JP2005525125A - Ｌｄｌ受容体関連タンパク質１及び２、並びに骨異常又は軟骨異常の治療 - Google Patents

Ｌｄｌ受容体関連タンパク質１及び２、並びに骨異常又は軟骨異常の治療 Download PDF

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Abstract

骨障害又は軟骨障害のような障害の診断及び治療における、LDL受容体関連タンパク質1及び2(LRP-1及びLRP-2)、並びにラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2又はp42/44 MAPキナーゼとの間の相互作用。関連治療用化合物のためのスクリーニング法も開示されている。

Description

発明の分野
本発明は、LRP-1及びLRP-2遺伝子が骨細胞内に発現されるという発見に関し、具体的には、骨又は軟骨の異常（condition）を診断する方法、骨又は軟骨の異常を治療するための候補化合物を同定する方法、並びに、骨細胞内のLRP-1及びLRP-2タンパク質のレベル又は活性を調節することにより骨又は軟骨の異常を治療する方法に関する。
関連出願
本出願は、2002年5月13日付けで出願された米国特許仮出願第60/380,227号明細書、及び2003年4月16日付けで出願された米国特許仮出願第60/463,419号明細書の優先権を主張する。前記両明細書の内容を参考のため本明細書中に引用する。
背景
低密度リポタンパク質(LDL)受容体(LDLR)は、一般的な細胞内膜循環及びエンドサイトーシスに関与する細胞表面受容体である。LDLRの機能は、(1)エンドソーム区画内へ細胞外成分を内在化するための貨物輸送、及び(2)体内のコレステロール・ホメオスタシスを維持するためのリポタンパク質代謝を含む。
LDLRは、LDL受容体関連タンパク質(LRP)をも含む受容体超科の員である。LRPの役割は、脂質代謝におけるLDLRの役割よりも大きく制限される。しかし、貨物輸送及び脂質代謝に加えて、LRPは、その他の細胞プロセス、例えば細胞の代謝及び生理に有意な影響を与えるシグナル伝達にも関与する。
LRP-1、LRP-1b、LRP-2、LRP-5、LRP-6、LRP-7、LRP-8、LRP-9、LRP-10、LRP-11(Strickland他(2002) Trends in Endocrinology and Metabolism 13(2):66-74; Herz and Strickland (2001) The Journal of Clinical Investigation 108(6):779-784;及びHerz(2001)Neuron 29:571-581)を含めて、幾つかのLRPが同定されている。全てのLRPはLDLRと同様に膜貫通配列を有し、そして多機能タンパク質である。LRPはわずかに互いに異なっており、例えばEGF様反復体、YWTD反復体、O結合糖ドメイン、相補体様反復体及び細胞質領域を含む、類似の構造モチーフを有している。LRPは多くの細胞内分子及び細胞外分子に結合する。このような細胞内分子はアダプター及び骨格タンパク質(例えばDab-1、FE65及びPSD-95)を含み、そしてこのような細胞外分子はリポタンパク質、プロテイナーゼ、細菌毒素、抗生物質、ウィルス、及びプロテイナーゼ阻害物質複合体を含む。
乳及び上皮分泌物中に存在する80kDaの糖タンパク質であるラクトフェリンは、免疫応答中に炎症細胞によって放出される。ラクトフェリンは血漿中2〜7μg/mlの濃度で循環し、鉄代謝、免疫性及び胚発育の調整に関与すると考えられる。
概要
本発明は、LRP-1及びLRP-2遺伝子が骨細胞内に発現されるという発見に基づいている。
本発明の1つの観点は、骨異常の診断方法を提供する。
一例において、この方法は、骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていると疑われる患者から試料(例えば骨組織)を準備し、そしてLRP-1遺伝子の発現レベルを定量化することを含む。試料中のLRP-1遺伝子の発現レベルは、これが正常試料中のものとは異なる場合には、該患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていることを示す。
別の例において、この方法は、骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていると疑われる患者の骨組織から試料を準備し、そしてLRP-2遺伝子の発現レベルを定量化することを含む。試料中のLRP-2遺伝子の発現レベルは、これが正常試料中のものとは異なる場合には、該患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていることを示す。
別の例において、この方法は、骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていると疑われる患者から試料(例えば骨組織)を準備し、そしてLRP-1タンパク質の活性を定量化することを含む。試料中のLRP-1タンパク質の活性は、これが正常試料中のものとは異なる場合には、該患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていることを示す。
さらに別の例において、この方法は、骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていると疑われる患者の骨組織から試料を準備し、そしてLRP-2タンパク質の活性を定量化することを含む。試料中のLRP-2タンパク質の活性は、これが正常試料中のものとは異なる場合には、該患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていることを示す。
本発明の別の観点は、骨異常を治療するための候補化合物を同定する方法を提供する。
一例において、この方法は、化合物を、LRP-1遺伝子を発現させる細胞、例えば骨細胞{例えば骨芽細胞、骨芽様細胞(例えばSaOS-2細胞)、骨細胞、又は破骨細胞}と接触させ、そして該細胞中の該LRP-1遺伝子の発現レベルを定量化することを含む。該化合物の存在における該LRP-1遺伝子の発現レベルは、これが該化合物の不存在におけるものとは異なる場合には、該化合物が骨異常を治療する候補であることを示す。
別の例において、この方法は、化合物を、LRP-2遺伝子を発現させる骨細胞{例えば骨芽細胞、骨芽様細胞(例えばSaOS-2細胞)、骨細胞、又は破骨細胞}と接触させ、そして該細胞中の該LRP-2遺伝子の発現レベルを定量化することを含む。該化合物の存在における該LRP-2遺伝子の発現レベルは、これが該化合物の不存在におけるものとは異なる場合には、該化合物が骨異常を治療する候補であることを示す。
別の例において、この方法は、化合物を、LRP-1タンパク質をコードするLRP-1遺伝子を発現させる細胞と接触させ、そして該細胞中の該LRP-1タンパク質の活性を定量化することを含む。該化合物の存在における該LRP-1タンパク質の活性は、これが該化合物の不存在におけるものとは異なる場合には、該化合物が骨異常を治療する候補であることを示す。
さらに別の例において、この方法は、化合物を、LRP-2タンパク質をコードするLRP-2遺伝子を発現させる細胞と接触させ、そして該細胞中の該LRP-2タンパク質の活性を定量化することを含む。該化合物の存在における該LRP-2タンパク質の活性は、これが該化合物の不存在におけるものとは異なる場合には、該化合物が骨異常を治療する候補であることを示す。
また本発明の範囲内には、骨細胞内のLRP-1又はLRP-2タンパク質のレベル又は活性を調節することによって、骨異常を治療する方法が含まれる。
一例において、この方法は、有効量の製薬組成物を、これを必要とする患者に投与し、これにより、骨細胞内のLRP-1又はLRP-2タンパク質のレベルを調節することを含む。LRP-1又はLRP-2タンパク質のレベルは、LRP-1又はLRP-2タンパク質をコードする核酸を提供して発現させること、LRP-1又はLRP-2タンパク質を提供すること、又はLRP-1又はLRP-2タンパク質をコードする配列に対して相補的な核酸、すなわちアンチセンス分子を提供して発現させることによって調節することができる。
別の例において、この方法は、有効量の製薬組成物を、これを必要とする患者に投与し、これにより、骨細胞内のLRP-1又はLRP-2タンパク質の活性を調節することを含む。LRP-1又はLRP-2タンパク質の活性は、LRP-1又はLRP-2タンパク質のアゴニストを提供すること、LRP-1又はLRP-2タンパク質のアンタゴニストを提供すること、又はLRP-1又はLRP-2タンパク質に対する抗体を提供することによって調節することができる。
製薬組成物は骨細胞内に直接的に投与することができる。製薬組成物は、骨細胞内に直接導入することなしに患者に投与することによって、骨細胞内のLRP-1の活性を調節することもできる。
本発明の範囲内には、骨異常の診断方法、骨異常を治療するための候補化合物の同定方法、及びLRP-1及びLRP-2の両方に関与する骨異常の治療方法が含まれる。
天然発生型LRP-1又はLRP-2タンパク質、そのフラグメント、その生体活性部分、及びその誘導体は、集合的に「LRP-1又はLRP-2ポリペプチド又はタンパク質」と呼ばれる。このようなポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸分子は集合的に「LRP-1又はLRP-2核酸」(例えば天然発生型遺伝子又は組換え遺伝子)と呼ばれる。LRP-1又はLRP-2分子は、LRP-1又はLRP-2核酸、ポリペプチド及び抗体を意味する。
本明細書に使用される「核酸分子」という用語は、DNA分子(例えばcDNA又はゲノムDNA)、RNA分子(例えばmRNA)、及びDNA又はRNAの類似体を含む。DNA又はRNA類似体はヌクレオチド類似体から合成することができる。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であってよい。
本明細書に使用される「遺伝子」及び「組換え遺伝子」という用語は、LRP-1又はLRP-2タンパク質をコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を意味する。遺伝子は任意にはさらに非コード配列、例えば調節配列及びイントロンを含むことができる。
本明細書に使用されるLRP-1又はLRP-2タンパク質の「生体活性タンパク質」は、相互作用、例えば分子内相互作用又は分子間相互作用に関与する、LRP-1又はLRP-2タンパク質のフラグメントを含む。分子間相互作用は、特異的結合相互作用又は酵素的相互作用(例えば、相互作用は一時的であってよく、その一つとしては、共有結合が形成又は破断される)。分子間相互作用は、LRP-1分子又はLRP-2分子と、非LRP-1分子又は非LRP-2分子との間で生じてよく、或いは、第1LRP-1分子又は第1LRP-2分子と、第2LRP-1分子又は第2LRP-2分子との間で生じてもよい。LRP-1又はLRP-2タンパク質の生体活性部分は、LRP-1又はLRP-2タンパク質のアミノ酸配列と十分に相同のアミノ酸配列、或いはLRP-1又はLRP-2タンパク質のアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドを含む。これらのアミノ酸配列は、完全長のLRP-1又はLRP-2タンパク質よりも短いアミノ酸を含み、そして、LRP-1又はLRP-2タンパク質の1つ以上の活性を示す。典型的には、生体活性タンパク質は、LRP-1又はLRP-2タンパク質の1つ以上の活性、例えば貨物輸送、脂質代謝、及びシグナル伝達を有するドメイン又はモチーフを含有する。LRP-1又はLRP-2タンパク質の生体活性部分は、例えばアミノ酸長10、25、50、100、200以上のポリペプチドであってよい。LRP-1又はLRP-2タンパク質の生体活性部分は、LRP-1又はLRP-2によって媒介される活性、例えば貨物輸送、脂質代謝及びシグナル伝達を調節する物質を発生させるための標的として使用することができる。
本明細書中で使用される「LRP-1又はLRP-2活性」、「LRP-1又はLRP-2の生体活性」又は「LRP-1又はLRP-2の機能活性」という用語は、LRP-1又はLRP-2ポリペプチド、タンパク質又は核酸分子によって与えられる活性を意味する。所定の生理的環境におけるLRP-1又はLRP-2によって、例えばLRP-1又はLRP-2応答性細胞又はLRP-1又はLRP-2基質、例えばタンパク質基質に与えられる活性であってよい。LRP-1又はLRP-2活性はin vivo 又はin vitro で見極めることができる。一例では、LRP-1又はLRP-2活性は直接的な活性、例えばLRP-1又はLRP-2標的分子との会合である。「標的分子」又は「結合相手」とは、LRP-1又はLRP-2タンパク質が本質的に結合又は相互作用する分子である。
LRP-1又はLRP-2活性は間接的な活性、例えばLRP-1又はLRP-2タンパク質とLRP-1又はLRP-2リガンドとの相互作用によって媒介される細胞シグナル化活性であってもよい。
LRP-1又はLRP-2、又は両分子の異常な発現又は活性は、骨代謝と関連する疾患を媒介することがある。「骨代謝」は骨構造の形成又は退化、例えば骨形成、骨吸収、及びこれら2つの代謝プロセス間のバランスにおける直接的又は間接的な効果を意味する。この用語はまた、骨細胞、例えば破骨細胞及び骨芽細胞内のLRP-1又はLRP-2分子によって媒介される活性を含む。これらの活性は結果として骨の形成及び退化をもたらす。例えば、LRP-1又はLRP-2分子は、骨吸収破骨細胞の種々異なる活性、例えば単球及び単核食細胞の破骨細胞への分化を刺激するのを支援することができる。従って、骨細胞の生成を調節するLRP-1又はLRP-2分子は、骨の形成及び退化に影響を与え、ひいては、骨障害を治療するのに使用することができる。このような障害の一例としては、骨粗鬆症、骨ジストロフィー、骨軟化症、くる病、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨ジストロフィー、骨硬化症、痙攣治療、骨量不足、骨線維形成不全、二次性副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、副甲状腺機能亢進症、肝硬変、閉塞性黄疸、薬物誘発性代謝、髄様癌、慢性腎疾患、くる病、サルコイドーシス、グルココルチコイド拮抗作用、吸収不良症候群、脂肪便、熱帯性スプルー、突発性高カルシウム血、乳熱、及び骨形成不全が挙げられる。
本明細書中に使用される「誤発現又は異常発現」は、RNA又はタンパク質レベルにおける遺伝子発現の非野生型パターンを意味する。誤発現又は異常発現は、非野生型レベルでの発現、すなわち過剰又は過少発現；遺伝子が発現される時間又は段階に関して野生型とは異なる発現パターン、例えば所定の発生期間又は発生段階における発現量の(野生型と比較した)増減；所定の細胞タイプ又は組織タイプにおける発現の変化、例えば発現量の(野生型と比較した)増減に関して野生型とは異なる発現パターン；スプライシング・サイズ、翻訳されたアミノ酸配列、翻訳後修飾、又は発現されたポリペプチドの生体活性に関して野生型とは異なる発現パターン；遺伝子の発現に対する環境刺激又は細胞外刺激の効果に関して野生型とは異なる発現パターン、例えば刺激の強さの増減の存在において(野生型と比較して)増減する発現のパターン、を含む。
本明細書中に使用される「化合物」は、例えば核酸、タンパク質、ペプチド、ペプチド疑似体、ペプトイド、又は小分子を含む。「アゴニスト」は、LRP-1又はLRP-2タンパク質の活性を増強する化合物を意味する。これはLRP-1又はLRP-2タンパク質に対応する天然発生型リガンドであってよい。「アンタゴニスト」は、LRP-1又はLRP-2タンパク質の活性を阻害する化合物を意味する。
本明細書中に使用される「患者」は、ヒト又はヒト以外の動物を意味する。
本発明はまた、骨細胞又は軟骨細胞内のラクトフェリンと、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質(LRP-1又はLRP-2)又はMAPキナーゼとの相互作用を見極め、そして調節することにより、骨異常又は軟骨異常を診断して治療することに関する。
1つの観点において、本発明は患者が骨又は軟骨の異常を患っているか、又は骨又は軟骨の異常を発生させる危険に晒されているか否かを見極める方法を提供する。この方法は、患者から試料(例えば骨組織又は軟骨組織の試料)を準備し、そして試料中のラクトフェリン・ポリペプチドと、LRP-1タンパク質、LRP-2タンパク質又はp42/44 MAPキナーゼとの間の相互作用レベルを見極めることを含む。試料中のこのような相互作用レベルが、正常試料中のものとは異なる場合には、これは該患者が骨又は軟骨の異常を患っているか、又は骨又は軟骨の異常を発生させる危険に晒されていることを示す。ラクトフェリン・ポリペプチドと、LRP-1、LRP-2又はp42/44 MAPキナーゼとの間の相互作用は、例えばラクトフェリンとLRP-1又はLRP-2との結合、LRP-1又はLRP-2によって媒介されたラクトフェリンのエンドサイトーシス、又はp42/44 MAPキナーゼのリン酸化を測定することによって見極めることができる。
別の観点において、本発明は骨異常又は軟骨異常を治療するための候補化合物を同定する方法を提供する。この方法は、ラクトフェリン・ポリペプチドと、LRP-1タンパク質、LRP-2タンパク質、又はp42/44 MAPキナーゼとを含有する系に化合物を導入し、そして、該ラクトフェリン・ポリペプチドと該LRP-1タンパク質、該LRP-2タンパク質、又は該p42/44 MAPキナーゼとの間の相互作用レベルを見極めることを含む。この系は、骨芽細胞、破骨細胞、線維芽細胞又は軟骨細胞を含有する細胞系、又は無細胞系であってよい。該化合物の存在における該ラクトフェリンと、該LRP-1、LRP-2又はp42/44 MAPキナーゼとの間の該相互作用レベルが、該化合物の不存在におけるものとは異なる場合には、これは該化合物が骨又は軟骨の異常を治療する候補であることを示す。
さらに別の観点において、骨細胞又は軟骨細胞内のラクトフェリン・ポリペプチドと、LRP-1タンパク質、LRP-2タンパク質、又はp42/44 MAPキナーゼとの間の相互作用を調節することにより、骨異常又は軟骨異常を治療する方法を提供する。一例において、この相互作用は、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼのアゴニスト、例えば外生的なラクトフェリン・ポリペプチドを提供することにより調節される。別の例において、この相互作用は、LRP-1又はLRP-2のアンタゴニスト(例えば受容体関連タンパク質)、又はp42/44 MAPキナーゼのアンタゴニスト(例えばp42/44 MAPキナーゼ阻害物質、すなわちp42/44 MAPキナーゼの発現、リン酸化、又は活性を阻害する化合物、例えばPD98059及びU-0126)を提供することにより調節される。LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼのアゴニスト又はアンタゴニストは、骨細胞又は軟骨細胞内に直接的に導入することができる。これらのアゴニスト又はアンタゴニストは独立して又は組み合わせて、順次又は同時に、他の骨治療又は軟骨治療を伴って、又は伴わずに使用することができる。
