス物質が捕捉された被分析物に施され、被分析物がレーザー脱吸着マススペクトロメトリーで検出される。使用される吸着剤はクロマトグラフィー的または生物特異性であり得る。SELDI技術は例えば米国特許第5、719、060号(HutchensおよびYip)および米国特許第6、225、047号(HutchensおよびYip)に記載されている。SELDIに基づくバイオチップおよび装置はCiphagen Biosystems、Inc.,Fremont、CAから入手可能である。
核酸ハイブリダイゼーション技術および免疫学的技術を用いるデフェンシン遺伝子およびデフェンシン発現の検出に加えて、表面エンハンサーレーザー脱吸着/イオン化(SELDI)も本発明のデフェンシン、またはデフェンシンを調節または結合する化合物の検出に使用できる。SELDIとは脱吸着/イオン化気相イオン分光学(例えばマススペクトロメトリー)の方法であり、被分析物が気相イオンスペクトロメーターのプローブ界面を占めるSELDIプローブの表面に捕捉される。SELDI MSでは、気相イオンスペクトロメーターはマススペクトロメーターである。ある実施態様では、SELDIには混合物から標的被分析物を捕捉する吸着剤で誘導化されるマススペクトロメータープローブ表面等の固体支持体の表面への被分析物分子の捕捉が含まれる。具体的にはマトリックス物質が捕捉された被分析物に施され、被分析物がレーザー脱吸着マススペクトロメトリーで検出される。使用される吸着剤はクロマトグラフィー的または生物特異性であり得る。SELDI技術は例えば米国特許第5、719、060号(HutchensおよびYip)および米国特許第6、225、047号(HutchensおよびYip)に記載されている。SELDIに基づくバイオチップおよび装置はCiphagen Biosystems、Inc.,Fremont、CAから入手可能である。
“表面増強親和性捕捉(Surface−Enhanced Affinity Capture)”または“SEAC”は、吸着剤表面を有するプローブ(SEACプローブ)の使用を含むSELDIの1つのバージョンである。“吸着剤表面”とは、吸着剤(“捕捉剤”または“親和剤”とも呼ばれる)が結合している表面のことである。吸着剤とは被分析試料(例えば標的ポリペプチドまたは核酸)が結合し得る任意の材料である。“クロマトグラフィー吸着剤”とは、クロマトグラフィーで代表的に使用できる材料のことである。クロマトグラフィー吸着剤には例えば、イオン交換材料、金属配位子(例えばニトリロ酢酸またはイミノ二酢酸)、固定化金属キレート、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、染料、単純な生体分子(例えばヌクレオチド、アミノ酸、単糖および脂肪酸)、および混合モード吸着剤(例えば疎水性引力/静電斥力吸着剤)が含まれる。“生体特異性吸着剤”とは、生体分子(例えば核酸分子(例えばアプタマー)、ポリペプチド、多糖、脂質、ステロイドまたはそれらの共役体(例えば糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、核酸(例えばDNA)−タンパク質結合体))を有する吸着剤である。ある場合は生体特異性吸着剤は多重タンパク質複合体、生物膜またはウイルス等の高分子構造であり得る。生体特異性吸着剤の例には抗体、受容体タンパク質および核酸がある。生体特異性吸着剤は代表的に、標的被分析物に対しクロマトグラフィー吸着剤より高い特異性を有する。SELDIに使用する吸着剤のさらなる例は米国特許第6、225、047号(HutchensおよびYip、“Use of retentate chromatography to generate difference maps”、2001年5月1日)に見られる。
ある実施態様では、SEACプローブが選ばれた吸着剤を提供する様に修飾し得る予備活性化表面として提供される。例えば、あるプローブには共有結合で生体分子を結合し得る反応性部分が備えられる。エポキサイドとカルボジイミドは、抗体または細胞受容体等の生体特異性吸着剤を共有結合するために有用な反応性部分である。
“表面増強ニート脱吸着(Surface−Emhamced Neat Desorption)”または“SEND”は、プローブ(SEBDプローブ)表面へ化学的に結合したエネルギー吸収分子を含むプローブの使用を含むSELDIの1つのバージョンである。“エネルギー吸収分子(Energy Absorbing Molecule)”(EAM)とは、レーザー脱吸着/イオン化源からエネルギーを吸収し、その後それに接触する被分析物分子の脱吸着とイオン化に寄与し得る分子を言う。この用語には“マトリックス”と呼ばれることが多いMALDIで用いられる分子が含まれ、明らかにケイ皮酸誘導体、シナピン酸(SPA)、シアノヒドロキシケイ皮酸(CHCA)およびジヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸、ヒドロキシアセトフェノン誘導体その他が含まれる。また、SELDIに用いられるEAMも含まれる。ある実施態様では、エネルギー吸収分子は直鎖または架橋ポリマー(例えばポリメタアクリレート)中に取り込まれる。例えば、その組成物はα−シアノ−4−メタクリロイルオキシケイ皮酸とアクリレートとの共重合体であり得る。他の実施態様では、その組成物はα−シアノ−4−メタクリロイルオキシケイ皮酸、アクリレートおよび3−(トリメトキシ)シリルプロピルメタクリレートの共重合体である。他の実施態様では、その組成物はα−シアノ−4−メタクリロイルオキシケイ皮酸とオクタデシルメタクリレートとの共重合体である(C18SEND)。さらにSENDは米国特許第5、719、060号および米国特許出願第60/408、255号(2002年9月4日出願、(Kitagawa、“Monomers and Polymers Having Energy Absorbing Moiety Of Use In Desorption/Ionization Of Analytes”)に記載されている。
“表面増強光感光性付着および放出(Surface−Enhanced Photolabile Attachment and Release)”または“SEPAR”は、被分析試料の共有結合可能な表面に付着する部分を有し、光(例えばレーザー光)への曝露後にその部分の感光性結合を切ることにより被分析試料を放出するプローブの使用を含む、SELDIの1バージョンである。SEPARは米国特許第5、719、060号にさらに記載されている。
“吸着”とは、被分析試料の吸着剤または捕捉試薬への検出可能な非共有結合を言う。“溶離液”または“洗浄液”とは、被分析試料の吸着剤表面への吸着に影響を及ぼす、または修飾する、および/または未結合材料を表面から除去するために用いられる試薬、具体的には溶液である。溶離液の溶離特性は例えばpH、イオン強度、疎水性、カオトロピズムの程度、界面活性強度および温度に依存する。“固体支持体”とは、捕捉試薬等の化学成分、反応性成分またはエネルギー吸収種で誘導体化、あるいはそれに付着させ得る固体材料を言う。例示的な固体支持体としては、チップ(例えばプローブ)、マイクロタイタープレートおよびクロマトグラフィー樹脂が挙げられる。“チップ”とは、化学成分が付着し得る一般に平面状の表面を有する固体支持体のことである。プローブ界面に取り付けるために適合されるチップも“プローブ”と呼ばれる。“バイオチップ”とは化学成分が付着するチップを言う。バイオチップの表面は多くの場合、複数のアドレス可能位置を有し、そのそれぞれの位置がそこに付着した化学成分を有する。“タンパク質バイオチップ”とは、ポリペプチド捕捉のために適合されるバイオチップである。多くのタンパク質バイオチップが当該分野で記載されている。これらは、例えば、Ciphergen Biosystems(Fremont、CA)、Packard BioScience Company(Meriden、CT)、Zymomyx(Hayward、CA)およびPhylos(Lexington、MA)で製造されたタンパク質バイオチップが含まれる。この様なタンパク質バイオチップの例は以下の特許または特許出願に記載されている:米国特許第6、225、047号(HutchensおよびYip、“Use of retentate chromatography to generate difference map”、2001年5月1日);国際特許公報WO99/51773号(KuimelisおよびWagner、“Addressable protein arrays”、1999年10月14日);米国特許第6、329、209号(Wagnerら、“Arrays of protein−capture agents and methods of use thereof”2001年12月11日);および国際特許公報WO00/56934(Englertら、“Continuous porous matrix arrays”、2000年9月28日)。
本発明のある実施態様では、デフェンシンをクロマトグラフィーおよび生体特異性SELDIバイオチップの両方で検出できる。デフェンシンを陽イオン交換表面を有するSELDIバイオチップ上で十分に分離し得ることが見出されている(WCX2ProteinChipアレイ、Ciphergen Biosystems、Inc.)。試料をチップに付着させ、吸着を促進するためにインキュベーションする。次いでバイオチップを100mM酢酸ナトリウム(pH4.5)とPBS緩衝液中の0.2%Triton−X100で洗浄する。タンパク質をマススペクトロメトリーで検出する。α−デフェンシンは約3371D、3443Dおよび3484Dに3重ピークとして現れる。
または、デフェンシンを、その表面に施したデフェンシン特異性抗体を有するSELDIバイオチップ上で検出できる。ある実施態様では、カルボキソイミダゾールまたはエポキシド等の官能基を有するSELDIバイオチップ(例えばPS10またはPS20ProteinChipアレイ、Ciphergen Biosystems、Inc.)が、バイオチップ表面上の抗体を反応緩衝液中でインキュベーションすることにより抗体で誘導される。次いで試料がチップ表面に施され、結合を促進するためにインキュベーションされ、洗浄される。タンパク質はマススペクトロメトリーで検出される。
バイオチップ上に捕捉されると、デフェンシン(またはデフェンシンの調節因子およびデフェンシンに結合する化合物)をマススペクトロメトリー、特に上記のSELDIを用いて検出することができる。マススペクトロメトリーにおけるデータの生成はイオン検出器でイオンを検出することで始まる。典型的なレーザー脱吸着マススペクトロメーターは337.1nmの窒素レーザーを使用することができる。有用なパルス幅は約4ナノ秒である。一般に、出力約1〜25μJが用いられる。検出器に当たるイオンは電位を生成し、その電位はアナログ信号をデジタル的に捕捉する高速時間アレイ記録装置でデジタル化される。CiphergenのProteinChip(登録商標)システムはこれを実行するためにアナログ−デジタル変換器(ADC)を採用する。ADCは規則的な時間間隔の検出器出力を時間依存性ビンに変換する。時間間隔は具体的には1〜4ナノ秒の長さである。さらに、最終的に解析された飛行時間スペクトルは試料に対するイオン化エネルギーの単一パルス由来の信号を表さず、むしろ多くのパルスからの合計量を表す。このためノイズが減少し、ダイナミックレンジが増加する。次に飛行時間データをデータ処理に供する。CiphergenのProteinChip(登録商標)ソフトウエアでは、具体的にはデータ処理にTOF−M/Z変換、ベースラインの減算、高周波数ノイズフィルタリングが含まれる。
TOF−to−M/Z変換には、飛行時間を質量−電荷比(M/Z)に変換するアルゴリズムの適用が含まれる。この工程で、信号が時間域から質量域へ変換される。すなわち、各飛行時間が質量−電荷比M/Zに変換される。補正は内部または外部で行われる。内部補正では、分析された試料はM/Zが既知1種またはそれより多い被分析試料を含む。これらの質量が既知の被分析試料を表す飛行時間のピークが既知のM/Zに割り当てられる。この割り当てられたM/Zに基づき、飛行時間をM/Zに変換する数学関数のパラメーターが計算される。外部補正では、内聞補正を使用せず、以前の内部補正で作成した関数等の飛行時間をM/Zに変換する関数が飛行時間スペクトルに応用される。
ベースライン減算により、スペクトルを乱す人工的な再現性のある装置の偏位を除去してデータの定量性が改善される。それにはピーク幅等のパラメーターを取り入れるアルゴリズムを用いてスペクトルのベースラインを計算し、マススペクトルからベースラインを差し引く操作が含まれる。