「ラクトフェリン・ポリペプチド」は天然発生型ポリペプチド、組換えポリペプチド、又は合成ポリペプチドであってよい。野生型ラクトフェリン・ポリペプチドの変異形{2つ以上(例えば4, 6, 8, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700個)のアミノ酸を含有する野生型ラクトフェリン・ポリペプチドのフラグメント、又は野生型ラクトフェリン・ポリペプチドの生体活性を維持するラクトフェリン・ポリペプチド配列を含有する組換えタンパク質}が本発明の範囲に含まれる。ラクトフェリン・ポリペプチドは哺乳動物起源、例えばヒト又はウシの乳起源であってよい。ポリペプチドに結合される金属イオンは(天然発生型ラクトフェリン・ポリペプチド中にあるような)鉄イオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、又は任意の他の配位金属イオン、例えばスカンジウム又はビスマスであってよい。
本発明の1つ又は2つ以上の実施態様の詳細を以下に説明する。本発明のその他の特徴、対象及び利点が、下記詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかになる。
詳細な説明
LRP-1及びLRP-2核酸分子、タンパク質、タンパク質同族体、アゴニスト、アンタゴニスト及び抗体は、下記方法の1つ又は2つ以上に使用することができる：a)スクリーニング・アッセイ;b)予測医療(例えば診断アッセイ、予後アッセイ、モニタリング臨床試験、及び薬理遺伝学)；及びc)治療方法(例えば治療及び予防)。
LRP-1及びLRP-2核酸分子を使用することにより、例えば、LRP-1及びLRP-2タンパク質を(例えば遺伝子治療用途において宿主細胞内の組換え発現ベクターを介して)発現させて、これにより下記のように、(例えば生体試料中の)LRP-1又はLRP-2 mRNA、又はLRP-1又はLRP-2遺伝子の遺伝的変化を検出すること、及びLRP-1又はLRP-2活性を調節することができる。LRP-1又はLRP-2タンパク質を使用することにより、LRP-1又はLRP-2基質の不十分又は過剰な生成、或いはLRP-1又はLRP-2阻害物質の生成を特徴とする障害を治療することができる。加えて、LRP-1又はLRP-2タンパク質を使用することにより、天然発生型LRP-1又はLRP-2基質をスクリーニングすること、LRP-1又はLRP-2活性を調節する薬物又は化合物をスクリーニングすること、並びに、LRP-1又はLRP-2タンパク質の不十分又は過剰な生成、或いは、LRP-1又はLRP-2野生型タンパク質と比較して減少した活性、異常な活性、又は望ましくない活性を有するLRP-1又はLRP-2タンパク質形態の生成を特徴とする障害{例えば骨障害(例えば骨粗鬆症、パジェット病、及び骨形成不全}を治療することができる。さらに、抗LRP-1又はLRP-2抗体を使用することにより、LRP-1又はLRP-2タンパク質を検出して分離し、LRP-1又はLRP-2タンパク質の生体利用効率を調整し、そしてLRP-1又はLRP-2活性を調節することができる。
患者のLRP-1又はLRP-2と相互作用する、例えば結合する能力に関して化合物を評価する方法が提供される。この方法は、化合物を患者のLRP-1又はLRP-2ポリペプチドと接触させ；そして、患者のLRP-1又はLRP-2ポリペプチドと相互作用し、例えばこれと結合するか、或いは患者のLRP-1又はLRP-2ポリペプチドとの複合体を形成する化合物の能力を評価することを含む。この方法はin vitro、例えば無細胞系で、又はin vivo、例えば2ハイブリッド相互作用トラップ・アッセイで行うことができる。この方法を用いることにより、患者のLRP-1又はLRP-2ポリペプチドと相互作用する天然発生型分子を同定することができる。この方法を用いることにより、患者のLRP-1又はLRP-2ポリペプチドの天然又は合成阻害物質を見いだすこともできる。スクリーニング法を以下により詳しく説明する。
スクリーニング・アッセイ
本発明は、モジュレーター、すなわちLRP-1又はLRP-2タンパク質に結合するか、例えばLRP-1又はLRP-2発現又はLRP-1又はLRP-2活性に対する刺激効果又は阻害効果を有するか、或いは例えばLRP-1又はLRP-2基質の発現又は活性に対する刺激効果又は阻害効果を有する候補化合物又は候補物質、或いは試験化合物又は試験物質を同定する方法(本明細書中で「スクリーニング・アッセイ」とも呼ぶ)を提供する。こうして同定された化合物を使用することにより、治療手順において標的遺伝子生成物(例えばLRP-1又はLRP-2遺伝子)の活性を調節すること、標的遺伝子生成物の生物学的機能を詳しく説明すること、又は、正常な標的遺伝子相互作用を混乱させる化合物を同定することができる。
1実施態様の場合、本発明は、LRP-1又はLRP-2タンパク質又はポリペプチド又はその生体活性部分の基質である候補化合物又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施態様の場合、本発明は、LRP-1又はLRP-2タンパク質又はポリペプチド、又はその生体活性部分に結合するか、或いは、RP-1又はLRP-2タンパク質又はポリペプチド、又はその生体活性部分の活性を調節する候補化合物又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
本発明の試験化合物は、当業者に知られた組み合わせライブラリ法における数多くのアプローチのいずれかを用いて得ることができる。これらの方法は下記のものを含む：生物学的ライブラリ；ペプトイド・ライブラリ(ペプチドの機能性を有する分子ではあるが、しかし酵素分解に対して抵抗性の新規の非ペプチド・バックボーンを備え、にもかかわらず生体活性であり続ける分子のライブラリ；例えばZuckermann, R.N.他(1994)J. Med. Chem. 37:2678-85参照)；空間的にアドレス可能な並列固相又は溶液相ライブラリ；デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリ法；「1-ビード・1-化合物」ライブラリ法；及びアフィニティ・クロマトグラフィ選択を用いる合成ライブラリ法。生物学的ライブラリ及びペプトイド・ライブラリのアプローチはペプチド・ライブラリに限定されるのに対し、他の4つのアプローチは、ペプチド、非ペプチド・オリゴマー又は化合物の小分子ライブラリに適用可能である(Lam(1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。
分子ライブラリの合成方法の例は、例えば：DeWitt他(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb他(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann他(1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho 他(1993) Science 261:1303; Carrell他(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell他(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061;及びGallop他(1994)J. Med. Chem. 37:1233において当業者によって見いだすことができる。
化合物のライブラリは溶液中(例えばHoughten(1992) Biotechniques 13:412-421)、又はビード(Lam(1991)Nature 354:82-84)、チップ(Fodor(1993)Nature 364:555-556)、細菌(Ladner,米国特許第5,223,409号明細書)、胞子(Ladner, 米国特許第5,223,409号明細書)、プラスミド(Cull他(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)又はファージ上(Scott及びSmith(1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla他(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici(1991) J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner 前掲)に提示することができる。
1実施態様の場合、アッセイは、細胞に基づいたアッセイであり、このアッセイの場合、LRP-1又はLRP-2タンパク質又はその生体活性部分を発現させる細胞を、試験化合物と接触させ、LRP-1又はLRP-2活性を調節する試験化合物の能力を見極める。LRP-1又はLRP-2活性を調節する試験化合物の能力を見極めることは、例えば貨物輸送、脂質代謝、シグナル伝達、又は細胞活性の何らかの他の局面、例えば、細胞増殖、鉱物の堆積又は溶解、或いはタンパク質合成をモニタリングすることにより達成することができる。細胞は例えば哺乳動物起源、例えばヒトのものであってよい。
化合物、例えばLRP-1又はLRP-2基質とLRP-1又はLRP-2との結合を調節する試験化合物の能力、或いは、LRP-1又はLRP-2に結合する試験化合物の能力を評価することもできる。この能力は、例えば化合物、例えば基質を放射性同位体又は酵素標識とカップリングし、これにより化合物、例えば基質とLRP-1又はLRP-2との結合を、複合体中で標識付け化合物、例えば基質を検出することにより見極めることができる。或いは、LRP-1又はLRP-2を放射性同位体又は酵素標識とカップリングすることにより、複合体中のLRP-1又はLRP-2基質とLRP-1又はLRP-2との結合を調節する試験化合物の能力をモニタリングすることもできる。例えば化合物(例えばLRP-1又はLRP-2基質)に、125I、35S、14C又は3Hを直接的又は間接的に標識付けし、そして、放射エミッションを直接的にカウントするか、又はシンチレーション・カウントすることにより、その放射性同位体を検出することができる。或いは、例えばホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、又はルシフェラーゼを化合物に酵素的に標識付けし、そして好適な基質が生成物に転化したことを見極めることによって、酵素標識を検出することもできる。
相互作用体をいずれかに標識付けすることを伴って、又は伴わずに、LRP-1又はLRP-2と相互作用する化合物(LRP-1又はLRP-2基質)の能力を評価することができる。例えば、マイクロフィジオメーターを使用することにより、化合物又はLRP-1又はLRP-2に標識付けすることなしに、化合物とLRP-1又はLRP-2との相互作用を検出することができる(McConnell, H.M.他(1992) Science 257:1906-1912)。本明細書中に使用される「マイクロフィジオメーター」(例えばサイトセンサー)は、光アドレス可能な電位差測定センサー(LAPS)を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析装置である。この酸性化速度の変化を、化合物とLRP-1又はLRP-2との相互作用の指標として用いることができる。
別の実施態様において、無細胞アッセイが提供される。この無細胞アッセイの場合、LRP-1又はLRP-2タンパク質又はその生体活性部分を、試験化合物と接触させ、そしてLRP-1又はLRP-2タンパク質、或いはその生体活性部分に結合する試験化合物の能力を評価する。本発明のアッセイに用いられるべきLRP-1又はLRP-2タンパク質の好ましい生体活性部分は、非LRP-1又は非LRP-2分子との相互作用に関与するフラグメント、例えば高表面確率スコアを有するフラグメントを含む。
分離されたタンパク質(例えばLRP-1又はLRP-2タンパク質、或いはその生体活性部分)の可溶性形態又は膜結合形態を、本発明の無細胞アッセイに使用することができる。タンパク質の膜結合形態を用いる場合には、可溶化剤を使用することが望ましい。このような可溶化剤の例は、非イオン性洗剤、例えばn-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-ドデシルマルトシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、デカノイル-N-メチルグルカミド、Triton(登録商標)X-100、Triton(登録商標)X-114、Thesit(登録商標)、イソトリデシルポリ(エチレングリコールエーテル)n、3-[(3-コルアミドプロピル)ジメチルアンミニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)、3-[(3-コルアミドプロピル)ジメチルアンミニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート(CHAPSO)、又はN-ドデシル=N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートを含む。
無細胞アッセイは、標的遺伝子タンパク質と試験化合物との反応混合物を調製することを伴い、この調製は、2つの成分が相互作用して結合し、ひいては除去又は検出され得る複合体を形成できるようにするのに十分な条件下で十分な時間にわたって行われる。
2つの分子間の相互作用は、例えば蛍光エネルギー転移(FET)(例えばLakowicz他、米国特許第5,631,169号明細書；Stavrianopoulos他、米国特許第4,868,103号明細書)を用いて検出することもできる。第1の「ドナー」分子上の発蛍光団標識が、その発せられた蛍光エネルギーが、第2の「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収されるように選択される。第2の「アクセプター」分子上の蛍光標識は、吸収されたエネルギーによって蛍光を発することができる。或いは、「ドナー」タンパク質分子は、単にトリプトファン残基の天然蛍光エネルギーを利用するだけでもよい。標識は、異なる光波長を発することにより、「アクセプター」分子標識を「ドナー」の標識と区別できるようなものが選択される。標識相互間のエネルギー転移の効率は、分子を隔離する距離に関連するので、分子間の空間的な関係を評価することができる。分子間に結合が生じる状況において、このアッセイにおける「アクセプター」分子標識の蛍光放射は最大になるべきである。FET結合事象は、当業者によく知られた標準的な蛍光検出手段を介して(例えばフルオリメーターを使用して)、従来通り測定することができる。
別の実施態様の場合、標的分子に結合するLRP-1又はLRP-2タンパク質の能力を見極めることは、リアルタイムの生体分子相互作用分析(Biomolecular Interaction Analysis:BIA)を用いて達成することができる(例えばSjolander, S及びUrbaniczky, C.(1991)Anal. Chem. 63:2338-2345及びSzabo他(1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705)参照)。「表面プラズモン共鳴」又は「BIA」は、相互作用体のいずれかを標識付けすることなしに、リアルタイムで生体特異的相互作用を検出する(例えばBIAcore)。結合表面における質量の変化(結合事象を示す)は、表面近くの光の屈折率を変化させ(表面プラズモン共鳴(SPR)の光現象)、その結果として、検出可能な信号をもたらし、この信号は生体分子間のリアルタイム反応の指標として使用することができる。
1つの実施態様の場合、標的遺伝子生成物又は試験物質は、固相上に固定される。固相上に固定された標的遺伝子生成物/試験化合物複合体は、反応終了時に検出することができる。標的遺伝子生成物を固体表面上に固定し、(固定されていない)試験化合物を、本明細書中で述べた検出可能な標識で直接的又は間接的に標識付けできることが好ましい。
LRP-1又はLRP-2、抗LRP-1又はLRP-2抗体、或いはその標的分子のいずれかを固定化することにより、タンパク質の一方又は両方の未複合形態から複合形態を分離することを容易にすること、並びにアッセイの自動化に対応することが望ましい。試験化合物とLRP-1又はLRP-2タンパク質との結合、又は候補化合物の存在及び不存在におけるLRP-1又はLRP-2タンパク質と標的分子との相互作用は、反応体を含有するのに適した任意の容器内で達成することができる。このような容器の例は、マイクロタイター・プレート、試験管、及びミクロ遠心分離管を含む。1実施態様の場合、タンパク質の一方又は両方がマトリックスに結合するのを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ/LRP-1又はLRP-2融合タンパク質、又はグルタチオン-S-トランスフェラーゼ/標的融合タンパク質をグルタチオンセファロース・ビード(Sigma Chemical, ミズーリ州セントルイス)又はグルタチオン誘導型マイクロタイター・プレート上に吸着させることができる。これらのビード又はプレートを次いで、試験化合物と、或いは試験化合物及び非吸着標的タンパク質又はLRP-1又はLRP-2タンパク質と合体させ、そしてこの混合物を複合体形成につながる条件下で(塩及びpHに関する生理学的条件で)インキュベートする。インキュベート後、ビート又はマイクロタイター・プレート・ウェルを洗浄することにより、未結合成分を除去し、ビードの場合にはマトリックスを固定化し、こうして形成された複合体を直接的または間接的に例えば上述のように見極める。或いは、複合体をマトリックスから解離し、そして標準的な技術を用いてLRP-1又はLRP-2結合レベル又は活性レベルを見極める。
LRP-1又はLRP-2タンパク質、或いは標的分子をマトリックス上に固定化するためのその他の技術は、ビオチンとストレプトアビジンとの接合を用いることを含む。ビオチン化されたLRP-1又はLRP-2タンパク質又は標的分子を、当業者に知られた技術(例えばビオチン化キット、Pierce Chemicals、イリノイ州ロックフォード)を用いてビオチン-NHS(N-ヒドロキシ-スクシニミド)から調製し、そしてストレプトアビジンを塗被された96ウェル・プレート(Pierce Chemical)のウェル内に固定化することができる。