高周波数ノイズ信号は平滑化関数を適用して除去される。典型的な平滑化関数では、各経時ビンに移動平均関数が適用される。改良バージョンでは、移動平均フィルターは、例えばフィルターのバンド幅が飛行時間の増加と共に一般により広くなるピークバンド幅の関数である幅可変デジタルフィルターである。例えばWO 00/70648、2000年11月23日(Gavinら、「Variable Width Digital Filter for Time−of−Flight Mass Spectrometry」)参照。
コンピューターが得られたスペクトルを様々な表示フォーマットに変換することができる。「スペクトル画面または保持マップ」と呼ばれるあるフォーマットでは、標準スペクトル画面が表示され、その画面は各分子量毎に検出器に到着する被分析試料の量を示す。「ピークマップ」と呼ばれる他のフォーマットでは、スペクトル画面からピーク高さと質量情報のみがスペクトル画面から保持され、より鮮明な画像を与え、近接した分子量を有する被分析試料をより容易に見ることができる。「ゲル画面」と呼ばれるまた別のフォーマットでは、ピーク画面からの各質量を各ピークの高さに基づいてグレースケール画像に変換し、電気泳動ゲルに類似した画面が得られる。「3次元重ね合わせ」と呼ばれるまた別のフォーマットでは、数個のスペクトルを重ね合わせて相対的なピーク高さのわずかな変化を調べることができる。「差マップ画面」と呼ばれるまた別のフォーマットでは、少なくとも2個のスペクトルを比較し、独自の被分析試料と、試料間で上方または下方制御された被分析試料を強調するのに便利である。
分析は一般に、被分析試料由来の信号を表すスペクトル中のピークの同定を包含する。勿論、ピークの選択は目で行うこともできる。しかしながら、CiphergenのProteinChip(登録商標)ソフトウエアの一部としてピーク同定を自動化するソフトウエアも使用できる。一般的に、このソフトウエアは選ばれた閾値以上の信号対雑音比を有する信号を同定することにより機能し、ピーク質量をピーク信号の中央に記入する。有用な応用の一つでは、多くのスペクトルを比較し、マススペクトルのアルゴリズム選ばれた割合で存在する同一ピークを同定する。このソフトウエアのアルゴリズムバージョンでは、指定した質量範囲内で様々なスペクトル中に現れる全てのピークの集合を作成し、質量(M/Z)クラスターの中点近くの全てのピークに対し質量(M/Z)を割り当てる。
1個またはそれより多いスペクトルからのピークデータをさらに解析し、例えば各行が特定のマススペクトルを表し、各列が質量で決定されるスペクトル中のピークを表し、各セルにはその特定のスペクトル中のピーク強度が含まれるスプレッドシートを作成する。様々な統計的またはパターン認識アプローチをデータに加えることができる。
(F.HIV阻害測定のためのアッセイ)
細胞培養物、細胞または生物全体中のウイルスレベルを当該分野において公知の手段で測定できる。代表的には、ウエスタンブロット、もしくはELISA等の他の免疫アッセイで、または定量的PCRを行ってウイルスレベルを測定する。免疫アッセイフォーマットでは、抗体等の免疫原試薬に対するタンパク質の結合を定量することによりウイルスタンパク質の量をモニターして、ウイルスレベルを測定する。定量的PCRでは、ウイルス核酸のレベルを、PCR増幅生成物をモニターし、得られた増幅された核酸の量を、既知の参照核酸で行った増幅で得られた増幅生成物に対して比較して測定する。
細胞培養物、細胞または生物全体中のウイルスレベルを当該分野において公知の手段で測定できる。代表的には、ウエスタンブロット、もしくはELISA等の他の免疫アッセイで、または定量的PCRを行ってウイルスレベルを測定する。免疫アッセイフォーマットでは、抗体等の免疫原試薬に対するタンパク質の結合を定量することによりウイルスタンパク質の量をモニターして、ウイルスレベルを測定する。定量的PCRでは、ウイルス核酸のレベルを、PCR増幅生成物をモニターし、得られた増幅された核酸の量を、既知の参照核酸で行った増幅で得られた増幅生成物に対して比較して測定する。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の製造法は当業者に公知であり、多くの抗ウイルス抗体が市販されている。例えばColigan(1991)、Current Protocols in Immunology、Wiley/Green、NY;HarlowおよびLane(1989)、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、NY;Sitesら編集、Basic and Clinical Immunology(第4版)、Lange Medical Publications、Los Altos、CAおよびその引用文献;Goding(1986)、Monoclonal Antibodies:Principle and Practice、第2版、Academic Press、New York、NY;およびKohlerおよびMilstein(1975)、Nature256:495−497参照。このような技術にはファージまたは類似のベクター中の組換え抗体ライブラリー由来の抗体の選択による抗体調製が含まれる。Huseら(1989)、Science、246:1275−1281;およびWardら(1989)、Nature、341:544−546参照。特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体、および抗血清は通常約0.1mM未満の、より一般的には約1μM未満の、好ましくは約0.1μM未満のまたはそれよりよい、最も典型的で好ましくは0.01μMまたはそれよりよいKDで結合する。
しばしば、ポリペプチドおよびその対応する抗体は、共有結合または非共有結合で検出可能な信号を提供する物質と結合させて標識される。様々な標識と結合技術が公知であり、科学論文および特許文献中で広範囲に報告されている。適切な標識には放射性ヌクレオチド、酵素、基材、コファクター、阻害剤、蛍光成分、化学発光成分、磁性粒子等が含まれる。このような標識を教示する特許には米国特許第3、817、837号;第3、850、752号;第3、939、350号;第3、996、345号;第4、277、437号;4、275、149号;および第4、366、241号が含まれる。
ある好ましいクラスの実施形態では、本発明においてウイルス阻害剤を定量する場合に検出されるウイルスタンパク質がヒトの患者中のウイルス(HIV等)の検出に用いられる。例えば、HIVポリペプチドが、患者の血液中の抗HIV抗体の検出のためのウエスタンブロットで日常的に用いられ、相互実験(患者の血液中のHIVポリペプチドを検出するための)が患者の血液中のHIVウイルス負荷の測定に適切である。このような試験は公知であり、現在では患者群中のHIV−1およびHIV−2感染を検出する標準法である。様々な免疫アッセイフォーマットが公知であり、使用され得る。
様々な免疫アッセイで特定のタンパク質を定量することができる。免疫手法および免疫アッセイ手法の概説についてはStitesおよびTerr(編集)、1991、Basic and Clinical Immunology(第7版)参照。さらに、本発明の免疫アッセイを、例えば以下の概説されるいくつか構造のいずれかで行うことができる:Maggio(編集)、1980、Enzyme Immunoassay、CRC Press、Boca Raton、Florida;Tijan(1985)、“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology、Elsevier Science Publishers B.V、Amsterdam;HarlowおよびLane、前出;Chan(編集、1987)、Immunoassay:A Practical Guide、Academic Press、Orland、FL;PriceおよびNewman(編集、1991)、Principle and Practice of Immunoassays、Stockton Press、NY;およびNgo(編集、1988)、Non Isotopic Immunoassays、Plenum Press、NY。
HIV転写物、抗体またはポリペプチドが、ヒト由来の細胞または組織等の生物試料中で定量されることが好ましい。好ましい実施形態では、抗HIVポリペプチド血清が血清中で定量される。別の好ましい実施形態では、HIV核酸が、本発明の核酸由来の遺伝子プローブを用いて感染者中で定量される。例えばある実施形態中では、生物試料中のHIV核酸がインビトロ増幅技術(例えばPCRまたはLCR)で増幅され、標識相補核酸を用いて検出される。
必要に応じて適切な緩衝液中に希釈、または必要あれば濃縮して試料を前処理する。標準水性緩衝液としては、生理的pHの燐酸塩、トリス等の様々な緩衝液の一つが適切である。必要に応じて、FACS等の細胞検索技術が、その中のウイルスを定量する必要のあるCD4+等の特定の細胞を単離するために用いられる。
本発明のHIV抗体、ポリペプチドおよび核酸が当業者に公知のいくつかの手段のいずれかを用いて定量される。これらには分光学、ラジオグラフィー、電気泳動、毛細管電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、超拡散クロマトグラフィー等の分析生化学法、および液体またはゲル沈殿反応、免疫拡散(一重または二重)、免疫電気泳動、放射線免疫アッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着アッセイ、等の様々な免疫学的が含まれる。核酸の検出はサザン分析、ノーザン分析、ゲル電気泳動、PCR、放射線標識、シンチレーション計数およびアフィニティクロマトグラフィー等の公知の方法で行われる。
当業者は、免疫アッセイまたは核酸アッセイにおいて、および被分析試料の精製中に非特異的結合を減少させることが望ましい場合が多いことを理解する。アッセイがウイルス抗体または固体基材上の固定化された他の捕捉剤を含む場合、基材に対する非特異的結合を最少にする異が望ましい。このような非特異的結合を減少させる手段は当業者に公知である。具体的な方法は基材をタンパク性組成物で被覆することである。特にウシ血清アルブミン(BSA)、脱脂粉乳およびゼラチン等のタンパク質組成物が広く使用される。
ウエスタンブロット分析もまた、試料中のポリペプチドまたは抗体(ペプチド、転写生成物または酵素消化生成物)の存在を検出および定量するために使用され得るる。その技術は一般的に分子量に基づいてゲル電気泳動で生成試料を分離し、分離されたタンパク質を適切な固体支持体(ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルターまたはナイロン誘導体フィルター等)上に移し、試料を被分析タンパク質(抗体またはHIV−2ポリペプチド)と特異的に反応する標識抗体とインキュベーションする抗体を有する。標識する抗体は被分析試料と特異的に結合する。これらの抗体は直接標識されるか、または標識抗体と特異的に結合する他の抗体(例えば被分析試料に対する抗体がマウス抗体である場合、標識ヒツジ抗マウス抗体)等の標識剤を用いてその後に検出される。
他のアッセイフォーマットにはリポソーム免疫アッセイがあり、使用されるリポソームは特定の分子(例えば抗体)と結合して、包含された試薬またはマーカーを放出する様に設計されている。次いで放出される薬剤が標準法で検出される(Monroeら、1986、Amer.Clin.Prod.Rev.、5:34−41参照)。
(G.本発明のポリペプチドの調節因子の同定)
本発明のポリペプチドの調節因子、すなわちポリペプチド活性、またはポリペプチドまたはポリヌクレオチド発現のアゴニストまたはアンタゴニストは、本明細書に記載のHIV感染に関連する疾患の治療に有用である。例えば、調節因子の投与をAIDS患者またはHIV感染者の治療に使用し進行を予防し、従ってHIVまたはAIDSに関連する症状を予防することができる。
本発明のポリペプチドの調節因子、すなわちポリペプチド活性、またはポリペプチドまたはポリヌクレオチド発現のアゴニストまたはアンタゴニストは、本明細書に記載のHIV感染に関連する疾患の治療に有用である。例えば、調節因子の投与をAIDS患者またはHIV感染者の治療に使用し進行を予防し、従ってHIVまたはAIDSに関連する症状を予防することができる。