アッセイを行うために、固定された成分を含有する塗被済表面に、固定化されていない成分を添加する。反応完了後、形成された複合体が固体表面上に固定化されたままになる条件下で、未反応成分を(例えば洗浄によって)除去する。固体表面上に固定された複合体の検出は、多くの方法で達成することができる。それまでは固定化されていない成分を前標識付けする場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。それまでは固定化されていない成分を前標識付けしない場合、間接的な標識を使用することにより、例えば固定化成分に対して特異的な標識付け抗体(この抗体は直接的又は間接的に、例えば標識付け抗Ig抗体で標識付けすることができる)を使用して、表面上に固定された複合体を検出することができる。
1実施態様の場合、このアッセイは、LRP-1又はLRP-2タンパク質又は標的分子と反応性ではあるが、しかしLRP-1又はLRP-2タンパク質とその標的分子との結合の妨害はしない抗体を利用して実施される。このような抗体をプレートのウェルに誘導し、そして未結合の標的又はLRP-1又はLRP-2タンパク質を、抗体接合によってウェル内に捕捉することができる。このような複合体の検出方法は、GST固定化複合体に関して上述した方法に加えて、LRP-1又はLRP-2タンパク質又は標的分子と反応性の抗体を使用した複合体の免疫検出、並びに、LRP-1又はLRP-2タンパク質又は標的分子と関連する酵素活性を検出することに依存する酵素連関アッセイを含む。
或いは、無細胞アッセイを液相で行うこともできる。このようなアッセイの場合、反応生成物は、多数の標準的な技術のいずれかによって未反応成分から分離される。このような技術の一例としては、分画遠心法(例えばRivas, G.及びMinton, A.P.(1993)Trends Biochem Sci 18:284-7参照)；クロマトグラフィ(ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ)；電気泳動法(例えばAusubel, F.他編、Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New York参照)；及び免疫沈降(例えばAusubel, F.他編(1999) Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley: New York参照)が挙げられる。このような樹脂及びクロマトグラフィ技術は当業者に知られている(例えばHeegaard, N.H., (1998)J Mol Recognit 11:141-8; Hage, D.S.及びTweed, S.A.(1997)J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 699:499-525参照)。さらに、本明細書中に記載したように、蛍光エネルギー転移を従来の形式で利用することにより、溶液から複合体をさらに精製することなしに結合を検出することもできる。
好ましい実施態様において、アッセイは、LRP-1又はLRP-2タンパク質又はその生体活性部分を、LRP-1又はLRP-2タンパク質に結合する既知化合物と接触させることによりアッセイ混合物を形成し、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させ、そしてLRP-1又はLRP-2タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を見極めることを含み、LRP-1又はLRP-2タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を見極めることは、既知化合物と比較して、LRP-1又はLRP-2タンパク質又はその生体活性部分に優先的に結合する試験化合物の能力、或いは標的分子の活性を調節する試験化合物の能力を見極めることを含む。
標的遺伝子生成物は、1つ又は2つ以上の細胞マクロ分子又は細胞外マクロ分子、例えばタンパク質とin vivoで相互作用することができる。この論議を目的として、このような細胞マクロ分子及び細胞外マクロ分子を、本明細書中では「結合相手」と呼ぶ。標的遺伝子生成物の活性を調整する上で、このような相互作用を妨害する化合物が有用な場合がある。このような化合物の一例としては、抗体、ペプチド及び小分子のような分子が挙げられる。この実施態様で使用するのに好ましい標的遺伝子/生成物は、本明細書中で同定されたLRP-1又はLRP-2遺伝子である。別の実施態様の場合、本発明は、LRP-1又はLRP-2標的分子の下流エフェクターの活性を調節することにより、LRP-1又はLRP-2タンパク質の活性を調節する試験化合物の能力を見極める方法を提供する。例えば、適切な標的に対するエフェクター分子の活性を見極めることができ、或いは既述のように、適切な標的とのエフェクターの結合を見極めることができる。
標的遺伝子生成物とその細胞結合相手又は細胞外結合相手との間の相互作用を妨害する化合物を同定するために、標的遺伝子生成物と結合相手とを含有する反応混合物を、これら2つの生成物が複合体を形成するのに十分な条件下で十分な時間にわたって調製する。阻害物質を試験するために、反応混合物は試験化合物の存在において、また不存在において提供される。試験化合物を最初、反応混合物に含むことができ、或いは、標的遺伝子及びその細胞結合相手又は細胞外結合相手の添加に続く時点で添加することができる。対照反応混合物を試験化合物を伴わずに、又はプラセボを共にインキュベートする。次いで、標的遺伝子生成物と、その細胞結合相手又は細胞外結合相手との間の複合体形成を検出する。対照反応において複合体が形成され、しかし試験化合物を含有する反応混合物中には形成されない場合、このことは、化合物が標的遺伝子生成物と相互作用性結合相手との間の相互作用を妨害することを示す。加えて、試験化合物と正常標的遺伝子生成物とを含有する反応混合物中の複合体形成を、試験化合物と突然変異標的遺伝子生成物とを含有する反応混合物中の複合体形成と比較することもできる。このような比較は、突然変異体の相互作用を妨害し、しかし正常標的遺伝子生成物を妨害することのない化合物を同定することが望ましい場合に重要であり得る。
これらのアッセイは、異種フォーマット又は同種フォーマットで行うことができる。異種アッセイは、標的遺伝子生成物又は結合相手を固相上に結合し、そして、反応終了時に、固相上に固定された複合体を検出することを含む。同種アッセイの場合、反応全体を液相で行う。いずれのアプローチにおいても、反応体の添加の順序を変更して、被験化合物に関する異なる情報を得ることができる。例えば標的遺伝子生成物と結合相手との相互作用を例えば競合によって妨害する試験化合物を、試験物質の存在において反応を行うことにより同定することができる。或いは、予め形成された複合体を崩壊する試験化合物、例えば複合体から成分の1つを押し退ける結合定数の高い化合物を、複合体が形成された後で反応混合物に試験化合物を添加することにより試験することもできる。種々のフォーマットを以下に手短かに説明する。
異種アッセイ系の場合、標的遺伝子生成物、又は相互作用性の細胞結合相手又は細胞外結合相手を固体表面上(例えばマイクロタイター・プレート)に固定する一方、非固定種を直接的又は間接的に標識付けする。固定種は、非共有結合又は共有結合によって固定化することができる。或いは、固定されるべき種に対して特異的な固定化抗体を使用することにより、種を固体表面に固定することもできる。
アッセイを行うために、固定化種の相手を、試験化合物を伴って又は伴わずに、塗被済表面に暴露する。反応完了後、未反応成分を(例えば洗浄によって)除去し、そして形成された複合体は固体表面上に固定化されたままとなる。固定化されていない種を前標識付けする場合には、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。固定化されていない種を前標識付けしない場合、間接的な標識を使用することにより、例えば最初は固定化されていなかった種に対して特異的な標識付け抗体(この抗体は直接的又は間接的に、例えば標識付け抗Ig抗体で標識付けすることができる)を使用して、表面上に固定された複合体を検出することができる。反応成分の添加順序に応じて、複合体形成を阻害する試験化合物、又は予め形成された複合体を崩壊する試験化合物を検出することができる。
或いは、試験化合物の存在又は不存在において反応を液相で実施し、未反応成分から反応生成物を分離し、そして例えば溶液中に形成された複合体を固定化するための、結合成分の1つに対して特異的な固定化抗体と、固定された複合体を検出するための、他方の相手に対して特異的な標識付け抗体とを使用して、複合体を検出する。ここでもやはり、液相への反応体の添加順序に応じて、複合体を阻害する試験化合物、又は予め形成された複合体を崩壊する試験化合物を同定することができる。
本発明の別の実施態様の場合、同種アッセイを用いることができる。例えば、標的遺伝子生成物と、相互作用性の細胞結合相手生成物又は細胞外結合相手生成物との予め形成された複合体を、標的遺伝子生成物又はこれらの結合相手が標識付けされるように、しかし標識によって発生したシグナルが複合体形成によりクエンチングされるように調製する(例えば、免疫アッセイのためにこのアプローチを利用する米国特許第4,109,496号明細書参照)。予め形成された複合体からの種の1つと競合するか、又はこれを押し退ける試験物質を添加すると、バックグラウンドを上回るシグナルが発生する。こうして、標的遺伝子生成物-結合相手の相互作用を妨害する試験物質を同定することができる。
さらに別の観点において、LRP-1又はLRP-2タンパク質は2ハイブリッド・アッセイ又は3ハイブリッド・アッセイにおいて「ベイト・タンパク質」として使用することにより(例えば米国特許第5,283,317号明細書；Zervos他(1993)Cell 72:223-232; Madura他(1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel他(1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi他(1993) Oncogene 8:1693-1696;及びBrent 国際公開第94/10300号パンフレット参照)、他のタンパク質を同定することができる。これらのタンパク質はLRP-1又はLRP-2と結合又は相互作用し(「LRP-1又はLRP-2結合タンパク質」、或いは「LRP-1又はLRP-2-bp」)、そしてLRP-1又はLRP-2活性に関与する。このようなLRP-1又はLRP-2-bpは、LRP-1又はLRP-2によって媒介される信号伝達経路の下流要素としての、LRP-1又はLRP-2タンパク質或いはLRP-1又はLRP-2標的によるシグナルのアクチベータ又は阻害物質であり得る。
2ハイブリッド系は、ほとんどの転写因子のモジュラー特質に基づいている。これらの転写因子は分離可能なDNA結合ドメイン及び活性化ドメインとから成る。手短かに云えば、アッセイは2つの異なるDNA構造を利用する。一方の構造において、LRP-1又はLRP-2タンパク質をコードする遺伝子は、既知の転写因子(例えばGAL-4)のDNA結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構造の場合、同定されていないタンパク質(「プレイ」又は「試料」)をコードする、DNA配列ライブラリに由来するDNA配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。(或いは、LRP-1又はLRP-2タンパク質をアクチベーター・ドメインに融合することもできる。)「ベイト」及び「プレイ」タンパク質がin vivoで相互作用可能であり、LRP-1又はLRP-2に依存する複合体を形成する場合に、転写因子のDNA結合ドメイン及び活性化ドメインは密に近接することになる。この近接関係は、転写因子に対して応答性の転写調節部位に作用連関されたリポーター遺伝子(lacZ)の転写を可能にする。リポーター遺伝子の発現を検出することができ、また、機能性転写因子を含有する細胞コロニーを分離して使用することにより、LRP-1又はLRP-2タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得ることができる。
別の実施態様の場合、LRP-1又はLRP-2発現のモジュレーターが同定される。例えば細胞又は無細胞混合物を候補化合物と接触させ、そしてLRP-1又はLRP-2 mRNA又はタンパク質の発現を、候補化合物の不存在におけるLRP-1又はLRP-2 mRNA又はタンパク質の発現レベルに対して評価する。LRP-1又はLRP-2 mRNA又はタンパク質の発現が候補化合物の存在において、その不存在の場合よりも多いときには、その候補化合物は、LRP-1又はLRP-2 mRNA又はタンパク質の発現の刺激物質として同定される。LRP-1又はLRP-2 mRNA又はタンパク質の発現が候補化合物の存在において、その不存在の場合よりも少ない(統計的に有意に少ない)ときには、その候補化合物は、LRP-1又はLRP-2 mRNA又はタンパク質の発現の阻害物質として同定される。LRP-1又はLRP-2 mRNA又はタンパク質の発現レベルは、LRP-1又はLRP-2 mRNA又はタンパク質の検出に関して本明細書中に記載した方法によって見極めることができる。
別の観点において、本発明は、本明細書に記載したアッセイのうちの2つ又は3つ以上を組み合わせることに関する。例えば細胞に基づくアッセイ又は無細胞アッセイを用いて、調節物質を同定することができ、そしてLRP-1又はLRP-2タンパク質の活性を調節するこの物質の能力を、例えば動物(例えば骨粗鬆症、パジェット病及び骨形成不全のような骨障害の動物モデル)においてin vivoで確認することができる。
本発明はさらに、上記スクリーニング・アッセイによって同定される新規の物質に関する。従って、本発明の範囲には、本明細書に記載したように同定された物質(例えばLRP-1又はLRP-2調節物質、アンチセンスLRP-1又はLRP-2核酸分子、LRP-1又はLRP-2特異的抗体、又はLRP-1又はLRP-2結合相手)をさらに使用することにより、このような物質を用いた治療の効果、毒性、副作用又は作用メカニズムを見極めることが含まれる。さらに、上記スクリーニング・アッセイによって同定された新規の物質を、本明細書中に記載した治療のために使用することができる。
予測医療
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、及びモニタリング臨床試験を予後(予測)目的で用いることにより個体を治療する予測医療の分野に関する。
一般に、本発明は、患者がLRP-1又はLRP-2をコードする遺伝子の損傷又は誤発現に関連する障害の危険に晒されているか否かを見極める方法を提供する。
このような障害は例えば、LRP-1又はLRP-2遺伝子の誤発現と関連する障害；骨の障害を含む。
この方法は下記のもののうちの1つ又は2つ以上を含む：
LRP-1又はLRP-2遺伝子の発現に影響を与える突然変異の有無を、患者の組織内で検出すること、或いは、遺伝子の発現を制御する領域内の突然変異、例えば5'制御領域内の突然変異の有無を検出すること；
LRP-1又はLRP-2遺伝子の構造を変化させる突然変異の有無を、患者の組織内で検出すること；
患者の組織内で、LRP-1又はLRP-2遺伝子の誤発現をmRNAレベルで検出すること、例えばmRNAの非野生型レベルを検出すること；
患者の組織内で、遺伝子の誤発現をタンパク質レベルで検出すること、例えばLRP-1又はLRP-2ポリペプチドの非野生型レベルを検出すること。
好ましい実施態様の場合、この方法は：LRP-1又はLRP-2遺伝子からの1つ又は2つ以上のヌクレオチドの抹消；遺伝子内への1つ又は2つ以上のヌクレオチドの挿入、点突然変異、例えば遺伝子の1つ又は2つ以上のヌクレオチドの置換、遺伝子の総染色体転位、例えば転座、反転、又は抹消、のうちの1つ以上の存在を確認することを含む。
例えば、遺伝的損傷の検出は：(i)オリゴヌクレオチドを含むプローブ/プライマーであって、オリゴヌクレオチドが、自然発生型突然変異体に由来するセンス又はアンチセンス配列と、或いはLRP-1又はLRP-2遺伝子に自然会合する5'又は3'フランキング配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列領域を含有する、プローブ/プライマーを準備し；(ii) プローブ/プライマーを組織の核酸に暴露し、そしてプローブ/プライマーを核酸とハイブリッド形成、例えばin situハイブリッド形成することにより、遺伝的損傷の有無を検出すること、を含む。
好ましい実施態様の場合、誤発現の検出は、下記のうちの1つ以上の存在を確認することを含む：LRP-1又はLRP-2遺伝子のメッセンジャーRNA転写レベルの変化；遺伝子のメッセンジャーRNA転写の非野生型スプライシング・パターンの存在；又はLRP-1又はLRP-2の非野生型レベル。
本発明の方法は、出生前に用いるか、又は患者の子孫が障害の危険に晒されることになるか否かを見極めるために用いることができる。
好ましい実施態様の場合、この方法は、LRP-1又はLRP-2遺伝子の構造を見極めることを含み、異常な構造が障害の危険を示す。
好ましい実施態様の場合、この方法は患者からの試料を、遺伝子と特異的にハイブリッド形成する、LRP-1又はLRP-2タンパク質又は核酸に対する抗体と接触させることを含む。これら及び他の実施態様を以下に説明する。
診断・予後アッセイ
本発明の診断・予後アッセイは、LRP-1又はLRP-2分子の発現レベルを評価する方法、及びLRP-1又はLRP-2分子の配列における変動及び突然変異を同定する方法を含む。
発現のモニタリング及びプロファイリング
生体試料中のLRP-1又はLRP-2タンパク質又は核酸の存在、レベル又は不存在は、被験者から生体試料を得、そしてLRP-1又はLRP-2タンパク質、又はLRP-1又はLRP-2タンパク質をコードする核酸(例えばmRNA、ゲノムDNA)を検出することができる化合物又は物質と、生体試料とを接触させることにより、LRP-1又はLRP-2タンパク質又は核酸の存在を生体試料中で検出することによって評価することができる。「生体試料」という用語は、患者から分離された組織、細胞及び流体、並びに患者中に存在する組織、細胞及び流体を含む。好ましい生体試料は血清である。LRP-1又はLRP-2遺伝子の発現レベルは多数の方法で測定することができる。これらの方法の一例としては、LRP-1又はLRP-2遺伝子によってコードされたmRNAを測定すること；LRP-1又はLRP-2遺伝子によってコードされたタンパク質の量を測定すること；又はLRP-1又はLRP-2遺伝子によってコードされたタンパク質の活性を測定することが挙げられる。
細胞中のLRP-1又はLRP-2遺伝子に対応するmRNAレベルは、in situフォーマット及びin vitroフォーマットの両方によって見極めることができる。
分離されたmRNAはハイブリダイゼーション・アッセイ又は増幅アッセイで使用することができる。これらのアッセイの一例としては、サザン分析又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析及びプローブ・アレイが挙げられる。mRNAレベルを検出するための1つの好ましい診断法は、分離されたmRNAを核酸分子(プローブ)と接触させることを伴う。この核酸分子は、被検出遺伝子によってコードされたmRNAとハイブリッド形成することができる。核酸プローブは例えば完全長LRP-1又はLRP-2核酸、例えばSEQ ID NO:1の核酸、又はその一部、例えば7つ以上、15個、30個、50個、100個、250個又は500個のヌクレオチド長から成り、緊縮条件下でLRP-1又はLRP-2 mRNA又はゲノムDNAと特異的にハイブリッド形成するのに十分なオリゴヌクレオチドであってよい。プローブはアレイ、例えば下記のアレイの所定のアドレスに配置することができる。診断アッセイに使用するのに適したその他のプローブをここに説明する。
1フォーマットにおいて、例えば、分離されたmRNAをアガロースゲル上で走行させ、ゲルから膜、例えばニトロセルロースにmRNAを移すことにより、mRNA(又はcDNA)を表面上に固定化し、そしてプローブと接触させる。別のフォーマットでは、プローブを表面上に固定化し、そしてmRNA(又はcDNA)を例えば下記二次元遺伝子チップアレイにおいて、プローブと接触させる。当業者ならば、LRP-1又はLRP-2遺伝子によってコードされたmRNAのレベルを検出するのに用いる既知のmRNA検出法を適合させることができる。
LRP-1又はLRP-2の一方によってコードされる試料中のmRNAレベルを、核酸増幅を用いて、例えばrtPCR(Mullis(1987)米国特許第4,683,202号明細書)、リガーゼ連鎖反応(Barany(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193)、自己持続型配列複製(Guatelli他(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwoh他(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-ベータ・レプリカーゼ(Lizardi他(1988)Bio/Technology 6:1197)、ローリング・サークル型複製(Lizardi他、米国特許第5,854,033号明細書)、又は任意のその他の核酸複製法によって評価し、続いて、当業者に知られた技術を用いて、増幅された分子を検出することができる。本明細書中に使用される増幅プライマーは、遺伝子の5'又は3'領域(それぞれプラス鎖及びマイナス鎖、又はその逆)にアニールし、そしてその間に短い領域を含有することができる核酸分子対として定義される。一般に、増幅プライマーは約10〜30個のヌクレオチド長であり、約50〜200個のヌクレオチド長の領域をフランキングする。適切な条件下でそして適切な試薬を用いることにより、このようなプライマーは、プライマーによってフランキングされたヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
in situ法の場合、細胞又は組織の試料を調製/処理し、そして支持体、典型的にはガラススライド上に固定化し、次いで分析されているLRP-1又はLRP-2遺伝子をコードするmRNAとハイブリッド形成することができるプローブと接触させることができる。
別の実施態様の場合、これらの方法はさらに、対照試料と、LRP-1又はLRP-2 mRNA又はゲノムDNAを検出することができる化合物又は物質とを接触させ、そして対照試料中のLRP-1又はLRP-2 mRNA又はゲノムDNAの存在を、試験試料中のLRP-1又はLRP-2 mRNA又はゲノムDNAの存在と比較することを含む。さらに別の実施態様の場合、米国特許第5,695,937号明細書に記載されているような連続的な遺伝子発現分析を用いることにより、LRP-1又はLRP-2転写レベルを検出することができる。
LRP-1又はLRP-2によってコードされるタンパク質のレベルを見極めるために、種々の方法を用いることができる。一般に、これらの方法は、タンパク質に選択的に結合する物質、例えば抗体を試料と接触させることにより、試料中のタンパク質レベルを評価することを含む。好ましい実施態様の場合、抗体は検出可能な標識を担持する。抗体はポリクローナル、又はより好ましくはモノクローナルであってよい。無傷の抗体又はそのフラグメント(例えばFab又はF(ab')2)を使用することができる。プローブ又は抗体に関連する「標識付け」という用語は、検出可能な物質をプローブ又は抗体にカップリング（すなわち物理的連関)することによるプローブ又は抗体の直接的な標識付け、並びに、検出可能な物質との反応性によるプローブ又は抗体の間接的標識付けを包含するものとする。検出可能な物質の例を本明細書中に示す。
これらの検出法を用いることにより、生体試料中のLRP-1又はLRP-2タンパク質をin vitro 又はin vivoで検出することができる。LRP-1又はLRP-2タンパク質のin vitro検出技術は、酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)、免疫沈降、免疫蛍光、酵素イムノ・アッセイ(EIA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、及びウェスタン・ブロット分析を含む。LRP-1又はLRP-2タンパク質を検出するためのin vivo技術は、患者中に標識付け抗LRP-1又はLRP-2抗体を導入することを含む。例えば、抗体は、放射性マーカーで標識付けすることができる。このマーカーの患者における存在及び位置は、標準的な画像形成技術によって検出することができる。別の実施態様の場合、試料を標識付け、例えばビオチン化し、次いでこれを抗体、例えば、抗体アレイ(下記の通り)上に配置された抗LRP-1又はLRP-2抗体に接触させる。試料は、例えば蛍光標識にカップリングされたアビジンで検出することができる。
別の実施態様の場合、これらの方法はさらに、対照試料と、LRP-1又はLRP-2タンパク質を検出することができる化合物又は物質とを接触させ、そして対照試料中のLRP-1又はLRP-2タンパク質の存在を、試験試料中のLRP-1又はLRP-2タンパク質の存在と比較することを含む。
本発明はまた、生体試料中のLRP-1又はLRP-2の存在を検出するためのキットを含む。例えば、キットは生体試料中のLRP-1又はLRP-2タンパク質又はmRNAを検出することができる化合物又は物質、及び標準を含むことができる。この化合物又は物質は、好適な容器内にパッケージングすることができる。キットはさらに、LRP-1又はLRP-2タンパク質又は核酸、又はLRP-1又はLRP-2タンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストを検出するためにキットを使用する際の指示書を含むことができる。
抗体に基づくキットの場合、キットは：(1)マーカーに対応するポリペプチドに結合する第1抗体(例えば固形支持体に取り付けられる)；及び任意には、(2)ポリペプチド又は第1抗体に結合し、そして検出可能な物質に接合される第2の異なる抗体を含むことができる。
オリゴヌクレオチドに基づくキットの場合、キットは：(1)オリゴヌクレオチド、例えばマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸配列とハイブリッド形成する、検出可能に標識付けされたオリゴヌクレオチド、或いは(2)マーカーに対応する核酸分子を増幅するのに有用なプライマー対を含むことができる。キットは、緩衝剤、保存剤又はタンパク質安定剤を含むこともできる。キットは、検出可能な物質(例えば酵素又は基質)を検出するのに必要な成分を含むこともできる。キットは対照試料又は一連の対照試料を含有することもできる。これらの対照試料は、アッセイして、含有される試験試料と比較することができる。キットのそれぞれの成分は、個々の容器内に密閉することができ、種々の容器の全ては、キットを使用して実施されるアッセイの結果を解釈するための指示書とともに、単一のパッケージ内に含まれることが可能である。
本明細書に記載された診断法は、誤発現された又は異常な又は望ましくないLRP-1又はLRP-2発現又は活性に関連する疾患又は障害を患っているか、或いはこの疾患又は障害を発生させる危険に晒されている患者を同定することができる。本明細書に使用する「望ましくない」という用語は、骨障害、例えば骨粗鬆症、パジェット病及び骨形成不全のような生体応答に関与する望ましくない現象を含む。
1実施態様の場合、異常な又は望ましくないLRP-1又はLRP-2発現又は活性に関連する疾患又は障害を同定する。患者から試料を得、そしてLRP-1又はLRP-2タンパク質又は核酸(例えばmRNA又はゲノムDNA)を評価し、LRP-1又はLRP-2タンパク質又は核酸のレベル、例えば存在又は不存在が、異常な又は望ましくないLRP-1又はLRP-2発現又は活性と関連する疾患又は障害を患者が患っているか、又はこれを発生させる危険に晒されていることの診断基準となる。本明細書に使用される「試料」という用語は、体液(例えば血清)、細胞試料、又は組織を含む、当該患者から得られる生体試料を意味する。
本明細書中に記載された予後アッセイを用いることにより、異常な又は望ましくないLRP-1又はLRP-2発現又は活性と関連する疾患又は障害を治療するための物質(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド擬似体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子又はその他の薬物候補)を患者に投与できるか否かを見極めることができる。例えば、このような方法を用いることにより、患者を骨障害、例えば骨粗鬆症、パジェット病及び骨形成不全に対する薬物で効果的に治療することができるか否かを見極めることができる。
別の観点において、本発明は、デジタル・コードされた複数のデータ記録を有するコンピューター媒体を提供する。それぞれのデータ記録は、試料中のLRP-1又はLRP-2の発現レベルを表す値と、試料の記述子とを含む。試料の記述子は試料の識別子、試料が導出された被験者(例えば患者)、診断又は治療(例えば好ましい治療)であってよい。好ましい実施態様の場合、データ記録はさらに、LRP-1又はLRP-2以外の遺伝子(例えばLRP-1又はLRP-2障害と関連する他の遺伝子、又はアレイ上の他の遺伝子)の発現レベルを表す値を含む。データ記録はテーブルとして、例えばリレーショナル・データベースのようなデータベース部分であるテーブル(例えばOracle又はSybaseデータベース環境のSQLデータベース)として構成することができる。
また試料の評価方法も提供される。この方法は、例えば患者から試料を準備し、そして試料の遺伝子発現プロファイルを見極めることを含み、プロファイルはLRP-1又はLRP-2発現レベルを表す値を含む。この方法はさらに、値又はプロファイル(すなわち多重値)を基準値又は基準プロファイルと比較することを含む。試料の遺伝子発現プロファイルは、本明細書に記載された方法のいずれかによって(例えば試料から核酸を準備し、そして核酸をアレイと接触させることによって)得ることができる。この方法を用いることにより、患者の骨障害、例えば骨粗鬆症、パジェット病及び骨形成不全を診断することができ、LRP-1又はLRP-2発現の増減は、患者が骨障害、例えば骨粗鬆症、パジェット病及び骨形成不全を患っているか、又は患う傾向があることを示す。この方法は、骨障害、例えば骨粗鬆症、パジェット病及び骨形成不全の治療をモニタリングするのに用いることができる。例えば、遺伝子発現プロファイルは、治療を受けている患者からの試料に関して見極めることができる。プロファイルは、基準プロファイル、或いは治療前又は疾患の開始前に患者から得られたプロファイルと比較することができる(例えばGolub他(1999)Science 286:531参照)。
さらに別の観点において、本発明は試験化合物の評価方法を提供する(上記「Screening Assays」も参照)。この方法は、細胞及び試験化合物を準備し；試験化合物を細胞と接触させ；接触させた細胞の患者発現プロファイルを得；そして患者発現プロファイルを1つ又は2つ以上の基準プロファイルと比較することを含む。これらのプロファイルは、LRP-1又はLRP-2発現レベルを表す値を含む。好ましい実施態様の場合、患者発現プロファイルを標的プロファイル、例えば正常細胞又は細胞の所期状態に対応するプロファイルと比較する。患者発現プロファイルが、未接触細胞から得られた発現プロファイルよりも標的プロファイルに似ている場合には、試験化合物は好ましく評価される。
別の観点において、本発明は患者の評価方法を提供する。この方法は：a)患者からの試料を、例えば介護者、例えば患者から試料を得る介護者から得;b)試料に対応する患者発現プロファイルを見極めることを含む。任意には、この方法はさらに、c) 患者発現プロファイルを1つ又は2つ以上の基準発現プロファイルと比較するステップ、及びd) 患者発現プロファイルと最も類似した基準プロファイルを選択するステップのいずれか又は両方を含む。患者発現プロファイルと基準プロファイルとは、LRP-1又はLRP-2発現レベルを表す値を含む。種々の日常的な統計尺度を用いて、2つの基準プロファイルを比較することができる。1つの考えられ得る測定基準は、2つのプロファイル間の差である距離ベクトルの長さである。患者プロファイル及び基準プロファイルのそれぞれが、多次元ベクトルとして表される。それぞれの次元はプロファイルにおける値である。
この方法はさらに、結果を介護者に伝達することを含む。結果は患者発現プロファイル、患者発現プロファイルと別のプロファイルとの比較結果、最も類似した基準プロファイル、又は上述のもののうちのいずれかの記述子であってよい。結果はコンピュータ・ネットワークによって伝達することができ、例えばこの結果は、コンピュータ伝送の形態、例えば搬送波内に組み込まれたコンピュータ・データ信号の形態であってよい。
また、下記ステップを生じさせるための実行可能なコードを有するコンピュータ媒体が提供される。これらのステップとは、患者発現プロファイルを受信するステップと；基準発現プロファイルのデータベースにアクセスするステップと；i)患者発現プロファイルと最も類似するマッチング基準プロファイルを選択するステップ又はii)1つ以上の基準プロファイルとの患者発現プロファイルの類似性に関する1つ以上の比較スコアを見極めるステップである。患者発現プロファイル及び基準発現プロファイルのそれぞれは、LRP-1又はLRP-2発現レベルを表す値を含む。
変異又は突然変異の検出
本発明の方法を用いることにより、LRP-1又はLRP-2遺伝子の遺伝的変化を検出し、これにより、変化した遺伝子を有する患者が、LRP-1又はLRP-2タンパク質活性又は核酸発現の誤調整によって特徴付けられる障害、例えば骨障害(例えば骨粗鬆症、パジェット病及び骨形成不全)の危険に晒されているか否かを見極めることができる。好ましい実施態様の場合、これらの方法は、LRP-1又はLRP-2タンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を与える変化、又はLRP-1又はLRP-2遺伝子の誤発現、のうちの少なくとも一方によって特徴付けられる遺伝的変化の有無を、患者からの試料中で検出することを含む。例えば、このような遺伝的変化は、1) LRP-1又はLRP-2遺伝子からの1つ又は2つ以上のヌクレオチドの抹消；2) LRP-1又はLRP-2遺伝子への1つ又は2つ以上のヌクレオチドの付加；3) LRP-1又はLRP-2遺伝子の1つ又は2つ以上のヌクレオチドの置換；4) LRP-1又はLRP-2遺伝子の染色体転位；5) LRP-1又はLRP-2遺伝子のメッセンジャーRNA転写レベルの変化；6) LRP-1又はLRP-2遺伝子、例えばゲノムDNAのメチル化パターンの異常修飾；7) LRP-1又はLRP-2遺伝子のメッセンジャーRNA転写の非野生型スプライシング・パターンの存在、8) LRP-1又はLRP-2タンパク質の非野生型レベル、9) LRP-1又はLRP-2遺伝子の対立遺伝子損失、及び10) LRP-1又はLRP-2タンパク質の不適切な翻訳後修飾、のうちの1つ以上の存在を確認することにより、検出することができる。
ポリメラーゼ連鎖反応、例えばPCR又はRACE PCRにおいて、或いはライゲーション連鎖反応(LCR)において、プローブ/プライマーなしで変化を検出することができる。ライゲーション連鎖反応は、LRP-1又はLRP-2遺伝子の点突然変異を検出するのに特に有用である場合がある。この方法は、患者から細胞試料を採取し、試料から核酸(例えばゲノム、mRNA又はその両方)を分離し、LRP-1又はLRP-2遺伝子のハイブリッド形成及び増幅が(もし存在するならば)発生するような条件下でLRP-1又はLRP-2遺伝子と特異的にハイブリッド形成する1つ又は2つ以上のプライマーと、核酸試料とを接触させ、そして、増幅生成物の有無を検出するか、或いは増幅生成物のサイズを検出し、対照試料と長さを比較するステップを含むことができる。本明細書中に記載された突然変異を検出するのに用いられる技術のいずれかとの関連において、予備的な増幅ステップとしてPCR又はLCRを用いるのが望ましい場合があることが予想される。或いは、本明細書中に記載された他の増幅方法又は当業者に知られた増幅方法を用いることもできる。
別の実施態様の場合、試料細胞からのLRP-1又はLRP-2遺伝子における突然変異は、制限酵素開裂パターンの変化を検出することにより同定することができる。例えば、試料及び対照DNAを分離し、(任意には)増幅し、1つ又は2つ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そしてフラグメント長を例えばゲル電気泳動法によって見極め、比較する。試料DNAと対照DNAとの間のフラグメント長サイズの差は、試料DNAの突然変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム(例えば米国特許第5,498,531号明細書参照)を使用することにより、リボザイム開裂部位の発生又は損失による特異的突然変異の存在をスコアリングすることができる。