本発明の好ましい調節因子は例えばデフェンシンの半減期を増加する、プレプロデフェンシン分子の加工を促進する、デフェンシンの翻訳をより効果的にするまたは増進する、デフェンシンの細胞阻害剤を隠蔽する、デフェンシンの分解を阻止する、デフェンシンの分泌と輸送を増加する、およびデフェンシン経路中の重要な分子を提供することにより、タンパク質レベルでデフェンシン活性を増加させる調節因子である。好ましい調節因子としては、デフェンシンの発現を核酸レベルで増加させる分子(例えばデフェンシンプロモーターの活性化因子)、デフェンシン遺伝子の染色体近接性を増加する化合物、デフェンシンRNAの安定性を増加する化合物、および細胞質または核中にデフェンシンRNAレベルを増加する化合物が挙げられる。
(1.本発明のポリペプチドを調節する薬剤)
デフェンシンタンパク質の調節因子として試験された化合物は任意の低分子量有機分子、または生体物質、例えば抗体またはペプチド等のタンパク質、糖、核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはリボソーム、または脂質である。または、調節因子はデフェンシンタンパク質の遺伝的修飾体である。典型的には、試験化合物は低分子量有機分子、ペプチド、RNA、アンチセンス分子、リボソームおよび脂質である。
デフェンシンタンパク質の調節因子として試験された化合物は任意の低分子量有機分子、または生体物質、例えば抗体またはペプチド等のタンパク質、糖、核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはリボソーム、または脂質である。または、調節因子はデフェンシンタンパク質の遺伝的修飾体である。典型的には、試験化合物は低分子量有機分子、ペプチド、RNA、アンチセンス分子、リボソームおよび脂質である。
本発明のアッセイでは任意の化合物を潜在的な調節因子またはリガンドとして本質的に使用できるが、水溶液または有機(特にDMSO系)溶液に可溶の化合物が使用されることが最も多い。アッセイ工程を自動化し、典型的には平行で走査される(例えばロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイターフォーマットで)任意のアッセイに便利な起原由来の化合物を提供することにより、大きな化学ライブラリーをスクリーニングする様にアッセイを設計する。Sigma(St.Louis、MO)、Aldrich(St.Louis、MO)、Sigma−Aldrich(St.Louis、MO)、Fluka Chemika−Biochemica Analytika(Buchs、Switzerland)等を含む化合物の供給者が多く存在することが理解される。
(2.本発明のポリペプチドの調節因子のスクリーニング法)
いくつかのインビトロおよびインビボのスクリーニングプロトコルが、細胞中、特に哺乳動物細胞中、特にヒト細胞中で本発明のポリペプチドの活性レベル、またはポリヌクレオチドの発現レベルを調節する試薬を同定するために使用され得る。一般的に言えば、スクリーニング法には例えばポリペプチドに結合するか、阻害剤または活性化剤のポリペプチドへの結合を阻止するか、ポリペプチドと阻害剤または活性化剤の会合を増加するか、またはポリペプチドの発現を活性化または阻害することによる、本発明のポリペプチドの活性を調節する複数の薬剤のスクリーニングが含まれる。
いくつかのインビトロおよびインビボのスクリーニングプロトコルが、細胞中、特に哺乳動物細胞中、特にヒト細胞中で本発明のポリペプチドの活性レベル、またはポリヌクレオチドの発現レベルを調節する試薬を同定するために使用され得る。一般的に言えば、スクリーニング法には例えばポリペプチドに結合するか、阻害剤または活性化剤のポリペプチドへの結合を阻止するか、ポリペプチドと阻害剤または活性化剤の会合を増加するか、またはポリペプチドの発現を活性化または阻害することによる、本発明のポリペプチドの活性を調節する複数の薬剤のスクリーニングが含まれる。
本発明のポリペプチドの全長またはその断片を発現する任意の細胞を、調節因子を同定するために使用し得る。ある実施形態では、細胞は本発明の相同ポリペプチドを発現する真核細胞株(例えばCHO)である。ある実施形態では、本発明の内因性ポリペプチドを発現する細胞(例えばCD4)がスクリーニングに使用される。他の実施形態では、調節因子をそのHIV複製阻害剤活性でスクリーニングする。
(a)ペプチド結合アッセイ)
本発明のポリペプチドに結合し得る薬剤についてスクリーニングすることによって予備スクリーニングを行うことができる。なぜなら、そのようにして同定された薬剤の少なくともいくつかが本発明のポリペプチドの調節因子である可能性があるからである。結合アッセイもまた、例えば、本発明のポリペプチドと相互作用する内因性タンパク質の同定に有用である。例えば、本発明のポリペプチドと結合する抗体、受容体または他の分子を、結合アッセイにおいて同定することができる。
本発明のポリペプチドに結合し得る薬剤についてスクリーニングすることによって予備スクリーニングを行うことができる。なぜなら、そのようにして同定された薬剤の少なくともいくつかが本発明のポリペプチドの調節因子である可能性があるからである。結合アッセイもまた、例えば、本発明のポリペプチドと相互作用する内因性タンパク質の同定に有用である。例えば、本発明のポリペプチドと結合する抗体、受容体または他の分子を、結合アッセイにおいて同定することができる。
結合アッセイは通常、本発明のポリペプチドを1またはそれより多い試験薬剤と接触させ、十分な時間をかけてタンパク質と試験試薬に結合複合体を形成させることを包含する。形成した任意の結合複合体を、確立された任意の数のアッセイ技術を用いて検出することができる。タンパク質結合アッセイには非変性SDSポリアクリルアミドゲル上で共沈殿または共泳動、またはウエスタンブロット上で共泳動を測定する方法が含まれるが、それに限定されない(例えばBennet、J.P.およびYamamura、H.I.(1985)、“Neurotransmitter、Hormons and Drug or Drug Receptor Binding Methods”、Neurotransmitter Receptor Binding(Yamamura H.I.ら編集)、pp61−89参照)。他の結合アッセイには本発明のポリペプチドに結合した分子または標識基材の移動を同定するためのマススペクトルまたはNMR技術が含まれる。このようなアッセイにおいて利用される本発明のポリペプチドは、天然で発現され得、クローニングされ得、または合成され得る。
ある実施形態では、高スループット結合アッセイがデフェンシンに結合する分子を同定するために行われるが、その場合、デフェンシンタンパク質またはその断片を潜在的調節因子と接触させ、適切な時間インキュベーションし、デフェンシンと分子間の結合を検出するおよび/または定量する。ある実施形態では、潜在的調節因子を固体詩自体に結合し、デフェンシンタンパク質を添加する。他の実施形態では、デフェンシンタンパク質を固体支持体に結合する。下記の様に、低分子量有機分子、ペプチド、抗体およびデフェンシンリガンドアナログを含む様々な調節因子を使用し得る。デフェンシン−調節因子結合を同定するために様々なアッセイを用いることができるが、その方法には標識タンパク質−タンパク質アッセイ、電気泳動易動度の変化、免疫アッセイ、キナーゼアッセイ等の酵素アッセイが含まれる。ある場合は、候補調節因子の結合が競合結合アッセイを用いて測定されるが、その場合、既知のリガンドまたは基材による結合の妨害が潜在的調節因子の存在で測定される。調節因子、または既知のリガンドまたは基材のいずれかが最初に結合し、次いで競合剤が添加される。デフェンシンタンパク質を洗浄後、潜在的調節因子、または既知のリガンドまたは基材のいずれかの結合が測定される。多くの場合、潜在的調節因子、または既知のリガンドまたは基材が標識される。ある実施形態では、アッセイは上記のタイトル「2.デフェンシンポリペプチドのSELDI検出」にある様なSELDIに基づくアッセイである。このようなアッセイでは、デフェンシン/試験化合物ペアのメンバーの一つがSELDI系バイオチップ(例えばCiphergen Biosystems、Inc.のプレ活性化ProteinChipアレイ)の表面に結合し、他のメンバーがチップの表面と接触する。ペア間の結合がSELDIで検出される。例えば、デフェンシンポリペプチドをバイオチップの表面に結合し、試験化合物のライブラリーを結合デフェンシンに晒すことができる。結合しない分子を洗い流す。次いで結合した分子をSELDIで検出する。
高スループットスクリーニングのアッセイには多数の潜在的治療用化合物(潜在的調節因子またはリガンド化合物)を含む低分子量有機分子またはペプチドのコンビナトリアルライブラリーを提供する工程が含まれる。このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」または「リガンドライブラリー」を本明細書記載の少なくとも一つのアッセイでスクリーニングし、所望の特性活性を示すこれらのライブラリーメンバー(特定の化学種またはサブクラス)を同定する。このようにして同定された化合物は通常の“リード化合物”となるか、またはそれ自体を潜在的または実際の治療薬として使用することができる。
コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬等のいくつかの化学的「建築ブロック」の組み合わせによる化学合成または生合成で生成した多様な化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチド大部ラリー等の線形コンビナトリアル化学ライブラリーが、一定の化合物の長さ(すなわちポリペプチド化合物中のアミノ酸数)に対するあらゆる可能な方法で化学的建築ブロック(アミノ酸)を組み合わせて形成される。このような化学的建築ブロックの組み合わせ混合により、何百万の化合物を合成することが可能である。
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製とスクリーニングは当業者に公知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーにはペプチドライブラリー(米国特許第5、010、175号;Furka、Int.J.Pept.Prot.Res.,37:487−493(1991);およびHoughtonら、Nature、354:84−88(1991))が含まれるが、それらに限定されない。化学的に多様なライブラリーを生成するための他の化学も使用される。このような化学にはペプトイド(例えばPCT公開番号WO91/19735)、コードされたペプチド(例えばPCT公開番号WO93/20242)、ランダムバイオオリゴマー(例えばPCT公開番号WO92/00091)、ベンゾジアゼピン(例えば米国特許第5、288、514号)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド等のダイバーソマー(diversomer)(Hobbsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:6909−6913(1993))、ビニロガスポリペプチド(Hagiharaら、J.Amer.Chem.Soc.、114:6568(1992))、グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチド模倣体(Hirschmannら、J.Amer.Chem.Soc.、114:9217−9218(1992))、低分子量化合物ライブラリーの類似有機合成(Chenら、J.Amer.Chem.Soc.、116:2661(1994));オリゴカルバメート(Choら、Science、261:1303(1993))、および/またはペプチジルホスフォネート(Campbellら、J.Org.Chem.、59:658(1994))、核酸ライブラリー(Ausubel、BergerおよびSambrook、前出参照)、ペプチド核酸ライブラリー(例えば米国特許第5、539、083号参照)、抗体ライブラリー(例えばVaughnら、Nature Biotechnology、14(3):309−314(1996)およびPCT/US96/10287参照)、炭化水素ライブラリー(例えばLiangら、Science、247:1520−1522(1996)および米国特許第5、593、853号参照)、低分子量有機分子ライブラリー(たとえばベンゾジアゼピン、Baum、C&EN、Jan.18、page33(1993));イソプレノイド、米国特許第5、569、588号;チアゾリジオンおよびメタチアザノン、米国特許第5、549、974号;ピロリジン、米国特許第5、525、735号および第5、519、134号;モルホリノ化合物、米国特許第5、506、337号;ベンゾジアゼピン、米国特許第5、288、514号等)が含まれるがそれらに限定されない。