他の実施態様の場合、試料及び対照核酸、例えばDNA又はRNA、二次元アレイ、例えばチップに基づくアレイをハイブリッド形成することにより、LRP-1又はLRP-2における遺伝的突然変異を同定することができる。このようなアレイは複数のアドレスを含む。これらのアドレスのそれぞれは他のアドレスから位置的に区別可能である。複数のアドレスのそれぞれには異なるプローブを配置する。プローブはLRP-1又はLRP-2核酸の領域又はその推定上の変異体(例えば対立遺伝子変異体)に対して相補的であってよい。プローブはLRP-1又はLRP-2核酸の領域に対して1つ又は2つ以上のミスマッチ(例えば不安定ミスマッチ)を有することができる。アレイは高密度のアドレスを有することができ、例えば数百又は数千個のオリゴヌクレオチド・プローブを含有することができる(Cronin, M.T.他(1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal, M.J.他(1996) Nature Medicine 2: 753-759)。例えばLRP-1又はLRP-2における遺伝的突然変異は、前掲のCronin, M.T.他に記載されているような発光型DNAプローブを含有する二次元アレイで同定することができる。手短かに云えば、プローブの第1ハイブリッド形成アレイを用いて、一連のオーバーラッピング・プローブから成る線状アレイを形成することにより、試料及び対照中のDNAの長い延びを通して走査し、これにより配列間の塩基変化を同定することができる。このステップは点突然変異の同定を可能にする。このステップに続いて、検出される全ての変異形又は突然変異形に対して相補的な、より小さな特定プローブ・アレイを使用することにより、第2ハイブリッド形成アレイが特異的突然変異の特徴付けを可能にする。それぞれの突然変異アレイは、並列プローブ集合から成り、一方の集合は野生型遺伝子に対して相補的であり、他方の集合は突然変異形遺伝子に対して相補的である。
さらに別の実施態様の場合、当業者に知られた種々の配列決定反応のいずれかを用いて、LRP-1又はLRP-2遺伝子を直接的に配列決定し、そして試料LRP-1又はLRP-2の配列を、対応する野生型(対照)配列と比較することにより、突然変異を検出することができる。質量分析による配列決定を含む診断アッセイ((1995)Biotechniques 19:448)を実施すると、自動配列決定手順を利用することができる。
LRP-1又はLRP-2遺伝子内の突然変異の他の検出方法は、開裂剤に対する保護を利用して、RNA/RNA又はRNA/DNAへテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法を含む(Myers他(1985)Science 230:1242; Cotton他(1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85:4397; Saleeba他(1992) Methods Enzymol 217:286-295)。
さらに別の実施態様の場合、ミスマッチ開裂反応は、細胞試料から得られたLRP-1又はLRP-2 cDNA中の点突然変異を検出してマッピングするための規定の系内で、二本鎖DNA中のミスマッチ塩基対を認識する1つ又は2つ以上のタンパク質 (いわゆる「DNAミスマッチ修復」酵素)を採用する。例えばE.coliのmutY酵素はG/AミスマッチでAを開裂し、HeLa細胞に由来するチミジンDNAグリコシラーゼは、G/TミスマッチでTを開裂する(Hsu他(1994)Carcinogenesis 15:1657-1662;米国特許第5,459,039号明細書)。
他の実施態様の場合、電気泳動移動度の変化を利用することにより、LRP-1又はLRP-2遺伝子の突然変異を同定する。例えば一本鎖配座多形(SSCP)を用いて、突然変異型核酸と野生型核酸との間の電気泳動移動度の差を検出することができる(Orita他(1989)Proc Natl. Acad. Sci USA: 86:2766、Cotton(1993) Mutat. Res. 285:125-144;及びHayashi(1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-39も参照)。試料及び対照LRP-1又はLRP-2核酸の一本鎖DNAフラグメントは変性させられ、そして復元することが可能になる。一本鎖核酸の二次構造は配列に従って変化し、その結果として生じる電気泳動移動度の変化は、単一の塩基の変化の検出をも可能にする。DNAフラグメントを標識付けするか、或いは標識付けプローブで検出することができる。このアッセイの感度は、(DNAではなく)RNAを使用することにより向上させることができる。RNAを使用した場合、二次構造は配列の変化に対してより鋭敏である。好ましい実施態様の場合、この方法は、電気泳動移動性の変化に基づいてヘテロ二本鎖分子を分離するためのヘテロデュプレックスを利用する(Keen他(1991) Trends Genet 7:5)。
さらに別の実施態様の場合、変性勾配ゲル電気泳動法(DGGE)(Myers他(1985) Nature 313:495を用いて、所定の勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミド・ゲル中の突然変異型又は野生型フラグメントの移動度をアッセイする。DGGEを分析法として用いる場合、例えばほぼ40bpの高融点GCが豊富なDNAから成るGCクランプをPCRによって付加することにより、DNAが完全には変性しないことを保証するように、DNAが修飾されることになる。別の実施態様の場合、変性勾配の代わりに温度勾配を用いることにより、対照及び試料DNAの移動度の差を同定する(Rosenbaum 及びReissner(1987) Biophys Chem 265:12753)。
点突然変異を検出するための他の技術例としては、選択的オリゴヌクレオチド・ハイブリッド形成、選択的増幅、又は選択的プライマー伸長が挙げられる(Saiki他(1986) Nature 324:163); Saiki他(1989) Proc. Natl Acad. Sci USA 86:6230)。点突然変異の別の検出法は、Xu他((2001) Nature Biotechnol. 19:148)に記載されているような、オリゴヌクレオチドの化学的連結反応である。試料核酸の照会部位に位置するヌクレオチドが照会オリゴヌクレオチドに対して相補的である場合には、照会部位に選択的にアニールする1つのオリゴヌクレオチドを有する隣接オリゴヌクレオチドが、互いに連結反応させられる。連結反応は例えば、オリゴヌクレオチドにカップリングされた蛍光色素によってモニタリングすることができる。
或いは、選択的PCR増幅に依存する対立遺伝子特異的な増幅技術を、本発明との関連において用いることもできる。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、当該突然変異を分子中心に担持することができる(従って、増幅は示差ハイブリダイゼーションに依存する)(Gibbs他(1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448)か、或いは1つのプライマーの3'最末端に担持することができ、この場所で、適切な条件下ではミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止又は低減することができる(Prossner (1993) Tibtech 11:238)。加えて、突然変異領域に新規の制限部位を導入することにより、開裂に基づく検出を行うことが望ましい(Gasparini他(1992) Mol. Cell Probes 6:1)。或る特定の実施例において、増幅のためのTaq リガーゼを使用して増幅を行うことも可能であることが予想される(Barany(1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189)。このような事例において、5'配列の3'末端に完全マッチングがある場合にのみ、連結反応が発生し、このことは、増幅の有無を探すことにより特異部位に既知の突然変異の存在を検出することを可能にする。
別の観点において、本発明はオリゴヌクレオチド集合を提供する。この集合は複数のオリゴヌクレオチドを含み、これらのそれぞれが、LRP-1又はLRP-2核酸に対して少なくとも部分的に相補的である(例えば少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、92%、95%、97%、98%又は99%の相補性)。
好ましい実施態様の場合、集合は第1及び第2のオリゴヌクレオチドを含む。第1及び第2のオリゴヌクレオチドは、LRP-1又はLRP-2遺伝子配列、或いはLRP-1又はLRP-2遺伝子配列の相補体の同じ又は異なる位置とハイブリッド形成することができる。異なる位置は異なってはいるがしかし同じ鎖上でオーバーラップしていてよく、或いはオーバーラップしていなくてもよい。第1及び第2のオリゴヌクレオチドは、同じ鎖上又は異なる鎖上の部位とハイブリッド形成することができる。
集合は例えばSNPを同定するか、又はLRP-1又はLRP-2の特定の対立遺伝子を同定するのに有用である場合がある。好ましい実施態様の場合、集合のそれぞれのオリゴヌクレオチドは、問い合わせ位置に異なるヌクレオチドを有する。1実施態様の場合、集合は、座、例えば2対立遺伝子座又は多形座における異なる対立遺伝子に対してそれぞれ相補的である2つのオリゴヌクレオチドを含む。
別の実施態様の場合、集合は4つのオリゴヌクレオチドを含む。それぞれのオリゴヌクレオチドは問い合わせ位置に、異なるヌクレオチド(例えばアデニン、グアニン、シトシン又はチミジン)を有する。問い合わせ位置はSNP又は突然変異部位であってよい。別の好ましい実施態様の場合、複数のオリゴヌクレオチドの配列は互いに同一である(長さの相違は除く)。オリゴヌクレオチドには、差異を有する標識を設けることができるので、1つの対立遺伝子とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドは、第2の対立遺伝子とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドとは区別可能なシグナルを提供する。さらに別の実施態様の場合、集合のオリゴヌクレオチドのうちの1つ以上は、照会位置に加えて所定の位置にヌクレオチド変化、例えばオリゴヌクレオチドのTmを低減するための不安定化突然変異を有する。別の実施態様の場合、集合の1つ以上のオリゴヌクレオチドは非天然型ヌクレオチド、例えばイノシンを有する。好ましい実施態様の場合、オリゴヌクレオチドは固形支持体、例えばアレイの種々異なるアドレス、又は種々異なるビード又はナノ粒子に取り付けられる。
好ましい実施態様の場合、オリゴヌクレオチド集合を使用することにより、例えばPCRによって特異的に増幅するか、或いはLRP-1又はLRP-2核酸を検出することができる。
本明細書に記載した方法は、例えば本明細書中に記載した1つ以上のプローブ核酸又は抗体試薬を含む前パッケージされた診断キットを利用することにより実施することができる。これらの診断キットは、例えばLRP-1又はLRP-2遺伝子に関与する疾患又は疾病の症状又は家族歴を示す患者を診断するための臨床状況において、好都合に使用することができる。
LRP-1又はLRP-2分子の代理マーカーとしての使用
LRP-1又はLRP-2分子は、障害又は疾患状態のマーカーとして、疾患状態の前駆物質のためのマーカーとして、疾患状態の素因のためのマーカーとして、薬物活性のマーカーとして、又は患者の薬理ゲノム・プロファイルのマーカーとしても有用である。本明細書中に記載された方法を用いて、LRP-1又はLRP-2分子の存在、不存在又は量を検出することができ、そして、in vivoでの1つ又は2つ以上の生物学的状態と相関させることができる。例えば、LRP-1又はLRP-2分子は、1つ又は2つ以上の障害状態又は疾患状態のための代理マーカー、又は疾患状態に至るまでの状態のための代理マーカーとして役立つことができる。本明細書中に使用される「代理マーカー」とは、疾患又は障害の有無、又は疾患又は障害の進行(例えば腫瘍の有無)と相関する客観的生化学マーカーである。このようなマーカーの存在又は量は、疾患とは無関係である。従ってこれらのマーカーは、特定の治療過程が疾患状態又は障害を低減する上で効果的であるか否かを示すのに役立つことができる。代理マーカーは、疾患状態又は障害の存在又は程度を標準的な方法によって評価するのが難しい場合(例えば早期腫瘍)、或いは、潜在的に危険な臨床末期に達する前に、疾患の進行の評価が望ましい場合に特に有用である(例えば、心筋梗塞又は完全発生したAIDSの不所望な臨床転帰に十分に先んじて、コレステロール・レベルを代理マーカーとして使用して心臓疾患の評価を行うことができ、そしてHIV RNAレベルを代理マーカーとして使用してHIV感染の分析を行うことができる)。当業者における代理マーカーの使用例は、Koomen他(2000) J. Mass. Spectrom. 35: 258-264;及びJames (1994) AIDS Treatment News Archive 209を含む。
LRP-1又はLRP-2分子は、薬力学マーカーとしても有用である。本明細書中に使用される「薬力学マーカー」は、薬物効果と特異的に相関する客観的な生化学マーカーである。薬力学マーカーの存在又は量は、薬物が投与されている疾患状態又は障害とは関連しておらず、従って、マーカーの存在又は量は、患者中の薬物の存在又は活性を示すものである。例えば、薬力学マーカーは生体組織内の薬物濃度を示すことができる。この場合、マーカーは、薬物レベルとの関連において、その組織内に発現又は転写されるか、或いは発現又は転写されない。このようにして、薬物の分布又は摂取を薬力学マーカーによってモニタリングすることができる。同様に、薬力学マーカーの存在又は量は、薬物の代謝生成物の存在又は量と関連させることができ、これにより、マーカーの存在又は量は、in vivoでの薬物の相対分解速度を示す。薬力学マーカーは、特に薬物が低容量で投与されるときに、薬物効果の検出感度を増大させる上で特に有用である。少量の薬物でも複数ラウンドのマーカー(例えばLRP-1又はLRP-2分子マーカー)転写又は発現を活性化させるのに十分なので、増幅されたマーカーは、薬物自体よりも検出が容易な量であることが可能である。またマーカーは、マーカー自体の性質により、より容易に検出することができ；例えば、本明細書中に記載された方法を用いて、LRP-1又はLRP-2タンパク質マーカーのための、免疫に基づく検出系において抗LRP-1又はLRP-2抗体を採用することができ、或いは、LRP-1又はLRP-2特異的放射性同位体標識付けプローブを使用することにより、LRP-1又はLRP-2 mRNAマーカーを検出することができる。さらに、薬力学マーカーの使用により、薬物治療によるリスクを、直接的観察で可能な範囲を超えて、メカニズムに基づいて予測することができる。当業者における薬力学マーカーの使用例は：Matsuda他、米国特許第6,033,862号明細書；Hattis他(1991) Env. Health Perspect. 90:229-238; Schentag (1999) Am. J. Health-Syst. Pharm. 56 Suppl. 3:S21-S24;及びNicolau(1999) Am, J. Health-Syst. Pharm. 56 Suppl. 3:S16-S20を含む。
LRP-1又はLRP-2分子は薬理ゲノムマーカーとして使用することもできる。本明細書中に使用される「薬理ゲノムマーカー」とは、患者中の特異的臨床薬物応答又は感受性と相関する客観的生化学マーカーである(例えばMcLeod他(1999)Eur. J. Cancer 35:1650-1652)。薬理ゲノムマーカーの存在又は量は、薬物の投与前の、特定の薬物又は薬物クラスに対する患者の予測応答に関連する。患者中の1つ又は2つ以上の薬理ゲノムマーカーの存在又は量を評価することにより、患者にとって最適な薬物治療、又は成功度がより高いと予測される薬物治療が選択される。例えば、患者中の特定の腫瘍マーカーに対応するRNA又はタンパク質(例えばLRP-1又はLRP-2タンパク質又はRNA)の存在又は量に基づいて、患者中に存在すると思われる特定の腫瘍を治療するのに最適化された治療薬物又は治療過程が選択される。同様に、LRP-1又はLRP-2 DNA内の特定の配列突然変異の有無は、LRP-1又はLRP-2薬物応答に相関する。従って、薬理ゲノムマーカーを使用することにより、療法を施す必要なしに、それぞれの患者に最適な治療を適用することが可能になる。
治療方法
本発明は、異常な又は望ましくないLRP-1又はLRP-2発現又は活性と関連する障害の危険に晒されている(障害にかかりやすい)患者又は障害を有している患者を治療する予防方法及び治療方法の双方を提供する。本明細書中に使用される「治療」という用語は、疾患、疾患の症状、又は疾患の素因を治療、治癒、緩和、改変、軽減、改善、改良し、好転させ、又は疾患に影響を与えるという目的を持って、疾患、疾患の症状、又は疾患の素因を有する患者に治療薬を適用又は投与すること、又は疾患、疾患の症状、疾患の素因を有する患者からの分離組織又は細胞系に、治療薬を適用又は投与することとして定義される。治療薬の一例としては、小分子、ペプチド、抗体、リボザイム及びアンチセンス・オリゴヌクレオチドが挙げられる。
予防方法及び治療方法の両方に関連して、このような治療は、薬理ゲノム学分野から得られる知識に基づいて、特異的に調整して変更することができる。本明細書中に使用される「薬理ゲノム学」は、ゲノム技術、例えば遺伝子配列決定、統計遺伝学、及び薬物に対する遺伝子発現分析を臨床開発及び市場において適用することを意味する。より具体的には、この用語は、患者の遺伝子がいかにして薬物に対する患者の応答を決定するかを研究することを意味する(例えば患者の「薬物応答表現型」又は「薬物応答遺伝子型」)。こうして、本発明の別の観点は、個体の薬物応答遺伝子型に応じて、本発明のLRP-1又はLRP-2分子、或いはLRP-1又はLRP-2モジュレーターを用いたその個体の予防方法又は治療方法を調整する方法を提供する。薬理ゲノム学は、臨床医又は医師が、その治療からほとんどの場合恩恵を被るであろう患者を予防処置又は治療の標的とすること、及び、毒性薬物に関連する副作用を受けることになる患者の治療を回避することを可能にする。
1つの観点において、本発明は、LRP-1又はLRP-2、或いはLRP-1又はLRP-2発現又は1つ以上のLRP-1又はLRP-2活性を調節する物質を患者に投与することにより、異常な又は望ましくないLRP-1又はLRP-2発現又は活性に関連する疾患又は状態を患者において防止する方法を提供する。例えば本明細書中に記載した診断アッセイ又は予後アッセイのいずれか、或いはこれらの組み合わせによって、異常な又は望ましくないLRP-1又はLRP-2発現又は活性が引き起こすか又は関与する疾患の危険に晒されている患者を同定することができる。LRP-1又はLRP-2異常に特徴的な症状が顕在化する前に、予防薬を投与することができるので、疾患又は障害は予防されるか、或いはその進行が遅らされる。LRP-1又はLRP-2異常のタイプに応じて、例えばLRP-1又はLRP-2、LRP-1又はLRP-2アゴニスト、LRP-1又はLRP-2アンタゴニスト剤を患者の治療に使用することができる。適切な薬剤は、本明細書に記載されたスクリーニング・アッセイに基づいて見極めることができる。
遺伝子生成物の異常レベルによって、又は異常な活性を示す遺伝子生成物の存在によって、いくつかのLRP-1又はLRP-2関連障害が少なくとも部分的に引き起こされることがある。このようなものとして、このような遺伝子生成物のレベル又は活性の低減は、障害の症状を軽減する。