コンビナトリアルライブラリーの調製装置は市販されている(例えば357MPS、390MPS、Advanced Chem Tech、Louisville KY、Symphony、Rainin、Woburn、MA、433A、AppliedBiosystems、Foster City、CA、9050 Plus、Millipore、Bedford、MA参照)。さらに、様々なコンビナトリアルライブラリー自体が市販されている(例えばComGenex、Princeton、N.J.、Asinex、Moscow、Ru、Tripos、Inc.、St.Louis、MO、ChemStar、Ltd.、Moscow、RU、3D Pharmaceuticals、Exton、PA、Martek Bioscience、Columbia、MD等参照)。
さらに、哺乳動物または酵母2重ハイブリッド法(例えばBartel、P.L.ら、Methods Enzymol.、254:241(1995))も、ポリペプチドまたは宿主細胞中の共発現により相互作用または結合する他の分子を同定するために用いられる。
(b)ポリペプチドの活性)
本発明のポリペプチドの活性を様々なインビトロおよびインビボのアッセイを用いて評価し、機能的、化学的および物理的効果、すなわち酵素活性、細胞増殖(例えばCD4+リンパ球増殖)、HIV複製、HIVタンパク質の発現、またはリガンドまたは基材結合を測定することができる。さらに、このようなアッセイを本発明のポリペプチドの阻害剤および活性化剤の評価に使用できる。調節因子も本発明のポリペプチドの遺伝的に変化したバージョンである。
本発明のポリペプチドの活性を様々なインビトロおよびインビボのアッセイを用いて評価し、機能的、化学的および物理的効果、すなわち酵素活性、細胞増殖(例えばCD4+リンパ球増殖)、HIV複製、HIVタンパク質の発現、またはリガンドまたは基材結合を測定することができる。さらに、このようなアッセイを本発明のポリペプチドの阻害剤および活性化剤の評価に使用できる。調節因子も本発明のポリペプチドの遺伝的に変化したバージョンである。
アッセイのポリペプチドを、本明細書に記載の寄託番号または配列番号1〜24でコードされる配列を有するポリペプチド、またはその保存修飾されたその改変体から選択する。または、デフェンシンタンパク質を真核細胞から誘導し、そのタンパク質には本明細書に記載の寄託番号と実質的に同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸部分配列が含まれる。一般にアミノ酸配列同一度は少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、70%、75%、80%、85%または90%、最も好ましくは少なくと95%である。必要に応じてアッセイのポリペプチドは細胞外ドメイン、膜横断ドメイン、細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン、サブユニット会合ドメイン、活性部位等の本発明のポリペプチド断片を有する。本発明のポリペプチドまたはそのドメインの何れかは相同タンパク質に共有結合し、本明細書に記載のアッセイに用いられるキメラタンパク質を形成する。
ポリペプチド活性の調節因子が、本発明の組換えまたは天然に存在するポリペプチドの何れかを用いて試験される。天然に存在するかまたは組換えタンパク質は単離され、細胞中で発現し、細胞由来の膜中で発現し、組織または動物中で発現する。例えば、組織切片、例えばポリペプチド本発明のポリペプチドを発現する組織由来の解離細胞、形質転換細胞、または膜を使用できる。本明細書に記載のインビトロまたはインビボでのアッセイの何れかを用いて調節を試験することができる。
本発明のポリペプチドに結合する調節因子、ドメインまたはキメラタンパク質を溶液中、二重膜中、固相に付着、脂質一重膜中またはビヒクル中で試験することができる。調節因子の結合を例えば分光学的特性(例えば蛍光、吸光度、屈折率)の変化、流体力学(例えば形状)、クロマトグラフィーまたは溶解度を用いて試験することができる。
潜在的調節因子(例えば「試験化合物」)で処理される試料またはアッセイを、試験化合物を含まない対照試料と比較し、調節の程度を調べる。対照試料(活性化剤または阻害剤で未処理)には相対活性100が割り当てられる。対照に対する活性値が約90%、必要に応じて50%または25〜0%の場合、本発明のポリペプチドが阻害されたものとする。対照に対する活性値が110%、必要に応じて150%、200%、300%、400%、500%、または1000〜2000%である場合、本発明のポリペプチドが活性化されたものとする。
(c)発現アッセイ)
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する化合物のスクリーニングもまた提供される。スクリーニング法は、一般に試験化合物が本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現する少なくとも1種の細胞と接触する細胞に基づくアッセイを行う工程、および続いて発現(転写または転移生成物)の増加または減少を検出する工程を含む。本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを発現する任意の細胞を用いてアッセイを行うことができる。発現は、多数の異なる方法において検出され得る。以下述べる様に、本発明のポリヌクレオチドの転写生成物(またはそれから誘導された相補核酸)と特異的にハイブリダイゼーションするプローブを用いて、本発明のポリヌクレオチドの細胞中の発現レベルを細胞中で発現したmRNAを探査して測定することができる。細胞を溶菌しノーザンブロットを行うか、または細胞を溶菌せずインサイチュハイブリダイゼーション技術を用いて探査を行うことができる。または、細胞溶菌物をポリペプチドに特異的に結合する抗体で探索する免疫学的方法を用いて、本発明のポリペプチドを検出することができる。
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する化合物のスクリーニングもまた提供される。スクリーニング法は、一般に試験化合物が本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現する少なくとも1種の細胞と接触する細胞に基づくアッセイを行う工程、および続いて発現(転写または転移生成物)の増加または減少を検出する工程を含む。本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを発現する任意の細胞を用いてアッセイを行うことができる。発現は、多数の異なる方法において検出され得る。以下述べる様に、本発明のポリヌクレオチドの転写生成物(またはそれから誘導された相補核酸)と特異的にハイブリダイゼーションするプローブを用いて、本発明のポリヌクレオチドの細胞中の発現レベルを細胞中で発現したmRNAを探査して測定することができる。細胞を溶菌しノーザンブロットを行うか、または細胞を溶菌せずインサイチュハイブリダイゼーション技術を用いて探査を行うことができる。または、細胞溶菌物をポリペプチドに特異的に結合する抗体で探索する免疫学的方法を用いて、本発明のポリペプチドを検出することができる。
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルまたは活性は、ベースライン値と比較され得る。ベースライン値は対照試料の値であるか、または特定の集団(例えばプログレッサー)または細胞(例えば調節因子に晒されない組織培養細胞)に対する本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルの代表値である統計値である。このような細胞に基づく分析に適した細胞にはPBMC、リンパ球(たとえばCD4+)、好中球、多形核白血球、および他の食細胞および食細胞株、例えばJurkat細胞、BJAB細胞等が含まれる。デフェンシンタンパク質は天然起原、化学合成または組換えデフェンシンである。
(d)動物法)
HIV感染の動物モデルもデフェンシンの調節因子のスクリーニングに用いられる。同様に、遺伝子ノックアウト技術を含むトランスジェニック動物技術、例えば適切な遺伝子標的化ベクターによる相同組換えまたは遺伝子過剰発現により、デフェンシンタンパク質が発現しないか、発現が増加する結果となる。ノックアウト細胞を作成するためにも、同じ技術が応用される。
HIV感染の動物モデルもデフェンシンの調節因子のスクリーニングに用いられる。同様に、遺伝子ノックアウト技術を含むトランスジェニック動物技術、例えば適切な遺伝子標的化ベクターによる相同組換えまたは遺伝子過剰発現により、デフェンシンタンパク質が発現しないか、発現が増加する結果となる。ノックアウト細胞を作成するためにも、同じ技術が応用される。
ノックアウト細胞とトランスジェニックマウスを、マーカー遺伝子または他の相同遺伝子をマウスゲノム中の内因性デフェンシン遺伝子部位へ相同組換えにより挿入することにより作成できる。内因性デフェンシンをデフェンシン遺伝子の変異体で置換する、または内因性デフェンシンを変異させる、例えば癌遺伝子に晒すことにより、このようなマウスを作製することもできる。
DNAコンストラクトを胚性幹細胞の核中へ導入する。新しく遺伝子操作された遺伝的障害を含む細胞を宿主マウス胚中へ注入し、それを受容体である雌マウス中に再移植する。これらの胚のあるものは、部分的に変異細胞株由来の生殖細胞を有するキメラマウスに成長する。従って、キメラマウスを飼育することにより、導入された遺伝的障害を含む新しい株を得ることが可能である(例えばCapecchiら、Science、244:1288(1989)参照)。キメラ標的マウスをHoganら、Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)およびTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach、Robertson編集、IRL Press、Washington、D.C.、(1987)に従って誘導することができる。
(e)固相および可溶高スループットアッセイ)
本発明の高スループットアッセイでは、一日に7000個までの異なった調節因子またはリガンドをスクリーニングすることができる。具体的には、マイクロタイタープレートの各ウエルを用いて選ばれた潜在的調節因子の独立した分析を行う、または濃度またはインキュベーション時間の影響を観察する場合、5〜10個のウエルで1個の調節因子を試験することができる。従って、1枚の標準マイクロタイタープレートで約100種(例えば96種)の調節因子をアッセイすることができる。1536ウエルプレートを使用した場合、1枚のプレートで約100〜1500種の異なった化合物を容易にアッセイすることができる。一日あたり数枚の異なったプレートのアッセイ;または本発明の複合システムを用いて6、000〜20、000以上のアッセイスクリーニングが可能である。さらに、試薬操作の微小流体法を用いることができる。
本発明の高スループットアッセイでは、一日に7000個までの異なった調節因子またはリガンドをスクリーニングすることができる。具体的には、マイクロタイタープレートの各ウエルを用いて選ばれた潜在的調節因子の独立した分析を行う、または濃度またはインキュベーション時間の影響を観察する場合、5〜10個のウエルで1個の調節因子を試験することができる。従って、1枚の標準マイクロタイタープレートで約100種(例えば96種)の調節因子をアッセイすることができる。1536ウエルプレートを使用した場合、1枚のプレートで約100〜1500種の異なった化合物を容易にアッセイすることができる。一日あたり数枚の異なったプレートのアッセイ;または本発明の複合システムを用いて6、000〜20、000以上のアッセイスクリーニングが可能である。さらに、試薬操作の微小流体法を用いることができる。
関心のある分子(例えば本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、またはその調節因子)を直接または間接的に、共有結合または非共有結合により、例えばタグ経由して固相部品に結合することができる。タグは様々な化合物の任意のものである。一般的に、タグに結合する分子(タグバインダー)を固体支持体に固定し、関心のあるタグ付き分子をタグとタグバインダーとの相互作用により固体支持体に付着させる。