上述のように、LRP-1又はLRP-2関連障害の申し分のない治療は、標的遺伝子生成物の発現又は活性を阻害するのに役立つ技術によって実施することができる。例えば、負の調節活性を示すことが判っている化合物、例えば上述のアッセイを用いて同定された物質を本発明に従って使用して、LRP-1又はLRP-2関連障害の症状を防止又は軽減することができる。このような分子の一例としては、ペプチド、ホスホペプチド、小有機分子又は小無機分子、又は抗体(例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体又は単鎖抗体、及びFab、F(ab')2及びFab発現ライブラリ・フラグメント、scFV分子、及びこれらのエピトープ結合フラグメントを含む)が挙げられる。
さらに、標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス分子及びリボザイム分子を本発明に従って使用して、これにより標的遺伝子発現レベルを低減し、こうして標的遺伝子活性レベルを効果的に低減することもできる。またさらに、標的遺伝子活性レベルを低減する上で三重螺旋分子を利用することができる。アンチセンス分子、リボザイム分子及び三重螺旋分子は上述の通りである。
突然変異遺伝子発現を低減又は阻害するためにアンチセンス分子、リボザイム分子及び三重螺旋分子を使用することにより、正常標的遺伝子の対立遺伝子によって生成されたmRNAの転写(三重螺旋)又は翻訳(アンチセンス、リボザイム)を低減又は阻害することもあり得るので、存在する正常標的遺伝子生成物の濃度は、正常表現型に対して必要となるよりも低いことがある。このような場合、正常標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードして発現させる核酸分子を、遺伝子療法を介して細胞中に導入することができる。或いは、標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする場合、正常標的遺伝子タンパク質を細胞又は組織中に同時投与して、これにより、細胞又は組織の所要の標的遺伝子活性レベルを維持することが好ましい場合もある。
LRP-1又はLRP-2発現によって特徴付けされる疾患を治療又は予防する上で核酸分子を利用できる別の方法は、LRP-1又はLRP-2タンパク質に対して特異的なアプタマー分子を使用することである。アプタマーは三次構造を有する核酸分子であり、この三次構造は、核酸分子がタンパク質リガンドに特異的に結合するのを可能にする(例えばOsborne他(1997) Curr. Opin. Chem Biol. 1:5-9;及びPatel, D.J.(1997) Curr Opin Chem Biol 1:32-46)。核酸分子は多くの場合、治療タンパク質分子よりも好都合に標的細胞中に導入することができるので、アプタマーは、多能性効果を有し得る薬物又はその他の分子を導入することなしに、LRP-1又はLRP-2タンパク質活性を特異的に減少させることのできる方法を提供する。
標的遺伝子生成物に対して双方とも特異的であり、そして標的遺伝子生成物活性を低減する抗体を生成することができる。従ってこのような抗体は、LRP-1又はLRP-2関連障害の治療の際に負の調節技術が適切である場合に投与することができる。抗体の説明に関しては、上記「抗体」の項を参照されたい。
LRP-1又はLRP-2、又は抗体生成を刺激するためのエピトープを動物又はヒト患者に注射することが、患者にとって有害である環境においては、抗イディオタイプ抗体を使用することにより、LRP-1又はLRP-2に対する免疫応答を生成することが可能である(例えばHerlyn, D(1999) Ann Med 31:66-78;及びBhattacharya-Chatterjee, M.及びFoon, K.A.(1998) Cancer Treat Res. 94:51-68)。抗イディオタイプ抗体を哺乳動物又はヒト患者中に導入する場合、この抗体は抗-抗イディオタイプ抗体の生成を刺激することになる。抗-抗イディオタイプ抗体はLRP-1又はLRP-2タンパク質に対して特異的となるはずである。LRP-1又はLRP-2発現によって特徴付けされた疾患に向けられるワクチンをこのように生成することもできる。
標的抗原が細胞内にあり、抗体全体が使用される場合には、抗体の内在化が好ましいことがある。リポフェクチン又はリポソームを使用することにより、抗体、又は、標的抗原に結合するFab領域のフラグメントを細胞中に供給することができる。抗体のフラグメントを使用する場合、標的抗原に結合する最小の阻害フラグメントが好ましい。例えば抗体のFv領域に対応するアミノ酸配列を有するペプチドを使用することができる。或いは細胞内標的抗原に結合する単鎖中和抗体を投与することもできる。このような単鎖抗体は、例えば、標的細胞個体群内で単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現させることにより投与することができる(例えばMarasco他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893)。
標的遺伝子の発現、合成又は活性を阻害する同定された化合物を、治療上有効な投与量で患者に投与することにより、LRP-1又はLRP-2関連障害を予防、治療又は軽減することができる。治療上有効なな投与量とは、疾患の症状の軽減を引き起こすのに十分な化合物の量を意味する。このような化合物の毒性及び治療効果は、上述のような標準的な製薬手順によって見極めることができる。
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータを使用して、ヒトに使用するための投与量範囲を決めることができる。このような化合物の投与量は好ましくは、毒性をほとんど又は全く有さないED50を含む循環濃度範囲内にある。投与量は、採用される投与形態及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動することができる。本発明の方法に使用されるいかなる化合物に関しても、治療上有効な投与量は細胞培養アッセイから最初に評価することができる。細胞培養において見極められたIC50(すなわち半分から最大の症状阻害率を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲に達するように、動物モデルにおいて投与量を決めることができる。このような情報を用いることにより、ヒトにおける有用な投与量をより正確に見極めることができる。血漿中レベルは例えば、高性能液体クロマトグラフィによって測定することができる。
個体の有効投与量の別の決定例は、被験者の血清中の「遊離」及び「結合」化合物のレベルを直接的にアッセイする能力である。このようなアッセイは、分子インプリンティング技術によって形成された抗体擬似体又は「バイオセンサー」を利用することができる。LRP-1又はLRP-2活性を調節することができる化合物を鋳型又は「インプリンティング分子」として使用し、これにより、触媒試薬で重合する前に、重合可能なモノマーを空間的に編成する。インプリントされた分子を続いて除去することにより、ポリマー・マトリックスが残される。このポリマー・マトリックスは、化合物の反復「ネガティブ画像」を含有し、生体アッセイ条件下で分子に選択的に再結合することができる。この技術の詳細な概観は、Ansell, R.J.他(1996) Current Opinion in Biotechnology 7:89-94及びShea,K.J.(1994) Trends in Polymer Science 2:166-173に見ることができる。このような「インプリント」されたアフィニティ・マトリックスは、リガンド結合アッセイを施しやすく、これにより、固定化されたモノクローナル抗体の代わりに、適切にインプリントされたマトリックスが使用される。このようなマトリックスをこうして使用する例は、Vlakakis, G.他(1993) Nature 361:645-647に見ることができる。同位体標識付けを用いることにより、LRP-1又はLRP-2の発現又は活性を調節する化合物の「遊離」濃度を容易にモニタリングして、IC50の計算に使用することができる。
このような「インプリント」されたアフィニティ・マトリックスは、蛍光基を含むように構成することもできる。蛍光基のフォトン放出特性は、標的化合物の局所的及び選択的な結合時に測定可能に変化する。これらの変化は、適切な光ファイバー装置を使用してリアルタイムに容易にアッセイすることができ、被験者への投与量が、その個々のIC50に基づいて迅速に最適化されることが可能になる。このような「バイオセンサー」の基本例がKriz, D.他(1995) Analytical Chemistry 67:2142-2144において論じられている。
本発明の別の観点は、治療目的でLRP-1又はLRP-2発現又は活性を調節する方法に関する。従って1実施態様において、本発明の調節方法は、細胞と、LRP-1又はLRP-2、又は細胞と関連するLRP-1又はLRP-2タンパク質活性の1つ又は2つ以上を調節する物質とを接触させることを伴う。LRP-1又はLRP-2タンパク質活性を調節する物質は、本明細書に記載された物質、例えば核酸又はタンパク質、LRP-1又はLRP-2タンパク質の天然発生型標的分子(例えばLRP-1又はLRP-2基質又は受容体)、LRP-1又はLRP-2抗体、LRP-1又はLRP-2アゴニスト又はアンタゴニスト、LRP-1又はLRP-2アゴニスト又はアンタゴニストのペプチド擬似体、又はその他の小分子であってよい。
1実施態様の場合、物質はLRP-1又はLRP-2活性の1つ又は2つ以上を刺激する。このような刺激性物質の例は、活性LRP-1又はLRP-2タンパク質及びLRP-1又はLRP-2をコードする核酸分子を含む。別の実施態様の場合、物質は1つ又は2つ以上のLRP-1又はLRP-2活性を阻害する。このような阻害物質の例は、アンチセンスLRP-1又はLRP-2核酸分子、抗LRP-1又はLRP-2抗体、及びLRP-1又はLRP-2阻害物質を含む。これらの調節方法は、(例えば細胞をこの物質で培養することにより)in vitroで実施するか、或いは、 (例えば物質を患者に投与することにより) in vivoで実施することができる。こういうものとして、本発明は、LRP-1又はLRP-2タンパク質、或いは核酸分子の異常な又は望ましくない発現又は活性によって特徴付けられる疾患又は障害を患う個体を治療する方法を提供する。1実施態様の場合、この方法は、LRP-1又はLRP-2発現又は活性を調節する(例えばアップ・レギュレート又はダウン・レギュレートする)物質(例えば本明細書中に記載されたスクリーニング・アッセイによって同定された物質)、又はこれらの物質の組み合わせを投与することを伴う。別の実施態様の場合、この方法は、低減された又は異常な又は望ましくないLRP-1又はLRP-2発現又は活性を補償するための療法として、LRP-1又はLRP-2タンパク質又は核酸分子を投与することを伴う。
LRP-1又はLRP-2活性の刺激は、LRP-1又はLRP-2が異常にダウン・レギュレートされている状況、又は増大したLRP-1又はLRP-2活性が有益な効果を有すると考えられる状況において望ましい。例えば、LRP-1又はLRP-2活性の刺激は、LRP-1又はLRP-2がダウン・レギュレートされている状況、又は増大したLRP-1又はLRP-2活性が有益な効果を有すると考えられる状況において望ましい。同様に、LRP-1又はLRP-2活性の阻害は、LRP-1又はLRP-2が異常にアップ・レギュレートされている状況、又は減少したLRP-1又はLRP-2活性が有益な効果を有すると考えられる状況において望ましい。
薬理ゲノム学
LRP-1又はLRP-2分子、並びに、本明細書中に記載されたスクリーニング・アッセイによって同定されたLRP-1又はLRP-2活性(例えばLRP-1又はLRP-2遺伝子発現)に対して刺激効果又は阻害効果を有する物質又はモジュレーターを個体に投与することにより、異常な又は望ましくないLRP-1又はLRP-2活性と関連するLRP-1又はLRP-2関連疾患(骨障害、例えば骨粗鬆症、パジェット病及び骨形成不全)を予防又は治療することができる。このような治療との関連において、薬理ゲノム学(すなわち、個体の遺伝子型と、外来化合物又は薬物に対する個体の応答との関係の研究)を考慮に入れることができる。治療の代謝の差異は、薬理学的に活性の薬物の投与量と血中濃度との関係を変化させることによって、深刻な毒性又は治療の失敗を招くおそれがある。こうして医師又は臨床医は、LRP-1又はLRP-2分子又はLRP-1又はLRP-2モジュレーターを投与するか否かを見極める上で、また、LRP-1又はLRP-2分子又はLRP-1又はLRP-2モジュレーターによる治療の投与計画又は治療計画を調整する上で、当該薬理学研究において得られた知識の適用を考慮に入れることができる。
薬理ゲノム学は、患者における薬物の性質の変化、及び異常作用に起因する、薬物に対する応答の臨床的に有意な遺伝的変異形を取り扱う。例えば、Eichelbaum, M.他(1996)Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23:983-985及びLinder, M.W.他(1997) Clin. Chem. 43:254-266を参照されたい。一般に、薬理ゲノム条件は2つのタイプに区別される。すなわち、身体に対する薬物の作用の仕方を変化させる単一ファクターとして伝えられる遺伝的条件(薬物作用の変化)、又は薬物に対する身体の作用の仕方を変化させる単一ファクターとして伝えられる遺伝的条件(薬物代謝の変化)、である。これらの薬理ゲノム条件は、稀な遺伝的欠陥、又は自然発生型多形として発生することがある。例えば、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠乏症(G6PD)は、一般的な遺伝性酵素病である。この酵素病の場合、主な臨床上の問題点は、酸化体薬物(抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン)の摂取後及びソラマメの消費後に溶血が生じることである。
「ゲノム-広範囲関連」として知られる、薬物応答を予測する遺伝子を同定しようという1つの薬理ゲノム学アプローチは主として、既知の遺伝子関連マーカーから成るヒトゲノムの高分解能マップ(例えば、それぞれが2つの変異形を有する、ヒトゲノム上の60,000-100,000個の多形部位又は可変部位から成る「2対立遺伝子」マーカー・マップ)に依存する。このような高分解能遺伝子マップを、第II/III期薬物試験に参加した統計上有意な数の患者のそれぞれのゲノムのマップと比較することにより、観察された特定の薬物応答又は副作用と関連するマーカーを同定することができる。或いはこのような高分解能マップは、ヒトゲノムにおける数千万個の既知の単一ヌクレオチド多形(SNP)の組み合わせから生成することができる。本明細書中に使用される「SNP」は、DNAの延びにおける単一ヌクレオチド塩基中に発生する共通の変化である。例えばSNPは、DNAの塩基1000個毎に1回発生することができる。SNPは疾患過程に関与することがあるものの、大部分は疾患とは関連しないと考えられる。このようなSNPの発生に基づいて遺伝子マップを考えると、個体は、個々のゲノムにおけるSNPの特定のパターンに応じて、遺伝子カテゴリーに分類することができる。こうして、遺伝的に類似の個体間で共通であり得る特性を考慮しながら、遺伝的に類似の個体から成る群に合わせて治療計画を立てることができる。
或いは、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法を利用することにより、薬物応答を予測する遺伝子を同定することもできる。この方法によれば、薬物標的をコードする遺伝子が既知の場合(例えば本発明のLRP-1又はLRP-2タンパク質)、その遺伝子の全ての共通の変異形を個体群中で極めて容易に同定することができ、そして、その遺伝子の別の変異形に対して1つの変異形を有することが特定の薬物応答と関連するか否かを見極めることができる。
或いは、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法を利用することにより、薬物応答を予測する遺伝子を同定することができる。例えば薬物(例えば本発明のLRP-1又はLRP-2分子、或いはLRP-1又はLRP-2モジュレーター)を投与された動物の遺伝子発現は、毒性に関連する遺伝子経路が開かれているか否かの示唆を与えることができる。
上記薬理ゲノム学アプローチのうちの2つ以上から生成された情報を用いることにより、個体の予防又は治療のための適切な投与計画及び治療計画を見極めることができる。このような知識は、投与量又は薬物の選択に適用されると、不都合な反応又は治療の失敗を回避することができ、ひいてはLRP-1又はLRP-2分子、或いはLRP-1又はLRP-2モジュレーター、例えば本明細書中に記載されたスクリーニング・アッセイ例の1つによって同定されたモジュレーターで患者を治療すると、治療効果又は予防効果を高めることができる。
本発明はさらに、本発明のLRP-1又はLRP-2遺伝子の1つ又は2つ以上によってコードされた遺伝子生成物のうちの1つ又は2つ以上の活性を調節する物質を同定することに基づいて、新しい物質又はこれらの組み合わせを同定する方法を提供する。これらの遺伝子生成物は、治療薬に対する細胞の耐性と関連する場合がある。具体的には、本発明のLRP-1又はLRP-2遺伝子によってコードされたタンパク質の活性を、治療薬耐性を克服するための物質を同定するベースとして用いることができる。耐性タンパク質のうちの1つ又は2つ以上の活性をブロックすることにより、例えばヒト細胞は、未修飾標的細胞が耐性を示す治療薬を用いた治療に対して感受性を有するようになる。
LRP-1又はLRP-2タンパク質の発現又は活性に対する物質(例えば薬物)の影響を、臨床試験においてモニタリングすることができる。例えば、LRP-1又はLRP-2遺伝子発現、又はタンパク質レベルを増大させるか、或いはLRP-1又はLRP-2活性をアップ・レギュレートするために、本明細書中に記載されたスクリーニング・アッセイによって見極められた物質の効果を、LRP-1又はLRP-2遺伝子発現、タンパク質レベルの減少、或いはLRP-1又はLRP-2活性のダウン・レギュレーションを示す患者の臨床試験においてモニタリングすることができる。或いは、LRP-1又はLRP-2遺伝子発現、又はタンパク質レベルを減少させるか、或いはLRP-1又はLRP-2活性をダウン・レギュレートするためにスクリーニング・アッセイによって見極められた物質の効果を、LRP-1又はLRP-2遺伝子発現、タンパク質レベルの増大、或いはLRP-1又はLRP-2活性のアップ・レギュレーションを示す患者の臨床試験においてモニタリングすることができる。このような臨床試験において、LRP-1又はLRP-2遺伝子、及び好ましくは、LRP-1又はLRP-2に関連する疾患に関与しているその他の遺伝子の発現又は活性を、特定細胞の表現型の「読み取り」又はマーカーとして用いることができる。