文献に十分に記載された公知の分子間相互作用に基づき、多数のタグとタグバインダーを使用できる。例えば、タグがビオチン、プロテインAまたはプロテインG等の天然タグバインダーを有する場合、それらを適切なタグバインダー(アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、免疫グロブリンのFc領域、ポリHis等)と組み合わせて使用できる。分子に対する抗体とビオチン等の天然バインダーとの組み合わせも広く使用され、適切なタグバインダーである(SIGMA Immunochemical1998年カタログ、SIGMA、St.Louis、MO参照)。
同様に、任意のハプテンまたは抗原化合物を適切な抗体と組み合わせて使用し、タグ/タグバインダーペアを形成することもできる。数千の特異性抗体が市販され、その他多くの抗体が文献に記載されている。例えば、ある共通の形態では、タグは第1抗体であり、タグバインダーは第1抗体を認識する第2抗体である。抗体−抗原相互作用に加えて、受容体−リガンド相互作用もタグとタグバインダーのペアとして適切であり、それらは例えば細胞膜受容体の作動物質と拮抗物質(例えばトランスフェリン、c−キット、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体と抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー等の細胞受容体−リガンド相互作用;例えばPigottおよびPower、The Adhesion Molecule Facts Book I(1993)参照)である。同様に、トキシンおよび毒素、ウイルスエピトープ、ホルモン(例えばオピエート、ステロイド等)、細胞間受容体(例えばステロイド、胸腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンDを含む様々な低分子量リガンドの効果を調節する受容体;ペプチド)、薬剤、レクチン、糖、核酸(洗浄および環状の双方)、オリゴ糖、タンパク質、燐脂質および抗体も様々な細胞受容体と相互作用し得る。
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミドおよびポリアセテート等の合成ポリマーもまた適切なタグまたはタグバインダーを形成し得る。本発明の開示を読むことにより当業者が理解し得るように、その他多くのタグ/タグバインダーペアも本明細書記載のアッセイシステムに有用である。
約5〜200アミノ酸間のポリgly配列等のポリペプチド配列を含むポリペプチド、ポリエーテル等の一般のリンカーもタグとなり得る。このような柔軟なリンカーも当業者に公知である。例えば、ポリ(エーテルグリコール)リンカーがShearwater Polymers、Inc.、Huntsville、Alabamaより市販されている。これらのリンカーはアミド結合、スルフヒドリル結合またはヘテロ官能基結合を有することもある。
タグバインダーを現在利用し得る様々な方法の何れかを用いて固体基材に固定する。一般的に、タグバインダーの一部と反応性である化学基を表面に固定する化学薬剤に基材の全てまたは一部を晒して、固体基材が誘導体化または官能化される。例えば、長い鎖部分に結合するのに適した化学基はアミン、ヒドロキシル、チオールおよび刈る僕知る基である。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランをガラス表面等の様々な表面を官能化するために使用できる。このような固相バイオポリマーアレイの構築は文献に十分に記載されている(例えばMerrifield、J.Am.Chem.Soc.、85:2149−2154(1963)、例えばペプチドの固相合成を記載;Geysenら、J.Immun.Metho.、102:259−274(1978)、ピン上の固相化合物の合成を記載;FrankおよびDoring、Tetrahedron、44:6031−6040(1988)、セルロース円盤上の様々なペプチドの合成を記載;Fodorら、Science、251:767−777(1991);Sheldonら、Clinical Chemistry、39(4):718−719(1993);およびKozalら、Nature Medicine、2(7):753−759(1996)、両者とも固体基材に固定化したバイオポリマーアレイを記載)。タグバインダーを基材に固定する非化学的アプローチには熱、紫外線による架橋等の他の一般の方法が含まれる。
本発明は、本発明のポリペプチドの発現または活性を調節し得る化合物を高スループットフォーマットで同定するためのインビトロアッセイ、例えばELISA等の免疫アッセイを提供する。潜在的調節因子を含まない細胞内の本発明のポリペプチドの活性を測定する対照反応は、分析が極めて均一であれば随意である。このような随意の対照反応は分析の信頼性を増加させるに適している。従って、ある実施形態では、本発明の方法にはこのような対照反応が含まれる。記載される分析フォーマットのそれぞれでは、調節因子を含まない「調節因子なし」の対照反応により結合活性のバックグラウンドレベルが得られる。
あるアッセイでは、陽性対照試料を使用することが望ましい。少なくとも2つの型の陽性対照試料が適切である。まず、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの既知の活性化剤をアッセイ試料の一つとインキュベーションし、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性増加レベルから得られた増分を本明細書に記載の方法で測定する。次に、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの既知の阻害剤を添加し、得られた本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現または活性シグナルの減少分を同様に検出する。調節因子も活性化剤または阻害剤と結合可能であり、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの既知の調節因子の存在で生じる増加または減少を阻害する調節因子を見出し得ることが分かる。
(H.デフェンシンと相互作用する分子のアッセイ)
デフェンシンポリペプチドの調節因子を同定するために使用することのできるアッセイを提供する他に、本発明はデフェンシンポリペプチドと相互作用する分子のアッセイも提供する。α−デフェンシンと相互作用するCD4+細胞由来の分子は、α−デフェンシンの抗ウイルス活性に重要であり、従って薬学的介入についての適切な標的である。従って、本発明はこのような分子を検出するための分析法を提供する。その方法には抗ウイルス反応を誘発するに十分な時間、CD4+細胞をα−デフェンシンに晒す工程と、次いでα−デフェンシンを結合する分子をCD4+細胞または細胞を培養する培養液から捕捉する工程が含まれる。α−デフェンシンに結合する分子を間接的または直接的に捕捉することができる。
デフェンシンポリペプチドの調節因子を同定するために使用することのできるアッセイを提供する他に、本発明はデフェンシンポリペプチドと相互作用する分子のアッセイも提供する。α−デフェンシンと相互作用するCD4+細胞由来の分子は、α−デフェンシンの抗ウイルス活性に重要であり、従って薬学的介入についての適切な標的である。従って、本発明はこのような分子を検出するための分析法を提供する。その方法には抗ウイルス反応を誘発するに十分な時間、CD4+細胞をα−デフェンシンに晒す工程と、次いでα−デフェンシンを結合する分子をCD4+細胞または細胞を培養する培養液から捕捉する工程が含まれる。α−デフェンシンに結合する分子を間接的または直接的に捕捉することができる。
直接法では、α−デフェンシンに晒した後に細胞由来の物質を固定化α−デフェンシン、例えば誘導体化ビーズまたはProteinChipアレイ等の親和性バイオチップに晒す。α−デフェンシンに結合する任意の分子が固相上に捕捉される。次いで固相を洗浄して未結合物質を洗浄し、α−デフェンシンに結合した分子を溶離し、検出のために知られる多くの方法の何れかで検出する。
直接法では、α−デフェンシンに晒した後に細胞由来の物質をα−デフェンシンを捕捉する捕捉剤に晒す。例えば、この物質はそれ自体が固相上に捕捉され得る、溶液中の固定化抗α−デフェンシン抗体または抗α−デフェンシン抗体である。このようにして、α−デフェンシンに結合した任意の分子がα−デフェンシンと共に捕捉される。次いで固相を洗浄して未結合物質を洗浄し、α−デフェンシンに結合した分子を溶離し検出することができる。
(I.キット)
本発明はデフェンシン検出用のキットも提供する。このようなキットは例えば診断または予防試験に有用である。キットには一般にデフェンシンを捕捉し、固相上の捕捉分子を検出するために用いられる固相が含まれる。従って、このような固相を抗デフェンシン抗体で誘導体化するか、またはキットに基材が誘導体化される抗体が含まれる。このような固相にはマイクロタイタープレート、ビーズまたはマススペクトルに用いられるバイオチップ、例えばCipergen Biosystems、Inc.から入手できるProteinChipアレイ(例えばPSI ProteinChipまたはPS2 ProteinChipアレイ)が含まれる。少なくとも2種の異なったデフェンシン、または少なくとも3種の異なったデフェンシン用の捕捉剤または検出剤を含むキットが特に有用である。α−デフェンシンの場合は、単一の抗体がその共通の配列によりα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3を捕捉することができる。これらのデフェンシンの識別は、質量で区別できるマススペクトル、またはα−デフェンシンのアミノ末端を特異的に指向する抗体を用いるサンドイッチ免疫分析で行うことができる。キットには試料中のデフェンシンを検出し定量するための説明書と、検出された量を予防またはHIV感染状況に検出量と関連付ける説明書も含まれる。
本発明はデフェンシン検出用のキットも提供する。このようなキットは例えば診断または予防試験に有用である。キットには一般にデフェンシンを捕捉し、固相上の捕捉分子を検出するために用いられる固相が含まれる。従って、このような固相を抗デフェンシン抗体で誘導体化するか、またはキットに基材が誘導体化される抗体が含まれる。このような固相にはマイクロタイタープレート、ビーズまたはマススペクトルに用いられるバイオチップ、例えばCipergen Biosystems、Inc.から入手できるProteinChipアレイ(例えばPSI ProteinChipまたはPS2 ProteinChipアレイ)が含まれる。少なくとも2種の異なったデフェンシン、または少なくとも3種の異なったデフェンシン用の捕捉剤または検出剤を含むキットが特に有用である。α−デフェンシンの場合は、単一の抗体がその共通の配列によりα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3を捕捉することができる。これらのデフェンシンの識別は、質量で区別できるマススペクトル、またはα−デフェンシンのアミノ末端を特異的に指向する抗体を用いるサンドイッチ免疫分析で行うことができる。キットには試料中のデフェンシンを検出し定量するための説明書と、検出された量を予防またはHIV感染状況に検出量と関連付ける説明書も含まれる。
以下の実施例は説明のために提示されるが、本願発明を限定しない。
(実施例I)
(材料および方法)
CD8+T細胞およびそれらの刺激された培養上澄の調製:静脈血液試料を、13年間以上HIV−1に感染していた(CD4およびウイルス負荷)にも拘わらず健康なままであった2名の長期生存者から採集した。さらなる血液試料を4名のHIV−1感染進行者から抗ウイルス治療前に(CD4およびウイルス負荷)、また15名の未感染正常個体から採集した。次いで末梢血単核細胞(PBMC)を標準Ficoll/Hypaque勾配遠心分離によって分離した。CD8+T細胞を、抗CD8モノクローナル抗体被覆磁気ビーズ(Dynal、Lake Success、NY)を用いる陽性選択でPBMCから単離した。次いで、Detach−a−Bead(Dynal)によりビーズを細胞から除去した。この手順で得た細胞の純度は、FACSで判定して99.5%を超えていた。単離したCD8+T細胞を加湿CO2インキュベーター中、37℃で3日間、0.1μg/ml抗CD3(12F6;MITのJohnsonより提供)および5μl/mlの抗CD28(Becton Dickinson)抗体と、同じ数の同種異系照射PBMCと共に、組換えIL−2(20U/ml)、ペニシリン(100U/ml)およびストレプトマイシン(100μg/ml)を補充した無血清RPMI 1640培地(Cellgro)中で刺激した。培養上澄を集め、3000rpmで5分間の短時間の遠心分離によって透明にし、使用するまで−80℃で保存した。
(材料および方法)
CD8+T細胞およびそれらの刺激された培養上澄の調製:静脈血液試料を、13年間以上HIV−1に感染していた(CD4およびウイルス負荷)にも拘わらず健康なままであった2名の長期生存者から採集した。さらなる血液試料を4名のHIV−1感染進行者から抗ウイルス治療前に(CD4およびウイルス負荷)、また15名の未感染正常個体から採集した。次いで末梢血単核細胞(PBMC)を標準Ficoll/Hypaque勾配遠心分離によって分離した。CD8+T細胞を、抗CD8モノクローナル抗体被覆磁気ビーズ(Dynal、Lake Success、NY)を用いる陽性選択でPBMCから単離した。次いで、Detach−a−Bead(Dynal)によりビーズを細胞から除去した。この手順で得た細胞の純度は、FACSで判定して99.5%を超えていた。単離したCD8+T細胞を加湿CO2インキュベーター中、37℃で3日間、0.1μg/ml抗CD3(12F6;MITのJohnsonより提供)および5μl/mlの抗CD28(Becton Dickinson)抗体と、同じ数の同種異系照射PBMCと共に、組換えIL−2(20U/ml)、ペニシリン(100U/ml)およびストレプトマイシン(100μg/ml)を補充した無血清RPMI 1640培地(Cellgro)中で刺激した。培養上澄を集め、3000rpmで5分間の短時間の遠心分離によって透明にし、使用するまで−80℃で保存した。
(細胞培養上澄のProteinChip(登録商標)アレイ分析)各ProteinChipアレイは、複雑な混合物からタンパク質/ペプチドを選択的に捕捉するために設計された別々の化学的(イオン性、疎水性、親水性等)または生物学的(抗体、受容体、DNA等)特性を有する。我々の実験では、最初に弱陽イオン交換体(WCX2)、強陰イオン交換体(SAX2)、固定化金属親和性捕捉剤(IMAC−3)および逆相H4(Ciphergen)を含め複数種類の多重型ProteinChipアレイを使用した。WCX2アレイを、培養上澄からタンパク質/ペプチド種の検出における我々が入手した高い再現性のために、全体の実験について最終的に選んだ。具体的には100μlの培養上澄を等容積の結合緩衝液(100mM NaAc、pH4.5;PBS中0.2%Triton X−100)と混合した。次いで、混合物をバイオプロセッサー(Ciphergen)を経てWCX2アレイにアプライし、水平に一定速度で振盪して4°Cで終夜インキュベートした。未結合タンパク質/ペプチドを結合緩衝液(50mM NaAc、pH4.5;PBS中0.1%Triton X−100)で各5分間3回、同じ温度および振盪条件で洗浄して除去した。次いで、WCX2アレイをバイオプロセッサーから取り外し、1mM HEPES(pH4.5)で30秒間リンスし、風乾した。乾燥後、50%アセトニトリルおよび0.5%トリフルオロ酢酸中の3,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシ桂皮酸(SPA)の飽和溶液をチップ表面に加えた。SPAは、表面増強レーザー脱着/イオン化(SELDI)質量分析法(Ciphergen)で検出される、捕捉されたタンパク質/ペプチドに対するエネルギー吸収分子として作用する。次いで、アレイをCiphergen Protein Biological System II(PBSII)中に置き、ナノ秒レーザーパルスを発生して窒素レーザー(337nm)からSPAとタンパク質/ペプチドとの混合物に発射した。レーザー強度220〜240で平均80回のレーザーショットを用いて、タンパク質/ペプチドのマススペクトルを得た。アレイ表面に捕捉された各タンパク質/ペプチドの質量対電荷比(M/Z)を、CiphergenのAGR−8−バソプレッシン(1,084.3Da)、ソマトスタチン(1,637.9Da)、ウシインスリンβ鎖(3,495.9Da)、ヒトインスリン(5,807.7Da)およびヒルジン(7,033.6Da)(Ciphergen)で補正した外部タンパク質/ペプチド標準に従って決定した。
(抗体被覆ビーズを用いるタンパク質の同定、続いてSELDI ProteinChip(登録商標)解析)Dynalビーズを、メーカーの指示書に従い、ヒト好中球(α)デフェンシン特異性抗体またはヒトマクロファージ炎症タンパク質(MIP)1α特異性抗体で被覆した。簡単に言えば、ヒト好中球デフェンシン1〜ヒト好中球デフェンシン3に特異的なビオチン化抗体(クローンD21、HyCult biotechnology)をPBS(0.1%Tween20を含む)中のBiotin−Binder Dynabeads(Dynal)と混合し、室温で30分間回転させた。未結合抗体をPBS(0.1%Tween20を含む)で3回洗浄して除去した。さらに、0.1Mホウ酸緩衝液(pH7.0〜7.5)中、4℃で終夜回転させてヒトMIP−1α特異性抗体(R&D systems)をDynabeads M−450 Epoxy(Dynal)に直接結合させた。15〜30分間のインキュベーション後、0.5%BSAを加えて抗体を最適に配向させた。次いで抗体被覆ビーズを0.1%BSA(pH7.4)を含むPBSで3回洗浄した。107個のビーズ毎に約2〜5μgの各抗体が必要であった。次いで、抗体被覆ビーズ(約4×107個)をそれぞれ、0.01%のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(CETAB、Sigma、St.Louis、MO)の存在下で刺激されたCD8+T細胞由来の200μlの培養上澄と混合し、4℃で終夜回転させた。次いで、抗原−抗体複合体被覆ビーズを磁石(Dynal)で上澄から除去し、残りの上澄をWCX2アレイにアプライして上記の様にSELDIで分析した。
(Qq−TOFによる抗ウイルス分析およびタンパク質同定のための刺激されたCD8+T細胞由来の富化および枯渇細胞培養物の調製)BioSepra Q−HyperDカラム(Ciphergen)を、10%アセトニトリル(CAN)および0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含む50mM Tris HCl(pH8.0)で平衡化し、洗浄した。推定されるα−デフェンシンペプチドを富化するため、培養上澄を50mM Tris HCl(pH8.0)中の50%アセトニトリルと混合し、カラムにアプライした。流出液を集め、同じ緩衝液で5倍に希釈し、BioSepra逆相C18カラムに直接アプライした。結合したタンパク質/ペプチドを、0.1%TFAを含む50mM Tris HCl(pH8.0)を用い、溶液中のACN量を30%、40%、50%および60%から、最終的に80%の範囲で上昇させて溶出した。
(Micromass Q−TOFIIを用いるタンパク質の同定)50%ACNおよび0.1%TFAを含むBioSepra逆相C18カラムからの溶出画分。10%v/vの100mM炭酸水素アンモニウム緩衝液(pH8)を加えてTFAを中和し、次いで中和した溶出液を室温で30分間、急速に減圧して溶液が1マイクロリットル当たり約25フェムトモルのタンパク質/ペプチドになるまで濃縮した。次いで、濃縮された物質を50mM Tris HCl(pH8.6〜9)中、90℃で5分間、5mM DTTで還元したが、アルキル化を行わなかった。還元された混合物を室温に冷却し、40℃で2時間、0.6μg/μlのトリプシンで消化し、次いで氷上で反応を停止した。上記の反応を全て、不活性アルゴンガス下で行った。トリプシン消化生成物をCiphergen NP−20アレイに直接アプライし、タンパク質の正体をCiphergen PCI−1000 ProteinChip(登録商標)InterfaceによってMicromass Q−TOFIIで決定した。
(ウイルス阻害アッセイ)ウイルス阻害アッセイを偽タイプ単一サイクルウイルスおよびHIV−1感染患者から単離した複製能力のあるHIV−1株の双方を用い、CEM174細胞および/またはPBMCで行った。CEM174細胞株はHIV−1共受容体CXCR4およびCCR5の両方を発現する様に遺伝子操作されている。偽タイプウイルスを、ヒト胚腎臓細胞株293T中へのルシフェラーゼレポーターウイルス骨格pNL4−3LucR−E−とJR−FLまたはHXB2のいずれかに対する外被発現ベクターとによる共感染で作製した。2日後にウイルスを含む上澄を集め、上澄中のp24抗原レベルを標準プロトコール(参考文献)を用いて定量した。次いで上澄をアリコートに分け、使用するまで−80℃で保存した。偽タイプ単一サイクルウイルスを用いるウイルス阻害アッセイでは、感染前日に96ウエルプレート中に1ウエル当たり2×105個のCEM174細胞を接種した。ヒト好中球デフェンシン1またはヒト好中球デフェンシン2(American Peptide Company、Inc.、Sunnyvale、CA)の何れかを単独、またはそれらを組み合わせの存在下で、5ナノグラムのp24単一サイクルJR−FLまたはHXB2レポーターウイルスを各ウエルに接種した。可能な阻害機構を研究するため、ヒト好中球デフェンシンまたは刺激されたLTNPのCD8+T細胞由来の培養上澄をウイルスと同時に、または感染後に一定間隔で添加した。ウイルス侵入阻害剤T−20および非ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤UC−781も、ウイルスの生活環中の各ステップのタイミングを評価する実験に含まれた。最初の感染の3日後、細胞をPBSで洗浄し、50μlルシフェラーゼ溶菌緩衝液(Promega)中で分解し、検出感度を上げるため凍結−解凍を一回行った。3,000rpmで10分間の短い遠心分離工程の後、Promegaルシフェラーゼ分析システムおよびルミノメーター(Dynex Technonolgy、Inc.)を用いて25μlの細胞溶解産物をルシフェラーゼ活性について測定した。
複製能力のあるウイルスを用いるウイルス阻害アッセイでは、最初にPBMCを20μg/mlの濃度のPHAで3日間刺激した。1ウエル当たり約2×105個の細胞を、各ウイルスの100組織培養感染用量(TCID50)で、ヒト好中球デフェンシン1またはヒト好中球デフェンシン2単独またはその組み合わせの存在下にて96ウエルプレート中に播種した。いくつかの実験では、刺激されたLTNPのCD8+T細胞由来の培養上澄も含めた。37℃で2時間感染後、上澄中の残りのウイルスをPBSでよく洗浄して除去した。同じ濃度のヒト好中球デフェンシンを含む新鮮な培地、または刺激されたLTNPのCD8+T細胞由来の培養上澄を添加した。上澄中のp24抗原レベルを感染後0、3および7日目に標準プロトコールを用いて測定した。阻害した場合、しない場合で、ウイルス生産のピーク時、通常最初の感染後7日目に阻害パーセントを上澄中のp24レベルを比較して決定した。
(結果)
(LTNPおよび正常人由来のCD8+細胞で分泌された低分子量タンパク質クラスターの同定)3名のLTNP、および4名の感染進行者および15名のコントロール由来の刺激されたCD8 Tリンパ球培養物および刺激されないCD8 Tリンパ球培養物から培養上澄液を収穫した。化学的に修飾したアレイ表面と表面増強レーザー脱着/イオン化(SELDI)飛行時間(TOF)質量分析法(MS)検出との組み合わせに基づくProteinChip(登録商標)System(Ciphergen Biosystems,Inc.、Fremont、CA)を用いて各試料を分析した。この技術を選んだ理由は、分解能と再現性が良く、使い易くフェムトモルレベルの感度を有するためである。図1aに示す様に、2名のLTNPと1名の正常コントロールの代表的なタンパク質マススペクトルでは、刺激されたCD8上澄と刺激されないCD8上澄との間のピークパターンに有意差を示した。分子量3,371.9Da、3,442.5Daおよび3,486.5Daを有する2本または3本のピークのクラスターが、刺激された培養物で見出された。この分子クラスターは3名のLNTPの全て、および15名の正常個体のうち11名由来の刺激されたCD8 Tリンパ球の培養物中で検出されたが、4名の進行者由来の刺激された培養物中では検出されなかった(図1a)。後にMIP−1αと同定された7,815.0Daの独自のピークも、2名のLTNP由来の刺激された試料で検出された。8,000〜200、000Daで多くのピークが観察されたが、3つの試験グループについて、刺激されたCD8培養物と刺激されないCD8培養物との間で有意差は見出されなかった(データは示さず)。特に、8,000Daより大きなピークはCAF活性の存在と関連が全くなかった。