本発明の新規の化合物のそれぞれを、骨のインプラント、移植又は補綴などに使用するための生体活性成分として使用することができる。これらの化合物は、特に骨異常の臨床管理が栄養学的介入及び薬学的介入の両方を必要とする場合に、栄養補助剤又は薬品として使用することもできる。
上記方法は、骨疾患の診断、骨成長及び骨形成のモニタリング、及び骨疾患からの治癒・回復過程の追跡のために単独で、又は組み合わせで用いることができる。
本発明はまた、ラクトフェリンがLRP-1又はLRP-2と相互作用し、そして骨細胞又は軟骨細胞内のMAPキナーゼのリン酸化を誘導するという予期せぬ発見に基づいている。骨細胞又は軟骨細胞内での、ラクトフェリンと、LRP-1又はLRP-2、又はMAPキナーゼとの相互作用は、骨異常又は軟骨異常を診断して治療し、そしてこのような異常を治療するための治療用化合物を同定する際にモニタリングすることができる。
本発明の診断方法は、被験者から調製された試料(例えば骨又は軟骨の組織試料)中のラクトフェリン・ポリペプチドと、LRP-1タンパク質、LRP-2タンパク質、又はp42/44 MAPキナーゼとの相互作用レベルを、正常被験者、すなわち骨異常又は軟骨異常を患っていない被験者から調製された試料中のものと比較することを伴う。このような相互作用は、例えばラクトフェリンとp LRP-1又はLRP-2との結合、LRP-1又はLRP-2によって媒介されたラクトフェリンのエンドサイトーシス、又はp42/44 MAPキナーゼのリン酸化を測定すること、或いは当業者に知られたその他の任意の方法によって見極めることができる。ラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとの相互作用のレベルが高い、又は低い場合には、このことは、その被験者が骨又は軟骨の異常を患っているか、又はこの異常を発生させる危険に晒されていることを示唆する。この方法を単独で、又はその他の手順との関連において用いることにより、骨又は軟骨の異常を診断することができる。
本発明はまた、細胞(例えば骨細胞又は軟骨細胞)中のラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとの相互作用を調節(増減)する化合物(例えばタンパク質、ペプチド、ペプチド擬似体、ペプトイド、抗体又は小分子)を同定して製造する方法を提供する。こうして同定された化合物は、例えば骨異常又は軟骨異常を予防し、治療するために使用することができる。
上記多数のアプローチのいずれかを用いて、本発明の候補化合物を得ることができる。ラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとの相互作用を調節する化合物を同定するために、ラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとを含有する系(細胞系又は無細胞系)を、候補化合物と接触させ、そして、ラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとの相互作用レベルを、候補化合物が不存在の場合と比較して評価する。細胞系、例えば骨細胞又は軟骨細胞を含有する系の場合、細胞は、ラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとを自然発現させる細胞であるか、或いは、例えばマーカー遺伝子に融合されたラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとを有する、組換えラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとを発現させるように修飾された細胞であってよい。ラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとの相互作用レベル、又はマーカータンパク質間の相互作用レベルは、上記方法及び当業者に知られた任意のその他の方法によって見極めることができる。ラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとの相互作用レベル、又はマーカータンパク質間の相互作用レベルが、候補化合物の存在において、候補化合物の不存在におけるよりも高い又は低い場合には、候補化合物は、骨異常又は軟骨異常を予防し、治療するのに有用であるものとして同定される。
本発明はさらに、有効量の組成物、例えばLRP-1、LRP-2又はp42/44 MAPキナーゼのアゴニスト又はアンタゴニストを含有する組成物を、治療を必要とする患者に投与することにより、骨異常又は軟骨異常を治療する方法を提供する。「有効量」とは、治療を受ける患者において医学的に望ましい結果（例えばラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとの相互作用レベルの増減)を生み出すことができる組成物の量である。「治療」という用語は、異常、異常の症状、異常に対する二次的な疾患状態、又は異常に向かう素因を治癒、緩和、軽減、改善、予防、又は改良するという目的を持って、骨異常又は軟骨異常の患者に組成物を投与することと定義される。患者は骨異常又は軟骨異常を患う人物、マーカーは陽性であるものの異常の臨床的証拠はない人物、又は遺伝的(家族)、習慣的(喫煙)、又は環境的(例えばラドン)な理由から、異常の危険に晒されている人物であってよい。このような骨異常の一例としては、骨粗鬆症、リューマチ、肝性骨ジストロフィー、骨軟化症、くる病、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨ジストロフィー、骨硬化症、骨量不足、骨線維形成不全、二次性副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、副甲状腺機能亢進症、慢性腎疾患、サルコイドーシス、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、突発性高カルシウム血、パジェット病、及び骨形成不全、骨移植、治癒しない骨折、及び骨欠陥が挙げられる。組成物は、軟骨修復の可能性のある軟骨細胞を刺激するのに使用し、これにより、変形性関節炎及びその他の関節炎を治療し、そしてヒト、競走馬及びその他の動物における自家骨移植及び自家軟骨移植を容易にすることもできる。こうして組成物は、骨及び軟骨の負傷を同時治療するという恩恵をもたらす。
例えば上述の方法によって、患者から調製された試料中のラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとの相互作用レベルを見極めることにより、治療されるべき患者を同定することができる。患者から採取した試料中のこのような相互作用レベルが、正常被験者から採取した試料中のものよりも高い又は低い場合には、この患者は、患者中のラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとの相互作用レベルを増減させる有効量の化合物を用いて治療するための候補である。治療方法は単独で、或いは他の薬物又は治療との関連において、in vivo又はex vivoで実施することができる。
1つのin vivoアプローチの場合、治療組成物(例えば細胞中のラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとの相互作用を調節する化合物を含有する組成物)を患者に投与する。一般に、化合物は、製薬上許容可能なキャリヤ(例えば生理食塩水)中に懸濁され、経口で、又は静脈内注射によって投与されるか、或いは、皮下、筋内、くも膜下、腹膜内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、又は肺内に注射されるか又は埋め込まれることになる。骨異常又は軟骨異常の予防及び治療の場合には、化合物は、骨又は軟骨の損傷部位、或いは骨細胞又は軟骨細胞に直接的に送達することができる。
所要投与量は、投与経路の選択；配合物の性質；患者の病気の性質；患者の体格、体重、表面積、年齢及び性別；投与されている他の薬物；及び主治医の判断に依存する。好適な投与量は0.01〜100.0mg/kgの範囲にある。種々の化合物が利用可能であり、また種々の投与経路が種々異なる効率を有することを考えれば、所要投与量は大幅に変動することが予期される。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高い投与量を必要とすることが予期される。このような投与量レベルの変動は、当業者に十分に理解されるような最適化のための標準的な経験的作業によって調整することができる。好適な送達ビヒクル(例えば高分子ミクロ粒子又は埋め込み可能な装置)中に化合物をカプセル化することにより、特に経口送達に関して送達効率を高めることができる。
或いは、例えば当業者に知られた高分子の生分解性ミクロ粒子又はミクロカプセル送達装置を使用することにより、ラクトフェリン・ポリペプチドをコードする核酸配列を含有するポリヌクレオチドを患者に送達することができる。
核酸を取り込む別の方法は、標準的な方法によって調製されたリポソームを使用することである。これらの送達ビヒクル中にはベクターを単独で組み込むことができ、或いは、ベクターを、組織特異的抗体と一緒に組み込むこともできる。或いは、静電力又は共有結合力によってポリ-L-リシンに付着されたプラスミド又は他のベクターから成る分子複合を調製することもできる。ポリ-L-リシンは、標的細胞上の受容体に結合することができるリガンドに結合する(Cristiano他(1995) J.Mol.Med. 73,479)。或いは、当業者に知られた組織特異的転写調節要素(TRE)を使用することにより、組織特異的ターゲティングを達成することもできる。筋内、皮内、又は皮下部位に「ネイクドDNA」(すなわち送達ビヒクルを有さない)を送達することが、in vivo発現を達成するための別の手段である。
当該ポリヌクレオチド(発現ベクター)において、ラクトフェリン・ポリペプチドをコードする核酸配列は、プロモーター又はエンハンサー-プロモーター複合体に作用連関される。エンハンサーは、時間、位置及びレベルに関して発現特異性を提供する。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、プロモーターが存在する場合に、転写開始部位から可変の距離で配置されたときに機能することができる。エンハンサーは転写開始部位の下流に配置することもできる。
好適な発現ベクターは、プラスミド及びウィルスベクター、例えばとりわけヘルペスウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス、弱毒化ワクシニアウィルス、カナリア痘瘡ウィルス、アデノウィルス及びアデノ随伴ウィルスを含む。
ポリヌクレオチドは製薬上許容可能なキャリヤで投与することができる。医学界でよく知られているように、投与量は変動することになる。ポリヌクレオチドの好ましい投与量は、ポリヌクレオチド分子の約106〜1012個の複製から成る。この投与量は必要に応じて、繰り返し投与することができる。投与経路は上述のもののいずれかであってよい。
骨異常又は軟骨異常の患者を治療するためのex vivo 戦略は、ラクトフェリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、患者から得られた細胞にトランスフェクト又は導入することである。或いは、細胞のゲノムにおいて天然発生型内生的ラクトフェリン遺伝子の転写開始部位の上流側に新しい活性プロモーターを相同組換えにより挿入するように構成されたベクターを、in vitroで細胞にトランスフェクトすることもできる。他の場合には極めてサイレントな遺伝子を「スイッチ・オン」するこのような方法は、当業者によく知られている。ラクトフェリンを所望のレベルで発現させる細胞の選択及び伸長の後、次いでトランスフェクション及び導入が施された細胞は、患者に戻される。これらの細胞は、広範囲のタイプの細胞のいずれかであってよい。その一例としては、骨髄間質性細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、又はこれらの前駆体が挙げられる。このような細胞は、これらが患者中に生き残る限り、ラクトフェリン源として使用する。
ex vivo法は、患者から細胞を採取し、細胞を培養し、細胞に発現ベクターを導入し、そしてラクトフェリン遺伝子の発現に適した条件下で細胞を維持するステップを含む。これらの方法は分子生物学の当業者に知られている。導入ステップは、リン酸カルシウム、リポフェクション、エレクトロポレーション、ウィルス感染及びバイオリスティック遺伝子導入を含む、ex vivo 遺伝子治療に用いられる任意の標準的な手段によって達成される。或いは、リポソーム又は高分子ミクロ粒子を使用することもできる。次いで、導入に成功した細胞を、例えばラクトフェリン遺伝子の発現に関して選択することができる。次いで細胞を患者の体内に注射するか、又は埋め込むことができる。
下記実施例は、一例にすぎず、開示内容の残りを限定するものでは決してない。更なる詳細が記載されていなくても、当業者であれば、本明細書の記載内容に基づいて本発明を最大限に活用できることは明らかである。本明細書中に引用した全ての刊行物全体を参考のため本明細書中に引用する。
初代ラット骨芽様細胞の培養
既述(Cornish他(1999)Amer. J. Physiol-Endocrinol. Metab. 277:E779-783)のように、日齢20日の胎児ラットの頭蓋冠から骨芽細胞を分離した。手短かに言えば、頭蓋冠を摘出し、そして縫合線及び骨膜細胞から離された前頭骨及び頭頂骨を捕集した。洗浄後、頭蓋冠を37℃で7分間にわたって1mg/mLのコラゲナーゼ3mLで2回処理した。これら2回の消化後の上澄みを廃棄した後、頭蓋冠をさらに2回、2mg/mLのコラゲナーゼ3mLで2回処理した(30分間、37℃)。後の2回の消化の上澄みをプールし、遠心分離し、そして細胞を洗浄した。細胞を密集するまで成長させ、次いで24ウェル・プレート内に継代培養した。細胞の捕集前の24時間にわたって、最小必須培地(MEM)/0.1%ウシ血清アルブミン中で成長停止させた。
SaOS-2細胞系培養
ヒト骨芽様骨肉腫細胞系SaOS-2を、2.2g/L NaHCO3、10% FBS及び10ml/L ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO 15140-122)を補充されたDMEM(GIMCO 12100-046)中に維持した。細胞を75cm2フラスコ内で平板培養し、そして密集時に、総RNA分離又は増殖アッセイのために使用した。
LRP-1及びLRP-2遺伝子発現の検出
LRP-1及びLRP-2遺伝子発現を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって同定した。培養された初代ラット骨芽細胞及びSaOS-2細胞から総細胞RNAを、単一ステップ・グアニジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルムRNA抽出の変更された方法(Chomczynski及びSacchi(1987)Analyt. Biochem. 162:156-159;及びGrey他(2001)Endocrinology 142:1098-1106)によって精製した。Gene Quant(登録商標)分光光度計(Pharmacia、英国リトル・チャルフォント)を用いて、光学濃度を測定することにより、RNA濃度及び純度を測定し、そして1%アガロースゲル上の電気泳動法により品質を測定した。RNAをDナーゼで処理し、既に発行されたプロトコル(Grey他(2001)Endocrinology 142:1098-1106)に従ってRT-PCR増幅を行った。自動DNAサーマル・サイクラー(Mastercycler Personal、Eppendorf、ドイツ国ハンブルク)内でPCRを行った。94℃で2分間の初期変性ステップの後、30秒間にわたって94℃で変性し、30秒間にわたって56℃でアニールし、そして1分間にわたって72℃で伸長するサイクルを35回行った。それぞれのサイクル・セット終了時に、15分間にわたって72℃で最終伸長ステップを行った。PCR反応生成物を1%TBEアガロース・ゲル上で視覚化した。LRP-1又はLRP-2を増幅するのに使用されたプライマーは次の通りであった：LRP-1プライマー5' GAG TGT TCC GTG TAT GGC AC及び5' GAT GCC TTG GAT GAT GGTC; LRP-2プライマー5' GTC ACC AGT TCA CTT GCT CC及び5' CCA CTC CCA TAA CCA TTCCであった。QIAquik ゲル抽出キット(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)を使用して、アガロース・ゲルからPCR生成物を精製し、そしてこれらの配列をABI 377XL DNA Sequencer(PE Biosystems、カリフォルニア州フォスター・シティ)上で決定した。逆転写酵素を使用することなしに、対照RT-PCR増幅を行った。
予期せぬことに、LRP-1は初代ラット骨芽細胞及びSaOS-2細胞の両方に発現されることが判った。LRP-2は初代ラット骨芽細胞内には発現されるが、しかしSaOS-2細胞内には発現されないことが判った。ラクトフェリンは、分画された牛乳中に存在する骨芽細胞成長因子として同定されている。ラクトフェリンは、ラット、マウス、及びヒト起源の培養された骨芽細胞の増殖を強く、そして投与量に依存して刺激する。ラクトフェリンはまた、軟骨細胞に対して***誘発性であり、同様に骨芽細胞分化を誘発することができる。ラクトフェリンは、長期の骨芽細胞培養において鉱化された骨瘤塊の数を著しく増大させることが判った。ラクトフェリンはまた、初代ラット骨芽細胞中の血清回収により誘発されるアポトーシスを阻害する。ラクトフェリンは、ネズミ骨髄培養アッセイにおいて破骨細胞形成を強力に阻害するが、しかし、成熟した破骨細胞の骨吸収活性には影響を与えない。ラクトフェリンがin vitroで骨芽細胞同化を誘発し、そして破骨細胞の発生を阻害する能力を有することは、in vivoで骨に対して同化作用を有することを示唆する。実際、ラクトフェリンを片側性局所半頭蓋冠注射によって成長マウスに投与すると、骨形成指数及び骨面積に投与量依存性の相当の増大が生じた。
ラクトフェリンと、LRP-1、LRP-2、又はp42/44 MAPキナーゼとの相互作用