(LTNPおよび正常人由来のCD8+細胞で分泌された低分子量タンパク質クラスターの同定)3名のLTNP、および4名の感染進行者および15名のコントロール由来の刺激されたCD8 Tリンパ球培養物および刺激されないCD8 Tリンパ球培養物から培養上澄液を収穫した。化学的に修飾したアレイ表面と表面増強レーザー脱着/イオン化(SELDI)飛行時間(TOF)質量分析法(MS)検出との組み合わせに基づくProteinChip(登録商標)System(Ciphergen Biosystems,Inc.、Fremont、CA)を用いて各試料を分析した。この技術を選んだ理由は、分解能と再現性が良く、使い易くフェムトモルレベルの感度を有するためである。図1aに示す様に、2名のLTNPと1名の正常コントロールの代表的なタンパク質マススペクトルでは、刺激されたCD8上澄と刺激されないCD8上澄との間のピークパターンに有意差を示した。分子量3,371.9Da、3,442.5Daおよび3,486.5Daを有する2本または3本のピークのクラスターが、刺激された培養物で見出された。この分子クラスターは3名のLNTPの全て、および15名の正常個体のうち11名由来の刺激されたCD8 Tリンパ球の培養物中で検出されたが、4名の進行者由来の刺激された培養物中では検出されなかった(図1a)。後にMIP−1αと同定された7,815.0Daの独自のピークも、2名のLTNP由来の刺激された試料で検出された。8,000〜200、000Daで多くのピークが観察されたが、3つの試験グループについて、刺激されたCD8培養物と刺激されないCD8培養物との間で有意差は見出されなかった(データは示さず)。特に、8,000Daより大きなピークはCAF活性の存在と関連が全くなかった。
3,300〜3,500Daの間のピーククラスターをさらに特徴付けするため、LTNP被験体−3(LTNP−3)および正常コントロール番号−2(正常−2)由来の刺激されたCD8 T細胞からの培養上澄を、これらのタンパク質について上記の様に富化した。次に富化された物質をジチオトレイトール(DTT)、アクリルアミドまたはヨードアセトアミドで処理し、クラスター中の各タンパク質内のジスルフィド結合の存在を厳密に調べた。次いで、得られた材料をCiphergen NP−20アレイに直接アプライし、SELDI−TOF−MSで分析した。下記の表1は、DTTで還元した場合の正常−2で見出された3本のピークの分子質量の変化を示す。各ピークの質量は還元後に約6Da増加し(図6)、このことは、DTT還元により2個の水素原子が追加されて、破壊された各ジスルフィド結合毎に2個の遊離スルフヒドリル基を形成するため、クラスター中の全てのタンパク質が3個の内部ジスルフィド架橋を有することを示唆している。さらに、LTNP−3由来の培養上澄中で検出されたピークでは、アクリルアミドまたはヨードアセトアミドによる還元およびアルキル化により、分子質量がそれぞれ約434Daまたは349Da増加した。アクリルアミド(m.w.71)およびヨードアセトアミド(m.w.57)の分子量を考慮すると、観察された質量増加は6個の遊離スルフヒドリル基による各タンパク質への6個のアクリルアミドまたはヨードアセトアミド分子の付加と一致した。この結果は、クラスター中の各タンパク質における3本の分子間ジスルフィド架橋の存在をさらに確認した。
Micromass Qq−TOF MS−MSを用いる低分子量クラスタータンパク質ピークのタンパク質配列決定:この結論をさらに確認するため、アルキル化実験で以前に用いられた濃縮材料をトリプシンで消化し、タンデムマススペクトルで解析した。LTNP−3および正常−2双方由来のトリプシン消化材料は、対照と比較して関心のあるタンパク質クラスターを含まない独自の1060.50Da(図2b、右上挿入図)断片を生じた。この独自の断片をさらに選択し、MS−MS衝突セル中で衝突誘起解離によりより小さなイオンに分解した。この手法で生じた7個の独自にイオン(図2b)を、1060.50Da親イオンの理論的断片を探すためのタンパク質検索エンジン(図2bの注釈参照)で使用した。検索により、ヒトα−デフェンシン1、ヒトα−デフェンシン2およびヒトα−デフェンシン3のトリプシン消化断片と完全で明瞭な一致が得られた。事実、このペプチドはこれらの3種のペプチド間で保存され、アミノ酸位置16〜24由来の配列YGTCIYQGRに正確に対応する(図2b)。タンパク質配列決定により、LTNPおよび正常対照者由来のCR8T細胞を刺激後に上方制御されたタンパク質は、ヒトα−デフェンシンファミリーのメンバーであることが確認された。
ヒトα−デフェンシン1、ヒトα−デフェンシン2およびヒトα−デフェンシン3は、βケモカインに帰せられないCAFのHIV−1抑制活性に関与する。全CAF活性に対するα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3の相対的な寄与を評価するため、上記の様に特異的抗体で被覆したビーズを用いてLTNP−3およびLTNP−5由来の刺激されたCD8+T細胞の培養上澄からこれらの分子を選択的に消耗するか、メーカーの指示書(American Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)に従ってHiTrap親和性カラムを用いて培養上澄からα−デフェンシン1、−2および−3を消耗させるために親和性カラム(クローンD21(HyCult Biotechnology)由来のビオチン化モノクローナル抗体)を用いた。図3aではα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3の消耗前後の、様々な遺伝子型由来の株を含むX4およびR5 HIV−1パネルに対する抗ウイルス活性(2回の実験の平均)を比較する。ウイルス阻害分析を上記の様に行った。消耗前は、培養上澄は遺伝子型にかかわらず試験したX4ウイルスの全ての複製の約50〜60%を阻害することが可能であった。しかしながら、消耗後はX4ウイルスに対する阻害効果は完全に消滅し、α−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3がX4ウイルスに対する抑制活性の全てではないが、ほとんどに関与していることを示した。R5ウイルスに対しては、α−デフェンシン除去後は抗HIV−1活性が平均で約40%減少した(図3a)。
α−デフェンシン1および−2が10μMの濃度で両方のウイルスの複製を約15〜30%阻害し得ることも見出された。しかしながら、同様な濃度のα−デフェンシン1およびα−デフェンシン2を同時に添加した場合、阻害率は70%まで上昇し、これらの2種のデフェンシン間の相乗効果を示唆している。さらに、α−デフェンシンによる両方のウイルスの阻害は投与量に依存した。
次に、β−ケモカインを同時に添加する場合、または添加しない場合で、抗α−デフェンシン1、2、3抗体を培養液上澄に添加してCAF活性が投与量に依存して中和できるかどうかを調べた。LTNP−1およびLTNP−5由来のCD9上澄の抗HIV−1活性は、抗α−デフェンシン抗体の濃度が増加するにつれて減少した(図3b)。抗体濃度が25μg/mlに達した場合、試験した全てのX4ウイルスで、CAFの抑制効果は実際に消滅したが、同様な量の対照抗体は影響がなかった(データは示されない)。R5ウイルスに対する阻害活性も、α−デフェンシン抗体の量を増やして添加すると減少したが、その効果はX4ウイルスで観察されたほど大きくなかった(図3b)。R5ウイルスに対する残存活性がβ−ケモカインによるかどうかと言う可能性を確かめるため、LTNP−3およびLTNP−5由来の培養上澄を抗MIP−1α、MIP−1βおよびRANTESに対する抗体の混合物(1:1:1)の量を増やして、一定濃度(25μg/ml)のα−デフェンシン抗体と共に処理した。3種のR5単離体に対する残存抗ウイルス活性は、使用した抗体の最高濃度でほとんど完全に中和された(図3b、右パネル)が、対照抗体の添加は最少の効果であった(データを示さず)。まとめると、これらの結果は、α−デフェンシン1、2および3が、β−ケモカインに帰せられない、刺激されたCD8+Tリンパ球培養液中のほぼ全ての抗HIV−1活性に関与することを示した。
合成および精製ヒトα−デフェンシンが試験管内でHIV−1複製を阻害できる。次に我々は合成または精製されたα−デフェンシンの試験管内抗HIV−1活性に関心を転じた。α−デフェンシン1およびα−デフェンシン2の2つの製品が市販されている(American Peptide Company、Sunnyvale、CA)。これらの2種のα−デフェンシンの混合物(1:1)の濃度を増やすと、ウイルスの表現型または遺伝子型にかかわらずHIV−1の6種の単離体に対して大きな阻害が観察された(図4)。混合物に対する50%阻害濃度(IC50)は約111〜24μMの範囲であった。この混合物の抗ウイルス能は大きくないが、SELDI−TOF−MSで分かる様に、これらの市販品が純粋でなかったことに注意する必要がある(図7)。CD8+T細胞が生産したα−デフェンシンと比較して、市販製品は正しい分子質量を有するピーク以外の数本のピークを含んでいた。さらに、ほぼ正しい分子質量を有するピークでも、適切なジスルフィド架橋が形成されているかどうかの確信はない。従って、市販α−デフェンシン製品の抗HIV−1活性の特異性を保証するためには、これらのペプチドでウイルス阻害分析を抗α−デフェンシン抗体の存在下で繰り返した。図4(左のパネル)は、抗体が実際に市販ペプチドの活性を実質的に中和したことを示す。この結果は、抗ウイルス効果が市販製品中の日特異的不純物によるものではなく、活性は抗α−デフェンシンで中和される要素にあることを示唆する。健常者(36、39)の好中球から精製されたα−デフェンシン1、−2および−3の抗HIV−1活性も試験された。この製品は、LTNP−5由来のCD8T細胞の上澄に見出されたものとは、マススペクトルで実際に区別できないα−デフェンシンピークを含んでいた(図8)。そのデフェンシンも試験管内でHIV−1複製を阻害したが、IC50は約0.5〜2.2μMであり(図4、右パネル)、精製されたα−デフェンシンが市販製品よりHIV−1に対し約10〜20倍有効であることを示唆している。精製ヒト好中球α−デフェンシンの抗ウイルス効果も、α−デフェンシン特異性抗体の添加で実質的に減少するか消失した。
α−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3を発現するCD8Tリンパ球のサブセット:数人の正常な献血者から精製された好中球およびCD8T細胞を、α−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3の細胞内発現について免疫蛍光法で調べた。未刺激CR8Tリンパ球の分画は、細胞質顆粒中にこれらの分子を含んでいたが、好中球内で見出された量よりかなり少なかった(図5)。刺激すると、CD8T細胞のいくつかは、多分培養上澄中への分泌によりα−デフェンシン陽性顆粒を失うように思われる。CD8T細胞のわずかな割合が活性化され、α−デフェンシンをより多く発現した(図5;右端のセル)。
フローサイトメトリー分析により、約2.3%の未刺激αβCD8Tリンパ球はかなりのレベルのα−デフェンシンを発現することが分かった(図9)。刺激の1日後に、α−デフェンシン含有細胞のいくつかは検出されなくなった。しかしながら、免疫蛍光分析の結果と一致して、刺激後2日目により多い量のα−デフェンシンを発現するCD8T細胞群がかなりの割合(21.1%)で現れた。α−デフェンシン陽性CD8細胞のほとんどはγδまたはNKマーカーのないαβT細胞であった。これらの発見により、CD8T細胞が実際に存在しα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3を分泌することがさらに確認され、先天的免疫系および後天的免疫系の間のまた別な結合が確立される。
(実施例II)
本実施例は、HIV感染患者の血清中のα−デフェンシンレベルが予後診断マーカーとなることを示す。
本実施例は、HIV感染患者の血清中のα−デフェンシンレベルが予後診断マーカーとなることを示す。
HIV感染患者の血漿中のα−デフェンシンの発現レベルが変化するかどうかを測定する実験を行った。患者の血漿を採集し、SELDIおよびELISA(HNP1−3ELISA、Cell Science)の両方を用いて分析した。また、健常者由来の血漿(保存血漿、Sigmaに発注)も陽性対照として使用した。21名の患者から、デフェンシンをHAART治療を開始する直前と、HAART治療の開始から正確に1年後の2回、デフェンシンを測定した。初期には全ての患者のウイルス量は測定可能であったが、1年間のHAART治療の最後では検出できなかった。HAART治療前後のT細胞数(CD4およびCD8の双方)を測定した。その結果を表2にまとめる。
デフェンシンは非感染対照ヒト血漿中に6.2〜7ng/mlの濃度で存在するが、21名の感染患者のうち、デフェンシンは33%(7/21)の患者でのみ検出されることが実験で示された。デフェンシンが検出可能であった7名の患者のうち、3名は初期ウイルス量が低く、デフェンシン負荷の増加がデフェンシンの生産に影響する可能性を示唆している。実験の開始時にデフェンシンレベルが検出可能であった7名の患者中の4名は、1年後のウイルス量が検出できず、CD4およびCD8数が正常であると言う事実にもかかわらず、HAART治療を1年間続けるとデフェンシンの発現が部分的または完全に失われた。
1名の患者では実験の開始時にデフェンシンレベルが検出不可能であったが、HAART中にそのCD4数が3倍になった後、デフェンシンは健常者の約1/3のレベルで検出可能であった。2名の患者では、HAART治療の前後でデフェンシンは低レベル(未感染者の約1/3のレベル)であった。
これらの結果から、HIV感染患者ではαデフェンシンレベルが未感染者より血漿中のα−デフェンシンレベルが低いことが確認された。このことは、デフェンシンがウイルス複製を停止し、健常な対照者および長期非進行性患者(LTNP)のCD8T細胞で分泌されるが、AIDS患者のCD8細胞では分泌されないと言う試験管内の知見と一致するものである。
Claims (64)
- デフェンシンポリペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む、組成物。
- 前記デフェンシンポリペプチドがα−デフェンシンポリペプチドである、請求項1に記載の組成物。
- 前記α−デフェンシンポリペプチドがα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる、請求項2に記載の組成物。
- 少なくとも2種のα−デフェンシンポリペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- α−デフェンシン1およびα−デフェンシン2を含む、請求項4に記載の組成物。
- α−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3を含む、請求項4に記載の組成物。
- デフェンシンポリペプチドをヒトに投与する工程を包含する、ヒトにおけるHIV感染治療法。
- デフェンシポリペプチドと第2治療薬を前記ヒトに投与する工程をさらに包含する、請求項7に記載の方法。
- 前記デフェンシンポリペプチドがα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれるα−デフェンシンポリペプチドである、請求項7に記載の方法。
- α−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる第2のα−デフェンシンポリペプチドを投与する工程をさらに包含する、請求項7に記載の方法。
- 前記α−デフェンシンポリペプチドがα−デフェンシン1およびα−デフェンシン2である、請求項9に記載の方法。
- 予防量のデフェンシンポリペプチドをHIV感染の危険性の高い人に投与する工程を包含する、方法。
- 前記デフェンシンポリペプチドがα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれるα−デフェンシンポリペプチドである、請求項11に記載の方法。
- α−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる第2のα−デフェンシンポリペプチドを投与する工程をさらに包含する、請求項11に記載の方法。
- 前記α−デフェンシンポリペプチドがα−デフェンシン1およびα−デフェンシン2である、請求項13に記載の方法。
- 細胞をデフェンシンポリペプチドと接触させる工程を包含する、培養液中のCD4+細胞のHIV感染予防法。
- 前記デフェンシンポリペプチドがα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれるα−デフェンシンポリペプチドである、請求項15に記載の方法。
- α−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる第2のα−デフェンシンポリペプチドを投与する工程をさらに包含する、請求項15に記載の方法。
- 薬学的に許容し得る担体中に第1デフェンシンポリペプチドをコードする第1核酸を含む、組成物。
- 第2デフェンシンポリペプチドをコードする第2核酸をさらに含む、請求項18に記載の組成物。
- 前記デフェンシンポリペプチドがα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれるα−デフェンシンポリペプチドである、請求項19に記載の組成物。
- 前記α−デフェンシンポリペプチドがα−デフェンシン1およびα−デフェンシン2である、請求項20に記載の組成物。
- 細胞をデフェンシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸にインビボで感染させる工程、または細胞に、デフェンシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をエクス・ビボでトランスフェクトさせ、該細胞をヒトに投与する工程を包含する、ヒトにおけるHIV感染の阻害法。
- 前記デフェンシンポリペプチドがα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれるα−デフェンシンポリペプチドである、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞が筋肉細胞である、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞がAC133+またはCD34+前駆体細胞である、請求項22に記載の方法。
- 感染がエクス・ビボで行われる、請求項22に記載の方法。
- 前記核酸がデフェンシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合する誘導性プロモーターを含む、請求項22に記載の方法。
- a)個体由来の試料中のα−デフェンシンの量を検出する工程;および
b)該量をHIV感染症状と関連付ける工程
を包含する、個体のHIV感染症状の測定方法。 - 前記デフェンシン量、およびCD8+細胞数、CD4+細胞数、HIVウイルス負荷および全T細胞数からなる群から選ばれる少なくとも一つの他のインディケーターをHIV感染症状と関連付ける工程をさらに包含する、請求項28に記載の方法。
- 前記α−デフェンシンがELISAまたはSELDIで検出される、請求項28に記載の方法。
- 前記α−デフェンシンポリペプチドがα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる、請求項28に記載の方法。
- a)個体由来の試料中のα−デフェンシンmRNAの量を検出する工程;および
b)該量をHIV感染症状と関連付ける工程
を包含する、個体のHIV感染症状を測定する方法。 - 前記α−デフェンシンポリペプチドがα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる、請求項32に記載の方法。
- a)α−デフェンシン生産細胞を化合物と接触させる工程;および
b)該化合物のα−デフェンシン活性に対する機能的効果を測定する工程
を包含する、化合物が細胞中のα−デフェンシン活性を調節するか否かを決定する方法。 - 前記細胞が好中球、CD8+細胞および上皮細胞からなる群より選ばれる、請求項34に記載の方法。
- 前記機能的効果がデフェンシン発現レベル、細胞増殖またはHIV複製を測定することにより決定される、請求項34に記載の方法。
- 前記化合物が低分子量有機分子である、請求項34に記載の方法。
- 前記α−デフェンシンポリペプチドがα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる、請求項34に記載の方法。
- 請求項35に記載の方法により同定される化合物をヒトに投与してα−デフェンシン活性を増加させる工程を包含する、ヒトにおけるHIV感染阻害法。
- a)細胞をα−デフェンシンに接触させる工程;
b)抗α−デフェンシン抗体を該細胞の溶解物と接触させる工程;
c)工程(b)の前または後に抗α−デフェンシン抗体を固相に固定化し、これによって該細胞由来のα−デフェンシンを該固相に結合させる工程;および
d)該固定化したα−デフェンシンに結合するタンパク質を検出する工程
を包含する、方法。 - a)細胞をα−デフェンシンに接触させる工程;
b)α−デフェンシンを該細胞の溶菌物と接触させる工程;
c)工程(b)の前または後に該α−デフェンシンを固相に固定化し、α−デフェンシンに結合するタンパク質を捕捉する工程;および
d)該固定化したα−デフェンシンに結合するタンパク質を検出する
工程を包含する、方法。 - 前記細胞がCD4+細胞、HeLa細胞またはHOS細胞である、請求項40または41に記載の方法。
- 前記α−デフェンシンポリペプチドがα−デフェンシン1、α−デフェンシン2およびα−デフェンシン3からなる群より選ばれる、請求項40または41に記載の方法。
- (a)抗体を結合する手段を含む基材;(b)抗α−デフェンシンポリペプチド抗体;および(c)患者試料中で検出されたα−デフェンシン量を進行性AIDSの予後と関連付ける指針書を備えるキット。
- 前記基材がマススペクトロメータープローブである、請求項44に記載のキット。
- 前記基材がマイクロタイタープレートである、請求項44に記載のキット。
- α−デフェンシン1、α−デフェンシン2またはα−デフェンシン3を特異的に指向する第2抗体をさらに含む、請求項44に記載のキット。
- 前記第2抗体が標識されている、請求項44に記載のキット。
- (a)α−デフェンシンポリペプチドを結合する手段を含む基材、および(b)患者試料中で検出されるαデフェンシン量を進行性AIDSの予後と関連付けるための指針書を備える、キット。
- α−デフェンシンを特異的に結合する第1抗体および、α−デフェンシン1、α−デフェンシン2またはα−デフェンシン3に特異的に結合する第2抗体を備える、キット。
- 第1α−デフェンシンポリペプチド部分およびCD4に結合する第2部分を含む、α−デフェンシン融合タンパク質。
- 第1α−デフェンシンポリペプチド部分および第2シグナルペプチド部分を含む、α−デフェンシン融合タンパク質。
- 前記第2シグナルペプチド部分がTPAシグナルペプチドである、請求項53に記載のα−デフェンシン融合タンパク質。
- 請求項52に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
- 第1α−デフェンシンポリペプチド部分およびタンパク質のインビボでの安定性または生物適合性を増加させる第2部分を含む、α−デフェンシン融合タンパク質。
- PEG化α−デフェンシンポリペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
- タンパク質分解開裂部位を除去するアミノ酸置換基を含む、α−デフェンシンアナログ。
- CD8+細胞を活性化する組成物を投与する工程を包含する、内因性α−デフェンシン生産の増加法。
- 前記組成物が抗CD3を含む、請求項59に記載の方法。
- a)CD8+細胞をエクス・ビボで増殖させる工程;
b)α−デフェンシンの生産をCD8+細胞によってモニタリングする工程;および
c)増殖したCD8+細胞をHLAの適合した人に投与する工程
を包含する、方法。 - 人にワクチンおよびα−デフェンシンポリペプチドまたはα−デフェンシンをコードする核酸を投与する工程を包含する、方法。
- ワクチンおよびα−デフェンシンポリペプチドまたはα−デフェンシンをコードする核酸を含む、組成物。
- α−デフェンシンポリペプチドと第2治療薬を含む、組成物。
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