ラクトフェリンは、低密度リポタンパク質受容体群の2つの内細胞員であるLRP-1及びLRP-2/メガリンに結合することが判っている。LRP-1及びLRP-2は両方とも齧歯類骨芽細胞中に発現されるが、しかしLRP-1だけがSaOS-2細胞中に発現される。共焦点顕微鏡下で観察されたように、ラクトフェリンは、初代ラット骨芽細胞によって取り込まれ、そしてLRP-1/2特異的阻害物質、受容体関連タンパク質(RAP)はこのプロセスを排除する。さらにラクトフェリンは、骨芽細胞内のp42/44 MAPキナーゼ信号伝達経路を活性化する。ラクトフェリンで誘発された骨芽細胞増殖は、MAPキナーゼの特異的阻害物質によって阻害されることが判った。ラクトフェリンで誘発された骨芽細胞増殖及びMAPキナーゼのリン酸化はまたRAPによってブロックされる。RAPは、骨芽細胞中のラクトフェリンの***誘発効果のメディエーターとしてLRP-1/2に影響を与える。さらに、ラクトフェリンはSaOS-2細胞の増殖を誘発する。ラクトフェリンで誘発されたLRP-1-ゼロ骨芽細胞の増殖は、LRP-1+/+細胞中で観察されるものよりも著しく僅かにしかマークされない。総合して、これらのデータが実証するのは、ラクトフェリンが骨に対して同化作用を有し、そして骨芽細胞に対するその成長因子様効果は大部分がLRP-1によって媒介されることである。この作用はさらに、骨成長の調整においてLRP受容体群が重要な役割を果たしている証拠を提供する。
ラクトフェリンの三次元構造は、ラクトフェリンがN-ローブとC-ローブとに分割され、それぞれが1つの鉄原子に結合することを明らかにしている。N-ローブは、完全長タンパク質にほぼ匹敵する***誘発効果を有することが判っている。このことはより短いポリペプチドが潜在的に治療作用を有することを示唆している。また、ラクトフェリンがゆっくりと分解するにつれて、いずれのローブにおける潜在活性も出現することが可能である。ラクトフェリシン、つまり殺菌効果を有することが判っている、ラクトフェリンの短いN-末端ペプチドは、僅かな骨形成効果しか有さなかった。トランスフェリンも骨芽細胞上の強力な***誘発因子ではなかった。ラクトフェリンを鉄から剥離し、クロムイオン又はマンガンイオンをラクトフェリンに再ローディングすると、その骨形成活性は鉄がローディングされた分子と類似した。このことは鉄自体が骨芽細胞中のラクトフェリンの***誘発活性にとって決定的なものではないことを示唆している。
その他の実施態様
本明細書中に開示された構成要件の全ては、任意に組み合わせることができる。本明細書中に開示されたそれぞれの構成要件に代えて、同じ、又は同等の、又は類似の目的に役立つ別の構成要件を使用することもできる。従って、特に断りのない場合には、開示されたそれぞれの構成要件は、包括的な一連の同等又は類似の特徴例にすぎない。
上記説明から、当業者ならば本発明の主要な特徴を容易に確認することができ、本発明の思想及び範囲から逸脱することなしに、本発明の種々の変化形及び変更形を形成して、本発明を種々の用途及び条件に合わせることができる。従って、その他の実施態様も添付の特許請求の範囲内に含まれる。

Claims (70)

  1. 患者が骨異常（bone condition）を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されているか否かを見極める方法であって、該方法が：
    骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていると疑われる患者から試験試料を準備し、そして
    LRP-1遺伝子の発現レベルを定量化する
    ことを含み、
    該試験試料中の該LRP-1遺伝子の発現レベルが、正常試料中のものとは異なる場合には、該患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていることを示す
    ことを特徴とする、患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されているか否かを見極める方法。
  2. 該試料が骨組織から調製される、請求項1に記載の方法。
  3. 患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されているか否かを見極める方法であって、該方法が：
    骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていると疑われる患者から試験試料を準備し、そして
    LRP-1タンパク質の活性を定量化する
    ことを含み、
    該試験試料中の該LRP-1タンパク質の活性が、正常試料中のものとは異なる場合には、該患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていることを示す
    ことを特徴とする、患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されているか否かを見極める方法。
  4. 該試料が骨組織から調製される、請求項3に記載の方法。
  5. 骨異常を治療するための候補化合物を同定する方法であって、該方法が：
    化合物を、LRP-1遺伝子を発現させる細胞と接触させ、そして
    該細胞中の該LRP-1遺伝子の発現レベルを定量化する
    ことを含み、
    該化合物の存在における該LRP-1遺伝子の発現レベルが、該化合物の不存在におけるものとは異なる場合には、該化合物が骨異常を治療する候補であることを示す
    ことを特徴とする、骨異常を治療するための候補化合物を同定する方法。
  6. 該細胞が骨芽細胞、骨芽様細胞、又は骨細胞である、請求項5に記載の方法。
  7. 該細胞がSaOS-2細胞である、請求項6に記載の方法。
  8. 該細胞が破骨細胞である、請求項5に記載の方法。
  9. 骨異常を治療するための候補化合物を同定する方法であって、該方法が：
    化合物を、LRP-1タンパク質をコードするLRP-1遺伝子を発現させる細胞と接触させ、そして
    該細胞中の該LRP-1タンパク質の活性を定量化する
    ことを含み、
    該化合物の存在における該LRP-1タンパク質の活性が、該化合物の不存在におけるものとは異なる場合には、該化合物が骨異常を治療する候補であることを示す
    ことを特徴とする、骨異常を治療するための候補化合物を同定する方法。
  10. 該細胞が骨芽細胞、骨芽様細胞、又は骨細胞である、請求項9に記載の方法。
  11. 該細胞がSaOS-2細胞である、請求項10に記載の方法。
  12. 該細胞が破骨細胞である、請求項9に記載の方法。
  13. 骨異常の治療方法であって、該方法が、骨細胞内のLRP-1タンパク質レベルを調節することを含むことを特徴とする、骨異常の治療方法。
  14. 該LRP-1タンパク質レベルが、LRP-1タンパク質をコードする核酸を提供して発現させることにより調節される、請求項13に記載の方法。
  15. 該核酸が該骨細胞内に発現される、請求項14に記載の方法。
  16. 該LRP-1タンパク質レベルが、LRP-1タンパク質を提供することにより調節される、請求項13に記載の方法。
  17. 該LRP-1タンパク質が該骨細胞内に導入される、請求項16に記載の方法。
  18. 該LRP-1タンパク質レベルが、LRP-1タンパク質をコードする配列に対して相補的な核酸を提供して発現させることにより調節される、請求項13に記載の方法。
  19. 該核酸が該骨細胞内で発現される、請求項18に記載の方法。
  20. 骨異常の治療方法であって、該方法が、骨細胞内のLRP-1タンパク質の活性を調節することを含むことを特徴とする、骨異常の治療方法。
  21. 該LRP-1タンパク質の活性が、該LRP-1タンパク質のアゴニストを提供することにより調節される、請求項20に記載の方法。
  22. 該アゴニストが該骨細胞内に導入される、請求項21に記載の方法。
  23. 該LRP-1タンパク質の活性が、該LRP-1タンパク質のアンタゴニストを提供することにより調節される、請求項20に記載の方法。
  24. 該アンタゴニストが該骨細胞内に導入される、請求項23に記載の方法。
  25. 該LRP-1タンパク質の活性が、該LRP-1タンパク質に対する抗体を提供することにより調節される、請求項20に記載の方法。
  26. 該抗体が該骨細胞内に導入される、請求項25に記載の方法。
  27. 患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されているか否かを見極める方法であって、該方法が：
    骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていると疑われる患者の骨組織から試験試料を準備し、そして
    LRP-2遺伝子の発現レベルを定量化する
    ことを含み、
    該試験試料中の該LRP-2遺伝子の発現レベルが、正常試料中のものとは異なる場合には、該患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていることを示す
    ことを特徴とする、患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されているか否かを見極める方法。
  28. 患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されているか否かを見極める方法であって、該方法が：
    骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていると疑われる患者の骨組織から試験試料を準備し、そして
    LRP-2タンパク質の活性を定量化する
    ことを含み、
    該試験試料中の該LRP-2タンパク質の活性が、正常試料中のものとは異なる場合には、該患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されていることを示す
    ことを特徴とする、患者が骨異常を患っているか、又は骨異常を発生させる危険に晒されているか否かを見極める方法。
  29. 骨異常を治療するための候補化合物を同定する方法であって、該方法が：
    化合物を、LRP-2遺伝子を発現させる骨細胞と接触させ、そして
    該細胞中の該LRP-2遺伝子の発現レベルを定量化する
    ことを含み、
    該化合物の存在における該LRP-2遺伝子の発現レベルが、該化合物の不存在におけるものとは異なる場合には、該化合物が骨異常を治療する候補であることを示す
    ことを特徴とする、骨異常を治療するための候補化合物を同定する方法。
  30. 該細胞が骨芽細胞、骨芽様細胞、又は骨細胞である、請求項29に記載の方法。
  31. 該細胞がSaOS-2細胞である、請求項30に記載の方法。
  32. 該細胞が破骨細胞である、請求項29に記載の方法。
  33. 骨異常を治療するための候補化合物を同定する方法であって、該方法が：
    化合物を、LRP-2タンパク質をコードするLRP-2遺伝子を発現させる骨細胞と接触させ、そして
    該細胞中の該LRP-2タンパク質の活性を定量化する
    ことを含み、
    該化合物の存在における該LRP-2タンパク質の活性が、該化合物の不存在におけるものとは異なる場合には、該化合物が骨異常を治療する候補であることを示す
    ことを特徴とする、骨異常を治療するための候補化合物を同定する方法。
  34. 該細胞が骨芽細胞、骨芽様細胞、又は骨細胞である、請求項33に記載の方法。
  35. 該細胞がSaOS-2細胞である、請求項34に記載の方法。
  36. 該細胞が破骨細胞である、請求項33に記載の方法。
  37. 骨異常の治療方法であって、該方法が、骨細胞内のLRP-2タンパク質レベルを調節することを含むことを特徴とする、骨異常の治療方法。
  38. 該LRP-2タンパク質レベルが、LRP-2タンパク質をコードする核酸を骨細胞内に導入して発現させることにより調節される、請求項37に記載の方法。
  39. 該LRP-2タンパク質レベルが、LRP-2タンパク質を骨細胞内に導入することにより調節される、請求項37に記載の方法。
  40. 該LRP-2タンパク質レベルが、LRP-2タンパク質をコードする配列に対して相補的な核酸を骨細胞内に導入して発現させることにより調節される、請求項37に記載の方法。
  41. 骨異常の治療方法であって、該方法が、骨細胞内のLRP-2タンパク質の活性を調節することを含むことを特徴とする、骨異常の治療方法。
  42. 該LRP-2タンパク質の活性が、該LRP-2タンパク質のアゴニストを骨細胞内に導入することにより調節される、請求項41に記載の方法。
  43. 該LRP-2タンパク質の活性が、該LRP-2タンパク質のアンタゴニストを骨細胞内に導入することにより調節される、請求項41に記載の方法。
  44. 該LRP-2タンパク質の活性が、該LRP-2タンパク質に対する抗体を骨細胞内に導入することにより調節される、請求項41に記載の方法。
  45. 患者が骨又は軟骨の異常を患っているか、又は骨又は軟骨の異常を発生させる危険に晒されているか否かを見極める方法であって、該方法が：
    患者から試験試料を準備し、そして
    該試験試料中のラクトフェリン・ポリペプチドとLRP-1又はLRP-2タンパク質との間の相互作用レベルを見極める
    ことを含み、
    該試験試料中の該ラクトフェリン・ポリペプチドと該LRP-1又はLRP-2タンパク質との間の該相互作用レベルが、正常試料中のものとは異なる場合には、該患者が骨又は軟骨の異常を患っているか、又は骨又は軟骨の異常を発生させる危険に晒されていることを示す
    ことを特徴とする、患者が骨又は軟骨の異常を患っているか、又は骨又は軟骨の異常を発生させる危険に晒されているか否かを見極める方法。
  46. 該試料が骨又は軟骨の組織から調製される、請求項45に記載の方法。
  47. 骨又は軟骨の異常を治療するための候補化合物を同定する方法であって、該方法が：
    ラクトフェリン・ポリペプチドとLRP-1又はLRP-2タンパク質とを含有する系に化合物を導入し、そして、
    該ラクトフェリン・ポリペプチドと該LRP-1又はLRP-2タンパク質との間の相互作用レベルを見極める
    ことを含み、
    該化合物の存在における該ラクトフェリン・ポリペプチドと該LRP-1又はLRP-2タンパク質との間の該相互作用レベルが、該化合物の不存在におけるものとは異なる場合には、該化合物が骨又は軟骨の異常を治療する候補であることを示す
    ことを特徴とする、骨又は軟骨の異常を治療するための候補化合物を同定する方法。
  48. 該試料が、骨芽細胞、破骨細胞、線維芽細胞、又は軟骨細胞を含有する、請求項47に記載の方法。
  49. 骨又は軟骨の異常の治療方法であって、該方法が、骨細胞又は軟骨細胞内のラクトフェリン・ポリペプチドとLRP-1又はLRP-2タンパク質との間の相互作用を調節することを含むことを特徴とする、骨又は軟骨の異常の治療方法。
  50. 該ラクトフェリン・ポリペプチドと該LRP-1又はLRP-2タンパク質との間の該相互作用が、該LRP-1又はLRP-2タンパク質のアゴニストを提供することにより調節される、請求項49に記載の方法。
  51. 該アゴニストが、該骨細胞又は該軟骨細胞内に導入される、請求項50に記載の方法。
  52. 該アゴニストが外生的なラクトフェリン・ポリペプチドである、請求項50に記載の方法。
  53. 該外生的なラクトフェリン・ポリペプチドが、該骨細胞又は軟骨細胞内に導入される、請求項52に記載の方法。
  54. 該ラクトフェリン・ポリペプチドと、該LRP-1又はLRP-2タンパク質との間の該相互作用が、該LRP-1又はLRP-2タンパク質のアンタゴニストを提供することにより調節される、請求項49に記載の方法。
  55. 該アンタゴニストが、該骨細胞又は該軟骨細胞内に導入される、請求項54に記載の方法。
  56. 該アンタゴニストが、受容体関連タンパク質である、請求項54に記載の方法。
  57. 該受容体関連タンパク質が、該骨細胞又は軟骨細胞内に導入される、請求項56に記載の方法。
  58. 患者が骨又は軟骨の異常を患っているか、又は骨又は軟骨の異常を発生させる危険に晒されているか否かを見極める方法であって、該方法が：
    患者から試験試料を準備し、そして
    該試験試料中のラクトフェリン・ポリペプチドとp42/44 MAPキナーゼとの間の相互作用レベルを見極める
    ことを含み、
    該試験試料中の該ラクトフェリン・ポリペプチドと該p42/44 MAPキナーゼとの間の該相互作用レベルが、正常試料中のものとは異なる場合には、該患者が骨又は軟骨の異常を患っているか、又は骨又は軟骨の異常を発生させる危険に晒されていることを示す
    ことを特徴とする、患者が骨又は軟骨の異常を患っているか、又は骨又は軟骨の異常を発生させる危険に晒されているか否かを見極める方法。
  59. 該試料が骨組織又は軟骨組織から調製される、請求項58に記載の方法。
  60. 骨又は軟骨の異常を治療するための候補化合物を同定する方法であって、該方法が：
    ラクトフェリン・ポリペプチドとp42/44 MAPキナーゼとを含有する系に化合物を導入し、そして、
    該ラクトフェリン・ポリペプチドと該p42/44 MAPキナーゼとの間の相互作用レベルを見極める
    ことを含み、
    該化合物の存在における該ラクトフェリン・ポリペプチドと該p42/44 MAPキナーゼとの間の該相互作用レベルが、該化合物の不存在におけるものとは異なる場合には、該化合物が骨又は軟骨の異常を治療する候補であることを示す
    ことを特徴とする、骨又は軟骨の異常を治療するための候補化合物を同定する方法。
  61. 該試料が、骨芽細胞、破骨細胞、線維芽細胞、又は軟骨細胞を含有する、請求項60に記載の方法。
  62. 骨又は軟骨の異常の治療方法であって、該方法が、骨細胞又は軟骨細胞内のラクトフェリン・ポリペプチドとp42/44 MAPキナーゼとの間の相互作用を調節することを含むことを特徴とする、骨又は軟骨の異常の治療方法。
  63. 該ラクトフェリン・ポリペプチドと該p42/44 MAPキナーゼとの間の該相互作用が、p42/44MAPキナーゼのアゴニストを提供することにより調節される、請求項62に記載の方法。
  64. 該アゴニストが、該骨細胞又は該軟骨細胞内に導入される、請求項63に記載の方法。
  65. 該アゴニストが外生的なラクトフェリン・ポリペプチドである、請求項63に記載の方法。
  66. 該外生的なラクトフェリン・ポリペプチドが、該骨細胞又は軟骨細胞内に導入される、請求項65に記載の方法。
  67. 該ラクトフェリン・ポリペプチドと該p42/44 MAPキナーゼとの間の該相互作用が、p42/44MAPキナーゼのアンタゴニストを提供することにより調節される、請求項62に記載の方法。
  68. 該アンタゴニストが、該骨細胞又は該軟骨細胞内に導入される、請求項67に記載の方法。
  69. 該アンタゴニストが、p42/44 MAPキナーゼの阻害物質である、請求項67に記載の方法。
  70. p42/44 MAPキナーゼの該阻害物質が該骨細胞又は該軟骨細胞内に導入される、請求項69に記載の方法。
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